ANALISIS KOMUNITAS BAKTERI FRUKTOSFER KELAPA SAWIT MENGGUNAKAN TEKNIK TERMINAL RESTRICTION FRAGMENT LENGTH POLYMORPHISM (T-RFLP)
DIMAS FANDI PRADITYA
DEPARTEMEN BIOLOGI FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2010
ANALISIS KOMUNITAS BAKTERI FRUKTOSFER KELAPA SAWIT MENGGUNAKAN TEKNIK TERMINAL RESTRICTION FRAGMENT LENGTH POLYMORPHISM (T-RFLP)
DIMAS FANDI PRADITYA
Skripsi sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains pada Departemen Biologi
DEPARTEMEN BIOLOGI FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2010
ABSTRAK DIMAS FANDI PRADITYA. Analisis Komunitas Bakteri Fruktosfer Kelapa Sawit Menggunakan Teknik Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism (T-RFLP). Dibimbing oleh ANTONIUS SUWANTO dan ESTI PUSPITASARI. Pengetahuan tentang keragaman komunitas bakteri fruktosfer kelapa sawit dapat menyediakan informasi dasar bagi pengembangan penelitian lebih lanjut. Salah satu metode yang dapat digunakan untuk menganalisis keragaman komunitas bakteri adalah Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism (T-RFLP). Tujuan dari penelitian ini ialah untuk menganalisis keragaman bakteri yang ada pada fruktosfer kelapa sawit. Gen 16S rRNA diamplifikasi menggunakan primer 27F dan 926R yang telah dilabel. Produk PCR yang diperoleh kemudian dipotong menggunakan empat enzim yang berbeda, yaitu BstUI, MspI, DdeI, dan Sau96I. Hasil elektroforegram menunjukkan bahwa keempat enzim restriksi yang digunakan menghasilkan pola pemotongan yang berbeda satu dengan yang lainnya. Hal ini karena setiap enzim restriksi memiliki situs pengenalannya masing-masing. Secara umum enzim restriksi BstUI dan MspI menghasilkan jumlah Terminal Restriction Fragment (TRF) yang lebih banyak dibandingkan dua enzim lainya. Dari hasil Analisis yang dilakukan diperoleh beberapa nama genus bakteri. Genus bakteri yang diduga terdapat pada fruktosfer kelapa sawit tersebut mewakili kelompok bakteri gram-positif dan gram-negatif, Proteobacteria, Actinobacteria, bakteri tanah, bakteri perairan, dan bakteri yang tidak dapat dikulturkan.
ABSTRACT DIMAS FANDI PRADITYA. Bacterial Community of Oil Palm Fructosphere Analysis Employing Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism (T-RFLP). Under the guidance of ANTONIUS SUWANTO and ESTI PUSPITASARI. The knowledge about bacterial community could provide basic information for the development of further research. One method that could be used to analize the diversity of microbial community is Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism (T-RFLP). The objective of this research is to analyze the existing bacterial diversity on oil palm fructosphere. The 16S rRNA genes were amplified by PCR using forward primer (27F) and reverse primer (926R) which have been labeled. The PCR product were then digested with four different enzymes, namely BstUI, MspI, DdeI, and Sau96I. The elecroforegram showed that these enzymes produce different patterns due to the unique restriction sites of each enzymes. In general, BstUI and MspI enzymes produce more Terminal Restriction Fragment (TRF) than two other enzymes. From T-RFLP analysis we could identify some bacterial genus. Bacteria that were predicted to be present in oil palm fructosphere were gram-positive and gram-negative bacteria, Proteobacteria, Actinobacteria, soil bacteria, marine bacteria, and bacteria that could not be cultured.
Judul
: Analisis Komunitas Bakteri Fruktosfer Kelapa Sawit Menggunakan Teknik Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism (T-RFLP)
Nama : Dimas Fandi Praditya NIM
: G34060961
Disetujui,
Pembimbing I
Pembimbing II
Prof. Dr. Ir. Antonius Suwanto, M. Sc.
Esti Puspitasari, M.Si.
NIP. 19581130 198503 1 003
NIK.6209009839
Diketahui, Ketua Departemen Biologi
Dr. Ir. Ence Darmo Jaya Supena, M.Si. NIP. 19641002 198903 1 002
Tanggal Lulus :
PRAKATA
Assalamualaikum Wr. Wb. Puji dan syukur penulis panjatkan ke kehadirat Allah SWT, yang telah melimpahkan rahmat dan anugerah-Nya, sehingga penulis dapat menyelesaikan karya ilmiah yang berjudul “Analisis Komunitas Bakteri Fruktosfer Kelapa Sawit Menggunakan Teknik Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism (T-RFLP)”. Penelitian ini dilakukan sejak bulan Februari 2010 sampai dengan bulan Juni 2010”, di Laboratorium Bioteknologi, PT Wilmar Benih Indonesia, Cikarang. Terima kasih penulis ucapkan kepada Bapak Prof. Dr. Ir. Antonius Suwanto, M. Sc. dan Ibu Esti Puspitasari, M.Si. selaku pembimbing, atas segala bimbingan, saran, dan masukan selama berlangsungnya kegiatan penelitian dan penyusunan karya ilmiah ini. Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada Bapak Dr. Ir. Miftahudin, M.Si. selaku dosen penguji wakil komisi pendidikan yang telah bersedia menguji dan memberikan masukan saat ujian dan penulisan karya ilmiah, serta kepada Kak Lukas A.M., S.Si. yang juga telah memberi masukan dan saran selama penelitian. Ungkapan terima kasih juga disampaikan kepada ayah, ibu serta keluarga, atas segala doa dan dukungannya, kepada teman-teman Biologi 43 untuk kebersamaannya, dan staf PT. Wilmar Benih Indonesia yang telah banyak membantu. Semoga karya ilmiah ini dapat memberikan pengetahuan tentang komunitas bakteri pada fruktosfer kelapa sawit bagi pembaca. Bogor, September 2010
Dimas Fandi Praditya
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Jakarta pada tanggal 11 Agustus 1988 sebagai anak pertama dari dua bersaudara. Pada tahun 2006 penulis menyelesaikan pendidikannya dari SMAN 61 Jakarta dan pada tahun yang sama diterima di Institut Pertanian Bogor (IPB) melalui jalur Undangan Seleksi Masuk IPB(USMI). Pada tahun 2005, penulis menjadi anggota tim olimpiade biologi tingkat kotamadya mewakili SMAN 61 dan juga menjadi wakil SMAN 61 pada Kompetisi Fisika Tingkat Nasional di UGM, Yogyakarta. Penulis melakukan Studi Lapang pada tahun 2008 mengenai Distribusi Primata Pada Kawasan Taman Wisata Alam Situ Gunung-Sukabumi, dan pada tahun 2009 penulis melaksanakan Praktik Lapang di PT. Sandoz Indonesia. Selama masa perkuliahan penulis pernah mendapat Beasiswa Bantuan Mahasiswa (BBM) yang diberikan oleh Direktorat Jendral Pendidikan Tinggi pada tahun ajaran 2008-2009 dan 2009-2010. Kegiatan organisasi yang pernah diikuti penulis antara lain menjadi ketua Komisi Pengawas Himabio IPB pada tahun 2007-2008, anggota divisi Infokom Ikahimbi pada tahun 20072008. Selain itu, penulis juga aktif di berbagai kegiatan yang diselenggarakan baik di tingkat jurusan maupun tingkat fakultas.
DAFTAR ISI Halaman DAFTAR GAMBAR .................................................................................................................... vii DAFTAR LAMPIRAN ................................................................................................................ vii PENDAHULUAN ........................................................................................................................... 1 Latar Belakang .............................................................................................................................. 1 Tujuan .......................................................................................................................................... 1 BAHAN DAN METODE ................................................................................................................ 1 Pengambilan sampel ..................................................................................................................... 1 Preparasi sampel .......................................................................................................................... 1 Isolasi DNA .................................................................................................................................. 1 Amplifikasi gen penyandi 16S rRNA .......................................................................................... 2 Digesti produk PCR menggunakan enzim restriksi ...................................................................... 2 Analisis TRFLP ............................................................................................................................ 2 Analisis TRFLP dengan metode pengkulturan ............................................................................ 2 HASIL ............................................................................................................................................. 2 Isolasi DNA genom bakteri fruktosfer kelapa sawit .................................................................... 2 Analisis T-RFLP .......................................................................................................................... 3 Analisis T-RFLP dengan metode pengkulturan ........................................................................... 4 PEMABAHASAN .......................................................................................................................... 4 SIMPULAN .................................................................................................................................... 6 SARAN ............................................................................................................................................ 6 DAFTAR PUSTAKA ..................................................................................................................... 6 LAMPIRAN .................................................................................................................................... 8
DAFTAR GAMBAR Halaman 1 Perbandingan analisis T-RFLP komunitas bakteri fruktosfer kelapa sawit menggunakan ZR dan WZ yang didigesti dengan enzim restriksi BstUI .......................................................................... 3 2 Analisis T-RFLP komunitas bakteri fruktosfer kelapa sawit dengan metode WZ dan didigesti menggunakan enzim restriksi BstUI ............................................................................................. 4 3 Analisis T-RFLP komunitas bakteri fruktosfer kelapa sawit dengan metode pengkulturan dan didigesti menggunakan enzim restriksi BstUI .............................................................................. 4
DAFTAR LAMPIRAN Halaman 1 Konsentrasi dan kemurnian rendemen DNA hasil isolasi DNA genom bakteri fruktosfer kelapa sawit menggunakan 3 metode yang berbeda ................................................................................. 9 2 Analisis T-RFLP komunitas bakteri fruktosfer kelapa sawit yang diisolasi menggunakan WZ dan didigesti menggunakan enzim restriksi BstUI, MspI, DdeI, dan Sau96I ...................................... 10 3 Prediksi genus bakteri fruktosfer kelapa sawit hasil isolasi dengan WZ dan didigesti menggunakan enzim BstUI, MspI, DdeI dan Sau96 .................................................................... 11 4 Analisis T-RFLP komunitas bakteri fruktosfer kelapa sawit dengan metode pengkulturan dan didigesti menggunakan enzim restriksi BstUI, MspI, DdeI, dan Sau96I ...................................... 12
PENDAHULUAN Latar Belakang Kelapa sawit (Elaeis guineensis Jacq) merupakan salah satu tanaman perkebunan yang memiliki nilai penting sebagai sumber penghasil devisa non migas bagi Indonesia. Berdasarkan data Badan Pusat Statistik tahun 2008, produksi kelapa sawit Indonesia telah mencapai 11.623.822 ton yang menjadikan Indonesia sebagai negara penghasil kelapa sawit terbesar di dunia (BPS 2008). Hal ini dipicu oleh meningkatnya permintaan dunia akan minyak kelapa sawit untuk minyak goreng, makanan, sabun, kosmetik dan bahan dasar industri lainnya. Bagian yang penting dari tanaman kelapa sawit adalah buahnya, buah tersebut akan diolah menjadi minyak kelapa sawit. Buah menyediakan habitat yang mendukung pertumbuhan mikroba disekitarnya yang didefinisikan sebagai fruktosfer. Mikroba, terutama bakteri dapat ditemukan baik dipermukaan maupun di bagian dalam buah (Campbell 1985). Selanjutnya, Lindow dan Brandl (2003) melaporkan bahwa bagian di atas tanah dari tanaman biasanya ditemukan berbagai komunitas bakteri dan cendawan. Komunitas bakteri memiliki peranan penting dalam siklus biogeokimia dan degradasi berbagai senyawa (Muyzer 1998). Komunitas bakteri terbukti mampu melakukan perubahan signifikan pada lingkungan (Buckley & Schmidt 2003) baik dalam waktu yang relatif singkat bahkan dapat merubah lingkungan dalam waktu yang relatif panjang. Untuk itu diperlukan penjabaran lengkap dari komunitas mikroba di tempat tertentu termasuk bakteri yang tidak dapat dikulturkan. Hal ini diperlukan untuk mengetahui fungsi komunitas mikroba tersebut dan dampaknya pada lingkungan. Salah satu metode yang dapat digunakan untuk menganalisis struktur komunitas mikroba adalah Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism (T-RFLP). Analisis T-RFLP merupakan salah satu metode culture-independent yang berdasarkan polimorfisme ukuran panjang potongan terminal produk PCR yang terlabel setelah didigesti menggunakan enzim restriksi. Metode culture-independent merupakan metode yang tidak memerlukan kultivasi pada medium pertumbuhan terlebih dulu. Analisis T-RFLP dapat digunakan untuk memeriksa struktur komunitas mikroba dan kemampuan komunitas tersebut menanggapi
perubahan dalam lingkungan. Beberapa peneliti telah menggunakan T-RFLP untuk menganalisis mikroorganisme pada suatu habitat. Liu et al. (1997) menggunakan teknik ini untuk menganalisis mikroba dari beberapa habitat, yaitu lumpur teraktifkan dan usus rayap, sedangkan Buckley dan Schmidt (2003) menggunakannya untuk mengetahui keragaman dan dinamika komunitas mikroba dari tanah ekosistem agro. Analisis ini merupakan salah satu metode fingerprinting yang cepat, mudah dilakukan dan memiliki tingkat reproducibility yang tinggi. Seperti yang telah dijelaskan bahwa buah merupakan bagian yang penting, maka pengetahuan tentang komunitas mikroba, dalam hal ini komunitas bakteri fruktosfer kelapa sawit diperlukan untuk menyediakan informasi dasar bagi pengembangan penelitian lebih lanjut. Informasi ini diharapkan akan membantu ilmuwan lain untuk menciptakan dasar kesehatan bagi pemetaan spesies bakteri fruktosfer. Penelitian ini juga dapat membantu untuk mengidentifikasi jenis spesies yang terkait dengan penyakit tertentu (Costello et al 2009) dan sejauh mana perubahan komposisi mikroba akan mempengaruhi pertumbuhan dan kesehatan buah kelapa sawit. Tujuan Tujuan dari penelitian ini ialah untuk menganalisis keragaman bakteri fruktosfer kelapa sawit.
BAHAN DAN METODE Pengambilan sampel Sampel yang digunakan berupa buah kelapa sawit segar dan matang yang diambil dari PT. Tania Selatan, Palembang. Preparasi sampel Bakteri fruktosfer diisolasi dari buah kelapa sawit. Sebanyak 20 buah dicuci menggunakan air steril sebanyak 200 ml selama 1 menit dan dilakukan sebanyak 2 kali, hal ini bertujuan menghilangkan bakteri transien. Kemudian buah dikupas kulitnya, kulit tersebut diambil sebanyak 10 g dan diblender dengan NaCl 0.85% sebanyak 100 ml. Isolasi DNA Isolasi DNA dilakukan menggunakan 3 metode, yaitu metode CTAB, Zymo Research (ZR) Plant/Seed DNA MiniPrep™ (Zymo Research, USA) dan Wizard® (WZ) Genomic DNA Purification Kit (Promega, USA). Untuk
metode CTAB, diambil sebanyak 1.5 mL dari sampel yang telah diblender tadi kemudian disentrifugasi selama 2 menit pada kecepatan 9600 g. Supernatan dibuang dan diresuspensi dengan 400 µl bufer TE 1×, ditambahkan 100 µl lisozim 50 mg/ml, kemudian diinkubasi pada suhu 37 ºC selama 60 menit. Proses lisis sel dilanjutkan dengan penambahan 100 µl SDS 10% dan 100 µl proteinase-K 10 mg/ml, diinkubasi pada suhu 37 ºC selama 60 menit. Sebanyak 100 µl NaCl 5M dan 100 µl CTAB 10% ditambahkan, kemudian diinkubasi pada suhu 65 ºC selama 20 menit. Purifikasi DNA dilakukan dengan menambahkan 500 µl PCI. DNA dipisahkan dengan debris sel dengan cara disentrifugasi pada 9600 g selama 10 menit. Zona bening bagian atas yang terbentuk diambil sebanyak 600 µl dan dimasukkan kedalam tabung mikro steril yang baru. Selanjutnya, ditambahkan 500 µl CI dan disentrifugasi kembali pada 9600 g selama 10 menit. Zona bening bagian atas yang terbentuk diambil sebanyak 500 µl. Pengendapan DNA dilakukan dengan menambahkan isopropanol absolut dingin sebanyak 600 µl. Pengendapan dibantu dengan inkubasi pada suhu 4º C selama 10 menit dan dilakukan sentrifugasi pada 9600 g selama 2 menit. Pelet yang didapatkan ditambahkan etanol 70% dingin sebanyak 200 µl dan kembali disentrifugasi. Fase supernatan dibuang, sedangkan pelet dikeringudarakan. Kemudian pelet DNA ditambahkan 50 µl ddH2O steril. Sedangkan untuk metode lainnya dilakukan sesuai dengan prosedur masingmasing kit.
Siklus PCR yang digunakan sebanyak 25 siklus yang terdiri dari 94 °C selama 5 min, 94 °C selama 30 det, 56 °C selama 30 det, dan 72 °C selama 1 min, dan dilanjutkan tahap perpanjangan terkahir selama 7 min pada suhu 72 °C. Produk PCR kemudian diverifikasi pada gel agarosa 1%.
Amplifikasi gen penyandi 16S rRNA Gen penyandi 16S rRNA bakteri fruktosfer kelapa sawit di amplifikasi menggunakan mesin PCR C1000™ Thermal Cycler (Bio-Rad). Primer yang digunakan untuk mengamplifikasi gen penyandi 16S rRNA adalah 27f-FAM (5'GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3') yang dilabel dengan fluorochrome 6carboxyfluorescein (Moeseneder et al. 1998) dan primer 926r-HEX (5'CCGTCAATTCCATTTRAGTTT -3') yang dilabel dengan hexachloro-6carboxyfluorescein. Primer ini didesain untuk menghasilkan gen penyandi 16S rRNA bakteri. Komposisi reaksi yang digunakan adalah 13.6 μl ddH2O, 5 μl bufer, 1 μl dNTPs 20 mM, 2 μl masing-masing primer 10 pmol , 0.4 μl enzim polimerase, dan 1 μl DNA cetakan.
Analisis T-RFLP dengan metode pengkulturan Sebanyak 1 ml hasil dari tahap preparasi sampel dimasukkan kedalam 9 ml NaCL 0.85%. Selanjutnya sebanyak 100 µl suspensi dari pengenceran tersebut disebar pada medium LA dan diinkubasi pada suhu 30 ºC selama 5 hari. Seluruh koloni yang terbentuk diambil untuk dilakukan isolasi DNA menggunakan WZ. Amplifikasi, digesti dan analisis T-RFLP dilakukan sesuai dengan prosedur yang telah dijelaskan di atas.
Digesti produk PCR menggunakan enzim restriksi Produk PCR didigesti menggunakan empat macam enzim berbeda, yaitu BstUI, MspI, DdeI, dan Sau96I. Komposisi reaksi untuk masing-masing enzim adalah 3U enzim restriksi, 2.5 µl bufer enzim, dan 5 µl DNA produk PCR, inkubasi selama ±16 jam pada suhu 37 ºC, untuk enzim BstUI inkubasi dilakukan pada suhu 60 ºC. Hasil digesti dipurifikasi dengan metode presipitasi etanol. Analisis T-RFLP Sebanyak 1 µl DNA yang telah didigesti dicampur dengan working dye dan GS500 (250) ROX sebagai standar ukuran internal. Selanjutnya campuran ini dilarikan pada mesin sequenser ABI PRISMTM 3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystem, Foster City, California) selama 30 menit. Kondisi alat saat digunakan, yaitu tegangan saat injeksi 16 kV, waktu injeksi 16 menit, kekuatan laser 15 mW,tegangan saat running 12 kV, dan suhu 60 ºC. Panjang fragmen yang terlabel bahan flurescens dideterminasi menggunakan program GeneMapper® Software v4.1. Hasil yang diperoleh selanjutnya dicocokan dengan basis data (http://mica.ibest.uidaho.edu/) menggunakan program FRAGSORT.
HASIL Isolasi DNA genom bakteri fruktosfer kelapa sawit Isolasi DNA genom bakteri fruktosfer kelapa sawit yang dilakukan menggunakan 3 metode menghasilkan konsentrasi rendemen
DNA yang berbeda-beda, seperti disajikan pada Tabel 1. Tabel 1 Konsentrasi DNA hasil isolasi DNA genom bakteri fruktosfer kelapa sawit menggunakan 3 metode berbeda Nama
Konsentrasi (ng/µl)
CTAB ZR WZ
196.05 ± 78.84 52.50 ± 0.42 102.06 ± 62.09
Intensitas pendaran (unit fluoresen)
Setelah dilakukan amplifikasi menggunakan mesin PCR C1000™ Thermal Cycler (Bio-Rad) diperoleh hasil berupa pita DNA yang berukuran ± 900 pb. Namun hasil isolasi yang menggunakan metode CTAB, tidak dihasilkan pita DNA sehingga tidak bisa digunakan untuk analisis T-RFLP. 58 pb
Analisis T-RFLP Hasil analisis T-RFLP berupa elektroforegram yang memperlihatkan grafik ukuran fragment ujung 5’ (Terminal Restriction Fragment / TRF). Grafik berwarna biru dan hijau merupakan contoh DNA yang dianalisis, dimana grafik berwarna biru menggambarkan TRF yang terlabel oleh FAM sedangkan grafik berwarna hijau menggambarkan TRF yang terlabel oleh HEX. Analisis yang dilakukan terhadap hasil isolasi DNA genom bakteri fruktosfer kelapa sawit dengan dua metode diperoleh puncakpuncak grafik yang memiliki pola TRF berbeda. Ukuran TRF yang dibahas hanya yang terlabel oleh FAM. Sampel hasil isolasi menggunakan WZ yang didigesti dengan enzim BstUI diperoleh variasi ukuran TRF antara 96 - 517 pb,
96 pb
ZR
138 pb 196 pb
360 pb
460 pb
Intensitas pendaran (unit fluoresen)
Ukuran panjang TRF (Pb)
58 pb
210 pb
WZ
389 pb 385 pb
96 pb
348 pb 177 pb
244 pb
397 pb 517 pb
Ukuran panjang TRF (Pb)
Gambar 1 Perbandingan analisis T-RFLP komunitas bakteri fruktosfer kelapa sawit menggunakan ZR dan WZ yang didigesti dengan enzim restriksi BstUI. sedangkan hasil isolasi dengan ZR diperoleh variasi ukuran TRF antara 96 – 460 pb. Perbandingan pola TRF yang dihasilkan untuk masing-masing metode, yaitu ZR dan WZ dapat dilihat pada Gambar 1. Dari hasil tersebut, maka untuk selanjutnya metode isolasi DNA yang digunakan adalah metode
WZ. Hasil digesti menggunakan 4 enzim yang berbeda diperoleh variasi TRF yang berbedabeda, digesti menggunakan enzim BstUI (Gambar 2) diperoleh variasi ukuran TRF antara 96-517 pb, MspI 71-489 pb, DdeI 287 pb, dan Sau96I 191-255 pb.
Intensitas pendaran (unit fluoresen)
210 pb
58 pb
389 pb
BstUI
385 pb 348 pb 96 pb
177 pb
244 pb
397 pb 517 pb
Ukuran panjang TRF (Pb) Gambar 2 Analisis T-RFLP komunitas bakteri fruktosfer kelapa sawit dengan metode WZ dan didigesti menggunakan enzim restriksi BstUI. Setelah dilakukan pencocokan TRF tersebut dengan basis data, diperoleh beberapa nama bakteri yang diduga terdapat pada fruktosfer kelapa sawit.
Intensitas pendaran (unit fluoresen)
52 pb
210 pb
69 pb 93 pb
229 pb
Analisis T-RFLP dengan metode pengkulturan Analisis ini dilakukan sebagai pembanding terhadap metode tanpa pengkulturan.
389 pb
395 pb
BstUI
224 pb 165 pb
142 pb
234 pb 334 pb 298 pb
495 pb
Ukuran panjang TRF (Pb) Gambar 3 Analisis T-RFLP komunitas bakteri fruktosfer kelapa sawit dengan metode pengkulturan dan didigesti menggunakan enzim restriksi BstUI. Hasil elektroforegram (Gambar 3) menunjukkan jumlah TRF yang terbentuk lebih banyak, dibandingkan dengan metode tanpa pengkulturan. Hasil analisis T-RFLP menggunakan enzim BstUI diperoleh variasi ukuran TRF antara 93-495 pb.
PEMBAHASAN Isolasi DNA merupakan tahap yang paling penting dalam analisis T-RFLP. Oleh karena itu perlu dilakukan pemilihan metode yang tepat, agar dapat menggambarkan sidik jari dari suatu komunitas dan mendapatkan hasil analisis T-RFLP yang konsisten. Pada penelitian ini isolasi DNA dilakukan menggunakan tiga macam metode, yaitu CTAB, ZR dan WZ. Dari ketiga metode tersebut, konsentrasi rendemen DNA tertinggi dihasilkan dari isolasi DNA genom yang dilakukan menggunakan metode CTAB, yaitu
sebesar 196.05 ± 78.84 ng, dan konsentrasi terendah dihasilkan dari isolasi yang dilakukan menggunakan ZR yaitu sebesar 52.50 ± 0.42 ng. Sedangkan kemurnian rendemen DNA (Lampiran 1) yang diperoleh memperlihatkan bahwa hasil isolasi menggunakan metode CTAB masih banyak mengandung kontaminan, hal ini dapat terlihat dari perbandingan absorbansi pada panjang gelombang 260/230 nm, dimana panjang gelombang 260 nm menggambarkan jumlah DNA yang terkandung di dalam sampel dan panjang gelombang 230 nm menggambarkan jumlah garam dan kontaminan lainnya, hasil ini sesuai dengan laporan Zidan et al. (2005), yang menyatakan bahwa CTAB tidak bisa menghilangkan kontaminan dengan sempurna. Purifikasi yang dilakukan juga tidak mampu menghilangkan kontaminan tersebut. Amplifikasi yang dilakukan dengan mesin PCR mendapatkan hasil bahwa DNA hasil
isolasi menggunakan metode CTAB tidak dapat teramplifikasi dengan baik, hal ini disebabkan oleh banyaknya kontaminan yang dapat mengganggu jalannya proses amplifikasi. Setelah dilakukan analisis TRFLP pada hasil isolasi DNA genom menggunakan ZR dan WZ menunjukkan bahwa hasil isolasi WZ menghasilkan profil T-RFLP yang lebih baik, karena jumlah TRF yang dihasilkan lebih banyak. Berdasarkan hasil pengukuran konsentrasi dan kemurnian DNA serta analisis T-RFLP yang dilakukan, maka dapat diketahui bahwa metode isolasi menggunakan WZ paling baik untuk isolasi DNA genom bakteri dari fruktosfer kelapa sawit. Hasil elektroforegram menunjukkan bahwa keempat enzim restriksi yang digunakan menghasilkan pola pemotongan yang berbeda (Lampiran 2). Hal ini karena setiap enzim restriksi memiliki situs pengenalannya masing-masing. Secara umum enzim restriksi BstUI dan MspI menghasilkan jumlah TRF yang lebih banyak dibandingkan dua enzim lainnya. Enzim BstUI dan MspI merupakan enzim yang memiliki frekuensi tinggi dalam menghasilkan populasi tunggal dalam model komunitas (Engebretson & Moyer 2003). Kedua enzim tersebut menghasilkan jumlah TRF yang sama banyak, yaitu 7 TRF. Keragaman spesies bakteri yang mungkin terdapat dalam suatu komunitas dapat diduga dari jumlah TRF yang teramati (Yogiara 2004), sehingga pada sampel fruktosfer kelapa sawit diduga terdapat minimal 7 spesies bakteri. Pada pembahasan selanjutnya akan lebih dibahas mengenai hasil analisis TRFLP yang menggunakan enzim BstUI, karena merupakan salah satu yang menghasilkan TRF terbanyak. Dari hasil pencocokan TRF tersebut dengan basis data menggunakan program FRAGSORT diperoleh beberapa nama bakteri yang diduga terdapat pada fruktosfer kelapa sawit. Namun karena kemungkinan jenis bakteri hasil pencocokan tersebut masih sangat banyak, maka yang ditampilkan hanya dibatasi sampai tingkat genus (Lampiran 3). Genus bakteri yang diduga terdapat pada fruktosfer kelapa sawit tersebut mewakili kelompok bakteri gram-positif dan gram-negatif, Proteobacteria, Actinobacteria, bakteri tanah, bakteri perairan, dan bakteri yang tidak dapat dikulturkan. Dari ke 7 TRF tersebut, TRF yang memiliki ukuran 389 bp merupakan fragmen dominan dengan kelimpahan sebesar 76.70%.
Kemungkinan bakteri yang memiliki fragmen ini antara lain Bacillus sp., Enterobacter sp., Achromobacter sp dan Pseudomonas sp., keempatnya merupakan genus bakteri endofit yang dapat dijumpai pada beberapa jenis tanaman (Bacon and Hinton 2006). Beberapa spesies bakteri tersebut juga telah dilaporkan dapat dijadikan sebagai biokontrol karena dapat menghasilkan komponen anti mikroba (Beattie 2006). Selain itu Fandy (2006) melaporkan bahwa pada buah kelapa sawit terdapat bakteri Bacillus brevis dan Bacillus laterosporus. Beberapa bakteri lain yang diduga terdapat pada fruktosfer kelapa sawit juga telah dilaporkan terdapat di berbagai macam lingkungan, diantaranya Acetobacter sp., Flavobacterium sp., dan Serratia sp. dilaporkan terdapat pada lubang penyadapan getah kelapa sawit (Faparusi 1974), Streptomyces sp. dilaporkan terdapat pada tanah (Dharmawan et al. 2009), Burkholderia sp. merupakan bakteri endofit kelapa sawit yang dapat menekan infeksi Ganoderma sp. pada kelapa sawit (Sapak et al. 2008). Berdasarkan hasil analisis T-RFLP dengan metode pengkulturan menunjukkan bahwa jumlah TRF yang diperoleh lebih banyak (Lampiran 4). Banyaknya jumlah TRF tersebut karena bakteri yang dapat dikulturkan telah diperkaya pada medium LA. Lebih sedikitnya jumlah TRF hasil analisis T-RFLP tanpa pengkulturan dapat disebabkan bakteri yang terdapat pada fruktosfer kelapa sawit yang digunakan jumlahnya sedikit, sehingga ketika dilakukan purifikasi, DNA yang jumlahnya sedikit tersebut ikut terbuang. Selain itu hal tersebut dapat terjadi jika bakteri yang terdapat pada fruktosfer kelapa sawit yang digunakan berada dalam kondisi dorman/membentuk spora sehingga isolasi DNA yang dilakukan tidak berhasil memecah sel. Berdasarkan Pelczar dan Chan (1986), mereka menyatakan bahwa spora tahan terhadap banyak bahan fisik dan kimia. Untuk itu perlu dilakukan kombinasi Isolasi DNA, yaitu secara fisik, kimiawi, maupun enzimatik. Apabila dibandingkan dengan hasil analisis T-RFLP tanpa pengkulturan maka terdapat TRF yang berukuran sama, yaitu TRF dengan ukuran 210 bp dan 389 bp. Dimana kemungkinan bakteri dengan ukuran TRF 210 bp adalah Aeromonas sp., Aliivibrio sp., Listonella sp., dan Stenotrophomonas sp..
SIMPULAN Untuk mendapatkan hasil analisis T-RFLP yang konsisten diperlukan metode isolasi DNA yang baik. Berdasarkan hasil analisis TRFLP diperoleh 7 TRF hasil digesti menggunakan enzim BstUI, dimana bakteri yang diduga terdapat pada fruktosfer kelapa sawit antara lain Bacillus sp., Enterobacter sp., Pseudomonas sp., dan Stenotrophomonas sp.. Bakteri terduga tersebut mewakili kelompok bakteri gram-positif dan gramnegatif, proteobacteria, actinobacteria, bakteri tanah, bakteri perairan, dan bakteri yang tidak dapat dikulturkan.
SARAN Berdasarkan Analisis T-RFLP yang dilakukan diperoleh kemungkinan nama bakteri yang masih cukup banyak. Untuk memastikan jenis bakteri tersebut maka perlu dilakukan analisis lanjutan menggunakan teknik Amplified Ribosomonal DNA Restriction Analysis (ARDRA) dan dilakukan sekuensing untuk mendapatkan identitas bakteri secara pasti.
DAFTAR PUSTAKA Bacon CW, Hinton DM. 2006. Bacterial Endophytes: The endophytic niche, its occupants, and its utility. In Samuel SG, editor. Plant-Associated Bacteria. Netherlands: Springer; page 155-194. Badan Pusat Statistik. 2008. Produksi perkebunan besar menurut jenis tanaman, Indonesia (Ton), 1995 – 2008. Beattie GA. 2006. Plant Associated Bacteria: Survey, Molecular phylogeny, genomics and recent advances. In Samuel SG, editor. Plant-Associated Bacteria. Netherlands: Springer; page 1-56. Buckley D, Schmidt TM. 2003. Diversity and dynamics of microbial communities in soils from agro-ecosystems. Environ Microbiol 5: 441-452. Campbell R. 1985. Plant Microbiology.Edward Arnold, London. Costello E et al. 2009. Bacterial community in human habitats across space and time. Report. Science express. Dharmawan IWE, Kawuri R, Parwanayoni MS. 2009. Isolasi Streptomyces spp. pada kawasan hutan provinsi Bali Serta uji daya hambatnya terhadap lima strain diarrheagenic Escherichia coli. J Biol. XIII (1) : 1 – 6.
Engebretson JJ, Moyer CL. 2003. Fidelity of select restriction endonucleases in determining microbial diversity by terminal-restriction fragment length polymorphism. Appl Environ Microbiol 69: 4823-4829. Faparusi SI. 1974. Microorganisms from oil palm tree tap holes. J Food Scienc. 39: 755-757. Fandy. 2006. Isolasi Bakteri endofit penghasil lipase pada buah sawit serta karakterisasi pH dan suhu enzim [skripsi]. Jakarta : Fakultas Teknobiologi, Universitas Katolik Indonesia Atmajaya. Lindow S, Brandl MT. 2003. Microbiology of the phyllosphere. Minirev. Appl Environ Microbiol 69: 1875-1883. Liu WT, Marsh TL, Cheng H, Forney LJ. 1997. Characterization of Microbal Diversity by Determining Terminal Restriction Fragmenth Length Polymorphism of Genes Encoding 16s rRNA. App Environ Microbiol 63: 45164522. Moeseneder MM, Arrieta JM, Muyzer G, Winter C, Herndl GJ. 1999. Optimization of terminal-restriction length polimorphism analysis for complex marine bacterioplankton communities and comparison with denaturing gradient gel electrophoresis. Appl Environ Microbiol 65:3518-3525. Muyzer G. 1998. Structure, function and dynamics of microbial communities: The molecular biological approach. Di dalam: Carvallo GR, editor. Advances in Molecular Ecology. IOS Press. Sapak Z, Meon S, Ahmad ZAM. 2008. Effect of endophytic bacteria on growth and suppression of Ganoderma infection in oil palm. Int J Agri Biol 10: 127-132. Shyu C , Soule T , Bent SJ , Foster JA , Forney LJ . 2007. MiCA: a web-based tool for the analysis of microbial communities based on terminal-restriction fragment length polymorphisms of 16S and 18S rRNA genes. J Microbiol Ecol 53:562570. Yogiara. 2004. Analisis komunitas bakteri kantung semar (Nepenthes spp.) menggunaakan teknik terminal restriction fragment lenght polymorphism (T-RFLP) dan amplified ribosomal DNA restriction analysis (ARDRA) [tesis]. Bogor : Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor.
Zidan WFH, Samir MR, Hussein E, Moawad KZ, Said MB. 2005. Extraction of microbial community DNA from soil for Polymerase Chain Reaction. ASTF : 113.
LAMPIRAN
Lampiran 1 Konsentrasi dan kemurnian rendemen DNA hasil isolasi DNA genom bakteri fruktosfer kelapa sawit menggunakan 3 metode yang berbeda Nama
Konsentrasi (ng/µl)
A260/280
A260/230
FR.A (CTAB) FR.B (ZR) Fr.C (WZ)
196.05 ± 78.84 52.50 ± 0.42 102.06 ± 62.09
1.06 ± 0.02 0.90 ± 0.03 1.98 ± 0.13
0.32 ± 0.02 0.86 ± 0.04 1.16 ± 0.30
Intensitas pendaran (unit fluoresen)
Lampiran 2 Analisis T-RFLP komunitas bakteri fruktosfer kelapa sawit yang diisolasi menggunakan WZ dan didigesti menggunakan enzim restriksi BstUI, MspI, DdeI, dan Sau96I.
210 pb
58 pb
BstUI
389 pb 385 pb 348 pb
96 pb
177 pb
244 pb
397 pb 517pb
Intensitas pendaran (unit fluoresen)
Ukuran panjang TRF (Pb)
460 pb
67 pb
487 pb 75 pb
489 pb
MspI
247 pb 485 pb
71 pb 87 pb
314 pb 205 pb
303 pb
388 pb
Ukuran panjang TRF (Pb)
Intensitas pendaran (unit fluoresen)
DdeI 169 pb
287 pb
Intensitas pendaran (unit fluoresen)
Ukuran panjang TRF (Pb)
Sau96I
196 pb 191 pb 187 pb
241 pb 249 pb 255 pb Ukuran panjang TRF (Pb)
600 pb
Lampiran 3 Prediksi genus bakteri fruktosfer kelapa sawit hasil isolasi dengan WZ dan didigesti menggunakan enzim BstUI, MspI, DdeI dan Sau96I Ukuran TRF Nama genus terduga (kelimpahan) Blastochloris sp. ; Crucihimalaya sp. ; Holophaga sp. ; Loktanella sp.; 96 (2.6%) marine bacterium ; Paracoccus sp. ; Pelagibaca sp. ; Rhodobacter sp. ; Rhodocyclus sp. ; Rhodovulum sp. ; Roseobacter sp. ; Roseovarius sp. ; Ruegeria sp. ; Salipiger sp. ; unculture bacteria. 177 (1.05%)
210 (8.99%)
244 (2.05%)
385 (6.16%)
389 (76.7%)
517 (2.44%)
Photorhabdus sp. ; Streptomyces sp. ; unculture bacteria. Acetobacter sp. ; Aeromonas sp. ; Alicycliphilus sp. ; Alicyclobacillus sp. ; Aliivibrio sp. ; α-proteobacterium ; Aquamonas sp. Azospira sp. ; Barophile sp.; Brachymonas sp. ; Burkholderia sp. ; Colwellia sp. ; Curvibacter sp. ; Dechlorosoma sp. ; Dyella sp. ; Frateuria sp. ; Haemophilus sp. ; Listonella sp. ; Luteibacter sp. ; Lysobacter sp. ; Methylocaldum sp. ; Morganella sp.; Moritella sp. ; Oceanimonas sp. ; Oceanisphaera sp. ; Petrobacter sp.; Photorhabdus sp. ; Pseudoalteromonas sp. ; Rhodanobacter sp. ; Rhodoferax sp. Stenotrophomonas sp. ; Thauera sp. ; Thermomonas sp. ; Tolumonas sp. Voriovorax sp. ; Verminephrobacter sp. ; Xanthomonas sp. ; Zoobella sp. ; unculture bacteria. Carnobacterium sp. ; Enterococcus sp. ; Vagococcus sp. ; unculture bacteria. Acidovorax sp. ; Acinetobacter sp. ; agricultural soil bacterium ; Aquitalea sp. ; Azotobacter sp. ; Azovibrio sp. ; beta proteobacterium ; Cellvibrio sp. ; Comamonas sp. ; Flavobacterium sp. ; gamma proteobacterium ; Kingella sp. ; Lampropedia sp. ; Massilia sp. ; Methylophaga sp. ; Methylophilus sp. ; Planctomyces sp. ; Propionivibrio sp. ; proteobacterium ; Rhodocyclus sp. ; Salinimonas sp. ; Thiobacillus sp. ; Vestimentiferan sp. ; Zoogloea sp. ; unculture bacteria. Achromobacter sp.; Alkanindiges sp. ; Aminomonas sp. ; Aranicola sp. ; Arcanobacterium sp. ; Bacillus sp. ; Beggiatoa sp. ; Buchnera sp. ; Cedecea sp. ; Citrobacter sp. ; Cronobacter sp. ; Edwardsiella sp.; Eikenella sp.; Enterobacter sp. ; Erwinia sp. ; Escherichia sp. ; Ewingella sp. ; Grimontella sp. ; Hafnia sp. ; Halomonas sp. ; Klebsiella sp. ; Kluyvera sp. ; Leclercia sp. ; Luteimonas sp. ; Marinobacter sp.; Methylobacillus sp. ; Neisseria sp. ; Pantoea sp. ; Pectobacterium sp. ; Proteus sp. ; Providencia sp. ; Pseudidiomarina sp. ; Pseudomonas sp. ; Rahnella sp. ; Raoultella sp.; Salmonella sp. ; Samsonia sp. ; Schineria sp. ; Serratia sp. ; Shewanella sp. ; Shigella sp. ; Sodalis sp. ; swine manure bacterium ; Tatumella sp. ; Tiedjeia sp. ; Vibrio sp. ; Xenorhabdus sp. ; Xylella sp. ; Yersinia sp. ; unculture bacteria. Arsenophonus sp. ; unculture bacteria.
Intensitas pendaran (unit fluoresen)
Lampiran 4 Analisis T-RFLP komunitas bakteri fruktosfer kelapa sawit dengan metode pengkulturan dan didigesti menggunakan enzim restriksi BstUI, MspI, DdeI, dan Sau96I. 52 pb
229 pb
210 pb
69 pb 93 pb
389 pb
BstUI
395 pb
224 pb 142 pb 165 pb
234 pb 298 pb 334 pb
495 pb
Intensitas pendaran (unit fluoresen)
Ukuran panjang TRF (pb)
168 pb
285 pb
DdeI
290 pb
251 pb 248 pb
Intensitas pendaran (unit fluoresen)
Ukuran panjang TRF (pb)
450 pb
65 pb 62 pb
MspI 460 pb
203 pb 395 pb
490 pb
310 pb 123 pb 164 pb
367 pb
Intensitas pendaran (unit fluoresen)
Ukuran panjang TRF (pb)
205 pb
326 pb
Sau96I 579 pb
90 pb
223 pb 322 pb 255 pb 288 pb
Ukuran panjang TRF (pb)
601 pb 573 pb
