ANALISIS SIDIK DNA (DNA Fingerprinting) RFLP (Restriction Fragmen Length Polymorphism) Laurencius Sihotang I.
II.
Tujuan Mempelajari cara teknik RFLP(Restriction Fragmen Length Polymorphism) Menganalisis pola pita DNA dengan tehnik RFLP
Kajian Pustaka RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) adalah sebuah metode yang digunakan oleh ahli biologi molekuler untuk mengikuti urutan tertentu DNA seperti yang disampaikan kepada sel-sel lain Sebuah RFLP adalah urutan DNA yang memiliki pembatasan situs pada setiap ujungnya dengan "target" urutan di antara keduanya. Dalam analisis RFLP, genomik DNA yang dipotong dengan enzim restriksi dipisahkan melalui gel elektroforesis. Dasar dari transfer DNA dari gel ke pensupport yang lebih solid adalah untuk mengawetkan posisi fragmen DNA dan menyebabkan hibridisasi dapat dilakukan. Restriction Fragment Length polymorphism (RFLP) merupakan penanda molekul yang pertama kali ditemukan dan digunakan. Penggunaannya dimungkinkan semenjak orang menemukan enzim endonuklease restriksi (RE), suatu kelas enzim yang mampu mengenal dan memotong seurutan pendek basa DNA (biasanya 4-6 urutan basa). Enzim ini dihasilkan oleh bakteri dan dinamakan menurut spesies bakteri yang menghasilkannya. Contoh:
EcoR I adalah enzim RE yang dihasilkan dari bakteri Escherichia coli strain R I (baca: R satu). Pada DNA utas ganda, sekuens GAATTC ini akan berpasangan dengan sekuens yang sama tetapi berlawanan arah. Enzim EcoRI ini memotong setiap utas dari utas ganda tersebut pada bagian anatara G dan A. Sebagai akibatnya, potongan-potongan atau fragmen-fragmen DNA utas ganda yang dihasilkan akan memliki ujung berutas tunggal. Ujung seperti ini yang dikenal dengan istilah sticky ends atau cohesive ends.
BamH I diperoleh dari bakteri Bacillus americanus strain H I (H satu). Struktur enzim restriksi BamHI yang mengikat DNA. Enzim tersebut mengenali double strand dari DNA dengan sekuens spesifik 5′-GGATCC-3′, yang selanjutnya memecah ikatan fosfodiester antara dua residu G. Hasilnya adalah berupa dua fragmen yang ujungnya sticky ends. Pada gambar tersebut warna hijau dan biru menunjukkan subunit protein dimer yang identik Deteksi RFLP dilakukan berdasarkan pada adanya kemungkinan untuk
membandingkan profil pita-pita yang di hasilkan setelah di lakukan pemotongan dengan enzim restriksi terhadap DNA target atau dari individu yang berbeda. Berbagai mutasi yang terjadi pada suatu organisme mempengaruhi molekul DNA dengan berbagai cara, menghasilkan fragmen-fragmen dengan panjang yang berbeda. Aplikasi tekhnik RFLP biasa di gunakan untuk mendeteksi diversitas genetik, hubungan kekerabatan,sejarah domestikasi,asal dan evolusi suatu spesies, genetik drift dan seleksi, pemetaan keseluruhan genom, tagging gen, mengisolasi gen-gen yang berguna dari spesies liar, mengkonstruksi perpustakaan DNA. Analisis pola restriction fragment dihasilkan ketika DNA dicerna oleh enzim restriksi. Praktek dalam aplikasi analisis restriction fragment didasari dari fakta bahwa tidak ada dua orang atau lebih yang kembar identik mempunyai sekuens basa DNA yang persis. Walaupun perbedaan sekuens DNA diantara dua orang cukup kecil, tetapi terdapat perubahan panjang III.
Alat dan Bahan Alat Pipet mikro, tabung mikro, tips mikro, alat elektroforesis vertical, transimulator UV, alat pemasok daya, dan sarung tangan Bahan Sampel DNA, kit PCR mix, oligonukleotida primer, deoksinukleotida fosfat, enzim polymerase
IV.
Cara Kerja Gel dikeluarkan dari paket dan cabut sisir gel, gel diletakkan kedalam tangki elektroforesis dengan posisi yang benar. Secara perlahan buffer diisi kedalam tangki elektroforesis dan isi hasil PCR dari setiap tabung sampel ke dalam sumur gel. Lalu tabung elektroforesis ditutup dan beri aliran listrik. Setelah itu, mengamati sampel yang akan bermigrasi dalam gel menuju elektroda merah, kemudian listrik dimatikan ketika pewarna loading telah mendekati akhir gel dan lepaskan power supply. Tutup
V.
elektroforesis dilepas dan tunggu kira-kira 10 detik. Dengan menggunakan sarung tangan gel yang ada didalam tangki elektroforesis akan dipindahkan keatas transiluminator UV lalu mengamati gel tersebut. Hasil Pengamatan Formulasi yang diberikan saat RFLP: MspI = 2µL 10 x T.Buffer = 2µL 0,1 % BSA = 2µL DNA Template = 5µL H2O = 9 µL + Jumlah = 20µL
Karena kita punya sampel 17, maka semuanya dikalikan 17.
Catatan : Diinkubasi 370 C selama 1 jam BSA : Bovaine Serum Albumin Setelah selesai di inkubasi, dilakukan elektroforesis dan diperoleh hasil seperti berikut: Sumur Gel
No. Sampel DNA
Deteksi DNA
1
Marker
2
1
-
3
3
-
4
4
-
5
5
-
6
7
-
7
8
-
8
9
-
9
10
-
10
11
-
11
12
-
12
13
-
13
14
-
14
15
-
15
Kontrol positif
+
Tabel 6. Hasil Elektroforesis RFLP Keterangan: Agarose sebanyak 2 % Waktu : 20 menit Daya : 90 volt DNA yang diambil sebanyak 4,3 μL dan marker sebanyak 1 μL
Gambar 6. DNA Hasil PCR yang di RFLP *ket: urutan sumur gel adalah nomor 1 dimulai dari bawah ke atas nomor 2 dan seterusnya VI.
Pembahasan Analisis Restriction fragment length polymorphism (RFLP) adalah salah satu teknik pertama yang secara luas digunakan untuk mendeteksi variasi pada tingkat sekuen DNA. Deteksi RFLP dilakukan berdasar pada adanya kemungkinan untuk membandingkan profil pita-pita yang dihasilkan setelah dilakukan pemotongan dengan enzim restriksi terhadap DNA target/dari individu yang berbeda. Meskipun gen dalam keadaan normal bersifat stabil, akan tetapi dalam menghadapi perubahan lingkungan, gen dapat bersifat sensitif atau rentan sehingga dapat menimbulkan mutasi pada urutan basa nukleotidanya. Berbagai mutasi yang terjadi pada suatu organisma
mempengaruhi molekul DNA dengan berbagai cara, menghasilkan
fragmen-fragmen dengan panjang yang berbeda. Perbedaan panjang fragmen ini dapat dilihat setelah dilakukan elektroforesis pada gel, hibridisasi dan visualisasi.
Gen ALAD (asam Amino Levulinat heme) terletak di kromosom 9q34130 pada urutan nomor 1161148591 bp (base pairs) sampai dengan 116163617 bp. ALAD 1-1, 1-2, dan 2-2, adalah tiga isozym yang berasal dari dua macam aIel yaitu ALAD 1 dan ALAD2. Keberadaan gen ALAD polimorfik, patogenesis toksisitas Pb telah mengimplikasikan bahwa secara genetik sangat potensial untuk menyebabkan terjadinya perbedaan suseptabilitas terhadap Pb. Sintesis heme berasal dari molekul suksinil-KoA, hasil siklus asam sitrat di mitokondria dan asam amino glisin. Produk reaksi penggabungan antara suksinil-KoA dan glisinadalah asam α-amino-βketoadipat, yang selanjutnya diderkaboksilasi untuk membentuk α- aminolevulinat (ALA) melalui enzim ALA sintase. ALA Dehidratase merupakan suatu enzim yang mengandung seng (Zn) dan peka terhadap inhibisi oleh plumbum(Pb), seperti yang dapat terjadi pada keracunan plumbum di lingkungan. Penyebab polimorfisme pada protein enzim ALAD adalah karena adanya transversion
dari G- ke –C pada
nukleotida yang ada dalam region kodon 59 sehingga menyebabkan terjadinya substitusi asam amino lisin oleh asparagin. Adanya substitusi ini akan menyebabkan terjadinya perbedaan afinitas Pb terhadap gen polimorfik tersebut. Setelah melakukan elektroforesis terhadap sampel yang sudaag di uji dengan RFLP, tidak ada gen yang terdeteksi. Sehingga tidak dapat diamati pada sampel gtersebut, apakah ada perubahan gen atau tidak. Hal ini mungkin terjadi dimana kasus seperti di awal, dapat seperti itu karena faktor kesalahan prosedur saat isolasi genom karena praktikan kurang terbiasa dengan praktikum mikro. Selain itu, hasil elektroforses saat PCR juga tampak negatif, sehingga jika pada saat RFLP juga negatif merupakan hal yang wajar. Praktikan ini tidak memungkinkan diulang kembali karena keterbatasan waktu.
VII.
Kesimpulan Gen ALAD pada manusia terdapat pada kromosom 9 lengan q, jika terpapar Pb dapat mengakibatkan polimorfisme. Dari hasil yang diuji, tidak dapat dipastikan apakah ada yang terkena Pb karena hasil elektroforesis negatif.
Daftar Acuan
Brown, S.M., Hay, J.G., Ostrer, H. 2009. Essentials of Medical Genomics. Second ed. John Wiley & Sons, Inc. New Jersey, USA. Campbell, A. N. J. B. Reece & L. G. Michell. 2012. Biologi. Edisi 8 jilid 1. terj. Erlangga. Jakarta Cohn Robert m., Roth Karl s. 1996. Biochemistry and Disease. William and Wilkins, Inc. Maryland Jamilah. 2005. Pengaruh pemberian macam deterjen, penambahan enzim dan ekstrak nanasterhadap hasil isolasi DNA berbagai macam buah. Universitas Negeri malang. Malang McPherson, M.J., Moller, S.G. 2006. PCR. Second ed. Taylor & Francis Group. Madison Avenue, NY, US. Theophilus, B.D.M. 2008. Principles and Medical Applications of the Polymerase Chain Reaction. In: Molecular Biomethods Handbook Second Edition. Ed: Walker, J.M., Rapley, R. Humana Press, NJ, USA.
