Analýza DNA
Co zjišťujeme u DNA Genetickou podstatu konkrétních proteinů Mutace – bodové (sekvenční delece nebo inzerce nukleotidů, záměny), chromosomové aberace (numerické, strukturní) Polymorfismy – konkrétní mutace, které se vyskytují v populaci s frekvencí vyšší než 1% Podobnost DNA mezi druhy Vlastnosti - koncentraci, čistotu, chemické vazby s proteiny, funkci …
ACGGTCGACTGCGATGAACTCCC ACGGTCGACTGCGATCAACTCCC ACGGTCGACTGCGATTTGAACTCCC
1
DNA
izolace detekce DNA specifické analýzy DNA struktury hlavní metody pro práci s DNA: PCR sekvenace RFLP DNA blotting DNA hybridizace cDNA
PCR – polymerase chain reaction
Nobelova cena za její objev v roce 1984
obdoba DNA replikace, která se odehrává v buňkách
amplifikace (zmnožení) vybraných úseků DNA
u oblasti, kterou se snažíme amplifikovat musíme znát sekvenci koncových částí
cyklické střídání těchto teplotních kroků: denaturace – dvoušroubovice se oddělí na jednotlivá vlákna (teplota; chemická činidla) annealing (anýlink) – ke 3' koncům vybraného úseku denaturované DNA se naváží primery (oligonukleotidy – jednovláknové řetězce; cca 20bp ) elongace – prodloužení primeru (Taq polymerasa / cca 70oC) vkládáním jednotlivých dNTP (A,G,C,T) na základě komplementarity k templátové DNA
3´ 5´
5´ 3´
primer
2
PCR
Princip PCR Teplotní denaturace
Annealing primerů
Elongace
Teplotní denaturace
Annealing primerů
Elongace
3
PRINCIP METODY PCR
1. CYKLUS
5´ 3´
3´ 5´
5´
3´
3´
5´
5´
3´
3´
5´
5´ 3´ 5´ 3´
3´ 5´ 3´ 5´
(1 MOLEKULA) DENATURACE
PRIMERY
Taq POLYMERÁZA
(2 MOLEKULY) DENATURACE PRIMERY
2. CYKLUS
Taq POLYMERÁZA
(4 MOLEKULY)
3. CYKLUS
DENATURACE PRIMERY Taq POLYMERÁZA
4. CYKLUS
(16 MOLEKUL)
5. CYKLUS
(32 MOLEKUL)
(8 MOLEKUL)
PCR v reakci: templát (DNA), Taqpolymeráza (teplotně stabilní), primery, dNTP (jednotlivé nukleotidy) a vhodný pufr (Mn2+) z jednoho cílového lokusu pro dané primery vznikne po 1 cyklu denaturace, annealingu a elongace vždy dvojnásobek DNA fragmentů (velikost fragmentu je dána primery) možno vyjádřit matematicky 2n – kde n je počet cyklů
Kolik bude DNA fragmentů po 8 PCR cyklech?
28= 256
4
Elektroforéza metoda, která slouží k rozdělení amplifikovaných DNA fragmentů o nestejné délce DNA má celkově slabě negativní náboj a v elektrickém poli putuje ke kladné elektrodě rychlost putování je závislá na její celkové délce gel (agaróza, polyakrylamid) je ponořen do vhodného pufru mezi elektrody v gelu u záporné elektrody jsou jamky, pro vzorky DNA jednosměrný elektrický proud po čase se fragmenty rozdílných délek rozdělí vizualizace fragmentů např. ethidiumbromidem (interkalačního činidla), svítí v UV světle
Sekvenace - Sangerova metoda
Zjištění konkrétní sekvence vybraného úseku DNA řetězce Sekvenační PCR - řetězce všech možných velikostí Fragmenty (řetězce) mají rozlišení ve své délce i o jeden nukleotid Sangerova metoda - chemicky modifikované dNTP (deoxyribonukleosidtrifosfátů) na ddNTP (dideoxyribonukleosidtrifosfáty), které postrádají 3'-OH skupinu; za ddNTP si při elongaci už nemůže přisednout žádný normální nukleotid a dojde tedy k terminaci elongace
Pro sekvenaci (sekvenační PCR reakce): a) zkoumaný fragment DNA, b) primer pro jedno vlákno DNA, c) pufr, d) polymeráza a e) mix normálních dNTP a f) odlišně fluorescenčně značených ddNTP (detekce laserem) Elektroforetická detekce (rozlišení fragmentů v gelu) - sekvenace ve 4 reakčních směsích (ddATP; ddTTP; ddCTP; ddGTP); obvykle bývá radioaktivně značený primer,
5
3'
5'
5'
*
Analyzovaná DNA (jednovláknová)
3'
Značený primer
DNA-polymerasa, primer, nukleotidy - rozdělení do čtyř zkumavek. Přidány jednotlivé ddNTP: ddATP, ddCTP, ddGTP, ddTTP PCR syntéza komplementárního vlákna (značeno barevně pro jednotlivé ddNTP) ve směru 5'→3'
* * *
A
* C A
C
* A
* G
*
C
*
G
*
*
G
*
T T
*
T
Elektroforéza A
C
G
T
-
+ Výsledná sekvence na syntetizovaném vlákně:
5'- C T A G T A G G T C C A - 3' Sekvence analyzované DNA (komplementarita párování basí):
3'- G A T C A T C C A G G T - 5'
Sekvenace - Sanger AAGTCCGATCGTTAGCTTCCGAATTGCATGGCAACTGCAGATCGATGCAAGTGCCGATC TTCAGGCTAGCAATCGAAGGCTTAACGTACCGTTGACGTCTAGCTACGTTCACGGCTAG začne probíhat sekvenační PCR s mixem dNTP a fluoresčenčně značenými ddNTP AAGTCCGATCGTTAGCTTC AAGTCCGATCGTTAGCTTCC AAGTCCGATCGTTAGCTTCCG AAGTCCGATCGTTAGCTTCCGA AAGTCCGATCGTTAGCTTCCGAA AAGTCCGATCGTTAGCTTCCGAAT AAGTCCGATCGTTAGCTTCCGAATT AAGTCCGATCGTTAGCTTCCGAATTG AAGTCCGATCGTTAGCTTCCGAATTGC nejkratší fragment ve schématu bude svítit červenou barvou a nejdelší také červenou
speciální elektroforéza s laserovou detekcí fluorescenčně barvených ddNTP
6
Restrikční endonukleázy - restriktázy Enzymy, které štípou dvouvláknovou molekulu DNA uvnitř řetězce a to vždy v konkrétní pozici, charakteristické pro danou restriktázu (restrikční místo) např. Eco R1 – restriktáza izolovaná z Escherichia coli, která specificky štípe v sekvenci G^AATTC
AATGCTAATGCCTAGTCAAGCTTTCATCGAGAATTCCAGTCGAA TTAGCTTTACGGATCAGTTCGAAAGTAGCTCTTAAGGTCAGCTT
AATGCTAATGCCTAGTCAAGCTTTCATCGAG TTAGCTTTACGGATCAGTTCGAAAGTAGCTCTTAA
AATTCCAGTCGAA GGTCAGCTT
Identifikace restrikčních míst Na uvedeném vlákně najděte restrikční místa pro nabídnuté enzymy
restrikční místo Alu I
AG / CT
Sau 3AI
/ GTAC
Msp I
C / CGG
5´G.G.G.C.G.T.A.C.A.T.A.G.C.T.A.A.T.G.G.C.A.A.G.C.T.A.T.G.G.T. 3´
8
7
RFLP – restriction fragment length polymorphism charakteristické fragmenty pro každého jedince po naštípání celkové DNA restriktázami jednotlivé cílové sekvence vybraných restriktáz mohou být mutovány, nebo v rámci jiných delecí/inzercí posunuty (variabilita restrikčních míst) každý člověk má proto charakterictické rozložení restrikčních míst pro určitou restriktázu (restrikční mapy) Mendelovská dědičnost délky restrikčních fragmentů EcoRI – štípání fragmentů 2 jedinců 5'AGAATTCGCCGATCGATCGATCGATCGATCGATCGATCGATTGAGCTCGAATTCC3'
5'
AGAATTCGCCGATCGATCGATCGATCGATCGATCGATCGATCGATTGAGCTCGAATTCC3'
na elektroforéze bude mít druhý jedinec delší fragment
RFLP – restriction fragment length polymorphism
8
Southern-blotting (jméno po objeviteli metody) Umožňuje z velkého množství fragmentů (např. po štěpení celkové DNA restrikčními endonukleázami) specificky detekovat DNA fragment V doslovném překladu pijákování – tzn. nasátí PCR produktů z elektroforetického gelu na membránu (nylonovou) a jejich následná analýza Hybridizace = spojení dvou jednovláknových DNA (vzorek + sonda) podle pravidla komplementarity Gel se denaturuje v chemickém činidle – tím se denaturuje i dvouvláknová DNA a na membránu jsou blottována jen jednořetězcová vlákna a to v takovém uspořádání, v jakém byla na elektroforetickém gelu Následuje hybridizace s radioaktivně značenou próbou – membrána je ponořena do roztoku s jednovláknovým radioaktivně značeným řetězcem DNA Na základě komplementarity basí buď dojde/nedojde k hybridizaci Nenavázaná próba je odmyta – V případě úspěšné hybridizace „svítí“ na membráně fragment s navázanou sondou
Southern - blotting
9
Southern blot – hybridizace sondy
DNA
Sonda
Zahřátí (denaturace) Ochlazení (renaturace)
12
PAH gen Fenylketonurie defekt genu pro fenylalaninhydroxylázu (PAH) – AR onemocnění PAH – 13 exonů mnoho mutací (více než 400 známých v roce 2000) • Mutace - např. delece v 2. exonu;
detekce systémem restrikční endonukleázy (viz obrázek)
Při negativním výsledku vyšetření jednoho exonu vyšetření mutací v dalších exonech
10
RFLP metoda Autosomálně recesivní onemocnění (např. cystická fibróza, fenylketonurie)
Vyšetření je informativní Druhá dcera má genotyp Aa
RFLP – prenatální vyšetření Fenylketonurie - AR A)
B)
Vyšetření je informativní Plod heterozygot - zdravý
11
RFLP metoda Polycystická choroba ledvin - AD Vyšetření je informativní Prenatální diagnostika - genotyp aa
RFLP metoda GR onemocnění – hemofilie (obdobné pro barvoslepost)
Dcera zdravá Genotyp X+Xh Přenašečka
?
12
Polymorfismy lidské DNA - vazebná analýza v přímé a nepřímé diagnostice
Mikrosatelity (syn. krátké tandemové repetice) STR…short tandem repeats, SSR…simple sequence repeats
TAGCCATCGGTACACACACACACACACAGTGCTTCAGTAGC TAGCCATCGGTACACACACACACAGTGCTTCAGTAGCGTAG Pokud se detekovatelný polymorfismus nachází dostatečně blízko lokusu, ve kterém se vyskytuje kauzální mutace pro sledovanou chorobu, bude možné jej využít i bez znalosti molekulární podstaty daného onemocnění: → vazba polymorfismu s mutovanou alelou. V závislosti na frekvenci crossing-overu bude současně s mutací předáván z rodičů na potomky → kosegregace markeru s mutovanou alelou. 3
Nondisjunkce u Downova syndromu
Tři rodokmeny rodin s dětmi postiženými Downovým syndromem (prostá trisomie). Výsledek analýzy DNA – tetranukleotidového polymorfismu na chromozómu 21 - je znázorněn pod rodokmeny. Od kterého z rodičů zdědilo dítě třetí kopii chromozómu 21? V kterém meiotickém dělení došlo k nondisjunkci? 1
13
Nondisjunkce u Downova syndromu
?
Meióza I u otce nebo u matky 2
Nondisjunkce u Downova syndromu
?
Meióza I u otce nebo u matky
Meióza I u matky 3
14
Nondisjunkce u Downova syndromu
?
Meióza I u otce nebo u matky
Meióza I u matky
Meióza II u matky 4
Polymorfismy lidské DNA využívané v přímé a nepřímé diagnostice
Jednonukleotidové polymorfismy (single nucleotide polymorphisms – SNP) SNP C/A TAGCCATCGGTA N GTACTCAATGATCAGCT G C T A 1
15
Polymorfismy lidské DNA využívané ve vazebné analýze, přímé a nepřímé diagnostice
Jednonukleotidové polymorfismy (single nucleotide polymorphisms – SNP) V 99.9% sekvence DNA se lidé od sebe vzájemně neliší. Ze zbývajícího 0.1% rozdílu tvoří SNP přes 80%. Projekt lidského genomu nyní pokračuje mj. ve formě identifikace miliónů SNP, které jsou shromažďovány ve veřejně přístupných databázích. Možnost typizace mnoha set tisíc SNP v jednom vzorku pomocí DNA čipů by měla usnadnit identifikaci alel, zodpovědných za řadu onemocnění vyskytujících se v určité populaci.
2
DNA čipy - microarrays Moderní metoda analýzy DNA v několika lokusech současně Měření exprese genů, polymorfismus SNP, mutace atp. Genové čipy obsahují velké množství sond (tisíce), které hybridizují s různými oblastmi genomu Využívá hybridizace Nanotechnologie – manipulace se vzorky probíhá převážně roboticky a vyhodnocení je softwarové
16
