Analýza DNA
Co zjišťujeme u DNA Genetickou podstatu konkrétních proteinů Mutace – bodové (sekvenční delece nebo inzerce nukleotidů), chromosomové aberace (numerické, strukturální) Polymorfismy – konkrétní mutace, které se vyskytují v populaci s frekvencí vyšší než 1% Podobnost DNA mezi druhy Vlastnosti - koncentraci, čistotu, chemické vazby s proteiny, funkci …
ACGGTCGACTGCGATGAACTCCC ACGGTCGACTGCGATCAACTCCC ACGGTCGACTGCGATTTGAACTCCC
DNA
Izolace Detekce DNA Specifické analýzy DNA struktury Hlavní metody pro práci s DNA: PCR sekvenace RFLP DNA hybridizace - blotting
Biologický materiál pro izolaci DNA
Teoreticky z jakéhokoliv dostupného biologického materiálu (s jádrem)
Izolace DNA Specifické postupy pro získání molekul DNA v takové čistotě a koncentraci, aby mohly být dále analyzovány běžně dostupnými molekulárně biologickými metodami
Mutace v sekvencích
ACGGTCGACTGCGATGAACTCCC ACGGTCGACTGCGATCAACTCCC ACGGTCGACTGCGATTTGAACTCCC ACGGTCGACTGCGATACTCCC
Normální sekvence Jednobodová záměna (SNP) Inzerce TT Delece GA (7. a 8. odzadu)
PCR – polymerase chain reaction
Nobelova cena za její objev v roce 1984
Obdoba DNA replikace, která se odehrává v buňkách
Amplifikace (zmnožení) vybraných úseků DNA
U oblasti, kterou se snažíme amplifikovat musíme znát sekvenci koncových částí 3´
Cyklické střídání teplotních kroků
Denaturace – dvoušroubovice se oddělí na jednotlivá vlákna (teplota; chemická činidla) Annealing (anýlink) – navázání primerů ke koncové oblasti vybraného úseku (oligonukleotidy – jednovláknové řetězce; cca 20bp ) Elongace – prodloužení primeru vkládáním jednotlivých dNTP (A,G,C,T) na základě komplementarity k templátové DNA
3´
5´
5´
3´
primer
Princip PCR Teplotní denaturace
Annealing primerů
Elongace
Teplotní denaturace
Annealing primerů
Elongace
PRINCIP METODY PCR
1. CYKLUS
5´ 3´
3´ 5´
5´
3´
3´
5´
(1 MOLEKULA) DENATURACE
PRIMERY 5´
3´
3´
5´ Taq POLYMERÁZA
5´ 3´ 5´ 3´
3´ 5´ 3´ 5´
(2 MOLEKULY) DENATURACE PRIMERY
2. CYKLUS
Taq POLYMERÁZA
(4 MOLEKULY)
3. CYKLUS
DENATURACE PRIMERY Taq POLYMERÁZA
(8 MOLEKUL) 4. CYKLUS
(16 MOLEKUL)
5. CYKLUS
(32 MOLEKUL)
PCR V reakci: templát (DNA), Taqpolymerasa (teplotně stabilní), primery, dNTP (jednotlivé dideoxynukleotidy) a vhodný pufr Z jednoho cílového úseku DNA (určený primery) vznikne po 1 cyklu denaturace, annealingu a elongace vždy dvojnásobek DNA fragmentů (velikost fragmentu je dána primery) Možno vyjádřit matematicky 2n – kde n je počet cyklů
Kolik bude DNA fragmentů po 8 PCR cyklech?
28= 256
Elektroforéza Metoda, která slouží k rozdělení DNA fragmentů o nestejné délce DNA má celkově slabě negativní náboj a v elektrickém poli putuje ke kladné elektrodě Rychlost putování je závislá na její celkové délce Gel (agaróza, polyakrylamid) je ponořen do vhodného pufru mezi elektrody V gelu u záporné elektrody jsou jamky pro vzorky DNA Stejnosměrný elektrický proud Vizualizace fragmentů se provádí např. ethidiumbromidem (interkalačního činidla), které svítí v UV světle
Sekvenace - Sangerova metoda Zjištění konkrétní sekvence vybraného úseku DNA řetězce
Fragmenty DNA (řetězce) - rozlišení ve své délce i o jeden nukleotid Sangerova metoda - chemicky modifikované dNTP (deoxyribonukleosidtrifosfáty) na ddNTP (dideoxyribonukleosidtrifosfáty)
ddNTP postrádají 3'-OH skupinu; za ddNTP si při elongaci už nemůže přisednout žádný dNTP - dojde k terminaci elongace PCR reakce: a) zkoumaný fragment DNA; pufr, DNA-polymerasa a mix normálních dNTP b) radioaktivně značený primer pro jedno vlákno DNA, c) sekvenace se odehrává ve 4 reakčních směsích (ddATP; ddTTP; ddCTP; ddGTP - odlišně fluorescenčně značeny); Elektroforetická detekce fragmentů v gelu
3'
5'
5'
*
Analyzovaná DNA (jednovláknová)
3'
Značený primer
DNA-polymerasa, primer, nukleotidy - rozdělení do čtyř zkumavek. Přidány jednotlivé ddNTP: ddATP, ddCTP, ddGTP, ddTTP PCR syntéza komplementárního vlákna (značeno barevně pro jednotlivé ddNTP) ve směru 5'→3'
* * *
A
* C A
C
* A
* G
*
C
*
G
*
*
G
*
*
Elektroforéza A
C
G
T
-
+ Výsledná sekvence na syntetizovaném vlákně:
5'- C T A G T A G G T C C A - 3' Sekvence analyzované DNA (komplementarita párování basí):
3'- G A T C A T C C A G G T - 5'
T T T
Sekvenace - Sanger AAGTCCGATCGTTAGCTTCCGAATTGCATGGCAACTGCAGATCGATGCAAGTGCCGATC TTCAGGCTAGCAATCGAAGGCTTAACGTACCGTTGACGTCTAGCTACGTTCACGGCTAG začne probíhat sekvenační PCR s mixem dNTP a fluoresčenčně značenými ddNTP
AAGTCCGATCGTTAGCTTC AAGTCCGATCGTTAGCTTCC AAGTCCGATCGTTAGCTTCCG AAGTCCGATCGTTAGCTTCCGA AAGTCCGATCGTTAGCTTCCGAA AAGTCCGATCGTTAGCTTCCGAAT AAGTCCGATCGTTAGCTTCCGAATT AAGTCCGATCGTTAGCTTCCGAATTG AAGTCCGATCGTTAGCTTCCGAATTGC Nejkratší fragment ve schématu bude svítit červenou barvou a nejdelší také červenou
Speciální elektroforéza s laserovou detekcí fluorescenčně barvených ddNTP
Restrikční endonukleázy - restriktázy Enzymy, které štípou dvouvláknovou molekulu DNA uvnitř řetězce a to vždy v konkrétní pozici, charakteristické pro danou restriktázu (restrikční místo) Např. Eco R1 – restriktáza izolovaná z Escherichia coli, která specificky štípe v sekvenci G^AATTC
AATGCTAATGCCTAGTCAAGCTTTCATCGAGAATTCCAGTCGAA TTAGCTTTACGGATCAGTTCGAAAGTAGCTCTTAAGGTCAGCTT
AATGCTAATGCCTAGTCAAGCTTTCATCGAG TTAGCTTTACGGATCAGTTCGAAAGTAGCTCTTAA
AATTCCAGTCGAA GGTCAGCTT
Identifikace restrikčních míst Na uvedeném vlákně najděte restrikční místa pro nabídnuté enzymy
restrikční místo Alu I
AG / CT
Sau 3AI
/ GTAC
Msp I
C / CGG
5´G.G.G.C.G.T.A.C.A.T.A.G.C.T.A.A.T.G.G.C.A.A.G.C.T.A.T.G.G.T.3´
RFLP – restriction fragment length polymorphism Charakteristické fragmenty pro každého jedince po naštípání celkové DNA restriktázami Jednotlivé cílové sekvence vybraných restriktáz mohou být mutovány, nebo v rámci jiných delecí/inzercí posunuty (variabilita restrikčních míst) Každý člověk má proto charakterictické rozložení restrikčních míst pro určitou restriktázu (restrikční mapy) Mendelovská dědičnost délky restrikčních fragmentů EcoRI – štípání fragmentů 2 jedinců AGAATTCGCCGATCGATCGATCGATCGATCGATCGATCGATTGAGCTCGAATTCC AGAATTCGCCGATCGATCGATCGATCGATCGATCGATCGATCGATTGAGCTCGAATTCC
Na elektroforéze bude mít druhý jedinec delší fragment
RFLP – restriction fragment length polymorphism Variabilita RFLP Vzorek DNA 2 a 5 má „typickou“ délku fragmentu Vzorek DNA 1 a 3 má navíc jedno nové restrikční místo (v jiné oblasti)
Vzorek DNA 4 je variantou vzorku 3, kdy vzniklo další restrikční místo Nová restrikční místa vznikají např. záměnou nukleotidů
Southern - blotting Jméno po objeviteli Southernovi; umožňuje z velkého množství fragmentů (např. po štěpení celkové DNA restrikčními endonukleázami) specificky detekovat DNA fragment V doslovném překladu pijákování – tzn. nasátí PCR produktů z elektroforetického gelu na membránu (nylonovou) a jejich následná analýza Hybridizace = spojení dvou jednovláknových DNA podle pravidla komplementarity Gel se denaturuje v chemickém činidlu – denaturuje se i dvouvláknová DNA; na membránu jsou blottována jen jednořetězcová vlákna - v uspořádání, v jakém byla na elektroforetickém gelu Hybridizace s radioaktivně značenou próbou – membrána je ponořena do roztoku s jednovláknovým radioaktivně značeným řetězcem DNA Na základě komplementarity basí dojde k hybridizaci Nenavázaná próba je odmyta V případě úspěšné hybridizace „svítí“ na membráně fragment tvořený jedním vláknem DNA a jedním vláknem próby
Southern - blotting
Southern blot – hybridizace sondy DNA
Zahřátí (denaturace) Ochlazení (renaturace)
Sonda
Fenylketonurie - PAH gen Fenylketonurie Defekt genu pro fenylalaninhydroxylasu (PAH) – AR onemocnění PAH – 13 exonů Mnoho mutací (více než 400 známých v roce 2000)
Oblast mutace (delece)
Mutace - např. delece v 2. exonu; detekce systémem restrikční endonukleasy (viz obrázek) Při negativním výsledku vyšetření jednoho exonu vyšetření mutací v dalších exonech Děti
Rodiče
Děti
RFLP metoda Autosomálně recesivní onemocnění (např. cystická fibróza, fenylketonurie)
Vyšetření je informativní Druhá dcera má genotyp Aa
RFLP – prenatální vyšetření Fenylketonurie - AR A)
B)
Vyšetření je informativní Plod heterozygot - zdravý
RFLP metoda Polycystická choroba ledvin - AD Vyšetření je informativní Prenatální diagnostika - genotyp aa
RFLP metoda GR onemocnění – hemofilie (obdobné pro barvoslepost)
Dcera zdravá Genotyp X+Xh Přenašečka
?
I
1
2
II
1
1 2
A a
aa
2
3
A AA
a
Jsou jedinci II/2 a II/3 heterozygoti pro mutovanou alelu sledovaného AR onemocnění? (vazba úplná)
I
1
2
II
1
1 2
2
A
aa a
AA
3
A a
A a
Jsou jedinci II/2 a II/3 heterozygoti pro mutovanou alelu sledovaného AR onemocnění? (vazba úplná)
II/2 ne
II/3 ano
I
1
2
II
1
1 2
Aa
a a
2
3
Aa
Jsou jedinci II/2 a II/3 heterozygoti pro mutovanou alelu sledovaného AR onemocnění? (vazba úplná) II/2 AA nebo Aa II/3 AA nebo Aa Vyšetření je neúspěšné (neinformativní z hlediska určení heterozygocie jedinců II/2 a II/3).
I
1
2
X+Xh
X+Y II
1
XhY
1 2
X+
Xh
2
X+Y X+
3
X+
X+
Xh
Xh
Je dcera II/3 přenašečkou (heterozygot) pro mutovanou alelu sledovaného GR onemocnění? (vazba úplná)
II/3 ano
I
1
2
II
2
1
1 2
X+
Xh
X+
3
X+ X+
Xh X+
Je dcera II/3 přenašečkou (heterozygot) pro mutovanou alelu sledovaného GR onemocnění? (vazba úplná)
II/3 ne
Polycystická choroba ledvin (AD, p = 5cM) I Aa
II
1
1
aa
2
2
3
A B C D a) Riziko postižení pro II/3 i II/4 je 50%.
32
4
Polycystická choroba ledvin (AD, p = 5cM) I Aa
II
1
aa
1
A B C D
A
2
2
3
A
a a
a a
a a
a) Riziko postižení pro II/3 i II/4 je 50%. b) Riziko postižení pro II/3 je 95%. b) Riziko postižení pro II/4 je 5%. 33
4
Polycystická choroba ledvin (AD, p = 5cM) I
1
II
2
1
aa
Aa
2
3
5
4
aa
Aa
III 1
A B C D
a) Riziko postižení pro III/1 34i III/2 je 50%.
2
Polycystická choroba ledvin (AD, p = 5cM) I
1
II
2
1
aa
2
3
Aa
5
4
aa
Aa
III 1
A B C D
b) Riziko postižení pro III/1 je 95%. b) Riziko postižení pro III/2 je 5%. 35
2
Polymorfismy lidské DNA - vazebná analýza v přímé a nepřímé diagnostice
Mikrosatelity (syn. krátké tandemové repetice) STR…short tandem repeats, SSR…simple sequence repeats
TAGCCATCGGTACACACACACACACACAGTGCTTCAGTAGC TAGCCATCGGTACACACACACACAGTGCTTCAGTAGCGTAG Pokud se detekovatelný polymorfismus nachází dostatečně blízko lokusu, ve kterém se vyskytuje kauzální mutace pro sledovanou chorobu, bude
možné jej využít i bez znalosti molekulární podstaty daného onemocnění: → vazba polymorfismu s mutovanou alelou V závislosti na frekvenci crossing-overu bude současně s mutací předáván z rodičů na potomky → kosegregace markeru s mutovanou alelou
Chromosomové mutace Aneuploidie → Downův syndrom (3x 21. chromosom)
Nondisjunkce u Downova syndromu
Tři rodokmeny rodin s dětmi postiženými Downovým syndromem (prostá trisomie). Výsledek analýzy DNA – tetranukleotidového polymorfismu na chromozómu 21 - je znázorněn pod rodokmeny. Od kterého z rodičů zdědilo dítě třetí kopii chromozómu 21? V kterém meiotickém dělení došlo k nondisjunkci? 1
Nondisjunkce u Downova syndromu
?
Meióza I u otce nebo u matky
Nondisjunkce u Downova syndromu
?
Meióza I u otce nebo u matky
Meióza I u matky
Nondisjunkce u Downova syndromu
?
Meióza I u otce nebo u matky
Meióza I u matky
Meióza II u matky
Přímá DNA diagnostika Huntingtonovy chorey
42
1 2 3 4.........................................n CAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAG
(CAG)n primer primer 203 bp
203 bp + 3n
Přímá DNA diagnostika Huntingtonovy chorey
43
I 1
2
II
1
2
4
3
III
353 329
3
2
1
expanze expanze
263 248 42
20 50 42
15
20 20
50
42
20
15 15 20
15
20 15
15
15
+
+
-
Polymorfismy lidské DNA využívané v přímé a nepřímé diagnostice
Jednonukleotidové polymorfismy (single nucleotide polymorphisms – SNP) SNP C/A
TAGCCATCGGTA N GTACTCAATGATCAGCT G C T A
Polymorfismy lidské DNA využívané ve vazebné analýze, přímé a nepřímé diagnostice
Jednonukleotidové polymorfismy (single nucleotide polymorphisms – SNP) V 99.9% sekvence DNA se lidé od sebe vzájemně neliší. Ze zbývajícího 0.1% rozdílu tvoří SNP přes 80%. Projekt lidského genomu nyní pokračuje mj. ve formě identifikace miliónů SNP, které jsou shromažďovány ve veřejně přístupných databázích. Možnost typizace mnoha set tisíc SNP v jednom vzorku pomocí DNA čipů by měla usnadnit identifikaci alel, zodpovědných za řadu onemocnění.
DNA čipy - microarrays Moderní metoda analýzy DNA v několika lokusech současně Genové čipy obsahují velké množství sond, které hybridizují s různými oblastmi genomu Využití nanotechnologií – manipulace se vzorky probíhá převážně roboticky a vyhodnocení je softwarové Klony DNA
Testovaný vzorek
Referenční vzorek
Reverzní transkripce Fluorescenční barvivo
PCR amplifikace purifikace
Počítačová analýza Hybridizace na mikrodestičce
Genetický čip DNA čip - 1.5 x 1.5 cm křemíková nosná destička s mřížkou (v plastové kazetě) Uměle syntetizované krátké jednovláknové řetězce DNA o známé sekvenci nukleotidů (oligonukleotidové próby); až několik milionů Analyzovaný vzorek jednořetězcové DNA označené fluorescenčním barvivem Snímání skenerem, počítačová analýza Testování aktivity genů (intenzita záření jednotlivých prób po hybridizaci) Využití: genetika, farmakologie, imunologie, mikrobiologie (genové profily virů a bakterií)
