Obsah přednášky 1) Co lze u rostlin manipulovat 2) Genový knock-out, knock-down, knock-in 3) „Klonování“ sekundárních metabolitů
4) Metody identifikace transgenních rostlin 5) Molecular pharming 6) Protilátky, vakcíny 7) Další produkty GM rostlin
Co lze u rostlin manipulovat proteiny strukturní (kolagen) – strukturní geny hormony, cytokiny – strukturní geny
sekundární metabolity – geny pro enzymy intenzitu exprese – regulační geny
„Klonování“ sekundárních metabolitů
E3 E1
A
D1
E2 B
C
E4
D2
Zvýšení produkce metabolitu D2
E3 E1
A
D1
E2 B
C
E4
vyblokování enzymu E3 E3 = genový „knock-out“
D2
Genový „knock-out“ Odstranění funkce genu výměna genu za jeho nefunkční kopii rekombinací – inzerce, delece, záměna inzerční mutageneze
mutace vedoucí k nesmyslnému kodonu mutace měnící smysl kodonu, která se projeví ve změně funkce enzymu zablokování funkce genu RNA interferencí
Biosyntéza isoflavonoidů chalkoisomerasa
CHALKONY naringenin
KNOCK-OUT hydroxyisoflavonsyntasa
ZVÝŠENÁ PRODUKCE isoflavony
AURONY FLAVONY FLAVONOLY
Vytvoření nového produktu Genový „knock-in“
E3 E1
A
E2 B
C
E4
D1 naklonujeme gen pro enzym E5 D2
E E5
chceme přidat funkční skupinu k metabolitu D2 vytvoříme nový sekundární metabolit E
Akumulace flavonolů v rajčatech V dužině plodů rajčat je exprese genů syntézy flavonoidů (pal, chs, chi, f3h, fls) velmi nízká 1. Ektopická exprese vhodných regulačních faktorů 2. Exprese 2-hydroxyisoflavonsyntázy (HIS) 3. Exprese HIS společně s chalkonisomerázou
4. Kombinovaná exprese HIS, genů nebo transkripčních faktorů počátečních fází syntézy a potlačení genů pro konkurenční syntézy
Akumulace flavonolů v rajčatech Cl, Lc = transkripční faktory
Lc
Cl
Cl, Lc
CHI = chalkonisomerasa CHS = chalkonsyntasa FLS = flavonolsyntasa
CHS FLS
CHI
Cl, Lc CHI
CH, CHS FLS
Zvýšení hladiny proanthokyanidinů Transformace transkripčním faktorem Lc z kukuřice
Lc
Lc transgenní vojtěška (Madicago sativa)
Zvýšená hladiny proanthokyanidů zlepšuje zažívání přežvýkavců → píce s vylepšenými vlastnostmi Ovlivněno podmínkami prostředí – světelný stres, nízké teploty
Změna barvy květů
Flavonoidy Obecná struktura flavonoidů 3´ 2´ 1
8 9
1´
O
7
2
A
C
6
4´
B
5´
6´
3 10 5
4
Anthokyany, Flavonoly, Flavony, Katechiny a Flavanoly
Anthokyany 3´
2´ 1
8 9
4´ 5´
1´
O+
6´
2
7
3
6 10 5
OH 4
Anthokyany R1 3´
2´ 1
8
HO
9
4´ 5´
1´
O+
6´
2
7
3
6 10 5 OH
4
R2
R4
R3
Změna barvy květů Hydroxylace B kruhu anthokyanů R1 OH OH
O+
HO
ROH 2
OH OH
3‘→ cytochrom cihlově červené Flavanon Gen pro F3‘5‘H specifický →až Flavonoid 3´,hydroxyláza 5‘ +- hydroxyláza (F3‘5‘H) →b5modrá oranžové modré a fialové karafiáty, růže barva květů
Flavonoly 3´
2´ 1
8 9
4´ 5´
1´
O
6´
2
7
3
6 10
OH
5
4 O
Flavonoly OH
Quercetin, R1 = H, R2 = OH
OH
HO
O RH1
R2 OH OH
O
Quercetin, Quercitrin, Myricetin, Rutin
Flavanoly a Katechiny Catechin, R1 = OH, R2 = H
3´
2´ 1
8
HO
9
4´ 5´
1´
O
6´
2
7
3
6 10 5 OH
R OH 1
4 RH2
monomerní - Catechin, Epikatechin oligomerní - Procyanidin
OH
OH
Modrá růže? Gen pro F3‘5‘H (flavonoid hydroxyláza) + specifický cytochrom b5 → změna barvy červené v tmavě fialovou
?
Zatím se to nikomu nepovedlo, vakuoly růží jsou kyselé Firma Florigene to zkouší 20 let
Modré růže přesto vykvetly! V roce 2004 japonská pivovarnická firma Suntory
Gen pro delfinidin Vývoj stál 28 milionů USD, růží se prodá za 10 miliard
Aurony – žlutá barva květů 1) Společná exprese dvou genů - auresidinsyntasa - chalkon 4‘-Oglukosyltransferasa
2) Potlačení biosyntézy flavonoidů
R
O CH
O
OH
Bílá barva květů • Potlačení genů pro chalkonsyntázu → flavonoidy se vůbec nevyskytují bílé, bezbarvé květy • Absence flavonoidů ovšem znamená zvýšenou citlivost rostliny na fytopatogeny
Identifikace transgenních rostlin A. Molekulární detekce transgenu B. Exprese transgenu C. Dědičnost transgenu
Molekulární detekce transgenu 1) DNA blot – Southern blot analýza sondou připravenou z transgenu 2) Polymerázová řetězová reakce – sekvence specifické pro transgen – např. rekombinantní brambory v praktiku
Southern Blot transgenního čiroku cDNA sondou genu bar
Exprese transgenu 1) Stanovení aktivity reportérového genu 2) Stanovení množství přepisované RNA nebo hladiny proteinu metodou northern nebo western blot
3) Test enzymové aktivity
Stresem regulovaná exprese chimérického genu na bázi GFP Control
Cold
Salt
Dark
ABA
Dědičnost transgenu Funkční inzerce v jednotlivém lokusu je fenotypicky ekvivalentní dominantní alele, je tedy dědičná podle Mendelových pravidel
I.
Restrikční fragmenty - DNA polymorfismy transgenu
II. Fenotyp viditelný v potomstvu
Molecular farming aplikace technik molekulární biologie na syntézu komerčních produktů u rostlin zvýšená produkce látek pro rostlinu přirozených
proteiny karbohydráty a rostlinné oleje sekundární metabolity
tvorba látek pro rostlinu úplně nových
Proteiny použitelné v medicíně protilátky vakcíny ostatní významné proteiny
Příprava rostlinných protilátek Základní strategie přípravy protilátek spočívá v konstrukci producentů jednotlivých podjednotek v různých liniích rostlin jejich následném křížení a vyhledání producentů celých imunoglobulinů
Protilátky produkované rostlinami první příklad v roce 1989 – myší imunoglobulin IgG1 2. linie
1. linie
gen pro těžký řetězec γ
F1
gen pro lehký řetězec κ
oba řetězce v množství až 1,3% celkového proteinu v listech
Protilátky produkované rostlinami imunoglobuliny nesly nativní signální sekvenci
ta je nasměrovala do ER, což bylo nezbytné pro efektivní sbalení proteinu a jeho stabilitu podmínky v ER umožnily vytvoření disulfidických můstků na procesu sbalování se podílely i chaperony
podíl imunoglobulinu v F1 generaci byl vyšší než podíl jednotlivých řetězců v rodičovských liniích
Využití rostlinných protilátek sekreční sIgA z Nicotiana tabacum proti zánětu zubů Streptococcus mutans rozpoznává adhesin I/II, kterým se S. mutans váže na povrch buněk – prevence kolonizace
4 výchozí transgenní linie, trojí křížení
scFv proteiny VL a VH části imunoglobulinu spojené vhodným linkerem
scFv proteiny připravují se s využitím vektoru na bázi viru tabákové mozaiky (tobamovirus TMV)
exprese scFv je řízena virovým promotorem kódující sekvence protilátky je umístěna po směru transkripce za vedoucí sekvencí pro α-amylázu z rýže – zacílení proteinu do extracelulárních prostorů v rostlině
Využití scFv proteinů k léčbě lymfomů B-buněk – vznikají individuálně specifické antigeny velmi rychlé vytvoření specifických protilátek za 6-8 týdnů v roce 2003 testován na 16 pacientech
Příklady rostlinných protilátek Aplikace
Rostlina
Protilátka
Sig. sekvence
Zubní zánět
Tabák
sIgA
myší IgG
Zubní zánět
Tabák
IgG
myší IgG
Nádor tlustého střeva
Tabák
IgG
myší IgG
IgG
extensin z tabáku
Herpes simplex
Sója
Lymfom
Tabák
scFv
α-amyláza z rýže
Embryonální karcinom
Obilniny
scFv
myší IgG
Vakcíny produkované rostlinami snaha produkovat jedlé vakcíny
levná prevence střevních chorob v rozvojových zemích využití snadno dostupných zdrojů původně tabák, přechod na rajčata, banány a obiloviny
problémy s dávkováním a prostupováním trávicím traktem (rozklad proteinů v žaludku)
Příklady rostlinných vakcín Původce
Rec protein
Rostlina
Množství
Vibrio cholerae
podjednotky CtoxA a B
Tabák
0,001% SLP
Hepatitida B
povrchový protein
Brambory
0,3% TSP
Virus vztekliny
glykoprotein
Rajčata
1% TSP
Slintavka a kulhavka
virový epitop VP1
Vojtěška/ Arabidopsis
N/A
Prasečí koronavirus
virový glykoprotein
Tabák/kukuřice
0,2% TSP
Psí parvovirus
peptid z kapsidu VP2
Arabidopsis
3% SLP
TSP = total soluble protein, SLP = soluble lipoprotein
Další produkty GMO rostlin Glukocerebrosidasa Lidský sérový albumin Hormony Cytokiny Strukturní proteiny
Glukocerebrosidasa Gaucherova choroba – dědičné onemocnění při kterém se cerebrosidy akumulují v lysozymech v důsledku deficience glukocerebrosidasy Gaucherova choroba vede k otokům sleziny a jater a vážným poškozením kostí, může být extrémně vysilující a bolestivá Cerebrosidy se purifikují z lidských placent (spotřeba 10-12 tun placent na roční léčbu jednoho pacienta) Levnější je produkce v kulturách savčích buněk a předpokládá se, že rostlinná produkce výrobu ještě zlevní
První použitelný rostlinný produkt
Květen 2012 Obchodní název: Elelyso
Enzym: taligluceráza alfa Produkuje: GM kultura mrkve Výrobce: Protalix BioTherapeutics, Izrael Pfizer, USA
Schválen FDA pro léčbu Gaucherovy choroby 46
Lidský sérový albumin léčba popálenin, cirhózy, aj. exprese v tabáku a bramborách pod kontrolou promotoru 35S dvě formy s různými signálními sekvencemi
lidská, nesprávně sbalený extracelulární protein PR-S z tabáku, sbalený správně
Další příklady biofarmaceutik - I Rec. protein
Původ
Rostlina
Aplikace
protein C
člověk
tabák
antikoagulant
hirudin
pijavice
canola
antikoagulant
somatotropin
člověk
tabák
růstový hormon
β-interferon
člověk
rýže/tuřín/tabák
hepatitida BaC
hemoglobiny
člověk
tabák
krevní náhrady
kolagen
člověk
tabák
kolagen
Další příklady biofarmaceutik - II Rec. protein
Původ
Rostlina
Aplikace
α1-antitrypsin
člověk
rýže
cystická fibróza
aprotinin (inhibitor trypsinu)
člověk
kukuřice
transplantace
laktoferrin
člověk
brambory
antimikrobiální účinky
ACE
člověk
tabák/rajčata
hypertenze
enkefalin
člověk
Arabidopsis
opiát
trichosanthin-α
Trichosanthes kirilowii
Tabák
HIV terapie nádory
Kde se dozvím víc ? www.osel.cz
www.gate2biotech.com
http://www.the-scientist.com/
Shrnutí přednášky 1) Co lze u rostlin manipulovat 2) Genový knock-out, knock-down, knock-in 3) „Klonování“ sekundárních metabolitů
4) Metody identifikace transgenních rostlin 5) Molecular pharming 6) Protilátky, vakcíny 7) Další produkty GM rostlin
