Úvod... 3 Cíl práce Obecné problémy stresu u rostlin Biologická kontrolní agens u rostlin. 6

Obsah Úvod......................................................................................................................................... 3

Cíl práce…………………………………………………………………………………….. 4 1. Obecné problémy stresu u rostlin…….………………………………………………….... 5

2. Biologická kontrolní agens u rostlin………………………………………………………. 6 2.1 Počátky využití mikroorganizmů k biologické kontrole…………………………. 6 2.2 Bakterie podporující rostlinný růst………………………………………………. 7

2.2.1 Biohnojiva a biopesticidy………………………………………………... 10

2.3 Mechanismy půdní biologické kontroly rostlinných nemocí……………...……... 10 2.3.1 Konkurenční kolonizace kořene………………………………………..... 11

2.3.1.1 Vzájemné vlivy rostlin a rhizobakterií…………………..…… 11 2.3.1.2 Kořenová kolonizace a místně specifická rekombináza……… 11 2.3.1.3 Využití kořenových výměšků a kořenového slizu u PGPB…...12

2.3.2 Biologická kontrolní aktivita zprostředkovaná syntézou alelochemikálií.. 12 2.3.2.1 Konkurence o železo a role sideroforů……………………….. 12 2.3.2.2 Antibióza a antibiotika……………………………………….. 13

2.3.2.3 Produkce lytických enzymů………………………………….. 14

2.3.2.4 Detoxifikace a degradace faktorů virulence………………….. 14

2.3.3. Indukovaná systematická rezistence a systematická získaná rezistence....15

3. Nejdůležitější rody bakterií podporujících rostlinný růst……….………………………… 17

3.1 Pseudomonas………………………..…………………………………………… 17 3.2 Serratia……………………………………………………………………..……..20

3.3 Streptomyces……………………………………………………………………... 21 3.4 Burkholderia……………………………………………………………………... 23

3.5 Bacillus……………………………………………………………...…………….24

3.6 Paenibacillus…………………………………………………….……………….. 26

3.7 Delftia……………………………………………………………………………..27 3.8 Stenotrophomonas…………………………………………………….………….. 28 3.9 Azospirillum…………………………………………………………………...…. 29

3.10 Rhizobium………………………………………………………………………..29

3.11 Azotobacter……………………………………………………………………... 30

3.12 Ralstonia……………………...………………………………………………… 30 1

3.13 Lactobacillus a bakterie mléčného kvašení…………………………………….. 30

4. Supresivní a napomáhající půdy…………………………………………………………... 31

5. Bakterie v biologické kontrole významných nemocí rostlin……………………………. 32 5.1 Take-all nemoci…………………………………………………………………... 32

5.2 Crown gall nemoci……………………………..………………………………… 34

6. Genetické modifikace a genetické inženýrství rostlin…………………………………….. 36 Diskuze………………………………………………………………………………………. 39

Závěr………………………………………………………………………………………… 41 Seznam literatury…………………………………………………………………………… 42

2

Úvod

Bakterie jsou jednobuněčné organizmy prokaryotického typu. Z evolučního hlediska

tvoří jednu ze tří domén života na Zemi (Rosypal a kol. 2003).

Není asi místa na naší planetě, kde by nebyly bakterie. Nejvíc je jich v půdě a ve vodě,

velmi mnoho je jich v tělech a na tělech jiných organizmů, rostlin, živočichů i člověka, a

mnoho je jich ve vzduchu. Váhově představují asi polovinu živé hmoty na Zemi. Vyskytují se

i v tak extrémních podmínkách prostředí, kde jiné formy života už nenajdeme. Jejich koncentrace je ovšem různá v různých prostředích, a i v tomtéž prostředí kolísá v širokém rozmezí a v závislosti na řadě okolností (Kaprálek 2000).

Bakterie žijící v půdě vytvářejí přirozená společenstva. Ovlivňují úrodnost půdy a

kořenovou výživu rostlin. Některé rozkládají zbytky rostlinných a živočišných těl a přeměňují je na látky, které jsou asimilované vyššími rostlinami (Rosypal a kol. 2003).

Množství bakterií v půdě se řádově odhaduje v rozmezí desítek milionů až několik

miliard na 1 g půdy (Dobiáš a kol. 2003).

Rostliny se během svého růstu v přírodních podmínkách setkávají s různými druhy

půdních mikroorganizmů. Některé z těchto mikroorganizmů jsou prospěšné pro rostliny, jiné

jsou škodlivé. Pomocí stimulace rostlinného růstu nebo snižováním půdních rostlinných patogenů dochází k vytváření vzájemných vztahů mezi rostlinami a bakteriemi prospěšnými pro rostliny (Persello-Cartieaux a kol. 2003). Prospěšné půdní bakterie volně žijící

v rhizosféře jsou označovány jako bakterie podporující rostlinný růst (PGPB). Nachází se ve spojení s kořeny různých rostlin (Han a kol. 2004).

3

Cíl práce Cílem této práce je zpracovat problematiku biologických kontrolních mechanismů

bakterií v životním prostředí, se zaměřením na kontrolu rostlinných patogenů. Práce se zabývá bakteriemi podporujícími rostlinný růst (PGPB) a mechanismy jejich antagonistického

působení proti patogenům. Součástí práce je i zpracování přehledu nejdůležitějších rodů uplatňujících se jako biologické kontrolní agens, zmíněny jsou ekologicky nejvýznamnější nemoci potlačované pomocí těchto bakterií.

Práce je také doplněna o problematiku prospěšných půd, které mají speciální vlastnosti

k potlačování patogenů, a problematiku genetických modifikací, které by mohly vyřešit problém kolísajících účinků bakterií při používání v běžných půdách.

4

1. Obecné problémy stresu u rostlin Rostliny jsou v průběhu svého života vystaveny velmi proměnlivým podmínkám

vnějšího prostředí. Ty mohou nejen zpomalovat jejich životní funkce, ale také poškozovat jednotlivé orgány a v krajním případě vést i k jejich uhynutí. Nepříznivé vlivy vnějšího

prostředí závažně ohrožující rostlinu označujeme jako stresové faktory (stresory). Termín

stres je obvykle používán pro souhrnné označení stavu, ve kterém se rostlina nachází pod vlivem stresorů.

Problematika stresu u rostlin je komplikovaná díky přisedlému způsobu života, který

neumožňuje únik před působením stresorů, ale také tím, že u rostlin je mnohem větší mezidruhová variabilita i heterogenita vnějšího prostředí. Ta se projevuje značným kolísáním

fyzikálně-chemických parametrů rostlinných buněk i v průběhu „normálního“ fungování (Procházka a kol. 2003).

Obr. 1 Přehled nejdůležitějších stresových faktorů, se kterými se rostliny setkávají (Procházka a kol. 2003).

Fyzikální Abiotické faktory

mechanické účinky větru

nadměrné záření (UV, viditelné)

extrémní teploty (horko, chlad, mráz) nedostatek vody (sucho)

nedostatek kyslíku (hypoxie, anoxie) Chemické

nedostatek živin v půdě

nadbytek iontů solí a vodíku v půdě

toxické kovy a organické látky v půdě toxické plyny ve vzduchu Biotické faktory

herbivorní živočichové (spásání, poranění)

patogenní mikroorganizmy

vzájemné ovlivňování (alelopatie, parazitismus)

5

Půdní patogeny patří do několika různých skupin: bakterie, houby nebo hlístice.

Přebývají v půdě v krátkých

nebo dlouhých periodách. Mohou přežívat na rostlinných

zbytcích nebo se chovají jako klidové organizmy, dokud se k nim nedostanou kořenové výměšky a neumožní jim růst. Tyto patogeny dokáží uniknout konkurenci s dalšími

mikroorganizmy pomocí penetrace do kořenů. Zůstávají buď uvnitř rostliny do její smrti nebo putují ven z rostliny a infikují další části kořenů nebo kořeny dalších rostlin.

Rostliny infikované půdními patogeny trpí například kořenovou hnilobou, černáním

kořene, vadnutím, zakrněním nebo opadáváním semenáčků. Půdní patogeny mohou mít ničivé účinky na polích i ve sklenících, v industrializovaných i rozvojových zemích (Haas a Défago 2005).

2. Biologická kontrolní agens u rostlin Úroda zeleniny, ovoce, květin i bavlny je často zničena houbovými i bakteriálními

nemocemi. Používání moderních chemických prostředků, například metylbromidu, ke kontrole půdních patogenů, však způsobuje závažné ekologické problémy. Tyto problémy by

mohly být vyřešeny pomocí biologických kontrolních agens, která jsou bezpečnější

alternativou. Nevýhodou těchto agens jsou rozdíly mezi používáním in vitro a jejich úspěšnou

aplikací na polích, způsobené půdní nestejnorodostí, výkyvy teploty, množstvím živin, půdní

strukturou, pH, přítomností toxických chemikálií, přítomností dalších mikrobiálních druhů a

dalšími faktory, které ovlivňují mikrobiální a houbový růst, přežívání a účinnost. Obecně

platí, že krátce po zavedení bakteriálních biologických kontrolních agens do půdy začne bakteriální populace postupně klesat (Bashan 1998, Zohar-Perez a kol. 2005). 2.1 Počátky využití mikroorganizmů k biologické kontrole V roce 1960 vědci, hlavně ze Sovětského Svazu, používali bakterie ke zvýšení

úrodnosti. Jako bakteriální hnojiva používali Azotobacter a Bacillus spp. Domnívali se, že ke

zvýšení úrodnosti dochází díky asociativní fixaci dusíku a rozpouštění fosfátů (Maier a kol. 2000).

V roce 1963 se konalo mezinárodní sympozium nazvané „Ekologie půdních

rostlinných patogenů – úvod do biologické kontroly“ („Ecology of soil-borne plant pathogens - prelude to biological control“). Vědci se domnívali, že antagonistické mikroorganizmy 6

mohou soutěžit s patogeny, zvláště pomocí produkce antibiotických složek. V půdě tato antibiotika mohou zasahovat do vývoje patogenů, například během klíčení spor nebo na počátku kořenové infekce. Toto vysvětlení bylo zajímavé, o spoustě mikroorganizmů se totiž

vědělo, že jsou výborní producenti antibiotik in vitro (například Streptomyces, Bacillus,

Pseudomonas spp.). Již kolem roku 1920 byly určité důkazy o tom, že antibiotika jsou produkována v půdě, ale nikdo je nespojoval s biologickou kontrolní aktivitou.

V roce 1956 Wright popsal, že Trichoderma viridae, houba používaná k biologické

kontrole,

produkuje

zjistitelné

množství

protihoubového

antibiotického

gliotoxinu

v upravených půdách. Rozhodující role antibiotik v biologické kontrole kořenových chorob však zůstává neobjasněna ze tří důvodů:

1. Šance detekce environmentálně významných antibiotik jsou mnohem lepší v rhizosféře

než v malém množství půdy, protože mikrobiální aktivity jsou 10-krát až 1000-krát vyšší v okolí rostlinných kořenů než v běžné půdě. Antibiotika navíc adsorbují na půdní částice.

2. Bylo potřeba více citlivých technik, jako například účinná kapalinová chromatografie (HPLC), aby mohla být provedena separace a detekce antibiotik.

3. K pochopení vztahů mezi antibiotiky a biologickou kontrolní aktivitou je nezbytné vytvořit mutanty biologických kontrolních kmenů, které specificky postrádají produkci antibiotik (Haas a Défago 2005).

V roce 1980 vzniklo označení rhizobakterie podporující rostlinný růst (PGPR = plant

growth-promoting rhizobacteria) a škodlivé rhizosférické mikroorganizmy (DRMO = deleterious rhizosphere microorganisms) (Maier a kol. 2000). 2.2 Bakterie podporující rostlinný růst

Bakterie podporující rostlinný růst (PGPB = plant growth-promoting bacteria) jsou

spojeny s mnoha, ale ne se všemi, rostlinnými druhy a jsou obvykle přítomny v různých

životních prostředích. Široce studovaná podskupina PGPB jsou PGPR - rhizobakterie podporující rostlinný růst, bakterie, které osídlují povrch kořene a vytváří vzájemné vztahy

s rhizosférou. Některé z těchto PGPR mohou také vstupovat dovnitř kořene a zde tvořit endofytní populaci. Mnohé z nich jsou schopny překročit endodermis, přecházet z kořenové kůry do cévního systému a následně prospívat jako endofyté ve stonku, listech, hlízách a dalších orgánech. Rozsah endofytické kolonizace v orgánech a pletivech hostitelské rostliny

odráží schopnost bakterií se selektivně adaptovat na specifické ekologické niky. Úzké spojení 7

mezi bakteriemi a hostitelskými rostlinami se vytváří bez poškození rostliny (Compant a kol. 2005).

Obr. 2 Vlevo luskoviny pěstované s PGPR, vpravo luskoviny pěstované bez PGPR. Bakterie

podporující rostlinný růst způsobují prodlužování kořene a větší počet kořenových vlásků (www.tau.ac.il/~ecology/virtau/5-Evgeniy_A/evgeniy.htm).

PGPR konkurenčně osídlují rostlinné kořeny a stimulují rostlinný růst a/nebo redukují

výskyt rostlinných nemocí (Haas a Défago 2005).

PGPR jsou běžně používány jako očkovací látky pro zlepšení růstu a úrody

zemědělských plodin, ačkoliv kontrola této selekce PGPR druhů je velmi obtížná (Khalid a kol. 2004).

Aby měly PGPR prospěšné účinky pro rostliny, musí být přítomny na kořenech

v dostatečném počtu. Rozhodující úroveň kolonizace, které musí být dosaženo, se odhaduje na 105 - 106 CFU (colony forming units) na kořenech v případě Pseudomonas spp. Odhaduje

se, že kořeny jsou v přirozených podmínkách kolonizovány 108 - 109 aerobních bakterií,

z nichž 0,1 - 1% tvoří biologické kontrolní druhy rodu Pseudomonas. Uměle naočkované

PGPR mohou zpočátku kolonizovat kořeny v 107 - 108 CFU, ale tato hladina vždy během pár týdnů poklesne (Haas a Défago 2005).

8

Obr. 3 Vzájemné vztahy mezi biologickými kontrolními PGPR, rostlinami, patogeny a půdou. Tyto prvky se ovlivňují navzájem prostřednictvím biotických a abiotických signálů, mnoho

z nich je stále neobjasněných. ISR = indukovaná systematická rezistence (Haas a Défago 2005).

Existuje teorie, že rychle rostoucí rhizobakterie mohou potlačovat houbové patogeny

pomocí konkurence o zdroje uhlíku a energie. Ačkoliv je dokázáno, že rhizobakteriální

populace jako celek může působit proti houbovým patogenům v půdě a účinné biologické

kontrolní PGPR musí být schopny konkurence o živiny v rhizosféře, je obtížné si představit, že 1% rhizobakterií může potlačovat rostlinné nemoci (Haas a Défago 2005).

9

2.2.1 Biohnojiva a biopesticidy Existují PGPR, označované jako biohnojiva . Zde se uplatňují mechanismy jako fixace

dusíku, rozpouštění fosfátů, produkce fytohormonů, například auxinů a cytokininů, a nestálé růstové stimulátory, například etylen a 2,3-butandiol.

Další PGPR se často nazývají biopesticidy. Tyto PGPR většinou patří do rodu

Pseudomonas nebo Bacillus spp. Jsou antagonisty kořenových patogenů (Haas a Défago 2005).

2.3 Mechanismy půdní biologické kontroly rostlinných nemocí Navzdory různým ekologickým nikám, volně žijící rhizobakterie a endofytické

bakterie využívají některé shodné mechanismy k podpoře rostlinného růstu a ke kontrole fytopatogenů (Hallman a kol. 1997, Compant a kol. 2005).

Mechanismy biologické kontroly zprostředkované PGPB jsou: • • •

Konkurence o ekologické niky nebo substráty Produkce inhibičních alelochemikálií

Indukovaná systematické rezistence (ISR = induction of systematic resistance) a

systematická získaná rezistence (SAR = systematic acquired resistence) (Compant a kol.2005)

Rozdělení mechanismů biologické kontroly zprostředkované PGPB: • •

Přímé účinky: zvýšené zásobování živinami a produkce fytohormonů

Nepřímé účinky: produkce antibiotik, produkce železitých chelátových sideroforů a indukce mechanismů rostlinné rezistence (Persello-Cartieaux a kol. 2003)

Přímé mechanismy u PGPR mohou být demonstrovány za nepřítomnosti rostlinných

patogenů

nebo

dalších

rhizosférických

mikroorganizmů.

K demonstraci

nepřímých

mechanismů je nutná přítomnost rostlinných patogenů, zahrnují schopnost PGPR redukovat škodlivé účinky těchto patogenů na výnosech plodin (Nelson 2004).

10

2.3.1 Konkurenční kolonizace kořene 2.3.1.1 Vzájemné vlivy rostlin a rhizobakterií Složení rhizobakteriální populace je závislé na rostlinných druzích a na rozdílech ve

složení a množství kořenových výměšků. Kořenové výměšky poskytují rhizosférickým

mikroorganizmům živiny bohaté na uhlík, jako jsou organické kyseliny (například citrát, malát, sukcinát, pyruvát, fumarát, oxalát, acetát) a cukry (například glukóza, xylóza, fruktóza, maltóza, sacharóza, galaktóza, ribóza). Tyto živiny jsou nepostradatelné, na rozdíl od

proměnlivého množství vyskytujících se α-aminokyselin, nukleobazí a vitamínů (například thiaminu a biotinu). Schopnost rhizobakterií využívat organické kyseliny a zdroje uhlíku ovlivňuje konkurenční vztahy v rhizosféře.

Vědci se domnívají, že specifické interakce probíhají při počátečních kontaktech

rhizobakteríí s kořeny. Důkaz o tomto tvrzení může být pozorován u některých bakteriálních mutantů se sníženou schopností kořenové kolonizace. Rozsáhlý výzkum kolonizačnědefektních mutantů Pseudomonas spp. ukázal, že schopnost využívat malát a sukcinát jsou

v podmínkách rhizosférické kompetence důležitější, než schopnost využívat glukózu a

fruktózu. Chemotaxe, pohyb pomocí bičíků, lipopolysacharidová (LPS) struktura, vnější membránový protein OprF a pili jsou také důležité pro konkurenční kolonizaci kořene (Haas a Défago 2005).

Z bakteriálních lipopolysacharidů, zvláště O-antigenní řetězce mohou přispět ke

kořenové kolonizaci, ačkoliv důležitost LPS v této kolonizaci může být druhově závislá.

Z pilů je důležitý typ IV, uplatňující se také při adhezi zvířecích a lidských patogenů

na eukaryotické buňky. Tento typ pilů hraje roli v rostlinné kolonizaci u endofytických bakterií, například u Azoarcus sp. (Compant a kol. 2005).

2.3.1.2 Kořenová kolonizace a místně specifická rekombináza Bakteriální vlastnosti vedoucí k účinné kořenové kolonizaci se nemusí vyskytovat

trvale. Uplatňuje se zde rekombinace DNA řízená místně specifickou rekombinázou.

U některých PGPB je účinná kořenová kolonizace spojena se schopností buněk produkovat tuto místně specifickou rekombinázu. Přenos místně specifického rekombinačního genu

z rhizosféricky kompetentní P. fluorescens do rhizosféricky nekompetentního kmene zvýší schopnost kolonizace kořenové špičky (Compant a kol. 2005). 11

2.3.1.3 Využití kořenových výměšků a kořenového slizu u PGPB Kořenové výměšky jsou primární zdroj živin pro rhizosférické mikroorganizmy.

PGPB jsou dobře přizpůsobené k jejich využití. V kořenových výměšcích jsou cukry a aminokyseliny, avšak tyto látky nejsou potřebné při kolonizaci kořene. Konkurenční

kolonizace kořene je ovlivněna polyaminy, jako je putrescin, spermin a spermidin. PGPB řídí

rychlost příjmu těchto látek. Jejich vysoké titry mohou zpomalit bakteriální růst a snížit

schopnost bakterií konkurenčně kolonizovat kořeny. Kořenový sliz také nabízí použitelný zdroj uhlíku pro PGPB, důležitý při konkurenční kolonizaci (Compant a kol. 2005).

Při kolonizaci kořene je rozhodující schopnost mikrobů soutěžit o živiny dostupné v

semenech a o kořenové výměšky. Kořenové výměšky mohou být rozpoznány, využity a zpracovány rhizobakteriemi jako živiny a signály, nebo působí jako toxiny (PerselloCartieaux a kol. 2003).

2.3.2 Biologická kontrolní aktivita zprostředkovaná syntézou alelochemikálií Kolonizace rostlin

bakteriálních

PGPB a ochrana rhizosférických nik je závislá na produkci

alelochemikálií,

včetně

železitých

chelátových

sideroforů,

antibiotik,

pesticidních těkavých látek, lytických enzymů a detoxifikačních enzymů (Compant a kol. 2005).

2.3.2.1 Konkurence o železo a role sideroforů Železo je esenciální růstový prvek pro všechny žijící organizmy. Nedostatek

dostupného železa v půdě a na povrchu rostlin vyvolává konkurenci o tento prvek. V podmínkách s nízkou koncentrací železa produkují PGPB nízkomolekulární látky siderofory, které přednostně získávají železité ionty (Compant a kol. 2005).

Dostupnost železa ovlivňuje mnoho metabolických procesů bakterií. Změny v

dostupnosti železa, které jsou i nejsou přidruženy s okamžitými a zjistitelnými změnami ve velikosti populace, ovlivňují způsobilost bakteriálního kmene (Loper a Henkels 1999).

Ačkoliv různé bakteriální siderofory se liší svou schopností získávání železa, důležité

je, že zbavují prostředí tohoto esenciálního prvku, který se stává nedostupným pro patogenní houby. Houbové siderofory mají totiž nižší afinitu k železitým iontům. Některé PGPB kmeny

12

jsou ještě důslednější a získávají železo z heterogenních sideroforů produkovaných jinými společně se vyskytujícími mikroorganizmy (Loper a Henkels 1999, Compant a kol. 2005).

Biosyntéza sideroforů je řízena železosenzitivními Fur proteiny, všeobecnými

regulátory GacS a GacA, sigma faktory RpoS, PvdS a FpvI, N-acetyl laktony homoserinu a místně specifickými rekombinázami (Cornelis a Matthijs 2002, Ravel a Cornelis 2003, Compant a kol. 2005).

Syntézu sideroforů ovlivňuje velké množství faktorů životního prostředí, včetně pH,

hladiny železa a forem železitých iontů, přítomnost dalších stopových prvků a přiměřené zásobování uhlíkem, dusíkem a fosforem ( Compant a kol. 2005). 2.3.2.2 Antibióza a antibiotika Antibióza

je inhibice nebo ničení jednoho organizmu pomocí metabolitů

produkovaných jiným organizmem. PGPB mohou produkovat silné růstové inhibující

sloučeniny, které jsou účinné proti široké skupině mikroorganizmů. Takové sloučeniny se nazývají širokospektrální antibiotika. Na druhé straně, některé metabolity jako bakteriociny

jsou účinné jen proti specifické skupině mikroorganizmů. Antagonisté, kteří produkují

antibiotika, mají konkurenční výhodu v zabírání určitých nik a v zabezpečování substrátů jako potravinových zdrojů, protože jejich antibiotika potlačují růst nebo rozmnožování dalších mikroorganizmů. Antibióza může být také účinný mechanismus k ochraně klíčících semen.

Mnoho antibiotik vytvářených antagonisty není produkováno proti specifickým

patogenům. Také specifický antagonista nemusí produkovat stejná antibiotika v různých

podmínkách vnějšího prostředí. Někteří antagonisté produkují několik biologicky aktivních sloučenin, které jsou účinné proti různým rostlinným patogenům (Trigiano a kol. 2003).

Rozmanitost antibiotik je velká, patří sem látky jako 2,4-diacetylfluoroglucinol

(DAPG), amfizin, oomycin A, fenazin a další produkované Pseudomonas spp. (Nielsen a Sorensen 2003, Compant a kol. 2005), oligomycin A, kanosamin, zwittermicin A a xantobacin produkované Streptomyces, Bacillus a Stenotrophomonas spp. (Hashidoko a kol.

1999, Compant a kol. 2005).

Regulační kaskáda antibiotik zahrnuje GacA/GacS nebo GrrA/GrrS, RpoD a RpoS,

N-acetyl laktony homoserinu a pozitivní autoregulaci (Chancey a kol. 1999, Compant a kol.

2005). Syntéza antibiotik je těsně spojena s celkovým metabolickým stavem buňky, který je

ovlivňován dostupností živin a dalšími podměty z vnějšího prostředí, jako jsou minerály, zdroj a zásoba uhlíku, pH, teplota a další parametry (Duffy a Défago 1999). Stopové prvky, 13

hlavně zinek, a zdroje uhlíku ovlivňují genetickou stabilitu/nestabilitu bakterií a ovlivňují jejich schopnost produkovat sekundární metabolity (Compant a kol. 2005).

Mnoho kmenů produkuje více sekundárních antimikrobiálních metabolitů. Podmínky

favorizující určitou látku mohou působit příznivě na produkci další látky (Duffy a Défago 1999). To zabezpečí různý stupeň flexibility pro antagonistické bakterie, které čelí proměnlivým vnějším podmínkám (Compant a kol. 2005).

Syntézu antibiotik také ovlivňují biotické podmínky, jako například růst a vývoj

rostliny. Biologická aktivita DAPG je navozena jen ve výměšcích starších rostlin (Picard a kol. 2000). Důležitou roli hraje také genotyp hostitelské rostliny (Compant a kol. 2005). 2.3.2.3 Produkce lytických enzymů

Lyze houbových buněk a degradace jejich buněčných stěn je pravděpodobně následek

produkce enzymů degradujících buněčnou stěnu bakteriemi, a to i v případě, že ve stejnou dobu jsou produkována antibiotika (Whipps 2001).

Mezi nejvýznamnější lytické enzymy patří chitinázy, proteázy, laminarinázy. Stejně

jako u sideroforů a antibiotik, regulaci produkce lytických enzymů, především proteáz a

chitináz, řídí GacA/GacS (Natsch a kol. 1994, Compant a kol. 2005) nebo GrrA/GrrS regulační systém (Compant a kol. 2005).

Chitináza produkovaná Serratia plymuthica C48 inhibuje klíčení spór a prodlužování

klíčících hyf u Botrytis cinerea (Frankowski a kol. 2001, Compant a kol. 2005). Schopnost produkce extracelulárních enzymů je považována za klíčovou u Serratia marcescens při působení jako antagonista proti Sclerotium rolfsii (Compant a kol. 2005) a u Paenibacillus sp.

kmene 300 a Streptomyces sp. kmene

385 potlačujících Fusarium oxysporum f. sp.

cucumerinum. Extracelulární chitinázy a laminarinázy syntetizované Pseudomonas stutzeri

způsobují hnití a rozklad mycelia u Fusarium solani (Lim a kol. 1991, Compant a kol. 2005). 2.3.2.4 Detoxifikace a degradace faktorů virulence

Další mechanismus biologické kontroly je detoxifikace faktorů virulence u patogenů

(Compant a kol. 2005).

Některé biologické kontrolní agens mohou detoxifikovat albicidin, toxin produkovaný

Xanthomonas albilineans. Detoxifikační mechanismus, do kterého patří produkce proteinů

dočasně blokuje toxiny u Klebsiella oxytoca a Alcaligenes denitrificans. Několik 14

mikroorganizmů, včetně kmenů Burkholderia cepacia a Ralstonia solanaceum může hydrolyzovat kyselinu fusarovou, fytotoxin produkovaný různými kmeny rodu Fusarium. Některé

PGPB potlačují quorum sensing (QS) systémy patogenů degradací

autoindukovaných signálů. Tím blokují expresi virulentních genů (Compant a kol. 2005). Buňky spolu často komunikují přes sekreci, absorpci, nebo rozpoznáváním malých signálních

molekul. V mnoha případech se uplatňuje mechanismus známý jako quorum sensing.

Hromadění quorum sensing signálních molekul slouží ke zjišťování hustoty bakteriální populace. Když dosáhnou prahové úrovně, dochází k aktivaci některých genů a ke vzniku kompetence. Různé bakteriální druhy produkují a reagují na různé quorum sensing signální

molekuly. Mechanismy působení quorum sensing signálních molekul jsou současná cílová

exprese genu a koordinace celulární aktivity. Difuzní signální molekuly N-acetyl laktony

homoserinu (AHL), které jsou přítomny v quorum sensing systémech, jsou typické pro mnoho G- bakterií. AHL řídí různorodé mikrobiální biologické funkce, včetně produkce antibiotik, exprese virulentních faktorů a tvorby biofilmu.

Bacillus thuringiensis potlačuje virulenci závislou na quorum sensing u rostlinného

patogenu Erwinia carotovora. E. carotovora produkuje a reaguje na signální acylované

laktony homoserinu (AHL). Kmeny B. thuringiensis mají AHL laktonázu, která je silný AHL

degradující enzym a tím potlačuje tento rostlinný patogen (Dong a kol. 2004).

Vědci se domnívají, že patogenní toxiny patogenů vykazují širokospektrální aktivitu a

mohou potlačovat růst mikrobiálních konkurentů nebo detoxifikovat antibiotika. Příkladem je

Fusarium oxysporum, které degraduje 2,4-diacetylfluoroglucinol produkovaný Pseudomonas

fluorescens, vzniká monoacetylfluoroglucinol a fluoroglucin (Schouten a kol. 2004). 2.3.3. Indukovaná systematická rezistence a systematická získaná rezistence Některé

biologické

kontrolní

PGPB

mohou

vyvolat

u hostitelské

rostliny

systematickou rezistenci proti širokému spektru patogenů (Compant a kol. 2005, Haas a Défago 2005).

Indukovaná systematická rezistence (ISR = induced systematic resistance) umožňuje

rostlinám odolávat útoku patogenů do listů a kořenů. Mnoho PGPB vyvolává ISR bez ohledu na produkci antibiotik (Haas a Défago 2005). ISR je fenotypicky

podobná systematické získané rezistenci (SAR = systematic

acquired resistence). SAR vznikne po úspěšné aktivaci obranných mechanismů rostliny jako odpověď na primární infekci způsobenou patogenem. Později dochází k hypersenzitivní 15

reakci a vzniku místních hnědých nekrotických lézí a k vysušení pletiv. Stejně jako SAR je

ISR účinná proti různým typům patogenů. Rozdíl je v tom, že při ISR prospěšné bakterie nezpůsobují na rostlinách viditelné změny.

Další rozdíl mezi ISR a SAR je závislost na pozdější akumulaci kyseliny salicylové

(Compant a kol. 2005). SAR se vyznačuje hromaděním kyseliny salicylové (SA) a proteinů příbuzným patogenním proteinům (PR).

Některé PR proteiny, například chitinázy a

glukanázy, působí přímo na houbách, kde degradují buněčné stěny. ISR vyvolaná některými

PGPR není spojena s hromaděním SA nebo PR proteinů, ale zahrnuje jinou signální transdukční dráhu tvořenou kyselinou jasmonovou a etylenem. Jakmile je ISR aktivována PGPB, udržuje se po dlouhé časové období, i když se sníží počet patogenních bakterií (Zehnder a kol. 1999).

Studie s mutanty Arabidopsis thaliana prokázala, že obrana pomocí jasmonátu a

etylenu je důležitá pro ISR, zatímco dráha závislá na kyselině salicylové u SAR je méně

důležitá (Haas a Défago 2005). ISR je více závislá na zvýšení citlivosti k těmto složkám, než

na zvýšení jejich produkce. Zvýšená produkce totiž může vést k aktivaci částečně odlišných obranných genů (Compant a kol. 2005).

Odezva ISR je závislá na kmenech PGPB, rostlinném druhu a kultivarech (Haas a

Défago 2005).

ISR vyvolaná PGPB byla poprvé pozorována na karafiátu (Dianthus caryophillus)

s redukcí citlivosti na vadnutí způsobené Fusarium sp. a na okurce (Cucumis sativus) s redukcí vnímavosti k listovým nemocem způsobeným Colletotrichum orbiculare.

Při navození ISR dochází v rostlině k zesílení buněčných stěn, ke změně fyziologie

rostliny a metabolickým odezvám, vedoucím ke zvýšení syntézy rostlinných obranných látek jako rekce na patogeny a/nebo na biotické stresové faktory (Compant a kol. 2005). Zesílení

buněčných stěn je způsobeno tvorbou, uvolňováním a hromaděním fenolických látek v místě

útoku patogenů. Biochemické nebo fyziologické změny v rostlině jsou způsobeny hromaděním PR proteinů, jako jsou PR-1, PR-2, chitináza a některé peroxidázy (M'Piga a kol.

1997). Ne všechny PGPB využívají PR proteiny, některé zvýší ukládání peroxidázy, fenylalanin amoniové lyázy, fytoalexinů, polyfenolové oxidázy a/nebo chalkonové syntázy.

Některé geny u PGPB zapojené v syntéze antibiotik jsou vysoce homologické

s některými rostlinnými geny, které jsou zapojeny v obranných reakcích (Compant a kol. 2005).

16

3. Nejdůležitější rody bakterií podporujících rostlinný růst Růst rostlin je v přírodních půdách ovlivňován biotickými i abiotickými stresovými

faktory. K potlačení těchto faktorů se používají chemické látky nebo bakterie podporující rostlinný růst. Tyto bakterie mají prospěšné účinky na růst a vývoj rostliny. Aby byly účinné,

musí být v půdě v dostatečném množství (Nelson 2004) a musí mít schopnost přežívat a usadit se v rhizosféře (Kurze a kol. 2001). Níže jsou popsány nejvýznamnější rody a druhy bakterií podporujících rostlinný růst a mechanizmy jejich vlivu na rostlinu a jiné, například patogenní, mikroorganizmy. 3.1 Pseudomonas Členové rodu Pseudomonas jsou G- bakterie tyčkovitého tvaru, které jsou

charakteristické metabolickou všestranností, aerobní respirací, pohyblivostí pomocí jednoho nebo několika polárních bičíků a vysokým obsahem guaninu a cytozinu (59 – 68 %).

Do této široké a heterogenní skupiny patří například Pseudomonas aeruginosa,

Pseudomonas putida, Pseudomonas fluorescens a Pseudomonas syringae (Haas a Défago 2005).

Některé kmeny fluorescenčních pseudomonád kolonizují kořeny u různých plodin a

chrání je před nemocemi způsobenými půdními houbovými patogeny. Potlačení nemocí těmito bakteriemi zahrnuje směs mechanismů, včetně účinné konkurence o živiny a

kolonizační místa, potlačení produkcí antimikrobiálních složek, a navození rezistence rostliny. Účinnost kmenů rodu Pseudomonas závisí velkou měrou na jejich schopnosti udržovat stabilní populaci a na metabolické aktivitě, projevující se minimálně po dobu

potřebnou k projevení prospěšných účinků bakterií. Stejně jako ostatní PGPB v půdě, jsou i

druhy rodu Pseudomonas vystaveny řadě proměnlivých biotických a abiotických stresových faktorů, jako je konkurence, predace, změny v teplotě a osmolaritě, dostupnost vody a živin. Tyto faktory ovlivňují biologickou kontrolní aktivitu PGPB i velikost populace.

Při přežívání v měnících se vnějších podmínkách jsou bakterie závislé na regulačních

mechanismech, které jim dovolí rychle reagovat na stresové situace. Mezi regulační prvky,

které přispívají k přežití bakterií ve stresových podmínkách, patří alternativní sigma faktory RpoS (σs) a RpoE (σ22), u fluorescenčních pseudomonád označovaný jako AlgU nebo AlgT.

RpoS se u pseudomonád uplatňuje při toleranci k hyperosmolaritě, vysoké teplotě a k agens tvořícím reaktivní kyslík. AlgU přispívá k toleranci proti osmotickému, oxidačnímu a 17

tepelnému stresu u P. aeruginosa a P. syringae (Schneider-Keel a kol. 2001). Obr. 4 Pseudomonas fluorescens kolonizující kořeny pšenice

(www.tau.ac.il/~ecology/virtau/5-Evgeniy_A/evgeniy.htm).

Fluorescentní Pseudomonas produkují během kořenové kolonizace antifungální

antibiotika, která navozují systematickou rezistenci v hostitelské rostlině nebo specificky ovlivňují schopnost patogena vyvolat onemocnění.

Fluorescence u Pseudomonas je způsobena extracelulárním difúzním

pigmentem,

který se nazývá pyoverdin (Pvd) nebo pseudobaktin. Tento pigment má vysokou afinitu k Fe3+ iontům, slouží jako siderofor. Ferripyoverdin je pyoverdin v komplexu s Fe3+ a reaguje s vnějším specifickým membránovým receptorem, který je přítomen u pyoverdin-

produkujících kmenů, ale může se vyskytovat i u některých neprodukujících kmenů. Následně je Fe3+ transportován do cytoplazmy a redukován na Fe2+. V určitých podmínkách funguje

pyoverdin jako difúzní bakteriostatické nebo fungicidní antibiotikum, zatímco ferripyoverdin

tuto funkci nemá. Pseudomonas produkující účinný siderofor jako je pyoverdin, mohou konkurovat dalším mikroorganizmům, které mají méně účinné systémy pro příjem iontů (Haas a Défago 2005).

Nedostatek železa způsobený pyoverdinem je biologický kontrolní mechanismus,

který se lépe uplatňuje v pH 6 než v pH 8. Bylo dokázáno, že pH je hlavní faktor ovlivňující dostupnost železa .

Další siderofor produkovaný Pseudomonas, pyochelin, je antifungální antibiotikum.

Pyochelin je relativně slabý Fe3+ chelát, ale dobrý Cu2+ a Zn2+ chelát, proto může zbavit

některé houby mědi a/nebo zinku. Rozdíl mezi siderofory a antibiotiky je nejasný. Siderofory jsou součástí primárního metabolismu, protože železo je esenciální prvek, ale příležitostně se chovají jako antibiotika, která jsou obvykle považována za sekundární metabolity. 18

Většina biologických kontrolních kmenů Pseudomonas spp. produkuje jednu nebo

více antibiotických složek, které nejsou příbuzné s typickými siderofory. In vitro tato antibiotika potlačují houbové patogeny, ale mohou být také účinné proti některým bakteriím a v některých případech i proti vyšším organizmům. Mezi nejvýznamnější antibiotika

produkovaná Pseudomonas patří fenaziny, fluoroglucinoly, pyoluteorin, pyrrolnitrin, cyklické

lipopeptidy a kyanovodík, který je nestálý (Haas a Défago 2005).

Obr. 5 Antibiotika produkovaná fluorescentními druhy rodu Pseudomonas, důležitá pro

biologickou kontrolu (Haas a Défago 2005).

Fenaziny jsou analogy flavinových koenzymů a potlačují transport elektronů.

V přítomnosti ferripyochelinu fenaziny katalyzují tvorbu hydroxylových radikálů, které poškozují lipidy a další makromolekuly. 2,4-diacetylfluoroglucinol ničí membrány u Pythium spp. a ničí zoospory těchto oomycet. Ve vysoké koncentraci je však fytotoxický. Pyrrolnitrin

je inhibitor houbových respiračních řetězců (Haas a Défago 2005) a jeho syntetická analoga se používají jako fungicidy (Ligon a kol. 2000). Cyklické lipopeptidy mají vlastnosti tenzidů 19

a jsou schopny se vkládat do membrán a rušit jejich funkce, mají široké antibakteriální a antifungicidní účinky (Haas a Défago 2005). Kyanidové ionty odvozené od kyanidu (HCN) jsou účinné inhibitory metalloenzymů, hlavně cytochromoxidázy c obsahující měď (Blumer a Haas 2000).

Některé kmeny Pseudomonas corrugata, P. fluorescens, P. marginalis a P. putida jsou

účinné proti houbě Verticillium dahliae Kleb., která způsobuje vadnutí plodin, hlavně u jahod

(Fragaria x ananassa), řepky olejky (Brassica napus) a brambor (Solanum tuberosum).

Mikrosklerocia V. dahlie se vyvíjí v pletivech mrtvé rostliny, mohou proniknout do půdy a

zůstávat v ní i několik let bez přítomnosti hostitele (Berg a kol. 2002).

Fluorescentí Pseudomonas spp. potlačují i patogenní houby Pythium ultimum a

Rhizoctonia solani v rhizosféře cukrové řepy (Beta vulgaris altissima) pomocí produkce

antibiotik viskosinamidu a 2,4-diacetylfluoroglucinolu, železitých chelátových sideroforů, kyanidu a enzymu endochitinázy (Nielsen a kol. 1998). 3.2 Serratia Serratia

jsou

G-

nesporulující,

fakultativně

anaerobní,

pohyblivé

tyčinky.

Biochemicky jsou značně aktivní, převažuje fermentativní nebo respirační typ metabolismu. Často tvoří pigmenty, například prodigiosin, které je chrání před slunečním zářením (Votava a kol. 2003).

Obr. 6 Biosyntéza prodigiosinu u Serratia marcescens. MAP a MBC jsou prekurzory identifikované na mutantech (Williams 1973).

Také rody Serratia jsou často asociovány s rostlinnými kořeny a mají antifungální

vlastnosti, proto se používají pro biologickou kontrolu rostlinných patogenů. Například 20

Serratia liquefaciens, vyskytující se v rhizosféře karafiátů, se užívá pro ochranu kořenových řízků a S. marcescens B2 potlačuje

půdní nemoci u bramboříků. S. plymuthica má

antifungální účinky proti Fusarium culmorum, Pythium spp. a dalším houbovým patogenům (Kurze a kol. 2001).

Některé chitinolytické bakterie a houby, například Serratia marcescens, jsou

biologické kontrolní agens (BCA) chránící rostliny proti patogenním houbám. Chitin, nerozpustný

lineární

1,4-β-glykosidicky

pospojovaný

polymer

N-acetylglukosaminu

(GlcNac), je významná stavební složka většiny buněčných stěn u hub (Berg a kol. 1999).

S. plymuthica kmen HRO-C48 se nachází v rhizosféře řepky olejky (Brassica napus) a

jako biologické kontrolní agens splňuje následující kritéria: vysoká chitinolytická aktivita působící proti houbovým patogenům, produkce rostlinného růstového hormonu indol-3octové kyseliny, relativní neškodnost k lidskému zdraví a životnímu prostředí

a nízká

rezistence k antibiotikům. S. plymuthica kmen HRO–C48 je účinný proti vadnutí a kořenové

hnilobě u jahod (Fragaria x ananassa) způsobených Verticillium dahlie a Phytophthora cactorum (Kurze a kol. 2001).

Kmen HRO-C48 produkuje siderofory a antibiotikům podobné látky. Přímé

antifungální účinky mohou být založeny na antibióze a produkci lytických enzymů. S. plymuthica kmen HRO-C48 produkuje různé chitinázy. Chitinolytický systém je tvořen ze dvou endochitináz, chitobiosidázy

a dvou N-acetyl-β-1,4-D-hexosaminidáz,

včetně

chitobiázy. N-terminální aminokyselinová sekvence endochitinázy je podobná chitináze u Serratia marcescens (Berg a kol. 1999). 3.3 Streptomyces Členové rodu Streptomyces jsou G+ bakterie patřící mezi aktinomycety. Většinou

tvoří rozsáhlé vzdušné mycelium s dlouhými řetízky spor. Jsou významnými producenty antibiotik (Rosypal a kol. 2003).

Tyto bakterie jsou velmi citlivé vůči kyselým podmínkám. Vyplývá to z jejich

rozšíření v kyselých půdách. Ve vysoce kyselých půdách je jejich množství často menší než 1% celkového množství bakterií, růst je prakticky potlačen v minerálních půdách s pH 5.0

nebo méně. Některé kmeny streptomycet vyskytující se v kyselých půdách jsou více

tolerantní ke kyselým podmínkám než kmeny z neutrálních nebo alkalických půd. Tato tolerance je ovlivněna i dalšími faktory, jako je konkurence, vlhkost a dostupnost dusíku.

21

Mohou být právě tak důležité jako půdní pH v ovlivnění vývoje těchto bakterií (Hagedorn 1976).

Streptomyces spp. jsou schopny produkovat široké spektrum antibiotik jako

sekundárních metabolitů, stejně jako rozmanité množství enzymů degradujících buněčnou stěnu hub, jako jsou celulázy, hemicelulázy, chitinázy, amylázy, glukanázy a jiné. Streptomyces spp. mohou vystupovat jako mykoparazité houbových spor a hyf, které ničí

pomocí výše uvedených extracelulárních enzymů. Sacharidy ovlivňují u streptomycet produkci antibiotik a vzájemné vztahy mezi bakteriální buňkou a buněčným povrchem

houbové hyfy.

Streptomyces ambofaciens potlačuje Pythium, které způsobuje opadávání semenáčků

u rajčat (Solanum lycopersicon), a Fusarium, které způsobuje vadnutí bavlníku (Gossypium herbaceum). Většina poškození Pythium nastane v počátečním stádiu klíčení semen, kdy

sazenice uvolní velké množství výměšků a zralé buněčné stěny nejsou ještě plně vytvořeny.

Podobné potlačení kořenových chorob způsobují některé druhy streptomycet ve formě spor, mycelia, nebo kombinace spor a mycelia.

Rhizoctonia, způsobující kořenovou hnilobu hrachu (Pisum sativum), je potlačována S.

hygroscopicus var. geldanus pomocí produkce geldanamycinu, antibiotika produkovaného tímto kmenem v půdě. Mnoho studií

naznačuje, že kmeny rodu Streptomyces jsou

kvantitativně i kvalitativně důležité v rhizosféře, mohou zde působit jako rostlinné růstové stimulátory, stejně jako kořenoví kolonizátoři (Yuan a Crawford 1995). Obr. 7 Chemická struktura geldanamycinu

(http://www.sigmaaldrich.com/sigma/datasheet/g3381dat.pdf).

Streptomyces kmen WYEC108 (později se ukázalo, že jde o druh Streptomyces

lydicus) je antagonista Pythium ultimum a Rhizoctonia solani. Druhy rodu Pythium jsou

významné půdní patogeny, které způsobují hnilobu semen 22

a před- a poemergenční

opadávání semenáčků u široké škály hostitelských rostlin. Kmen Streptomyces lydicus WYEC108 je silný antagonista různých houbových patogenů. Mechanismus spočívá v

produkci extracelulárních antifungálních metabolitů. Když byly spory nebo vlákna S. lydicus WYEC108 použity pro obalení hrachových semen, semena byla chráněná před invazí P. ultimum. Kolonizace kořenových špiček kmenem WYEC108 může dlouhodobě tlumit

kořenové nemoci. Mladé buňky v kořenových špičkách jsou více náchylné k útokům půdních houbových patogenů (Yuan a Crawford 1995).

Obr. 8 Kmen S. lydicus WYEC108 ničící buněčnou stěnu hyfy P. ultimum P8 (Yuan a Crawford 1995).

Kmeny streptomycet kolonizující kořeny se využívají k nahrazení nebo k doplnění

chemických fungicidů v zemědělství (Yuan a Crawford 1995). 3.4 Burkholderia

Členové tohoto rodu jsou G- nefermenutjcí štíhlé tyčinky, rovné nebo mírně zahnuté,

neschopné fermentovat glukózu, ovšem štěpící ji aerobně respiračním mechanismem (Votava a kol. 2003).

Burkholderia sp. kmen PsJN, který byl původně určen jako Pseudomonas sp. kmen

PsJN, je bakterie stimulující rostlinný růst. Byla izolována jako kontaminanta symbionta cibulových kořenů Glomus vesiculiferum. Tato bakterie slouží jako PGPB, snižuje hladinu

zpomalujícího hormonu etylenu pomocí produkce deaminázy 1-aminocyklopropan-123

karboxylové kyseliny (ACC). Kmen PsJN také vykazuje biologickou kontrolní aktivitu proti plísni šedé a může efektivně chránit před Botrytis cinerea. Tato bakterie byla objevena v

kořenech a stoncích brambor (Solanum tuberosum) a rajčat (Solanum lycopersicon), v listech,

stoncích a kořenech révy vinné (Vitis vinifera) (Reiter a kol. 2005).

Obr. 9 Kořenový povrch a kořenové vnitřní pletivo Vitis vinifera kolonizované Burkholderia

sp. kmenem PsJN (Reiter a kol. 2005).

Burkholderia, stejně jako ostatní PGPB kolonizuje nejprve kořenové povrchy. Po

tomto počátečním kolonizačním kroku mohou tyto bakterie vstupovat do kořenů skrz trhliny a/nebo procházejí kořenovými špičkami nebo přes střední lamelu epidermální vrstvy. Buňky

PsJN také kolonizují rhizodermální buňky, mezibuněčné a vnitrobuněčné prostory kortikálních buněk, endodermis a xylemové cévy. Burkholderie mohou narušit kořenová

vnitřní pletiva - procházejí mezi epidermálními a kortikálními buňkami a mohou proniknout centrálním válcem porušením endodermis. Buňky PsJN také produkují endoglukanázu a

endopolygalakturonázu, enzymy degradující buněčnou stěnu. Byla pozorována hostitelská obranná reakce, hromadění fenolických látek v některých kortikálních buňkách, jako následek kolonizace kmenem PsJN. Tento kmen se šíří ke

vzdušným částem rostliny pomocí

transpiračního proudu z kořenových xylémových cév (Reiter a kol. 2005). 3.5 Bacillus

Rod Bacillus, v přírodě velmi rozšířený, zahrnuje G+, aerobní, případně fakultativně

anaerobní tyčinky. Většinou jsou pohyblivé díky peritrichálně umístěným bičíkům. Důležitým

znakem tohoto rodu je schopnost tvořit endospóry, sporulace probíhá pouze za přítomnosti kyslíku (Votava a kol. 2003).

24

Bacillus thuringiensis potlačuje virulenci regulovanou quorum sensing (QS) u

rostlinného patogenu Erwinia carotovora díky mikrobiálnímu antagonismu. E. carotovora produkuje a reaguje na signálové acyl laktony homoserinu (AHL) při regulaci produkce antibiotik a expresi virulence. Kmeny B. thuringiensis mají AHL laktonázu, která je účinným

AHL degradujícím enzymem. B. thuringiensis nezasahuje do růstu E. carotovora, ale ruší

hromadění AHL signálních molekul. B. thuringiensis významně snižuje dopad tohoto

patogenu, který způsobuje měkkou hnilobu brambor (Solanum tuberosum). Virulence E.

carotovora je závislá na schopnosti produkovat a vylučovat enzymy degradující buněčnou

stěnu rostlin, včetně pektátové lyázy, pektinové lyázy a polygalakturonázy. Kmeny B. thuringiensis neprodukují antibiotikům podobné látky, které by mohly zasahovat do šíření E.

carotovora.

Bacillus cereus a Bacillus mycoides, druhy blízce příbuzné B. thuringiensis, také

produkují AHL laktonázy. Tyto enzymy bacilů jsou vysoce konzervované, sdílejí více než 90% homologii na peptidové úrovni.

B. fusiformis, který neprodukuje AHL degradující enzymy, má mnohem nižší účinky

na hromadění AHL než kmeny B. thuringiensis, které produkují AHL laktonázy.

Bacillus sp. kmen A24 má AHL laktonázovou aktivitu a působí jako biologické

kontrolní agens proti E. carotovora. Také působí proti Agrobacterium tumefaciens, které způsobuje crown gall nemoc u rajčete (Solanum lycopersicon) (Dong a kol. 2004).

Některé druhy Bacillus produkují in vitro antibiotika, jako například oligomycin A,

kanosamin, zwittermicin A a xantobacin (Compant a kol. 2005). Mohou také spustit ISR pomocí 2,3-butandiolu (Haas a Défago 2005). Často se používají jako bakteriální hnojiva (Maier a kol. 2000).

Obr. 10 Chemická struktura zwittermicinu A (Broderick a kol. 2000).

25

3.6 Paenibacillus Paenibacillus jsou G+ tyčinky tvořící oválné endospóry zduřující buňku a jsou

pohyblivé pomocí bičíků. Jsou fakultativně anaerobní, chemoorganotrofní a některé druhy produkují sliz (www.en.wikipedia.org/wiki/Paenibacillus).

Paenibacillus polymyxa, dříve nazývaný Bacillus polymyxa, je běžná půdní bakterie

patřící do skupiny PGPB. Nepřímé mechanismy podpory růstu rostlin u Paenibacillus polymyxa zahrnují sekundární bakteriální metabolity jako kyanovodík, siderofory a

antibiotika. Jeho naočkováním

dochází k potlačení některých rostlinných patogenů. Do

přímých mechanismů patří konkurence o živiny. Tato bakterie má relativně široký hostitelský

okruh. Nachází se na obilninách a některých dvouděložných rostlinách, včetně Arabidopsis thaliana. U Arabidopsis thaliana dochází po naočkování Paenibacillus polymyxa ke změnám v expresi genů a

k vytvoření částečné rezistence k biotickým i abiotickým stresovým

faktorům. P. polymyxa je antagonista Erwinia carotovora (Timmusk a Wagner 1999). Obr. 11 Vlevo rostlina pěstovaná v přítomnosti

P. polymyxa. Došlo k potlačení vadnutí

rostliny. Vpravo kontrolní rostlina (Timmusk a Wagner 1999).

Paenibacillus polymyxa syntetizuje indol-3-etanol (TOL). TOL se snadno dostává do

rostlin, kde slouží jako zásobní prekurzor indoloctové kyseliny (IAA). Může být převedený na aktivní fytohormony IAA pomocí rostlinné TOL-oxidázy a O2. Navíc převedení TOL na IAA

uvnitř kořenů může snížit pravděpodobnost nadbytku IAA v rhizosféře a následný škodlivý

26

účinek na kořenový vývoj. Paenibacillus polymyxa také navozuje ISR v rostlinách (PerselloCartieaux a kol. 2003).

Paenibacillus sp. kmen 300 a Streptomyces sp. kmen 385 produkují extracelulární

chitinázy k potlačení Fusarium oxysporum f. sp. cucumerinum, které napadá okurky (Cucumis

sativus). Syntetizují také β-1,3-glukanázu a tak lyzují buněčnou stěnu tohoto houbového

patogenu (Compant a kol. 2005). 3.7 Delftia

Delftia jsou G- rovné nebo mírně zakřivené tyčinky, vyskytující se samostatně nebo v

párech. Pohybují se pomocí peritrichálních bičíků a v buňkách se jim hromadí poly-β-

hydroxybutyrát (PHB). Kolonie jsou mírně vypouklé, hladké, s nepravidelnými difůzními okraji.

Téměř všechny kmeny Delftia se vyskytují v půdě, v prostředí silně kontaminovaném

organickými škodlivinami

nebo v kalech biologických čistíren odpadních vod. Mohou

degradovat škodlivé organické i anorganické látky. D. acidovorans P4a mineralizuje 2,4-

dichlorofenoxyoctovou kyselinu (2,4-D) a 2-metyl-4-chlorofenoxyoctovou kyselinu v

alkalických podmínkách. D. acidovorans kmen WDL34 degraduje 3,4 DCA (3,4dichloroanilin). Tereftalát 1,2-dioxygenázový systém (TERDOS) byl objeven v buněčných

extraktech z D. tsuruhatensis T7. Další enzymy izolované z D. acidovorans, která byla dříve

označována jako Pseudomonas acidovorans, jsou součástí xenobiotických degradujících drah pro látky jako jsou organofosfáty, haloacetáty, nitrobenzen, anilin nebo 3-chloroanilin a další.

Delftia tsuruhatensis kmen HR4 byl izolovaný z rhizosféry rýže (Oryza sativa). Tento

kmen potlačuje růst různých rostlinných patogenů, zvláště třech hlavních rýžových patogenů,

Xanthomonas oryzae pv. oryzae, Rhizoctonia solani a Pyricularia oryzae Cavara, má vysokou biologickou kontrolní aktivitu a schopnost fixovat atmosférický dusík. HR4 působí proti

rýžové bakterióze a ničení rýžových pouzder. Navržené mechanismy, kterými Delftia působí

jako PGPB jsou produkce antibiotik, sideroforů, lytických enzymů nebo navození systematické rezistence. Kmen HR4 může také pronikat dovnitř rýžových kořenů. Jeden gram

čerstvého rýžového kořenu může vyměšovat 2,25 mg organických kyselin do rhizosféry. Všechny tyto organické kyseliny mohou být zdrojem uhlíku pro acidofilní kmeny bakterií

Delftia. Pokles pH v půdě z 6 na 4 vlivem biochemických procesů, jako jsou nitrifikace a oxidace železa je výhodné pro osídlování a růst kmenů Delftia (Han a kol. 2004).

27

3.8 Stenotrophomonas Stenotrophomonas jsou G- tyčinky, štíhlé, mírně zahnuté, pohyblivé a nefermentující

(Votava a kol. 2003).

Tyto bakterie mohou degradovat xenobiotické látky a tím dekontaminovat půdu.

Produkují fytohormon indol-3-octovou kyselinu (IAA), který je odpovědný za podporu rostlinného růstu. Stenotrophomonas také produkují antifungální antibiotika jako maltofilin,

alteramid a xantobacin A spolu s širokým spektrem extracelulárních enzymů jako chitinázy,

proteázy a glukanázy. Mnohé z těchto metabolitů jsou odpovědné za biotechnologické

aplikace při dekontaminaci půdy a v biologické kontrole nad rostlinnými patogeny (Suckstorff a Berg 2003).

Obr. 12 Dvě tautomerické struktury sodíkových solí xantobacinu A a jejich metanolytický produkt (Hashidoko a kol. 1999).

Stenotrophomonas dříve patřily do rodu Pseudomonas a později do rodu

Xanthomonas. Na rozdíl od Xanthomonas, u Stenotrophomonas nebyla zjištěna žádná fytopatogenní aktivita, ale za určitých podmínek mohou poškodit rostliny nebo jejich části. Stenotrophomonas mají pozitivní účinky na kořenovou délku a vývoj kořenových vlásků,

zatímco negativně působí na délku stonků a na vývoj listů. Účinky jednotlivých druhů Stenotrophomonas jako biologických kontrolních agens jsou závislé na množství

produkované indol-3-octové kyseliny a hlavně na koncentraci jednotlivých bakterií. Optimální koncentrace pro stimulaci růstu rostlin je 105 CFU, při vyšší nebo nižší koncentraci

se růst zpomaluje. Například S. rhizophila DSM 14405 při koncentraci 105 CFU může zvýšit

vyvíjení kořenových vlásků až o 71%. Koncentrace také ovlivňuje počet listů na rostlině. Vysvětlení závislosti účinků Stenotrophomonas na koncentraci je pravděpodobně v regulaci sekundárních metabolitů. Tento jev je závislý na komplexní regulaci a dovoluje bakteriím

detekovat jejich vlastní hustotu pomocí produkce AHL a tím reagovat na různé faktory 28

vnějšího prostředí. Avšak žádné quorum sensing mechanismy nebyly objeveny u S. maltophilia a S. rhizophila (Suckstorff a Berg 2003).

Největší účinky jako PGPB má S. nitritireducens (Suckstorff a Berg 2003). Kombinací

bakterií Pseudomonas fluorescens a Stenotrophomonas maltophila dochází ke zlepšení

ochrany řepy cukrovky (Beta vulgaris) proti Pythium, které způsobuje opadávání semenáčků

(Whipps 2001).

3.9 Azospirillum Azospirillum jsou bakterie žijící samostatně v půdě, nebo v těsných asociacích s

rostlinami v rhizosféře. Nachází se v rhizosféře tropických a subtropických travin Jsou to Gtyčinky, pohyblivé pomocí jednoho bičíku a jsou schopny vázat atmosférický dusík (www.en.wikipedia.org/wiki/Rhodospirillaceae).

Mechanismus, kterým Azospirillum spp. může chránit rostliny, je složen z více vlivů,

zahrnující syntézu fytohormonů, N2 fixaci, aktivitu nitrát reduktázy a zvýšenou absorpci minerálů. Nevýhodou je, že Azospirillum spp. nerozpouští fosforečnany. Proto ke zvýšení

dostupnosti dusíku a fosforu jako živin u rostlin se používá kombinace bakterií rodu Azospirillum a bakterií rozpouštějících fosfor. Mikrobiální fixace prodlužuje metabolickou

aktivitu při opětovném použití buněk.

Alternativní přístup pro používání bakterií rozpouštějících fosfor jako mikrobiálních

očkovacích látek je používání smíšených kultur nebo jejich společné naočkování s ostatními

mikroorganizmy. Například společné naočkování kmenů Pseudomonas striata a Bacillus

polymyxa vykazuje schopnost rozpouštět fosforečnany s kmenem Azospirillum brasilense. To

má za následek významné zlepšení stavu obilnin a výnosu sušiny, s průvodním zvýšením N a

P absorpce. Společné naočkování pšenice Azospirillum lipoferum kmenem 137 a Bacillus

megaterium poskytuje více vyvážené výživy pro rostliny a zlepšení v absorpci N a P.

Kombinované očkování bakterií rozpouštějících fosforečnany a Azospirillum nebo

Azotobacter má prospěšný vliv na výnos, stejně jako na N a P hromadění v různých plodinách (Hesham a El-Komy 2005). 3.10 Rhizobium

Rhizobium jsou G- aerobní tyčky, heterotrofní. Některé druhy jsou schopny vázat

atmosférický dusík. Rhizobium leguminosarum žije v symbióze s bobovitými rostlinami. Tyto 29

bakterie se vyskytují v hlízkách kořene jako tzv. bakteroidy, které vážou vzdušný dusík do formy využitelné rostlinou (Rosypal a kol. 2003).

Rhizobium leguminosarum také produkuje růstové faktory jako kyselinu indoloctovou

a cytokiny, které chrání růst v počátečním stádiu u hlávkového salátu (Persello-Cartieaux a kol. 2003).

3.11 Azotobacter Azotobacter jsou G- aerobní tyčinky, chemoheterotrofní, některé druhy se vyznačují

schopností vázat vzdušný dusík (Rosypal a kol. 2003).

Azotobacter se používají jako bakteriální hnojiva, ke zvýšení výnosu dochází vlivem

asociativní fixace dusíku a rozpouštění fosfátů (Maier a kol. 2000). 3.12 Ralstonia

Ralstonia je rodem relativně novým. Jsou to G- štíhlé, rovné nebo mírně zahnuté

tyčinky, nefermentující. Dříve patřily do rodu Pseudomonas (Votava a kol. 2003). Ralstonia

solanacearum

může

hydrolyzovat

kyselinu

fusarovou,

fytotoxin

produkovaný různými druhy Fusarium. Patogenní toxiny totiž mohou mít širokospektrální

aktivitu k potlačování růstu mikrobiálních konkurentů nebo k detoxifikaci antibiotik produkovaných některými biologickými kontrolními mikroorganizmy (Compant a kol. 2005). 3.13 Lactobacillus a bakterie mléčného kvašení Laktobacily jsou G+ nesporulující tyčinky pravidelného tvaru, mezofilní a heterotrofní

(Rosypal a kol. 2003).

Některé bakterie mléčného kvašení izolované z rostlinných povrchů jsou antagonisté

fytopatogenů Xanthomonas campestris, Erwinia carotovora a Pseudomonas syringae. Tyto

bakterie produkují antibiotika nebo antibiotikům podobné látky, jako acidofilin a laktocidin

produkované Lactobacillus acidophilus, laktolin produkovaný Lactobacillus plantarum nebo nisin produkovaný Streptococcus lactis. Také pomocí konkurence o živiny a snižováním

redukčně-oxidačního potenciálu mohou působit jako antagonisté.

Informace o výskytu laktobacilů na žijících rostlinách jsou vzácné, obvykle se

vyskytují na uříznutých nebo pohmožděných rostlinných pletivech. Informace o vzájemném 30

ovlivňování mléčných bakterií na rostlinách a fytopatogenních bakterií jsou také vzácné. Antagonistická aktivita laktobacilů byla zjištěna při pokusech s in vitro izoláty.

Mezi největší antagonisty rostlinných patogenů patří L. plantarum, L. hilgardii, L.

brevis, L. vaccinostercus a L. bavaricus. L. plantarum je nejvýznamnější antagonista P.

syringae u fazole (Pheseolus vulgaris).

Bakterie mléčného kvašení mohou mít budoucnost jako biologické kontrolní agens

posklizňových rostlinných chorob ovoce i zeleniny (Visser a kol. 1986)

4. Supresivní a napomáhající půdy Půdní ekosystémy jsou bohaté na biologické zdroje, které mohou být spojeny s

využitím ke kontrole rostlinných nemocí. Půdy, které mají přirozeně nízký výskyt onemocnění jsou obvykle označovány jako supresivní půdy (Mazzola 2002). Jsou to půdy, ve

kterých se patogeny nemohou ujmout, nebo se ujmou, ale nedojde ke vzniku onemocnění. Patogeny se mohou i ujmout, způsobit počáteční onemocnění, ale onemocnění je méně rozsáhlé a závažné (Trigiano a kol. 2003).

Supresivní půdy obsahují poměrně vysoký počet bakterií a hub, které jsou antagonisty

patogenů. Mohou také obsahovat některé z nepatogenních Fusarium oxysporum kmenů.

Nepatogenní kmeny často úspěšně konkurují patogenním kmenům o potraviny a prostor. Potlačení rostlinných nemocí může také ovlivnit půdní struktura, chemická charakteristika a

obsah organických látek. V některých případech se potlačující schopnost půd zvyšuje doplněním půdy biologickými kontrolními houbami a bakteriemi (James a Perez 1999).

Potlačení nemocí může být charakterizováno jako všeobecné nebo specifické.

Všeobecné potlačení je následek celkové biologické diverzity mikroorganizmů, které zabraňují rozvoji rostlinných nemocí. Je přenosné mezi půdami. Specifické potlačení je

následek přímého působení jednoho mikroorganizmu na známý patogen a není přenosné mezi půdami. Typický příklad specifického potlačení je naočkování konkrétního biologického agens k potlačení konkrétní nemoci (Trigiano a kol. 2003).

Zemědělské supresivní půdy se vyskytují celosvětově, například v Salinas Valley

v Kalifornii, v Chateaurenard regionu ve Francii, na Kanárských ostrovech a v Broye Valley ve Švýcarsku.

Přírodní supresivní půdy byly popsány ve vztahu k některým patogenům, například

Gaeumannomyces graminis var. tritici, které způsobuje tzv. „take-all“ nemoci, způsobující 31

černání kořenů rostlin, zakrnění a v některých případech zbělání a vysušení zrn, Fusarium oxysporum, které způsobuje vadnutí rajčat, ředkviček a banánů, Phytophthora cinnamoni,

které způsobuje hnití eukalyptu, Pythium spp. a Rhizoctonia solani, které způsobují opadávání

sazenic u řepy a ředkviček. Mohou potlačovat také Thielaviopsis basicola způsobující černou

hnilobu kořenů u tabáku, fazole a třešní, Streptomyces scabies, způsobující strupovitost brambor, Ralstonia solanacearum, způsobující vadnutí rajčat, a tabáku, a hlístici Meloidogyne incognita, způsobující kořenové otoky a puchýře na některých plodinách, převážně v tropických a subtropických zemích.

Opakem supresivních půd jsou napomáhající půdy. Jsou to půdy, které podporují

rozvoj různých nemocí (Haas a Défago 2005).

5. Bakterie v biologické kontrole významných nemocí rostlin 5.1 Take-all nemoci Jednou z nejvýznamnějších světových houbových nemocí pšenice (Tritium sativum),

ječmene (Hordeum aestivum) i travin je tzv. „take-all disease“, způsobená Gaeumannomyces graminis. Způsobuje velké ničení ječmene a pšenice, které se pěstují každý rok na stejném místě. Dokáže přežít v rostlinných zbytcích a následující rok napadá kořeny a ničí celý

kořenový systém rostliny. Dokáže zničit i celou úrodu, od toho je odvozen název take-all. G.

graminis napadá i traviny, speciálně druhy rodu Agrotis, které se používají na golfová hřiště

(Deacon 2001).

Napadené rostliny tvoří na poli kruhová místa, dochází k zastavení růstu rostlin a k

jejich zblednutí. Část infikovaných rostlin uhyne před dozráním, ostatní tvoří zakrslé klasy se

zakrnělými nebo žádnými zrny. Kořeny, koruna a báze stonku začnou hnít, bazální části rostliny zhnědnou nebo zčernají, rostlina je snadno vytažitelná z půdy (Eisenbach a vanTiederman 2000).

32

Obr. 13 Take-all nemoc na kořenech pšenice (Eisenbach a vanTiederman 2000).

Druhy Gaeumannomyces graminis jsou rozděleny do tří variet, které se liší v

morfologických rysech a v různé patogenitě. G. graminis var. tritici je patogen pšenice a

ječmene. G. graminis var. avenae je patogen ovsa (Avena sativa) a travin. G. graminis var.

graminis je slabý parazit kukuřice (Zea mays) a travin. Všechny tyto variety G. graminis mohou napadat traviny. Rostou na povrchu kořenů jako tmavé hyfy. Větve z těchto hyf

pronikají kůrou kořenů. Jejich schopnost nákazy závisí na zásobách živin a na stupni

rezistence rostlinného pletiva. Při úspěšné infekci tímto patogenem prorostou hyfy kořenovou kůrou, pronikají a ničí kořenový floém, pak napadají xylém a způsobují barevnou skvrnitost a blokaci xylémových cév. Houba se pak rozšiřuje směrem k bázi stonku a zabíjí rostlinu. G.

graminis přežívá jako saprofyt v infikovaných kořenech a stoncích. Ve vhodných podmínkách

může produkovat pohlavní stádium, lahvovité perithecium, ze kterého se tvoří askospory (Deacon 2001).

Obr. 14 Kořen pšenice napadený G. graminis. Dochází ke vzniku barevných skvrn, hyfy patogenní houby pronikají do kořene (Deacon 2001).

33

Postupů k odstranění této nemoci na citlivých plodinách je několik, zahrnují orbu,

střídání plodin, hnojiva a používání chemicky a biologicky mořených osiv (McSpadden Gardener a Keller 2001). Na polích s výskytem take-all nemocí by se neměla pěstovat pšenice déle než rok nebo dva. Pěstováním plodin, které nejsou náchylné k tomuto onemocnění, jako

například luštěnin (vojtěška, jetel, sojové boby, fazole) a kořenové zeleniny (řepa, brambory)

dochází k redukci tohoto patogenu. Také je důležité vyvážené hnojení. Používáním fosfátových a draselných hnojiv dojde k zlepšení kořenového systému rostlin. Orání předchází šíření spor G. graminis a podporuje rozklad této houby v půdě. Další účinný krok v boji proti

tomuto patogenu je ničení travnaté plevele, která slouží jako zásobárna G. graminis

(Eisenbach a vanTiederman 2000).

Je však možné nepřetržité pěstování pšenice i ječmene, i když je patogen přítomen v

půdě. Po čtyřech až šesti letech pěstování monokulturní pšenice nebo ječmene dochází v půdě

k přirozenému potlačení tohoto patogenu nazývané take-all pokles (TAD = take-all decline).

Potlačující faktory u TDF v různých oblastech, kde se pěstuje pšenice nebo ječmen, jsou různé, půdní mikrobiální společenstvo je totiž ovlivňováno rostlinnými i půdními složkami. Nedávná studia ukázala, že fluorescentní Pseudomonas produkující antibiotika jsou schopny

potlačovat take-all nemoci a to pomocí syntézy 2,4-diacetylfluoroglucinolu (2,4 - DAPG).

Psedomonády, které produkují tato širokospektrální antibiotika mohou potlačovat

různé houbové kořenové patogeny. Tyto bakterie jsou přítomny v půdách s TAD faktory a potlačení take-all nemocí je závislé na jejich přítomnosti v půdách. V rhizosférách rostlin

nakažených take-all nemocemi je zvýšeno množství těchto bakterií (McSpadden Gardener a Keller 2001). Existuje přesvědčivý důkaz, že také konkurence ostatních hub v rhizosféře rostliny hraje důležitou roli v potlačení tohoto patogenu (Deacon 2001). 5.2 Crown gall nemoci Další významnou a důležitou nemocí rostlin způsobující velké ekonomické ztráty je

tzv. „crown gall disease“. Napadá dvouděložné rostliny, hlavně čeleď růžovité, jako jabloně,

hrušky, třešně, meruňky, růže. Také napadá mandloně a vlašské ořechy, vinnou révu a

maliník (Deacon a kol. 2002). Zřídka napadá rostliny jako bavlník, řepu cukrovku, rajčata, fazole a vojtěšku. Crown gall tvoří na kořenech, bázích nebo korunách rostlin nádory připomínající puchýře (Kado 2002). Podle těchto nádorů získala tato nemoc i název (Deacon

a kol. 2002). Tyto nádory jsou tvrdé a silné. Když jsou starší než jeden rok, začnou se kroutit a drobit. Uvnitř těchto nádorů mohou žít různé druhy hmyzu, například škvoři (Kado 2002). 34

Obr. 15 Crown gall nemoc tvořící nádory na bázi stonku u růže (Deacon a kol. 2002).

Crown gall nemoc způsobuje Agrobacterium tumefaciens, G- tyčkovitá, pohyblivá,

nesporulující bakterie, blízce příbuzná rodu Rhizobium (Deacon a kol. 2002). Běžně se

nachází u kořenů různých polních rostlin. Tato bakterie může volně přežívat v různých půdách s dobrým provzdušňováním nebo na povrchu kořenů některých plevelů.

Agrobacterium tumefaciens se dostane do půdy z poškozených nebo opadlých nádorů

nakažených rostlin. Dalšímu šíření bakteriálních buněk pomáhá zavlažování a zahradnické

nářadí (Kado, 2002). Bakterie přenese část své DNA do rostliny, tato DNA se začlení do rostlinného geonomu, tím způsobí vznik nádorů a změny v metabolismu rostliny (Deacon a kol. 2002).

Kmeny Agrobacterium jsou rozděleny do tři biovarů podle jejich využívání sacharidů.

Jednotlivé biovary napadají stejné rostliny, vyjímkou je biovar 3, který je celosvětový patogen révy vinné (Deacon a kol. 2002).

Obr 16 Cyklus crown gall nemoci způsobené Agrobacterium tumefaciens (Kado 2002).

35

Jedna buňka může vyvolat růst nádoru, ale velikost tohoto nádoru závisí na množství

buněk napadajících rostlinu. Takže platí - čím větší počet buněk Agrobacterium tumefaciens

napadne rostlinu, tím vznikne větší nádor a závažnější onemocnění. Rostliny systémově

infikované touto bakterií jí poskytují útočiště po dlouhou dobu bez zřetelných příznaků. Některé pole slouží jako rezervoáry A. tumefaciens. Jsou na polích, kde se několik let po sobě

pěstují obilniny, nebo na polích kde se předtím pěstovaly ovocné stromy a ořechy. Některé

plevele mohou sloužit jako přírodní hostitel A. tumefaciens, příkladem je povíjnice (Ipomoea leptphylla) (Kado 2002).

90% a více druhů Agrobacterieum izolovaných z kořenového povrchu rostlin je

nepatogenních. Tyto nepatogenní kmeny byly pojmenovány jako Agrobacterium radiobacter. Z toho vyplývá, že většina těchto bakterií je nepatogenních a pouze malé procento z nich, které obsahuje Ti konjugativní plastid, je patogenních (Deacon a kol. 2002).

Redukce A. tumefaciens zahrnuje několik různých metod. Mezi ně patří střídání

plodin, používání směsí založených na kreozotu a mědi, silná oxidační činidla jako chlornan sodný.

Některé druhy A. tumefaciens jsou citlivé na antibiotikum agrocin. Agrocin je

produkovaný A. radiobacter K84. Agrocin 84 je analog agrocinopinu A, látky produkované v

nádorech způsobených A. tumefaciens. Agrocin 84 napodobuje agrocinopin A, je veden

transportním systémem A. tumefaciens a uvnitř této bakterie inhibuje DNA replikaci a

buněčný růst (Kado 2002).

Díky jedinečnému mechanismu působení se A. tumefaciens používá při šlechtění

rostlin. Vybrané geny se integrují do T-DNA bakteriálního plazmidu, pak se mohou

integrovat do rostlinných chromozomů při přenosu T-DNA. Touto cestou se mohou integrovat do bakteriálního genu insekticidní toxinové geny a geny rezistentní k herbicidům (Deacon a kol. 2002).

6. Genetické modifikace a genetické inženýrství rostlin Používání biologických kontrolních agens k potlačování půdních nemocí je často

neúspěšné díky různým podmínkám na polích, jako jsou například nedostatečná koncentrace antibiotik, proměnlivý počet PGPB, genetická diverzita patogena. Důležitým faktorem je i počasí.

Jedním z možných přístupů k překonání těchto různých podmínek je genetická

modifikace mikroorganizmů (GMM = genetically modified microorganisms) pro zvýšenou 36

a/nebo konstitutivní biosyntézu antibiotik. Geneticky modifikované mikroorganizmy by neměly mít vliv na růst rostliny, ale mohou ovlivňovat rhizosférickou původní mikroflóru (Viebahn a kol. 2003).

Genetické inženýrství rostlin zahrnuje několik metod k ochraně těchto rostlin. Patří

mezi ně integrace selektovaných genů do bakteriální DNA nebo používání malých mikroprojektilů pokrytých DNA, které jsou pak zaváděny do rostlinných buněk (Deacon a kol. 2002).

Například geneticky upravená Pseudomonas putida kmen WCS358r konstitutivně

produkuje

antimikrobiální

fenazin-1-karboxylovou

kyselinu

(PCA)

nebo

2,4-

diacetylfluoroglucinol (DAPG), které mohou způsobit dočasné změny v bakteriální i houbové

rhizosférické mikroflóře u pšenice. Takto geneticky modifikovaná Pseudomonas má větší účinky v potlačování houbových patogenů, ale nijak neovlivňuje rostlinný růst (Viebahn a kol. 2003).

Některé plodiny se geneticky upravují k větší rezistenci k herbicidům. Tyto herbicidy

pak mohou být použity k ničení plevele bez poškození úrody.

Geneticky modifikovaná rajčata potlačují gen pro polygalakturonázu, enzym

degradující pektin, který způsobuje měknutí ovocných pletiv (Deacon a kol. 2002). Nejznámější

metabolit používaný k biologické kontrole je krystalový toxin

produkovaný Bacillus thuringiensis (Bt). Tento Bacillus produkuje

během svého růstu

parakrystalické tělísko, které je toxické pro specifické skupiny hmyzu. Toxický krystalový Bt

protein je účinný ve střevě hmyzu s alkalickým pH. Ve střevě se váže na specifické receptory a způsobuje ochromení jeho činnosti. Hmyz přestává přijímat potravu a umírá na vyhladovění kombinované s poškozením tkání. Bt toxin se v dnešní době používá jako mikrobiální

insekticid po celém světě. Některé rostliny byly geneticky upraveny pomocí genů kódujících tento toxin a tím získávají vlastní ochranný systém proti hmyzu. Tyto geny byly vneseny

například do brambor (Solanum tuberosum), u kterých zvyšují odolnost proti mandelince bramborové (Maier a kol. 2000).

Obr. 16 Účinnost Bacillus thuringiensis var. kurstaki na housenku

(http://www.nysaes.cornell.edu/ent/biocontrol/pathogens/bacteria.html). 1. Housenka sní listí s Bt (spóry nebo krystalový toxin)

2. Během pár minut se toxin váže na specifické receptory ve stěně střeva, housenka přestane přijímat potravu

37

3. Během pár hodin dojde k poškození střeva, spóry B. thuringiensis a střevní bakterie pronikají do tělních dutin, toxin se začne rozpouštět

4. Během 1-2 dnů housenka umírá na následky infekce způsobené proliferací spór a střevních bakterií do hemolymfy

Další metody, které se používají k ochraně rostlin, jsou virová rezistence pomocí

začlenění genů virové bílkoviny obalu nebo pozitivní RNA, rezistence k houbovým

patogenům pomocí zvýšené exprese enzymů degradujících buněčnou stěnu a ochrana semen rostlin během pozdní fáze jejich vývoje pomocí exprese genů udržujících semena sterilní (Deacon a kol. 2002).

38

Diskuze Rozhodující význam pro účinnost biologických kontrolních agens má jejich

životaschopnost a antagonistická aktivita. Avšak po přidání biologických kontrolních PGPB

do půdy dochází v průběhu času k postupným změnám v potlačení širokého spektra půdních patogenů. Tyto změny mohou být vysvětlovány různými způsoby.

Jedním z možných vysvětlení rozdílů v potlačování patogenů je to, že běžné půdy

obsahují různé kmeny PGPR s různými biologickými vlastnostmi. Jednotlivá společenstva kmenů PGPR jsou specificky adaptována na kořeny hostitelských rostlin a na působení specifických rostlinných patogenů.

Dalším vysvětlením jsou ještě nepoznané a neprozkoumané půdní vlastnosti, zvláště

dostupnost některých minerálů důležitých k biologické kontrole. Například P. fluorescens CHA0 chrání rostlinné kořeny proti houbovým patogenům v půdách obsahujících vodu,

křemičitan hlinitý, bohatých na hořčík a železo. Naopak v půdách, které obsahují vodu, křemičitan hlinitý a draslík k potlačení těchto patogenů nedochází. Z toho vyplývá důležitost půdních minerálů. V půdách s pH 7 je koncentrace rozpustných Cu2+ iontů nižší než Fe3+.

Díky této nízké koncentraci Cu2+ iontů mohou mít některé PGPR konkurenční výhodu proti

rostlinným patogenům. Jsou schopny se při této nízké koncentraci množit a mají lepší schopnosti k získávání mědi.

V praxi by mohlo být účinné používání směsí PGPR kmenů kombinujících produkci

antibiotik a navození ISR. Přirozené půdy by mohly být naočkovány těmito PGPR k lepší

biologické kontrole některých rostlinných patogenů. Avšak účinnost biologických kontrolních

agens při používání v běžných půdách musí být zvýšena. Toho by mohlo být dosaženo pomocí genetických modifikací jednotlivých kmenů bakterií nebo rostlin. Některé země však odmítají potraviny z geneticky modifikovaných rostlin, mají obavy z negativních dopadů na

lidský organizmus a na životní prostředí. Některé studie popisují účinky geneticky modifikovaných bakterií na původní mikrobiální společenstvo.

Používání PGPB jako přírodních hnojiv je pro budoucnost velmi důležité. Jako

komerčně prodávaná přírodní hnojiva se nejčastěji používají sporulující rody Bacillus spp. PGPB tolerantní k pesticidům mohou být použity při redukci používání těchto pesticidů. Umělá hnojiva používaná v dnešní době mají totiž negativní dopad na životní prostředí.

Ještě mnoho specifických otázek však zůstává nezodpovězených. Které signální

molekuly bakteriálního a rostlinného původu řídí expresi genů odpovídajících za biologické

kontrolní vlastnosti? Které bakteriální signály jsou nejdůležitější k navození rezistence přes 39

ISR, SAR a alternativní cesty? Existují specifické mechanismy pro kořenovou kolonizaci rostlin? Jak půdní minerály a další abiotické faktory ovlivňují biologické kontrolní

mechanismy? Jak jsou regulovány účinky houbových patogenů v rhizosféře? Odpovědi na tyto a další otázky mohou přispět k lepšímu pochopení jednotlivých mechanismů biologické

kontroly u PGPB. Pak by mohlo docházet k účinnému kombinování různých kmenů bakterií nebo bakterií s prospěšnými houbami k lepší biologické kontrole rostlinných patogenů. Mohly by se také začít používat biotechnologické metody ke zlepšení kvality jednotlivých kmenů.

40

Závěr Bakterie podporující rostlinný růst slouží jako antagonisté bakteriálních a houbových

nemocí. Některé z těchto nemocí způsobují značné ekonomické ztráty u obilnin a jiných

plodin na celém světě, například take-all nemoc může způsobit až 80% ztráty na polích. Proto je výskyt těchto nemocí důležitým celosvětovým problémem.

PGPB mají význam jako přírodní hnojiva. Aplikace PGPB je však v dnešní době

obtížná, protože mechanismy jejich působení nejsou ještě zcela objasněny. Kmeny fluorescenčních pseudomonád značně přispěly k porozumění těmto mechanismům. Jejich

nevýhodou při praktickém použití je ale ztráta životaschopnosti a účinnosti v půdě po několika týdnech. Lepší trvanlivost v půdě mají sporulující kmeny rodu Bacillus, například

B. subtilis GB03, B. pumilis GB34, B. licheniformis SB 3086. Kromě druhů rodu Bacillus se

jako komerční hnojiva používají i některé druhy rodů Pseudomonas a Streptomyces .

K biologické kontrole rostlinných patogenů patří přirozené i modifikované

mikroorganizmy, geny nebo produkty těchto genů a genetické modifikace rostlin. Díky

genetickým modifikacím jsou rostliny lépe chráněny proti škodlivým faktorům a zároveň jsou regulovány kolísavé účinky kontrolních agens.

41

Seznam literatury

Bashan Y. (1998): Inoculants of plant growth-promoting bacteria for use in agriculture. Biotechnol. Adv. 16: 729-770. Berg G., Frankowski J., Bahl H. (1999): Biocontrol of Verticillium wilt in oilseed rape by chitinolytic Serratia plymuthica. University of Rostock, Microbiology, Gertrudenstrasse 11a, D-18051 Rostock, Germany. Proccedings of the Tenth International Rapeseed Congress 1999 in Canberra (Australia). http://www.regional.org.au/au/gcirc/3/369.htm#P0_0 Berg G., Roskot N., Seidle A., Eberl L., Zock A., Smalla K. (2002): Plant-Dependent Genotypic and Phenotypic Diversity of Antagonist Rhizobacteria Isolated from Different Verticillium Host Plants. Appl. Environ. Microbiol. 68: 3328–3338.

Blumer C., Haas D. (2000): Mechanism, regulation, and ecological role of bacterial cyanide biosynthesis. Arch. Microbiol.173: 170-177.

Broderick A.N., Goodman M.R., Raffa F.K., Handelsman J. (2000): Synergy Between Zwittermicin A and Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki Against Gypsy Moth (Lepidoptera: Lymantriidae). Environ. Entomol. 29: 101-107. Compant S., Duffy B., Nowak J., Clément Ch., Barka E.A.(2005): Use of Plant GrowthPromoting Bacteria for Biocontrol of Plant Diseases: Principles, Mechanisms of Action, and Future Prospect. Appl. Environ. Microbiol. 71: 4951-4959.

Cornelis P., Matthijs S. (2002): Diversity of siderophore-mediated iron uptake systems in fluorescent pseudomonads: not only pyoverdines. Environ. Microbiol. 4: 787-798. Deacon J. (2001): The Microbial World: Biology and control of take-all disease. Institute of Cell and Molecular Biology, The University of Edinburgh. http://helios.bto.ed.ac.uk/bto/microbes/takeall.htm Deacon J., Robertson A., Isbister A. (2002): The Microbial World: Biology and Control of Crown Gall (Agrobacterium tumefaciens). Institute of Cell and Molecular Biology, The University of Edinburgh. http://helios.bto.ed.ac.uk/bto/microbes/crown.htm

Dobiáš L., Dobiášová S., Seman M. (2003): Vztah mezi mikroorganismy a biosféra. Obecná a speciální mikrobiologie, 12-13. MULTEX Soft, s.r.o., Ostrava.

Dong Y.H., Zhang X.F., Xu J.L., Zhang L.H. (2004): Insecticidal Bacillus thuringiensis Silences Erwinia carotovora Virulence by a New Form of Microbial Antagonism, Signal Interference. Appl. Environ. Microbiol. 70: 954-960. Duffy K.B., Défago G. (1999): Environmental Factors Modulating Antibiotic and Siderophore Biosynthesis by Pseudomonas fluorescens Biocontrol Strains. Appl. Environ. Microbiol. 65: 2429-2428. Eisenbach J.D., vanTiederman U. (2000): Take-all diseases of wheat. MycoPix, A Journal of Mycological Images, Vol. 1. www.uoguelph.ca/pdc/Factsheets/PDFs/044WheatTakeAll.pdf 42

Frankowski J., Lorito M., Scala F., Schmidt R., Berg G., Bahl G. (2001): Purification and properties of two chitinolytic enzymes of Serratia plymuthica HRO-C48. Arch. Microbiol. 176: 421-426. Haas D., Défago G. (2005): Biological control of soil-borne pathogens by fluorescent pseudomonas. Nat. Rev. Microbiol. 3 : 307-319. Hagedorn Ch. (1976): Influences of Soil Acidity on Streptomyces Populations Inhabiting Forest Soils. Appl. Environ. Microbiol. 32: 368-375. Hallmann J., Quadt-Hallmann A., Mahaffee W.F., Kloepper J.W. (1997): Bacterial endophytes in agricultural crops. Can. J. Microbiol. 43: 895-914. Han J., Sun L., Dong X., Cai Z., Sun X., Yang H., Wang Y., Song W. (2004): Characterization of a novel plant growth-promoting bacteria strain Delftia tsuruhatensis HR4 both as a diazotroph and a potential biocontrol agent against various plant pathogens. Syst. Appl. Microbiol. 28: 66-76. Hashidoko Y., Nakayama T., Homma Y., Tahara S. (1999): Structure Elucidation of Xanthobaccin A, a New Antibiotik Produced from Stenotrophomonas sp. Strain SB-K88. Tetrahedron Lett. 40: 2957-2960. Hesham M. A. El-Komy (2005): Coimmobilization of Azospirillum lipoferum and Bacillus megaterium for Successful Phosphorus and Nitrogen Nutrition of Wheat Plants. Food Technol. Biotechnol. 43 : 19–27. Chancey T.S., Wood W.D., Pierson S.L. (1999): Two-Component Transcriptional Regulation of N-Acyl-Homoserine Lactone Production in Pseudomonas aureofaciens. Appl. Environ. Microbiol. 65: 2294-2299.

James L.R., Perez R. (1999): Fungal colonization of residual conifer seedling roots in soil. USDA Forest Service Lucky Peak Nursery, Boise, Idaho. USDA Forest Service, Northern Region, Forest Health Protection. Report 99-10. 13p. Kado, C.I. (2002): Crown gall. The Plant Health Instructor. DOI:10.1094/PHI-I-2002-111801. www.apsnet.org/education/LessonsPlantPath/CrownGall/default.htm. Kaprálek F. (2000): Význam životní činnosti bakterií v hospodářství přírody a člověka. Základy bakteriologie, 17-19. Karolinum, Praha.

Khalid A., Arshad M., Zair Z.A. (2004): Screening plant growth-promoting rhizobacteria for improving growth and yield of wheat. Applied Microbiology 96: 473-480. Kurze, S., Bahl, H., Dahl, R., Berg, G. (2001): Biological control of fungal strawberry diseases by Serratia plymuthica HRO-C48. Plant Dis. 85:529-534. Ligon J.M., Hill D.S., Hammer P.E., Torkewitz N.R., Hofmann D., Kempf H.J., van Pee K.H. (2000): Natural products with antifungal activity from Pseudomonas biocontrol bacteria. Pest Manag. Sci. 56: 688-695. 43

Lim H.S., Kim Y.S., Kim S.D. (1991): Pseudomonaas stutzeri YPL-1 genetic transformation and antifungal mechanism against Fusarium solani, an agent of plant root rot. Appl. Environ. Microbiol. 57: 510-516 Loper E.J., Henkels D.M. (1999): Utilization of Heterologous Siderophores Enhances Levels of Iron Available to Pseudomonas putida in the Rhizosphere. Appl. Environ. Microbiol. 65: 5357-5363. Maier M.R., Pepper L.I., Gerba P.Ch. (2000): Environmental Microbiology, 443-445. Academic press, San Diego.

Mazzola M. (2002): Determinative Role of Plant Genotype in Composition of Soil Microbial Communities and Induction of Soil Suppressiveness. Proceedings of Management of Soilborne Plant Pathogens 13: 69-78. McSpadden Gardener B.B., Weller M.B. (2001): Changes in Populations of Rhizosphere Bacteria Associated with Take-All Disease of Wheat. Appl. Environ. Microbiol. 67: 4414– 4425. M´Piga M.P., Bélanger R.R., Paulitz C.T., Benhamou N. (1997): Increased resistance to Fusarium oxysporum f. sp. radicis lycopersici in tomato plants treated with the endophytic bacterium Pseudomonas fluorescens strain 63-28. Physiol. Mol. Plant P. 50: 301-320. Natsch A., Keel C., Pfirter H.A., Haas D., Défago G. (1994): Contribution of the global regulator gene GACA to persistence and dissemination of Pseudomonas fluorescens biocontrol strain CHAO introduced into soil microcosms. Appl. Environ. Microbiol. 60: 2553-2560. Nelson M.L. (2004): Plant growth promoting rhizobacteria (PGPR): Prospects for new inoculants. Plant Management Network 0301-0305. Nielsen H.T., Sorensen J. (2003): Production of Cyclic Lipopeptides by Pseudomonas fluorescens Strains in Bulk Soil and in the Sugar Beet Rhizosphere. Appl. Environ. Microbiol. 69: 861-868.

Nielsen N.M., Sorensen J.,1 Fels J., Pedersen Ch.H. (1998): Secondary Metabolite- and Endochitinase-Dependent Antagonism toward Plant-Pathogenic Microfungi of Pseudomonas fluorescens Isolates from Sugar Beet Rhizosphere. Appl. Environ. Microbiol. 64: 3563–3569. Persello-Cartieaux F., Nussaume L., Robaglia C. (2003): Tales from the underground: molecular plant-rhizobacteria interactions. Plant, Cell and Environment 26: 189-199. Picard C., Di Cello F., Ventura M., Fani R., Guckert A. (2000): Frequency and Biodiversity of 2,4-Diacetylphloroglucinol-Producing Bacteria Isolated from the Maize Rhizosphere at Different Stages of Plant Growth. Appl. Environ. Microbiol. 66: 948-955.

Procházka S., Macháčková I., Krekule J., Šebánek J., Gloser J., Havel L., Nátr L., Prášil I., Sladký Z., Šantrůček J., Šebánek J., Tesařová M., Vyskot B. (2003): Fyziologie stresu. Fyziologie rostlin, 412-422. ACADEMIA, Praha. 44

Ravel J., Cornelis P. (2003): Genomic of pyoverdine-mediated iron uptake in pseudomonads. TRENDS Microbiol. 11: 195-200. Reiter B., Compant S., Sessitsch A., Nowak J., Cle´ment Ch., Barka A.E. (2005): Endophytic Colonization of Vitis vinifera L. by Plant Growth-Promoting Bacterium Burkholderia sp. Strain PsJN. Appl. Environ. Microbiol. 71: 1685–1693. Rosypal S., Doškař J., Frynta D., Homola J., Horáček I., Hůrka K., Kalina T., Kubišta V., Kvaček Z., Linc R., Losos B., Mazura I., Mladá J., Mladý F., Nedvídek J., Novotný I., Pavlová L., Pikálek P., Prášil K., Psota V., Roček Z., Slavíková J., Slavíková Z., Smrž J., Šašek V., Šebánek J., Šmarda J., Štys P., Zrzavý J. (2003): Morfologie bakteriálních buněk, fyziologie bakterií, systém bakterií. Nový přehled biologie, 114-141. Scientia, Praha. Schnider-Keel U., Lejbolle B.K., Baehler E., Haas D., Keel Ch. (2001): The Sigma Factor AlgU (AlgT) Controls Exopolysaccharide Production and Tolerance towards Desiccation and Osmotic Stress in the Biocontrol Agent Pseudomonas fluorescens CHA0. Appl. Environ. Microbiol. 67: 5683–5693. Schouten A., van den Berg G., Edel-Hermann V., Steinberg C., Gautheron N., Alabouvette C., de Vos C.H., Lemanceau P., Raaijmakers J.M. (2004): Defense responses of Fusarium oxysporum to 2,4-Diacetylphloroglucinol, a broad-spectrum antibiotic produced by Pseudomonas fluorescens. Mol. Plant Microbe In. 17: 1201-1211. Suckstorff I., Berg G. (2003): Evidence for dose-dependent effects on plant growth by Stenotrophomonas strains from different origins. J. Appl. Microbiol. 95: 656-663. Timmusk S., Wagner H.G.E. (1999): The Plant-Growth-Promoting Rhizobacterium Paenibacillus polymyxa Induces Changes in Arabidopsis thaliana Gene Expression: A Possible Connection Between Biotic and Abiotic Stress Response. Mol. Plant Microbe In. 12: 951-959. Trigiano N.R., Windham T.M, Windham S.M. (2003): Biological Control of Plant Pathogens (Ownley H.B., Windham T.M). Plant Pathology: Concepts & Laboratory Exercises, 323332.CRC Press. Viebahn M., Glandorf M.C.D., Ouwens M.W.T., Smit E., Leeflang P., Wernars K., Thomashow S.L., van Loon C.L., Bakker1 M.H.A.P. (2003): Repeated Introduction of Genetically Modified Pseudomonas putina WCS358r without Intensified Effects on the Indigenous Microflora of Field-Grown Wheat. Appl. Environ. Microbiol. 69: 3110–3118. Visser R., Holzaphel H.W., Bezuidenhout J.J., Kotze M.J. (1986): Antagonism of Lactic Acid Bacteria against Phytopathogenic Bacteria. Appl. Environ. Microbiol. 52: 552-555. Votava M., Černohorská L., Heroldová M., Holá V., Mejzlíková L., Ondrovčík P., Růžička F., Dvořáčková M., Woznicová V., Zahradníček O. (2003): Lékařská mikrobiologie speciální, 29-207. Neptun, Brno. Whipps M.J. (2001): Microbial interactions and biocontrol in the rhizosphere. J. Exp. Bot. 52: 487-511. 45

Williams P.R. (1973): Biosynthesis of Prodigiosin, a Secondary Metabolite of Serratia marcescens. Applied Microbiology 25: 396-402. Yuan M.W., Crawford L.D. (1995): Characterization of Streptomyces lydicus WYEC108 as a Potential Biocontrol Agent against Fungal Root and Seed Rots. Appl. Environ. Microbiol. 61: 3119–3128. Zehnder W.G., Yao Ch., Murphy F.J., Sikora R.E., Kloepper W.J., Schuster J.D., Polston E.J. (1999): Microbe-Induced Resistance Against Pathogens and Herbivores: Evidence of Effectiveness in Agriculture. Induced Plant Defenses Against Pathogens and Herbivores: Biochemisry, Ecology and Agriculture, 335-355.A. A. Agrawal et.al. eds. APS Press, St. Paul, MN. Zohar-Perez C., Chet I., Nussinovitch A. (2005): Mutual Relationships Between Soils and Biological Carrier Systeme. Wiley InterScience 92: 54-60. www.en.wikipedia.org/wiki/Paenibacillus www.en.wikipedia.org/wiki/Rhodospirillaceae www.nysaes.cornell.edu/ent/biocontrol/pathogens/bacteria.html www.sigmaaldrich.com/sigma/datasheet/g3381dat.pdf www.tau.ac.il/~ecology/virtau/5-Evgeniy_A/evgeniy.htm Abrosimov E. : Plant Growth Promoting Rhizobacteria.

46