Chem. Listy 109, 775783(2015)
Referát
VÝZNAM A METODY STUDIA S-NITROSYLACE PROTEINŮ U ROSTLIN
histidinů4 a nitrosace cysteinových thiolů5. V tomto referátu jsou shrnuty aktuální poznatky o významu a funkci S-nitrosylace významných rostlinných proteinů a přehled moderních metod analýzy S-nitrosylovaných proteinů.
TEREZA TICHÁ, LUCIE KUBIENOVÁ, LENKA LUHOVÁ a MAREK PETŘIVALSKÝ Katedra biochemie, Přírodovědecká fakulta Univerzity Palackého, Šlechtitelů 11, 783 71 Olomouc
[email protected]
2. Vznik a odbourávání S-nitrosylovaných proteinů S-Nitrosylace je považována za jeden z nejdůležitějších molekulárních mechanismů, kterým NO reguluje funkce proteinů a buněčnou signalizaci prostřednictvím změn v konformaci a subcelulární lokalizaci cílových proteinů a jejich interakci s dalšími proteiny. S-Nitrosylace patří mezi tzv. redoxní signální dráhy. Redoxní změny vedou ke vzniku reaktivních forem dusíku a kovalentní vazbě nitrosylové skupiny na thioly postranního řetězce cysteinů v proteinech za vzniku S-nitrosothiolů5. Vedle S-nitrosylace proteinů vznikají i nízkomolekulární S-nitrosothioly, z nichž nejvýznamnější je S-nitrosoglutathion (GSNO)6. Podobně jako fosforylace proteinů je S-nitrosylace reverzibilní a místně specifická, ale probíhá bez enzymové katalýzy. Existuje řada reakčních mechanismů vedoucích k tvorbě S-nitrosothiolů. Dosud není přesně známo, který z nich převládá in vivo5. Biologická reaktivita S-nitrosothiolů zahrnuje přímé efekty těchto sloučenin, transnitrosační reakce, S-thiolace a uvolnění NO při rozkladu molekuly7. Silná polarizace vazby S-NO je příčinou značné nestability S-nitrosothiolů. V biologických systémech a in vitro byla popsána široká škála produktů jejich rozkladu zahrnující dusík a síru v řadě oxidačních stavů. Nejčastěji dochází k uvolnění NO za vzniku odpovídajícího disulfidu5. Na stabilitu S-nitrosothiolů má vliv i řada faktorů jako světlo, teplota, přítomnost kyslíku a kationtů přechodných kovů katalyzujících rozklad vazby S-NO. Byly popsány dva klíčové enzymy katalyzující odbourání S-nitrosothiolů: S-nitrosoglutathionreduktasa a thioredoxinreduktasa8. Enzym S-nitrosoglutathionreduktasa (GSNOR) náleží do rodiny alkoholdehydrogenas třídy III (ADH3, EC 1.1.1.1) a je rovněž znám ze starších publikací jako S-(hydroxymethyl)glutathiondehydrogenasa (EC 1.1.1.284) díky katalýze NAD+-dependentní oxidace S-(hydroxymethyl)glutathionu9. Fyziologicky významnější reakci katalyzovanou GSNOR představuje ireverzibilní NADHdependentní redukce GSNO, která reguluje celkový metabolismus GSNO a ostatních S-nitrosothiolů v buňkách10,11. U živočichů byl popsán mechanismus zahrnující přímou interakci S-nitrosylovaných proteinů s thioredoxinreduktasou prostřednictvím disulfidové vazby. Další možností metabolismu S-nitrosothiolů je transnitrosační reakce, kdy dochází k přechodné S-nitrosylaci thioredoxinreduktasy12.
Došlo 11.6.15, přijato 28.6.15. Rukopis byl zařazen k tisku v rámci placené služby urychleného publikování. Klíčová slova: oxid dusnatý, reaktivní formy dusíku, posttranslační modifikace proteinů, S-nitrosylace, S-nitrosothioly
Obsah 1. Úvod 2. Vznik a odbourávání S-nitrosylovaných proteinů 3. S-Nitrosylace významných rostlinných proteinů 3.1. Signální dráha kyseliny salicylové 3.2. Biosyntéza ethylenu 3.3. Peroxiredoxiny 3.4. Metakaspasy 3.5 Glyceraldehydfosfát-3-dehydrogenasa 4. Metody analýzy S-nitrosothiolů 4.1. Stanovení celkového obsahu S-nitrosothiolů 4.2. Metody analýzy S-nitrosylovaných proteinů 4.3. Identifikace S-nitrosylovaných proteinů proteomickými metodami s radionuklidovými značkami 4.4. Softwarové nástroje pro predikci S-nitrosylace proteinů 5. Závěr
1. Úvod Oxid dusnatý (NO) patří společně s oxidem uhelnatým a sulfanem mezi plynné signální molekuly, jejichž význam v řadě důležitých fyziologických i patologických procesů byl prokázán ve všech typech organismů1. Známé signální účinky NO jsou zprostředkovány jeho interakcí s biomolekulami, mezi které patří zejména vazba na kovová centra cílových metaloproteinů nebo reakce s jinými reaktivními partnery jako jsou superoxidový anionradikál, lipidové radikály nebo redukované thioly2,3. Významné postavení v signálních drahách NO zaujímají také posttranslační modifikace proteinů účinkem radikálu NO nebo z něj vznikajících reaktivních forem dusíku (RNS). Mezi nejvýznamnější posttranslační modifikace související s NO patří nitrace proteinových tyrosinů, tryptofanů nebo 775
Chem. Listy 109, 775783(2015)
Referát
kace thiolu působením GSNO tedy zabraňuje vytvoření disulfidické vazby TGA1 a přispívá tak ke stabilizaci výhodnější konformace pro interakci TGA1-NPR1. Významnou roli v mechanismu působení kyseliny salicylové má také chloroplastový enzym karbonátanhydrasa (systematický název karbonáthydrolyasa, EC 4.2.1.1), která vzhledem k silné vazebné kapacitě pro kyselinu salicylovou bývá označována jako SABP3 (salicylic acidbinding protein 3)23. S-Nitrosylace SABP3 způsobuje ztrátu enzymové aktivity a schopnost vázat kyselinu salicylovou. S-Nitrosylace SABP3 slouží jako negativní zpětnovazebná smyčka modulující obrannou reakci. Prostřednictvím S-nitrosylace jsou regulovány i další proteiny vázající kyselinu salicylovou, jako je katalasa a askorbátperoxidasa24,25.
3. S-Nitrosylace významných rostlinných proteinů Oxid dusnatý je regulátorem řady fyziologických procesů rostlin, jako je dormance a klíčení semen, vegetativní růst stonku a listů, vývoj kořenového systému, pohyb svěracích buněk průduchů a senescence13,14. Reguluje metabolismus buněčných organel a aktivitu řady enzymů, jako je mitochondriální cytochrom c oxidasa, peroxisomální katalasa a askorbátperoxidasa a cytosolické akonitasa. V chloroplastech se NO účastní regulace biosyntézy fotosyntetických pigmentů a fotofosforylace15. NO má dále důležitou funkci v signálních drahách rostlinných hormonů a regulátorů a v odpovědích rostlin na abiotické i biotické stresové faktory16. NO se účastní procesu programované buněčné smrti, hypersenzitivní reakce a systémové odezvy na infekci rostlin patogeny17. V následujícím přehledu jsou shrnuty aktuální poznatky o regulaci struktury a aktivity některých významných rostlinných proteinů a enzymů reverzibilní S-nitrosylací.
3.2. Biosyntéza ethylenu Ethylen je důležitý plynný hormon regulující fyziologické rostlinné procesy jako otvírání květů a zrání plodů. Signální dráhy ethylenu jsou také zapojeny do odpovědi rostlin na řadu abiotických stimulů jako hypoxie kořenů, poškození mrazem nebo mechanické poranění18. Methioninadenosyltransferasa 1 (MAT1, EC 2.5.1.6) je klíčovým enzymem biosyntézy S-adenosylmethioninu, který slouží jako donor methylové skupiny při transmethylačních reakcích a jako substrát při biosyntéze ethylenu a polyaminů. U rostlin byly nalezeny tři isoformy MAT (MAT1, MAT2, MAT3)26. Po inkubaci s NO donorem GSNO došlo ke 30% snížení aktivity MAT1, na rozdíl od MAT2 a MAT3, u nichž nebyl pozorován významnější vliv GSNO na jejich aktivitu. Metodami místně-řízené mutageneze a hmotnostní spektrometrie bylo prokázáno, že u MAT1 dochází vlivem donoru NO k S-nitrosylaci Cys114, která způsobuje částečnou inhibici enzymové aktivity. Je známo, že ethylen a NO působí u řady rostlinných procesů antagonisticky26. S-Nitrosylace MAT1 způsobuje pokles produkce S-adenosylmethioninu a následně snížení syntézy a hladiny ethylenu. Předpokládá se, že MAT1 může plnit úlohu tzv. molekulárního přepínače v regulaci interakce signálních drah NO a ethylenu.
3.1. Signální dráha kyseliny salicylové Kyselina salicylová je významným rostlinným hormonem, jehož signální dráhy regulují odpovědi rostlin na biotické stresové faktory, jako jsou infekce mikrobiálními patogeny nebo atak hmyzích škůdců18. Zvýšená hladina kyseliny salicylové ve stresových podmínkách vede k aktivaci obranných genů na lokální i systémové úrovni, které jsou zprostředkovány klíčovým proteinem NPR1 (nonexpressor of pathogenesis-related protein 1). Bylo prokázáno, že subcelulární lokalizace a transkripční aktivita tohoto proteinu jsou regulovány procesem S-nitrosylace. Inaktivní protein je lokalizován ve formě oligomeru v cytosolu. Na tvorbě intermolekulárních disulfidických můstků se u Arabidopsis podílí pět z deseti cysteinů NPR1 proteinu19. V případě, že v buňce dojde k vyvolání redoxní změny působením kyseliny salicylové produkované např. po infekci patogenem, dochází k rozpadu disulfidických můstků. Vzniklý aktivní monomer NPR1 je translokován do jádra, kde se váže na specifické transkripční faktory TGA a spouští expresi obranných genů20. Bylo pozorováno, že působení GSNO jako donoru NO aktivuje prostřednictvím S-nitrosylace residua Cys156 oligomerizaci NPR1 proteinu21. Předpokládá se, že S-nitrosylace Cys156 může vyvolat konformační změny usnadňující vznik disulfidické vazby mezi monomery NPR1. TGA1, jeden z transkripčních faktorů aktivovaný prostřednictvím vazby monomeru NPR1, rovněž podléhá redoxní modifikaci působením NO. TGA1, obsahující čtyři cysteinová residua, je inaktivní, pokud jsou vytvořeny dvě disulfidické vazby. Přídavek GSNO indukuje in vitro vazebnou schopnost TGA1 pro sekvenční element 1 nacházející se u promotorů řady rostlinných obranných genů22. V přítomnosti NPR1 dochází ke zvýšení této vazebné schopnosti přerušením disulfidické vazby v proteinu TGA1 mezi Cys172 a Cys287 a obě residua dále podléhají S-nitrosylaci nebo glutathionylaci. Modifi-
3.3. Peroxiredoxiny Peroxiredoxiny (EC 1.11.1.15) představují skupinu antioxidačních enzymů, které jsou schopny redukovat širokou škálu substrátů odvozených od reaktivních forem kyslíku. Jedním z nich je peroxydusitan, vznikající velmi rychlou reakcí mezi stechiometrickým množstvím NO a superoxidu27. U rostlin dochází k stálé produkci nízké hladiny peroxydusitanu v aktivně fotosyntetizujících chloroplastech, zatímco vysoké hladiny jsou pozorovány během odpovědi rostlin na stresové podmínky, kdy dochází k intenzivní tvorbě NO i reaktivních forem kyslíku včetně superoxidu28. U rostlin bylo doposud popsáno pět hlavních tříd peroxiredoxinů v závislosti na jejich lokalizaci29. Aktivita peroxiredoxinu II E (PrxII E), nacházejícího se ve stromatu chloroplastů, je inhibována S-nitrosylací cysteinu 776
Chem. Listy 109, 775783(2015)
Referát
v aktivním místě, která vede ke snížené schopnosti rostlinných buněk odbourávat peroxydusitan. Tento mechanismus byl popsán během hypersensitivní reakce rostlin Arabidopsis thaliana infikovaných avirulentním bakteriálním patogenem Pseudomonas syringae pv. tomato30. Vedle chloroplastového PrxII E byla po přídavku GSNO k buněčné kultuře Arabidopsis prokázána S-nitrosylace také u cytosolické formy PrxII B a mitochondriální PrxII F (cit.31).
ných rozkladem S-nitrosothiolů v přítomnosti iontů přechodných kovů jako Cu+ či Hg2+ nebo fotolýzou. NO/NOx lze detegovat řadou kolorimetrických, chemiluminiscenčních, fluorescenčních nebo elektrochemických metod38. Pro kalibraci metod se často používá S-nitrosoglutathion, který lze snadno připravit nitrosací redukovaného glutathionu dusitany v kyselém prostředí39. Klasická kolorimetrická Savillova metoda je založena na diazotační reakci dusitanů vzniklých rozkladem S-nitrosothiolů v přítomnosti rtuťnatých solí s modifikovaným Griessovým činidlem40. Pro detekci NO/NOx v nanomolárních koncentracích lze použít fluorescenční metody využívající činidla jako 4,5-diaminofluorescein nebo 2,3-diaminonaftalen41. Vysoce citlivá je chemiluminiscenční metoda, při níž je plynný NO ze vzorku smísen s ozónem za vzniku NO2, z části v excitovaném stavu. Množství fotonů uvolněných při návratu excitovaných molekul do základního stavu je přímo úměrné množství NO (cit.42). Uvolněný NO lze také detegovat elektrochemickými metodami s použitím specifických elektrod43 nebo metodou elektronové paramagnetické rezonance44.
3.4. Metakaspasy Intracelulární hladina NO reguluje signální dráhy vedoucí k zahájení apoptózy – programované buněčné smrti. O tom, zda NO bude iniciovat programovanou buněčnou smrt nebo buňku před apoptózou chránit, rozhoduje řada faktorů jako typ buněk, dostupnost NO a hladina reakčních partnerů32. Mechanismus anti-apoptotického účinku NO je zprostředkován S-nitrosylací kritického cysteinového residua, které se nachází v aktivním místě u všech isoforem kaspas33. U Arabidopsis byla za fyziologických podmínek popsána inhibice autoproteolytické aktivity prometakaspasy 9 (AtMC9) prostřednictvím konstitutivní S-nitrosylace Cys147. Inhibice enzymové aktivity je pozorována pouze v případě, že AtMC9 se nachází ve formě inaktivního zymogenu, zatímco AtMC9 ve své aktivní formě není S-nitrosylací ovlivněna34.
4.2. Metody analýzy S-nitrosylovaných proteinů V průběhu uplynulých let byla vyvinuta řada metod pro specifickou detekci a identifikaci S-nitrosylovaných proteinů. Referenčním standardem v této oblasti se stala metoda tzv. biotinového přepínače (biotin-switch technique, BST), založená na reverzibilním značení nitrosylovaných cysteinů značkou nesoucí navázanou molekulu biotinu45 (obr. 1). V prvním kroku metody BST se blokují všechny nemodifikované cysteinové thioly vnesením thiomethylové skupiny použitím činidla S-methylmethanthiosulfonátu (MMTS), jehož nadbytek je poté odstraněn precipitací proteinů v acetonu. V druhém kroku BST se S-nitrosothioly redukují askorbátem na thioly za vzniku O-nitrosoaskorbátu jako nestabilního meziproduktu. Některé studie uvádějí, že askorbát může způsobovat redukci disulfidových vazeb nebo jiných oxidačních modifikací cysteinů (např. sulfinových nebo sulfenových skupin), což pak vede k jejich nesprávné identifikaci jako S-nitrosothiolů při následné analýze46,47. Na základě termodynamických analýz byla označena jako pravděpodobná příčina možných artefaktů při redukci askorbátem nadměrná expozice vzorků světlu či přítomnost měďnatých nebo rtuťnatých iontů ve vzorku48. Jako alternativa k redukci S-nitrosothiolů askorbátem bylo popsáno použití kyseliny sinapové (3,5-dimethoxy-4-hydroxyskořicová kyselina), která nenarušuje disulfidové vazby v proteinech49. Posledním krokem je značení vzniklých redukovaných thiolů, na kterých byla ve výchozím vzorku přítomna modifikace S-nitrosylací, pomocí specifického modifikačního činidla biotinu-HPDP (N-[6-(biotinamido)hexyl]-3´-(2´-pyridyldithio)propionamid). Takto značené proteiny s biotinovou značkou mohou být detegovány metodou Western blot pomocí specifické anti-biotin protilátky, nebo je lze purifikovat afinitní chromatografií s využitím avidin-
3.5. Glyceraldehydfosfát-3-dehydrogenasa Glyceraldehydfosfát-3-dehydrogenasa (GAPDH, EC 1.2.1.12), která katalyzuje reverzibilní přeměnu glyceraldehyd-3-fosfátu na 1,3-bisfosfoglycerát, je jedním z klíčových enzymů glykolýzy. U rostlin se isoformy GAPDH nachází v cytosolu, plastidech a v jádře35. Bylo prokázáno, že rostlinná GAPDH je S-nitrosylována in vitro a také in vivo. Aktivita cytosolární GAPDH z A. thaliana je snížena S-nitrosylací dvou cysteinů v katalytickém místě31,36. U tabáku byly popsány dvě isoformy GAPDH, které konstitutivně interagují s proteinkinasou NtOSAK v cytosolu a v jádře tabákových buněk. S-Nitrosylace GAPDH nemá vliv na její aktivitu nebo na interakci s NtOSAK, ale hraje významnou roli v regulaci buněčné lokalizace komplexu NtOSAK s jadernou isoformou GAPDH. S-Nitrosylace dvou katalytických cysteinů GAPDH zamezuje lokalizaci tohoto komplexu v jádře. GAPDH v jádře rostlinných buněk plní funkci transnitrosylasy katalyzující přenos NO na další cílové proteiny37.
4. Metody analýzy S-nitrosothiolů 4.1. Stanovení celkového obsahu S-nitrosothiolů Metody stanovení celkového obsahu S-nitrosothiolů (tj. součtu koncentrací nízkomolekulárních a proteinových S-nitrosothiolů) jsou většinou založeny na detekci a kvantifikaci reaktivních oxidů dusíku (NO/NOx) uvolně777
Chem. Listy 109, 775783(2015)
Referát
Obr. 1. Přímé metody pro studium S-nitrosylovaných proteinů
agarosové matrice. Po eluci pufrem s přídavkem silného redukčního činidla jako dithiothreitol nebo -merkaptoethanol, které je schopné odstranit biotinovou značku, lze purifikované S-nitrosylované proteiny identifikovat hmotnostní spektrometrií45. Na principu podobném BST metodě byla vyvinuta řada dalších metod identifikace S-nitrosylovaných proteinů. Jednu z nich představuje SNOSID (S-NitrosothiolsSite Identification), kde štěpení biotinylovaných proteinů ve vzorku trypsinem před afinitní purifikací umožňuje efektivnější a selektivnější navázání peptidů na neutravidinovou matrici v porovnání s nanášením intaktních proteinů50. Pro účinnou identifikaci S-nitrosylovaných peptidů ve vzorku byla využita metoda nanokapalinové chromatografie ve spojení s tandemovou hmotnostní spektrometrií (nLC-MS/MS). Další metoda SNO-RAC (S-Nitrosothiols Resin-Assisted-Capture) využívá pro purifikaci S-nitrosylovaných proteinů kovalentní vazbu volných thiolů, vzniklých po blokaci cysteinových residuí a následné redukci S-nitrosothiolů askorbátem, s thiol-reaktivní matricí obsahující imobilizované rtuťnaté ionty48. Odpadá tak krok značení proteinů biotinovou značkou. Kovalentně navázané proteiny na matrici je také současně možné štěpit trypsinem a zjednodušit následný postup při identifikaci proteinů pomocí MS analýzy. Modifikace SNO-RAC metody spočívá ve využití organické fenylrtuti imobilizované na agarosové kuličky nebo vázané na biotin, kdy dochází k přímému zachycení S-nitrosylovaných proteinů na matrici a není tedy nutná redukce askorbátem. V porovnání s klasickou BST metodou je metoda SNO-RAC vhodnější pro purifikaci S-nitrosylovaných proteinů s vyšší molekulovou hmotností48. Další publikované metody jsou založeny na použití jiného značení než biotinovou značkou. V případě „Histag switch“ metody probíhá v závěrečném kroku reakce zredukovaných cysteinových thiolů s alkylovaným peptidem s navázanou hexahistidinovou kotvou (I-CH2-CO-Gly-Arg-Ala-His6). Značené proteiny jsou detegovány specifickou protilátkou s afinitou k histidinové kotvě, případně mohou být purifikovány chelatační chromatografií s využitím matrice obsahující nikelnaté nebo kobaltnaté ionty. Výhodou této metody je možnost přímé identifikace proteinu s cysteinem s navázanou histidinovou kotvou pomocí MS (cit.51). Technika S-FLOS (Selective Fluorescent Labeling Of S-nitrosothiols) využívá selektivního fluorescenčního značení S-nitrosylovaných proteinů pomocí komerčně dostupných cyaninových fluorescenčních barviv Cy3 a Cy5. Tato barviva tvoří selektivně adukty s proteinovými S-nitrosothioly při pH 7, které nepodléhají redukci redukčními činidly běžně používanými při elektroforéze, jako je dithitreitol nebo tris(2-karboxyethyl)fosfin, na rozdíl od možné redukce vazby, kterou je navázána biotinová značka52. Ostatní fluorescenční značky jako Alexa Fluors, Texas Red a BODIPY, mohou být také použity, ale na rozdíl od Cy3 a Cy5 nejsou nábojově vyvážené a tudíž nejsou vhodné pro 2D elektroforézu53. Fluorescenčního značení S-nitrosylovaných proteinů dále využívá metoda 2D-SNO-DIGE (2D-Difference Gel Electrophore778
Obr. 2. Metoda „biotin switch“ (BST) a modifikované metody pro detekci a identifikaci proteinových S-nitrosothiolů
Chem. Listy 109, 775783(2015) Referát
779
Chem. Listy 109, 775783(2015)
Referát
sis). Výhodu této metody představuje možnost přímého porovnání různých vzorků v jednom gelu pomocí fluorescenčních zobrazovacích technik. Její vysoká citlivost se uplatňuje při analýze méně abundantních S-nitrosylovaných proteinů54 (obr. 2). 4.3. Identifikace S-nitrosylovaných proteinů proteomickými metodami s radionuklidovými značkami
Obr. 3. Značení S-nitrosylovaných proteinů kovalentními radionuklidovými značkami technikou ICAT a tandemovými hmotnostními značkami iodoTMT
Kovalentní značení radionuklidovými značkami (ICAT) bylo pro studium S-nitrosylace poprvé použito jako metoda SNOCAP (S-Nitrosothiol Capture)55. V posledním kroku po blokaci thiolů a redukci S-nitrosothiolů askorbátem je ke vzorkům přidáno činidlo, které se skládá ze tří částí: biotinové značky umožňující afinitní purifikaci označených peptidů, raménka (linkeru) obsahujícího stabilní isotopy a reaktivní skupiny vážící se na redukované cysteinové thioly. ICAT činidla existují ve dvou formách: lehké (L-ICAT, obsahuje nuklidy 12C, 14N nebo 1H) a těžké (H-ICAT, obsahuje nuklidy 13C, 15N nebo 2H). Kontrolní vzorek značený L-ICAT a sledovaný vzorek značený H-ICAT jsou spojeny a proteolyticky štěpeny trypsinem na peptidové fragmenty. Pomocí biotin-avidinové afinitní chromatografie jsou ze směsi separovány značené peptidy. Izolované peptidy jsou po rozdělení chromatografií na reverzní fázi analyzovány tandemovou hmotnostní spektrometrií12,56 (obr. 3). Forrester a spol.48 popsal použití značení iTRAQ (Isobaric Tags for Relative and Absolute Quantitation) ve spojení s metodou SNORAC. Imobilizované proteiny na thiol-reaktivní matrici jsou proteolyticky štěpeny trypsinem a N-terminální konce peptidů nebo postranní řetězec lysinu jsou kovalentně značeny připojením iTRAQ činidla složeného ze tří skupin: reportérové (N-methylpiperazin), vyrovnávací (karbonyl) a peptidové reaktivní skupiny (ester N-hydroxysukcinimidu). Hmotnost reportérové skupiny se pohybuje v rozmezí 114–117 Da ve 4-plexové a 113–121 Da v 8-plexové variantě. Vyrovnávací skupina vyrovnává rozdílné hmotnosti reportérových skupin a celá značka je tak izobarická s konstantní hmotností 145 Da. Vysoké variability se dosahuje kombinací značení různými nuklidy 13C, 15N nebo 18O. Značené peptidy jsou rozděleny kapalinovou chromatografií a poté analyzovány tandemovou hmotností spektrometrií. Při fragmentaci v MS/MS módu se odštěpí specifický reportérový ion, podle kterého lze rozeznat jednotlivé vzorky. Výhodou tohoto přístupu je možnost značení osmi různých vzorků v jednom experimentu, kvanti780
Chem. Listy 109, 775783(2015)
Referát
fikaci lze odečítat naráz z jednoho spektra a identifikovat proteiny přítomné ve vzorku v rozdílné koncentraci. Tandemové hmotnostní značky (Tandem Mass Tags, TMT) představují další strategii kvantifikace pro srovnávací analýzy komplexních proteinových směsí57. Metoda CysTMT6 (Cysteine reactive Tandem Mass Tag) byla použita pro specifickou detekci, identifikaci a kvantifikaci S-nitrosylovaných proteinů58. Volné proteinové thioly vzniklé redukcí S-nitrosothiolů jsou ireverzibilně značeny činidlem CysTMT. Výhodu představuje fragmentace až šesti isotopicky vyvážených reportérových iontů s hodnotou m/z 126–131 umožňující multiplexní kvantifikaci a výrazné zlepšení detekce možných falešněpozitivních výsledků při redukci askorbátem. Nejnověji popsanou je metoda ISA (Iodoacetyl Tandem Mass Tag Switch Assay) využívající thiol-reaktivní značky s komerčním označením iodo-TMT, které na podobném principu jako u CysTMT6 umožňují rovněž ireverzibilní značení šesti vzorků proteinu59. Po označení jednotlivých proteinů iodo-TMT jsou vzorky proteinů spojeny a štěpeny trypsinem, naneseny na matrici s navázanou anti-TMT protilátkou a purifikovány pomocí kompetitivní eluce. Finální krok zahrnuje analýzu peptidových štěpů metodou LC-MS/MS. Všechny výše uvedené metody umožňují nepřímou detekci a identifikaci S-nitrosylovaných proteinů. Pomocí MS byly přímo identifikovány např. S-nitrosylované fytochelatiny extrahované z kadmiem ošetřených listů Arabidopsis60. Vzhledem k labilnímu charakteru vazby S-NO se možná degradace S-nitrosothiolů při ionizaci eliminuje použitím měkkých ionizačních technik60,61. Je potřeba zmínit, že většina úspěšně identifikovaných S-nitrosylovaných proteinů nebo peptidů, které byly přímo detegovány MS, byly purifikované rekombinantní proteiny50,62. Přímá detekce S-nitrosylovaných proteinů z extraktů biologických vzorků zůstává zatím velkou výzvou63.
byly polohy S-nitrosylovaných cysteinů předpověděny se 76% přesností a 80% specificitou. Schopnost teoretické predikce S-nitrosylačních míst autoři dále ověřili na souboru stovek proteinů z databáze PubMed (http:// www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed), u kterých bylo dosaženo 74% úspěšnosti. Další software nazvaný SNOSite sloužící k predikci S-nitrosylace byl testován ve studii S-nitrosylace proteinů v myších endoteliálních buňkách stimulovaných donorem NO, kde bylo nalezeno celkem 568 nitrosylačních míst66. Byla charakterizována řada strukturálních faktorů v okolí S-nitrosylovaných cysteinů jako složení a náboj ohraničujících aminokyselin, dostupná povrchová plocha a interakce postranních řetězců. Vzhledem k obtížnosti získání konzervovaného motivu pomocí konvenční statistické analýzy, bylo nutné pro vytvoření klastru všech sekvencí obsahující S-nitrosylovaná místa použít tzv. metodu MDD (Maximal Dependence Decomposition). Při validaci softwaru dostupného na internetovém portále SNOSite (http:// csb.cse.yzu.edu.tw/SNOSite/) na nezávislém testovacím souboru, který představoval výchozí experimentální data použitá při optimalizaci softwaru GPS-SNO, bylo dosaženo 90% přesnosti. Další dostupný software iSNO-PseAAC (Pseudo Amino Acid Composition) využívá k predikci S-nitrosylovaných míst začlenění parametru pozičněspecifické aminokyseliny do obecnější metody tzv. aminokyselinového pseudosložení67. Pro testování softwaru byl použit referenční soubor využívající data vybraných 731 experimentálně potvrzených S-nitrosylačních míst z veřejně přístupných databází. Dosažená 90% úspěšnost při validaci na nezávislém datovém souboru potvrzuje iSNO-PseAAC jako slibný nástroj pro identifikaci S-nitrosylovaných míst v proteinech (http://app.aporc.org/ iSNO-PseAAC/). V současnosti existuje řada databází experimentálně prokázaných S-nitrosylací cysteinových residuí v proteinech ze všech typů organismů. Pro integraci všech dostupných dat a také poskytnutí strukturní analýzy byla vytvořena databáze dbSNO (cit.68). Aktuálně (k 1. 6. 2015) databáze zahrnuje 4165 S-nitrosylačních míst nalezených u 2277 proteinů (http://dbSNO.mbc.nctu.edu.tw). Poskytuje rovněž strukturní a funkční informace týkající se S-nitrosylovaných proteinů, jako jsou sekundární a terciární struktury proteinů, proteinové domény a ontologii příslušných genů. Databáze SNObase (http://www.nitrosation.org) byla vytvořena souběžně s dbSNO (cit.69). V současnosti obsahuje data 2884 nalezených míst S-nitrosylace a poskytuje další biologické informace o vlivu S-nitrosylace na funkci proteinu a souvisejících patologických stavech a onemocněních. Rozdílný stav znalostí o S-nitrosylaci proteinů v rostlinách lze dokumentovat na faktu, že cíle S-nitrosylace u rostlin připadají pouze na 6,4 % z databáze, ve srovnání 41,5 % lidských a 32,6 % myších proteinů v databázi.
4.4. Softwarové nástroje pro predikci S-nitrosylace proteinů Přestože byla věnována velká snaha najít shodné strukturální prvky, které by na základě velkého počtu souborů dat z proteomických studií specificky předpovídaly S-nitrosylační místa proteinů, je predikce míst podléhajících S-nitrosylaci v proteinech stále obtížná. V případě jiných posttranslačních modifikací proteinů, jako např. fosforylace, bylo prokázáno, že výpočetní přístupy podávají velice užitečné informace podporující experimentální ověření64. První dostupný software pro predikci S-nitrosylace GPS-SNO 1.0 (http://sno.biocuckoo.org) vycházel z vylepšené verze již dříve vytvořeného algoritmu pro predikci specifické fosforylace označené jako GPS (Group-based Prediction System)65. Při ověření predikční schopnosti algoritmu vycházeli autoři z dříve publikovaných výsledků zahrnujících celkem 327 proteinů, u kterých byla detegována S-nitrosylace na celkem 504 jedinečných místech. S využitím softwaru GPS-SNO 781
Chem. Listy 109, 775783(2015)
Referát
14. Šírová J., Sedlářová M., Piterková J., Luhová L., Petřivalský M.: Plant Sci. 181, 560 (2011). 15. Frohlich A., Durner, J.: Plant Sci. 181, 401 (2011). 16. Adámková Š., Petřivalský M.: Chem. Listy 106, 166 (2012). 17. Moricová P., Luhová L., Lochman J., Kašparovský T., Petřivalský M.: Chem. Listy 108, 1133 (2014). 18. Bari R., Jones J.: Plant Mol. Biol. 69, 473 (2009). 19. Mou Z., Fan W. H., Dong X. N.: Cell 113, 935 (2003). 20. Dong X.: Curr. Opin. Plant Biol. 7, 547 (2004). 21. Tada Y.: Science 325, 1072 (2009). 22. Lindermayr C., Sell S., Muller B., Leister D., Durnera J.: Plant Cell 22, 2894 (2010). 23. Slaymaker D. H., Navarre D. A., Clark D., del Pozo O., Martin G. B., Klessig D. F.: Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 99, 11640 (2002). 24. Fares A., Rossignol M., Peltier J. B.: Biochem. Biophys. Res. Commun. 416, 331 (2011). 25. Ortega-Galisteo A. P., Rodriguez-Serrano M., Pazmino D. M., Gupta D. K., Sandalio L. M., RomeroPuertas M. C.: J. Exp. Bot. 63, 2089 (2012). 26. Lindermayr C., Saalbach G., Bahnweg G., Durner J.: J. Biol. Chem. 281, 4285 (2006). 27. Gaupels F., Kuruthukulangarakoola G. T., Durner J.: Curr. Opin. Plant Biol. 14, 707 (2011). 28. Sakamoto A., Tsukamoto S., Yamamoto H., UedaHashimoto M., Takahashi M., Suzuki H., Morikawa H.: Plant J. 33, 841 (2003). 29. Dietz K. J.: Antioxid. Redox Signaling. 15, 1129 (2011). 30. Romero-Puertas M. C., Laxa M., Matte A., Zaninotto F., Finkemeier I., Jones A. M. E., Perazzolli M., Vandelle E., Dietz K. J., Delledonne M.: Plant Cell 19, 4120 (2007). 31. Lindermayr C., Saalbach G., Durner J.: Plant Physiol. 137, 921 (2005). 32. Kim Y.-M., Talanian R. V., Billiar T. R.: J. Biol. Chem. 272, 31138 (1997). 33. Martínez-Ruiz A., Lamas S.: Cardiovasc. Res. 75, 220 (2007). 34. Belenghi B., Romero-Puertas M. C., Vercammen D., Brackenier A., Inze D., Delledonne M., Van Breusegem F.: J. Biol. Chem. 282, 1352 (2007). 35. Anderson L. E., Ringenberg M. R., Carol A. A.: Protoplasma 223, 33 (2004). 36. Holtgrefe S., Gohlke J., Starmann J., Druce S., Klocke S., Altmann B., Wojtera J., Lindermayr C., Scheibe R.: Physiol. Plant. 133, 211 (2008). 37. Wawer I., Bucholc M., Astier J., Anielska-Mazur A., Dahan J., Kulik A., Wyslouch-Cieszynska A., ZarebaKoziol M. K. E., Dadlez M., Dobrowolska G., Wendehenne D.: Biochem. J. 429, 73 (2010). 38. Diers A. R., Keszler A., Hogg N.: Biochim. Biophys. Acta 1840, 892 (2014). 39. Moore K. P., Mani A. R., v knize: Measurement of protein nitration and S-nitrosothiol formation in biology and medicine. Methods in Enzymology, str. 256. (Packer E. C., ed.). Academic Press, San Diego, CA
5. Závěr S-Nitrosylace, reverzibilní modifikace cysteinových residuí v proteinech, představuje jednu z klíčových redoxních signálních drah oxidu dusnatého. V současnosti je považována za významnou posttranslační modifikaci proteinů, jejíž mechanismy a význam pro regulaci struktury a aktivity proteinů jsou intenzivně studovány u živočichů i v rostlinných systémech. Přesto nadále zůstává neobjasněna řada otázek týkajících se vyjasnění její role ve fyziologických i patologických procesech. Studium úlohy S-nitrosylace umožnily moderní experimentální metody přímé a nepřímé identifikace S-nitrosylovaných proteinů, které jsou intenzivně rozvíjeny a modifikovány s cílem zvýšení citlivosti pro detekci málo abundantních a nestabilních proteinů v buněčných extraktech. Využitím výpočetních metod lze vytvořit kompletní mapy potenciálních proteinů podléhajících S-nitrosylaci. Predikce i identifikace S-nitrosylovaných proteinů představují výchozí body pro další ověření funkce S-nitrosylace u jednotlivých proteinů detailnějšími experimentálními přístupy, které využívají rekombinantních proteinů, mutantů příslušných cysteinových residuí a proteomické studie in vivo. Tato práce byla podpořena interním grantem Univerzity Palackého IGA_PrF_2015_026 a grantem GA ČR P501/12/0590. LITERATURA 1. Yu M., Lamattina L., Spoel S. H., Loake G. J.: New Phytol. 202, 1142 (2014). 2. Gow A. J., Farkouh C. R., Munson D. A., Posencheg M. A., Ischiropoulos H.: Am. J. Physiol. Lung Cell. Mol. Physiol. 287, 262 (2004). 3. Němčáková H., Hnízdová I., Luhová L., Petřivalsky M.: Chem. Listy 104, 756 (2010). 4. Hnízdová I., Luhová L., Petřivalský M.: Chem. Listy 103, 788 (2009). 5. Jahnová J., Tichá T., Kubienová L., Luhová, L., Petřivalský M.: Chem. Listy 107, 350 (2013). 6. Martínez-Ruiz A., Lamas, S.: Cardiovasc. Res. 62, 43 (2004). 7. Hogg N.: Anal. Biochem. 272, 257 (1999). 8. Benhar M., Forrester M. T., Stamler J. S.: Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 721 (2009). 9. Kubienova L., Tichá T., Jahnová J., Luhová L., Petřivalský M.: Chem. Listy 107, 202 (2013). 10. Malik S. I., Hussain A., Yun B.-W., Spoel S. H., Loake G. J.: Plant Sci. 181, 540 (2011). 11. Kubienová L., Kopečný D., Tylichová M., Briozzo P., Skopalová J., Šebela M., Navrátil M., Tâche R., Luhová L., Barroso J. B., Petřivalský,M.: Biochimie 95, 889 (2013). 12. Wu C. G., Parrott A. M., Liu T., Jain M. R., Yang, Y. F., Sadoshima J., Li H.: J. Proteom. 74, 2498 (2011). 13. Piterková J., Mieslerová B., Sedlářová M., Luhová L., Lebeda A., Petřivalský M.: Env. Exp. Bot. 74, 37 (2011). 782
Chem. Listy 109, 775783(2015)
Referát
2002. 40. Saville B.: Analyst 83, 670 (1958). 41. Kostka P., Park J. K. J., v knize: Fluorometric detection of S-nitrosothiols. Methods in Enzymology. str. 227, (Packer L., ed.). Academic Press, San Diego, CA 1999. 42. Gow A., Doctor A., Mannick J., Gasto B.: J. Chromatogr. B 851, 140 (2007). 43. Allen B. W., Liu J., Piantadosi C. A., v knize: Electrochemical Detection of Nitric Oxide in Biological Fluids. Methods in Enzymology. (Packer E., Cadenas E., ed.), str. 68. Academic Press, San Diego, CA 2005. 44. D'Alessandro S., Posocco B., Costa A., Zahariou G., Lo Schiavo F., Carb D., Zottini M.: Front. Plant Sci. 4, (2013). 45. Jaffrey S. R., Erdjument-Bromage H., Ferris C. D., Tempst P., Snyder S. H.: Nat. Cell Biol. 3, 193 (2001). 46. Landino L. M., v knize: Protein Thiol Modification by Peroxynitrite Anion and Nitric Oxide Donors. Methods in Enzymology, (Packer E. C., ed.), str. 95. Academic Press, San Diego, CA 2008. 47. Huang B., Che C.: Free Radical Biol. Med. 41, 562 (2006). 48. Forrester M. T., Thompson J. W., Foster M. W., Nogueira L., Moseley M. A., Stamler J. S.: Nat. Biotechnol. 27, 557 (2009). 49. Kallakunta V. M., Staruch A., Mutus B.: Biochem. Biophys. Acta 1800, 23 (2010). 50. Hao G., Derakhshan B., Shi L., Campagne F., Gross S. S.: Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 103, 1012 (2006). 51. Camerini S., Polci M. L., Restuccia U., Usuelli V., Malgaroli A., Bachi A.: J. Proteome Res. 6, 3224 (2007). 52. Kettenhofen N. J., Wang X., Gladwin M. T., Hogg N., v knize: In-Gel Detection of S-Nitrosated Proteins Using Fluorescence Methods. Methods in Enzymology, str. 53 (Packer E. C., ed.). Academic Press, San Diego, CA 2008. 53. Santhanam L., Gucek M., Brown T. R., Mansharamani M., Ryoo S., Lemmon C. A., Romer L., Shoukas A. A., Berkowitz D. E., Cole R. N.: Nitric Oxide Biol. Chem. 19, 295 (2008). 54. Chouchani E. T., Hur T. R., Nadtochi S. M., Brookes P. S., Fearnley I. M., Lilley K. S., Smith R. A. J., Murphy M. P.: Biochem. J. 430, 49 (2010). 55. Paige J. S., Xu G., Stancevic B., Jaffrey S. R.: Chem. Biol. 15, 1307 (2008). 56. Huang B., Chen C.: Free Radical Biol. Med. 49, 447 (2010). 57. Thompson A., Schafer J., Kuhn K., Kienle S., Schwarz J., Schmidt G., Neumann T., Hamon C.: Anal. Chem. 75, 1895 (2003). 58. Murray C. I., Uhrigshardt H., O'Meally R. N., Cole R. N., Van Eyk J. E.: Mol. Cell. Proteom. 11, (2012). 59. Qu Z., Meng F. J., Bomgarden R. D., Viner R. I., Li J.
60. 61.
62. 63. 64. 65. 66. 67. 68. 69.
L., Rogers J. C., Cheng J. L., Greenlief C. M., Cui J. K., Lubahn D. B., Su G. Y., Gu Z. Z.: J. Proteome Res. 13, 3200 (2014). Elviri L., Speroni F., Careri M., Mangia A., di Toppi L. S., Zottini M.: J. Chromatogr. A 1217, 4120 (2010). Wang Y. Q., Feechan A., Yun B. W., Shafiei R., Hofmann A., Taylor P., Xue P., Yang F. Q., Xie Z. S., Pallas J. A., Chu C. C., Loake G. J.: J. Biol. Chem. 284, 2131 (2009). Chen K. J., Pittman R. N., Popel A. S.: Antioxid. Redox Signaling. 10, 1185 (2008). Lamotte O., Bertoldo J. B., Besson-Bard A., Rosnoblet C., Aimé S., Hichami S., Terenzi H., Wendehenne D.: Front. Chem. 2, (2015). Blom N., Gammeltoft S., Brunak S.: J. Mol. Biol. 294, 1351 (1999). Xue Y., Liu Z. X., Gao X. J., Jin C. J., Wen L. P., Yao X. B., Ren J. A.: PLoS One 5, (2010). Lee T. Y., Chen Y. J., Lu T. C., Huang H. D., Chen Y. J.: PLoS One 6, (2011). Xu Y., Ding J., Wu L. Y., Chou K. C.: PLoS One 8, (2013). Lee T. Y., Chen Y. J., Lu C. T., Ching W. C., Teng Y. C., Huang H. D., Chen Y. J.: Bioinformatics 28, 2293 (2012). Zhang X., Huang B., Zhang L. F., Zhang Y. Y., Zhao Y. Y., Guo X. F., Qiao X. H., Chen C.: Protein Cell 3, 929 (2012).
T. Tichá, L. Kubienová, L. Luhová, and M. Petřivalský (Department of Biochemistry, Faculty of Science, Palacký University, Olomouc): Functions and Methods of Protein S-Nitrosylation Studies in Plants S-Nitrosylation, a reversible attachment of the nitrosyl (NO-) to thiol groups of cysteine residues in proteins is the most important post-translational modification in NO signalling. S-Nitrosylation is known to impact protein functionality, stability and its localization in cells. This review summarizes the current knowledge of protein S-nitrosylation, its function and importance in plants, and presents a wide range of methods, which are actually used in medicine and plant research. More specifically, the regulation of plant proteins through a reversible S-nitrosylation, which are involved in the transduction of plant hormone signals, regulation of enzyme activities, induction of apoptosis and control of carbohydrate metabolism control were studied. Plant model research was focused on the identification of S-nitrosylated proteins in unstressed plants and in plants exposed to stress. Comparative analysis of the S-nitrosoproteom under control and stress conditions is an important tool for providing information on the biological relevance of NO signalling under various stress conditions. The main aim is to obtain a deep insight into the signalling pathways associated with reactive N and O species.
783
