NOVÉ METODY STUDIA REAKTIVITY A TRANSPORTNÍCH VLASTNOSTÍ BIOKOLOIDŮ

VYSOKÉ UČENÍ TECHNICKÉ V BRNĚ BRNO UNIVERSITY OF TECHNOLOGY

FAKULTA CHEMICKÁ ÚSTAV FYZIKÁLNÍ A SPOTŘEBNÍ CHEMIE FACULTY OF CHEMISTRY INSTITUTE OF PHYSICAL AND APPLIED CHEMISTRY

NOVÉ METODY STUDIA REAKTIVITY A TRANSPORTNÍCH VLASTNOSTÍ BIOKOLOIDŮ NEW METHODS OF STUDY OF REACTIVITY AND TRANSPORT PROPERTIES OF BIOCOLLOIDS

DIZERTAČNÍ PRÁCE DOCTORAL THESIS

AUTOR PRÁCE

Ing. JIŘÍ SMILEK

AUTHOR

VEDOUCÍ PRÁCE SUPERVISOR

BRNO 2015

prof. Ing. MARTINA KLUČÁKOVÁ, Ph.D.

Vysoké učení technické v Brně Fakulta chemická Purkyňova 464/118, 61200 Brno

Zadání dizertační práce Číslo dizertační práce: Ústav: Student(ka): Studijní program: Studijní obor: Vedoucí práce Konzultanti:

FCH-DIZ0121/2015 Akademický rok: 2015/2016 Ústav fyzikální a spotřební chemie Ing. Jiří Smilek Fyzikální chemie (P1404) Fyzikální chemie (1404V001) prof. Ing. Martina Klučáková, Ph.D.

Název dizertační práce: Nové metody studia reaktivity a transportních vlastností biokoloidů

Zadání dizertační práce: Vývoj metod pro studium reaktivity biokoloidů pomocí difúzních technik, posouzení vlivu interakcí na transportní vlastnosti

Termín odevzdání dizertační práce: 31.12.2015 Dizertační práce se odevzdává v děkanem stanoveném počtu exemplářů na sekretariát ústavu a v elektronické formě vedoucímu dizertační práce. Toto zadání je přílohou dizertační práce.

----------------------Ing. Jiří Smilek Student(ka)

V Brně, dne 5.1.2015

----------------------prof. Ing. Martina Klučáková, Ph.D. Vedoucí práce

----------------------prof. Ing. Miloslav Pekař, CSc. Ředitel ústavu ----------------------prof. Ing. 0DUWLQ :HLWHU, 3K.' Děkan fakulty

ABSTRAKT Účelem předložené dizertační práce bylo studium reaktivity, transportních a bariérových vlastností biokoloidních a syntetických polymerních látek prostřednictvím jednoduchých difúzních technik. Studován byl především vliv základních fyzikálně-chemických parametrů (teplota, koncentrace, pH a modifikace materiálu) na reaktivitu výše uvedené skupiny látek. Jako vhodné modelové materiály, jejichž vlastnosti byly zkoumány, byli vybráni zástupci biokoloidních látek (huminové kyseliny, alginát, chitosan respektive hyaluronan) a jako zástupce syntetického polymeru (polystyrensulfonát). Reaktivita výše uvedených substancí byla zkoumána interakcemi s opačně nabitými organickými barvivy (methylenová modř, rhodamin 6G případně amidočerň 10B) v hydrogelových médiích na bázi termoreverzibilního lineárního polysacharidu (agaróza). Pozornost byla věnována rovněž charakterizaci zkoumaných látek, stejně tak jako hydrogelovým matricím, která byla realizována základními fyzikálně-chemickými metodami (infračervená spektrofotometrie, reologie, elementární analýza, termogravimetrie, rastrovací elektronová mikroskopie). Klíčovou oblast celé dizertační práce představuje optimalizace zvolených difúzních technik (metoda difúzní cely a nestacionární difúze v kyvetách) pro studium reaktivity, bariérových a transportních vlastností zvolených látek tak, aby se vyvinuté metody daly využít jako univerzální metoda pro studium reaktivity širokého spektra látek při různých experimentálních podmínkách. Na základě stanovení fundamentálních difúzních parametrů (difúzní koeficient, čas průchodu, koncentrace na rozhraní hydrogelroztok, tortuozní faktor, zdánlivá rovnovážná konstanta a rozdělovací koeficient) bylo usuzováno o reaktivitě a transportních vlastnostech vybraných biokoloidních respektive syntetických substancí.

KLÍČOVÁ SLOVA hydrogel, biokoloidy, difúze, reaktivita, organická barviva, interakce, transportní a bariérové vlastnosti

3

ABSTRACT The main aim of doctoral thesis was the study on reactivity, transport and barrier properties of biocolloidal and synthetic polymeric substances by simple diffusion techniques. It was studied mainly the influence of basic physic-chemical parameters (temperature, concentration, pH and modification of material) on the reactivity and barrier ability of chosen compounds. Further substances were chosen as a model compounds: biocolloids (humic acids, alginate, chitosan, hyaluronate) and synthetic polymer (polystyrenesulfonate). Reactivity, barrier and transport properties of chosen substances were studied by interactions with oppositely charged basic organic dyes (methylene blue, rhodamine 6G, amido black 10B respectively) in hydrogels medium based on linear polysaccharide (agarose). The attention was also paid to basic physic-chemical characterisation (infrared spectroscopy, rheology, elemental analysis, thermogravimetry and scanning electron microscopy) of chosen materials and also hydrogels. Key part of the whole doctoral thesis was the optimization of selected diffusion techniques (diffusion cell technique and nonstationary diffusion in cuvettes) designated for the study on reactivity and barrier properties of wide range compounds (optimized method should be used as an universal method for simple and fast determination of reactivity of different compounds at given or changing conditions). The rate of reactivity, transport and barrier properties was determined based on fundamental diffusion parameters such as diffusion coefficients, break-through time so called lag time, interfacial concentration of chosen organic dye, apparent equilibrium constant, tortuosity factor, partition coefficient.

KEYWORDS hydrogel; biocolloids; diffusion; reactivity; organic dyes; interaction; transport and barrier properties

4

SMILEK, J. Nové metody studia reaktivity biokoloidů. Brno: Vysoké učení technické v Brně, Fakulta chemická, 2015. 166 s. (přílohy 65 s.). Vedoucí dizertační práce: prof. Ing. Martina Klučáková, Ph.D.

PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, že tato dizertační práce byla vypracována samostatně, a že všechny použité literární zdroje jsou správně a úplně citovány. Tato práce je z hlediska obsahu majetkem Fakulty chemické, Vysokého učení technického v Brně a může být využita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího dizertační práce a děkana FCH VUT.

……………………… Ing. Jiří Smilek

Dizertační práce byla podpořena projektem Centrum materiálového výzkumu na FCH VUT v Brně – udržitelnost a rozvoj, r.č. LO1211, za finanční podpory Národního programu udržitelnosti I (Ministerstvo školství, mládeže a tělovýchovy). Na tomto místě bych velmi rád poděkoval mojí vedoucí dizertační práce prof. Ing. Martině Klučákové, Ph.D. za vedení, cenné připomínky, čas a energii, kterou mi věnovala během mého doktorského studia. Můj velký dík patří také Ing. Petrovi Sedláčkovi, Ph.D. za neustálou motivaci, rozsáhlou spolupráci nejen při zpracovávání dizertační práce a cenné rady poskytnuté při řešení vědeckých problémů. Dále bych rád poděkoval kolegům a kolegyním z huminového týmu, jmenovitě Ing. Michalovi Kalinovi, Ph.D., Ing. Vojtěchovi Enevovi a Ing. Marcele Laštůvkové za hojné a podnětné diskuze nad experimentálními problémy. Poděkování patří také studentům, jejichž závěrečné práce jsem vedl či konzultoval, za spolupráci na řešení experimentální části dizertační práce. Speciální poděkování patří mojí rodině za neustálou podporu, kterou mi poskytovala po celou dobu mého studia nejen na vysoké škole.

5

OBSAH 1

ÚVOD .......................................................................................................................... 9

2

TEORETICKÁ ČÁST ............................................................................................. 10 2.1

Huminové látky ................................................................................................ 10 2.1.1 Rozdělení huminových látek .............................................................. 11

2.2

Huminové látky ................................................................................................ 12 2.2.1 Extrakce a frakcionace huminových látek .......................................... 12 2.2.2 Struktura huminových kyselin ............................................................ 14 2.2.3 Využití huminových kyselin............................................................... 17

2.3

Chitin a chitosan ............................................................................................... 17 2.3.1 Struktura chitinu a chitosanu .............................................................. 18 2.3.2 Vlastnosti chitinu a chitosanu ............................................................. 18 2.3.3 Využití chitosanu ................................................................................ 19

2.4

Polystyrensulfonát ............................................................................................ 20 2.4.1 Vlastnosti a využití polystyrensulfonátu ............................................ 21

2.5

Alginát .............................................................................................................. 22 2.5.1 Vlastnosti a využití alginátu ............................................................... 22

2.6

Kyselina hyaluronová ....................................................................................... 23 2.6.1 Struktura kyseliny hyaluronové.......................................................... 23 2.6.2 Vlastnosti a využití kyseliny hyaluronové ......................................... 24

2.7

Agaróza ............................................................................................................. 24 2.7.1 Struktura agarózy................................................................................ 25 2.7.2 Využití agarózy .................................................................................. 25

2.8

Disperzní systémy............................................................................................. 26 2.8.1 Dělení disperzních soustav ................................................................. 26 2.8.2 Koloidní disperze................................................................................ 27

2.9

Gely................................................................................................................... 28 2.9.1 Vznik gelových struktur ..................................................................... 28 2.9.2 Klasifikace gelů .................................................................................. 29 2.9.3 Vlastnosti gelových disperzních soustav ............................................ 30

2.10 Difúze ............................................................................................................... 31 2.10.1 Fickovy zákony difúzních procesů ..................................................... 32 2.10.2 Fickovy rovnice aplikované pro jednoduché difúzní případy ............ 34 2.10.3 Složitější případy difúzních procesů .................................................. 38 2.11 Difúzní koeficient ............................................................................................. 39 2.11.1 Metody stanovení difúzního koeficientu ............................................ 40 3

SOUČASNÝ STAV ŘEŠENÉ PROBLEMATIKY ............................................... 44 3.1

Fyzikální modely difúze pro polymerní roztoky a gely.................................... 44

6

3.1.1 3.1.2 3.1.3 3.1.4

Překážkové modely (obstrukční efekty) ............................................. 44 Teorie nedeformovatelných kulovitých částic.................................... 46 Hydrodynamické teorie ...................................................................... 46 Teorie volného objemu ....................................................................... 49

3.2

Difúzní procesy s ohledem na gelový charakter vzorku ................................... 50

3.3

Interakce biokoloidů s opačně nabitými látkami .............................................. 51 3.3.1 Chitosanové hydrogely a tenké filmy ................................................. 51 3.3.2 Huminové látky .................................................................................. 52 3.3.3 Polystyrensulfonát .............................................................................. 53

3.4

Zhodnocení současného stavu řešené problematiky ......................................... 53

4

CÍLE DIZERTAČNÍ PRÁCE................................................................................. 55

5

EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST ................................................................................... 56

6

5.1

Příprava biokoloidů a syntetických polymerů .................................................. 56 5.1.1 Biokoloidní sloučeniny – huminové kyseliny .................................... 56 5.1.2 Modifikace huminových kyselin ........................................................ 57 5.1.3 Ostatní biokoloidní látky .................................................................... 57 5.1.4 Syntetické polymery ........................................................................... 58

5.2

Charakterizace zkoumaných látek .................................................................... 58 5.2.1 Použité přístroje a techniky pro charakterizaci zkoumaných látek .... 58 5.2.2 Elementární analýza ........................................................................... 58 5.2.3 Termogravimetrie ............................................................................... 58 5.2.4 Skenovací elektronová mikroskopie................................................... 59 5.2.5 Infračervená spektrofotometrie s Fourierovou transformací .............. 59 5.2.6 Stanovení kyselosti huminových kyselin ........................................... 59

5.3

Příprava hydrogelových matric......................................................................... 60 5.3.1 Hydrogely – difúzní cela .................................................................... 61 5.3.2 Příprava hydrogelových vzorků – neustálená difúze.......................... 62 5.3.3 Vzorky pro sorpční experimenty ........................................................ 63

5.4

Charakterizace hydrogelů ................................................................................. 63 5.4.1 Použité přístroje a techniky pro charakterizaci hydrogelů ................. 63 5.4.2 Stanovení viskoelastických vlastností ................................................ 63

5.5

Difúzní experimenty ......................................................................................... 64 5.5.1 Použité přístroje a techniky pro realizaci difúzních experimentů ...... 64 5.5.2 Neustálená difúze v kyvetách ............................................................. 64 5.5.3 Difúzní cela ........................................................................................ 67 5.5.4 Difúzní cela – matematický model ..................................................... 69 5.5.5 Neustálená difúze v kyvetách – matematický model ......................... 71 5.5.6 Sorpční experimenty........................................................................... 73

VÝSLEDKY A DISKUZE....................................................................................... 75 6.1

Charakterizace materiálů .................................................................................. 75 6.1.1 Elementární analýza a termogravimetrie (EA a TGA) ....................... 75

7

6.1.2 6.1.3 6.1.4

Infračervená spektrofotometrie s Fourierovou transformací (FTIR).. 77 Skenovací elektronová mikroskopie (SEM) ....................................... 78 Stanovení kyselosti vybraných látek .................................................. 80

6.2

Charakterizace hydrogelů ................................................................................. 81 6.2.1 Stanovení viskoelastických vlastností hydrogelů (REO) ................... 81

6.3

Transportní procesy ve vodných roztocích ....................................................... 85

6.4

Transportní procesy v hydrogelech .................................................................. 87 6.4.1 Agaróza – difúzní cela ........................................................................ 87 6.4.2 Agaróza – neustálená difúze............................................................... 92 6.4.3 Lignitické huminové kyseliny – difúzní cela ..................................... 95 6.4.4 Lignitické huminové kyseliny – neustálená difúze .......................... 103 6.4.5 Standardy huminových kyselin – difúzní cela.................................. 113 6.4.6 Standardy huminových kyselin – neustálená difúze ........................ 116 6.4.7 Kyselina hyaluronová – difúzní cela a neustálená difúze ................ 119 6.4.8 Alginát – difúzní cela a neustálená difúze v kyvetách ..................... 122 6.4.9 Chitosan –neustálená difúze v kyvetách........................................... 125 6.4.10 Polystyrensulfonát – difúzní cela a neustálená difúze v kyvetách ... 126

6.5

Sorpční experimenty na lignitických huminových kyselinách ....................... 128 6.5.1 Hydrogely s přídavkem huminových kyselin ................................... 128 6.5.2 Adsorpční experimenty na pevných huminových kyselinách .......... 130

7

ZÁVĚR .................................................................................................................... 133

8

SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY .................................................................. 134

9

PŘEHLED ZKRATEK ......................................................................................... 151

10

SEZNAM POUŽITÝCH SYMBOLŮ .................................................................. 153

11

SEZNAM OBRÁZKŮ ........................................................................................... 156

12

SEZNAM TABULEK ............................................................................................ 160

13

VĚDECKÁ A PUBLIKAČNÍ ČINNOST ............................................................ 161 13.1 Články v impaktovaném časopise .................................................................. 161 13.2 Konferenční příspěvky indexované v databázi Web of Science .................... 161 13.3 Příspěvky na mezinárodních konferencích ..................................................... 161 13.4 Abstrakty......................................................................................................... 164 13.5 Přednášky na zahraničních konferencích........................................................ 165 13.6 Postery na zahraničních konferencích ............................................................ 165 13.7 Seznam řešených projektů .............................................................................. 165 13.8 Absolvované stáže .......................................................................................... 166

14

SEZNAM PŘÍLOH ................................................................................................ 167

8

ÚVOD

1

Fakulta chemická, VUT v Brně

ÚVOD

Materiály přírodního charakteru jako jsou huminové látky, chitosan, alginát či kyselina hyaluronová jsou známy a hojně využívány ve všech oblastech lidského života. Stejně tak jako syntetické polymery jsou běžně používány v celé řadě průmyslových aplikací. Není tedy překvapením, že chemické vlastnosti a jejich složení jsou (ve většině případů) poměrně dobře prozkoumány. Hlavní nedostatky v charakterizaci výše uvedených substancí lze nalézt především v oblasti studia reaktivity, bariérových a transportních vlastností, vzhledem k tomu, že stále ještě neexistuje jednoduchý univerzální model či technika, pomocí něhož by se dala studovat reaktivita případně schopnost interakcí vybraných látek s modelovými činidly. Reaktivita, transportní a bariérové vlastnosti stejně tak jako schopnost interakce s jinými látkami je běžně zkoumána v práškové formě (především v případě huminových látek), formou sorpčních experimentů, které ovšem ne zcela ideálně simulují podmínky, ve kterých se tyto látky přirozeně vyskytují. Přirozeným prostředním huminových látek je půda, kde se většinou vyskytují ve formě nabotnaného hydrogelu nebo jsou rozpuštěny v půdním roztoku. Vzhledem k tomu, že je nezbytné v laboratorním prostředí, co nejdůvěryhodněji simulovat přirozené podmínky biokolodních látek, byly navrženy jednoduché laboratorní metody založené na difúzních procesech, které by měly být aplikovatelné pro široké spektrum látek nehledě na typ nebo původ. Základem těchto difúzních metod je realizovatelnost studia reaktivity, transportních a bariérových vlastností vybraných látek v (nereaktivních) hydrogelových matricích, které mají při srovnání s klasickými metodami studia interakcí hned několik předností. Jednou z nich je majoritní podíl vody, vzhledem k tomu, že právě přirozené prostředí huminových látek – půda – obsahuje ve většině případů taktéž velké množství vody. Dalším příkladem může být kyselina hyaluronová, jelikož jejím přirozeným prostředím je lidské tělo, proto i tato látka bude v častém kontaktu s vodou. Stejně tak tomu je i u ostatních biokoloidních látek jako jsou chitosan či alginát. Další neoddiskutovatelnou výhodou hydrogelů je jejich jednoduchá příprava, vzhledem k tomu, že gelační proces lze poměrně jednoduše ovlivnit změnou základních fyzikálněchemických podmínek a tím pádem připravit hydrogel s přesně definovanými rozměry a vlastnostmi, které požadujeme, což je v podstatě nezbytné pro exaktní popis difúzních procesů z matematického hlediska. Především pak lze připravit hydrogel s přídavkem vybrané aktivní látky, která je do hydrogelu zabudována (interpenetrována). Navržené metody (metoda difúzních cel a neustálená difúze v kyvetách) tedy mají sloužit jako jednoduché a levné univerzální metody pro studium transportních a bariérových vlastností celé řady látek. Výhodou také je, že lze pomocí těchto metod poměrně jednoduše zkoumat vliv základních fyzikálně-chemických parametrů jako je například koncentrace, teplota, modifikace materiálu, pH případně iontová síla.

9

TEORETICKÁ ČÁST

2

TEORETICKÁ ČÁST

2.1

Huminové látky


Huminové látky (HL) jsou látky, které se přirozeně vyskytují v půdě. Obecně lze říci, že huminové látky tvoří základ organické hmoty půdy (anglicky Soil Organic Matter – SOM). Jedná se o směs organických substancí, většinou aromatického charakteru, s bohatou rozmanitostí. Látky huminového charakteru se přirozeně vyskytují nejenom v půdě, ale také ve vodách, kalech, kompostu, mořských a jezerních sedimentech, rašelině, lignitu, hnědém a oxyhumolitech čili v tzv. kaustobiolitech (hořlavé sedimenty organogenního původu) [1]. Množství uhlíku obsaženého v huminových látkách až 10× přesahuje množství uhlíku v živých organismech. Množství uhlíku v látkách huminového charakteru dosahuje hodnoty 60 × 1011 tun [2]. Huminové látky vznikají složitým procesem zvaným humifikace [3]. Tento proces v přírodě probíhá zcela samovolně. V dnešní době, kdy se huminové látky, především pak huminové kyseliny, těší zájmu mnohých vědeckých skupin, existuje několik teorií, jakým způsobem může být tento cenný materiál přirozeně formován. Obecně je známo, že huminové látky vznikají během procesu tlení rostlinných a živočišných zbytků v půdě. Hlavní postupy vzniku huminových látek, které jsou přijímány vědeckou obcí, jsou uvedeny na Obr. 1.

Obr. 1: Mechanismus formování huminových látek [1].

Klasický přístup, prezentován Waksmanem [4], [5] je nazýván tzv. ligninová teorie. Tato teorie byla uznávána po mnoho roků. Dle Waksmanovi teorie je zdrojem huminových látek právě zmiňovány lignin [6]. Přítomnost dusíku, obsaženého v huminových látkách, je

10

TEORETICKÁ ČÁST


výsledkem kondenzačních procesů modifikovaného ligninu s proteiny, podle schématu níže. modifikovaný lignin − CHO + RNH → modifikovaný lignin − CH = NR + H O

Podle této teorie je lignin získáván působením mikroorganismů. Modifikace ligninu zahrnuje ztrátu methoxylových skupin (−OCH3) za vzniku ortho-hydroxyfenolů a oxidaci alifatických postranních řetězců za vzniku karboxylových skupin. Tento proces je ilustrován na Obr. 2.

Obr. 2: Schématické znázornění ligninové teorie tvorby huminových látek [1].

S postupem času a vývojem znalostí o huminových látkách byla ligninová teorie zavržena. Další přípustná teorie vzniku huminových látek je tzv. polyfenolová teorie. Na rozdíl od dříve uvedené teorie vzniku huminových látek, polyfenolová teorie předpokládá jako počáteční materiál nízkomolekulární organické sloučeniny, ze kterých jsou formovány vysokomolekulární komponenty pomocí kondenzačních a polymerizačních procesů. V tomto modelu jsou v prvním kroku základní stavební bloky (veškeré zbytky rostlin a živočichů, včetně ligninu), ze kterých jsou huminové látky následně formovány, rozštěpeny na monomerní strukturní jednotky. Jedna z cest vychází z ligninu, jehož fenolické, aldehydické a karboxylové skupiny jsou mikrobiálně atakovány a vedou k přeměně na chinony. Ty podléhají polymerizaci za vzniku huminových makromolekul. Druhá cesta spočívá v tom, že polyfenoly jsou syntetizovány mikroorganismy, například z celulózy a ty jsou enzymaticky oxidovány na chinony, které jsou následně převedeny na huminové látky. 2.1.1

Rozdělení huminových látek

Huminové substance lze kategorizovat do skupin podle velkého množství kritérií. Nejběžnější dělení huminových látek je na základě acidobazické rozpustnosti [1]. Huminové látky mohou být rozděleny do třech základních podskupin: huminové kyseliny (HK) – frakce huminových látek, která je rozpustná v zásaditém prostředí a naopak nerozpustná v kyselinách. Po rozpuštění huminových látek v silně zásaditém prostředí a následném okyselení roztoku humátu při hodnotách pH < 2 dochází k precipitaci. 11

TEORETICKÁ ČÁST


fulvinové kyseliny (FK) – po okyselení roztoku huminových látek rozpuštěných v zásaditém prostředí zůstávají rozpuštěny v roztoku. Jde tedy o frakci huminových látek, která je rozpustná jak v kyselém, tak také v zásaditém prostředí. huminy (HU) – tuto frakci huminových látek nelze rozpustit v bazických ani kyselých roztocích. Jedná se tedy o nerozpustnou frakci huminových látek. Jednotlivé frakce huminových látek se neliší pouze svými acidobazickými vlastnostmi. Lze je odlišit také na základě dalších parametrů, jako je například zbarvení, molekulová hmotnost, obsah kyslíku, dusíku apod. Výčet odlišných vlastností všech zmíněných frakcí huminových látek nabízí Obr. 3.

Obr. 3: Vlastnosti jednotlivých frakcí huminových látek [1].

Jak je patrné z Obr. 3, jednotlivé frakce huminových látek se již od pohledu liší zbarvením. Fulvinové kyseliny mají žlutou až žlutooranžovou barvu, zatímco huminové kyseliny jsou hnědé, v některých případech šedé. Frakce s nejvyšší molekulovou hmotností – huminy – se vyznačují černou barvou. Podle jedné z teorií [7] je tmavé zbarvení huminových kyselin ve srovnání s kyselinami fulvinovými dáno přítomností složek s vyšší molekulovou hmotností. Odlišnosti v molekulové hmotnosti obou frakcí mohou být způsobeny odlišným počtem funkčních skupin (karboxylová, fenolická, aromaticita, atd.) v obou zmíněných frakcích a především pak stupněm polymerizace. Některé publikované teorie [8] predikují také přítomnost tzv. hymatomelanové kyseliny (HMK) jako podfrakce huminových kyselin. V podstatě se jedná o tu část huminových kyselin, které jsou rozpustné v zásaditém prostředí a vysrážené prostředím kyselým, ovšem na rozdíl od samotných huminových kyselin jsou rozpustné v alkoholech.

2.2

Huminové látky

2.2.1

Extrakce a frakcionace huminových látek

Chemické a koloidní vlastnosti půdní organické hmoty mohou být studovány v izolovaném stavu, oproštěny od anorganických půdních komponent. Z tohoto důvodu se velké množství vědeckých pracovišť specializuje na separování organické části půdy od té anorganické. Ve většině případů se využívá tzv. alkalické extrakce, obvykle za použití

12

TEORETICKÁ ČÁST


0,1 mol·dm−3 respektive 0,5 mol·dm−3 hydroxidu sodného. Níže je uveden stručný přehled extrakčních metod v chronologickém pořadí. První pokus izolace huminových kyselin z půdy byl publikován Achardem [9] již v roce 1786, který extrahoval rašelinu alkáliemi a po okyselení silnou kyselinou získal černou hmotu. De Saussure v roce 1806 poprvé zavedl termín „humus“ jako tmavý organický materiál v půdě. Ve své práci také poznamenal, že humus je bohatší na uhlík a naopak chudší na vodík a kyslík, ve srovnání s rostlinnými materiály, ze kterých je získáván. První rozsáhlou studii o původu a chemické povaze huminových látek provedl Sprengel [10] v roce 1837. Mnoho procedur izolace huminových kyselin, které navrhl, se staly základem ostatních procesů izolací huminových látek, jako například přečištění půdy pomocí slabých minerálních kyselin před extrakcí huminových látek alkáliemi (demineralizace). Chemické vlastnosti huminových látek byly ve velké míře zkoumány švédským vynálezcem Berzeliusem [11], v roce 1839 objevil, že světle žluté huminové látky izolované z minerálních vod jsou schopny tvořit stabilní komplexní sloučeniny s měďnatými, hlinitými, železitými ionty, apod. Ve 20. letech 20. století se švédský vědec Oden zabýval klasifikací huminových látek podle jejich rozpustnosti. Jako první navrhl dělení huminových látek na humus, huminové kyseliny, hymatomelanovou kyselinu a fulvinové kyseliny.

Obr. 4: Schéma frakcionace půdní organické hmoty (humus) [15].

Detailní studii o struktuře huminových kyselin poskytl v roce 1930 Shmook, který se zabýval nejen strukturou těchto komplexních sloučenin, ale také jejich formováním za přítomnosti mikroorganismů. Zastával také názor, že se nejedná pouze o jednu konkrétní

13

TEORETICKÁ ČÁST


sloučeninu, ale že jde o velké množství chemických komponent s podobnými vlastnostmi a strukturou. Proto nelze huminové kyseliny popsat jedním sumárním vzorcem. Na závěr byl Odenův postup frakcionace huminových látek rozšířen o několik dalších frakcí, které lze izolovat z organické hmoty půdy, tzv. hnědé a šedé huminové kyseliny. Hlavní diference v těchto dvou frakcích huminových kyselin je dán jejich rozpustností po přídavku elektrolytu. Zatímco šedé huminové kyseliny po přídavku elektrolytu koagulují z roztoku humátu, hnědé huminové kyseliny zůstávají v roztoku, bez zjevné tendence koagulovat. Šedé huminové kyseliny jsou charakteristické především pro černozemě, hnědé huminové kyseliny se vyskytují například v rašelině či v hnědém uhlí. Odlišnosti ve zbarvení těchto dvou frakcí huminových kyselin je dán především obsahem uhlíku (šedé huminové kyseliny mají vyšší obsah uhlíku ve srovnání s hnědými). Izolací huminových kyselin moderními postupy se zabývají následující publikace [12-14]. 2.2.2

Struktura huminových kyselin

Studium molekulární struktury huminových látek je jednou z nejpozoruhodnějších výzkumných oblastí v půdní chemii a také jednou z nejtěžších. Znalost základní struktury huminových kyselin je vyžadována především s ohledem na porozumění funkce těchto významných součástí půdy v jejich přirozeném prostředí. Vzhledem k rozmanitosti huminových kyselin, velkého množství různorodých funkčních skupin, které drží celou supramolekulu pohromadě, nelze popsat huminové kyseliny jedním strukturním vzorcem. Proto jsou huminové kyseliny zjednodušeně charakterizovány přítomností strukturních jednotek, s ohledem na jejich reaktivitu, komplexaci kationtů v půdě, formování půdních organických komplexů či vázání pesticidů. Struktura huminových kyselin, i když hypotetická, je odvozena na základě studia elementární analýzy [13], funkčních skupin ve struktuře [16], degradačních produktů [17] či spektrofotometrických analýz [18]. Z historického hlediska byla prvotní struktura huminových kyselin definovaná německým vědcem Fuchsem, který navrhl strukturu, která byla ve velké míře založena na přítomnosti kondenzovaných jader, na nichž byly navázány karboxylové a hydroxylové funkční skupiny. Výsledky pro stanovení reaktivních funkčních skupin, stejně tak jako chemická degradace huminových kyselin naznačují, že aromatická jádra trihydroxyfenolového typu jsou přítomna ve struktuře huminových kyselin. Tato aromatická jádra jsou následně propojena pomocí následujících funkčních skupin –O–, –(CH2)n–, –NH–, –N– [19]. Jednou z prvních uváděných struktur byl strukturní vzorec huminových kyselin podle Flaiga (Obr. 5). Na rozdíl od dříve uváděných struktur podle Fuchse a Dragunova [20], Flaigův vzorec přinesl inovativní novinky v uspořádání karboxylových skupin. Karboxylové skupiny ve struktuře huminové kyseliny jsou podle Flaiga uspořádány tak, aby mohly vytvářet anhydridy při chemických reakcích.

14

TEORETICKÁ ČÁST


Obr. 5: Hypotetická struktura huminových kyselin podle Flaiga [1].

Na základě elementární analýzy a obsahu karboxylových a hydroxylových skupin odvodil Steelink hypotetickou strukturu huminových kyselin (Obr. 6). Jím navrhnutá struktura byla mnohem více alifatického charakteru než modely prezentované dříve. Dle jeho názoru jsou karboxylové skupiny (funkční skupiny zodpovědné za celkovou kyselost molekuly) spojovány s alifatickou částí molekuly.

Obr. 6: Strukturní vzorec huminových kyselin podle Steelinka [3].

Struktura publikovaná Stevensonem (Obr. 7) splňuje veškeré požadavky pro „typické“ půdní huminové kyseliny, včetně volných a vázaných hydroxylových skupin, chinonových struktur, dusíku a kyslíku coby můstku a karboxylových skupin volně rozmístěných na aromatických jádrech [21].

15

TEORETICKÁ ČÁST


Obr. 7: Stevensonův strukturní model huminových kyselin [1].

Schulten a Schnitzer vytvořili schématickou strukturu pro huminové kyseliny na základě nukleární magnetické rezonance [22] pyrolýzy a dat z oxidační degradace. Struktura zobrazená na Obr. 8 obsahuje aromatická jádra, která jsou spojená alkylovými zbytky. Dochází k vytvoření flexibilní sítě obsahující dutiny k navázání či imobilizaci jiných organických sloučenin (polutanty, ionty těžkých kovů, pesticidy aj.). Karboxylové i hydroxylové skupiny jsou taktéž hojně zastoupeny, jak na aromatických jádrech, tak také na alifatických zbytcích huminové kyseliny.

Obr. 8: Strukturní vzorec huminových kyselin podle Schultena a Schnitzera [22].

16

TEORETICKÁ ČÁST


Při tvorbě strukturních vzorců je brán zřetel především na polydisperzitu celého systému. Výše uvedené strukturní vzorce se vyznačují tím, že neobsahují žádné pravidelně se opakující strukturní jednotky (myšleno z makroskopického hlediska). Charakterizace huminových kyselin ze strukturního hlediska jsou důležité především z toho důvodu, že poskytují informaci o typu funkčních skupin, kterými je tvořeno jádro celé molekuly a také postranní řetězce. Následně poskytují také informaci o možném uspořádání funkčních skupin a ve finále mohou napovědět něco více o biologickém působení huminových kyselin v půdě. 2.2.3

Využití huminových kyselin

Huminové kyseliny nacházejí uplatnění v širokém spektru oborů, ať již se jedná o průmysl, zemědělství či jiná spotřebitelská odvětví. Mezi hlavní odvětví, ve kterých lze potenciálně huminové kyseliny využít, patří především ochrana životního prostředí či farmacie a biomedicína [23]. Lidstvo využívalo potenciálu HK již od pradávna, aniž by mělo ponětí, že právě HK jsou zodpovědné za zlepšování kvality půdy či zvyšování úrodnosti plodin. V zemědělství je využíváno pozitivního vlivu HK především na obsah živin a zadržování vody v půdě. HK jsou používány coby aditivum k běžně používaným hnojivům, především ve formě humátu sodného či draselného [24]. Mimo jiné přispívají k vývoji mikroflóry či provzdušnění půdy. Potenciální využití v zemědělství tkví také v aplikaci HK coby přísad do krmiv pro hospodářská zvířata, jelikož byl zjištěn pozitivní vliv na růst a váhu dobytka. Ve stavebnictví se huminové kyseliny využívají jako plniva do cementů, čímž lze docílit řízeného vytvrzování těchto materiálů, dále také ovlivnit smáčivost [25] připravených povrchů apod. V oblasti životního prostředí se huminové kyseliny využívají především díky jejich afinitě k iontům těžkých kovů, toxickým polutantům a jiným nebezpečným látkám. Tomuto tématu se věnuje velké množství publikací. Kalina a kol. [26] se ve své publikaci věnuje interakcím huminových kyselin s modelovými ionty těžkých kovů. Interakce jsou zkoumány pomocí difúzních procesů v hydrogelových médiích. Další publikace [27] je zaměřena na tvorbu komplexů huminových kyselin se zirkoniem, thoriem respektive hafniem. Zkoumán je také vliv různých parametrů, například vliv pH a iontové síly na sorpční kapacitu huminových kyselin. Kolektiv autorů v čele s Tang [28] publikoval přehledné review zaměřené na odstraňování těžkých kovů z vodných roztoků s využitím huminových respektive fulvinových kyselin.

2.3

Chitin a chitosan

Chitin (β-(1-4)-N-acetyl-D-glukosamin) je biopolymerní látka polysacharidového charakteru, která se skládá z N-acetyl-glukosaminových jednotek vázaných β-(1-4) glykosidickou vazbou, které se neustále opakují, v podstatě se jedná o derivát glukózy. Jedná se o druhý nejrozšířenější polysacharid na zemském povrchu (nejčastěji se vyskytujícím polysacharidem je glukóza). Chitin byl poprvé izolován v roce 1811 z hub, následně v roce 1832 z kutikul hmyzu. Chitin je nejvíce zastoupen právě v buněčných stěnách hub, schránkách měkkýšů a exoskeletu členovců, kde plní především funkci ochrannou.

17

TEORETICKÁ ČÁST


Chitosan (CHIT) je derivátem chitinu, který vzniká alkalickou N-deacetylací (50 % hydroxid sodný). Systematicky se jedná o β(1-4)-D-glukosamin. Obecně platí, že pokud heteropolymer chitinu a chitosanu obsahuje více než 50 % glukosaminových jednotek, poté je taková sloučenina označována jako chitosan. Poprvé byl chitosan popsán v roce 1859 francouzským vědcem C. Rougetem. V přírodě neexistuje 100 % acetylovaný chitin (běžně se vyskytuje 70 – 90 %), jedná se tedy vždy o heteropolymer chitinu a chitosanu. Molekulová hmotnost komerčně vyráběného chitosanu se pohybuje v rozmezí 3 800 až 20 000 Daltonů. 2.3.1

Struktura chitinu a chitosanu

Chitosan patří po strukturní stránce mezi unikátní polysacharidy, jelikož jako jeden z mála biopolymerů se ve vodných roztocích chová jako polykationt. Tento iontový charakter je dán tím, že chitosan ve své struktuře disponuje volnými aminoskupinami, které se ve slabě kyselých roztocích protonizují [29]. Díky své struktuře se chitosan vyznačuje komplexací látek anionaktivního charakteru, která je intenzivně studována. I přesto, že ve vodných roztocích při fyziologickém pH disponuje kladným nábojem, zachovává si chitosan důležité vlastnosti – bioadhezivitu, biokompatibilitu a biodegradabilitu.

Obr. 9: Rozdíl ve struktuře chitinu a chitosanu [30].

2.3.2

Vlastnosti chitinu a chitosanu

Chitin patří mezi polysacharidy se silným hydrofobním charakterem, který je díky své hydrofobitě nerozpustný ve vodě a většině organických rozpouštědel. Je taktéž

18

TEORETICKÁ ČÁST


nerozpustný ve zředěných kyselinách a zásadách. Jeho rozpustnost je silně ovlivněna stupněm deacetylace. Rozpustnost chitosanu je podobná jako rozpustnost chitinu, taktéž je nerozpustný ve vodě a ve většině organických rozpouštědel. Chitosan lze ovšem poměrně dobře rozpustit ve zředěných minerálních kyselinách [31]. Chitosan se díky svému unikátnímu strukturnímu charakteru, biokompatibilitě a biodegradabilitě řádí do popředí zájmu mnohých vědeckých, výzkumných a lékařských institucí. Přehled aplikací chitosanu je uveden v kap. 2.3.3 a vlastností v Tab. 1 Tab. 1: Specifické vlastnosti chitosanu [32]

2.3.3

specifická vlastnost

aplikační oblast

bioaktivita

prevence proti mikrobiálnímu růstu

biodegradabilita

zdroj uhlíku pro bioinženýrství

reaktivita aminoskupin

imobilizace enzymů

filmotvorné vlastnosti

textilní produkty s řízenou propustností

adsorpční vlastnosti

čištění odpadních vod

Využití chitosanu

Chitosan díky svým vlastnostem nachází uplatnění v širokém spektru aplikací, počínaje farmacií a biomedicínou [33] přes textilní průmysl až po zemědělství [34]. V lékařských a farmaceutických odvětvích je chitosan ceněn hlavně díky jeho biokompatibilitě a biodegradabilitě. Dalším neméně důležitým využitím chitosanu ve farmaceutickém průmyslu jsou kapsule s řízeným uvolňováním aktivních komponent [35], [36]. Při těchto aplikacích se využívá jeho postupné biodegradability, kdy s přibývajícím časem dochází k rozkladu chitosanové schránky transportovaného léčiva a do těla se poté postupně (řízeně na základě změny fyzikálně chemických vlastností prostředí, v tomto případě na základě změny acidity/bazicity) uvolňují účinné látky. V biomedicínských aplikacích je chitosan hojně využíván coby obvazový materiál [37] vzhledem k tomu, že podporuje hojení ran a chrání rány před mechanickým poškozením, znečištěním a infekcí. V poslední době se na biomedicínském trhu objevují také samovstřebávací chirurgické nitě, které jsou na jednu stranu pevné a pružné, ale na druhou stranu nezanechávají stehy, vzhledem k tomu, že jsou opět vyrobeny na bázi chitosanu, který je s postupem času biodegradabilní. Chitosan se využívá také jako antikoagulant, tedy jako látka zabraňující srážení krve. Na tento účel se využívá speciálně modifikovaného chitosanu, konkrétně karboxymetylovaného. Chitosan se také s oblibou využívá na tvorbu kontaktních čoček, vzhledem k tomu, že je biokompatibilní a lidské tělo ho poměrně lehce přijímá. Samostatnou kapitolou v oblasti aplikací chitosanu v biomedicínském odvětví tvoří tzv. scaffoldy [38], [39]. Tento pojem spadá do oblasti tkáňového inženýrství a využívá chitosanu coby nosného média („lešení“), sloužícího jako matrice pro růst nových buněk, tkání či dokonce orgánů. Kmenové buňky bez rozlišení působnosti jsou umístěny na scaffold, s výhodou se využívá chitosanu, vzhledem k tomu, že chitosan podporuje růst

19

TEORETICKÁ ČÁST


buněk a jejich výživu. Tímto způsobem lze tedy uměle vypěstovat poškozenou část lidského organismu. Pro tento způsob aplikace se nevyužívá čistý chitosan, ale většinou kompozitní materiál (kompozit chitosanu a hydroxyapatitu). Chitosan je díky svým vlastnostem také hojně využíván v kosmetickém průmyslu, vzhledem k tomu, že disponuje fungicidním a antibakteriálním účinkem, dokáže zvlhčovat pokožku a zlepšovat penetraci lipofilních látek přes lidskou kůži. Potenciální využití chitosanu lze nalézt v potravinářském průmyslu. Teoreticky lze říci, že chitosan v případě požití je schopen vázat v lidském žaludku tuky, tím pádem by mohl fungovat jako odstraňovač tuků, ovšem toto využití chitosanu ještě nebylo dostatečně experimentálně prostudováno. V potravinářském průmyslu ovšem nachází chitosan také své uplatnění především coby konzervant potravin. Chitosanové přípravky jsou využívány také v ostatních odvětvích jako je zemědělství či ochrana životního prostředí. Zvyšují odolnost rostlin proti houbové, mikrobiální a virové infekci. Dále lze na bázi chitosanu připravit různě modifikované sorbenty, vzhledem k tomu, že chitosan disponuje poměrně vysokou afinitou vůči iontům těžkých kovů a tím pádem je schopen tyto ionty imobilizovat a omezovat tak jejich biologickou aktivitu, dostupnost a působení v půdě [40]. Dokonce lze říci, že chitosan disponuje lepšími sorpčními schopnosti vůči běžným polutantům než zeolity.

2.4

Polystyrensulfonát

Polystyrensulfonát (PSS) patří mezi polymerní látky, které jsou odvozené z polystyrenu, ovšem obsahují sulfonovou kyselinu, případně sulfonované funkční skupiny. Polystyrensulfonát ve formě sodné soli (NaPSS) se vyskytuje jako bílý prášek, který je poměrně dobře rozpustný ve vodě a naopak nerozpustný v alkoholech. Polystyrensulfonát tvoří v roztoku dlouhé, natažené řetězce, jehož centrální část tvoří vinylové jednotky, zatímco sulfonové skupiny směřují do prostoru [41]. Běžně se molekulová hmotnost solí polystyrensulfonátu pohybuje v rozmezí 104 – 106 Daltonů. Nutno říci, že polystyrensulfonát není na rozdíl od ostatních zmíněných biopolymerních či biokoloidních látek přírodního charakteru. Jedná se o synteticky vytvořenou látku, která se běžně nevyskytuje v přírodě. Polystyrensulfonát je připravován reakcí sulfonové kyseliny sulfonové s polystyrenem (sulfonací polystyrenu) dle následujícího schématu

CH2 CH

CH2 CH n

n

+

+

nH2SO4 S O

nH2O

O OH

Obr. 10: Schématické znázornění vzniku polystyrensulfonátu sulfonací polystyrenu.

Sodná sůl polystyrensulfonátu je následně připravována neutralizační reakcí vzniklého polystyrensulfonátu s hydroxidem sodným dle schématu na Obr. 11

20

TEORETICKÁ ČÁST


CH2 CH

CH2 CH n

n

+ S O

+

nNaOH

O

S O

OH

nH2O

O -

+

O Na

Obr. 11: Vznik finálního produktu polystyrensulfonátu sodného neutralizační reakcí s hydroxidem sodným.

Dalším způsobem, kterým může být NaPSS syntetizován je volná radikálová polymerizace styrensulfonátu sodného [42]. Tento způsob přípravy je ovšem méně využíván ve srovnání se sulfonací polystyrenu. Typ přípravy NaPSS ovšem výrazným způsobem ovlivňuje finální vlastnosti polystyrensulfonátu sodného. Výrazné změny jsou pozorovány například na mezifázových vlastnostech polystyrensulfonátu sodného (NaPSS připravený volnou radikálovou polymerizací má o 20 % vyšší koeficient osmózy než NaPSS připravený klasickou sulfonací polystyrenu) [42]. V této dizertační práci byl polystyrensulfonát použit jako zástupce syntetických polymerů, protože právě tato látka se používá jako modelové polymerní činidlo. Polystyrensulfonát sodný v roztoku disociuje a tím pádem se chová jako polyanion. Tohoto faktu bylo využito při studiu reaktivity této sloučeniny v rámci předložené dizertační práce. Pro studium reaktivity sodné soli polystyresulfonátu byly použity kationaktivní barviva, kde byla předpokládána pozitivní interakce mezi anionaktivním PSS a kationaktivními barvivy. 2.4.1

Vlastnosti a využití polystyrensulfonátu

Vlastnosti a využití polystyrensulfonátu se odvíjí především od jeho struktury. Při pohledu na strukturu polystyrensulfonátu (sodné soli) je patrné, že tato syntetická sloučenina bude hojně využívána především pro iontovou výměnu. Sodná sůl polystyrensulfonátu je využívána především jako činidlo pro změkčování tvrdé vody. Tvrdá voda obsahuje vápenaté ionty, kterých může být voda zbavena tehdy, pokud je přefiltrována přes síto obsahující sodnou sůl polystyrensulfonátu. Dojde k iontové výměně, vápenaté případně hořečnaté ionty jsou imobilizovány volnými sulfonovými skupinami, zatímco sodné ionty putují společně s vodou přes síto, čímž je zachována elektroneutralita [43] a [44]. Široké spektrum využití sodných či vápenatých solí polystyrensulfonátu díky iontové výměně nabízejí také medicínské aplikace. Například sodná sůl PSS je využívána pro léčbu hyperkalemie (vyšší koncentrace draslíku v krvi) [45]. Tato substance je známá pod komerčními názvy Resical® a využívá se pro snižování koncentrace draslíku nejen v krvi, ale také v játrech. Výhodou sodné soli polystyrensulfonátu je fakt, že nedochází k jeho kumulaci v lidském těle [46].

21

TEORETICKÁ ČÁST


Z vědeckého hlediska je polystyrensulfonát taktéž hojně využíván především s ohledem na studium různých fenoménů v systémech obsahujících polyelektrolyty. Polystyrensulfonát je využíván jako modelová molekula [47].

2.5

Alginát

Alginát (ALG) je přírodním polysacharidem, který je běžně extrahován z buněčných stěn hnědé mořské řasy, ve kterých plní přirozenou funkci – zvyšování flexibility. Alginát sodný byl poprvé studován anglickým chemikem E. C. C Stanfordem v roce 1881 [48]. Z chemického hlediska je alginát polysacharidem, který je tvořen dvěma základními složkami – manurátem (MA) a guluronátem (GU). Obě tyto strukturní podjednotky jsou do finální struktury alginátu zabudovány blokově a vzájemně jsou spojeny β-1-4 glykosidickou vazbou [49]. Alginát se běžně dodává ve formě sodných či draselných solí, které jsou poměrně dobře rozpustné ve vodě, na rozdíl od vápenatých solí alginátu, které jsou nerozpustné ve vodě, vzhledem k tomu, že dvojvazný vápník slouží jako jakýsi můstek mezi dvěma podjednotkami alginátu. Rozpustnost všech solí alginátu je v ostatních rozpouštědlech (etanol, éter, apod.) značně omezená [50].

Obr. 12: Strukturní vzorec alginátu (vlevo) a hnědá řasa Laminaria digitata (vpravo) [51].

Alginát je schopen s vícevalenčními ionty kovů tvořit poměrně stabilní gel. Schopnost gelace je významnou měrou ovlivněna poměrem manurátových a guluronátových podjednotek. Jensen a spol. [52] zjistili, že pokud je poměr M ku G 4:5, gel vykazuje lepší mechanické vlastnosti než v případě vyšších poměrů (1,3:1 a 2,5:1). 2.5.1

Vlastnosti a využití alginátu

Využití alginátu je založeno na třech hlavních vlastnostech. V prvé řadě se využívá toho, že při rozpuštění sodných či draselných solí alginátu v roztocích se poměrně rapidně zvyšuje viskozita finálního roztoku. Další vlastnosti, které se hojně využívá, je fakt, že alginát je schopen poměrně jednoduše tvořit gel po přidání vápenatých iontů. Gel je tvořen chemickou reakcí, kdy vápník nahradí sodík ve struktuře alginátu a přítomnost vápníku způsobí sesíťování (propletení) alginátových řetězců, čímž se vytvoří gelová struktura. Výhodou je, že například oproti agaróze, není zapotřebí zahřívání alginátu pro tvorbu gelu. Tyto gely jsou také termostabilní, čili vystavení alginátového gelu teplu nezpůsobuje rozpad gelovité struktury. Poslední vlastností, které se hojně využívá v průmyslovém měřítku je to, že alginát je schopen vytvářet tenké filmy případně alginátová vlákna [5355]. Alginát se běžně používá v textilním průmyslu k barvení různých produktů. Svou roli zde plní především jako ztužovač past obsahujících reaktivní barviva. Oproti ostatním 22

TEORETICKÁ ČÁST


ztužovačům, které se běžně používání (škrob) má alginát výhodu v tom, že s reaktivními barvivy neinteraguje, čímž nesnižuje barvící schopnost [56] a [57]. Alginát se také běžně používá v potravinářském průmyslu opět jako ztužovač či želírující činidlo. V poslední době také nachází velké uplatnění v nově se rozvíjejícím oboru vaření – molekulární gastronomie, kde se využívá především jeho schopnosti tvorby gelu s vápenatými ionty. Vzhledem k tomu, že se jedná o přírodní polysacharid, nezpůsobuje žádné zdravotní problémy a byl dokonce vybrán organizací WHO jako jedno z nejbezpečnějších potravinářských aditiv [50]. Samostatnou kapitolu využití alginátu tvoří biomedícínské a farmaceutické aplikace. V prvé řadě se alginát využívá jako aditivum, které urychluje rozpouštění a vstřebávání účinných látek v lécích [58]. Dále je alginát také využíván jako ochranu žaludku před překyselením, vzhledem k tomu, že na povrchu žaludku je schopen tvořit gelovitý obal, který má ochranný charakter [59]. Samozřejmě, že jeho gelotvorných a ztužovacích schopností je hojně využíváno také v kosmetickém průmyslu [60]. Alginát je také běžně používán coby materiál pro přípravu scaffoldů a ve tkáňovém inženýrství [61], [62].

2.6

Kyselina hyaluronová

Kyselina hyaluoronová (HYA) je přírodní lineární polysacharid, který byl poprvé objeven v roce 1934 skupinou vědců kolem Karla Meyera. Výhoda tohoto přírodního biopolymeru spočívá především v tom, že se jedná o relativně vysokomolekulární substanci (i když v lidském těle se kyselina hyaluronová vyskytuje v široké škále molekulových hmotností, včetně nízkomolekulárních frakcí), biologicky odbouratelnou (biodegradabilní), lidským tělem velmi dobře snesitelnou (biokompatibilní). Poprvé byl tento cenný materiál izolován očního sklivce hovězího dobytku. 2.6.1

Struktura kyseliny hyaluronové

Kyselina hyaluronová má nerozvětvenou lineární strukturu, která je tvořena opakujícími se disacharidovými jednotkami, konkrétně se jedná o D-glukoronovou kyselinu a N-acetyl-Dglukosamin [63]. Tyto opakující se jednotky jsou následně spojeny střídajícími se β-1,4 a β-1,3 glykosidickými vazbami. Struktura kyseliny hyaluronové je naznačena na Obr. 13.

Obr. 13: Základní chemická struktura kyseliny hyaluronové.

Důležitým faktorem ve struktuře kyseliny hyaluronové je její celkový náboj, který je záporného charakteru, vzhledem k tomu, že kyselina hyaluronová ve své struktuře obsahuje karboxylové skupiny, které jsou schopny disociace. Esenciálnost hyaluronanu v lidském organismu je dána především díky jeho amfifilní struktuře, která ho předurčuje

23

TEORETICKÁ ČÁST


k tomu, aby byl schopný interagovat s buněčnými membránami. Hyaluronan je schopen vázat fosfolipidy, které jsou základním stavebním kamenem buněčných membrán [64]. 2.6.2

Vlastnosti a využití kyseliny hyaluronové

Kyselina hyaluronová se běžně vyskytuje u všech typů obratlovců stejně tak jako u bakterií. Není tedy divu, že je také přirozenou součástí lidského těla. Nachází se mimo jiné v mezibuněčné hmotě, kde zajišťuje správnou hydrataci pokožky. Lze ji nalézt také v očním sklivci. Ovšem pravděpodobně nejdůležitější roli hraje kyseliny hyaluronová v kloubním prostoru, kde působí jako lubrikant [65]. Kyselina hyaluronová má unikátní reologické a viskoelastické vlastnosti [66] (absorbuje energii nárazů při chůzi či běhu a snižuje tření v kloubním prostoru). Vyniká také svými hygroskopickými vlastnostmi [67] (je schopna na sebe pojmout až tisíci násobek vody vůči své původní hmotnosti v suchém stavu). Díky svým unikátním vlastnostem, především pak díky již zmiňované biokompatibilitě a biodegradabilitě, našla kyselina hyaluoronová své uplatnění především v medicínských oblastech jako je tkáňové inženýrství [68], oftalmologie [69] nebo při léčbě osteoartrózy [70]. Pozitivní účinky byly pozorovány také při hojení ran, vzhledem k tomu, že kyselina hyaluronová slouží jako výborný humektant. Dále může být kyselina hyaluronová využívána pro léčení popálenin, na tvorbu scaffoldů ve tkáňovém inženýrství při hojení ran. Kyselina hyaluronová je také hojně využívána jako aktivní látka v řadě kosmetických preparátů [71].

2.7

Agaróza

Agaróza (AG) patří mezi lineární polysacharidy, tvořená opakujícími se jednotkami agarobiózy. V podstatě se jedná o disacharid tvořený střídajícími se galaktózovými a 3,6anhydrogalaktózovými podjednotkami [72]. Její výjimečné vlastnosti byly známy již na počátku 17. století. Jedná se o biopolymerní látku, která je syntetizována z mořských řas typu Agarophyte, což je typicky červená řasa, která ve své buněčné stěně vytváří hydrokoloidní formu agaru. Agaróza disponuje velmi zajímavými vlastnostmi především z pohledu fyzikálně-chemického. Hydrogely na bázi agarózy vykazují tzv. termoreverzibilní vlastnosti, kterých je využíváno především v biochemických oblastech. Agaróza je poměrně dobře rozpustná ve vodném prostředí, ovšem pouze za zvýšené teploty (přibližně při 85 °C dochází k dokonalému rozpuštění agarózy za vzniku solu). Teplota, při které se agaróza rozpouští, značně závisí na způsobu izolace a stupni substituce. Některé typy agarózy mohou zůstávat ve formě solu až při teplotě 30 − 35 °C [73]. Při poklesu teploty dochází ke zgelovatění za vzniku polotuhé gelové hmoty [74]. Následným zahřátím nad teplotu tání agarózy dochází k opětovnému vzniku solu. Agarózové hydrogely tedy vykazují tzv. hysterezní chování. Agaróza zaujímá jednoduchou nebo v některých případech dvojitou helikální konformaci. Ke gelaci dochází při agregaci dvojitých helikálních struktur, při teplotě, která značně závisí na obsahu methoxylových a sulfátových skupin. Třídimenzionální síť, jejímž základem jsou asociované dvojité helikální struktury, je následně stabilizována

24

TEORETICKÁ ČÁST


vodíkovými můstky. Podrobnější informace o gelaci agarózových hydrogelů nabízí reference [75], [76]. 2.7.1

Struktura agarózy

Až do roku 1937 vědci zastávali názor, že struktura agaru je dána pouze jednotkami galaktózy, které jsou sulfatovány. Avšak v roce 1937 japonský vědec C. Araki zjistil, že agar obsahuje nejméně dva separované polymery. Jeden nazval jako agaróza a druhý agaropektin. Později v roce 1957 bylo zjištěno, že agaróza je alternující kopolymer β-Dgalaktózy a 3,6-anhydro-α-L-galaktózy. Základní řetězec je nepravidelně substituován sulfátovými či metylovými estery, popřípadě pyruvátovými zbytky [77]. Lineární polysacharid agarózy agreguje ve zředěných roztocích a ve fázi solu vytváří dlouhé svazky vláken a při tvorbě mikrogelové fáze tyto svazky zůstávají spojeny pomocí slabých vazebných interakcí – vodíkové můstky. Studiu struktury agarózy pomocí elektronového mikroskopu se věnovali publikace [78], [79]. Autoři těchto publikací zjistili, že sktruktura agarózových gelů je při přípravě velmi heterogenní obsahující intersticiální prostory ohraničené řetězci agarózy různé hustoty. Při vyšších koncentracích (> 0,5 hm. %) agarózových gelů jsou nehomogenity ve struktuře agarózových gelů zanedbatelné. Z tohoto důvodu bude v předložené práci ve většině případů použita koncentrace 1 hm. %, aby bylo zabráněno případným nehomogenitám ve struktuře agarózových hydrogelů.

Obr. 14: Strukturní vzorec lineárního polysacharidu – agaróza.

2.7.2

Využití agarózy

Agaróza se poměrně hojně využívá v biomedicínských aplikacích, v potravinářském průmyslu či pro purifikaci proteinů. Ovšem pravděpodobně největší význam má agaróza ve vědeckých aplikacích. Využívá se především jako kultivační médium pro růst bakterií, jako stacionární fáze v gelové permeační chromatografii (GPC) či jako nosné médium při procesech elektroforézy [80] a [81]. Gelovou elektroforézou v agarozových hydrogelech lze například separovat jednotlivé nukleové kyseliny ze struktury lidské DNA. Potenciální využití agarózových gelů může být také v tkáňovém inženýrství, což je úzce spjato s využitím agarózových hydrogelů pro růst mikroorganismů. Vzhledem k tomu, že agaróza se jeví jako biokompatibilní materiál, který je do jisté míry inertní, může být agarózových hydrogelů v budoucnu využito také pro růst lidských tkání coby tzv. scaffoldů [82-84]. Využití agarózy nejen ve formě hydrogelů v potravinářském průmyslu nabízí reference [85]. Zatímco v potravinářském průmyslu jsou preferovány hydrogely na bázi

25

TEORETICKÁ ČÁST


agarózy s nižší koncentrací, v biomedicínských aplikacích jsou vyžadovány hydrogely s vyšší mechanickou odolností, což je úzce spjato s koncentrací agarózy v gelu. Poměrně ucelený přehled o aplikacích agarózy při elektroforetických experimentech nabízí reference [86], zatímco článek [87] se zabývá především využití agarózy v potravinářském průmyslu.

2.8

Disperzní systémy

Pojem disperzní soustava zahrnuje termodynamické systémy, které jsou tvořeny minimálně dvěma složkami. Každá disperzní soustava obsahuje disperzní podíl, který je rovnoměrně či nerovnoměrně (v případě nestabilních disperzních soustav) rozptýlen v disperzním prostředí. Obecně platí, že disperzní podíl (dispergum) a disperzní prostředí (dispergens) jsou dvě chemicky odlišné složky. 2.8.1

Dělení disperzních soustav

Disperzní soustavy lze klasifikovat podle mnoha kritérií. Nejběžněji mohou být disperzní soustavy děleny podle velikosti disperzního podílu, podle počtu fází či tvaru částic [88]. Podle počtu fází systému lze disperzní soustavy klasifikovat jako: • homogenní – disperzní podíl i disperzní prostředí tvoří jednu fázi • heterogenní – disperzní podíl je od prostředí oddělen mezifázovým rozhraním. Podle velikosti disperzního podílu jsou disperzní soustavy rozděleny následovně: • hrubě disperzní soustavy – rozměr disperzních částic je větší než 500 (1 000) nm, • koloidně disperzní soustavy – rozměr disperzních částic je v rozmezí 1-500 (1 000) nm, • analyticky disperzní soustavy – rozměr částic je menší než 1 nm. Podle tvaru částic mohou být disperzní soustavy klasifikovány jako: • globulárně disperzní soustavy – soustavy s izometrickými částicemi, • laminárně disperzní soustavy – soustavy s anizometrickými částicemi, jejich rozměr je řádově menší než ostatní rozměry, • fibrilárně disperzní soustavy – soustavy s anizometrickými částicemi, jejich rozměr je řádově větší než ostatní rozměry. Podle rozdělení velikosti částic disperzního podílu: • monodisperzní (uniformní) – všechny disperzní částice mají přibližně stejnou velikost, • paucidisperzní – systémy obsahující několik disktrétních frakcí částic, • polydisperzní (neuniformní) – disperzní soustavy obsahující částice různých velikostí. Podle skupenství disperzního podílu respektive disperzního prostředí lze disperzní soustavy klasifikovat podle Tab. 2.

26

TEORETICKÁ ČÁST


Tab. 2: Dělení disperzních soustav dle skupenství disperzního prostředí a disperzního podílu [89].

disperzní prostředí

plynné

kapalné

pevné

2.8.2

disperzní podíl

velikost disperzních částic koloidní

hrubě disperzní

plynný

-

-

kapalný

aerosoly (mlha)

déšť

pevný

aerosoly (dým)

kouř

plynný

pěny

bublina, pěna

kapalný

emulze

emulze

pevný

lyosoly

suspenze, gel

plynný

tuhé pěny

minerály s uzavřenými plyny

kapalný

tuhé emulze

minerály s uzavřenými kapičkami

pevný

tuhé soly

eutektika

Koloidní disperze

Jedná se o heterogenní disperzní systém, který obsahuje disperzní podíl, jehož velikost je v rozmezí 1 – 500 (1 000) nm. Koloidní disperzní soustavy mohou být připraveny buď z velkých částic dispergací nebo z pravých roztoků kondenzací. Ve většině případů jsou koloidní disperzní soustavy termodynamicky nestabilní (fázové koloidy), a proto samovolně zanikají. Z tohoto důvodu musí být stabilita koloidně disperzních soustav většinou podpořena přídavkem třetí fáze, která je mísitelná s disperzním prostředím (podílem) a neomezeně mísitelná s disperzním podílem (prostředím). V případě koloidní disperzní soustavy, kde disperzní podíl i disperzní prostředí tvoří kapalina, látka, která se přidává pro zvýšení stability zmiňované disperzní soustavy, nazývá se emulgátor. Co se týče optických vlastností, koloidní disperzní soustavy leží mezi hrubě disperzními a analytickými. Zatímco disperzní podíl v případě hrubě disperzních koloidních soustav lze ve většině případů pozorovat okem, v případě koloidních disperzí tomu tak není. Disperzní podíl u koloidních disperzních soustav lze pozorovat pod elektronovým mikroskopem, popřípadě ultramikroskopem (lze pozorovat samotný Brownův pohyb disperzních částic). Na rozdíl od hrubě disperzních soustav disperzní podíl nepodléhá sedimentaci (v případě, že se jedná o stabilní koloidně disperzní soustavu v termodynamické rovnováze). Jednou z unikátních vlastností koloidních soustav je to, že mají schopnost rozptylovat světlo procházející právě touto soustavou. Rozptyl světla na disperzním podílu koloidních soustav se nazývá tzv. Tyndallův jev. Tento jev je taktéž pozorován v přírodě například při průchodu slunečního záření skrz přírodní koloidní soustavy (mlha, mrak apod.). Paprsek světla se po průchodu takovými soustavy stává viditelný ve formě kužele. Koloidní disperzní soustavy lze rozdělit podle vztahu disperzního prostředí k disperzním částicím na lyofilní a lyofobní [90]. Lyofilní disperzní soustavy jsou charakteristické tím, že disperzní částice vykazují afinitu k částicím disperzního prostředí. Částice disperzního

27

TEORETICKÁ ČÁST


podílu jsou tedy ve většině případů solvatovány na povrchu molekulami disperzního prostředí. Ve většině případů se jedná o reverzibilní disperzní soustavy (bílkoviny, polysacharidy, mýdla apod.). Na rozdíl od lyofilních disperzních soustav, u lyofobních soustav není pozorována afinita disperzního prostředí k disperzním částicím, jakýkoliv zásah do tohoto systému (přídavek elektrolytu, změna fyzikálních podmínek apod.) může vést ke koagulaci a zániku disperzní soustavy.

2.9

Gely

Z fyzikálně chemického hlediska se jedná o koloidní soustavy, ve kterých je disperzním podílem pevná látka a disperzním prostředím kapalina. V případě, že disperzním prostředím je voda, nazýváme tuto disperzní soustavu jako hydrogel. Odborná definice pojmu hydrogel zní následovně: jedná se o disperzní systémy tvořené trojrozměrnou polymerní sítí, vytvářející souvislou strukturu, která prostupuje celým disperzním prostředím. Spojité tedy není jen disperzní prostředí, ale i samotný disperzní podíl [91]. Pevné disperzní částice jsou uzavřeny v disperzním prostředí a z toho důvodu nejsou schopny se v něm volně pohybovat. Jediný pohyb, který mohou disperzní částice vykonávat je pohyb vibrační. Síly, které udržují částice disperzního podílu na místě, jsou chemického či fyzikálního původu a nazývají se adhezní. Z mechanického hlediska mají gely velmi zajímavé vlastnosti, lze říci, že leží na pomezí pevných látek a kapalin. I když disperzní prostředí (v případě hydrogelů voda) zaujímá majoritní podíl, jejich mechanické vlastnosti jsou spíše podobné pevným látkám. 2.9.1

Vznik gelových struktur

Gely vznikají procesem zvaným gelace, která může být vyvolána jedním z následujících procesů: změna fyzikálního stavu roztoku (změna pH, změna teploty, přídavek elektrolytu) – tímto způsobem lze připravit fyzikálně síťované gely (například termoreverzibilní hydrogel na bázi agarózy, či srážený hydrogel huminových kyselin), chemická reakce – chemickou reakcí vznikají gely s kovalentními uzly (lepší mechanická odolnost ve srovnání s fyzikálně síťovanými gely), botnání – přídavek disperzního prostředí ke xerogelu (disperzní podíl po odstranění disperzního prostředí z původního lyogelu, viz. kap. 2.9.2) reverzibilního gelu. Proces gelace lze charakterizovat tzv. bodem gelace [92], což je okamžik, kdy se v systému objeví nekonečná trojrozměrná síť. Slovo nekonečná lze vysvětlit tak, že rozměry vzniklé sítě jsou totožné s rozměry makroskopické gelové fáze. Váhový podíl sítě je v bodě gelace ještě nepatrný, ale v dalším průběhu se rychle zvětšuje.

28

TEORETICKÁ ČÁST


Obr. 15: Vznik chemicky síťovaného hydrogelu reakcí polymeru obsahujícího hydroxylové skupiny s glutaraldehydem [93].

2.9.2

Klasifikace gelů

Nejčastěji bývají gely klasifikovaný podle jejich chování ve vysušeném stavu [89]: gely reverzibilní – při vysoušení zmenšují svůj objem, až dojde k úplnému odstranění volného disperzního prostředí a vzniku kompaktního xerogelu, které jsou schopné přecházet zpět do původního stavu opětovným přijímáním disperzního prostředí (botnání). Tyto vlastnosti vykazují především gely makromolekulární. Prostorová struktura těchto gelů je tedy tvořena sítí makromolekulárních řetězců, které jsou spojeny působením fyzikálních či chemických sil v místech, které se odborně nazývají uzly. gely ireverzibilní – tento typ gelů je charakteristický tím, že si při vysoušení udržuje prakticky stejný objem jako původní lyogel. Při styku s disperzním prostředím jsou sice schopné určité množství kapaliny nasorbovat, ovšem původní lyogel tím nevzniká. Vysoušení původního lyogelu je tedy nevratný proces. Dalším kritériem, podle kterého mohou být gely klasifikovaný, je typ disperzního prostředí [89]. Prvním typem jsou hydrogely, kde disperzním prostředím je voda (např. termoreverzibilní hydrogel na bázi agarózy) a druhým typem jsou organogely, kde disperzní prostředí tvoří organické rozpouštědlo (např. polyethylenglykol). Zvláštním případem makromolekulárních gelů jsou tzv. izogely, v nichž je disperzním prostředím monomer disperzního podílu (polystyren ve styrenu). Gely mohou být klasifikovány také podle typu vazeb, které je drží pohromadě [89] na: fyzikálně síťované gely – vznikají působením sil fyzikálního charakteru (van der Waalsovy, polární síly, vodíkové můstky). Uzly se netvoří na konci každé makromolekuly, ale mohou být vytvořeny mezi libovolnými úseky makromolekul, což umožňuje zapojení jedné makromolekuly do více uzlových oblastí. K asociaci mezi jednotlivými řetězci dochází například změnou fyzikálních podmínek roztoku (změna teploty, pH apod.), zvýšením koncentrace nebo zhoršením kvality rozpouštědla. Uzlové oblasti fyzikálně síťovaných gelů se liší strukturou, pevností a životností, což má velký vliv na finální vlastnosti připravených gelů. Gel s pevnými spoji se více podobá kovalentně síťovaným hydrogelům, zatímco gely s nižší pevností uzlů mohou podléhat degradaci působením vnějších podmínek (vyšší napětí, zvýšení teploty apod.). Gely, které lze ohřátím převést na roztok a ochlazením roztoku zpět na původní gel se nazývají termoreverzibilní. kovalentně síťované gely – představují gely s nekonečně trojrozměrnou síťovou strukturou, která je tvořena chemickými vazbami. Tato síťová struktura vzniká kondenzační nebo adiční polymerací monomerů nebo z lineárních polymerů zesíťováním za přítomnosti

29

TEORETICKÁ ČÁST


vhodného síťovacího činidla (divinylbenzen + lineární řetězce polystyrenu). Struktura takto připravených gelů je značně pevná. Odstraněním disperzního prostředí vznikají kompaktní, reverzibilní xerogely, které jsou schopny opětovně botnat. Botnání reverzibilního xerogelu v přítomosti disperzního prostředí bývá kvantitativně popisováno pomocí stupně nabotnání Q (rovnice 1) =

=

∆!

,

(1)

kde výraz "# udává hmotnost botnajícího gelu v čase t od počátku botnání, "$ symbolizuje počáteční hmotnost xerogelu. Stupeň nabotnání Q je tedy možné stanovit jako přírůstek hmotnosti xerogelu vážením nebo měřením objemu pohlcené kapaliny ∆% a konečně symbol & představuje hustotu kapaliny.

Botnání může být také popsáno tzv. objemovým koeficientem botnání Φ, který vyjadřuje poměr objemu nabotnalého gelu (Vt) k objemu původního xerogelu (V0) viz. rovnice 2 !

' = !( .

(2)

Na botnání gelů má vliv především teplota, obecně platí, že rychlost botnání s rostoucí teplotou roste. Velmi důležitou roli hraje také přídavek elektrolytu a charakter roztoku z hlediska acido-bazických vlastností. Přídavek elektrolytu má negativní vliv na rychlost botnání a stupeň botnavosti. 2.9.3

Vlastnosti gelových disperzních soustav

I když gely obsahují majoritní podíl disperzního prostředí, vykazují některé vlastnosti charakteristické pro tuhé materiály. Mezi tyto charakteristické vlastnosti spadají mechanické vlastnosti, elektrická vodivost, difuzivita a stárnutí gelů. Hydrogelové systémy odolávají určitému mechanickému napětí až do hodnoty tzv. kritického napětí [94]. Pod hodnotou kritického napětí se chovají jako tuhá elastická tělesa, ovšem po překročení této hodnoty dojde k nevratné deformaci vnitřní struktury, hydrogel vlivem aplikovaného napětí teče – chová se jako kapalina. Gely tedy disponují jakousi pružností (jsou schopny absorbovat energii, která je jim dodána ve formě mechanického namáhání). Hodnota kritického napětí je závislá na různých parametrech. Hlavní faktory, které ji ovlivňují, jsou koncentrace polymeru v gelu a také pevnost uzlů a charakter gelu. Některé gely (plastické a pseudoplastické) vykazují při namáhání tzv. tixotropní vlastnosti. Zpočátku jsou hydrogely s tixotropními vlastnostmi charakteristické vysokou zdánlivou viskozitou, která se postupně s namáháním (třepání, míchání, odstřeďování apod.) snižuje. Pokud je ovšem hydrogel ponechán v klidu, narušené vazby se začnou opět obnovovat a viskozita takového systému opět narůstá a limitně se blíží viskozitě původní. Tixotropní chování gelů je z aplikačního hlediska velmi důležité.

30

TEORETICKÁ ČÁST


Obr. 16: Tixotropní chování gelů (časová závislost viskozity, červená křivka symbolizuje proměnnou viskozitu, zatímco černá křivka značí impuls aplikovaného napětí neboli deformace).

U čerstvě připravených gelů (reverzibilních i ireverzibilních) dochází k celé řadě samovolných procesů, neboť tyto systémy ještě nejsou v termodynamické rovnováze. Jedním z těchto samovolných dějů je synereze (stárnutí gelů). Při tomto ději roste počet styčných bodů, síťovitá struktura nově vzniklého gelu se poněkud smršťuje, což je doprovázeno vytlačováním části disperzního prostředí. Děj synereze je podporován zvýšením teploty a také přídavkem elektrolytu. Elektrická vodivost gelových systémů, jejichž disperzní prostředí obsahuje disociované nízkomolekulární ionty, zůstává téměř stejně vysoká, jako vodivost v roztocích. Taktéž difuzivita nízkomolekulárních látek v gelech je jen o něco málo menší než v původním solu, z něhož byl gel připraven. Tento aspekt je dodržen i přesto, že při gelaci prudce vzrůstá viskozita systému. Díky síťovité struktuře není difuzivita iontů nízkomolekulárních látek ovlivněna prouděním ani tepelnými konvekcemi. Nerušená difúze v gelových systémech umožňuje vznik tzv. Liesegangových obrazů. Jestliže do gelu, který obsahuje nějakou nízkomolekulární látku, difunduje další nízkomolekulární látka s odlišnou molekulovou hmotností, která s ní může tvořit nerozpustnou sraženinu, probíhá poté srážecí reakce jen v určitých zónách soustavy (tam, kde je dostatečná koncentrace pro překročení součinu rozpustnosti). Většina gelů přirozeně se vyskytujících v živých organismech vykazuje anizotropii. Příčinou anizotropie uměle připravených gelů je obligátně jejich nerovnoměrná deformace při přípravě nebo nerovnoměrná objemová kontrakce při vysoušení. U těchto gelů jsou vlastnosti jako roztažnost při botnání, smršťování při vysoušení a také optické a mechanické vlastnosti různé v různých směrech působení.

2.10

Difúze

Difúze je proces, pomocí něhož je hmota v makroskopicky nehybném uzavřeném systému transportována z jedné části systému do jiné zcela náhodným pohybem molekul. Hnací silou difúzních procesů je nerovnoměrnost koncentrace rozpuštěné látky v systému – koncentrační gradient. Výjimku tvoří termodifúze, kde je hnací silou rozdíl teplot a barodifúze,

31

TEORETICKÁ ČÁST


kde hnací sílu představuje rozdíl tlaků na obou stranách membrány. Vzhledem k tomu, že takové systémy spějí do stavu s nejnižší vnitřní energií (do stavu termodynamické rovnováhy) dochází tedy k samovolnému pohybu molekul ve směru koncentračního gradientu (Brownův pohyb) [95]. Obecně platí, že při konstantní teplotě a tlaku je maximální práce, kterou může vykonat jeden mol látky při transportu z místa s chemickým potenciálem µ do místa s chemickým potenciálem µ + dµ daná vztahem dW = dµ. V systému, kde je chemický potenciál funkcí prostorové souřadnice x [96], dostáváme rovnici 3 +,

d) = * .

+- /,1

d2.

(3)

Při porovnání rovnice 3 s teoretickým vztahem pro práci jako takovou dW = −Fdx, získáváme teoretické vyjádření síly vyjadřující spontánní tendenci částic k rozptylu (rovnice 4) +,

3 = − *+- .

/,1

.

(4)

Podstata spontánní síly rozptylu částic v nehomogenním prostředí z hlediska termodynamiky spočívá v tom, že chemický systém vždy zvyšuje svoji entropii, čili spěje do stavu s nejnižší vnitřní energií.

Obr. 17: Příklad difúze s naznačením Brownova pohybu [95].

V případě rozpuštěné látky v jakémkoliv rozpouštědle nedochází pouze k difúzi rozpuštěné látky (i když to tak navenek vypadá). Společně s rozpuštěnou látkou vždy difunduje i rozpouštědlo, proces difúze je tedy vzájemný. V tomto případě hovoříme o tzv. binární difúzi. K tepelnému pohybu může docházet i v čistých látkách či rovnovážných směsích, v systémech, kde je nulový koncentrační gradient. Tento proces je nazýván tzv. samodifúze. Rychlost difúzních procesů se odvíjí od toho, v jakém prostředí k difúzi dochází, v plynech je rychlost difúze ~ 5 cm/min, v kapalném prostředí ~ 0,05 cm/min a v pevných látkách je rychlost difúze nejpomalejší, ~ 1·10−5 cm/min. 2.10.1

Fickovy zákony difúzních procesů

Jak již bylo uvedeno výše, podstata difúzních procesů tkví v neuspořádaném pohybu molekul. Stejný pohyb stojí také v pozadí vedení tepla. Existuje určitá analogie mezi

32

TEORETICKÁ ČÁST


vedením tepla a difúzními procesy, která byla objevena v roce 1855 německým fyzikem Adolfem Eugenem Fickem [97]. Tento průkopník v oblasti studia difúzí navrhl matematický aparát pro popis difúzních procesů, založený na podobnostech s vedením tepla. Definoval celkový jednorozměrný difúzní tok J (rovnice 5) 4 =5∙7 =5∙8∙

: ;

9

9<

,

(5)

kde Q značí množství materiálu, které projde přes kolmou plochu A za jednotku času t. D označuje difúzní koeficient a j představuje jednotkový difúzní tok. Rychlost změny poměru prošlého materiálu ku ploše se poté nazývá difúzní tok. Difúzní tok J je definován v mol·s−1. Obecně je jednorozměrný difúzní tok materiálu skrz kolmou plochu vyjádřen 1. Fickovým zákonem (rovnice 6) 4 = −8 ∙

=>

+-

,

(6)

kde D představuje difúzní koeficient, J je již zmiňovaný difúzní tok a výraz

+>

+-

reprezentuje

parciální derivaci změny koncentrace v ose x. Jednotkou difúzního koeficientu je poté podle mezinárodní soustavy SI (m2·s−1). Pokud tedy lze uvažovat soustavu tvořenou dvěma látkami, dostáváme dvě rovnice, z nichž každá vyjadřuje difúzní tok jedné z látek. Difúzní toky obou látek jsou však vzájemně spřažené, platí, že existuje-li koncentrační gradient složky A, který způsobuje difúzní tok, musí v ustáleném stavu v soustavě existovat stejně velký koncentrační gradient složky B, který v opačném směru způsobí difúzní tok látky B o stejné velikosti. Proto není nutné explicitně vyjadřovat všechny rovnice pro obě dvě složky. První Fickův zákon (rovnice 6) udává změnu koncentrace difundující látky podle souřadnice x, pokud uvažujeme pouze jednodimenzionální difúzi ve směru x-ové osy. Také je předpokládáno, že koncentrační gradient se nemění v průběhu času. U většiny difúzních procesů ovšem dochází právě k časové změně koncentrace. Vztah vyjadřující změnu koncentrace v závislosti na čase při nestacionární difúzi vyjadřuje tzv. 2. Fickův zákon (rovnice 7), který platí tehdy, pokud difúzní koeficient je nezávislý na koncentraci +> +<

+? >

#

+@

+>

= 8 ∙ *+- ? + @ ∙ +- ∙ +-..

(7)

V případě, že je plocha A konstantní, bude rovnice 7 zjednodušena do tvaru rovnice 8 +> +<

+? >

= 8 ∙ *+- ? ..

(8)

Rovnice 8 je diferenciální rovnicí, popisující koncentraci látky v systému jako funkci času a pozice. Řešení této diferenciální rovnice závisí na okrajových podmínkách, stejně tak jako na parametru D – difúzní koeficient. Rovnice 6 a 8 jsou základním kamenem matematického popisu všech difúzních procesů. Z těchto rovnic jsou následně odvozeny difúzní modely založené na různých principech. Přehledné review zabývající se difúzními modely nabízí reference [96]. Skupina autorů kolem Masaro [96] sumarizuje různé difúzní modely založené na překážkovém faktoru, hydrodynamických teoriích a teorii volného objemu. Vzhledem k tomu, že difúzní procesy 33

TEORETICKÁ ČÁST


jsou značně závislé na okolních podmínkách, musí být každý případ řešen zvlášť. Například pro studium reaktivity biokoloidních látek, které jsou v roztoku schopny se solvatovat a vytvářet tak objemově větší překážku než samotné biokoloidní klubko je vhodný model Peppas-Reinhartův, který zahrnuje nejen vliv solvatačního obalu, ale také vliv interakcí mezi biokoloidem, rozpouštědlem a rozpuštěnou látkou. 2.10.2

Fickovy rovnice aplikované pro jednoduché difúzní případy

Přestože matematický popis difúzních procesů je poměrně složitou záležitostí, existuje několik jednoduchých řešení pro konkrétní případy. Konkrétně se jedná o difúzi skrz tenký film a volnou difúzi (neustálená difúze v polonekonečném prostředí). Difúze skrz tenký film Tento difúzní model odpovídá ustálené difúzi, kdy platí

9> 9<

= 0. Hlavními parametry, které

mají být stanoveny, jsou difúzní tok J a koncentrační profil. Jinak řečeno, má být stanoveno, kolik rozpuštěné látky je transportováno skrz tenký film a jak se mění koncentrační profil rozpuštěné látky v tenké vrstvě. Případně lze také stanovit difúzní koeficient, za předpokladu, že známe difúzní tok J.

Obr. 18: Difúze skrz tenký film.

Ustálená difúze skrz tenký film je ilustrována na Obr. 18. Na každé straně tenkého filmu (membrány) je dobře promíchaný roztok rozpuštěné látky o různých koncentracích. Je ovšem důležité si také uvědomit, že v obou případech se jedná o zředěné roztoky. Rozpuštěná látka difunduje z místa s vyšší koncentrací přes membránu do místa s nižší koncentrací. Nejprve musí být definována hmotnostní bilance skrz tenkou přepážku ∆z v jakékoliv libovolné pozici z uvnitř tenkého filmu. Hmotnostní bilanci v tenkém filmu vystihuje rovnice 9 [100] BCD = EFG,H − EIJK,HL∆H ,

(9)

kde EFG,H představuje hmotnostní bilanci vstupující do materiálu, EIJK,HL∆H značí hmotnostní bilanci vystupující z materiálu ve směru osy z. Za předpokladu, že je proces ustálený a nedochází k akumulaci látky v membráně, množství látky, které do membrány vstoupí,

34

TEORETICKÁ ČÁST


tak také z membrány vystoupí, je rychlost difúzního procesu tedy závislá na difúzním toku a ploše membrány A podle rovnice 10 [100] 0 = 5M7#,H − 7#,HLNH O,

(10)

kde 7#,H představuje difúzní tok látky do membrány a 7#,HLNH symbolizuje difúzní tok látky z membrány. Podělením rovnice 10 objemem membrány (A·∆z) lze získat rovnici 11 [100] 0 = −*

P ,QRSQ P ,Q ., HLNH H

(11)

kde z značí tloušťku membrány. V případě, že bude uvažován tenký film o zanedbatelné tloušťce (∆z = 0), poté bude rovnice 11 nabývat rozměrů derivace (rovnice 12) [100] 0=−

9

7. 9H #

(12)

V kombinaci s 1. Fickovým zákonem (rovnice 6) lze poté získat rovnici 13 pro difúzní koeficient 0=8

9? >

9H ?

.

(13)

Tuto diferenciální rovnici lze řešit pro dvě okrajové podmínky (rovnice 14 a 15), kde c1 symbolizuje koncentraci v čase t ≠ 0, c10 počáteční koncentraci v čase t = 0 a c1l koncentraci v čase t ≠ 0 T = 0, B# = B#$

(14)

T = U, B# = B#V .

(15)

Integrací výrazu (rovnice 13) pro tenkou membránu podle okrajových podmínek (rovnice 14 a 15) lze získat jednoduché řešení (rovnice 16 a 17) [100] H

B# = B#$ + B#V − B#$ ∙ V ,

7# = −8

9>

9H

=

W V

B#$ − B#V .

(16) (17)

Koncentrační profil v membráně je lineární, vzhledem k tomu, že závisí pouze na zvolených okrajových podmínkách čili na koncentracích na povrchu membrány a tloušťce dané membrány (nezávislý na difúzním koeficientu). Difúzní tok není časově závislý, celkové množství transportované látky skrz tenkou membránu roste taktéž s časem lineárně. V případě, že homogenní tenká membrána je nahrazena mikroporézní vrstvou, difúzní proces již není dál jednodimenzionální, vzhledem k tomu, že velkou roli zde hraje tortuozita. Trajektorie rozpuštěné látky skrz mikroporézní přepážku je tedy zakřivená.

35

TEORETICKÁ ČÁST


Obr. 19: Příklad zakřivení trajektorie difundujících částic (tortuozita) [96].

Je nutné si uvědomit, že v případě difúze v mikroporézních systémech se vliv tortuozity zahrnuje, v rámci zjednodušení, do sumárního difúzního koeficientu (efektivní difúzní koeficient), který zahrnuje nejen vliv tortuozity, ale také rozdělovací koeficient. Difúzní tok lze poté vypočítat pomocí rovnice 18 [100] 7# = X

WYZZ ∙[ V

\ ∙ B#$ − B#V ,

(18)

kde výraz Deff symbolizuje již zmiňovaný efektivní difúzní koeficient, H reprezentuje rozdělovací koeficient a l je tloušťka vrstvy. Existuje celá řada způsobů, jak difúzi skrz tenký film řešit. Výše uvedené okrajové podmínky lze navolit podle toho, jaké difúzní parametry známe (difúzní koeficient, povrchové koncentrace, difúzní tok, koeficient přestupu, apod.). Následně podle znalostí těchto parametrů lze řešit konkrétní difúzní problémy. Volná difúze Volnou difúzí jsou myšleny neustálené difúzní procesy v polonekonečném prostředí. Jako polonekonečné prostředí může být prezentován systém, který začíná rozhraním a následně je velmi dlouhý. Důležitým faktem je, že na rozhraní dochází k nárůstu koncentrace látky (v porovnání s původní koncentrací) a dojde tedy ke vzniku koncentračního gradientu, což vede k tomu, že látka začíná difundovat hlouběji do polonekonečného média. V dostatečně krátkých difúzních časech se každý systém bude chovat jako polonekonečné médium. Příkladem může být totožný roztok, který je oddělen membránou (analogie s případem difúze skrz tenký film). Na začátku experimentu je v každém místě daného systému konstantní koncentrace, s výjimkou membrány, kde se uplatňuje vliv rozdělovacího koeficientu Obr. 20 (a). V případě, že koncentrace na levé straně membrány vzroste, vzroste také koncentrace v tenkém filmu (v blízkosti té části roztoku, kde došlo k nárůstu koncentrace). Vytvoří se tedy neustálený stav společně s koncentračním gradientem v tenkém filmu. Krátce po nárůstu koncentrace zůstává koncentrace u pravé části tenkého filmu neměnná Obr. 20 (b). V tenkém filmu se tedy vytvoří koncentrační profil. Po určitém čase se tenký film dostává opět do ustáleného stavu Obr. 20 (c). Difúzní proces v polonekonečné desce je znázorněn na Obr. 20. V případě, že chceme stanovit koncentrační profil, tok případně difúzní koeficient při této situaci, musí být opět použita látková bilance, v případě tenkého filmu o objemu A∆z [100] +

+<

∙ 5ΔTB# = 5 ∙ 7# , T + ΔT . 36

(19)

TEORETICKÁ ČÁST


Pokud je rovnice 19 podělena výrazem A∆z získáváme rovnici 20 +>

+<

= −*

P ,QRSQ P ,Q .. HLNH H

(20)

V případě, že výraz ∆z se limitně blíží k nule poté lze využít definici derivace podle rovnice 21 [100] +>

+<

+P

=

+H

.

(21)

Kombinací rovnice 21 s 1. Fickovým zákonem a za předpokladu, že difúzní koeficient je nezávislý na koncentraci dostáváme rovnici 22 [100] +>

=8

+<

+? >

+H ?

.

(22)

Řešení rovnice 22 pro následující okrajové podmínky [100] z ∈ <0;∞>

t=0 t>0

c1 = c1∞

z=0

c1 = c10

z=∞

c1 = c1∞

kde c1∞ značí koncentraci difundující látky na konci difúzního média, lze získat metodou separace proměnných, v tom případě, pokud je zavedena nová proměnná (rovnice 23) [100] b=

-

√dW<

.

(23)

V podstatě se jedná o difúzní model konstantního zdroje (viz. rovnice 22), kdy nedochází ke změně koncentrace difúzního média během celého experimentu. Diferenciální rovnice 22 poté může být přepsána do tvaru rovnice 24 [100] e>

ef

+f

* +< . = 8

+? >

+f ?

+f

*+H. .

(24)

Integrováním rovnice 24 lze získat rovnici 25 [100] e>

ef

= gh

f?

.

(25)

Druhou integrací a uplatněním okrajových podmínek lze získat rovnici 26 ve tvaru [100] >

>

> i >

= erf b,

(26)

kde výraz erf b je vyjádřen rovnicí 27, což je chybovou funkcí b [100] erf b =

f

m h √l $

n?

do.

(27)

Ve většině případů je ovšem důležitější vyjádření základních difúzních parametrů jako difúzního toku případě difúzního koeficientu ve srovnání se samotným koncentračním profilem. Difúzní tok může být vyjádřen kombinací Fickových zákonů jako rovnice 28 [100] 7# = −8

+>

+H

= p8/rs B#$ − B#t .

37

(28)

TEORETICKÁ ČÁST


Z rovnice 28 je patrné, že difúzní tok je funkcí polohy a času. Celkové množství látky přenesené skrz rozhraní je funkcí odmocniny z času a pro jeho zdvojnásobení tedy musí být doba difúze čtyřnásobná.

Obr. 20: Princip neustálené difúze [74].

2.10.3

Složitější případy difúzních procesů

Výše zmíněné modely jsou značně idealizované, jelikož v reálných systémech dochází k řadě procesů, které difúzní procesy do velké míry ovlivňují. Jedním z těchto procesů je například chemická reakce. Volná difúze s chemickou reakcí Difundující látka může poměrně reagovat s okolním prostředím, které je nehybné a nemůže difundovat. Tato reakce může být vratná či nevratná. V případě, že budeme uvažovat rychlou a vratnou reakci 1. řádu v obou směrech, může být volná difúze popsána modelem uvedeným v této kapitole. Difúzní procesy budou v tomto případě značně zpomaleny právě vlivem chemické reakce. V těchto situacích lze vyjádřit druhý Fickův zákon (časovou změnu koncentrace sledované látky při jednodimenzionální difúzi vztahem (rovnice 29)

38

TEORETICKÁ ČÁST

Fakulta chemická, VUT v Brně +>

=8

+<

+? >

+ Eu ,

+- ?

(29)

kde symbol rɺ vyjadřuje rychlost chemické reakce, kterou lze vyjádřit rovnicí 30 Eu = −

e>? e<

= −vB# ,

(30)

kde K značí rovnovážnou konstantu chemické reakce. Difundující látka se v tomto případě může vyskytovat ve dvou formách 1) solut, který může volně difundovat a 2) solut, který reagoval s nehybným prostředím. V případě, že chemická reakce je reverzibilní a rychlostní konstanta je větší, než v případě difúzních procesů, platí rovnice 31 B = vB#,

(31)

kde výraz c2 symbolizuje koncentraci solutu, který již podstoupil chemickou reakci, c1 značí koncentraci nezreagovaného solutu, který může podléhat nerušené volné difúzi. Rovnice 31 poté tedy přechází do následujícího vztahu (rovnice 32) +>

+<

W +? >

= wL# +- ? .

(32)

Při porovnání rovnice 32 s 2. Fickovým zákonem lze získat rovnici 33 vyjadřující efektivní difúzní koeficient 8xyy w =

W

wL#

,

(33)

kde symbol 8xyy w vyjadřuje již zmíněný efektivní difúzní koeficient zahrnující vliv chemické reakce. V podstatě se jedná o difúzní koeficient, v němž je zahrnut právě vliv chemické reakce. Použité matematické modely pro popis difúzních procesů zůstávají totožné. Mění se pouze velikost difúzního koeficientu. Difúzní procesy v porézním médiu V případě, že difúzní procesy probíhají v porézním prostředí, jehož pevná fáze je nepropustná a póry tohoto média jsou naplněny kapalinou, ve které lze realizovat difúzi, poté tato difúze probíhá pouze v pórech (vzhledem k tomu, že difúze do pevné části je zanedbatelná vzhledem k difúzi v kapalině) a to po trajektorii, která není lineární. Trajektorie difundujícího solu je nějakým způsobem deformovaná – zakřivená, proto tyto difúzní procesy probíhající v porézním médiu jsou ovlivněny tortuozitou a porozitou. Tyto efekty lze zohlednit v tzv. efektivním difúzním koeficientu zahrnující vliv porézního prostředí (rovnice 18) nebo také rovnicí 34 W

8xyy ∅ = ∅ { ,

(34)

kde D je difúzní koeficient v homogenním prostředí, ∅ představuje volný objem prostředí, ve kterém lze realizovat difúzní procesy a | je jakási křivolakost prostředí (tortuozita). Hodnota | vyjadřuje prodloužení dráhy difundujícího solu ve srovnání s dráhou lineární.

2.11

Difúzní koeficient

Jak již bylo zmíněno výše, difúzní koeficient je jakási materiálová konstanta úměrnosti vyskytující se v difúzních zákonech, který je přímo úměrný difúznímu toku. Difúzní koeficienty v plynech se pohybují okolo 0,1 cm2·s-1, zatímco v kapalinách dosahují hodnot

39

TEORETICKÁ ČÁST


10−5 cm2·s-1. V pevných látkách je hodnota difúzního koeficientu značně závislá na teplotě, pohybuje se okolo 10−10 cm2·s-1. Difúzní koeficienty v polymerech nabývají hodnot mezi difúzními koeficienty v kapalinách a v pevných látkách (~ 10-8 cm2·s-1). Nejběžnější rovnicí pro stanovení difúzního koeficientu je Stokesův-Einsteinův zákon (rovnice 35) 8=

}~ 1 •

=

}~ 1

€•,‚

,

(35)

kde f představuje frikční koeficient, kB je Boltzmannovou konstantou, ƒ symbolizuje viskozitu systému a R $ značí poloměr difundující látky a T představuje termodynamickou teplotou. Nutno říci, že Stokesův-Einsteinův vztah (rovnice 35) je použitelný pouze pro částice kulovitého tvaru. 2.11.1

Metody stanovení difúzního koeficientu

V minulosti bylo měření absolutních hodnot difúzních koeficientů pokládáno za velmi složité. S postupem času a především s rozvojem analytických metod se stalo měření difúzních koeficientů poměrně rutinní záležitosti. Difúzní koeficienty mohou být poměrně jednoduše stanoveny s maximálně 5-10 % chybou. Existuje několik metod, pomocí nichž lze stanovit difúzní koeficient, stručný přehled o metodách lze nalézt v jedné z kapitol knihy [98]. Nejvyužívanější metody pro stanovení difúzního koeficientu jsou uvedeny v knize [99], jedná se o metody diafragmové cely, nekonečného páru a Taylorovy disperze [100]. Některé další metody stanovení difúzního koeficientu, i když poměrně dražší, jsou nukleární magnetická rezonance [101], dynamický rozptyl světla [102], [103] či Gouyeho interferometr [104]. Odborný článek [105] poměrně výstižně shrnuje principy a omezení nukleární magnetické rezonance coby metody pro stanovení difúzního koeficientu. Celkový přehled difúzních technik použitelných pro stanovení difúzního koeficientu nabízí reference [106]. Difúzní cela Stokesova diafragmová cela je pravděpodobně jedním z nejlepších nástrojů pro stanovení difúzních koeficientů v plynech či kapalinách při difúzi realizované skrz membránu. Jedná se o poměrně levnou metodu, pomocí které lze stavovat difúzní koeficient s relativně malou chybou (relativní chybu lze snížit až na 0,2 %). Uspořádání difúzní cely může být horizontální či vertikální. V obou případech se difúzní cela skládá z dvou komor, které jsou odděleny skleněnou fritou nebo porézní přepážkou ve formě membrány. Jedna z kompartment difúzní cely je naplněna difundující látkou o vyšší koncentraci, druhá část difúzní cely je naplněna buď vodou případně difundující látkou s nižší koncentrací (základem difúzních procesů je koncentrační gradient). Jedním z hlavních nedostatků stanovení difúzního koeficientu pomocí metody difúzních cel je velká spotřeba difúzního média. Další výhodou difúzních procesů realizovaných formou difúzních cel je použití UV-VIS spektrofotometrie coby analytické metody pro detekci změny koncentrace solutu a zjištění časové závislosti vývoje koncentrace zvolené difúzní sondy. Další analytickou metodou,

40

TEORETICKÁ ČÁST


která může být použita pro stanovení změny koncentrace v přijímací části difúzní cely, je například konduktometrie (difúze chloridu draselného coby standardu – kalibrace difúzní cely). Difúzní koeficient stanovený metodou difúzní cely lze poté vypočítat podle rovnice 36 8=

#

„<

M† ,‡ˆ‰Š‹ŠŒá > ,Žř•‹í’“”í O •

ln …M†

,‡ˆ‰Š‹ŠŒá

> ,Žř•‹í’“”í O

–,

(36)

kde symbol D představuje difúzní koeficient (v případě difúzních procesů realizovaných skrz porézní média s přesně definovanou tloušťkou musí být definován efektivní difúzní koeficient zahrnující porozitu a tortuozitu). Výraz t symbolizuje čas experimentu, v čitateli výrazu za přirozeným logaritmem je rozdíl koncentrací v obou částech difúzní cely na počátku experimentu čili v čase 0, zatímco ve jmenovateli tohoto výrazu je rozdíl koncentrací ve zvoleném čase t. β je tzv. konstanta difúzní cely, kterou lze vypočítat pomocí rovnice 37 @

β = ln ˜ V

#

!Žř•‹í’“”í

+

#

!‡ˆ‰Š‹ŠŒá

™,

(37)

A je plocha, skrz kterou je difúze realizována, l je efektivní tloušťka membrány, popřípadě pevného vzorku (např. hydrogel) a V je objem difúzní cely v obou difúzních komorách (horní a dolní). Konstanta β musí být stanovena experimentálně použitím nějakého difúzního materiálu, jehož difuzivita je v roztocích dobře známa. V případě difúzních procesů realizovaných v kapalinách se jako referenční látka používá 0,1 mol·dm−3 roztok chloridu draselného. Tímto roztokem je naplněna jedna komora difúzní cely, zatímco druhá je naplněna destilovanou vodou. Vzhledem ke koncentračnímu gradientu na obou stranách membrány začne probíhat difúzní proces. Výše zmíněná metoda difúzní cely je poměrně hojně využívána pro studium difúzních procesů v hydrogelech. Skupina autorů kolem Falka [107] studovala difúzi paracetamolu v nanoporézních chitosanových hydrogelech v závislosti na pórovité struktuře připravených hydrogelů a změně koncentrace chitosanu v těchto materiálech. Výhodou stanovení difúzních koeficientů pomocí difúzní cely je fakt, že celé experimenty mohou být poměrně jednoduše temperovány průtokovým termostatem. Další prací autorů Ibrahim a Kasting [108], kde byla využita difúzní cela pro studium difúzních procesů parathionu skrz lidskou kůži je práce autorů Ibrahima a Kastinga. Skupina autorů kolem Lakatos [109] a [110] využívala ve svých publikacích právě výše zmiňovanou metodu difúzní cely pro stanovení bariérových schopností membrán. Jako difúzní média byly použity roztoky iontů chromu proti destilované vodě.

41

TEORETICKÁ ČÁST


Obr. 21: Schématické znázornění difúzní cely v horizontálním uspořádání.

Nekonečný pár Následující metoda stanovení difúzního koeficientu je omezena pouze na pevné případně polotuhé látky. Experimentální uspořádání je složeno ze dvou pevných vzorků, které se liší svým koncentrací. Na začátku experimentu jsou oba vzorky spojeny (mohou být odděleny nějakou porézní přepážkou, která je v čase t = 0 odstraněna) a poté ve zvolených časových intervalech jsou měřeny koncentrační změny ve zdrojové respektive přijímací části vzorku v závislosti na poloze. Tímto způsobem lze stanovit koncentrační profil difundující látky, z jehož tvaru lze numericky spočítat celkové množství transportované látky skrz rozhraní, na základě něhož lze poté stanovit hodnotu difúzního koeficientu podle rovnice 38. >

ššš >

> i ššš >

= erf *

H

√dW<

.,

(38)

kde výraz B# představuje koncentraci v přijímací části, B›# symbolizuje konečnou koncentraci na rozhraní, kterou lze spočítat jako aritmetický průměr B# a B#t B#t + B# / 2, výraz erf značí chybovou funkci, z symbolizuje polohu, D a t znamená difúzní koeficient respektive čas.

Obr. 22: Nekonečný pár. Dva pevné vzorky o různých koncentracích spojené dohromady (v čase t = 0 – nahoře a v čase t = t1 – dole).

42

TEORETICKÁ ČÁST


Metoda konstantního zdroje Metoda konstantního zdroje [111] je založena na kontaktu látky, ve které lze realizovat difúzní procesy s difúzním médiem o neměnné (konstantní) koncentraci. Tento základní předpoklad lze v reálných experimentech realizovat tak, že difúzní procesy jsou prováděny v prostředí nasyceného roztoku difúzního média, případně doplňováním difúzního média v průběhu experimentu nebo v dostatečně velkém objemu, ve kterém je difúze realizována. Jednoduše řečeno, koncentrace difúzního média ve zdrojovém roztoku musí zůstat během celého experimentu konstantní. Řešení druhého Fickova zákona poté bude následující: B# = B$ erfc

-

√dW<

,

(39)

kde B# představuje koncentraci difundujícího média, erfc je chybová funkce, x je poloha, nebo také vzdálenost od rozhraní médium – pevná fáze (hydrogel), D představuje difúzní koeficient a t je doba difúze. Celkové množství prošlé látky (N) lze poté stanovit podle rovnice 40 W<

ž# = 2B# Ÿ l .

(40)

V případě, že koncentrace difundující látky není v hydrogelu nulová, ale má nějakou hodnotu c2 přechází rovnice 39 do tvaru rovnice 41 > >

>? >?

= erf

-

√dW<

43

.

(41)

SOUČASNÝ STAV ŘEŠENÉ PROBLEMATIKY


3


3.1

Fyzikální modely difúze pro polymerní roztoky a gely

Modely difúzních procesů realizovaných v polymerních roztocích a gelech jsou založeny na různých fyzikálně-chemických konceptech, jako jsou obstrukční efekty, teorie volného objemu či hydrodynamické interakce. Následující kapitoly shrnují základní poznatky týkající se difúzních modelů založených na zmíněných principech. 3.1.1

Překážkové modely (obstrukční efekty)

Překážkový model uvažuje polymerní řetězce jako nehybné vůči difundujícímu médiu. Tento model je založen na předpokladu, že difúzní koeficient polymeru je mnohem menší ve srovnání s difúzním koeficientem zvoleného difúzního média. Polymery jsou v tomto případě prezentovány jako pevně ukotvené a neprostupné segmenty rozptýlené v roztoku. Přítomnost nehybných polymerních řetězců vede k nárůstu trajektorie difundujícího média mezi dvěma body sytému. Maxwell-Frickův model Tento model byl poprvé prezentován Frickem v roce 1924, který měřil elektrickou vodivost dispergovaných částic kulovitého tvaru v krevním séru. Výpočet difúzního koeficientu pomocí Maxwell-Frickova modelu vystihuje rovnice 42 [112]. W #

W

=

#

#L

¡

¡ /¢

,

(42)

kde D představuje samotný difúzní koeficient, D0 reprezentuje difúzní koeficient v čistém rozpouštědle bez přídavku polymeru, £ je objemová frakce polymeru, £ ¤ je objemová frakce polymeru + nedifundující rozpouštědlo, které je navázáno na řetězec polymeru (solvatace). ¥ symbolizuje faktor závisející na tvaru molekul rozpouštědla. Hodnota tohoto faktoru je v rozmezí 1,5 (tyčovité částice) – 2,0 (kulovité částice). Thomas a kol. [113] studovali difúzi vybraných difúzních médií (malé molekuly jako například chloridový či jodidový anion, sodný kation v agarózových gelech v rozmezí 0,67 – 4 hm. % radioaktivním značením. V případě, že byla koncentrace elektrolytu do 0,1 mol/dm−3 platila lineární závislost difúzního koeficientu na koncentraci agarózy v hydrogelu. Svou prací také potvrdily platnost Maxwell-Frickova modelu včetně solvatace molekul agarózy rozpouštědlem. Obecně lze říci, že Maxwell-Frickův model je vhodný pro malé difundující molekuly ve zředěných roztocích polymerů. Výhodou také je, že zahrnuje orientaci a tvar molekul rozpouštědla. Naopak nevhodný tento model je pro koncentrovanější roztoky polymerů a velké difunudjící molekuly. Mackie-Mearesův model Dalším modelem, který bere v potaz obstrukční efekty je model Mackie-Mearesův [114]. Tento model vychází ze stejných předpokladů jako model předešlý čili bere v úvahu, že mobilita polymeru je mnohem méně důležitá ve srovnání s mobilitou iontů či rozpouštědla, z čehož vyplývá, že místa okupovaná polymerem jsou permanentně nedostupná iontům či

44



rozpouštědlu. V tomto modelu je poprvé zmiňován pojem tortuozita čili jakési prodloužení dráhy difundujících molekul ve srovnání s nerušenou difúzí bez přítomnosti překážky ve formě polymeru. Difúzní koeficient malých molekul (např. iontů) je poté závislý na objemovém zlomku monomerního segmentu a je dán rovnicí 43 W

W

=X

#

#L

\ .

(43)

Tento model poskytuje uspokojivé výsledky přes širokou řadu koncentrací celulózy, což bylo hlavní náplní práce Browna a kol. [115], kteří studovali difuzivitu vybraných difúzních médií s rostoucí molekulovou hmotností (voda, alkoholy, etylen glykol, PEG, oligosacharidy či dokonce polysacharidy) v dextranových hydrogelech. Ve většině z těchto případů (především pro difúzní média s menší velikostí částic) naměřená data poměrně dobře korelovaly s modelem Mackie a Mearese, zatímco pro oligomery a polysacharidy nebyla shoda experimentální dat s teoretickými dostatečně průkazná. Autoři předpokládali interakci těchto látek s polymerními řetězci. Hlavní přednost předloženého modelu tkví především v tom, že ho lze aplikovat pro široký rozsah koncentrací difundujícího média. Tento model je ovšem nepoužitelný pro roztoky polymerů, vzhledem k tomu, že nezahrnuje tvar a orientaci molekul na rozdíl od dalšího modelu podle Wanga, podle kterého lze difúzní koeficient spočítat podle rovnice 44 W

W

= 1 − £§,

(44)

kde symbol D opět představuje difúzní koeficient v přítomnosti polymeru, D0 je difúzní koeficient dané látky v čistém rozpouštědle bez přítomnosti překážky, £ je objemový zlomek polymeru a koeficient α je parametr závisející na geometrii difundující látky [115]. Ogstonův model Ogston a kol. [116] vyvinuli nový difúzní model pro difúzi větších molekul. Autoři tohoto modelu považují polymery jako „zformovanou bariéru“ tvořenou náhodným seskupením dlouhých molekulárních vláken. Difundující molekuly tak nenarušují polymerní síť. Nevýhoda tohoto modelu ovšem spočívá v tom, že uvedený model není zcela univerzální pro různé typy polymerů (dextran, agaróza, hyaluronan). Autoři tohoto modelu vysvětlují tuto neuniverzálnost odlišnou morfologií polymerů (rigidita, tloušťka polymerního řetězce apod.). Výhody tedy spočívají především v tom, že lze použít pro některé roztoky polymerů (zředěné), v nichž difundují velké molekuly a taktéž je vhodný pro gely. Difúzní koeficient lze spočítat podle rovnice 45 W

W

= exp X−

‚ª L«¬ «¬

£ $,- \,

(45)

výraz RH udává hydrodynamický poloměr difundující látky, E! značí efektivní poloměr řetězce polymeru a £ je opět objemový zlomek polymeru. Difúzní koeficient je tedy dle rovnice 45 závislý především na velikosti překážky (polymer) a velikosti difundující látky.

45


3.1.2


Teorie nedeformovatelných kulovitých částic

Difúzní modely vycházející z teorie nedeformovatelných kulovitých částic jsou založeny na třech základních předpokladech: a) přepážka ve formě polymeru způsobuje zpomalení difuzivity rozpuštěné látky, b) hydrodynamické interakce polymeru s rozpouštěnou látkou nejsou brány v potaz, c) struktura polymerní sítě (přepážky) je rozložena na soubor válcovitých článků a příspěvek každého tohoto článku k finální hodnotě difúzního koeficientu je dán jako distribuce mezer v polymerní síti. Výpočet hodnoty difúzního koeficientu je založen na sumě všech lokálních toků v mikroskopických subsystémech. Difúzní tok je v tomto případě závislý pouze na velikosti difundující látky, množství polymeru (koncentrace) a vlastnostech daného polymeru (délka řetězce, rigidita apod.). Difúzní koeficient lze poté spočítat kombinací rovnic 46 a 47 W

W

=h

®

+ ¯ h ® °# 2¯ ,

¯=£

‚ª L

?

?

,

(46) (47)

kde koeficient ¯ představuje parametr související s fyzikálními vlastnostmi polymeru a difundující látky, & značí koeficient související s délkou polymeru, RH je hydrodynamický poloměr difundující látky a konečně E1 symbolizuje exponenciální integrál, který lze spočítat pomocí rovnice 48 t ± ²³

°# 2 = m-

´

dµ.

(48)

Aplikace tohoto modelu poskytuje poměrně dobré výsledky pro difúzi albuminu (M = 69 000 Da) [117] v solech a gelech kyseliny hyaluronové a dextranu. Přehled výhod a nevýhod difúzních modelů založených na teorii nedeformovatelných kulovitých částic nabízejí reference [118] a [119]. Tento model je ovšem nevhodný pro difúzní procesy látek s narůstajícím poloměrem řetězců látek. Závěrem bylo, že rovnici 49 nelze použít pro popis Brownova pohybu kulovitých částic tehdy, když mají poloměr větší než 20 Å. Všechny zmíněné difúzní modely založené na obstrukčních faktorech mohou být použity pro malé molekuly ve zředěných či polozředěných roztocích. Omezení nastává tehdy, když difundují molekuly větších rozměrů a v případě, že difúze probíhá v koncentrovaných roztocích polymerů. 3.1.3

Hydrodynamické teorie

Hydrodynamické teorie difúzních modelů berou, na rozdíl od překážkových modelů, v úvahu interakce probíhající v celém systému. Typy interakcí mohou být následující: a) difundující látka – polymer, b) difundující látka – rozpouštědlo, c) rozpouštědlo – polymer. Tyto úvahy dovolují popsat difúzní procesy v koncentrovanějších systémech, tehdy kdy se polymerní řetězce začínají překrývat.

46



Cukierův model Tento model byl poprvé publikován Cukierem [120] v roce 1984. V této teorie jsou brány v úvahu polozředěné roztoky polymeru, které jsou považovány za statické jednotky, které se navzájem překrývají, ale tyto řetězce spolu vzájemně neinteragují.

Obr. 23: Zředěný roztok polymeru (vlevo), středně koncentrovaný roztok polymeru (uprostřed) a koncentrovaný roztok polymeru (vpravo).

Zředěný roztok polymeru (vlevo) je považován za nehomogenní systém, jelikož obsahuje jak domény čistého rozpouštědla, tak také řetězce polymeru. V případě polozředěného roztoku polymeru jsou řetězce polymeru ve vzájemném kontaktu (může docházet k interakcím), ovšem stále ještě nedochází k překryvu jednotlivých polymerních řetězců jako v případě koncentrovaného roztoku polymeru (vpravo). Difúzní koeficient podle Cukierova modelu lze vypočítat podle rovnice 49 W

= 1 − ¶R · .

W

(49)

¸· značí hydrodynamický poloměr difundující látky, ¶ je koeficient vystihující hydrodynamické interakce mezi polymerem a difundující látkou v polozředěném roztoku polymeru. Pro tyčinkovité polymery může být koeficient ¶ spočítán pomocí rovnice 50 ¶¹ =

fº Hº »

,

(50)

kde b¹ je frikční koeficient pro jednu tyčinku, T¹ je poměrné zastoupení tyčinkovitých molekul polymeru vůči kulovitým molekulám a ¼ je viskozita systému. Frikční koeficient je závislý především na délce a poloměru tyčinkových polymerů. Pro kulovité polymery (klubka) je koeficient hydrodynamických interakcí popsán rovnicí 51 ¶W =

f½ H¾∗ »

= 6πTC∗ E,

(51)

kde bW je tentokrát frikční koeficient pro jednu kuličku, TC∗ je hustota zastoupení polymerních jednotek kulovitého charakteru vůči molekulám tvaru tyčinek a r je poloměr monomerní jednotky. Altenbergův model Altenberg ve své publikaci [121] popsal polymery jako imobilizované body náhodně rozmístěné v roztoku. Rozpouštědlo považoval za nestlačitelnou newtonovskou kapalinu,

47



kterou jsou naplněny mezery mezi těmito izolovanými body. Malá difundující molekula je poté schopna interagovat s těmito náhodnými body a vytvářet tak prostorovou síť. Hydrodynamické interakce jsou poté výsledkem tření mezi difundující látkou a stacionárními body polymeru. Mobilita difundující látky bude poté značně závislá na koncentraci polymeru, při nízkých koncentracích (zředěné a středně koncentrované roztoky polymerů) budou mít interakce menší vliv a difúzní koeficient poté lze spočítat podle rovnice 52 W

W

= exp −ÂB $,- ,

(52)

Kde ζ představuje parametr závisející na poloměru difundující látky, c reprezentuje koncentraci polymeru. Tento model je omezen pouze na malé molekuly, difuzivitu velkých molekul typu PEG v roztoku PVA tímto modelem dle článku [122] nelze stanovit. Philliesův model Tento difúzní model bere v potaz difúzi makromolekulárních látek (polymery a proteiny) v širokém rozsahu koncentrací. Podle Philliesových výpočtu v publikaci [123] lze difúzní koeficient pro makromolekulární látky spočítat podle rovnice 53 W

W

= exp −ÂB Ã ,

(53)

ζ a ν jsou parametry závisející na molekulové hmotnosti difundující látky a poloměru difundující látky. Obecně platí, že pro difundující látky s menším hydrodynamickým poloměrem je ζ rovna právě hydrodynamickému poloměru, zatímco pro makromolekulární látky je ζ ~ Μ0,9±0,1. Koeficient ν je pro nízkomolekulární látky roven 1 a pro vysokomolekulární látky roven 0,5. Na rozdíl od modelu dle Altenberga či Cukiera jsou zde polymerní řetězce brány jako mobilní útvary, které jsou schopny rotovat. Rovnice 53 dle Philliese je založena na třech základních presumpcích: nárůst koncentrace polymeru z c na c + dc zvyšuje frikční koeficient z hodnoty f na hodnotu f + df, což výrazným způsobem ovlivní hodnotu difúzního koeficientu, jelikož ten je závislý nepřímo úměrně na frikčním koeficientu dle Einsteinova vztahu (rovnice 54) 8=

}~ 1 •

.

(54)

Druhým předpokladem jsou hydrodynamické interakce mezi polymerními řetězci (nevznikají propleteniny, ale dochází pouze k hydrodynamickým interakcím) a třetím vlivem ovlivňující difúzní procesy dle Philliese je závislost natažení řetězce na koncentraci polymeru. Dle publikace [124] se jedná o univerzální rovnici, pomocí které lze řešit složité difúzní případy zahrnující hydrodynamické interakce a vliv molekulové hmotnosti difundující látky přes širokou škálu koncentrací. Genessův model Tento difúzní model bere v úvahu tepelný pohyb velmi dlouhých lineárních řetězců (zapletených makromolekul) v koncentrovaných roztocích polymerů. Poprvé byl představen Gennesem [125] který ve své práci popisoval pohyb polymerního řetězce o molekulové hmotnosti M uvnitř třídimenzionální sítě polymeru (gel). Brownův pohyb

48



pro vysokomolekulární polymery byl odhadnut podle rovnice 55 jako závislost difúzního koeficientu na molekulové hmotnosti 8~Å

.

(55)

Naopak difúze vysokomolekulárního polymeru v nezapleteném systému nebo ve zředěných roztocích polymerů je popsán rovnicí 56 8~Å

#

.

(56)

Na závěr lze říci, že modely podle Cukiera a Altenberga jsou schopny popsat difúzní procesy malých molekul v polozředěných roztocích polymerů. Polymerní řetězce jsou v tomto případě brány jako nehybné. Těmito modely naopak nelze popsat difúzi v koncentrovaných roztocích polymerů. První modelem, který popisoval difúzi markosloučenin v materiálech gelového charakteru byl model dle Gennese. 3.1.4

Teorie volného objemu

Jako volný objem je definován objem, který není okupován hmotou. Může být také definován jako rozdíl objemů, který zaujímá hmota při určité teplotě a objemu, který zaujímá stejný systém při teplotě 0 K. Při 293,15 K, bude tedy volný objem definován podle rovnice 57. Vzhledem k tepelnému pohybu se molekuly rozpouštědla neustále pohybují (redistribuce) a z toho důvodu tedy bude vyloučený objem větší než nula, jelikož pohybující se molekuly zaujímají větší objem než molekuly při teplotě rovné absolutní nule ∆% = % ÆÇ,#- È − %$ È .

(57)

Difúzní modely na základě teorie volného objemu se liší od ostatních modelů v tom, že nepovažují difúzi za termálně aktivovaný proces. Místo toho je dle této teorie difúze výsledkem náhodné redistribuce částic ve volném objemu polymerní matrice. Model podle Vrentas a Duda Největší pokrok ve vývoji teorie volného objemu nastal tehdy, když Vrentas a Duda publikovali svou práci [126], kde testovali teorii volného objemu v závislosti na měnících se podmínkách difúzních procesů, jako například teplota (aktivační energie difúze), široký rozsah koncentrace polymeru, velikost difundující látky, molekulová hmotnost polymeru apod. Bylo ověřeno, že nárůst volného objemu je dán jak rozpuštěnou látkou, tak také polymerem coby přepážkou a v neposlední řadě také samotným rozpouštědlem. V případě, že existuje ternární systém (difúze rozpuštěné látky v polymerní síti) lze definovat rovnici 58 pro výpočet difúzního koeficientu následovně: W

W

É

= exp X− ‚1¾ \ exp Ê− Í

Ì∗ LË? f! Ì∗ Ë ! ?

Î MÍ? ²ÏÐ RÏO Í ? Î? MÍ?? ²ÏÐ? RÏO L Ñ Ñ?

Ò,

(58)

kde 8$ symbolizuje difúzní koeficient solventu při absenci polymeru, E je aktivační ∗ Ì energie difúzního procesu, ÓÔ je hmotnostní frakce komponenty i, % # je specifický objem potřebný pro přesun 1 molekuly i-té komponenty, b značí poměr objemu difundujícího rozpouštědla ku objemu difundujícího polymeru, ¯Ô je překryvový faktor volného objemu pro čistou komponentu i, ÕÖÔ je teplota skelného přechodu komponenty i, v## a v # jsou 49



parametry volného objemu difundující látky a konečně v# a v jsou parametry volného objemu pro polymer. Tyto parametry jsou definovány v publikaci [96]. Rovnice 58 může být v některých případech zjednodušena, například tehdy, když jsou koncentrace polymeru velmi malé (viz. rovnice 59) W

log * . = W

3.2

f!? Ë?

,Ç$Çw Mw?

1Ð L1O/®

.

(59)

Difúzní procesy s ohledem na gelový charakter vzorku

Rychlost difúzních procesů je značně závislá na tom, v jakém prostředí je difúze realizována. Velké oblibě se těší realizace difúzních procesů v hydrogelových médiích. Difúze v hydrogelech má několik výhod: difúze je nerušená – transport látek skrz hydrogelová média není rušen konvekcí. Další obrovskou výhodou hydrogelových nosičů je fakt, že lze připravit materiály přesně definovaných rozměrů a tvarů, což významným způsobem napomáhá k jednoduššímu matematickému popisu samotných difúzí. Skupina čínských autorů v čele s Liang se ve své publikaci [127] zabývali studiem transportu proteinů v agarózových gelech. Jejich hlavním cílem bylo navrhnout a následně optimalizovat systém pro cílené a kontrolované uvolňování léčiv na bázi proteinů (hovězí sérový albumin – BSA a lysozomy). Experimenty realizovaly při teplotě 37 °C, což odpovídá teplotě lidského těla. Analytickou metodou pro stanovení změny koncentrace proteinů difundujících skrz agarózový gel bylo měření indexu lomu. Hlavními výstupy byly efektivní difúzní koeficienty. Ve své další publikaci [128] tito autoři studovali difúzní model použitelný pro transport polysacharidů skrz stejné prostředí. Dospěli k názoru, že agarózový hydrogel má překážkový charakter a difúzní procesy lze tedy nejlépe popsat pomocí Philiesova či Ogstenova modelu. Difúzní procesy realizované v agarózových gelech byly také hlavní náplní publikace [129]. Golmohamadi a kolektiv studovali difúzi kademnatých iontů a také organických sloučenin iontového charakteru v agarózových gelech pomocí fluorescenční korelační spektrofotometrie a také pomocí difúzních cel. Hlavními parametry, které zkoumaly, byly iontová síla a vliv pH. Jakožto organické látky iontové charakteru použili barvivo typu rhodamin 6G (RH). Dospěli k závěru, že difuzivita nabitých látek je funkcí pH a klesá od zásaditého pH ke kyselému. Obecně lze říci, že metoda difúzní cely je hojně využívána pro studium difúzních procesů v agarózových hydrogelech. Hlavními parametry, které lze pomocí této metody stanovit, jsou především efektivní hodnoty difúzního koeficientu, adsorbovaná/absorbovaná koncentrace difundující látky uvnitř hydrogelu (pouze v případě, že dochází k sorpci) a také čas průchodu prvotní molekuly difundující látky. Difúzní cely byly využity například pro studium huminových kyselin [130], proteinů [131] nebo etanolu [132]. Shackelford a Moore [133] popsali difúzi radionuklidů v porézních médiích. Hlavním přínosem této publikace je především objasnění pojmu porozita a tortuozita. Dle této publikace není cesta difundující látky zcela přímočará, ovšem v určitých fázích při difúzi dochází k zakřivení dráhy difundující látky vlivem překážky v podobě řetězců hydrogelové matrice.

50



Studiem reaktivity huminových kyselin metodou difúzní cel v závislosti na různých parametrech (teplota, iontová síla, pH, charakter difundující látky, modifikace huminových kyselin) se zabývají také publikace [134-136]. Reaktivitu huminových kyselin lze v hydrogelových matricích studovat také pomocí neustálených difúzních procesů. Pozitivní afinita huminových kyselin vůči iontům těžkých kovů je poměrně dobře prozkoumána. Následující publikace [137], [138] se věnují právě této problematice interakce huminových kyselin povětšinou s měďnatými ionty. Studován je vliv iontové síly či modifikace huminových kyselin v koagulovaných huminových hydrogelech. Difúzí léčiv (valinomycin) v agarózových hydrogelech se zabývá publikace [139] britských vědců. Jako analytické metoda pro stanovení difúzních parametrů (efektivní difúzní koeficient, doba průchodu, difúzní konstanta) byla použita konduktometrie. Dle této publikace valinomycin vytváří poměrně velké agregáty, což výrazným způsobem ovlivňuje rychlost difúzních procesů.

3.3

Interakce biokoloidů s opačně nabitými látkami

3.3.1

Chitosanové hydrogely a tenké filmy

Vzhledem k tomu, že chitosan se v roztoku nabíjí kladně, očekává se, že bude docházet k interakcím s anionaktivními látkami. Interakce chitosanu s anionaktivními látkami je poměrně dobře prokázána v několika publikacích. Těchto interakcí se velmi často využívá při tvorbě scaffoldů na bázi chitosanu [140] a [141]. Publikace [142] se zabývá syntézou chitosanových hydrogelů s přídavkem siliky, které mají být následně využity pro odstraňování potravinářských barviv z vodných roztoků. Pro zhodnocení míry interakce mezi chitosanem a anionaktivními potravinářskými barvivy byly použity jednoduché sorpční experimenty a data byla analyzována pomocí Langmuirovy, Freundlichovy respektive Dubinin-Raduskhevichovy izotermy. Autoři v této publikaci také zkoumali vliv pH na sorpční kapacitu takto připravených hydrogelů. Jiná práce [143] brazilských vědců se taktéž zabývá odstraňováním potravinářských barviv z vodných roztoků pomocí adsorpčních procesů na chitosanové filmy. V tomto případě byl studován především vliv teploty v rozmezí 20 – 60 °C. Míra interakce mezi chitosanem a barvivy byla studována pomocí infračervené spektrofotometrie s Fourierovou transformací a také pomocí diferenciální skenovací kalorimetrie. Experimentálně bylo zjištěno, že adsorpční procesy potravinářských barviv se řídí podle Redlich-Petersonovy izotermy. Japonští vědci Harikishore a Seung-Mok se ve své publikaci [144] věnují optimalizaci přípravy magnetických kompozitů na bázi chitosanu a jejich následnému využití k odstraňování těžkých kovů respektive barviv z vodných roztoků. Podle této publikace jsou magnetické chitosanové kompozity inovativním materiálem, který vykazuje poměrně dobré sorpční schopnosti vůči toxickým polutantům ve vodných roztocích. Sorpční kapacita a rychlost těchto procesů byla studována pomocí infračervené spektrofotometrie či termogravimetrie. Jako největší výhodu těchto materiálů uvádí, že je lze použít opakovat na resorpci. Vzhledem k tomu, že desorpci toxických polutantů lze provést velmi jednoduše pomocí magnetického pole. Přehledné review o aplikaci těchto materiálů nabízí reference [145]. Další publikace [146], [147] se věnují stejné problematice se zaměřením především na kinetiku sorpčních procesů.

51



Skupina japonských vědců kolem Yoshida se ve své publikaci [148] věnují mechanismu uvolňování sorbanu draselného z chitosanových filmů s ohledem na cílenou a postupnou distribuci aktivních látek ve vodných roztocích. K posouzení uvolňování využily difúzní procesy, kde hlavním parametrem byl difúzní koeficient. Zkoumali také vliv přítomnosti lipidové dvojvrstvy na rychlost těchto difúzních procesů. Dle této publikace však lipidová dvojvrstva nemá významnější vliv na rychlost uvolňování sorbanu draselného z chitosanových filmů. Další publikace [149] zaměřující se na difúzní procesy v chitosanových hydrogelech pochází od vědecké skupiny kolem García-Aparicio. Zabývali se především difúzí malých molekul jako například kofeinu či kaprolaktamu v chitosanových gelech s rozdílnou koncentrací vody. Použitou metodou pro vyhodnocení byla protonem lokalizovaná nukleární magnetická rezonance. Dle autorů se jedná o nedestruktivní metodu, která je schopna monitorovat koncentrace difundující látky v závislosti na měnícím se čase. Experimentálně získané koncentrační profily byly následně korelovány s teoretickými modely podle Fickových zákonů. Hodnoty difúzních koeficientů se pohybovaly v rozmezí 3,4·10-6 až 6,1·10-6 cm2s-1 v závislosti na koncentraci chitosanu v gelu a typu difundující látky. 3.3.2

Huminové látky

Hlavní náplní předložené dizertační práce bylo studium interakce biokoloidních látek s organickými barvivy. Této problematice se věnuje velké množství odborných publikací. Guy a kolektiv [150] studovali interakci methylenové modři a huminových kyselin. Výsledky jejich studie jsou následující: interakce tohoto barviva s huminovými kyselinami jsou dvojího typu – iontová výměna a fyzikální adsorpce. Tato tvrzení potvrdila také publikace autorů Tan a Chaudhuri [151]. Janoš [152] se ve své publikaci věnoval sorpci organických barviv na humát železitý. Jako organická barviva byly použity běžně dostupné látky, konkrétně methylenová modř, malachitová zeleň nebo rhodamin 6B. Sorpce barviv na humáty byla popsána pomocí vícevrstvé Lagmuirovy izotermy, sorpční kapacita byla stanovena v rozmezí 0,01 – 0,09 mmol/g. Zkoumán byl také vliv pH a přítomnost nízkomolekulární anorganických solí. Bylo zjištěno, že tyto dva zkoumané parametry měly pouze malý efekt na výslednou sorpční kapacitu. Na rozdíl od přítomnosti anionaktivního surfaktantu (SDS), který zvyšoval sorpční kapacitu zcela významně. V rámci studia reaktivity huminových kyselin v této dizertační práci byla studována také interakce s dalším anionaktivním barvivem – rhodamin 6G. Rhodamin jakožto difúzní médium, byl do práce přidán především z toho důvodu, jelikož difúze rhodaminu v hydrogelech je poměrně široce rozšířena [153-155]. V jiných pracích [156] a [157] autoři studovali sorpci kationaktivních a anionaktivních barviv na oxyhumolit (typ oxidačně modifikovaného hnědého uhlí), což je materiál tvořeny až ze 70 hm. % huminovými látkami. Autoři těchto článků označili mezičásticové difúzní procesy jako hlavní mechanismus, který řídí rychlost sorpčního procesu. Fernandes a kolektiv [158] studovali odstraňování methylenové modři z vodných roztoků rašelinou a jinými materiály bohatými na huminové látky. Byl opět sledován i vliv teploty. Rovnováhy bylo dosaženo již po 4,5 hodinách. Teplota ovlivňovala sorpční procesy pouze velmi málo. Sorpce z hlediska termodynamického byla endotermní. 52


3.3.3


Polystyrensulfonát

Kolektiv autorů kolem Salem [159] studoval interakci polystyrensulfonátu sodného s neionogenním surfaktantem Tritonem X-100 pomocí viskozitních měření a měřením vodivosti. Výsledky ukázali, že viskozita takového systému se snižuje se zvyšující se koncentrací polystyrensulfonátu při konstantní koncentraci Tritonu X-100, což potvrzuje, že polystyrensulfonát je schopen interagovat s neionogenními tenzidy. Další publikace autorů Feng, Liu a Song [160] se zabývá studiem interakcí polystyrensulfonátu s micelami, které jsou tvořeny lauryldimethylamin oxid (DDAO). Studován byl především vliv koncentrace DDAO. Jako metody vhodné pro kvantifikaci těchto interakcí byly zvoleny turbidimetrie, dynamický rozptyl světla a elektroforetický rozptyl světla. Experimentálně bylo ověřeno, že interakce jsou zásadně řízeny iontovou silou a že koncentrace DDAO v micelách nemá žádný efekt na výsledné interakce. Interakce mezi imidazolium iontovou kapalinou a anionaktivním polystyrensulfonátem sodným byly studovány v publikaci [161]. Jako analytická metoda byla použita isotermální titrační mikrokalorimetrie (ITC), dynamický rozptyl světla (DLS) a stanovení povrchového napětí. Bylo zjištěno, že formování agregátů polymer/surfaktant a tím tedy míra interakce je dáno především koncentrací surfaktantu (tvorba micel), což bylo ověřeno všemi uvedenými metodami. Vázání surfaktantu (alkylpyridium chlorid) na sodnou sůl polystyrensulfonátu bylo studováno v publikaci [162] autorů Ishiguro a Koopal. Autoři ve své publikaci zmiňují, že interakce kationaktivních tenzidů a anionaktivních polymerů jsou poměrně dobře prostudovány. Vážné mezery ve výzkumu ovšem nacházejí při studiu interakcí polymeru a surfaktantu při velmi nízkých koncentracích nebo naopak extrémně vysokých. Z tohoto důvodu studovali interakce hexadecyl, dodecal a decyl-pyridium chloridu se sodnou solí polystyrensulfonátu. Rovnováhu stanovovali pomocí membránové elektrody selektivní na surfaktanty. Zároveň se věnovali také vlivu iontové síly na míru interakcí mezi výše zmíněnými látkami. Další publikaci [163] autorů Yoshimura a Esumi se zaměřuje opět na studium interakcí kvarterních amoniových solí s polystyrenemsulfonátem sodným. Na rozdíl od výše zmíněných publikací, tito autoři využívají pro studium interakcí fluorescenční měření, které následně potvrzují měřením dynamického rozptylu světla. Hlavním závěrem, kterým vydedukovali je fakt, že interakce mezi oběma zmíněnými látkami je hydrofobního charakteru.

3.4

Zhodnocení současného stavu řešené problematiky

Jak je patrné z předešlých odstavců, publikací věnujících se studiu interakce polystyrensulfonátu či sodné soli polystyrensulfonátu je celé množství, stejně tak jako publikací věnujících se studiu interakcí a reaktivitě huminových látek (kyselin). Předložená dizertační práce se hlavně věnuje studiu interakcí (reaktivity) biolátek a syntetických polymerů, ovšem jako experimentální metoda jsou využity difúzní procesy, což je v tomto ohledu poměrně neprozkoumané téma, vzhledem k tomu, že existuje pouze minimum publikací, které by se věnovaly studiu interakcí polystyrensulfonátu s různými látkami

53



právě s využitím difúzních technik. Další bezespornou výhodou výše uvedených difúzních metod je fakt, že reaktivita biokoloidních látek je studována v hydrogelových médiích, které obsahují majoritní podíl vody a tím pádem jsou poměrně účelně schopny simulovat přirozené podmínky biokoloidních látek v jejich přirozeném prostředí. Například reaktivita či afinita biokoloidních látek (huminových kyselin) vůči barvivům či iontům těžkých kovů je běžně studována pomocí klasických sorpčních procesů. Tyto studie přinášejí velmi cenné informace například o sorpční kapacitě, ale bohužel nejsou schopny podat nám informace o tom, jak k interakcím dochází v dynamickém systému, který je podobný přirozenému prostředí huminových látek. Právě tyto informace nám mohou poskytnout níže zmíněné experimentální techniky.

54

CÍLE DIZERTAČNÍ PRÁCE

4


CÍLE DIZERTAČNÍ PRÁCE

Předložená dizertační práce je zaměřena na studium reaktivity, bariérových a transportních vlastností biokoloidních (huminové kyseliny, kyselina hyaluronová, chitosan, alginát) respektive syntetických polymerních (polystyrensulfonát) látek pomocí difúzních technik. Coby difúzní médium jsou použity iontové sloučeniny ve formě jednoduchých organických barviv (rhodamin 6G, C. I. 45160, methylenová modř, C. I. 52015 a amidočerň 10 B, C. I. 20470), v závislosti na tom, o jaký biokoloid či syntetický polymer (kationaktivní či anionaktivní) se jedná. Výhodou zvolených difúzní sond je snadná detekovatelnost změny koncentrace pomocí UV-VIS spektrofotometrie. Hlavním cílem je vyvinout a následně optimalizovat jednoduché difúzní techniky určené pro studium míry interakcí mezi zvolenou látkou a difúzním médiem. Tyto metody by měly být vhodné také pro studium reaktivity a transportních vlastností vybraných látek při různých experimentálních podmínkách, čili díky optimalizovaným difúzním technikám by mělo být možné zkoumat také vliv základních fyzikálně-chemických parametrů jako je teplota, pH, iontová síla či modifikace materiálu. Navrženy byly dvě difúzní techniky, konkrétně metoda difúzní cely a neustálená difúze v kyvetách, jejichž odlišnosti, výhody a nevýhody jsou diskutovány dále v textu. Obě tyto metody jsou založeny na realizaci penetračních experimentů v hydrogelových matricích na bázi agarózy pouze s nízkým přídavkem aktivní látky. Každá z těchto metod poskytuje relevantní informace o procesu penetrace skrz hydrogelovou přepážku (metoda difúzní cely) respektive o penetraci dovnitř hydrogelového média (neustálená difúze v kyvetách). Hlavními parametry, pomocí nichž bylo usuzováno o míře interakce respektive reaktivitě mezi aktivní látkou a zvolenou difúzní sondou byly v obou případech efektivní či zdánlivý difúzní koeficient, v případě difúzních cel také čas průchodu prvotní molekuly difúzní sondy a koncentrace barviva imobilizovaná v hydrogelové matrici. V případě neustálené difúze v kyvetách zkoumanými parametry byly také koncentrace difúzního média na rozhraní hydrogel – roztok a tortuozní faktor. Na základě těchto parametrů byl vypočítán tzv. rozdělovací koeficient mezi difúzním médiem a hydrogelovou matricí s přídavkem aktivní látky, který charakterizuje afinitu vybraných látek k difundujícím substancím. Dalšími parametry, které byly stanovovány, byly porozita nebo zdánlivá rovnovážná konstanta difúzních procesů. Použité biokoloidní či syntetické látky včetně hydrogelových matric byly charakterizovány základními fyzikálně-chemickými metodami. Odlišnosti v mechanických vlastnostech hydrogelů, které by mohly zapříčinit změnu transportních vlastností, byly ověřovány pomocí oscilačních testů na rotačním reometru (REO). Velikost částic, porozita a specifický povrch huminových kyselin v závislosti na modifikaci byly stanoveny pomocí rastrovací elektronové mikroskopie (scanning electron microscopy – SEM). Acidobazické vlastnosti zkoumaných látek byly posuzovány pomocí automatického titrátoru třemi typy titrací (přímá, zpětná a karboxylová). Huminové kyseliny byly dále charakterizovány také pomocí základních spektrofotometrických metod (FTIR). Tato analýza měla prokázat úspěšnou modifikaci materiálu. U všech látek, jejichž reaktivita byla zkoumána, byla provedena také elementární analýza (EA), rovněž bylo stanoveno množství nespalitelného podílu a vlhkost materiálu pomocí termogravimetrie (TGA). 55

EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST


5


5.1

Příprava biokoloidů a syntetických polymerů

5.1.1

Biokoloidní sloučeniny – huminové kyseliny

Jako modelový biokoloid, jehož reaktivita byla zkoumána pomocí zmíněných difúzních technik, byly zvoleny huminové kyseliny, které byly izolovány z jihomoravského lignitu (důl Mír, Mikulčice) standardizovanou metodou izolace – alkalickou extrakcí [164], [165]. Podrobný postup izolace huminových kyselin byl následující: lignit byl separován podle velikosti částic pomocí síta. Pro izolaci huminových kyselin byly využity pouze částice s velikostí menší než 0,2 mm. Následně byl takto separovaný lignit umístěn do sušárny na dobu 3 dnů při 105 °C, aby byl řádně vysušen a zbaven vzdušené vlhkosti. Samotná extrakce huminových kyselin byla provedena pomocí směsi hydroxidu sodného (NaOH) a polyfosfátu sodného (Na4P2O7). Koncentrace obou látek byla podle procedury zvolena následovně: hydroxid sodný – 0,5 mol·dm-3 a polyfosfát sodný – 0,1 mol·dm-3. Lignit (30 g) v extrakčním činidle (1 000 cm3), které bylo připraveno smícháním hydroxidu sodného a polyfosfátu sodného v poměru 1:1, byl třepán na třepačce po dobu 18 hodin při laboratorní teplotě. Následně byl pevný podíl podroben opětovné extrakci pomocí výše zmíněného extrakčního činidla po dobu 1 hodiny při laboratorní teplotě, zatímco kapalný podíl (obsahující fulvinové a huminové kyseliny) byl okyselen koncentrovanou kyselinou chlorovodíkovou na pH ~ 1. Následně byl také druhý kapalný extrakt okyselen stejnou směsi HCl a H2O na pH ~ 1 a oba okyselené roztoky byly smíchány a ponechány přes noc v lednici. Následující den byly vysrážené huminové kyseliny odděleny od fulvinových kyselin pomocí centrifugace (4 000 RPM, 15 minut, 20 °C). Sediment obsahující huminové kyseliny byl několikrát promyt vodou a následně znovu centrifugován při stejných experimentálních podmínkách do doby, dokud nevykazoval negativní reakci na chloridy (testováno pomocí AgNO3). Po finálním odstředění byly huminové kyseliny umístěny na Petriho misku a sušeny při 50 °C. Takto izolované huminové kyseliny byly poté charakterizovány pomocí níže uvedených metod či modifikovány. Pro účely difúzních experimentů byl připraven zásobní roztok lignitických huminových kyselin (LHK) následujícím způsobem: 0,1 g huminových kyselin bylo rozpuštěno v 50 ml 0,5 mol·dm-3 NaOH. Rozpouštění huminových kyselin probíhalo po dobu 12 hodin při 250 RPM na magnetické míchačce. Po dokonalém rozpuštění LHK bylo upraveno pH roztoku pomocí 1 mol·dm-3 HCl na finální hodnotu pH = 7. Na závěr byl roztok LHK doplněn destilovanou vodou na objem 100 cm3 tak, aby bylo dosaženo požadované koncentrace 1 g·dm-3. Po doplnění požadovaného objemu destilované vody bylo ověřeno pH, které mělo hodnotu 7,0 ± 0,1. Zásobní roztok huminových kyselin byl připravován čerstvý vždy po dvou týdnech používání, vzhledem k tomu, že bylo experimentálně ověřeno (data prozatím nebyla publikovaná v žádném z článků), že právě po této době dochází k degradaci huminových kyselin v roztoku [166], [167] vlivem koagulace a tím pádem se mění jejich základní fyzikálně-chemické vlastnosti, především tedy velikosti částic, což je z hlediska studia reaktivity nežádoucí.

56



V rámci dizertační práce byla zkoumána reaktivita nejen lignitických huminových kyselin, ale také huminového standardu (IHSS HK), který byl získán od International Humic Substances Society (IHSS) ve formě již vyizolovaných huminových kyselin. Vzorek, který byl, použit v této dizertační práci nese označení 1S104H a byl izolovaný z leonarditu (Severní Dakota, USA). Více informací o standardní proceduře, pomocí níž byly tyto huminové kyseliny izolovány lze nalézt na oficiálních stránkách mezinárodní huminové společnosti (IHSS) [168]. Zásobní roztok standardu huminových kyselin byl připravován stejným způsobem jako zásobní roztok LHK. 5.1.2

Modifikace huminových kyselin

Jedním z dílčích cílů předložené dizertační práce bylo prostudovat transportní procesy vybraných látek v huminových systémech bez ovlivnění reaktivity přítomností karboxylových funkčních skupin. Z tohoto důvodu byly veškeré huminové kyseliny (LHK i IHSS HK) modifikovány pomocí selektivní metylace. Tímto způsobem lze vyselektovat vliv některých funkčních skupin ve struktuře huminových kyselin na jejich reaktivitu a naopak ověřit vliv jiných funkčních skupin. V této dizertační práci byly huminové kyseliny modifikovány pomocí trimethylsilyldiazometanu (TMS), který je schopen selektivně obsadit karboxylové funkční skupiny skupinou –CH3 a tím umožní, aby se právě tyto skupiny nepodílely na interakci s iontovými látkami, čímž umožní posuzovat vliv ostatních efektů podílejících se na reaktivitě huminových kyselin jako jsou například vliv – OH skupin, hydrofobicita, aj. Metylace huminových kyselin byla provedena následujícím způsobem: 1 g LHK nebo IHSS HK byl dispergován ve směsi 4 cm3 chloroformu a 2 cm3 metanolu. Do této suspenze byly přidány 4 cm3 TMS o koncentraci 2 mol·dm-3. Metylace huminových kyselin probíhala po dobu 2 hodin při konstantním míchání na vícemístné míchačce a poté byly modifikované huminové kyseliny sušeny po dobu 2 hodin pod dusíkovou atmosférou a následně 12 hodin v sušárně při teplotě 50 °C. Nově připravené metylované vzorky nesly označení MHK v případě metylovaných huminových kyselin připravených z LHK a MIHSS v případě huminových kyselin připravených metylací ze standardů IHSS HK. 5.1.3

Ostatní biokoloidní látky

Jako zástupce anionaktivních biokoloidních látek byly zvoleny: alginát sodný a kyselina hyaluronová. Zástupcem kationaktivních biokoloidů byl vybrán chitosan. Veškeré tyto látky byly získány od komerčních dodavatelů a používány bez další purifikace. Alginát sodný (čistota > 99 hm. %) a chitosan (čistota > 93 hm. %, molekulová hmotnost v rozmezí 110 – 150 kDa) byl získán od společnosti Sigma Aldrich, Inc. Kyselina hyaluronová (molekulová hmotnost 73 kDa) byla získána od společnosti CPN spol. s.r.o . Příprava zásobních roztoků jednotlivých biokoloidních látek probíhala následujícím způsobem: navážka příslušného biokoloidu (0,1 g) byla kvantitativně převedena do 80 cm3 destilované vody a ponechána po dobu 24 hodin na magnetické míchačce při 250 RPM. Po požadované době míchání byl roztok biokoloidu doplněn na finální objem 100 cm3, čímž byla získána potřebná koncentrace 1 g·dm-3. Kvůli nerozpustnosti chitosanu ve vodě,

57



musel být zásobní roztok tohoto kationaktivního biokoloidu připraven následovně: 0,1 g chitosanu bylo dispergováno v 80 cm3 5 hm. % kyselině octové a tato směs byla ponechána na míchačce při 250 RPM po dobu 24 hodin. Po dokonalém rozpuštění chitosanu byl roztok doplněn 5 hm. % kyselinou octovou na finální objem 100 cm3 proto, aby byl opět získán zásobní roztok o koncentraci 1 g·dm-3. 5.1.4

Syntetické polymery

Jako zástupce syntetických polymerů, jejichž reaktivita byla v rámci předložené dizertační práce zkoumána, byl vybrán polystyrensulfonát sodný. Tento polymer odvozený od polystyrenu byl získán od společnosti Sigma Aldrich, Inc. s čistotou > 99 hm. %. Příprava zásobního roztoku, jehož koncentrace taktéž činila 1 g·dm-3, byla realizována stejným způsobem jako v případě alginátu sodného a kyseliny hyaluronové, čili rozpuštěním požadované navážky v příslušeném množství destilované vody.

5.2

Charakterizace zkoumaných látek

5.2.1

Použité přístroje a techniky pro charakterizaci zkoumaných látek

• • • • •

elementární analýza – CHNSO Mikroanalyzátor Flash 112, Thermo Finningan termogravimetrie – TGA Q5000, TA Instruments skenovací elektronová mikroskopie – JEOL JSM-7600F, Jeol infračervená spektrofotometrie s Fourierovou transformací – Nicolet iS50, Thermo Scientific stanovení kyselosti – Titroline Alpha plus Schott, SI Analytics

5.2.2

Elementární analýza

Látky, jejichž reaktivita byla zkoumána, včetně gelačního činidla – agarózy, která byla využita pro přípravu hydrogelových médií, ve kterém byly difúzní experimenty realizovány, byly podrobeny základní charakterizaci v podobě elementární analýzy. Tato charakterizace byla realizována na přístroji Thermo Finnigan FLASH EA 1112 Series CHNS/O Analyzer na Ústavu struktury a mechaniky hornin, Akademie věd České republiky v Praze. Základní charakterizaci zkoumaných materiálů pomocí elementární analýzy se věnuje kap. 6.1.1. 5.2.3

Termogravimetrie

Veškeré vzorky byly taktéž charakterizovány pomocí termogravimetrického měření. Tato základní charakterizace sloužila především ke stanovení nespalitelného podílu (množství popela) a vzdušné vlhkosti ve vzorcích biokoloidů. Všechny experimenty byly realizovány na přístroji TGA Q5000 od společnosti TA Instruments na FCH VUT. Měření byla prováděna v kyslíkové atmosféře v rozsahu teplot od 20 °C do 800 °C s rychlostí ohřevu 10 °C·min-1. Průtok plynu byl nastaven na konstantní hodnotu 20 dm3·min-1. Veškerá měření byla provedena opakovaně, čímž byla zajištěna věrohodnost měření. Zastoupení vlhkosti ve zkoumaných látkách bylo stanovováno při 200 °C.

58


5.2.4


Skenovací elektronová mikroskopie

Vzorky huminových kyselin před metylací a po metylaci byly porovnávány také pomocí skenovací elektronové mikroskopie (SEM). Snímky povrchu huminových kyselin byly pořízeny na zařízení typu JEOL JSM-7600F od společnosti Jeol. Hlavním účelem tohoto měření bylo ověření, zda modifikace huminových kyselin zásadním způsobem ovlivňuje specifický povrch huminových kyselin, což by mělo poměrně významný vliv na zkoumané transportní charakteristiky. Snímky huminových kyselin získané pomocí skenovací elektronové mikroskopie jsou uvedeny v kap. 6.1.3. 5.2.5

Infračervená spektrofotometrie s Fourierovou transformací

Následující charakterizaci byly podrobeny primárně vzorky huminových kyselin (lignitické, metylované lignitické, standardy IHSS a metylované standardy IHSS). Hlavním účelem této charakterizace bylo potvrzení případně vyvrácení pozitivní modifikace zvolených materiálů. Vibrační spektra huminových kyselin byly měřeny metodami zeslabeného úplného odrazu záření (ATR – Attenuated Total Reflectance) a metodou průchodu v tabletě z bromidu draselného (KBr). Pro stanovení vibračních spekter byl použit přístroj Nicolet iS50 od společnosti Thermo Scientific a vzorky pro měření byly připraveny následujícím způsobem: vzorek huminové kyseliny byl sušen při 50 °C po dobu tří dnů, jelikož vzorek před měřením musel být zbaven vzdušné vlhkosti. V případě měření v KBr tabletě byl vysušený vzorek smíchán s bromidem draselným, který byl také předem vysušen, v poměru 1:3 (jeden díl huminových kyselin a tři díly bromidu draselného). Vzorek byl dokonale rozdispergován v KBr a pomocí lisu byla vylisována tableta, kde byly huminové kyseliny homogenně rozptýleny. V prvé řadě u obou metod bylo změřeno pozadí (baseline), což byl vzduch. V případě ATR metody byl vzorek umístěn na ATR krystal, ke krystalu připevněn pomocí nástavce a nechalo se probíhat měření po dobu 256 skenů. Stejné nastavení (pozadí a počet skenů) bylo použito také v případě měření průchodu infračerveného záření skrz vylisovanou tabletu KBr s přídavkem vzorku. Všechna spektra byla měřena v rozsahu 4 000 – 400 cm-1. Infračervená spektra zkoumaných látek jsou uvedena v kap. 6.1.2. 5.2.6

Stanovení kyselosti huminových kyselin

Stanovení kyselosti huminových kyselin bylo prováděno pomocí třech typů titrací na automatickém titrátoru Titroline Alpha plus Schott od společnosti SI Analytics. Opět hlavním cílem, především u huminových kyselin, bylo stanovení odlišností v kyselosti nemodifikovaných a modifikovaných vzorků. V prvé řadě byla stanovena celková kyselost huminových kyselin pomocí zpětné titrace kyselinou chlorovodíkovou a také pomocí přímé titrace hydroxidem sodným [170]. Pro ověření úspěšné metylace huminových kyselin byla použita karboxylátová titrace pomocí acetátové metody [171]. Všechny typy titrací huminových kyselin byly provedeny třikrát. Výsledné hodnoty kyselostí jsou tedy průměrem ze tří hodnot, stejně jako vypočítaná směrodatná odchylka.

59



Zpětná titrace Příprava vzorku pro zpětnou titraci probíhala následujícím způsobem: navážka huminových kyselin (100 mg) byla převedena do 100 cm3 hydroxidu sodného o koncentraci 0,1 mol·dm-3. Pro dokonalé rozpuštění byl vzorek míchán po dobu 24 hodin na magnetické míchačce (250 RPM). Následující den byl vzorek titrován 0,05 mol·dm-3 kyselinou chlorovodíkovou, s intervalem přídavku po 30 s, objem přídavku 0,05 cm3. Titrace byla ukončena tehdy, když finální objem kyseliny chlorovodíkové dosáhl 60 ml. Hlavními výstupy z titračních měření bylo stanovování pH a vodivosti (G) v časovém intervalu 5 s. Titrační křivky včetně vypočítaných titračních parametrů jako je karboxylová kyselost, celková kyselost, apod. jsou uvedeny v kap. 6.1.4. Přímá titrace Příprava vzorku pro přímou titraci probíhala následujícím způsobem: navážka huminových kyselin (100 mg) byla suspendována ve 100 cm3 destilované vody. Vzorek byl opět ponechán na vícemístné míchačce po dobu 24 hodin při 250 RPM. Po dokonalém suspendování byl roztok titrován 0,05 mol·dm-3 hydroxidem sodným s krokem 0,05 cm3 v časovém intervalu po 150 s. Finální objem titračního činidla činil 30 cm3. V průběhu titrace byla automaticky detekována změna vodivosti a pH v časovém intervalu 30 s. Karboxylátová titrace Karboxylátová titrace huminových kyselin byla provedena za účelem stanovení množství karboxylátových skupin (kyselosti), které se podílejí na pozitivní afinitě huminových kyselin vůči polutantům či jiným kladně nabitým sloučeninám. Příprava vzorku pro účely karboxylátové titrace byla provedena následujícím způsobem: navážka huminových kyselin (50 mg) byla kvantitativně převedena do 40 cm3 roztok octanu vápenatého (Ca(CH3COO)2) o koncentraci 0,5 mol·dm-3 a 10 cm3 destilované vody. Pro stanovení přesné karboxylátové kyselosti byl připraven také slepý vzorek bez huminových kyselin. Tento slepý vzorek byl vytvořen smícháním 40 cm3 octanu vápenatého s 10 cm3 destilované vody. Oba tyto vzorky byly umístěny na magnetickou míchačku a byly míchány po dobu 24 hodin při 250 RPM. Po promíchání byly vzorky přefiltrovány přes papírový film, promyty vodou a následně byl objem filtrátu doplněn destilovanou vodou na finální objem 100 cm3. Takto připravený vzorek byl poté titrován hydroxidem sodným o koncentraci 0,1 mol·dm-3 s přídavkem 0,05 cm3 po 30 s. Celkový přídavek titračního činidla činil 10 cm3. V průběhu celého experimentu byla opět detekována změna vodivosti a pH pomocí elektrod.

5.3

Příprava hydrogelových matric

V následujících kapitolách budou shrnuty přípravy hydrogelových materiálů na bázi agarózy s přídavkem případně bez přídavku zvolené látky, jejíž reaktivita byla zkoumána. Zmiňovány budou hydrogely, které byly použity v difúzních celách, stejně tak jako příprava hydrogelů pro nestacionární typ difúzních experimentů v kyvetách. Tyto dynamické metody byly porovnávány také s klasickými sorpčními experimenty, z toho důvodu bude zmíněna také příprava hydrogelů pro sorpci zvolených difúzních médií v podobě jednoduchých organických barviv.

60


5.3.1


Hydrogely – difúzní cela

Jak již bylo zmíněno výše, pro studium reaktivity vybraných látek bylo použito hydrogelové médium na bázi lineárního polysacharidu – agarózy. Hlavním důvodem, proč byla zvolena právě agaróza je fakt, že disponuje termoreverzibilními vlastnostmi a tím pádem příprava gelů s přesně definovanými parametry jako jsou velikost, tvar či pórovitost je poměrně jednoduchá. Tyto parametry je nezbytné znát pro přesný matematický popis difúzních procesů navíc významným způsobem ovlivňují transportní vlastnosti finálních materiálů. Současně také agaróza má charakter neionogenního a chemicky inertního materiálu, tedy alespoň z hlediska pozitivní afinity vůči iontovým sloučeninám, proto nebude specificky interagovat se zvolenými difúzními médii. Z výše uvedených důvodů byla agaróza zvolena jako vhodná matrice pro studium reaktivity biokoloidních a syntetických polymerních látek. Příprava čistých agarózových hydrogelů Příprava agarózových hydrogelů pro difúzní procesy realizované v difúzních celách probíhala následujícím způsobem: požadované množství agarózy (0,1 g) bylo naváženo na analytických vahách a následně převedeno do 10 cm3 destilované vody. Výsledná koncentrace agarózy v gelu tedy byla 1 hm. %. Suspenze agarózy ve vodě byla následně zahřívána až na teplotu 85 °C při kontinuálním míchání skleněnou tyčinkou. Aktuální teplota byla kontrolována pomocí digitálního teploměru. Zahřívání probíhalo do té doby, než nedošlo k úplnému rozpuštění agarózy. Do předehřáté sušárny na 100 °C byla předem umístěna dvě mikroskopická sklíčka společně s teflonovou formou (10 minut). Následně bylo jedno sklíčko upevněno na teflonovou formu pomocí svorek a roztok rozpuštěné agarózy byl ještě za horka nalit do připravené formy (průměr 40 mm, šířka 5 mm, viz. Obr. 25). Poté byl překryt druhým sklíčkem tak, aby výsledný gel neobsahoval žádné vzduchové bubliny a opět upevněno pomocí svorky. Gelace agarózy probíhala po dobu 45 minut při laboratorní teplotě. Při poklesu teploty pod 45 °C dochází k proplétání jednotlivých agarózových řetězců, které jsou následně stabilizovány vodíkovými můstky. Tímto způsobem tedy dojde k vytvoření 3D sítě prostupující celým disperzním prostředím. Schéma procesu gelace termoreverzibilních agarózových hydrogelů je uvedeno na Obr. 24.

~ 45 °C

stárnutí

100 °C

100 °C

Obr. 24: Schéma gelace agarózových hydrogelů (termoreverzibilní proces).

Pro účely studia reaktivity vybraných látek byla jako vhodná koncentrace agarózy v gelu zvoleno 1 hm. %. Pro účely studia vlivu koncentrace samotné agarózy na difúzní

61



charakteristiky barviv byly zvoleny následující koncentrace: 0,5 hm. %, 1,0 hm. %, 2,0 hm. % a 4,0 hm. %.

Obr. 25: Teflonová forma pro přípravu agarózových hydrogelů (vlevo) a 1 hm. % agarózový hydrogel (vpravo).

Příprava agarózových hydrogelů s přídavkem vybrané látky Příprava vzorků s přídavkem vybrané látky probíhala prakticky stejným způsobem jako v případě přípravy čistých agarózových gelů. Jediný rozdíl spočíval v tom, že do destilované vody před přidáním agarózy, bylo přidáno také požadované množství zvolené látky ve formě zásobního roztoku (1 g·dm-3). V případě huminových kyselin, alginátu a polystyrensulfonátu byly jako vhodné koncentrace zvoleny následující: 0,002 hm. %, 0,005 hm. % a 0,010 hm. % (koncentrace byly zvoleny na základě předešlých laboratorních studií). Při interakci kyseliny hyaluronové s vybranými organickými barvivy neměly výše uvedené koncentrace prakticky žádný vliv na změnu vybraných difúzních parametrů. Proto byla v případě kyseliny hyaluronové testována i vyšší koncentrace, konkrétně 0,02 hm. %, 0,05 hm. % a 0,10 hm. %. 5.3.2

Příprava hydrogelových vzorků – neustálená difúze

Veškeré hydrogely, které byly použity pro zdárnou realizaci neustálených difúzních procesů v kyvetách, byly připraveny stejným způsobem gelace termoreverzibilní agarózy jako v případě gelů pro difúzní cely. Po rozpuštění agarózy v horké vodě byl roztok nalit do připravených spektrofotometrických (plastových) kyvet a nad hranou kyvety byla vytvořena „čepička“ z horkého agarózového roztoku. Rozměry plastových kyvet byly 10 × 10 × 45 mm. Gelace opět probíhala po dobu 45 minut při laboratorní teplotě. Po stanovené době bylo pomocí skalpelu vytvořeno ostré rozhraní mezi vzduchem a vzniklým gelem přesně v místě, kde končila kyveta. Tímto způsobem bylo definováno přesné množství hydrogelu v každé kyvetě a především difúzní procesy mohly probíhat rovnoměrně a vždy stejně ve všech gelech. V případě neustálené difúze v kyvetách, což je ve srovnání s difúzní celou časově méně náročné, byl testován také vliv iontové síly (IS) a pH. Z tohoto důvodu byly připraveny také vzorky čisté agarózy respektive agarózy s přídavkem vybrané látky, ve fosfátovém

62



pufru. Pro přípravu fosfátového pufru (PBS) byly využity dihydráty hydrogenfosforečnanu sodného a dihydrogenfosforečnanu sodného. Konkrétně byly difúzní experimenty realizovány v roztocích o třech pH (3,7,11) a dvou iontových silách (0,01 mol·dm-3 a 0,20 mol·dm-3).

Obr. 26: Vzorky 1 hm. % agarózových hydrogelů s různou koncentrací huminových kyselin (LHK) v následujících procentuálních zastoupeních (zleva – 0,000 hm. %, 0,002 hm. %, 0,005 hm. % a 0,010 hm. %, vždy po dvou vzorcích).

5.3.3

Vzorky pro sorpční experimenty

Pro účely studia reaktivity a sorpční kapacity vybraných látek v agarózových gelech byly připraveny vzorky pro klasické sorpční experimenty následujícím způsobem: opět bylo využito termoreverzibility agarózy. Koncentrace zvolených látek byly 0,002 hm. %, 0,005 hm. % a 0,010 hm. % čili stejně jako v případě studia reaktivity pomocí difúzních cel. Agarózové hydrogely s přídavkem dané látky byly připraveny do skleněných trubiček o délce 10 mm a vnitřním průměru taktéž 10 mm. Gelace agarózy probíhala přímo v těchto trubičkách po dobu 45 minut při laboratorní teplotě. Po uplynutí požadované doby bylo pomocí skalpelu vytvořeno ostré rozhraní na obou otevřených stranách trubičky.

5.4

Charakterizace hydrogelů

5.4.1

Použité přístroje a techniky pro charakterizaci hydrogelů

• •

reologie – reometr AR-G2, TA Instruments (FCH VUT) reologie – reometr Physica MCR 501, Anton Paar (JKU, Linec, Rakousko)

5.4.2

Stanovení viskoelastických vlastností

Stanovení mechanických vlastností připravených hydrogelů s přídavkem látek, jejichž reaktivita byla zkoumána, bylo provedeno na reometru typu AR-G2 od společnosti TA Instruments, částečně také na reometru Physica MCR 501 od společnosti Anton Paar, Ltd. v rámci zahraniční stáže na rakouské univerzitě v Linci. Hlavním cílem této charakterizace bylo ověřit, zda přídavkem biokoloidní či syntetické látky má výraznější vliv na finální mechanické vlastnosti gelů. Změna mechanických vlastností gelů by vedla k výraznému

63



ovlivnění transportních vlastností v hydrogelových systémech. Stanovené transportní parametry, pomocí nichž bylo usuzováno o reaktivitě a míře interakce zkoumaných látek, by tedy nebyly dány pouze interakcí difúzních sond s vybranými látkami, ale také právě změnou mechanických vlastností. Mechanické vlastnosti jednotlivých hydrogelů byly zkoumány pomocí dvou oscilačních testů a to konkrétně pomocí amplitudového testu s konstantní frekvencí oscilací a pomocí frekvenčního testu s konstantní amplitudou deformace. První zmíněný test měl za úkol stanovit tzv. lineární viskoelastickou oblast (LVO). Z této oblasti byla poté vybrána hodnota konstantní amplitudy deformace pro druhý test tak, aby nedošlo k nevratnému zdeformování vzorku při stanovení viskoelastických charakteristik pomocí frekvenčního testu. Veškeré oscilační experimenty byly měřeny systémem (geometrií) deska-deska s měřící plochou, jejíž průměr byl 40 mm. Veškerá měření byla prováděna třikrát a výsledné hodnoty viskoelastických charakteristik jsou průměrem z těchto měření. Experimentální nastavení amplitudového testu s konstantní frekvencí oscilací bylo následující: test byl realizován při 25 °C, temperace vzorku probíhala po dobu 5 minut, maximální aplikovaná normálová síla při stlačování vzorku nepřesáhla hodnotu 5 N. Frekvence oscilací byla udržována na hodnotě 1 Hz a měřený rozsah amplitudy deformace byl v rozmezí od 0,1 % do 100 % (měřeno se stoupající tendencí). Druhý test – frekvenční test s konstantní amplitudou deformace – byl také realizován při konstantní teplotě 25 °C. Temperace i normálová síla při stlačování byla stejná jako v případě předešlého testu. Amplituda deformace byla po celou dobu testu konstantní – 0,1 % (hodnota vybrána z LVO byla pro všechny zkoumané hydrogely stejná). Rozsah frekvencí oscilací byl od 0,1 do 20 Hz (měřeno se vzestupnou tendencí). Výstupem z výše uvedených oscilačních testů byly základní viskoelastické charakteristiky jako elastický (paměťový) modul (G'), viskózní (ztrátový) modul (G''), komplexní modul (G*) případně komplexní viskozita (η*) a také ztrátový úhel (δ).

5.5

Difúzní experimenty

5.5.1

Použité přístroje a techniky pro realizaci difúzních experimentů

• • • • •

horizontální difúzní cely – PermeGear průtokový regulátor teploty – ED-5, Julabo vláknový spektrofotometr – USB2000+, Ocean Optics spektrofotometr v ultrafialové a viditelné oblasti – Hitachi U-3300, Hitachi spektrofotometr v ultrafialové a viditelné oblasti – Cary 50 UV-VIS, Varian

5.5.2

Neustálená difúze v kyvetách

Popis přípravy hydrogelových vzorků s/bez přídavku aktivní látky je uveden v kap. 5.3.2. Po vytvoření stabilního agarózového gelu a seříznutí přebytků gelů tak, aby bylo vytvořeno ostré rozhraní, byly kyvety společně s gelem ponořeny do roztoku vhodného barviva. V případě huminových kyselin, alginátu, kyseliny hyaluronové a polystyrensulfonátu čili anionaktivních látek se jednalo o barvivo methylenová modř a rhodamin 6G, coby 64



zástupce kationaktivních barviv. U chitosanu, jakožto představitele kationaktivního biokoloidu, se jednalo o anionaktivní barvivo amidočerň. Kyvety byly ponořeny do skleněné nádoby obsahující 250 cm3 vybraného organického barviva o koncentraci 0,01 g·dm-3. Zásadním předpokladem bylo, aby v průběhu celého experimentu byla zachována konstantní koncentrace barviva ve zdrojovém roztoku (i po nadifundování části barviva do struktury hydrogelu), aby mohl být zachován použitý difúzní model (viz. kap. 2.11.1 – Metoda konstantního zdroje). Následně byla tato nádoba opatřena víkem a utěsněna parafilmem tak, aby nedocházelo k odpařování vody a tím pádem zakoncentrování difúzního média (barviva). Do každé nádoby byly umístěny vždy 4 kyvety (jedna kyveta s referenčním vzorkem – čistý 1 hm. % agarózový gel, dále kyvety s 1 hm. % agarózovým gelem s přídavkem 0,002 hm. %, 0,005 hm. %, respektive 0,010 hm. % (viz. Obr. 27 vlevo)). Nádoby s kyvetami byly umístěny na míchačku a zdrojový roztok barviva byl kontinuálně míchán při 250 RPM, čímž byla zajištěna vždy konstantní koncentrace barviva na rozhraní kyveta-roztok a nemohlo tedy docházet ke vzniku koncentračních gradientů, což by poté neumožňovalo použití zvoleného difúzního modelu z matematického hlediska. Následující den (po 24 hodinách) byla měřena UV-VIS spektra nadifundovaného barviva do struktury gelu v různých vzdálenostech od rozhraní kyveta-roztok. Tímto způsobem byla proměřena celá kyveta a mohl být tedy vytvořen koncentrační profil, čili závislost koncentrace na vzdálenosti od rozhraní. Proměřit UV-VIS spektra v celém rozsahu kyvety bylo umožněno díky zkonstruování speciálního pohyblivého držáku kyvet vytvořený přímo pro tento typ měření. Momentálně je podána přihláška na patentové řízení ochrany průmyslového vlastnictví. Tento speciální držák je přihlášen jako užitný vzor pod názvem zásuvný modul precizního vertikálního posuvu kyvety do spektrofotometru umožňující studium transportu nízkomolekulárních látek. Tento držák je uveden na Obr. 27 (vpravo).

Obr. 27: Kyvety s 1 hm. % agarózovým gelem lišící se koncentrací alginátu ponořenými v barvivu methylenová modř respektive rhodamin (vlevo). Speciální polohovatelné zařízení určené pro měření UV-VIS spekter v různé vzdálenosti od rozhraní kyveta-roztok (vpravo).

UV-VIS spektra v různých vzdálenostech od rozhraní kyveta-roztok byla měřena ve zvolených časových intervalech (24, 48 a 72 hodin) na UV-VIS spektrofotometru Cary 50, Varian. Studium vlivu teploty na reaktivitu, respektive difuzivitu zvolených barviv do

65



agarózových gelů s přídavkem aktivní látky bylo realizováno tak, že celá nádoba s kyvetami byla umístěna do předem vytemperované sušárny (30 °C, 40 °C a 50 °C). UV-VIS spektra byla měřena ve stejných časových intervalech jako v předešlém případě. Vliv pH a iontové síly byl studován obdobným způsobem, s tím rozdílem, že zásobní roztok barviva nebyl připraven v destilované vodě, ale v pufru o požadovaném pH a iontové síle. Stejně tak agarózové hydrogely byly připraveny ve stejném pufru a také pH zásobních roztoků aktivních látek bylo upraveno pomocí kyseliny chlorovodíkové respektive hydroxidu sodného na požadovanou hodnotu. Po naměření UV-VIS spekter byla tato spektra vyhlazena v programu Origin 8 (Obr. 28) a následně byla odečtena základní linie, která odpovídá čistému agarózovému hydrogelu (Obr. 29). Tento krok byl prováděn z toho důvodu, aby byl získán pouze od prodifundovaného barviva do struktury hydrogelu, čímž bylo eliminováno hydrogelové médium – agaróza.

Obr. 28: Příklad naměřených UV-VIS profilů v surové podobě (vlevo) a po vyhlazení (vpravo) v programu Origin 8.

Obr. 29: Ukázka odečtu základní linie agarózy od píku methylenové modři (λmax = 665 nm).

Naměřená absorpční spektra byla převedena na koncentraci pomocí kalibrační závislosti (měřeno na Hitachi U-3300), kdy byly připraveny hydrogely se známou koncentrací barviva a známou koncentrací aktivní látky a bylo změřeno jejich UV-VIS spektrum. Absorbance při vlnové délce odpovídající maximu (λmax) byla vynesena do závislosti na známé koncentraci barviva (viz. Obr. 30). Směrnice této závislosti byla použita jako

66



molární extinkční koeficient (ε). Následně byla absorbance převedena na požadovanou molární koncentraci (c) pomocí Lambert-Beerova zákona A = B ∙ ε ∙ d,

(60)

kde A představuje již zmíněnou absorbanci a d představuje optickou délku (m).

absorbance 665 nm (a.u.)

1,2

y = 119,715x R² = 0,994

1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 0,000

0,002 0,004 0,006 0,008 koncentrace methylenové modři (g·dm-3)

0,010

Obr. 30: Příklad kalibrační závislosti pro 1 hm. % + 0,005 hm. % alginátu sodného.

Experimentálně získané koncentrační profily byly následně korelovány s teoretickým modelem neustálené difúze v kyvetách (viz. 5.5.5). Kritérium posuzující teoretickou a experimentální koncentraci bylo minimalizováno metodou nejmenších čtverců pomocí přídavné funkce Řešitel v MS Excel. Z tohoto porovnání koncentrací a vhodného difúzního modelu lze poté stanovit základní difúzní parametry jako efektivní difúzní koeficient a koncentrace na rozhraní kyveta-roztok a vypočítat další potřebné parametry sloužící k posuzování reaktivity či míry interakce vybraných látek a zvolených difúzních médií.

Obr. 31: Koncentrační profily pro 1 hm. % agarózový gel bez přídavku PSS (vlevo) a 1 hm. % agarózový gel s přídavkem 0,01 hm. % PSS (vpravo).

5.5.3

Difúzní cela

Metoda difúzní cely reprezentuje velmi jednoduchý způsob studia reaktivity vybraných látek v hydrogelových médiích. V prvé řadě bylo nutné provést kalibraci difúzní cely pomocí roztoku látky o známé hodnotě difúzního koeficientu. Jako vhodná látka pro

67



kalibraci difúzní cely byl zvolen chlorid draselný [172]. Difúze 0,1 mol·dm-3 proti destilované vodě byla realizována přes syntetickou membránu Spi-poreTM (polykarbonát) s velikostí pórů 2 µm. Popis kalibrace včetně experimentálního stanovení konstanty β je uveden v publikaci [173]. Konstanta difúzní cely byla experimentálně stanovena na 6·104 m-2. Difúzní experimenty byly realizovány v temperovatelné, horizontální difúzní cele zakoupené od společnosti PermeGear, Inc. Hydrogel, připravený podle postupu v kap. 5.3.1, byl umístěn mezi obě komory difúzní cely a následně zajištěn pomocí držáku difúzních cel. Poté byl k vnějšímu plášti difúzní cely připojen průtokový termostat, který byl nastaven na požadovanou teplotu. Do každé z komor difúzní cely bylo napipetováno 60 cm3 roztoku (do zdrojové bylo napipetováno vybrané barvivo o koncentraci 0,01 g·dm-3 a do přijímací čistá destilovaná voda). Tato soustava byla umístěna na vícemístnou magnetickou míchačku (250 RPM). Do přijímací části difúzní cely (komora s destilovanou vodou) byla umístěna spektrofotometrická sonda spojená optickými vlákny se zdrojem záření (OceanOptics, HL-2000) a také s detektorem (OceanOptics, USB 2000+). Detektor byl dále spojen s počítačem. Komunikace a převod dat byl zajištěn pomocí softwaru Spectra Suite také od společnosti OceanOptics. Zdroj záření byl zapnut alespoň 45 minut před měřením, aby dosáhl maximální možné intenzity záření. Po ponoření sondy do přijímací komory difúzní cely byla nastavena základní linie (destilovaná voda) a odečten šum detektoru (vše automaticky pomocí softwaru). UV-VIS spektra měřená kontinuálně byla ukládána automaticky ve zvolených časových intervalech (30 minut) v rozsahu 300 – 900 nm. Ze změny absorbance v závislosti na čase poté byla vypočítána koncentrace pomocí kalibrační závislosti a z této koncentrační závislosti poté mohly být spočítány fundamentální difúzní parametry. Pomocí experimentů realizovaných v horizontálních difúzních celách byl zkoumán vliv koncentrace (huminové kyseliny, alginát, polystyrensulfonát a kyselina hyaluronová), vliv teploty (huminové kyseliny), vliv modifikace zvolených materiálů (huminové kyseliny) a také vliv zvolené difúzní sondy (methylenová modř a rhodamin). Příprava vzorků, koncentrace zvolených látek i gelovacího činidla jsou totožné jako v případě neustálené difúze v kyvetách (viz. kap. 5.5.2).

Obr. 32: Difúzní cela při penetraci methylenové modři přes 1 hm. % agarózový hydrogel s 0,01 hm. % IHSS HK.

68


5.5.4


Difúzní cela – matematický model

Změna koncentrace v přijímací části difúzní cely byla stanovována podle následující rovnice ln

>½ >; (

>½ >;

= −β8$ s,

(61)

kde D0 představuje difúzní koeficient solutu v roztoku (koeficient volné difúze), BW − B@ < a BW − B@ $ reprezentují rozdíl mezi molárními koncentracemi difundující látky ve zdrojové a přijímací částic difúzní cely v čase t respektive v čase 0. Koeficient β představuje konstantu difúzní cely a t je čas. Na Obr. 33 je uvedena typická závislost změny koncentrace difúzního média na čase v případě difúzních experimentů realizovaných v difúzní cele (průchodová křivka). Tato průchodová křivka může být rozdělena do dvou fází – v první fázi nedochází ke změně koncentrace vybraného barviva v přijímací části difúzní cely, v této fázi dochází k sorpci barviva na hydrogel s/bez přídavku aktivní látky a průchodu barviva skrz porézní materiál (tloušťka hydrogelu byla 5 mm). Koncentrace barviva v přijímací části difúzní cely je tedy nulová. V čase, kdy veškerá vazebná místa jsou vyčerpána a barvivo prodifunduje skrz póry hydrogelu až na konec, dochází k započetí nárůstu koncentrace v přijímací části difúzní cely. Čas, který odpovídá prvotní molekule prodifundované do přijímací komory difúzní cely, je nazýván jako čas průchodu. V tomto případě již je možné uvažovat o ustálené difúzi. Koncentrace barviva v přijímací komoře difúzní cely začne lineárně narůstat a ze směrnice tohoto lineárního nárůstu koncentrace barviva v čase je možné stanovit základní difúzní parametr v podobě efektivního difúzního koeficientu případně difúzního toku. koncentrace difúzního média (g·dm-3)

0,003 0,002

ustálená difúze

0,002 0,001 0,001 0,000 0

5

10 čas (s)

tL

15

20

Obr. 33: Příklad časové závislosti koncentrace barviva v přijímací části difúzní cely.

Pro kvantifikaci penetrace zvolených barviv skrz porézní materiály v difúzní cele byl použit teoretický model vytvořený Shackelfordem a Moorem [133]. Tento matematický model difúzních procesů je založen na faktu, že porézní charakter média výrazně ovlivňuje difúzi solutu dvěma způsoby. 1) pro difúzi solutu je k dispozici pouze redukovaná plocha

69



hydrogelu ve srovnání s makroskopickým průřezem hydrogelu, vzhledem k tomu, že předpokládáme, že agarózové řetězce vytvářejí jakousi překážku pro difúzi a tím pádem jsou tedy neproniknutelné pro difúzní médium, 2) existence neproniknutelných řetězců v difúzní dráze solutu zvyšuje tortuozní faktor (viz. Obr. 19). Po zahrnutí těchto faktorů může být první Fickův zákon modifikován do podoby potřebné pro kvantifikace uvedených difúzních procesů v difúzní cele. Difúzní tok (rovnice 62) zůstává konstantní během druhé fáze (v grafu ustálená difúze) během celého průběhu experimentu. Platí tedy pro něj: 4e =

ÙYZZ 1’

8$

∆>ÚYÛ Ü

= 8x

∆>ÚYÛ Ü

,

(62)

kde D0 představuje difúzní koeficient volné difúze, ∆BÝxÞ symbolizuje rozdíl koncentrací na obou stranách hydrogelů, L je tloušťka hydrogelu, ßxyy vyjadřuje efekt porozity a Tm je tortuozní faktor, který lze spočítat podle rovnice 63. ¹

Õà = * ÜY . ,

(63)

kde Le představuje skutečnou vzdálenost, kterou urazí molekula barviva při penetraci přes gel a L je makroskopická vzdálenost (tloušťka gelu). Oba zmíněné faktory (tortuozita i porozita) jsou skryty v symbolu De, který představuje efektivní difúzní koeficientu. Rozdíl koncentrací solutu na obou stranách gelu není nezbytně stejný jako rozdíl koncentrací v přijímací a zdrojové komoře difúzní cely, jelikož hydrogel představuje zcela jiné prostředí ve srovnání s vodným roztokem. Ustanoví se tedy rovnováha na rozhraní roztoku a gelu [133]. Tato rovnováha může být následně popsána rozdělovacím koeficientem podle rovnice 64 >ÚYÛ >

= á,

(64)

kde á představuje rozdělovací koeficient a popisuje tedy distribuci koncentrace rozpuštěné látky mezi roztokem (c) a gelem (cgel). Ustálený difúzní tok tedy může být díky zavedení rozdělovacího koeficientu popsán rozdílem koncentrací ve zdrojové a přijímací komoře difúzní cely podle rovnice 65 4e = â8x

N> ¹

.

(65)

Výše uvedené rovnice platí pouze pro druhou část difúzních procesů – ustálenou difúzi, tedy až poté, co dojde k vyčerpání vazebných míst v gelu a prodifundovaní solutu skrz porézní materiál. Průchodová část difúzních procesů (ta část, kdy nedochází ke změně koncentrace v přijímací komoře difúzní cely) se řídí jinými zákony než ustálená difúze. Zatímco v případě ustálené difúze je hydrogel saturován difúzními částicemi a jejich distribuce v hydrogelu se nemění, v průchodové části jsou uplatňovány specifické interakce mezi solutem a hydrogelem. Pro popis neustálené difúze (sorpce barviva na hydrogel a penetrace přes porézní přepážku, kdy se koncentrace v přijímací cele nemění) se změnou koncentrace v čase může být použit modifikovaný druhý Fickův zákon (rovnice 66) +> +<

=

WY + ? >

ã +- ?

= 8ä

70

+? >

+- ?

.

(66)



Ve výše uvedené rovnici je zaveden symbol Da, který představuje zdánlivý difúzní koeficient a symbol α, což představuje „rock capacity factor“, který vyjadřuje schopnost hydrogelu reagovat s difundující látkou a imobilizovat ji ve svojí vnitřní struktuře. Tento faktor může být vyjádřen jako zdánlivá rovnovážná konstanta sorpčních procesů podle rovnice 67 § = ßxyy M1 + K äææ O,

kde K äææ představuje poměr mezi nasorbovaným množstvím vůči volnému solutu.

(67)

V případě experimentů realizovaných v difúzní cele, lze čas potřebný pro penetraci difúzního média skrz porézní přepážku v podobě hydrogelu vyjádřit výrazem tL, tzv. čas průchodu, který je nepřímo úměrný zdánlivému difúznímu koeficientu podle rovnice 68 ¹?

sÜ = €W . ¾

(68)

Rovnice jsou založeny na následujících předpokladech: 1) pokud solut nemůže penetrovat do pevné fáze hydrogelu, ale pouze do jeho pórů, poté je čas průchodu nezávislý na ploše hydrogelu, ale pouze na tvaru a reálné vzdálenosti (Le), kterou solut urazí při difúzi skrz porézní překážku. 2) solut specificky interaguje s pevnými částicemi ve struktuře hydrogelu a tím je difúze zpomalována. Výše uvedené rovnice představují základ matematického modelu pro správný popis difúzních procesů realizovaných v difúzních celách. Tyto rovnice představují jakýsi návod, jak extrahovat fundamentální difúzní parametry z naměřených experimentálních dat. 5.5.5

Neustálená difúze v kyvetách – matematický model

Pokud zvolená látka difunduje v porézním médiu, rychlost molekulárního transportu je řízena změnou koncentračního gradientu solutu. Pro nejjednodušší případ jednodimenzionální difúze, který zanedbává veškeré ostatní vlivy jako je koncentrační tok vyvolaný teplotními gradienty či změnou koncentrace způsobenou interakcí s okolním prostředím, lze použít druhý Fickův zákon +> +<

+? >

= 8 +- ? .

(69)

Tuto rovnici lze použít tehdy, pokud je difúzní koeficient solutu v hydrogelovém médiu časově a koncentračně nezávislý. Pokud je ovšem difúze realizována v hydrogelovém médiu, transport solutu je ovlivněn dvěma základními efekty: tortuozitou a porozitou (viz. kap. 5.5.4). Pokud tedy dochází ke specifické interakci mezi solutem a hydrogelovou matricí, druhý Fickův zákon (rovnice 69) musí být upraven do podoby, kde bude zahrnut také vliv chemické reakce. Jednoduchá reverzibilní imobilizace solutu na hydrogel s přídavkem aktivní látky je prvním základním předpokladem modifikace Fickova zákona. Interakční mechanismus může být vyjádřen rovnicí 70 Èäææ

çèIÞ éêë çnIì ,

(70)

kde Svol představuje volný solut, zatímco Ssor je solut vázaný neboli nasorbovaný na hydrogel a tím pádem neschopen volného pohybu. Zdánlivá rovnovážná konstanta v tomto

71



případě vyjadřuje poměr nasorbovaného množství vůči volnému solutu v rovnováze a lze vyjádřit rovnicí 71 K äææ = X

>íŠ‰

\ .

>ŒŠÛ xî

(71)

Pro porézní systémy, kde hrají svůj vliv i interakce volného solutu s okolním prostředím, zdánlivý difúzní koeficient je definován rovnicí 72 8C = 1

W

ï M#LÈ“ŽŽ O

,

(72)

kde Tm představuje tortuózní faktor, D0 je difúzní koeficient čistého solutu při volné difúzi a Kapp je zdánlivá rovnovážná konstanta. Druhý Fickův zákon definovaný rovnicí 69 může být tedy přepsán do podoby vyhovující popisu difúzních procesů s vlivem chemické reakce do rovnice 73 +>ŒŠÛ +<

= 8C

+ ? >ŒŠÛ +- ?

.

(73)

Analytické řešení rovnice 73 podle korespondujících experimentálních podmínek poskytuje časovou a prostorovou závislost koncentrace solutu v médiu. Za předpokladu, že koncentrace solutu ve zdrojovém médiu je udržována během celého experimentu na konstantní hodnotě, rovnice 73 může být nahrazena Laplacovou transformací a poté tedy časový vývoj jednotlivých koncentračních profilů difundujícího solu do struktury hydrogelu s přídavkem aktivní látky může být popsán rovnicí 74 BèIÞ = BèIÞ,ðñ$ ∙ erf

-

pdW“ <

,

(74)

kde výraz BèIÞ,ðñ$ je časově nezávislá koncentrace solutu ve zdrojovém médiu (konstantní hodnota během celého experimentu). Vzhledem k tomu, že koncentraci solutu, která je nasorbová, lze jednoduše vyjádřit z rovnice 71, získáváme celkovou koncentraci solutu v gelu podle rovnice 75 BKIK = BèIÞ + BòIì = BèIÞ,ðñ$ ∙ M1 + K äææ O ∙ erf

-

pdW“ <

.

(75)

Velmi často dochází k tomu, že solut se participuje na rozhraní dvou fází (např. solut na rozhraní kapaliny a porézního média, do kterého solut difunduje), což má za následek nerovnoměrnou koncentraci solutu na rozhraní. Proto bývá velmi často zaváděn rozdělovací koeficient (H), který popisuje distribuci volného solutu mezi roztokem a porézní přepážkou na rozhraní (rovnice 76) á=

†ŒŠÛ,óô |ŽŠ‰é‡öí . †ŒŠÛ,óô |‰Š‡•Š÷

Rovnice 75 poté přechází do tvaru rovnice 77 BKIK = cèIÞ,ðñ$|æIìéøGí ∙ erf

-

pdW“ <

= áBèIÞ,ðñ$|ìIøKI} ∙ M1 + väææ O ∙ erf

(76) -

pdW“ <

.

(77)

Pro koncentraci BèIÞ,ðñ$|ìIøKI} platí, že je rovna koncentraci zásobního roztoku, ze kterého dochází k difúzi (pokud je tedy roztok dostatečně míchán).

72



Stanovení koncentračního profilu v závislosti na čase pomocí rovnice 77 umožňuje determinaci základních difúzních parametrů pro tento model – rozdělovacího koeficientu (H) a zdánlivé rovnovážné konstanty Kapp. 5.5.6

Sorpční experimenty

Hydrogely Pro porovnání dynamických metod studia reaktivity vybraných látek – difúzní cela a neustálená difúze v kyvetách pro vybraný typ látek (huminové kyseliny) s klasickými metodami studia interakcí látek byly realizovány také klasické sorpční procesy . Vybraná barviva (methylenová modř a rhodamin 6G) byla sorbována na agarózové hydrogely s přídavkem lignitických případně modifikovaných lignitických huminových kyselin. Koncentrace agarózy respektive přídavek huminových kyselin byl totožný jako v případě difúzních procesů, tj. 1 hm. % AG hydrogel s přídavkem 0,000 hm. %, 0,002 hm. %, 0,005 hm. % a 0,010 hm. % LHK respektive MHK. Skleněné trubičky o rozměrech 1 × 1 cm (průměr × výška) byly naplněny příslušným agarózovým hydrogelem a ponořeny do roztoku barviva (10 cm3 o koncentraci 0,01 g·dm-3). Po 7 dnech od započetí sorpčních experimentů (po tomto časovém intervalu již bylo dosaženo rovnováhy) byly agarózové hydrogely z roztoku vytaženy a následně byl změřen úbytek koncentrace barviva ve zdrojovém roztoku pomocí UV-VIS spektrofotometrie. Agarózové hydrogely s přídavkem huminových kyselin byly následně podrobeny desorpčním experimentům. Hlavním cílem těchto experimentů bylo zjistit, jaký charakter a jaká je síla vazby mezi AG hydrogelem s HK a zvoleným barvivem. Na základě literatury byly vybrány 2 luhovací činidla o různé síle. V prvé řadě byly AG hydrogely ponořeny do vody (10 cm3) a desorpce se nechala probíhat po dobu 7 dnů. Po tomto časovém intervalu byly vzorky umístěny do 10 cm3 kyseliny chlorovodíkové o koncentraci 1 mol·dm-3, desorpce probíhala opět po dobu 7 dnů. V každé fázi desorpčních experimentů byly stanovovány výluhy barviv pomocí UV-VIS spektrofotometrie. Výsledky týkající se sorpčních a desorpčních experimentů jsou uvedeny v kap. 6.5.1. Pevné částice Posledním experimentem, díky kterému lze usuzovat o míře reaktivity a sorpčních vlastnostech vybraných látek byly klasické adsorpční experimenty na pevných částicích huminových kyselin. Práškové huminové kyseliny (50 mg) byly dispergovány v 50 cm3 organického barviva o koncentraci 25 – 150 g·m-3 v uzavřené nádobě. Následně byla tato směs kontinuálně třepána po dobu 72 hodin při 40 RPM. Sorpční kapacita gelů s různým přídavkem huminových kyselin byla posuzována na základě změny absorbance (MB – 665 nm a RH – 525 nm) oproti původnímu zdrojovému roztoku barviva.

73



Obr. 34: Ukázka realizace sorpčních experimentů na agarózové hydrogely. Vlevo sorpce na hydrogelech, vpravo adsorpce na pevných částicích huminových kyselin.

74

VÝSLEDKY A DISKUZE


6

VÝSLEDKY A DISKUZE

6.1

Charakterizace materiálů

6.1.1

Elementární analýza a termogravimetrie (EA a TGA)

Nezbytnou charakterizací zkoumaných látek je elementární analýza, která umožňuje stanovit zastoupení základních biogenních prvků (kyslík, uhlík, vodík, dusík a síra), stejně jako termogravimetrická měření, díky nimž lze stanovit množství nespalitelného podílu (popel) včetně vlhkosti materiálu. Této charakterizaci byly podrobeny veškeré látky, které byly používány, konkrétně se jednalo o agarózu (AG), lignitické huminové kyseliny (LHK), metylované lignitické huminové kyseliny (MHK), standardy huminových kyselin z leonarditu (IHSS HK), metylovaný standard huminových kyselin z leonarditu (MIHSS HK), alginát sodný (ALG), kyselina hyaluronová (HYA), polystyrensulfonát sodný (PSS) a chitosan (CHIT). Výsledky elementární analýzy a termogravimetrického stanovení nespalitelného podílu a vlhkosti jsou uvedeny v Tab. 3. Tab. 3: Elementární analýza vybraných látek (zastoupení jednotlivých prvků je uvedeno v atomových procentech) včetně stanovení vlhkosti a popelu. vzorek

O C H N S popel vlhkost H/C O/C H/O (at. %) (at. %) (at. %) (at. %) (at. %) (hm. %) (hm. %)

AG

23,4

27,7

48,7

0,0

0,1

1,8

0,8

2,1

1,7

11,7

LHK

18,2

40,0

40,7

0,8

0,3

1,0

0,5

2,2

28,9

7,0

MHK

14,5

37,7

46,8

0,8

0,2

1,2

0,4

3,2

29,4

2,1

IHSS HK

17,7

48,1

33,2

0,8

0,2

0,7

0,4

1,9

2,6

7,2

MIHSS HK

15,9

45,5

37,8

0,6

0,2

0,8

0,3

2,4

2,1

2,8

ALG

26,9

21,4

40,0

0,0

0,0

1,9

1,3

1,5

2,1

11,7

HYA

25,1

23,5

38,9

0,0

0,0

1,7

1,1

1,5

0,9

12,5

PSS

23,3

28,1

35,1

0,0

2,5

1,2

0,8

1,5

1,1

11,9

CHIT

18,5

24,0

49,9

3,3

0,0

2,1

0,8

2,7

1,3

10,8

Jak vyplývá z výše uvedené tabulky, výrazným způsobem se liší především huminové kyseliny (LHK a MHK), coby přírodní biokoloidy, od všech zmíněných bio a syntetických látek včetně standardů huminových kyselin (IHSS) především v množství nespalitelného podílu. Hlavní důvod této odlišnosti spočívá v tom, že lignitické huminové kyseliny nebyly během izolace dostatečně purifikovány. Nejedná se o chybu, avšak o záměr, vzhledem k tomu, že byl stanovován také vliv popele na transportní charakteristiky. Množství popele lze významným způsobem ovlivnit během izolace huminových kyselin z jejich zdroje. Purifikací huminových kyselin především pak vlivem kyseliny fluorovodíkové na výsledné hodnoty nespalitelného podílu se věnuje publikace [174]. Autoři této publikace ověřili, že zavedením purifikačního kroku do izolačního procesu huminových kyselin může snížit množství popele až na minimální hodnotu. 75

VÝSLEDKY A DISKUZE


Při porovnání huminových kyselin před metylací (LHK) a po metylaci (MHK) je také zřejmé, že u modifikovaných HK dochází k nárůstu množství vodíku, což lze logicky vysvětlit tím, že při metylaci dochází k selektivnímu obsazení karboxylových skupin metylovými skupinami –CH3. Výsledná skupina –COOCH3 tedy teoreticky obsahuje trojnásobné množství vodíku v porovnání s nemodifikovanými huminovými kyselinami. Stejný trend čili rostoucí množství vodíku a naopak klesající zastoupení kyslíku je pozorován i při porovnání standardů IHSS HK s jejich metylovanými ekvivalenty. V případě, že se zaměříme na prvkové složení chitosanu (viz. Tab. 3), nelze si nepovšimnout, že prakticky jako jediný obsahuje nezanedbatelné množství dusíku. Vzhledem k tomu, že se jedná o kationaktivní biokoloid, v jehož struktuře se objevuje nemalé množství –NH2 skupin, není toto zjištění tedy žádným překvapením. Vzhledem k tomu, že v přírodě se nevyskytuje chitosan v absolutně čisté formě, ale vždy se jedná o heteropolymer v kombinaci s chitinem, důležitým parametrem je tedy stupeň (de)acetylace, který rozhoduje o kvalitě chitosanu. Z procentuálního zastoupení dusíku v elementární analýze chitosanu lze stanovit stupeň deacetylace chitosanu a je jedním ze základních parametrů popisujících tento kationaktivní biokoloid. Při porovnání prvkového složení agarózy s ostatními biokoloidními či syntetickými látkami, s výjimkou PSS, je patrné, že agaróza obsahuje malé množství síry, což je běžné, vzhledem k tomu, že ve struktuře agarózy se vyskytují sulfátové zbytky. 100

199.90°C 88.07%

hmotnost (%)

80

60

40

20 Residue: 1.096% (0.1059mg)

0 0

200

400

600

teplota (°C)

800 Universal V4.5A TA Instruments

Obr. 35: Příklad termogravimetrické křivky pro polystyrensulfonát sodný.

Významnou diferenci lze nalézt také v zastoupení vlhkosti jednotlivých zkoumaných látek. Zatímco vlhkost huminových kyselin se pohybuje kolem 2 hm. % (v případě metylovaných huminových kyselin) respektive kolem 7 hm. % (v případě nativních), u ostatních látek biokolidního charakteru je vlhkost vždy nad 10 hm. % a to včetně také syntetického polystyrensulfonátu sodného. Tento rozdíl může být způsoben odlišným stupněm hydratace jednotlivých biokoloidních látek. Vzhledem k tomu, že základními

76

VÝSLEDKY A DISKUZE


funkčními skupinami, vykazujícími pozitivní afinitu vůči vodě a rozhodujícími tedy o stupni hydratace jako takovém, jsou karboxylové skupiny, není tedy překvapením, že metylované huminové kyseliny disponují nižší hodnotou vlhkosti v porovnání s nativními huminovými kyselinami. Velké množství polymerních a biokoloidních molekul je schopno vázat na sebe vodu a tím pádem se hydratovat. Švédští autoři v čele s Albérem [175] studovali hydrataci hyaluronanu pomocí isotermální sorpční kalorimetrie a diferenciální skenovací kalorimetrie. Jejich hlavním závěrem bylo, že i vysušená kyselina hyaluronová v sobě obsahuje určité množství vázané vody, kterou nelze odstranit vysušením při nižších teplotách. Za tuto vázanou vodu jsou opět podle [175] zodpovědné práce karboxylové skupiny ve struktuře molekuly hyaluronanu. 6.1.2

Infračervená spektrofotometrie s Fourierovou transformací (FTIR)

Hlavním účelem infračervené spektrofotometrie s Fourierovou transformací bylo ověření úspěšnosti metylace huminových kyselin. Proto bude celá tato kapitola věnována pouze huminovým kyselinám. Rozsáhlou diskuzi rozdílů v naměřených infračervených spektrech modifikovaných a nativních huminových kyselin lze nalézt v publikaci [217]. Naměřená spektra huminových kyselin (viz. Obr. 36) lze interpretovat následujícím způsobem: široký pás v rozmezí 3600 – 3200 cm-1 dokazuje přítomnost –OH skupin v jakékoliv formě. U spektra metylovaných lignitických huminových kyselin lze vidět pás při 2953 cm-1, který odpovídá asymetrické valenční vibraci –CH3 skupin. Tento absorpční pás je odlišný v porovnání se spektrem lignitické huminové kyseliny, které tento pás postrádá. Dalšími reprodukovatelnými pásy, které jsou přítomny v obou srovnávaných spektrech, je pás při 2920 cm-1, který odpovídá asymetrické valenční vibraci –CH2 a pás symetrické valenční vibrace –CH2 (2850 cm-1). Ostrým a navíc velmi intenzivním pásem je pokles transmitance při 1730 cm-1 v případě MHK respektive 1720 cm-1 u LHK. Tento pás je charakteristický pro vibraci karbonylových skupin, v případě MHK se jedná o karbonylové skupiny v arylesterech, zatímco u LHK jde o karbonyl v karboxylových skupinách (–COOH). Díky tomu, že esterová skupina vykazuje vyšší molekulovou hmotnost ve srovnání s karboxylovou skupinou, dochází k posunu pásu k vyšším vlnočtům (vzhledem k tomu, že pro rozvibrování esterové skupiny je zapotřebí vyšší energie a právě energie je přímo úměrná vlnočtu) a právě tento posun je jedním z hlavních kritérií, která dosvědčují zdárnou metylaci huminových kyselin. Další pás společný pro obě spektra je patrný u vlnočtu 1610 cm-1 a indikuje skeletální vibraci konjugovaných vazeb v aromátech. Ostrý pás ve spektru MHK při 1430 cm-1 odpovídá deformační vibraci –CH3 a ve srovnání se spektrem nativních huminových kyselin je značně intenzivní. Série poklesu intenzity prošlého záření u vlnočtů 1420 cm-1 a 1380 cm-1 ve spektru LHK odpovídá asymetrické vibraci COO- v prvém případě a symetrické deformační vibraci COO- v druhém případě. Pás společný pro obě spektra při vlnočtu 1250 cm-1 odpovídá vazebné vibraci C-C-O- skupin v aromatických esterech. V oblasti 1200 – 1000 cm-1 se poté nachází C-O vibrace ve stavebních jednotkách huminových kyselin (estery, ethery, alifatické sekundární alkoholy, aj.).

77

VÝSLEDKY A DISKUZE


transmitance

LHK MHK

4 000

3 600

3 200

2 800

2 400 2 000 vlnočet (cm-1)

1 600

1 200

800

400

Obr. 36: Infračervená spektra lignitických respektive metylovaných lignitických huminových kyselin.

Na základě analýzy vzorků pomocí infračervené spektrofotometrie lze tedy tvrdit, že huminové kyseliny byly úspěšně modifikovány (karboxylové skupiny byly selektivně překryty metylovými zbytky). Stejným způsobem byla provedena i modifikace standardů huminových kyselin od mezinárodní společnosti pro huminové látky (IHSS). FT-IR spektra vykazovala obdobný charakter se stejným poklesem absorbance a stejnými pásy jako v případě srovnání LHK a MHK. Studiu metylace huminových kyselin se věnují mnohé publikace. Wagner a Stevenson [176] zjistili, že až třetina karboxylových skupin je v takové pozici, že jsou schopny tvořit cyklické anhydridy, zatímco dvě třetiny –OH skupin jsou fenolického původu. Piccolo a Stevenson [177] studovali infračervená spektra komplexů huminových kyselin s vícemocnými kovovými ionty (Cu2+, Pb2+ a Ca2+). Dospěli k názoru, že na imobilizaci výše zmíněných kovových iontů se podílejí nejenom karboxylové skupiny ve struktuře huminových kyselin, ale také fenolické skupiny včetně karbonylových. Charakter vazby (iontová či kovalentní) ovšem nelze podle [177] přesně určit z pozice antisymetrických a symetrických vibrací karboxylových skupin. 6.1.3

Skenovací elektronová mikroskopie (SEM)

Primárním cílem tohoto měření bylo porovnání případných změn texturních vlastností povrchu huminových kyselin před a po metylaci. V odborných publikacích [178], [179] je zmiňováno, že pozitivní afinita huminových kyselin vůči sloučeninám různého charakteru je dána především přítomností polárních strukturních skupin (karboxylové, fenolické či alkoholové skupiny). Podle těchto publikací tedy dochází k chemické sorpci díky přítomnosti funkčních skupin. Ovšem existují také názory, že schopnost sorpce huminových kyselin vůči nepolárním sloučeninám je dána především hydrofobními charakterem (například aromaticita huminových kyselin) [180]. Není tedy divu, že se rozšiřuje také názor, že huminové kyseliny mají schopnost vázat sloučeniny rozličného původu právě díky vysokému specifickému povrchu. Z tohoto důvodu byly pořízeny

78

VÝSLEDKY A DISKUZE


snímky LHK a MHK pomocí SEM analýzy, aby bylo možné usuzovat o jejich povrchu a specifický povrch poté následně korelovat se sorpčními případně transportními charakteristikami huminových kyselin. Jak je patrné z Obr. 37 lignitické huminové kyseliny (vlevo) disponují odlišným povrchem v porovnání s metylovanými huminovými kyselinami (vpravo). Lze tedy tvrdit, že metylace významným způsobem ovlivňuje především drsnost a mikroporozitu povrchu huminových kyselin. Rozdílnost ve specifickém povrchu byla potvrzena také měřením adsorpce plynu pomocí BET analýzy. Podle tohoto měření metylované huminové kyseliny vykazovali téměř dvakrát vyšší specifický povrch ve srovnání s nativními LHK. Výše zmíněné odlišnosti ve specifickém povrchu obou porovnávaných HK mohou, a dost pravděpodobně i budou mít, velmi významný vliv na sorpční kapacitu těchto biokoloidních sloučenin. Předpokládáme-li, že míra interakce těchto látek se zvolenými difúzními sondami je přímo úměrná zastoupení karboxylových skupin ve struktuře HK, lze očekávat, že metylované HK budou disponovat nižší sorpční kapacitou a nižší mírou interakcí. Ovšem právě změna fyzikálních vlastností HK během metylace může ovlivnit pozitivním způsobem finální difúzní a sorpční parametry.

Obr. 37: Snímky pořízené pomocí SEM analýzy pro lignitické huminové kyseliny (vlevo) a metylované lignitické huminové kyseliny (vpravo) při zvětšení 1000× (nahoře) respektive 100 000× (dole).

79

VÝSLEDKY A DISKUZE

6.1.4


Stanovení kyselosti vybraných látek

Titračním experimentům čili stanovení kyselosti pomocí zpětné, přímé a acetátové metody byly podrobeny lignitické a metylované huminové kyseliny. Hlavním účelem tohoto stanovení bylo opět ověření úspěšné metylace huminových kyselin, stejně tak jako stanovení kyselostí huminových kyselin, což je dle literatury jedním ze základních parametrů vypovídajících o reaktivitě HK. Jak již je uvedeno výše, metylace huminových kyselin vede k selektivnímu obsazení karboxylátových skupin metylovými zbytky, tím pádem lze očekávat, že se u modifikovaných vzorků výrazným způsobem sníží celková kyselost respektive karboxylová kyselost bude velmi blízká nule. Jak je uvedeno v Tab. 4 výsledné hodnoty kyselostí vzorků LHK a MHK se výrazně odlišují. Zatímco vzorek nativních lignitických huminových kyselin vykazoval hodnotu celkové kyselosti 4,45 ± 0,09 mmol kyselých funkčních skupin na 1 g huminových kyselin, kde majoritní podíl kyselosti tvořily právě karboxylové skupiny (4,24 ± 0,07 mmol·g-1), vzorek MHK dle očekávání vykazoval téměř nulovou hodnotu karboxylátové kyselosti, konkrétně 0,06 ± 0,03 mmol·g-1, což je prakticky zanedbatelná hodnota kyselosti v porovnání s ostatními. Výsledná hodnota fenolické kyselosti byla vždy dopočítávána jako rozdíl celkové stanovené kyselosti a karboxylátové. Získané kyselosti pro oba typy huminových kyselin jsou v dobré shodě s již publikovanou literaturou. Andjelkovic a kol. [181], [182] studovali kyselost huminových kyselin se selektivně blokovanými funkčními skupinami pomocí přímé, nepřímé respektive karboxylátové titrace. Půdní huminové kyseliny vykazovaly celkovou hodnotu kyselosti 4,68 mmol·g-1, karboxylátová kyselost činila 2,80 mmol·g-1 a fenolická kyselost byla 1,88 mmol·g-1. Zatímco esterifikované huminové kyseliny vykazovaly celkovou kyselost 1,96 mmol·g-1, karboxylátovou 0,20 mmol·g-1 a fenolickou 1,76 mmol·g-1. Tyto již publikované hodnoty se tedy příliš neliší od námi stanovených hodnot kyselosti pro lignitické respektive modifikované lignitické huminové kyseliny. Tab. 4: Stanovení celkové a karboxylátové kyselosti pomocí titračních metod.

vzorek

celková kyselost (mmol·g-1)

karboxylátová kyselost (mmol·g-1)

fenolická kyselost (mmol·g-1)

LHK

4,45 ± 0,09

3,24 ± 0,07

1,21 ± 0,08

MHK

1,24 ± 0,05

0,06 ± 0,03

1,18 ± 0,04

Na základě tohoto stanovení lze opět tvrdit, že modifikací huminových kyselin pomocí metylace lze úspěšně selektivně zakrýt vybrané funkční skupiny (karboxylátové) s poměrně vysokou konverzí (> 90 %). Tento fakt tedy opět napomáhá tomu, aby byla objasněna reaktivita huminových kyselin a především tedy vliv karboxylových skupin na reaktivitu a bariérové vlastnosti huminových kyselin vůči látkám kationaktivního charakteru. Více informací o kyselosti vybraných huminových kyselin včetně standardů IHSS a modifikovaných huminových kyselin lze nalézt v publikaci [216].

80

VÝSLEDKY A DISKUZE


6.2

Charakterizace hydrogelů

6.2.1

Stanovení viskoelastických vlastností hydrogelů (REO)

Stanovení viskoelastických vlastností hydrogelů bylo realizováno pomocí jednoduchých oscilačních testů na titanovém senzoru deska-deska o průměru 40 mm. Primárním cílem této charakterizace bylo ověřit, zda přídavek aktivní substance v podobě biokoloidních látek či syntetického polystyrensulfonátu výraznějším způsobem ovlivňuje finální mechanické vlastnosti agarózových hydrogelů. Změna mechanických vlastností hydrogelů by vedla k výrazné změně bariérových charakteristik, vzhledem k tomu, že výsledná elasticita gelové sítě je schopna poměrně výrazně ovlivňovat transportní vlastnosti gelů. Prvním testem, který byl na hydrogely aplikován, byl test s proměnou amplitudou deformace a konstantní frekvencí oscilací (strain sweep). Hlavním cílem tohoto testu bylo stanovení lineární viskoelastické oblasti (LVO), což je oblast, kdy odezva viskoelastických modulů je nezávislá na aplikované amplitudě deformace a zároveň charakterizuje oblast vratných a nevratných deformací. Právě rozsah LVO je jedním z fundamentálních kritérií, pomocí nichž lze posuzovat viskoelastické vlastnosti gelů s / bez přídavku aktivní látky. Druhým testem, pomocí něhož bylo usuzováno o viskoelastických vlastnostech připravených hydrogelů, byl taktéž oscilační test, ale v tomto případě se jednalo o frekvenční test (frequency sweep). U tohoto testu je na vzorek aplikována konstantní amplituda deformace (vhodně vybraná z LVO na základě amplitudového testu), zatímco vzorek je vystavován proměnné frekvenci oscilací. Základními výstupy z těchto oscilačních testů jsou elastický modul, viskózní modul, ztrátový úhel či komplexní viskozita. Agaróza – koncentrační závislost V první fázi byly charakterizovány čisté agarózové gely, konkrétně pak vliv koncentrace agarózy ve finálním hydrogelu na jeho mechanické vlastnosti. Z níže uvedeného grafu (viz. Obr. 38) je patrné, že změna koncentrace agarózy ve finálním gelu ovlivňuje absolutní hodnoty viskoelastických modulů, ovšem LVO, což je oblast, kde je odezva elastického modulu konstantní, je na této amplitudě deformace prakticky nezávislá. U obou testovaných koncentrací agarózy dochází ke zlomu a tedy trvalé deformaci vnitřní gelovité struktury hydrogelu nad hodnotou amplitudy deformace vyšší než 0,1 %. Za touto kritickou amplitudou deformace je již hydrogelová síť nenávratně zdeformována, vzhledem k tomu, že dochází k trvalému přetrhání uzlů ve struktuře hydrogelu. Lze tedy tvrdit, že i když koncentrace agarózy poměrně výrazně ovlivňuje mechanické vlastnosti připravených hydrogelů, rigidita čili jakási pevnost agarózových řetězců ve vnitřní struktuře hydrogelu, je na koncentraci prakticky nezávislá.

81

VÝSLEDKY A DISKUZE


1 hm. % AG

100000

100000

viskoelastické moduly (Pa)


4 hm. % AG 10000

1000

100

10 0,01

0,1 1 10 amplituda deformace (%)

10000

1000

100

10 0,01

100

0,1 1 frekvence oscilací (Hz)

10

Obr. 38: Závislost viskoelastických modulů (G' – plné symboly a G'' – prázdné symboly) na amplitudě deformace při konstantní frekvenci 1 Hz (vlevo) a závislost viskoelastických modulů na frekvenci oscilací při konstantní amplitudě deformace 0,1 % (vpravo) pro různě agarózové hydrogely lišící se svou koncentrací.

Pro účely frekvenčního testu byla jako vhodná amplituda deformace zvolena hodnota 0,05 %. Z frekvenční závislosti (viz. Obr. 38) je zřejmé, že zkoumané hydrogely disponují plně síťovanou strukturou vykazující elastický charakter v celém měřeném rozsahu (0,01 – 20 Hz), i přesto, že agarózové hydrogely obsahují majoritní podíl vody, v tomto případě až 99 hm. %. Toto tvrzení je podpořeno tím, že odezva elastického modulu se prakticky nemění v závislosti na frekvenci oscilací v celém rozsahu měření. Opět je z grafu očividné, že s rostoucí koncentrací agarózy dochází k nárůstu jak viskózního, tak také elastického modulu. Agaróza – časová stabilita Velmi důležitým parametrem hydrogelů z hlediska transportních procesů je jejich časová stálost. Vzhledem k tomu, že difúzní experimenty byly, v případě neustálené difúze v kyvetách, realizovány až po dobu 3 dnů, bylo také nutné ověřit, zda během tohoto časového intervalu nedochází ke změně mechanických vlastností vlivem degradace v čase. Právě výše zmíněný fakt byl hlavní motivací pro studium časové stability z hlediska mechanických vlastností 1 hm. % agarózového gelu, který byl použit jako hydrogelové médium pro studium reaktivity vybraných látek. Časová závislost mechanických vlastností agarózových hydrogelů byla zkoumána opět pomocí oscilačních testů frekvenčního i amplitudového charakteru. Tyto experimenty byly realizovány tak, že byly připraveny tři stejné 1 hm. % agarózové hydrogely s tím, že jeden vzorek byl proměřen na reometru 2 hodiny po přípravě, další dva vzorky byly umístěny do exsikátoru s destilovanou vodou (tím bylo zabráněno vysychání vzorku a zároveň také simulováno difúzní prostředí) a tyto vzorky byly měřeny po 1 respektive 3 dnech od přípravy.

82

VÝSLEDKY A DISKUZE

100000


0 dnů od přípravy

100000

1 den od přípravy viskoelastické moduly (Pa)


3 dny od přípravy 10000

1000

100

10 0,01


10000

1000

100 0,01

100


10

Obr. 39: Závislost viskoelastických modulů (G' – plné symboly a G'' – prázdné symboly) na amplitudě deformace při konstantní frekvenci 1 Hz (vlevo) a závislost viskoelastických modulů na frekvenci oscilací při konstantní amplitudě deformace 0,1 % (vpravo) pro 1 hm. % agarózový gel. Porovnání viskoelastických modulů v závislosti na stáří hydrogelu.

Z uvedeného grafu (viz. Obr. 39) je patrné, že po dobu minimálně 3 dnů nedochází k detekovatelným změnám mechanických vlastností agarózových hydrogelů, jelikož odezvy viskoelastických modulů na amplitudě deformace respektive na frekvenci oscilací v druhém případě, jsou prakticky totožné a nezávislé na čase. Mírné odchylky lze pozorovat pouze u odezvy viskózního modulu po 1 dnu od přípravy, ovšem vzhledem k tomu, že řádově jsou veškeré viskózní moduly stejné, lze tedy považovat AG hydrogely za časově stabilní. Díky tomuto ověření lze vyloučit vliv stárnutí hydrogelů (změnu mechanických vlastností) na finální bariérové a transportní vlastnosti agarózových hydrogelů. Agaróza – přídavek aktivní substance Stěžejní částí reologické charakterizace připravených hydrogelů bylo stanovení vlivu koncentrace aktivních látek na finální mechanické vlastnosti hydrogelů. Pro následující experimenty byly vybrány pouze 1 hm. % agarózové hydrogely. Pomocí oscilačních testů byly proměřeny všechny přídavky aktivní substance, které byly používány při transportních experimentech (tj. 0,002 hm. %, 0,005 hm. % i 0,010 hm. %). Pro přehlednost grafických závislostí jsou uváděny vždy pouze nejvyšší koncentrace čili 0,010 hm. % ve srovnání s čistým agarózovým hydrogelem. Z níže uvedeného grafu (viz. Obr. 40) je zřejmé, že přídavek aktivní látky k 1 hm. % agarózovému gelu ve většině případů neovlivňuje finální mechanické vlastnosti. Výjimku tvoří pouze kationaktivní chitosan. V případě chitosanu dochází k výraznému nárůstu LVO (ve srovnání s čistým agarózovým gelem je LVO u hydrogelu obsahujícího chitosan ukončena až ~10 % amplitudy deformace). Z tohoto faktu lze tedy vydedukovat, že transportní vlastnosti takové hydrogelové sítě budou ovlivněny nejen interakcí chitosanu s opačně nabitými difúzními sondami, ale také právě nárůstem elasticity hydrogelové sítě.

83

VÝSLEDKY A DISKUZE

1 hm.% AG 1 hm. % AG + 0,01 hm.% ALG 1 hm.% AG + 0,01 hm.% LHK

10000

1000

100

10 0,01

100000



100000



10000

1000

100

10 0,01

100

1 % hm.AG + 0,01 hm.% CHIT 1 hm.% AG + 0,01 hm.% MHK 1 hm.% AG + 0,01 hm.% PSS


100

Obr. 40: Amplitudový test při konstantní frekvenci 1 Hz. Porovnání viskoelastických modulů (G' – plné symboly a G'' – prázdné symboly) pro 1 hm. % agarózový gel s přídavkem vybraných aktivních látek.

Při porovnání viskoelastických modulů pro AG hydrogely s přídavkem LHK a MHK je patrné, že modifikace huminových kyselin nemá výraznější vliv na finální viskoelastické vlastnosti hydrogelů. V případě AG hydrogelu obsahujícího MHK dochází sice ve srovnání s LHK k mírnému nárůstu absolutních hodnot elastického modulu, ovšem tento nárůst není nijak rapidní. 1 hm.% AG 1 hm.% AG + 0,01 hm.% ALG 1 hm.% AG + 0,01 hm.% LHK

10000

1000

100 0,01

100000



100000


10000

1000

100 0,01

10

1 % hm.AG + 0,01 hm.% CHIT 1 hm.% AG + 0,01 hm.% MHK 1 hm.% AG + 0,01 hm.% PSS


10

Obr. 41: Frekvenční test s konstantní amplitudou deformace 0,1 %. Porovnání viskoelastických modulů (G' – plné symboly a G'' – prázdné symboly) pro 1 hm. % agarózový gel s přídavkem vybraných aktivních látek.

Změny v mechanických vlastnostech pro hydrogel obsahující alginát sodný respektive polystyrensulfonát sodný jsou patrné z níže uvedeného grafu (viz. Obr. 41). Pokles elastického modulu (G‘) u 1 hm. % AG s přídavkem 0,01 hm. % ALG resp. PSS ve 84

VÝSLEDKY A DISKUZE


srovnání s referenčním agarózovým hydrogelem svědčí o nižší elasticitě hydrogelové sítě. Nejedná se ovšem o řádový pokles, z toho důvodu lze tvrdit, že transportní procesy nebudou významněji ovlivněny mechanickými vlastnostmi. I v tomto případě lze tvrdit, že veškeré zkoumané hydrogely disponují plně síťovanou strukturou, vzhledem k tomu, že elastický modul převyšuje modul viskózní v celém rozsahu měřených frekvencí oscilací. Z výše uvedených oscilačních testů je patrné, že veškeré zkoumané hydrogely vykazují viskoelastické chování s převahou elasticity a to v celém rozsahu měření. Jedním z dílčích cílů dizertační práce bylo také studium reaktivity vybraných látek konkrétně pak huminových kyselin při proměnném pH a iontové síle. Z tohoto důvodu byly oscilačním testům podrobeny také agarózové hydrogely s přídavkem huminových kyselin v pufru o požadované hodnotě pH a IS. Grafické závislosti z těchto měření nejsou součástí dizertační práce, vzhledem k tomu, že změna iontového prostředí či pH hydrogelů bez/s přídavku huminových kyselin neměla absolutně žádný vliv na finální mechanické vlastnosti agarózových hydrogelů. Odezvy viskoelastických modulů byly ve všech případech prakticky totožné jako u 1 hm. % agarózovým hydrogelem (viz. Obr. 39).

6.3

Transportní procesy ve vodných roztocích

V prvé fázi byla provedena studie penetrace vybraného organického barviva (methylenová modř) přes komerční polykarbonátovou membránu (průměr pórů 2 µm). Účelem tohoto měření bylo stanovení difúzního koeficientu volné difúze D0 ve vodném prostředí, vzhledem k tomu, že při difúzi barviva přes tenkou membránu, nejsou difúzní procesy narušovány vlivem tortuozity, případně reaktivity jako v případě transportních procesů přes hydrogelové vzorky. Zároveň byly tyto experimenty realizovány při třech různých teplotách (30, 40 a 50 °C), čímž mohla být stanovena aktivační energie difúzních procesů (Ea). 1,6E-05

2,0

30°C 40°C 50°C

1,4E-05

1,8 1,6

1,2E-05 LN cMB (a.u.)

cMB (mol·dm-3)

1,4 1,0E-05 8,0E-06 6,0E-06

1,2 1,0 0,8 0,6

4,0E-06 0,4 2,0E-06

0,2

0,0E+00

0,0 0

1

2 3 čas (hod.)

4

0

5

1

2 3 čas (hod.)

4

5

Obr. 42: Změna koncentrace methylenové modři v přijímací části difúzní cely jako funkce času (vlevo), vypočítaná funkce LN cMB jako funkce času při různých teplotách (vpravo).

85

VÝSLEDKY A DISKUZE


Časový vývoj koncentrace barviva v přijímací cele je zobrazen na grafické závislosti výše (viz. Obr. 42 vlevo). Vývoj koncentrace v přijímací cele byl poté převeden na funkci LN (viz. Obr. 42 vpravo), kterou lze vypočítat pomocí rovnice 78. Tato rovnice také posloužila pro výpočet samotné hodnoty difúzního koeficientu barviva ve vodném roztoku. #

M>‡ˆ‰Š‹ŠŒá >Žř•‹í’“”í O

8$ s = − „ ln …M>

‡ˆ‰Š‹ŠŒá

>Žř•‹í’“”í O

(

–

(78)

kde D0 představuje difúzní koeficient volné difúze ve vodných roztocích, t je čas difúze, β symbolizuje konstantu difúzní cely (6·104 m-2), která byla stanovena v předešlých měřeních [134], czdrojová představuje koncentraci barviva ve zdrojové komoře difúzní cely, cpřijímací značí koncentraci barviva v přijímací části difúzní cely v čase t (čitatel) respektive na začátku experimentu (jmenovatel). Na základě rovnice 78 byl tedy vypočítán difúzní koeficient MB ve vodě. Závislost difúzního koeficientu barviva ve vodě na teplotě zobrazuje Obr. 43. Hodnoty difúzního koeficientu volné difúze vypočítané pomocí rovnice 78 byly následující: (0,84 ± 0,09) × 10-9 m2s-1 pro 30 °C, (1,03 ± 0,01) × 10-9 m2s-1 pro 40 °C a (1,64 ± 0,01) × 10-9 m2s-1 pro 50 °C. Jak je patrné ze závislosti difúzního koeficientu barviva ve vodě na teplotě, s rostoucí teplotou dochází k lineárnímu nárůstu difúzního koeficientu, který vyjadřuje rychlost difúze. Experimentálně tedy bylo potvrzeno, že difúze je teplotně aktivovaný proces. S rostoucí teplotou dochází také k nárůstu intenzity Brownova pohybu, který je přímo úměrný rychlosti difúzních procesů vyjádřených právě difúzním koeficientem. -20

ln D0 (a.u.)

y = -2,68E+03x - 1,19E+01 R² = 1,00E+00

-20,5

-21 3,0E-03 3,1E-03 3,2E-03 3,3E-03 3,4E-03 1/T (K–1)

Obr. 43: Závislost přirozeného logaritmu difúzního koeficientu na převrácené hodnotě termodynamické teploty.

Experimentálně získané difúzní koeficienty jsou poměrně v dobré shodě s teoretickými předpoklady podle Leaista a kol. [183], kteří studovali penetraci methylenové modři ve vodných roztocích pomocí konduktometrie a také podle Horiho a kol. [184], kteří naopak studovali difuzivitu MB pomocí Stokesových diafragmových difúzních cel.

86

VÝSLEDKY A DISKUZE


Pomocí Stokesovy-Einsteinovy rovnice (str. 40, rovnice 35) lze poté vypočítat Stokesův poloměr methylenové modři. Tento poloměr byl experimentálně stanoven na 0,33 nm, což je opět ve velmi dobré shodě s publikací Hogan a kol. [185] , kteří stanovovali Stokesův poloměr methylenové modři pomocí fluorescenčního zhášení. Z grafické závislosti (Obr. 43 vpravo) je zřejmé, že difúzní koeficient volné difúze může být korelován s teplotou podle Arrheniova vztahu (viz. rovnice 79). 8$ = 5exp *−

Éù

‚1

.

(79)

kde A představuje předexponenciální faktor, EA vyjadřuje aktivační energii, R je univerzální plynová konstanta (8,314 J·K-1·mol-1) a T je termodynamická teplota vyjádřená v Kelvinech. Díky tomuto předpokladu lze vypočítat aktivační energie difúzních procesů methylenové modři ve vodných prostředích. Aktivační energie difúze MB ve vodě byla experimentálně stanovena na 21,4 kJ·mol-1, což je opět v dobré shodně s dříve publikovanou literaturou [184]. Hori a kol. stanovili aktivační energii tohoto procesu jako hodnotu 19,5 kJ·mol-1.

6.4

Transportní procesy v hydrogelech

Pro účely studia reaktivity, bariérových a transportních vlastností zvolených látek byly realizovány difúzní procesy v hydrogelových médiích na bázi agarózy, kde bylo předpokládáno, že nedochází žádným či pouze omezeným specifickým interakcím mezi gelačním médiem (agaróza) a zvolenými difúzními sondami (organická barviva). Tento předpoklad lze jen velmi těžko experimentálně ověřit, ovšem existují některé publikace [186], které se tímto tématem zabývají. Z tohoto důvodu bylo o reaktivitě vybraných látek diskutováno na základě porovnání s čistým referenčním agarózovým hydrogelem. 6.4.1

Agaróza – difúzní cela

Vliv koncentrace a teploty Při optimalizaci studia reaktivity a bariérových vlastností zvolených látek pomocí laboratorních difúzních technik byly v prvé fázi studovány vlivy koncentrace čisté agarózy a teploty na fundamentální difúzní parametry. Těmito základními difúzními parametry jsou míněny následující: Jd představuje difúzní tok, tL reprezentuje čas průchodu, ns je nasorbované množství barviva v hydrogelu, De představuje efektivní difúzní koeficient a konečně Da je zdánlivý difúzní koeficient (viz. rovnice 66). Z níže uvedené Tab. 5 je patrné, že koncentrace agarózy v hydrogelu má významný vliv na transportní procesy methylenové modři. S rostoucí koncentrací agarózy v gelu dochází k poklesu difúzního toku Jd , stejně tak jako k poklesu efektivního (De). Naopak pozoruhodným faktem je, že nedochází k výraznějším změnám v hodnotách času průchodu (tL) a hodnotách zdánlivého difúzního koeficientu (Da). Čas průchodu je tedy na koncentraci agarózy v hydrogelu nezávislý. Pokles výše zmíněných parametrů s rostoucí koncentrací agarózy v gelu je dán především nárůstem počtu řetězců agarózy v objemovém elementu hydrogelu. Řetězce agarózy v hydrogelu představují jakousi neproniknutelnou překážkou, která je nepropenetrovatelná, jak je diskutováno v současném stavu řešené problematiky (viz. kap. 3.1) a z toho důvodu dochází k prodloužení dráhy difundující látky 87

VÝSLEDKY A DISKUZE


(zvýšení vlivu tortuozity), stejně tak jako snížení porozity a proto je nárůst koncentrace methylenové modři v přijímací části difúzní cely pozvolnější. Právě ze směrnice nárůstu koncentrace MB v přijímací difúzní cele lze stanovit jak difúzní tok, tak také efektivní difúzní koeficient. Porovnáme-li vliv koncentrace agarózy v hydrogelu na nasorbované množství (ns), lze si povšimnout, že s rostoucí koncentrací agarózy dochází i k nárůstu nasorbovaného množství. Naopak opačný vliv má teplota. S rostoucí teplotou dochází k poklesu nasorbovaného množství, což je dáno opět vyšší intenzitou Brownova pohybu při vyšší teplotě. Tab. 5: Experimentálně stanovené difúzní parametry pro difúzi methylenové modři přes agarózové hydrogely lišící se svou koncentrací při různých teplotách [134].

wagaróza (hm. %)

1

2

4

T (°C)

Jd×109 (mol·m-2s-1)

tL (hod.)

ns×107 (mol)

De×1010 (m2·s-1)

Da×1010 (m2·s-1)

30

4,39

6,5

4,9

1,42

1,80

40

6,02

2,6

2,9

3,28

4,48

50

8,02

1,7

3,3

3,87

6,66

30

3,83

6,3

9,5

0,64

1,84

40

6,15

2,8

6,1

1,59

4,21

50

7,29

1,9

5,8

1,96

6,07

30

1,73

7,8

13,3

0,20

1,48

40

3,84

2,6

10,7

0,56

4,40

50

6,08

1,5

8,7

1,10

7,63

Aymard a kol. [187] studovali difuzivitu nízkomolekulárních iontů v různě koncentrovaných agarózových hydrogelech. Zjistili, že efektivní difúzní koeficient klesá přímo úměrně s rostoucí koncentrací agarózy v gelu. V našem případě se nejednalo o lineární pokles efektivního difúzního koeficientu, ovšem o pokles exponenciální. V případě nižších koncentrací agarózy v hydrogelu docházelo k prudšímu poklesu efektivního difúzního koeficientu ve srovnání s koncentrovanějšími hydrogely. Difuzivita MB v hydrogelu klesá pozvolněji v důsledku strukturálních a konformačních změn v agarózových hydrogelech, zásadní vliv může mít také velikost difundující látky (MB) ve srovnání s nízkomolekulárními ionty uvedenými níže. Strukturální a konformační změny při gelaci agarózy studovalo několik vědeckých skupin. V publikacích [188], [189] je zmiňován fakt, že s rostoucí koncentrací agarózy v hydrogelu dochází k nárůstu interakcí polymer-polymer, což vede ke vzniku kompaktnější struktury. Právě tato „kompaktnější“ struktura významným způsobem ovlivňuje transportní vlastnosti finálních hydrogelů, včetně difúzního toku a rozdělovacího koeficientu. Pokud porovnáme difúzní charakteristiky získané pro různě koncentrované agarózové hydrogely při různých teplotách, je patrné, že s rostoucí teplotou dochází k nárůstu difúzního toku stejně tak jako efektivního a zdánlivého difúzního koeficientu. V případě

88

VÝSLEDKY A DISKUZE


9,0E-09

30°C

-20,0

0%

8,0E-09

40°C

-20,5

1%

7,0E-09

50°C

-21,0

2%

-21,5

4%

6,0E-09

ln De (a.u.)

Jd (mol·m-2s-1)

času průchodu je tento trend opačný – s rostoucí teplotou dochází k poklesu času průchodu. Tato tvrzení jsou v souladu s teoretickými předpoklady, že difúze je teplotně aktivovaný proces. S rostoucí teplotou dochází k nárůstu Brownova tepelného pohybu částic, což je hlavní činitel, který je zodpovědný za difúzní procesy. Z tohoto důvodu jsou difúzní procesy nejen v hydrogelových médiích rychlejší při vyšší teplotě. Získané difúzní parametry v podobě difúzního toku a efektivního difúzního koeficientu v závislosti na inverzní termodynamické teplotě jsou uvedeny na Obr. 44.

5,0E-09 4,0E-09

-22,0 -22,5 -23,0

3,0E-09

-23,5

2,0E-09

-24,0 -24,5

1,0E-09

-25,0 3,0E-03 3,1E-03 3,2E-03 3,3E-03 3,4E-03 1/T (K-1)

0,0E+00 0

2

4

6

wagaróza (hm. %)

Obr. 44: Závislost difúzního toku pro různě koncentrované agarózové hydrogely při různých teplotách (vlevo) a závislost přirozeného logaritmu efektivního difúzního koeficientu na inverzní termodynamické teplotě (vpravo).

Vypočítané efektivní difúzní koeficienty lze opět vynést do grafu v závislosti na inverzní termodynamické teplotě. Ze směrnice této lineární závislosti (viz. Obr. 44) lze vypočítat aktivační energie difúzních procesů pro různě koncentrované agarózové hydrogely opět podle rovnice 79. V případě 1 hm. % agarózové hydrogelu nabývala tato aktivní energie hodnoty 33,3 kJ·mol-1, u 2 hm. % AG hydrogelu byla 47,6 kJ·mol-1 a u 4 hm. % AG gelu měla hodnotu 53,7 kJ·mol-1. Je tedy patrné, že aktivační energie difúzních procesů roste s rostoucí koncentrací agarózy v gelu a to z toho důvodu, že agarózové řetězce tvoří neprodifundovatelné části gelu, stejně tak díky tomu, že s rostoucí koncentrací agarózy v gelu dochází k poklesu porozity. Hodnota difúzního toku (Jd) je také značně závislá na rozdělovacím koeficientu H, který vyjadřuje rozdíl koncentrace v gelu vůči roztoku a lze vypočítat z množství barviva obsaženého v agarózovém hydrogelu na konci experimentu (rozdíl původní koncentrace ve zdrojové komoře difúzní cely proti součtu koncentrací ve zdrojové a přijímací komoře difúzní cely na konci experimentu), lze jej spočítat podle rovnice 64. Můžeme tedy říci, že rozdělovací koeficient vyjadřuje jak moc se barvivo zakoncentrovává v hydrogelu ve srovnání s původní koncentrací barviva v roztoku. V případě penetrace methylenové modři skrz porézní přepážky ve formě hydrogelů byla pozorována silná parciace (viz. Obr. 45). Toto tvrzení je v souladu s již publikovanou literaturou [153], [154]. Golmohamadi a kol. [153] potvrdili silnou parciaci kademnatých iontů a rhodaminu v agarozóvých 89

VÝSLEDKY A DISKUZE


hydrogelech. V těchto publikacích vysvětlují nárůst rozdělovacího (parciačního) koeficientu díky nespecifickým Donnanovým efektům, které jsou spojeny s nábojem hydrogelu, čili v podstatě se jedná o elektrostatické interakce. Vylučují ovšem jakýkoliv vliv specifických interakcí mezi agarózou a difundujícím médiem, což bylo experimentálně potvrzeno několika metodami. 45

30°C

rozdělovací koeficient (a.u.)

40

40°C

35

50°C

30 25 20 15 10 5 0 0

1

2

3

4

5

wagaróza (hm. %) Obr. 45: Rozdělovací koeficient (H) v závislosti na koncentraci agarózy v hydrogelu pro methylenovou modř.

Alternativní vysvětlení nárůstu rozdělovacího koeficientu spočívá v tom, že teoreticky může docházet ke specifickým chemickým interakcím mezi molekulou difundující látky – methylenová modř a gelotvorným činidlem – agaróza. Na druhou stranu by ovšem specifické interakce mezi AG a MB způsobily prokazatelný nárůst času průchodu MB skrz hydrogel, který by v tomto případě byl závislý na množství vazebných míst. Kdyby tedy docházelo k intenzivním specifickým interakcím mezi AG a MB, počet vazebných míst by se zákonitě musel zvyšovat s rostoucí koncentrací agarózy v hydrogelu. Ovšem jak je patrné z Tab. 5, čas průchodu tL je nezávislý na koncentraci agarózy v hydorogelu. Z tohoto důvodu lze tvrdit, že nedochází k výraznějším specifickým interakcím mezi agarózou a methylenovou modří. Pozvolnější nárůst rozdělovacího koeficientu v závislosti na koncentraci agarózy při vyšších teplotách (50 °C) ve srovnání s 30 °C lze vysvětlit změnou mechanických a strukturních vlastností finálních agarózových hydrogelů, stejně tak i zvýšeným tepelným pohybem částic (Brownův pohyb). Především pak mechanické vlastnosti agarózových hydrogelů budou značně závislé na teplotě, vzhledem k tomu, že elasticita výsledné hydrogelové sítě bude klesat s rostoucí teplotou, alespoň tedy v případě fyzikálních hydrogelů. Rovnice 65 a 66 lze použít pouze za předpokladu, že nedochází k žádným specifickým interakcím mezi AG a MB čili platí, že zdánlivá rovnovážná konstanta Kapp = 0. Vypočítané parametry porozity a tortuozity v závislosti na koncentraci agarózy v hydrogelu při různých teplotách jsou uvedeny na Obr. 47.

90


1,0

30°C

0,9

40°C

0,8

50°C

7 6 5

0,7 tortuozita (a.u.)

efektivní porozita (a.u.)

VÝSLEDKY A DISKUZE

0,6 0,5 0,4 0,3

4 3 2

0,2 1

0,1 0,0

0 0

1

2

3

4

5

0

1

2

3

4

5

wagaróza (hm. %)

wagaróza (hm. %)

Obr. 46: Efektivní porozita agarózových hydrogelů při různých teplotách (vlevo) a tortuozita agarózových hydrogelů lišících se koncentrací (vpravo).

Jak je patrné z výše uvedeného grafu (viz. Obr. 46), efektivní porozita agarózových hydrogelů výrazně klesá s rostoucí koncentrací agarózy v hydrogelu. Tento pokles je způsoben především změnou mechanických vlastností agarózových hydrogelů (viz. kap. 6.2.1) a tedy nárůstem rigidity koncentrovanějších AG gelů, dále pak změnou hustoty a také hydratací agarózových řetězců [190]. Při hydrataci biokoloidních řetězců dochází k nárůstu hydrodynamického poloměru (RH), vzhledem k tomu, že biokoloidní řetězce jsou obaleny molekulami vody a díky tomu zaujímají v objemovém elementu více místa, což způsobuje pokles efektivní porozity. Významný vliv bude hrát také zastoupení respektive koncentrace agarózových řetězců ve finálním hydrogelu. Při vyšších koncentracích budou jednotlivé řetězce blíže k sobě a tím pádem bude volný objem hydrogelu nižší, což způsobí právě nižší pórovitost. Co se týče vlivu teploty, tak ten je patrný pouze u méně koncentrovaných agarózových hydrogelů (4 hm. % AG gel má prakticky stejnou efektivní porozitu při všech zkoumaných teplotách). Zatímco efektivní porozita je značně závislá na koncentraci agarózy ve finálních hydrogelech, tortuozitní faktor (Tm) je na koncentraci agarózy prakticky nezávislý. Tortuozní faktor vyjadřuje, kolikrát se prodlouží dráha difundující substance skrz hydrogelovou matrici ve srovnání s volnou difúzí v roztoku, kde je ve většině případů dráha přímočará. Při 30 °C je tortuozita v agarózových gelech rovna hodnotě 5,0 ± 0,6, což odpovídá tomu, že dráha difundující látky se oproti obyčejné šířce hydrogelu prodlouží přibližně 2,2 krát. Experimentálně stanovený vliv teploty je poměrně značný, jelikož prodloužení aktuální dráhy solutu při vyšší teplotě (50 °C) je pouze 1,5 krát. Vysvětlení nezávislosti tortuozity na koncentraci agarózy ve finálním hydrogelu spočívá pravděpodobně v tom, že s rostoucí koncentrací agarózy sice dochází k poklesu porozity, ovšem v agarózových řetězcích se tvoří „kanálky“, které jsou nezávislé na koncentraci. Z toho důvodu by teoreticky měla být tortuozita při všech teplotách stejná. Ovšem svou roli zde hraje také zvýšený tepelný pohyb částic při vyšší teplotě. Zásadní vliv také může hrát pohyblivost makromolekulárních řetězců agarózy, která se s rostoucí teplotou opět

91

VÝSLEDKY A DISKUZE


zvyšuje. Agaróza coby gelační činidlo sice vytváří síť, tím pádem řetězce jsou pouze omezeně pohyblivé, ovšem stále jsou schopny tepelného pohybu. S rostoucí teplotou tento tepelný pohyb nabývá na intenzitě, čímž se mohou otevírat některé „nové kanálky“ ve výsledných agarózových hydrogelech a právě díky tomuto je pozorován pokles tortuozity s rostoucí teplotou difúzních procesů. 6.4.2

Agaróza – neustálená difúze

Vliv koncentrace a teploty Výše uvedená difúzní metoda – metoda difúzní cely – představuje velmi cenný aparát vhodný pro stanovení transportních charakteristik vybraných látek. Ovšem tato metoda má také několik úskalí. Hlavní nevýhoda spočívá především v tom, že nelze zároveň relevantně kvantifikovat proces parciace mezi gelem a roztokem společně s interakcemi solutu a hydrogelové matrice. Z tohoto důvodu byla navržena také druhá metoda – neustálená difúze v kyvetách, která má napomoci ke stanovení obdobných difúzních parametrů nezbytných pro kvantifikaci difúzních procesů, ovšem z jiného pohledu, se zaměřením především na proces parciace barviva v hydrogelu. Zatímco v případě metody difúzní cely se jedná o ustálený difúzní proces, kde penetrace barviva probíhá skrz celou hydrogelovou přepážku, v případě neustálené difúze v kyvetách probíhá difúze do struktury hydrogelu, ve kterém je aktivní substance homogenně rozptýlena. Takže zatímco v případě metody difúzní cely nejsme schopni usuzovat o tom, co se s difundujícím médiem děje uvnitř hydrogelu, v případě nestacionární difúze v kyvetách už ano. Z koncentračních profilů pro různě koncentrované agarózové hydrogely byly vypočítány fundamentální difúzní parametry v podobě zdánlivého difúzního koeficientu, efektivní porozity, rozdělovacího koeficientu a nově zavedeného parametru koncentrace na rozhraní hydrogel-roztok (cs). Tyto parametry pro různé koncentrace agarózy při různých teplotách pro difúzní procesy realizované ve vodě jsou sumarizovány v Tab. 6 pro methylenovou modř a v Tab. 7 pro rhodamin 6G. Jak je patrné z Tab. 6, s rostoucí koncentrací agarózy v hydrogelech dochází k poklesu efektivního difúzního koeficientu, což je zcela ve shodě s výsledky z difúzních cel (viz. kap. 6.4.1). Naopak v případě nově zavedeného parametru – koncentrace na rozhraní hydrogel-roztok (cs) – který lze dávat do souvislosti s rozdělovacím koeficientem (H) je zřejmé, že s rostoucí koncentrací agarózy dochází k mírnému nárůstu koncentrace cs, stejně jako rozdělovacího koeficientu. Pokles efektivního difúzního koeficientu s rostoucí koncentrací agarózy v gelu je opět vysvětlovaná nespecifickými interakcemi mezi AG řetězci a zvolenou difúzní sondou (MB respektive RH), stejně tak jako změnou mechanických vlastností a především koncentrací řetězců agarózy v hydrogelu. Trend poklesu efektivního difúzního koeficientu je shodný s předešlými měřeními realizovanými v difúzní cele. Rozdíl ovšem nastává tehdy, podíváme-li se na absolutní hodnoty efektivních difúzních koeficientů. Efektivní difúzní koeficienty získané metodou neustálené difúze jsou výrazně vyšší ve srovnání s metodou difúzní cely. Vysvětlení inkriminovaného rozdílu může být následující: zatímco v difúzní cele jsou zdánlivé difúzní koeficienty počítány nepřímo z času průchodu (tL) potřebného pro penetraci difúzní sondy skrz hydrogelovou matrici definované tloušťky, v případě experimentů realizovaných

92

VÝSLEDKY A DISKUZE


v kyvetách lze pozorovat časový vývoj koncentračních profilů po dlouhou dobu a opakovaně, vzhledem k tomu, že nedochází ke změně koncentračního gradientu ve zdrojovém roztoku (koncentrace zdrojové difúzní sondy je udržována po celou dobu na konstantní hodnotě buď tak, že je difúze realizována v nasyceném roztoku a nebo přídavkem zdrojového difúzního média v průběhu experimentu), což významným způsobem redukuje možnou experimentální chybu stanovení. Z tohoto důvodu jsou nestacionární difúzní metody realizované v kyvetách vhodnější metodou pro popis té části difúzních procesů, kde dochází k sorpci a penetraci barviva skrz porézní přepážku ve srovnání s metodou difúzní cely. Tab. 6: Efektivní difúzní koeficient, koncentrace na rozhraní hydrogel-roztok, rozdělovací koeficient a efektivní porozita pro agarózové hydrogely při různých teplotách (jako difúzní sonda použita MB)

wagaróza (hm. %)

1

2

4

T (°C)

De×1010 (m2·s-1)

cs (g·dm-3)

H (a.u.)

úûüü (a.u.)

30

5,58 ± 0,88

0,015 ± 0,003

1,5 ± 0,3

1,50 ± 0,34

40

7,79 ± 0,60

0,030 ± 0,004

3,0 ± 0,4

3,04 ± 0,38

50

8,39 ± 0,77

0,027 ± 0,004

2,7 ± 0,4

2,65 ± 0,38

30

5,01 ± 0,28

0,021 ± 0,001

2,1 ± 0,1

4,28 ± 0,23

40

6,64 ± 0,12

0,045 ± 0,007

4,5 ± 0,7

9,55 ± 1,40

50

7,68 ± 1,32

0,053 ± 0,018

5,3 ± 1,8

10,59 ± 3,52

30

4,04 ± 0,57

0,032 ± 0,006

3,2 ± 0,6

6,47 ± 1,15

40

4,23 ± 0,22

nelze stanovit

nelze stanovit

nelze stanovit

50

6,77 ± 1,04

nelze stanovit

nelze stanovit

nelze stanovit

V některých případech, především pak u 4 hm. % agarózového hydrogelu, byly difúzní parametry stanoveny s poměrně vysokou chybou či nemohly být stanoveny vůbec (viz. koncentrace na rozhraní hydrogel-roztok v případě 4 hm. % agarózového hydrogelu při teplotách 40 a 50 °C). Bohužel, koncentrace na rozhraní hydrogel-roztok byla v tomto případě tak vysoká, že nebylo schopné ji detekovat pomocí použité analytické metody (UV-VIS spektrofotometrie). V jiných případech, například u 2 hm. % agarózového hydrogelu při 40 °C byly detekovány vysoké koncentrace na rozhraní hydrogel-roztok, což zapříčinilo také poměrně vysoké hodnoty rozdělovacího koeficientu a efektivní porozity. Tento fakt může být způsoben změnou mechanických vlastností hydrogelových matric (viz. kap. 6.2.1). Stejně jako v předešlých případech, se neočekává jakákoliv specifická interakce mezi AG a difúzními sondami, proto veškeré změny v difúzních charakteristikách AG gelů jsou dány změnou strukturálních a texturních vlastností, respektive vlivem měnící se tortuozity, porozity či rozdělovacího koeficientu případně vlivem koncentrace.

93

VÝSLEDKY A DISKUZE


Stejné trendy ve fundamentálních difúzních parametrech byly zaznamenány také pro druhou difúzní sondu – rhodamin 6G. Tyto výsledky jsou sumarizovány v níže uvedené tabulce (viz. Tab. 7). Tab. 7: Efektivní difúzní koeficient, koncentrace na rozhraní hydrogel-roztok, tortuozita a efektivní porozita pro agarózové hydrogely při různých teplotách (jako difúzní sonda použit RH)

wagaróza (hm. %)

1

2

4

T (°C)

De×1010 (m2·s-1)

cs (g·dm-3)

H (a.u.)

úûüü (a.u.)

30

4,59 ± 0,29

0,024 ± 0,004

2,4 ± 0,4

4,78 ± 0,75

40

6,59 ± 0,25

0,028 ± 0,004

2,8 ± 0,4

5,69 ± 0,86

50

9,52 ± 0,59

0,023 ± 0,005

2,3 ± 0,5

4,67 ± 1,00

30

3,50 ± 0,37

0,035 ± 0,006

3,5 ± 0,6

6,95 ± 1,23

40

5,54 ± 0,33

0,047 ± 0,007

4,7 ± 0,7

9,45 ± 1,47

50

7,25 ± 0,56

0,039 ± 0,008

3,9 ± 0,8

7,83 ± 1,56

30

3,15 ± 0,37

0,086 ± 0,016

8,6 ± 1,6

8,63 ± 1,62

40

4,35 ± 0,29

0,120 ± 0,018

12,0 ± 1,8

24,06 ± 3,63

50

6,15 ± 1,35

0,080 ± 0,036

8,0 ± 3,6

15,95 ± 7,19

Pro hlubší porozumění významu zdánlivého difúzního koeficientu, byly získané hodnoty těchto koeficientů v agarózových hydrogelech při různých teplotách porovnány s hodnotami difúzního koeficientu volné difúze (D0), který byl získán metodou difúzních cel při penetraci vybraných organických barviv skrz syntetické membrány (viz. Tab. 8) při všech experimentálních nastaveních (teplota, iontová síla, pH). Získané hodnoty difúzních koeficientů volné difúze pro methylenovou modř jsou v dobré shodě s dříve publikovanou literaturou [183]. Na rozdíl od difúzních koeficientů pro rhodamin 6G, kde se tyto difúzní koeficienty od literatury [191] odlišují. Tato odlišnost může být připsána efektu vysoké koncentrace, vzhledem k tomu, že při takových koncentracích, jaké byly použity v této dizertační práci, může docházet k agregaci této difúzní sondy [192], což je u výše uvedeného literárního zdroje [191] vyloučeno, vzhledem k tomu, že pracovali s řádově mnohem nižšími koncentracemi. Při porovnání rozdělovacího koeficientu je očividné, že u 1 hm. % agarózového hydrogelu při 30 °C je distribuce MB coby, difúzního média, téměř rovnoměrná mezi hydrogelem a roztokem (H = 1,5), zatímco v případě rhodaminu 6G dochází k výraznějšímu nárůstu koncentrace barviva v hydrogelu (H = 2,4). Ve většině případů hodnota rozdělovacího koeficientu nepřesáhla hodnotu 10, s výjimkou 4 hm. % agarózového gelu při 40 °C (RH). Tyto výsledky jsou v dobré shodě s již publikovanou literaturou. Fatin-Rouge a kol. [154] studovali parciaci barviva rhodamin 6G v 1 hm. % agarózovém hydrogelu. Rozdělovací koeficient stanovili v rozmezí 1-4 podle toho, v jakém prostředí byly difúzní procesy realizovány (vliv pH). Také v publikaci [129] stanovili rozdělovací koeficienty v agarózových hydrogelech v rozmezí 1-10.

94

VÝSLEDKY A DISKUZE


Tab. 8: Hodnoty difúzního koeficientu volné difúze pro methylenovou modř a rhodamin 6G při proměnných experimentálních podmínkách (pH, teplota a iontová síla).

IS

T -3

(mol·dm )

voda

0,01

0,20

(°C)

pH

methylenová modř 10

2 -1

rhodamin 6G

D0×10 (m ·s )

D0×1010 (m2·s-1)

30

-

9,66 ± 0,08

9,94 ± 0,02

40

-

12,95 ± 0,01

11,84 ± 0,05

50

-

16,41 ± 0,07

14,44 ± 0,05

30

3

8,74 ± 0,05

7,45 ± 0,05

30

7

7,34 ± 0,23

6,07 ± 0,01

30

11

9,20 ± 0,62

6,25 ± 0,04

30

3

8,88 ± 0,02

6,98 ± 0,01

30

7

8,50 ± 0,09

7,12 ± 0,03

30

11

11,24 ± 0,06

6,90 ± 0,03

Při porovnání difúzních koeficientů volné difúze a zdánlivého difúzního koeficientu stanoveného pro agarózové hydrogely je patrné, že difuzivita obou barviv je v hydrogelech velmi podobná difuzivitě ve vodě. Tento fakt opět potvrzuje tvrzení, že agarózové hydrogely jsou vhodné materiály pro studium reaktivity vybraných látek, jelikož neprojevují výraznější specifické interakce se zvolenými difúzními sondami v porovnání s malým přídavkem biokoloidní látky, jak bude diskutováno níže. Změna difúzních charakteristik je tedy dána pouze změnou strukturálních a texturních vlastností hydrogelů. Závěrem lze tedy říci, že obě zkoumaná kationaktivní barviva (methylenová modř i rhodamin 6G) se významným způsobem neliší v parciaci či transportních procesech v hydrogelových médiích (opět ve srovnání s malým přídavkem biokoloidu), což indikuje, že změny ve fundamentálních difúzních charakteristikách jsou výsledkem celkového náboje molekuly a rozdílné strukturální parametry jako jsou molekulová hmotnost či tvar molekuly nehrají žádnou zásadní roli, alespoň tedy v případě difúzních procesů realizovaných v čistém agarózovém hydrogelu bez přídavku zvoleného biokoloidu či jiné syntetické látky. 6.4.3

Lignitické huminové kyseliny – difúzní cela

Vliv koncentrace a teploty Prvními přírodními látkami, jejíž reaktivita byla zkoumána pomocí metody difúzní cely, byly lignitické huminové kyseliny izolované z jihomoravského lignitu. Malý přídavek LHK v porovnání s množstvím agarózy v gelu (maximální přídavek LHK byl 100 krát nižší v porovnání s koncentrací agarózy v hydrogelu) zcela zásadním způsobem ovlivňuje difuzivitu vybraných organických barviv a zároveň i bariérové schopnosti těchto směsných agarózových a huminových gelů. Stejně jako u vlivu koncentrace agarózy, i v tomto případě dochází k nárůstu nasorbovaného množství MB respektive RH v agarózovém

95

VÝSLEDKY A DISKUZE


hydrogelu v závislosti na rostoucí koncentraci LHK. Tento nárůst je natolik razantní, že lze zcela jistě vyloučit, že by mohl být způsoben pouze zvýšením pevného podílu ve finálním hydrogelu. Zcela zásadně se zvyšuje také druhý parametr rozhodující o difúzních procesech v difúzních celách – čas průchodu (tL). I v tomto případě dochází k výraznému nárůstu času průchodu, kdy tento nárůst je úměrný zvyšující se koncentraci LHK v gelu. Na druhou stranu, hodnota difúzního toku (Jd) signifikantně klesá s rostoucí koncentrací LHK v 1 hm. % agarózovém hydrogelu. Změna těchto základních difúzních parametrů je dána intenzivními interakcemi mezi kladně nabitými difúzními sondami (MB a RH) a celkově záporně nabitými lignitickými huminovými kyselinami. Charakter těchto interakcí bude diskutován dále. 0,000 hm. % LHK

0,002 hm. % LHK

0,005 hm. % LHK

0,010 hm. % LHK

4,0E-06

5,0E-06

koncentrace RH (mol·dm-3)

koncentrace MB (mol·dm-3)

5,0E-06

3,0E-06

2,0E-06

1,0E-06

4,0E-06

3,0E-06

2,0E-06

1,0E-06

0,0E+00

0,0E+00 0

10

20

30

0

čas (hod.)

10

20

30

čas (hod.)

Obr. 47: Časová závislost koncentrace difúzní sondy (methylenová modř – vlevo, rhodamin 6G – vpravo) pro 1 hm. % AG gel s proměnným přídavkem LHK.

Základní parametry v podobě času průchodu a efektivního difúzního koeficientu byly vypočítány z časových vývojů koncentrace vybrané difúzní sondy v přijímací části difúzní cely (viz. Obr. 47). Efektivní difúzní koeficient charakterizuje ustálenou difúzi barviva do přijímací komory difúzní cely, čili až tu část difúze, kdy barvivo propenetruje skrz porézní přepážku ve formě hydrogelu. Z tohoto důvodu by neměla být hodnota efektivního difúzního koeficientu ovlivněna jakýmikoliv specifickými interakcemi mezi difundujícím solem a aktivní látkou v hydrogelu, vzhledem k tomu, že ustálená difúze přichází na řadu až tehdy, když je ustanovena dynamická rovnováha mezi difundující látkou a hydrogelem. Proto lze uvažovat, že difúzní koeficient bude zcela nezávislý na malém přídavku aktivní látky. Toto tvrzení ovšem není zcela pravdivé, vzhledem k tomu, že malé nuance byly v případě závislosti efektivního difúzního koeficientu na proměnném množství huminových kyselin v AG gelu prokázány (viz. Tab. 9 a Tab. 10). Stejně tak jako ve srovnání efektivního difúzního koeficientu pro čistý agarózový hydrogel a hydrogel s přídavkem HK. Jak je patrné z Obr. 47, s rostoucí koncentrací LHK v AG gelu dochází k poklesu směrnice nárůstu koncentrace vybraného organického barviva v přijímací části difúzní cely. Právě strmost tohoto nárůstu koncentrace je základním parametrem, který rozhoduje 96

VÝSLEDKY A DISKUZE


o difúzním toku (Jd), z kterého jsou následně počítány efektivní difúzní koeficienty (viz. Tab. 9 a Tab. 10). Tab. 9: Experimentálně stanovené difúzní parametry pro difúzi methylenové modři přes 1 hm. % agarózový hydrogel s přídavkem lignitických huminových kyselin při různých teplotách.

wLHK (hm. %)

0,000

0,002

0,005

0,010

T (°C)

Jd×109 (mol·m-2s-1)

tL (hod.)

ns×107 (mol)

De×1010 (m2·s-1)

Da×1010 (m2·s-1)

30

4,39

6,4

4,9

1,42

1,80

40

6,02

2,6

2,9

3,28

4,48

50

8,02

1,7

3,3

3,87

6,66

30

4,11

7,5

6,6

1,39

1,55

40

5,64

3,6

5,7

3,68

3,22

50

6,50

2,2

5,7

3,70

5,31

30

2,76

11,2

7,6

1,11

1,03

40

5,40

4,7

7,9

4,22

2,44

50

6,87

3,7

8,6

4,94

3,11

30

1,73

17,2

10,5

0,76

0,57

40

2,88

8,3

9,6

2,62

1,40

50

6,95

4,8

10,5

6,03

2,42

K prokazatelnému nárůstu s rostoucí koncentrací huminových kyselin v gelu dochází také v případě nasorbovaného množství barviva v hydrogelu po ukončení experimentu. Lze tedy tvrdit, že minimální přídavek aktivní substance v podobě lignitických huminových kyselin výrazným způsobem zvyšuje sorpční kapacitu (respektive sumu nasorbovaného a volného barviva v gelu) agarózových hydrogelů u obou barviv, jak je patrné z Tab. 9 a Tab. 10. Tab. 10: Experimentálně stanovené difúzní parametry pro difúzi rhodaminu 6G přes 1 hm. % agarózový hydrogel s přídavkem lignitických huminových kyselin při 30 °C.

wLHK

T

Jd×109

tL

ns×107

De×1010

Da×1010

(hm. %)

(°C)

(mol·m-2s-1)

(hod.)

(mol)

(m2·s-1)

(m2·s-1)

0,000

30

2,64

4,8

3,9

1,05

2,39

0,002

30

1,29

6,7

6,5

0,80

1,73

0,005

30

1,20

8,3

6,7

0,71

1,39

0,010

30

1,05

13,9

5,2

0,50

0,83

97

VÝSLEDKY A DISKUZE


Pozitivní interakce mezi LHK a difúzními sondami v podobě organických barviv je tedy zřejmá z uvedených průchodových křivek již na první pohled. Otázkou ovšem zůstává, jaký charakter mají tyto interakce a jaký je mechanismus sorpce barviv na huminové kyseliny obsažené v agarózovém hydrogelu. Pro vysvětlení povahy inkriminovaných interakcí můžeme uvažovat následující model: jedná se o reverzibilní sorpci, kterou lze vystihnout schématem (viz. rovnice 60) MBvolná ↔ MBvazaná, případně RHvolná ↔ RHvázaná,

(60)

čili očekáváme, že nastane rovnováha mezi barvivem navázaným na LHK a barvivem schopným difundovat skrz hydrogel do přijímací komory difúzní cely. Tento předpoklad lze uvažovat tehdy, jedná-li se o velmi rychlý proces v porovnání s difúzí barviva, což je v tomto případě splněno a také tehdy, pokud sorbent (LHK) obsahuje velké množství funkčních skupin, které jsou schopny se podílet na sorpčních procesech. Samotné reakce (mechanismy) jsou splněny tehdy, pokud se jedná o reakce 1. Řádu v obou směrech (nesmí vznikat žádné vedlejší produkty). Podmínka lokální rovnováhy je splněna tehdy, pokud je reakce velmi rychlá v porovnání s difúzí. Druhý předpoklad je splněn pro systémy obsahující funkčních skupiny, které jsou v celém objemovém elementu distribuovány homogenně (jako v případě agarózových hydrogelů s přídavkem LHK). Pokud jsou tyto předpoklady splněny, lze z modelu vázaného a volného barviva vypočítat zdánlivou rovnovážnou konstantu reverzibilních sorpčních procesů (Kapp) podle rovnice 67. Z grafů na Obr. 48 je patrné, že s rostoucí koncentrací LHK v agarózových hydrogelech dochází také k nárůstu zdánlivé rovnovážné konstanty, kterou lze vyjádřit jako poměr koncentrací vázaného barviva a volného barviva, kterému je umožněna difúze. Patrný je také vliv teploty, vzhledem k tomu, že pokud porovnáme Kapp pro AG hydrogel s konstantním přídavkem LHK, lze pozorovat znatelný nárůst absolutní hodnoty zdánlivé rovnovážné konstanty. Tím pádem lze tedy tvrdit, že teplota má pozitivní vliv na afinitu LHK vůči zvoleným organickým barvivům a tedy na samotné sorpční procesy. Právě díky tomuto tvrzení jsme schopni určit, že povaha těchto interakcí je endotermního charakteru. Fernandes a kol. [193] studovali sorpci methylenové modři na rašelinu bohatou na huminové kyseliny. Ověřili, že rovnovážná konstanta sorpce roste se zvyšující se teplotou. Nárůst zdánlivé rovnovážné konstanty může být způsoben tím, že funkční skupiny LHK jsou při vyšších teplotách dostupnější pro interakci s MB. Pokud porovnáme absolutní hodnoty zdánlivé rovnovážné konstanty pro obě barviva při 30 °C, je patrné, že LHK disponují vyšší afinitou k methylenové modři, vzhledem k tomu, že směrnice nárůstu zdánlivé rovnovážné konstanty je v případě methylenové modři vyšší ve srovnání s rhodaminem 6G. Tento fakt může být způsoben strukturními rozdíly u zkoumaných barviv, případně také mírně odlišnou molekulovou hmotností či nižší schopností disociace v případě RH.

98

VÝSLEDKY A DISKUZE 3,5

Fakulta chemická, VUT v Brně 0,2

30 °C

30 °C

40 °C

3,0

50 °C Kapp RH (a.u.)

Kapp MB (a.u.)

2,5 2,0 1,5

0,1

1,0 0,5 0,0

0,0 0

0,005 koncentrace LHK (hm. %)

0,01

0


0,01

Obr. 48: Zdánlivá rovnovážná konstanta (Kapp) pro 1 hm. % AG gely s přídavkem LHK. Vlevo – methylenová modř při teplotě 30, 40 a 50 °C, vpravo – rhodamin 6G, pouze při teplotě 30 °C.

Závěrem lze tedy říci, že experimentální výsledky poměrně jasně ilustrují efekt interakcí huminových kyselin s vybranými organickými barvivy. Bylo ověřeno, že i malý přídavek LHK výrazným způsobem mění transportní a bariérové vlastnosti AG hydrogelů (transport kladně nabitých organických barviv je signifikantně zpomalován). Změna transportních a bariérových vlastností je dána především specifickou interakcí MB respektive RH a LHK, kterou lze vyjádřit pomocí zdánlivé rovnovážné konstanty. Podrobnější informace o studiu reaktivity LHK v agarózových hydrogelech formou difúzních procesů lze nalézt v literatuře [134]. Vliv modifikace huminových kyselin Pozitivní afinita huminových kyselin vůči opačně nabitým sloučeninám (např. ionty těžkých kovů, polutanty, organická barviva, apod.), je běžně připisována funkčním skupinám ve struktuře huminových kyselin, především pak kyselého charakteru. Liu a Gonzalez [178] ověřili, že právě přítomnost kyselých funkčních skupin má významný vliv na reaktivitu HK vůči hydrofilním látkám. Guan a kol. [179] zjistili, že funkční skupiny kyselého charakteru mají také zásadní vliv při interakci s povrchy. Hlavní pozornost je věnována především mechanismu interakcí huminových kyselin s nízkomolekulárními látkami amfifilního charakteru (kombinace hydrofility a hydrofobity), například nabitými aromatickými soluty s postranními řetězci. Tento fakt reprezentuje základní aspekt environmentální povahy huminových látek v jejich přirozeném prostředí, protože valná většina látek (pesticidy, růstové retardanty případně odpadové průmyslové materiály – surfaktanty, barviva, apod.) jsou amfifilního charakteru. Senesi a kol. [194] studovali adsorpční mechanismus atrazinů a herbicidů s huminovými kyselinami kombinací spektrofotometrických metod. Výsledky této práce naznačují interakci mezi HK a herbicidy různého charakteru (iontová, přenos náboj, slabé vazebné interakce, atd.). Iglesias a kol. [195] studovali vliv pH a iontové síly na schopnost

99

VÝSLEDKY A DISKUZE


imobilizace kyselých pesticidů pomocí fulvinových a huminových kyselin. Interakce v tomto případě popsali jako elektrostatického charakteru. Výše uvedená fakta jsou hlavní motivací pro objasnění povahy interakcí mezi HK a vybranými organickými barvivy, používanými v rámci této dizertační práce jako modelové kationaktivní látky. Z toho důvodu byl studován vliv karboxylové kyselosti na reaktivitu huminových kyselin tím způsobem, že byly karboxylové skupiny selektivně blokovány díky modifikaci huminových kyselin trimetylsilyldiazometanem, který je schopen selektivně nametylovat pouze karboxylové funkční skupiny. Pozitivní metylace huminových kyselin již byla potvrzena v předešlých kapitolách (viz. kap. 6.1.2 a 6.1.4). Reaktivita a schopnost interakce nativních a modifikovaných huminových kyselin byla opět porovnávána pomocí fundamentálních difúzních parametrů v podobě difúzního toku (viz. Obr. 49), dále také pomocí zdánlivého difúzního koeficientu (viz. Obr. 50) a konečně také díky času průchodu prvotního barviva do příjímací části difúzní cely (viz. Obr. 51). 5

4,5

5 LHK 3,6

MHK

3,5

2,4

3

1,8

1,8 2

1,5

4 Jd×109 (mol·m2·s-1)

Jd×109 (mol·m2·s-1)

4

1

3

2

2,7

1,6 1,3

1,3 1,3

1,3 1,1

1

0

0 0 0,002 0,005 0,01 hmotnostní koncentrace HK (hm. %)

0 0,002 0,005 0,01 hmotnostní koncentrace HK (hm. %)

Obr. 49: Difúzní tok pro AG hydrogely s různým přídavkem LHK respektive MHK. Vlevo – methylenová modř, vpravo – rhodamin 6G.

Obr. 49 zobrazuje závislost difúzního toku difúzních sond pro 1 hm. % agarózový hydrogel s přídavkem lignitických, případně metylovaných lignitických huminových kyselin. Huminové kyseliny byly homogenně dispergovány v AG hydrogelu v rozmezí koncentrací 0,002 – 0,010 hm. %, což je zanedbatelné množství v porovnání s AG. Bylo ověřeno, že žádným způsobem neovlivňovaly výsledné fyzikálně-chemické vlastnosti hydrogelu (např. mechanické vlastnosti), což bylo potvrzeno v kap. 6.2.1. Díky tomuto lze tvrdit, že změny difúzních toků vyvolané přítomností různého množství huminových kyselin budou dány pouze pozitivní interakcí mezi HK a difndujícími barvivy. Dle výše uvedených teoretických předpokladů lze očekávat, že transportní vlastnosti agarózových hydrogelů s modifikovanými (metylovanými) huminovými kyselinami budou významným způsobem odlišné od difúzních charakteristik pro LHK. Pokud porovnáme experimentálně stanovený difúzní tok barviva v přijímací části difúzní cely (viz. Obr. 49), je patrné, že v případě MHK sice dochází k mírnému nárůstu Jd ve srovnání s nativními

100

VÝSLEDKY A DISKUZE


LHK, ovšem tento nárůst není natolik signifikantní, jako jsme očekávali. Nárůst difúzního toku pro MHK se pohyboval v rozmezí 9 – 25 % ve srovnání s difúzním tokem pro LHK v případě methylenové modři. Stejný trend byl pozorován i u druhého zkoumaného barviva. I v tomto případě byl zaznamenán mírný nárůst difúzního toku při porovnání MHK s LHK. Tento nárůst se pohyboval v rozmezí 16 – 19 % ve srovnání s difúzním tokem pro LHK. I v případě zdánlivého difúzního koeficientu je pozorovatelný mírný nárůst Da pro MHK ve srovnání s LHK, což opět svědčí o tom, že transport barviva do přijímací části difúzní cely je nepatrně intenzivnější. Ovšem ani v tomto případě není tento nárůst natolik signifikantní, vzhledem k tomu, že veškeré změny v difúzních parametrech jsou pouze v rámci chybových úseček. LHK

4

4

MHK 2,9 3 2,0 2,1 2

1,4 1,3 1,0

Da×1010 (m2·s-1)

Da×1010 (m2·s-1)

3

2,4 2,1

2

1,7

1,5 1,4

1,3 0,8

0,8 1

1

0



Obr. 50: Zdánlivé difúzní koeficienty (Da) pro AG gely s přídavkem LHK respektive MHK. Vlevo – methylenová modř, vpravo – rhodamin 6G.

Pokud uvážíme fakt, že téměř veškeré karboxylové skupiny, dostupné pro interakci s difundujícími látkami, byly selektivně obsazeny metylovými skupinami (-CH3), což bylo experimentálně ověřeno v dřívejších kapitolách (viz. kap. 6.1.2 a 6.1.4), lze tedy tvrdit, že přítomnost karboxylových skupin ve struktuře huminových kyselin má minoritní vliv na imobilizaci či ovlivnění penetrace organických barviv skrz materiály obsahující huminové kyseliny. Charakter interakcí tedy nebude pouze elektrostatického charakteru a pozitivní afinita huminových kyselin vůči katioaktivním látkám nebude dána pouze schopností transformace karboxylových funkčních skupin do nedisociované formy po interakci s kladně nabitou látkou. Významnou roli bude hrát především specifický povrch, jak již bylo diskutováno v kap. 6.1.3. Z těchto výsledků tedy můžeme dedukovat, že jiné strukturální jednotky v huminových kyselinách budou hrát taktéž důležitou roli při interakci s opačně nabitými látkami. Toto tvrzení je v souladu například s odborným článkem publikovaným Maszkowska a kol. [196], kteří prováděli termodynamické kalkulace sorpčních procesů modelových farmaceutických látek na půdě. Výsledky této práce naznačují, že pro organické látky kationaktivního charakteru hrají významnou roli vazebné interakce jiného typu než iontově-výměnné (například slabé vazebné interakce – 101

VÝSLEDKY A DISKUZE


vodíkové můstky, van der Waalsovy síly, apod.). Vliv jiných strukturních jednotek na reaktivitu huminových kyselin studovali také například Zanini a kol. [197], kteří prokázali silnou interakci huminových kyselin s oxazinovými barvivy, která nebyla elektrostatického charakteru. Z níže uvedeného grafu (viz. Obr. 51) je patrné, že s rostoucí koncentrací huminových kyselin v AG hydrogelu (nehledě na to, zda se jedná o nativní či modifikované huminové kyseliny), dochází k nárůstu času průchodu pro obě zvolená barviva. Tento nárůst je v případě nativních huminových kyselin více než trojnásobný ve srovnání s čistým agarózovým hydrogelem, který byl používán jako reference. U metylovaných huminových kyselin čas průchodu stoupá pozvolněji, což svědčí o tom, že rychlost penetrace skrz AG hydrogel s přídavkem modifikovaných huminových kyselin je nižší ve srovnání s lignitickými. Lze tedy tvrdit, že kyselé karboxylové skupiny zpomalují penetraci organických barviv díky interakci s funkčními skupinami ve struktuře barviva, ale jak již bylo diskutováno výše, tento rozdíl není natolik signifikantní, jak jsme očekávali. Pro druhé použité barvivo – rhodamin 6G – byly pozorovány prakticky stejné tendence nárůstu času průchodu. Zatímco v případě čistého AG gelu došlo k propenetrování barviva za 4,8 hodin, v případě nejvyšší koncentrace huminových kyselin (0,01 hm. %) byl čas stanoven na 13,9 hodin u LHK respektive 9,5 hodin u MHK. 14,5 11,3

čas průchodu (hod.)

MHK 9,0 10

9,5 8,2

5,9 5,9 5

13,9

15

LHK

4,0

čas průchodu (hod.)

15

0

8,3 7,7

10 6,7 5,5 4,8 5



Obr. 51: Čas průchodu zvolených barviv přes AG hydrogely s různým přídavkem LHK respektive MHK. Vlevo – methylenová modř, vpravo – rhodamin 6G.

Rozšíření výše uvedené diskuze a potvrzení výsledků z difúzních cel lze nalézt v kap. 6.4.4, kde byly provedeny obdobné experimenty se stejnými typy huminových kyselin i barvivy ovšem formou neustálených difúzích procesů v kyvetách. Závěrem této kapitoly lze říci, že karboxylové skupiny mají svou roli ve schopnosti huminových kyselin interagovat s kationaktivními látkami, ovšem jak již bylo prokázáno a diskutováno výše, tento vliv není natolik průkazný.

102

VÝSLEDKY A DISKUZE

6.4.4


Lignitické huminové kyseliny – neustálená difúze

Výše uvedená metoda studia reaktivity huminových kyselin je vhodná pro stanovení difúzních toků a ověření schopnosti difundující látky propenetrovat skrz porézní přepážku v podobě AG hydrogelu. Hlavní nevýhoda této metody spočívá v tom, že neposkytuje informace o tom, co se s difundující látkou děje uvnitř hydrogelu. Z tohoto důvodu byla provedena také série experimentů s lignitickými huminovými kyselinami i druhou metodou studia reaktivity vybraných látek založenou opět na difúzních procesech – neustálenou difúzí v kyvetách. V tomto případě jsme schopni posoudit například to, jakým způsobem penetrují organická barviva do struktury AG hydrogelů a do jaké míry ovlivňuje přídavek huminových kyselin právě rychlost a intenzitu této penetrace (obdobou v difúzní cele je čas průchodu). Další výhoda této metody spočívá v tom, že penetrace barviv do hydrogelů je studována pomocí nedestruktivních spektrofotometrických metod, kde se s výhodou využívá vlastnosti organických barviv absorbovat světlo o určité vlnové délce a tím pádem jsme schopni pomocí jednoduché UV-VIS metody, která je rutině používána v laboratořích, stanovovat základní penetrační vlastnosti. Navíc navržené metody mohou být použity pro široké spektrum modelových hydrogelů a solutů, což je i potvrzeno v literatuře uvedené dále. Dunmire a kol. [198] navrhli a následně také optimalizovali metodu analýzy molekulového transportu několika vybraných molekul do struktury hydrogelů, především s ohledem na cílenou distribuci léčiv. Tyto metody byly opět založeny na UV-VIS spektrofotometrii. Podobné techniky stanovení difúze solů v transparentních gelech byly použity také pro farmaceutické látky [199] a [200]. Studován byl nejen vliv koncentrace, teploty a modifikace, jako tomu bylo v případě difúzních cel, ale také vliv pH a iontové síly na reaktivitu a bariérové vlastnosti huminových kyselin. Pro studium reaktivity těchto biokoloidních látek byla opět použita stejná organická barviva (MB a RH) jako v případě experimentů realizovány v difúzní cele. Vliv koncentrace a teploty Matematický aparát pro kvantifikaci difúzních procesů je uveden v kap. 5.5.5. Experimentálně stanovené koncentrační profily (vývoj koncentrace vybraného organického barviva v závislosti na vzdálenosti od rozhraní hydrogel-roztok) byly následně porovnávány s teoretickou funkcí a na základě tohoto porovnání byly stanoveny základní difúzní parametry. Významný vliv huminových kyselin na finální transportní vlastnosti agarózových hydrogelů byl ověřen již v předešlé kapitole. I v případě neustálené difúze v kyvetách docházelo k rozsáhlým změnám ve schopnosti penetrace vybraných organických barviv do struktury hydrogelu v závislosti na rozdílném množství huminových kyselin. Rozdíl v penetrovatelnosti methylenové modři vystihuje fotografie (viz. Obr. 52). Vizuálním porovnáním je patrné, že přídavek HK zpomaluje transport MB do struktury gelu. Zatímco v případě čistého agarózového gelu propenetrovala methylenová modř přibližně do poloviny výšky kyvety s gelem, v případě AG gelu s 0,010 hm. % (vpravo) byla tato penetrace značně zbrzděna. Z níže uvedených koncentračních profilů (viz. Obr. 53) pro hydrogely o stejné koncentraci agarózy, lišící se pouze přídavkem LHK je patrné, že minimální přídavek 103

VÝSLEDKY A DISKUZE


huminových kyselin zcela zásadním způsobem ovlivňuje charakter koncentračního profilu a zpomaluje penetraci barviva do AG hydrogelu. Dalším zajímavým faktem je koncentrace na rozhraní hydrogel-roztok. Jak již je patrné také z výše uvedené fotografie, přídavek HK způsobuje signifikantní nárůst koncentrace barviva na rozhraní hydrogel-roztok, což se také významným způsobem podepíše na hodnotách rozdělovacího koeficientu. Tyto předpoklady jsou potvrzením výsledků dosažených v difúzních celách (viz. kap. 6.4.3).

Obr. 52: Difúze MB do struktury 1 hm. % AG hydrogelu s přídavkem LHK po 72 hodinách. Přídavek LHK zleva: 0,000 hm. %, 0,002 hm. %, 0,005 hm. % a 0,010 hm. %. Vždy po dvou vzorcích.

Z těchto koncentračních profilů byly následně vypočítány hodnoty zdánlivého difúzního koeficientu (Da), rozdělovacího koeficientu (H) a také zdánlivé rovnovážné konstanty (Kapp). Hodnoty zdánlivých difúzních koeficientů výrazně klesající s narůstajícím množstvím LHK v hydrogelu (viz. Obr. 54). Tyto poklesy mohou být vysvětleny třemi způsoby: 1) přídavkem huminových kyselin k AG gelů narůstá množství pevné fáze ve finálním produktu, tím pádem se zvyšuje vliv tortuozity. Na druhou stranu, přídavek huminových kyselin je v maximální hodnotě 0,010 hm. %, což sice ovlivňuje tortuozní faktor, ovšem ne natolik, aby docházelo k tak rapidním změnám ve transportu vybraného barviva. 2) změna v difuzivitě organických barviv může být způsobena změnou mechanických vlastností agarózových hydrogelů po přídavku HK – ovšem i tento předpoklad byl vyvrácen, vzhledem k tomu, že přídavek HK do struktury gelu významnějším způsobem neovlivňuje viskoelastické vlastnosti hydrogelů, jak bylo ověřeno v kap. 6.2.1. 3) rozdílnost v transportu difúzních sond je dána specifickou interakcí mezi huminovými kyselinami a organickými barvivy. Právě bod 3) se jeví jako jediné schůdné vysvětlení, proč dochází k poklesu mobility organických barviv skrz hydrogelové matrice s přídavkem aktivní látky, vzhledem k tomu, že vliv ostatních zmíněných parametrů je zanedbatelný.

104

VÝSLEDKY A DISKUZE

koncentrace (g·dm-3)

0,05 0,04

0,02

0,002 hm. % LHK 0,05

24 hod. - teoretická 48 hod. - teoretická 72 hod. - teoretická

0,03

0,06

0,000 hm. % LHK

24 hod. - experimentální 48 hod. - experimentální 72 hod. - experimentální

0,01


0,06


0

0,04 0,03 0,02 0,01 0 0

0 0,01 0,02 0,03 0,04 vzdálenost od rozhraní hydrogel-roztok (m) 0,06

0,005 hm. % LHK

0,05

0,05

0,04

0,04



0,06

0,03 0,02 0,01

0,01 0,02 0,03 0,04 vzdálenost od rozhraní hydrogel-roztok (m)

0,010 hm. % LHK

0,03 0,02 0,01 0

0

0

0 0,01 0,02 0,03 0,04 vzdálenost od rozhraní hydrogel-roztok (m)

0,01

0,02

0,03

0,04

vzdálenost od rozhraní hydrogel-roztok (m)

Obr. 53: Vývoj koncentrace MB v závislosti na vzdálenosti od rozhraní hydrogel-roztok pro 1 hm. % agarózové hydrogely s různou koncentrací lignitických huminových kyselin.

Za předpokladu, že nedochází ke změně tortuozního faktoru vlivem přídavku huminových kyselin, jak již bylo potvrzeno výše zmíněnou metodou difúzních cel, může být spočítána hodnota zdánlivé rovnovážné konstanty Kapp (rovnice 72), která vyjadřuje míru reverzibilní sorpce organického barviva. Jak je patrné z Obr. 55 zdánlivá rovnovážná konstanta je ve všech případech, při jakémkoliv přídavku LHK větší než 1, což znamená, že rovnováha sorpčních procesů je posunuta směrem k produktům (viz. rovnice 71). Z porovnání zdánlivé rovnovážné konstanty pro methylenovou modř je patrné, že rostoucí teplota zcela zásadním způsobem ovlivňuje sorpční procesy MB na LHK. Zatímco v případě druhého použitého barviva – RH – nebyl pozorován zásadnější vliv teploty na hodnoty Kapp.V případě methylenové modři dochází k poklesu zdánlivé rovnovážné konstanty s rostoucí teplotou. Tyto výsledky jsou v rozporu s výsledky Kapp získané pro stejné hydrogelové vzorky se stejným přídavkem LHK stanovené pomocí metody difúzní cely, kde s rostoucí teplotou docházelo k nárůstu zdánlivé rovnovážné konstanty. Odlišnosti ve stanovení zdánlivých rovnovážných konstant pomocí obou inkriminovaných metod a fakt, zda charakter interakcí LHK-MB je endotermického respektive exotermického charakteru se prozatím nedovedlo objasnit. Ovšem naskytuje se několik řešení, jakým způsobem by mohly být interakce tohoto typu objasněny. Využita by mohla být například isotermická kalorimetrie (ITC), díky níž lze stanovit reakční teplo vydané či

105

VÝSLEDKY A DISKUZE


spotřebované během interakce HK-barvivo. Tímto směrem by se mohl odvíjet další výzkum v oblasti interakcí HK-organická barviva. 30°C 10

10

40°C

9

9

50°C 8 7

7

Da×1010 (m2·s-1)

Da×1010 (m2·s-1)

8

6 5 4

6 5 4

3

3

2

2

1

1 0

0 0,000%

0,002%

0,005%

0

0,010%

0,002

0,005

0,01

koncentrace LHK (hm. %)

koncentrace LHK (hm. %)

Obr. 54: Zdánlivý difúzní koeficient pro 1 hm. % AG hydrogely s přídavkem LHK při teplotách 30, 40 a 50 °C. Vlevo – methylenová modř, vpravo – rhodamin 6G.

Veškeré charakteristiky stanovené z neustálených difúzních procesů jsou sumarizovány v Tab. 11 pro metylenovou modř respektive v Tab. 12 pro rhodamin 6G. Z uvedených tabulek je patrné, že sebemenší přídavek LHK má významný vliv na parciaci obou organických barviv použitých jako modelové difúzní činidlo ve srovnání s čistým agarózovým hydrogelem (s výjimkou difúze methylenové modři v hydrogelu obsahujícím 0,002 hm. % LHK, kde byly detekovány vyšší hodnoty rozdělovacího koeficientu H při 40 °C respektive 50 °C, v tomto případě se pravděpodobně jedná o experimentální chybu při stanovení). V případě methylenové modři byl zaznamenán postupný pokles rozdělovacího koeficientu, tzn. s rostoucí koncentrací LHK v AG hydrogelu dochází k exponenciálnímu poklesu rozdělovacího koeficientu. I přesto, že trendy poklesu stanovených rozdělovacích koeficientů kopírují trend zdánlivé rovnovážné konstanty, vyskytují se zde určité nejasnosti, kterým je potřeba věnovat hlubší pozornost v navazujících studiích věnujících se studiu reaktivity, transportních a bariérových vlastností huminových kyselin pomocí difúzních technik. Jak již bylo zmíněno, nestacionární difúzní experimenty dovolují se hlouběji zaměřit na problematiku parciace barviva v hydrogelech v porovnání s ustálenou difúzí v difúzních celách. Nicméně pokud se chceme zaměřit na parciaci barviva v hydrogelech, je nutné mít na paměti několik aspektů, které mohou komplikovat přesné stanovení rozdělovacího koeficientu. Pravděpodobně nejkritičtější problém experimentálního stanovení rozdělovacího koeficientu spočívá v tom, jakým způsobem stanovit vázanou a volnou formu solutu. V rámci řešení dizertační práce byly použity spektrofotometrické metody, které poskytují informaci o celkové koncentraci barviva v hydrogelu. Nelze pomocí nich tedy rozlišit vázanou a volnou difundující látku. Tento problém jsme se snažili překonat stanovením UV-VIS spekter (kalibračních závislostí) pro hydrogely se známým přídavkem

106

VÝSLEDKY A DISKUZE


jak LHK, tak také barviva. Předpokládali jsme, že distribuce mezi volným a vázaným solutem je vždy stejná a nezávislá na tom, zda molekuly barviva jsou zaneseny do struktury hydrogelu před gelací (během přípravy) a nebo až během transportních procesů. Experimentálně bylo ověřeno, že absorbance MB a RH v hydrogelech při specifických vlnových délkách (MB – 665 nm, RH – 525 nm) po odečtení pozadí v podobě čistého agarózového hydrogelu bez přídavku barviva, je přímo úměrná celkovému množství barviva, které bylo do hydrogelu s přídavkem LHK přidáno. Toto tvrzení bylo ověřeno pro všechny zkoumané koncentrace LHK, měnila se pouze směrnice závislosti absorbance na koncentraci barviva s měnícím se množstvím LHK v hydrogelu. Díky tomu, že kalibrační závislosti byly realizovány již v hydrogelových médiích s přídavkem LHK a MB respektive RH, lze snížit experimentální chybu stanovení koncentrace prodifundovaného barviva (a tím i fundamentálních difúzních parametrů) oproti tomu, kdyby kalibrační závislosti byly provedeny pouze v roztocích se známou koncentrací organických barviv. Tab. 11: Vypočtené difúzní parametry pro 1 hm. % AG gel s různým množstvím LHK pro methylenovou modř.

wLHK

T

Da×1010

cs

H

Kapp

EA

(hm. %)

(°C)

(m2·s-1)

(g·dm-3)

(a.u.)

(a.u.)

(kJ·mol-1)

30

5,58 ± 1,88

0,015 ± 0,030

1,5 ± 0,3

0,5

40

7,79 ± 0,43

0,027 ± 0,004

3,0 ± 0,4

0,7

50

8,39 ± 0,77

0,030 ± 0,004

2,7 ± 0,4

1,0

30

1,92 ± 0,60

0,044 ± 0,009

4,4 ± 0,9

3,4

40

2,85 ± 0,30

0,156 ± 0,017

22,0 ± 2,5

3,5

50

4,36 ± 0,30

0,220 ± 0,025

15,6 ± 1,7

2,9

30

0,87 ± 0,27

0,067 ± 0,011

6,7 ± 1,1

8,7

40

1,68 ± 0,09

0,146 ± 0,013

20,4 ± 1,4

6,7

50

2,09 ± 0,20

0,204 ± 0,014

14,6 ± 1,3

7,1

30

0,50 ± 0,16

0,063 ± 0,003

6,3 ± 0,3

15,8

40

1,27 ± 0,05

0,161 ± 0,020

22,7 ± 3,4

9,2

50

1,80 ± 0,13

0,227 ± 0,034

16,1 ± 2,0

8,4

0,000

0,002

0,005

0,010

16,7 ± 5,8

33,3 ± 1,4

35,9 ± 9,7

52,2 ± 12,8

Dalším důležitým faktorem pro korektní použití zvoleného difúzního modelu diskutovaného v kap. 5.5.5, bylo zajištění konstantní koncentrace barviva v průběhu celého experimentu. K ověření tohoto předpokladu byla porovnána absorbance obou barviv před experimentem (v čase 0) a po ukončení experimentu (v čase 72 hodin). Bylo ověřeno, že pokles koncentrace barviva nebyl vyšší než 5 rel. %, což je považováno za dovolenou relativní chybu. Toto potvrzení společně s kontinuálním mícháním difundujícího roztoku tak, aby nedocházelo k vyčerpání koncentrace na rozhraní hydrogel-roztok, zajišťovalo

107

VÝSLEDKY A DISKUZE


konstantní koncentraci barviva na rozhraní po celou dobu experimentu a tedy zdárné použití uvedeného difúzního modelu. 18

5

30 °C

16

40 °C

14

50 °C

4

Kapp (a.u.)

Kapp (a.u.)

12 10 8

3

2

6 4

1

2 0

0 0


0,01

0


0,01

Obr. 55: Zdánlivá rovnovážná konstanta Kapp pro agarózové hydrogely s různým přídavkem LHK při proměnné teplotě. Vlevo – methylenová modř, vpravo – rhodamin 6G.

I přesto, že byly výše uvedené podmínky dodrženy, lze pozorovat určité odlišnosti v hodnotách koncentrací na rozhraní pro stejné hydrogely při různých časech (viz. Obr. 53). Rozdíly v koncentracích závislých na čase mohou být vysvětleny dvěma způsoby: 1) i přes kontinuální míchání difundujícího solutu mohou vznikat koncentrační gradienty na rozhraní hydrogel-roztok, což může zapříčinit změnu v nasorbovaném množství, vlivem rozdílné zdrojové koncentrace, 2) parciace barviva může být časově závislá, což by bylo v rozporu s naším zvoleným difúzním modelem, kde předpokládáme nezávislost difúzních procesů na čase. Časově závislá parciace barviva může být způsobena například změnou Donnanovy rovnováhy na rozhraní hydrogel-roztok vlivem toho, jak dochází k selektivní blokaci funkčních skupin po specifické interakci LHK-MB respektive LHK-RH. Tyto dva aspekty mohou a pravděpodobně také budou zahrnuty v pokračujícím výzkumu studia reaktivity huminových kyselin formou difúzních procesů. Nicméně, jakákoliv snaha k zavedení časové závislosti koncentrací na rozhraní hydrogel-roztok bude mít za následek značně složitý matematický aparát, který by v tomto případě bránil jednoduchému vyhodnocení experimentálních dat. Posledním kritériem, které může vést k vysvětlení charakteru interakcí HK-barvivo a odlišnostech ve stanovení zdánlivých rovnovážných konstant oběma difúzními metodami je zvolený sorpční mechanismus (viz. rovnice 70 a 71). Tento sorpční mechanismus je běžně používán pro popis sorpčních procesů probíhajících v reaktivních porézních médiích [133]. Nejlépe je aplikovatelný v systémech, kde se předpokládá velké množství reaktivních míst, zásadně převyšující množství solutu, které difunduje a je schopno specificky interagovat s těmito reaktivními místy, především z toho důvodu, aby během experimentu nedošlo k vyčerpání vazebných míst na reaktivní materici. Tento předpoklad je vhodný pro systémy s homogenně distribuovanými reaktivními skupinami v celém objemu (například reaktivní hydrogely), avšak nevhodný pro sorpční procesy realizované 108

VÝSLEDKY A DISKUZE


v suspenzích, kde dochází především k sorpci na povrch pevných částic. Ovšem v našem případě je použitelnost výše uvedeného sorpčního modelu značně diskutabilní, vzhledem k tomu, že do nereaktivního hydrogelu v podobě agarózy je přidáváno pouze velmi malé množství reaktivních huminových kyselin. Tyto rozdíly mezi teoretickým sorpčním modelem a interakčním mechanismem v praktických difúzních procesech mohou vést k výraznému ovlivnění stanovených difúzních parametrů včetně zdánlivé rovnovážné konstanty a rozdělovacího koeficientu. I toto tedy může být vysvětlení rozdílnosti ve stanovení fundamentálních difúzních parametrů pomocí metody difúzních cel a nestacionární difúze v kyvetách. Dalším vysvětlením může být závislost difúzního koeficientu na koncentraci. Tab. 12: Vypočtené difúzní parametry pro 1 hm. % AG gel s různým množstvím LHK pro rhodamin 6G.

wLHK (hm. %)

0,000

0,002

0,005

0,010

T (°C)

Da×1010 (m2·s-1)

cs (g·dm-3)

H (a.u.)

Kapp (a.u.)

30

4,94 ± 0,13

0,009 ± 0,001

1,7 ± 0,3

0,7

40

7,31 ± 0,42

0,015 ± 0,001

3,1 ± 0,3

0,8

50

7,52 ± 0,20

0,012 ± 0,000

2,5 ± 0,1

1,3

30

2,53 ± 0,03

0,014 ± 0,001

2,9 ± 0,2

2,3

40

2,99 ± 0,22

0,026 ± 0,002

5,1 ± 0,3

3,3

50

3,41 ± 0,16

0,023 ± 0,001

4,6 ± 0,1

4,0

30

1,75 ± 0,18

0,019 ± 0,001

3,9 ± 0,2

3,4

40

1,95 ± 0,08

0,042 ± 0,003

8,3 ± 0,6

5,6

50

2,42 ± 0,14

0,038 ± 0,002

7,6 ± 0,3

6,0

30

1,30 ± 0,06

0,030 ± 0,003

6,1 ± 0,5

5,5

40

1,70 ± 0,13

0,038 ± 0,002

12,2 ± 0,5

6,6

50

1,95 ± 0,21

0,065 ± 0,005

13,1 ± 1,0

7,7

EA (kJ·mol-1) 17,3 ± 8,2

12,2 ± 0,7

9,7 ± 4,7

16,5 ± 2,6

Z difúzních experimentálních dat lze opět spočítat aktivační energie difúzních procesů. Jak je patrné z Tab. 12, aktivační energie roste se zvyšující se koncentrací LHK v AG gelu, což je v souladu s teoretickými předpoklady, vzhledem k tomu, že při difúzi organických barviv skrz porézní přepážky v podobě AG hydrogelů dochází k již diskutovaným specifickým interakcím s LHK, což má za následek nárůst energie nutné pro úspěšnou realizaci difúzních procesů a s nimi spojených specifických interakcí. Vliv pH a iontové síly Dalšími parametry, ovlivňujícími difúzní procesy a především pak specifickou interakci mezi zvolenými difúzními soluty a huminovými kyselinami, které byly studovány, byly vlivy pH a iontové síly. Za předpokladu, že budeme uvažovat základní premisu, že charakter interakcí huminových kyselin s kladně nabitými látkami včetně organických 109

VÝSLEDKY A DISKUZE


barviv je elektrostatického charakteru, lze očekávat, že vliv pH a tedy schopnosti disociace funkčních skupin jak ve struktuře LHK tak také organických barviv, bude mít výrazný vliv na finální transportní schopnosti AG hydrogelů. Tyto předpoklady byly základní motivací pro ověření vlivu pH a iontové síly na reaktivitu lignitických huminových kyselin. Pro stanovení fundamentálních difúzních parametrů při měnících se experimentálních podmínkách (pH a iontová síla), bylo nutné stanovit difúzní koeficienty volné difúze, čili pouze barviva při konkrétním pH a iontové síle ve vodě. Tyto difúzní koeficienty pro obě zkoumaná barviva jsou sumarizovány v Tab. 8. Jak je patrné z této tabulky, difuzivita obou barviv je mírně zbrzděna vlivem pufru (PBS) s porovnáním difuzivity ve vodě. Hlavním důvodem může být případná agregace zvolených organických barviv, což bude významným způsobem ovlivňovat velikost částic a poté tedy i základní transportní vlastnosti, především pak jejich míru. Agregace methylenové modři byla potvrzena spektrofotometrickým měřením během difúzních procesů. Zatímco absorbance MB ve vodných roztocích dosahovala svojí maximální hodnoty při 665 nm, v případě rozpuštění MB v roztoku pufru při vyšším pH (IS = 0,01 M, pH = 11, případně IS = 0,20 M, pH =11), došlo k posunu absorpčního maxima k nižším vlnovým délkám, konkrétně byla maximální absorbance takového roztoku detekována při 605 nm [201]. Pokud dochází k odstínění odpudivých elektrostatických sil mezi molekulami barviva vlivem zvýšení iontové síly, nastává tím podpoření agregace a tím pádem se tedy i zvyšuje již zmiňovaná velikost difundujících částic. Samoagregace vybraných organických barviv (MB a RH) byla studována několika vědeckými skupinami. Sariri a kol. [202] studovali molekulární asociaci rhodaminových barviv v isotropických a anizotropických solventech pomocí polarizované spektrofotometrie (elektronová absorpční spektrofotometrie s polarizovaným světlem). Dimerizaci xantanových barviv ve vodě včetně rhodaminu 6G studovali Daré-Doyen a kol. [192] pomocí 1D a 2D nukleární magnetické rezonance. V obou případech dospěli k názoru, že vliv pH a iontové síly je jedním z důležitých činitelů, které ovlivňují agregaci těchto barviv. Dle literatury je vliv pH a iontové síly na sorpci organických barviv nezanedbatelný. Ve většině případů dochází k nárůstu sorpční kapacity kyselých přírodních sorbentů jako například jílů [203] nebo kalů [204] se zvyšujícím se pH. Výsledky nestacionárních difúzních procesů při různém pH a iontové síle naznačují velmi zajímavé závěry. Schopnost imobilizace obou používaných barviv LHK klesá s rostoucí hodnotou pH, což je charakterizováno klesající hodnotou rozdělovacího koeficientu H (viz. Obr. 56 vpravo), respektive klesající hodnotou koncentrace na rozhraní hydrogel-roztok (viz. Obr. 56 vlevo). Jak je patrné z níže uvedeného grafu (viz. Obr. 56) vliv pH na koncentraci MB na rozhraní hydrogel-roztok je v případě čistého agarózového hydrogelu prakticky zanedbatelný. Rozdíly je ovšem možné pozorovat v případě přídavku LHK. S rostoucím pH dochází k výraznému poklesu cs pro AG hydrogely obsahující příměs 0,01 hm. % LHK. Pokles koncentrace na rozhraní hydrogel-roztok se výrazně podepíše také na finální hodnotě rozdělovacího koeficientu. I v tomto případě je rozdělovací koeficient v čistém agarózovém hydrogelu prakticky nezávislý na pH systému, zatímco pokud je do AG hydrogelu přidán LHK, dochází k výraznému poklesu rozdělovacího koeficientu H s rostoucím pH.

110

VÝSLEDKY A DISKUZE

0,12


1 hm. % AG gel + 0,00 hm. % LHK

11

1 hm. % AG gel + 0,01 hm. % LHK

10

0,10

9 8 H (a.u.)

cs (g·dm-3)

0,08 0,06

7 6 5 4

0,04

3 2

0,02

1 0,00

0 3

7

3

11

pH

7

11

pH

Obr. 56: Hodnoty koncentrace na rozhraní hydrogel-roztok cs (vlevo) a rozdělovacího koeficientu H (vpravo) a pro 1 hm. % AG hydrogel bez přídavku respektive s 0,01 hm. % LHK při různém pH.

Tyto výsledky opět potvrzují tvrzení, které bylo konstatováno v kapitolách týkajících se vlivu karboxylových funkčních skupin na reaktivitu a sorpční schopnosti huminových kyselin. Tento nárůst je tedy pravděpodobně způsoben tím, že interakce mezi zvolenými difúzními soly a huminovými kyselinami nemusejí být pouze elektrostatického charakteru, jak je diskutováno výše. Pokud by tomu tam bylo, dalo by se očekávat, že s rostoucím pH dochází ke zvýšení disociace kyselých funkčních skupin ve struktuře huminových kyselin, což značí, že pro specifickou interakci HK-barvivo by bylo k dispozici větší množství funkčních skupin a tím pádem by sorpční kapacita měla zákonně narůstat, což by se podepsalo v tom, že difúzní procesy by byly zásadním způsobem zpomaleny a tedy zdánlivá rovnovážná konstanta by se vzrůstajícím pH také rostla. Naopak v případě nižšího pH by docházelo k protonaci kyselých funkčních skupin a tím pádem by tyto skupiny nebyly k dispozici pro případnou interakci s difundujícími barvivy. Jelikož huminové kyseliny ve své struktuře obsahují nejen kyselé funkční skupiny (karboxylové, fenolické a enolické, alifatické alkoholy), ale také množství strukturních podjednotek jako jsou aromatické kruhy, apod., které poskytují vhodná funkční místa pro komplexaci látek organického charakteru, může být charakter interakcí dán právě těmito funkčními podjednotkami. Například sorpční procesy polycyklických aromatických uhlovodíků na aromatických cyklech ve struktuře huminových kyselin je poměrně dobře známy [205]. Interakce tohoto typu jsou mnohem méně sensitivní na změnu pH případně iontové síly v porovnání s elektrostatickými interakcemi. Změny v difúzních charakteristikách, stejně jako ve zdánlivé rovnovážné konstantě, mohou být dány také již diskutovaným vlivem agregace organických barviv při měnících se experimentálních podmínkách. Jak již bylo diskutováno v kapitole věnující se studiu mechanických vlastností hydrogelů pomocí oscilačních testů, zmíněné změny v difúzních charakteristikách nejsou dány změnami mechanických vlastností hydrogelů po přídavku

111

VÝSLEDKY A DISKUZE


LHK, vzhledem k tomu, že mechanické vlastnosti nemají signifikantní vliv na transportní charakteristiky. Při všech zkoumaných pH a IS byly určeny obdobné hodnoty viskoelastických modulů vypovídajících o podobné hydrogelové síti jako v případě čistého agarózového hydrogelu. Ovlivnění reaktivity a bariérových vlastností lignitických huminových kyselin iontovou sílou není v tomto případě diskutován, jelikož rozdílná iontová síla (0,01 M a 0,20 M PBS) neměla prakticky žádný vliv na difúzní parametry v podobě efektivního difúzního koeficientu, koncentrace na rozhraní hydrogel-roztok, případě rozdělovacího koeficientu. Vliv modifikace huminových kyselin Stejně jako v případě experimentů realizovaných v difúzní cele, vliv modifikace huminových kyselin a tedy selektivní zastínění kyselých funkčních skupin ve struktuře HK byl studován také pomocí neustálených difúzních procesů v kyvetách. Sumarizované data včetně vypočtených difúzních parametrů v podobě zdánlivého difúzního koeficientu (viz. Obr. 57), koncentrace solutu na rozhraní hydrogel-roztok (viz. Obr. 58) v podobě poměrových hodnot vztažených na čistý agarózový hydrogel používaný jako reference 0,47

0,5

LHK

0,5

MHK 0,36 0,33

0,4

0,26

0,3

0,23 0,16

0,2

Da,HK/Da,AG (a.u.)

Da,HK/Da,AG (a.u.)

0,4

0,40

0,37

0,36

0,28

0,3

0,21 0,2

0,09 0,1

0,1

0,0

0,0 0,002

0,002

0,005 0,01 koncentrace HK (hm. %)

0,005

0,01

koncentrace HK (hm. %)

Obr. 57: Poměrová závislost zdánlivých difúzních koeficientů pro AG hydrogely s různou koncentrací LHK respektive MHK vztažená na referenční 1 hm. % AG hydrogel. Vlevo – methylenová modř, vpravo – rhodamin 6G.

Z Obr. 57 je patrné, že s rostoucí koncentrací LHK i MHK dochází k poklesu zdánlivého difúzního koeficientu, kdy podobnost poklesu je srovnatelný s výsledky získanými v difúzní cele. Pokud porovnáme zdánlivé difúzní koeficienty pro LHK a MHK mezi sebou, zjistíme, že v případě modifikovaných huminových kyselin je patrný mírný nárůst Da, což opět potvrzuje výsledky v kap. 6.4.3. Rozdíly v hodnotách zdánlivých difúzních koeficientů ani v tomto případě nenabývají takových hodnot, jaké lze podle literatury očekávat. Pokud mezi sebou porovnáme koncentrace na rozhraní hydrogel-roztok (viz. Obr. 58), je patrné, že s rostoucí koncentrací huminových kyselin v hydrogelu dochází k mírnému nárůstu koncentrace, stejně tak jako rozdělovacího koeficientu a to pro oba typy 112

VÝSLEDKY A DISKUZE


lignitických huminových kyselin (nativní i modifikované). Rozdíly mezi nasorbovaným množstvím pro LHK vůči MHK nejsou natolik markantní, jak lze očekávat, a v některých případech jsou na úrovni vypočtených relativních odchylek. Jak je patrné z níže uvedených grafů, s rostoucí koncentrací huminových kyselin v hydrogelů dochází k nárůstu koncentrace barviva na rozhraní hydrogel-roztok nehledě na to, zda se jedná o LHK či MHK. Změny v hodnotách koncentrace na rozhraní vztažených k čisté agaróze ovšem nejsou zcela signifikantní, vzhledem k tomu, že rozdíly v jednotlivých koncentracích jsou na úrovni směrodatných odchylek. Podrobnější diskuzi odlišností ve stanovených difúzních parametrech lze nalézt v kapitolách výše. LHK

6

4,45

4,66

6

MHK

3,97

5

5

4,05

4

3,21

cs,HK/cs,AG (a.u.)

cs,HK/cs,AG (a.u.)

3,44 2,96 3 2 1

3,24

4 2,82 2,41

3 1,78

1,69

2 1 0

0 0,002


0,002


Obr. 58: Poměrová koncentrace barviva na rozhraní hydrogel-roztok pro AG hydrogely s různou koncentrací LHK respektive MHK vztažená na referenční 1 hm. % AG hydrogel. Vlevo – methylenová modř, vpravo – rhodamin 6G.

6.4.5

Standardy huminových kyselin – difúzní cela

Reaktivita huminových kyselin byla zkoumána nejen pro lignitické huminové kyseliny získané standardizovanou extrakční metodou, ale také pro standardy huminových kyselin získané od mezinárodní huminové společnosti IHSS. Konkrétně se jednalo o vzorek huminových kyselin izolovaných z Leonarditu (1S104H). Standardy huminových kyselin se ve srovnání s lignitickými HK liší především v množství popela, jak je diskutováno v kap. 6.1.1, což také významným způsobem ovlivňuje jejich rozpustnost ve vodných roztocích pozitivním charakterem. Pomocí difúzních cel byl opět studován vliv koncentrace na transportní vlastnosti AG hydrogelů a také modifikace standardů huminových kyselin stejně jako tomu bylo u LHK respektive MHK. Z níže uvedeného grafu (Obr. 59) je patrné, že stejně jako v případě LHK respektive MHK (viz. kap. 6.4.3) tak také u standardů HK dochází k poklesu difúzního toku s rostoucí koncentrací HK v hydrogelu, což opět svědčí o pozitivní interakci mezi huminovými kyselinami a vybraným organickým barvivem. Tento pokles byl experimentálně ověřen pro obě zkoumaná barviva (difúzní toky pro methylenovou modř jsou uvedeny na Obr. 59 vlevo a pro rhodamin 6G na Obr. 59 vpravo). Ze srovnání IHSS HK s modifikovanými

113

VÝSLEDKY A DISKUZE


standardy MIHSS HK je zřejmé, že selektivní metylace karboxylových skupin ve struktuře huminových kyselin má pouze minoritní vliv na finální transportní a bariérové schopnosti AG hydrogelů, vzhledem k tomu, rozdíly ve vypočítaných difúzních tocích jsou prakticky zanedbatelné a v mnohých případech na úrovni chybových úseček. Zásadní vliv na reaktivitu a sorpční kapacitu huminových kyselin budou hrát jiné aspekty jako například specifický povrch huminových kyselin, jak je diskutován v kapitole věnující se charakterizaci pomocí skenovaní elektronové mikroskopie (viz. kap. 6.1.3) a také v kapitole věnující se klasickým sorpčním procesům na pevné huminové kyseliny (viz. kap. 6.5.2). Trend poklesu difúzního toku pro standardy a modifikované standardy IHSS HK byl obdobný jako v případě lignitických huminových kyselin. Zaměříme-li se ovšem na srovnání absolutních hodnot difúzních toků vztažených k referenčnímu vzorku (1 hm. % AG hydrogel) pro standardy huminových kyselin a LHK, můžeme konstatovat, že IHSS standardy HK vykazují nižší absolutní hodnoty difúzních toků, což naznačuje vyšší míru interakcí se zvolenými difúzními médii. Zatímco například pro 1 hm. % AG + 0,002 hm. % LHK byl pokles difúzního toku ve srovnání s 1 hm. % AG pouze o 22 %, v případě standardů IHSS HK (stejná koncentrace HK v hydrogelu) byl tento pokles téměř trojnásobný (58 %). Lze tedy uvažovat, že množství nespalitelného podílu (popel) stanoveného při elementární a termogravimetrické analýze může ovlivňovat transportní schopnosti hydrogelů obsahujících huminové kyseliny. 6

IHSS HK 5,2

mIHSS HK

mIHSS HK

5

5 Jd×109 (mol·m2·s-1)

Jd×109 (mol·m2·s-1)

IHSS HK

6

4 2,8 3 2,0

2,2 2

3,9

4 2,3

3 2,1 2

1,5 1,4 0,9

0,9

1

0,6 0,7

1

0

0,8

0 0

0,002 0,005 0,01 hmotnostní koncentrace HK (hm. %)


Obr. 59: Difúzní tok v závislosti na koncentraci HK v 1 hm. % AG hydrogelu. Vlevo – methylenová modř, vpravo – rhodamin 6G.

O míře interakcí a reaktivitě standardů huminových kyselin lze usuzovat také na základě srovnání času průchodu (tL) prvotního barviva přes porézní přepážku v podobě hydrogelu. Jak je patrné z Obr. 60 (vlevo methylenová modř, vpravo rhodamin 6G), s rostoucí koncentrací HK v hydrogelu dochází k výraznému nárůstu času průchodu, což bylo potvrzeno pro obě barviva a také pro obě zkoumané huminové kyseliny (nativní i modifikovaný standard HK).

114

VÝSLEDKY A DISKUZE


Na rozdíl od difúzního toku, v případě času průchodu jsou rozdíly mezi nativními a modifikovanými huminovými kyselinami znatelnější. V případě metylovaných MIHSS HK dochází k poklesu času průchodu ve srovnání s nativními IHSS HK. Opět je ovšem nutné říci, že tyto rozdíly nedosahují takových hodnot, jako jsme očekávali podle teoretických předpokladů. Faktem ovšem je, že huminových kyselin v inkriminovaných hydrogelech je poměrně málo ve srovnání s AG. Jak již bylo několikrát zmiňováno, pozitivní afinita huminových kyselin rozličného původu vůči kladně nabitým substancím je běžně dle literatury připisována karboxylové kyselosti. I v tomto případě bylo pomocí titrační a spektrofotometrických metod ověřeno úspěšné selektivní obsazení karboxylových skupin metylovými skupinami. Kdyby tedy pozitivní afinita HK vůči organickým kationaktivním látkám byla pouze záležitostí karboxylové kyselosti, získali bychom zcela odlišná data jak pro veškeré difúzní parametry včetně difúzního toku a času průchodu. V tomto případě se tomu tak ovšem nestalo a rozdíly v difúzních parametrech jsou velmi malé. Srovnáme-li absolutní hodnoty časů průchodu jednotlivých organických barviv pro standardy huminových kyselin s klasickými lignitickými HK, je patrné, že rozdíly v časech průchodu (tL) jsou pro oba typy huminových kyselin prakticky zanedbatelné. Lze tedy konstatovat, že zatímco výše diskutovaný difúzní tok se pro jednotlivé typy huminových kyselin lišil, čas průchodu je prakticky totožný. Přídavek standardů huminových kyselin tedy ovlivňuje transportní a bariérové vlastnosti AG hydrogelů (tortuozita, porozita, sorpční kapacita, apod.) obdobný způsobem jako LHK respektive MHK. Typ huminových kyselin tedy zásadnějším způsobem neovlivňuje první fázi difúzních procesů – čili tu fázi, kdy dochází k sorpci barviva, specifickým interakcím a penetraci skrz porézní přepážku v podobě hydrogelu (viz. Obr. 33), ale až ustálenou část difúzního procesu v difúzní cele, čili po překonání tL v podobě času průchodu. IHSS HK

16

IHSS HK

16

14,1

mIHSS HK 14 10,6

12

8 5,4 4,1

7,0

5,9

4

4

2

2

0

7,9

8 6

4,9

10,2

9,1

10 7,9

tL (hod)

tL (hod)

11,1

12

9,9

10

6

mIHSS HK

14

4,1

0 0

0,002 0,005 0,01 hmotnostní koncentrace HK (hm. %)


Obr. 60: Čas průchodu barviva skrz 1 hm. % AG hydrogel v závislosti na koncentraci HK. Vlevo – methylenová modř, vpravo – rhodamin 6G.

115

VÝSLEDKY A DISKUZE

6.4.6


Standardy huminových kyselin – neustálená difúze

Reaktivita, bariérové a transportní vlastnosti standardů huminových kyselin byla studována také pomocí nestacionárních difúzních procesů v kyvetách. Hlavní motivací k tomuto experimentu bylo opět ověření univerzálnosti optimalizovaných difúzních metod. Vzhledem k tomu, že standardy huminových kyselin obsahují nižší množství nespalitelného podílu v porovnání s LHK, což významným způsobem ovlivňuje rozpustnost huminových kyselin, důraz byl kladen také na to, zda huminové kyseliny jsou imobilizovány v hydrogelu a zda se neuvolňují do difúzního roztoku, jak bude diskutováno níže. Vliv koncentrace a teploty Difúzní parametry vypočítané na základě nestacionárních difúzních experimentů jsou sumarizovány v Tab. 13 pro MB respektive v Tab. 14 pro RH. Z těchto tabulek je zřejmé, že s rostoucí teplotou dochází k nárůstu zdánlivého difúzního koeficientu prakticky ve všech případech, stejně jako tomu bylo v případě lignitických huminových kyselin. Zajímavým zjištěním je vývoj koncentrace barviva na rozhraní hydrogel-roztok. V případě standardů IHSS HK nelze vypozorovat zásadní nárůst koncentrace na rozhraní s rostoucí koncentrací HK v gelu, což je v rozporu s vývojem cs pro lignitické huminové kyseliny. Tento rozdíl může být způsoben právě odlišnou rozpustností lignitických huminových kyselin LHK a standardů huminových kyselin IHSS HK ve vodných roztocích. Tab. 13: Difúzní parametry pro IHSS HK. Jako difúzní sonda použita MB.

wLHK (hm. %)

0,000

0,002

0,005

0,010

T (°C)

Da×1010 (m2·s-1)

cs (g·dm-3)

H (a.u.)

Kapp (a.u.)

30

5,86 ± 0,62

0,020 ± 0,003

2,0 ± 0,3

0,4

40

8,15 ± 0,29

0,023 ± 0,003

2,3 ± 0,3

0,6

50

9,27 ± 0,20

0,015 ± 0,001

1,5 ± 0,1

0,8

30

2,55 ± 0,15

0,053 ± 0,003

5,3 ± 0,3

2,3

40

3,40 ± 0,19

0,044 ± 0,003

4,4 ± 0,3

2,8

50

4,52 ± 0,15

0,025 ± 0,003

2,5 ± 0,3

2,7

30

2,02 ± 0,10

0,044 ± 0,005

4,4 ± 0,5

3,2

40

2,57 ± 0,15

0,049 ± 0,002

4,9 ± 0,2

4,0

50

3,85 ± 0,31

0,033 ± 0,001

3,3 ± 0,1

3,4

30

1,71 ± 0,16

0,055 ± 0,004

5,5 ± 0,4

3,9

40

1,93 ± 0,47

0,058 ± 0,005

5,8 ± 0,5

5,7

50

2,69 ± 0,28

0,051 ± 0,002

5,1 ± 0,2

5,3

EA (kJ·mol-1) 18,8 ± 4,4

23,3 ± 0,4

26,2 ± 4,3

18,4 ± 5,3

Při porovnání difúzních parametrů pro obě zkoumaná barviva je zřejmé, že v případě rhodaminu disponují hydrogely s přídavkem standardů huminových kyselin vyššími

116

VÝSLEDKY A DISKUZE


hodnotami rozdělovacích koeficientů H, což svědčí o zakoncentrovávání barviva na rozhraní hydrogelu a roztoku. Tyto odlišnosti mohou spočívat v povaze a fyzikálních vlastnostech jednotlivých barviv. Svou roli může hrát také molekulová hmotnost barviva. Vzhledem k tomu, že rhodamin 6G disponuje vyšší molekulovou hmotnostní ve srovnání s methylenovou modří, lze očekávat, že zdánlivý difúzní koeficient Da bude nižší pro hydrogely se standardy huminových kyselin v případě RH, což bylo také experimentálně ověřeno (viz. Tab. 14). Toto tvrzení je v souladu i pro LHK v případě srovnání zdánlivých difúzních koeficientů pro MB a RH (alespoň tedy při nižších koncentracích LHK v hydrogelu). Pokud porovnáme zdánlivou rovnovážnou konstantu vyjadřující poměr koncentrací barviva vázaného a volného, lze konstatovat, že Kapp roste s rostoucí koncentrací IHSS HK v hydrogelu, což platí pro obě zkoumaná barviva. Opět lze tedy tvrdit, že v případě realizace difúzních procesů organických barviv skrz hydrogely s HK dochází k jakési imobilizaci určité frakce organického barviva (vázaná frakce) formou specifických interakcí s huminovými kyselinami. Míra těchto interakcí se poté zvyšuje s rostoucí koncentrací IHSS HK v hydrogelu. Teplota v tomto případě nemá zásadnější vliv na hodnoty zdánlivých rovnovážných konstant, stejně tak jako nemá vliv na koncentraci barviva na rozhraní hydrogel-roztok. Naopak teplota má výraznější vliv na hodnotu zdánlivého difúzního koeficientu, vzhledem k tomu, že se stoupající teplotou dochází k nárůstu intenzity Brownova tepelného pohybu. Tab. 14: Difúzní parametry pro IHSS HK. Jako difúzní sonda použit RH.

wLHK (hm. %)

0,000

0,002

0,005

0,010

T (°C)

Da×1010 (m2·s-1)

cs (g·dm-3)

H (a.u.)

Kapp (a.u.)

30

5,09 ± 0,23

0,019 ± 0,002

1,9 ± 0,2

0,7

40

6,08 ± 0,29

0,022 ± 0,001

2,2 ± 0,1

1,1

50

6,66 ± 0,18

0,028 ± 0,001

2,8 ± 0,1

1,5

30

2,44 ± 0,15

0,047 ± 0,003

4,7 ± 0,3

2,5

40

3,47 ± 0,29

0,055 ± 0,003

5,5 ± 0,3

2,7

50

4,08 ± 0,25

0,046 ± 0,003

4,6 ± 0,3

3,2

30

1,64 ± 0,28

0,058 ± 0,005

5,8 ± 0,5

4,1

40

1,81 ± 0,25

0,097 ± 0,010

9,7 ± 1,0

6,2

50

2,28 ± 0,37

0,066 ± 0,004

6,6 ± 0,4

6,4

30

1,23 ± 1,00

0,071 ± 0,006

7,1 ± 0,6

5,9

40

1,52 ± 0,10

0,131 ± 0,018

13,1 ± 1,8

7,5

50

1,96 ± 0,07

0,092 ± 0,005

9,2 ± 0,5

7,6

117

EA (kJ·mol-1) 11,0 ± 1,8

21,0 ± 4,1

23,4 ± 3,4

19,0 ± 1,4

VÝSLEDKY A DISKUZE


Vliv modifikace Stejně jako v případě LHK i standardy huminových kyselin IHSS byly modifikovány trimetylsilyldiazometanem. Modifikované huminové kyseliny byly podrobeny taktéž neustáleným difúzním procesům. Výsledky v podobě zdánlivého difúzního koeficientu a koncentrace barviva na rozhraní hydrogel-roztok jsou uvedeny na následujících grafických závislostech (viz. Obr. 61 respektive Obr. 62). Z níže uvedených grafů je patrné, že modifikace standardů huminových kyselin ani v tomto případě nemá zásadnější vliv na transportní a bariérové vlastnosti huminových kyselin. Mírný nárůst poměrového zdánlivého koeficientu je v případě MIHSS HK ve srovnání s IHSS HK pozorován pro všechny koncentrace HK v hydrogelu, ovšem tento nárůst není zcela signifikantní. Nezávisle na tom, zda se jedná o modifikované či nativní huminové kyseliny, ve všech případech dochází k mírnému poklesu zdánlivého difúzního koeficientu s rostoucí koncentrací HK v gelu, kdy u nativních HK je tento pokles markantnější. Pokles poměrového zdánlivého difúzního koeficientu lze vysvětlit pozitivní afinitou huminových kyselin vůči difundujícím barvivům. O míře interakce mezi difúzní látkou a huminovými kyselinami svědčí také závislost koncentrace barviva na rozhraní hydrogelroztok (cs) vztažená k referenční koncentraci na rozhraní pro 1 hm. % agarózový hydrogel bez přídavku HK. Jak je patrné z níže uvedeného grafu, přítomnost huminových kyselin v gelu způsobuje nárůst koncentrace na rozhraní hydrogel-roztok. Tento nárůst je přibližně 2-4 × vyšší ve srovnání s čistým agarózovým hydrogelem. Bohužel v tomto případě nelze dedukovat jakékoliv závislosti cs na množství huminových kyselin v gelu. IHSS HK

0,6

IHSS HK

0,6

mIHSS HK

0,5

0,5

0,4

0,4 Da,HK/Da,AG (a.u.)

Da,HK/Da,AG (a.u.)

mIHSS HK

0,3 0,2 0,1

0,3 0,2 0,1

0,0

0,0 0,002


0,002


Obr. 61: Závislost Da,HK/Da,AG na koncentraci IHSS HK v 1 hm. % AG hydrogelu. Vlevo – methylenová modř, vpravo – rhodamin 6G.

Standardy huminových kyselin vykazují ve srovnání s lignitickými huminovými kyselinami nejenom nižším zastoupením nespalitelného podílu, ale také menší velikostí částic. Velikost částic zásadním způsobem ovlivňuje imobilizaci huminových kyselin v AG gelu. Vzhledem k menší velikosti částic nelze 100 % zaručit fakt, že IHSS huminové kyseliny budou v AG hydrogelu dokonale imobilizovány, proto během experimentu

118

VÝSLEDKY A DISKUZE


může docházet k uvolňování HK do zdrojového difúzního média. Změna koncentrace HK v hydrogelu by zásadním způsobem ovlivňovala také transportní a bariérové vlastnosti AG hydrogelů. Z tohoto důvodu bylo ověřeno uvolňování HK do roztoku jednoduchým experimentem, kdy kyvety s hydrogely a přídavkem HK byly umístěny do nádoby s vodou a v časových intervalech 1, 2 a 3 dny byly proměřeny UV-VIS spektra. V případě lignitických huminových kyselin byl úbytek koncentrace v gelu respektive nárůst koncentrace v difúzním médiu < 5 % ve srovnání s původní koncentrací HK v hydrogelu. Problém ovšem nastal v případě standardů huminových kyselin IHSS. V tomto případě byl detekován úbytek koncentrace v hydrogelu do 10 %, což jak již bylo zmíněno, může zásadním způsobem ovlivnit transportní charakteristiky. Uvedená data tedy mohou být zatížena experimentální chybou, která mohla vzniknout kvůli výše popsanému problému. Z toho důvodu například závislost vypočítané aktivační energie nekopíruje trend lineárního nárůstu v závislosti na koncentraci huminových kyselin jako v případě LHK. Řešením tohoto problému může být realizace difúzních experimentů se standardy huminových kyselin v agarózových hydrogelech vyšší koncentrace. S rostoucí koncentrací AG v hydrogelu dochází k nárůstu pevného podílu ve struktuře hydrogelu, což zcela zásadně ovlivňuje velikost pórů [206]. Při menší velikosti pórů je možné předpokládat, že i standardy huminových kyselin IHSS budou v koncentrovanějších hydrogelech lépe imobilizovány. IHSS HK

3,5

IHSS HK

4,5

mIHSS HK

mIHSS HK

4,0

3,0

3,5 3,0 cs,HK/cs,AG (a.u.)

cs,HK/cs,AG (a.u.)

2,5 2,0 1,5 1,0

2,5 2,0 1,5 1,0

0,5

0,5

0,0

0,0 0,002


0,002


Obr. 62: Závislost koncentrace na rozhraní hydrogel-roztok vztažené na referenční koncentraci na rozhraní pro 1 hm. % AG hydrogel v závislosti na koncentraci IHSS HK v hydrogelu. Vlevo – methylenová modř, vpravo – rhodamin 6G.

6.4.7

Kyselina hyaluronová – difúzní cela a neustálená difúze

Vhodnost vyvinutých a optimalizovaných difúzních metod byla ověřována také na jiných biokoloidních látkách, například na tělu vlastní látce kyselině hyaluronové. Metodou difúzní cely byl studován vliv koncentrace HYA v hydrogelu, stejně jako vliv molekulové hmotnosti na reaktivitu, bariérové a transportní vlastnosti AG hydrogelů obsahujících přídavek této aktivní látky.

119

VÝSLEDKY A DISKUZE


V prvé fázi byly realizovány experimenty v difúzní cele. Difúzní parametry vypočítané ze změny koncentrace methylenové modři v přijímací cele v závislosti na čase jsou sumarizovány v Tab. 15. Studium reaktivity kyseliny hyaluronové bylo realizováno pouze za použití MB coby difúzního média, vzhledem k tomu, že vhodnost vyvinutých difúzních technik již byla úspěšně ověřena u huminových kyselin. Tab. 15: Vypočtené difúzní parametry pro 1 hm. % AG hydrogel s přídavkem kyseliny hyaluronové. Difúze methylenové modři realizována v difúzní cele při 30 °C.

WHYA

M

Jd×109

tL

ns×107

De×1010

Da×1010

(hm. %)

(kDa)

(mol·m-2s-1)

(hod.)

(mol)

(m2·s-1)

(m2·s-1)

0,00

-

3,23 ± 0,36

4,8 ± 0,5

3,6 ± 0,9

1,40 ± 0,26

2,41 ± 0,36

0,01

500

2,67 ± 0,27

4,4 ± 0,1

4,3 ± 0,4

1,20 ± 0,02

2,62 ± 0,37

0,01

1 250

3,56 ± 0,43

4,5 ± 0,8

5,5 ± 0,4

1,76 ± 0,12

2,57 ± 0,42

Na základě dat ve výše uvedené tabulce lze konstatovat, že přídavek kyseliny hyaluronové do agarózového hydrogelu má pouze velmi malý vliv na tranposrtní a bariérové vlastnosti hydrogelů nezávisle na koncentraci a na molekulové hmotnosti kyseliny hyaluronové. Porovnáme-li difúzní toky (Jd) pro 1 hm. % AG hydrogel bez/s přídavkem 0,01 hm. % kyseliny hyaluronové, je patrné, že rozdíly v absolutních hodnotách jsou prakticky zanedbatelné. Stejně tomu je také u ostatních difúzních parametrů, jako je čas průchodu, efektivní či zdánlivý difúzní koeficient. Výraznější rozdíly jsou patrné pouze v množství methylenové modři v hydrogelu stanoveném po ukončení experimentu jako rozdíl zdrojové koncentrace a sumy koncentrace barviva v přijímací a zdrojové komoře difúzní cely. Přídavek kyseliny hyaluronové mírně zvýšil sorpční kapacitu agarózového hydrogelu. V případě HYA o molekulové hmotnosti 500 kDa, je tento nárůst přibližně o 17 rel. %, zatímco v případě HYA s vyšší molekulovou hmotností (1 250 kDa) je nárůst sorpční kapacity hydrogelu o přibližně 35 rel. %. Ovšem v žádném případě tyto změny v difúzních parametrech včetně sorpční kapacity nejsou natolik markantní jako v případě výše uvedených huminových kyselin. Na základě výše uvedených difúzních parametrů lze tvrdit, že kyselina hyaluronová nemá takové bariérové schopnosti jako je tomu u huminových kyselin. Hlavní odlišnosti ve stanovených difúzních charakteristikách lze nalézt v samotném skeletu kyseliny hyaluronové. Hustota náboje ve struktuře kyseliny hyaluronové je velmi malá, jak je uvedeno v odborném článku [210]. Dle knihy publikované Gargem a Halesem [211] připadá na každý druhý hyaluronový zbytek ve struktuře kyseliny hyaluronové pouze jeden náboj. Hustota náboje a tedy hustota funkčních skupin čili možných vazebných míst ve skeletu kyseliny hyaluronové bude výrazným způsobem ovlivňovat finální míru interakce mezi HYA a MB. Právě tato odlišnost v hustotě náboje ve srovnání s huminovými kyselinami je zodpovědná za to, že stanovené difúzní parametry jsou prakticky nezávislé na koncentraci stejně tak jako na molekulové hmotnosti kyseliny hyaluronové. Výše stanovené difúzní charakteristiky metodou difúzní cely byly verifikovány také druhou uvedenou metodou – neustálenou difúzi v kyvetách. Opět pro studium bariérových vlastností AG hydrogelů s přídavkem HYA bylo v tomto případě použito pouze barvivo

120

VÝSLEDKY A DISKUZE


MB. Difúzní parametry vypočítané z korelace mezi teoretickou funkcí a experimentálními daty jsou sumarizovány v Tab. 16. Vzhledem k tomu, že nestacionární difúzní procesy v kyvetách jsou časově méně náročné ve srovnání s experimenty realizovanými v difúzních celách, tak rozsah koncentrací kyseliny hyaluronové v hydrogelu byl rozšířen. Konkrétně byly doplněny koncentrace 0,02 hm. %, 0,05 hm. % a 0,10 hm. %. Testován byl také vliv takto vysoké koncentrace kyseliny hyaluronové v AG hydrogelu na finální viskoelastické vlastnosti, ovšem opět nebyl pozorován žádný zřetelný nárůst v hodnotách viskoelastických modulů (data nejsou uvedena v dizertační práci). Jak je patrné z níže uvedených difúzních parametrů, ani nejvyšší přídavek kyseliny hyaluronové (0,1 hm. %) výraznějším způsobem neovlivnil transport methylenové modři či bariérové vlastnosti AG hydrogelů. Signifikantní změny nejsou patrné ani při porovnání koncentrace barviva na rozhraní hydrogel-roztok. Dokonce ani při porovnání zdánlivé rovnovážné konstanty nelze vydedukovat, že by docházelo ke specifickým interakcím mezi kationaktivním barvivem a anionaktivním biokoloidem. Vysvětlení výše uvedených tvrzení může spočívat v již diskutované hustotě náboje ve skeletu kyseliny hyaluronové. Dalším možným vysvětlením může být fakt, že kyselé funkční skupiny (především pak karboxylové a hydroxylové) přítomné ve struktuře kyseliny hyaluronové nejsou k dispozici pro specifickou interakci s difundujícím barvivem. Dle knihy autora Walter [212] patří kyselina hyaluronová mezi jedny z nejsilnějších biologických organických kyselin. Disociační konstanta kyseliny hyaluronové nabývá hodnoty pKa = 3,23. Je tedy možné, že kyselé funkční skupiny ve struktuře HYA se nemusí nacházet v disociované formě (studium reaktivity a bariérových vlastností hydrogelů s přídavkem kyseliny hyaluronové bylo realizováno při neutrálním pH) a tím pádem by tyto skupiny byly nepřístupné pro interakci s organickým barvivem. Společně tedy s nízkou hustotou náboje ve skeletu HYA může právě disociace kyselých funkčních skupin zásadním způsobem ovlivňovat transport MB, a proto nedochází ke změně fundamentálních difúzních parametrů s rostoucí koncentrací kyseliny hyaluronové v hydrogelu. Tab. 16: Difúzní parametry pro AG hydrogely s odlišným množstvím kyseliny hyaluronové (1 250 kDa) při difúzi methylenové modři při 30 °C. Nestacionární difúze v kyvetách.

WHYA (hm. %)

M (kDa)

Da×1010 (m2·s-1)

cs (g·dm-3)

H (a.u.)

Kapp (a.u.)

0,000

1 250

5,45 ± 0,09

0,036 ± 0,002

3,6 ± 0,2

0,6

0,002

1 250

5,33 ± 0,12

0,031 ± 0,001

3,1 ± 0,2

0,6

0,005

1 250

5,37 ± 0,10

0,029 ± 0,002

2,9 ± 0,2

0,6

0,010

1 250

5,11 ± 0,16

0,021 ± 0,001

2,1 ± 0,1

0,7

0,020

1 250

5,14 ± 0,07

0,034 ± 0,001

3,4 ± 0,1

0,6

0,050

1 250

5,14 ± 0,17

0,026 ± 0,004

2,6 ± 0,4

0,6

0,100

1 250

5,11 ± 0,19

0,025 ± 0,002

2,5 ± 0,2

0,7

121

VÝSLEDKY A DISKUZE


Závěrem této kapitoly lze říci, že kyselina hyaluronová coby přírodní biokoloid disponuje nižší reaktivitou ve srovnání s huminovými kyselinami. Vliv disociace karboxylových funkčních skupin může být potvrzen či vyloučen studiem reaktivity HYA při rozdílném pH a iontové síle jako v případě huminových kyselin, což může být námětem pro další experimenty týkající se studia reaktivity biokoloidních látek v hydrogelových médiích pomocí difúzních procesů. 6.4.8

Alginát – difúzní cela a neustálená difúze v kyvetách

Dalším testovaným biokoloidem byl alginát sodný. Na rozdíl od výše uvedené kyseliny hyaluronové, přídavek alginátu do agarózového hydrogelu vyvolával silnou interakci mezi tímto biokoloidem a difundujícím médiem v podobě methylenové modři, která se projevila ve stanovených difúzních parametrech. Tato interakce je verifikována poklesem difúzního toku Jd, jehož závislost na koncentraci alginátu v hydrogelu je zobrazena na Obr. 63 vlevo. Pozitivní interakce mezi zmíněným biokoloidem a barvivem je potvrzena také nárůstem času průchodu barviva skrz hydrogel s rostoucí koncetrací alginátu na Obr. 63 vpravo. Změny v uvedených difúzních parametrech jsou pravděpodobně způsobeny odlišnou nábojovou hustotou. Jak je uvedeno v [213], nábojová hustota ve struktuře alginátu sodného je poměrně vysoká, především pak u manuronové kyseliny coby podjenotky vyskytující se ve struktuře alginátu, což je výrazná změna ve srovnání s nábojovou hustotou kyseliny hyaluronové. Důležitým parametrem může být také hydratace biokoloidních látek. Vzhledem k tomu, že kyselina hyaluronová je známa svým silným hygroskopickým efektem, dokonce je prezentována jako jedna z nejvíce hygroskopických látek v přírodě [214], dochází tedy k hydrataci hyaluronových řetězců a tím pádem nasorbovaná voda tvoří jakýsi neprostupný obal a proto dochází pouze k omezené interakci s barvivem. Alginát je v tomto případě odlišný. V literatuře [215] je taktéž popsán hygroskopický efekt alginátu, ovšem ve srovnání s kyselinou hyaluronovou není natolik markantní. Srovnáme-li hodnoty disociačních konstant pro obě dvě látky, zjistíme, že se od sebe příliš neliší. Zatímco u kyseliny hyaluronové je hodnota pKa 3,23, jak je uvedeno v kap. 6.4.7, pKa pro alginát nabývá dle literatury [213] hodnoty 3,40. Výše diskutovaný vliv disociace na reaktivitu a bariérové vlastnosti biokoloidních látek tedy v tomto případě můžeme vyloučit, jelikož obě porovnávané biokoloidní látky disponují téměř stejnou hodnotou pKa, tím pádem disociace kyselých funkčních skupin v obou případech bude prakticky stejná. Jejich reaktivita vyjádřená změnou difúzního toku respektive času průchodu v závislosti na koncentraci alginátu v hydrogelu se ovšem velmi významně liší. Hlavní odlišnosti v reaktivitě obou porovnávaných látek budou tedy způsobeny především již diskutovanou nábojovou hustotou.

122

VÝSLEDKY A DISKUZE


5

30 25 20 tL (hod)

Jd×109 (mol·m2·s-1)

4

3

15

2 10 1

5

0

0 0,00

0,01

0,05

0,10

0,50

0,00

hmotnostní koncentrace alginátu (hm. %)

0,01

0,05

0,10

0,50


Obr. 63: Difúzní tok Jd (vlevo) a čas průchodu barviva tL (vpravo) pro 1 hm. % AG hydrogely s různou koncentrací alginátu. Výsledky z difúzní cely.

Míru interakce mezi methylenovou modří a alginátem sodným v AG hydrogelu lze vyjádřit také množstvím barviva v hydrogelu stanoveném po ukončení experimentu. Jak je patrné z Obr. 64 vlevo, s rostoucí koncentrací alginátu v AG hydrogelu, dochází k exponenciálnímu nárůstu koncentrace barviva ve finálním hydrogelu po ukončení experimentu. Tyto výsledky jsou opět odlišné v porovnání s kyselinou hyaluronovou, kde nedocházelo k prokazatelnému zakoncentrovávání barviva v hydrogelu. V případě alginátu sodného bylo dosaženo až trojnásobného zakoncentrovaní methylenové modři v hydrogelu obsahujícím 0,5 hm. % ALG ve srovnání s čistým agarózovým hydrogelem. Opět lze tvrdit, že dochází ke specifické interakci mezi barvivem a alginátem, molekuly barviva jsou tedy v AG hydrogelu poměrně pevně imobilizovány. 15

2,0

1,5 Deff×1010 (m2·s-1)

ns×107 (mol)

10

5

0

1,0

0,5

0,0 0,00

0,01

0,05

0,10

0,50

0,00


0,01

0,05

0,10

0,50


Obr. 64: Nasorbované množství barviva ns (vlevo) a efektivní difúzní koeficient Deff (vpravo) pro 1 hm. % AG hydrogely s různou koncentrací alginátu. Výsledky z difúzní cely.

123

VÝSLEDKY A DISKUZE


Vliv přídavku alginátu sodného na transportní a bariérové vlastnosti agarózových hydrogelů byl studován také neustálenou difúzní metodou. Výsledky vyhodnocených experimentálních dat jsou sumarizovány v Tab. 17. Z níže uvedené tabulky je patrné, že s rostoucí koncentrací alginátu v hydrogelu dochází k výraznému snižování zdánlivého difúzního koeficientu Da. Stejně jako v případě experimentů realizovány v difúzních celách, i v tomto případě tento pokles symbolizuje silnou interakci mezi alginátem a difundujícím barvivem. Porovnáme-li ovšem koncentraci barviva na rozhraní hydrogelroztok pro všechny zkoumané koncentrace alginátu, zjistíme, že alginát v hydrogelu nemá prokazatelný vliv na finální hodnoty cs. Z tohoto tvrzení lze usuzovat, že rychlost difúzních procesů je sice brzděna pozitivní interakcí mezi ALG a MB, ovšem nedochází k žádnému zakoncentrovávání barviva na rozhraní jako tomu bylo například u huminových kyselin, což se podepíše také na hodnotách rozdělovacího koeficientu H, který se s rostoucí koncentrací ALG v hydrogelu prakticky nemění. Změny jsou prakticky na úrovni stanovených relativních odchylek. Tab. 17: Sumarizované difúzní parametry pro agarózové hydrogely s přídavkem alginátu sodného pro difúzi methylenové modři při teplotě 30 °C. Neustálené difúzní experimenty realizované v kyvetách.

WALG (hm. %)

T (°C)

Da×1010 (m2·s-1)

cs (g·dm-3)

H (a.u.)

Kapp (a.u.)

0,00

30

5,23 ± 0,12

0,019 ± 0,002

1,9 ± 0,8

0,6

0,01

30

1,63 ± 0,20

0,014 ± 0,004

1,4 ± 0,4

4,2

0,05

30

0,64 ± 0,17

0,018 ± 0,004

1,8 ± 0,4

12,2

0,10

30

0,27 ± 0,05

0,011 ± 0,003

1,1 ± 0,3

30,3

0,50

30

0,11 ± 0,04

0,009 ± 0,001

0,9 ± 0,1

75,6

Výše uvedené difúzní parametry vypočítané z neustálených difúzních experimentů potvrzují výsledky získané metodou difúzní cely, alespoň tedy v případě difúzních koeficientů, které klesají s rostoucí koncentrací alginátu respektive zdánlivé rovnovážné konstanty, která naopak s rostoucí koncentrací alginátu v hydrogelu roste. Neshodu výsledků z obou použitých difúzních technik lze nalézt v koncentraci barviva na rozhraní hydrogel-roztok, respektive v množstvím barviva obsaženém v hydrogelu po ukončení experimentu (difúzní cela). Zatímco v případě experimentů realizovaných v difúzní cele docházelo k exponenciálnímu nárůstu koncentrace barviva v hydrogelu n (viz. Obr. 65 vlevo), v případě koncentrace na rozhraní cs, není pozorována zřejmá závislost mezi touto koncentrací a množstvím alginátu v hydrogelu. Tyto odlišnosti mohou být pravděpodobně způsobeny odlišnými difúzními modely. Zatímco u metody difúzní cely dochází k průchodu barviva přes celou porézní přepážku v podobě hydrogelu, u neustálené difúze v kyvetách je studována především penetrace dovnitř hydrogelu. Za předpokladu, že bychom nechali probíhat difúzní procesy v kyvetách až do stádia, kdy by barvivo proniklo až nakonec kyvety, docházelo by pravděpodobně k nárůstu koncentrace barviva na rozhraní hydrogel-roztok s rostoucí koncentrací alginátu v hydrogelu, což je ovšem nutné experimentálně ověřit. 124

VÝSLEDKY A DISKUZE

6.4.9


Chitosan –neustálená difúze v kyvetách

Vhodnost vyvinutých metod, stejně tak jako univerzálnost byla testována nejen na biokoloidních látkách anionaktivního charakteru, ale také na kationaktivním zástupci biokoloidních sloučenin – chitosan. Dle teoretických předpokladů [32] se chitosan v roztoku vyskytuje jako kladně nabitý biokoloid, vzhledem k tomu, že ve své struktuře obsahuje nemalé množství –NH2 skupin, které jsou schopny se protonizovat, čímž dává chitosanu poměrně unikátní vlastnosti. Díky této presumpci byla očekávána pozitivní interakce mezi kationaktivním chitosanem a anionaktivním organickým barvivem v podobě amidočerni 10B. Výsledky získané z experimentů realizovaných metodou neustálené difúze v kyvetách jsou sumarizovány na Obr. 65. Na základě těchto grafických závislostí lze usuzovat o pozitivní interakci mezi chitosanem a zvoleným organickým barvivem, vzhledem k tomu, že s rostoucí koncentrací chitosanu v agarózovém hydrogelu dochází k poklesu zdánlivého difúzního koeficientu (Da) viz. Obr. 65 (vlevo). Na rozdíl od koncentrace barviva AMD na rozhraní hydrogel-roztok, která je na koncentraci chitosanu v hydrogelu prakticky nezávislá. Pokles zdánlivého difúzního koeficientu je zcela jistě způsoben reverzibilní interakcí CHIT s difúzním médiem. 7

30 °C

0,012

40 °C 6

0,010

50 °C

0,008 cs (g·dm-3)

Da×1010 (m2·s-1)

5 4 3

0,006 0,004

2

0,002

1 0

0,000 0,000% 0,002% 0,005% 0,010% hmotnostní koncentrace chitosanu (hm. %)

0,000% 0,002% 0,005% 0,010% hmotnostní koncentrace chitosanu (hm. %)

Obr. 65: Zdánlivý difúzní koeficient (vlevo) a koncentrace na rozhraní hydrogel-roztok (vpravo) pro 1 hm. % AG hydrogely s různým množstvím chitosanu při použití AMD jako difúzního média. Výsledky z neustálené difúze v kyvetách.

Pomocí neustálené difúze v kyvetách byl studován také vliv teploty na reaktivitu a bariérové vlastnosti hydrogelů obsahujících příměs chitosanu. Z výše uvedených grafických závislostí je patrné, že s rostoucí teplotou dochází k mírnému nárůstu zdánlivého difúzního koeficientu, porovnáme-li hodnoty těchto difúzních koeficientů pro jednotlivé koncentrace chitosanu v AG gelu. Stejně jako v předešlých případech, i zde je difúze barviva teplotně aktivovaný proces, kdy s rostoucí teplotou dochází k nárůstu intenzity Brownova pohybu a z toho důvodu dochází také k nárůstu zdánlivého difúzního koeficientu. Jak již bylo avizováno dříve, koncentrace chitosanu v hydrogelu neměla

125

VÝSLEDKY A DISKUZE


prokazatelný vliv na změnu koncentrace na rozhraní hydrogel-roztok, stejně tak tomu bylo i v případě vlivu teploty. Ani v tomto případě nedocházelo k signifikantní změně cs při různých teplotách. 6.4.10

Polystyrensulfonát – difúzní cela a neustálená difúze v kyvetách

Univerzálnost vyvinutých difúzních technik byla testována nejen na substancích přírodního charakteru, ale také na modelové syntetické látce v podobě polystyrensulfonátu sodného. Vzhledem k tomu, že polystyrensulfonát obsahuje ve své struktuře disociované sulfonové skupiny, které jsou vykompenzovány sodnými ionty, očekávalo se, že tato látka bude vykazovat pozitivní afinitu vůči kationaktivní methylenové modři respektive rhodaminu 6G. Veškeré difúzní parametry získané metodou difúzní cely pro barvivo methylenová modř jsou sumarizovány v níže uvedeného tabulce (viz. Tab. 18). Tab. 18: Difúzní parametry pro AG hydrogely s přídavkem PSS pro difúzi MB. Výsledky z měření v difúzní cele.

WPSS (hm. %)

T (°C)

Jd×109 (mol·m-2s-1)

tL (hod.)

ns×107 (mol)

De×1010 (m2·s-1)

Da×1010 (m2·s-1)

0,000

30

5,39 ± 0,23

4,4 ± 0,6

3,9 ± 0,9

3,79 ± 0,15

4,66 ± 0,31

0,002

30

1,03 ± 0,12

9,7 ± 0,5

11,5 ± 1,1

0,86 ± 0,14

1,20 ± 0,16

0,005

30

0,73 ± 0,09

9,3 ± 0,3

12,1 ± 1,3

0,66 ± 0,07

1,24 ± 0,21

0,010

30

0,33 ± 0,07

9,1 ± 0,6

16,6 ± 0,9

0,52 ± 0,11

1,29 ± 0,13

Z výše uvedené tabulky je patrné, že nepatrný přídavek aktivní látky v podobě polystyrensulfonátu sodného do 1 hm. % agarózového hydrogelu způsobuje zásadní změny ve stanovených difúzních charakteristikách. S rostoucí koncentrací polysytensulfonátu sodného v AG hydrogelu dochází k exponenciálnímu poklesu difúzního toku Jd, což se podepíše také na hodnotách efektivního difúzního koeficientu. Pokles těchto difúzních charakteristik je způsoben poměrně silnou interakcí mezi aktivní látkou v podobě PSS a zvoleným difúzním médium, v tomto případě se jednalo o methylenovou modř. Poměrně výrazně narůstá také množství barviva, které bylo detekováno po ukončení experimentu v hydrogelu obsahujícím aktivní látku. Zatímco v případě čistého agarózového hydrogelu je množství barviva 3,9·107 molu, v případě vyšších koncentrací PSS dosahuje koncentrace barviva vázaného na hydrogelu případně volného v hydrogelu až 16,6·107 molu. Tento nárůst je opět způsoben pozitivní interakcí mezi kladně nabitým barvivem a disociovaným PSS. Polystyrensulfonát vykazuje vyšší míru afinity a s tím spojených interakcí se zvolenými difúzními médii v podobě organických barviv ve srovnání s biokoloidními látkami především pak ve srovnání s kyselinou hyaluronovou. Rozdílnost v míře reaktivity těchto dvou látek je způsobena opět nábojovou hustotou. Výsledky získané metodou difúzní cely byly potvrzeny také metodou neustálené difúze v kyvetách, která byla realizována se stejnými koncentracemi PSS jako v případě předešlé

126

VÝSLEDKY A DISKUZE


difúzních techniky. Difúzní parametry vypočítané z koncentračních profilů pro hydrogely obsahující PSS jsou sumarizovány na Obr. 66. Jak je patrné z těchto obrázků, se vzrůstající koncentrací PSS v AG hydrogelu dochází k rapidnímu poklesu zdánlivého difúzního koeficientu Da a to v případě obou testovaných barviv (MB i RH). Naopak poměrně výrazně dochází k nárůstu koncentrace na rozhraní s rostoucí koncentrací PSS v AG hydrogelu, ovšem pouze v případě methylenové modři. Příčina rozdílné reaktivity PSS s MB respektive s RH spočívá pravděpodobně v tom, že rhodamin má podle literatury vyšší tendenci k tvorbě dimerních forem, což zásadním způsobem ovlivní míru interakce této difúzní sondy s aktivní látkou. Z tohoto důvodu tedy není nárůst koncentrace na rozhraní hydrogel-roztok tak strmý, jako v případě methylenové modři. 5,0

MB

0,7

RH

0,6

4,0 cs (g·dm-3)

Da×1010 (m2·s-1)

0,5 3,0

2,0

0,4 0,3 0,2

1,0 0,1 0,0

0,0 0 0,002 0,005 0,01 hmotnostní koncentrace PSS (hm. %)

0 0,002 0,005 0,01 hmotnostní koncentrace PSS (hm. %)

Obr. 66: Zdánlivý difúzní koeficient Da (vlevo) a koncentrace na rozhraní hydrogel-roztok cs (vpravo) pro AG hydrogely s různým přídavkem PSS. Výsledky z neustálené difúze v kyvetách.

Pozitivní interakci mezi methylenovou modří a polystyrensulfonátem sodným ve srovnání s interakcí MB a kyseliny hyaluronové velmi dobře vystihuje Obr. 67.

Obr. 67: Difúze methylenové modři do AG hydrogelu s přídavkem polystyrensulfonátu sodného (vlevo) a kyseliny hyaluronové (vpravo) po 72 hodinách. Zleva – 0,000 hm. %, 0,002 hm. %, 0,005 hm. % a 0,010 hm. % aktivní látky.

127

VÝSLEDKY A DISKUZE


Závěrem lze konstatovat, že optimalizované difúzní techniky lze použít i pro syntetické polymerní látky, což bylo potvrzeno výše uvedenými výsledky a studiem reaktivity, bariérových a transportních vlastností polystyrensulfonátu sodného.

6.5

Sorpční experimenty na lignitických huminových kyselinách

6.5.1

Hydrogely s přídavkem huminových kyselin

Veškeré výše uvedené experimenty realizované v difúzních celách respektive neustálené difúzní experimenty v kyvetách poskytují cenné informace o reaktivitě, transportních a bariérových schopnostech biokoloidů a mobilitě organických barviv v systémech obsahujících biokoloidní látky při dynamicky měnících se podmínkách (experimenty realizované v systémech, kdy není dosaženo rovnováhy). V tomto případě je difúze barviva realizována do skleněných trubiček obsahujících AG hydrogel až do té doby, dokud není sorpční kapacita hydrogelu respektive huminových kyselin zcela vyčerpána (dokud není dosaženo rovnováhy). Výsledky těchto experimentů jsou sumarizovány na Obr. 68, kde jsou uvedeny koncentrace barviva v AG hydrogelech s různým přídavkem HK při rovnováze. Vypočítaná koncentrace barviva v gelu byla vždy podělena koncentrací barviva v referenčním vzorku (1 hm. % AG gel bez přídavku HK) taktéž v rovnováze. Z níže uvedeného grafu je zřejmé, že na rozdíl od koncentrací na rozhraní hydrogel-roztok stanovených z neustálených difúzních experimentů v kyvetách, koncentrace v gelu v tomto případě není signifikantně ovlivněna přítomností huminových kyselin v AG gelech. Především při nižších koncentracích huminových kyselin v AG gelu se poměr rovnovážných koncentracích pohybuje kolem hodnoty 1, což svědčí o tom, že rovnovážná koncentrace pro AG gel obsahující 0,002 hm. % respektive 0,005 hm. % dosahoval stejné sorpční kapacity jako v případě referenčního 1 hm. % AG hydrogelu. Navíc bylo zjištěno, že tato koncentrace je prakticky nezávislá (opět alespoň u nižších koncentrací HK v gelu) na tom, zda jsou v gelu obsaženy nativní lignitické huminové kyseliny LHK nebo modifikované lignitické huminové kyseliny MHK. LHK

1,8 1,6

1,6

1,4

1,4

1,2

1,2 ceq,HK/ceq,0 (a.u.)

ceq,HK/ceq,0 (a.u.)

1,8

MHK

1,0 0,8 0,6

1,0 0,8 0,6

0,4

0,4

0,2

0,2

0,0

0,0 0,002


0,002


Obr. 68: Rovnovážné koncentrace barviva v AG hydrogelech s různou koncentrací HK.

128

VÝSLEDKY A DISKUZE


Na první pohled se může zdát, že výsledky získané pomocí rovnovážných sorpčních experimentů jsou v rozporu s difúzními experimenty prezentovanými v předešlých kapitolách, především pak s nestacionárními difúzními experimenty realizovanými v kyvetách (viz. kap. 6.4.4). Při těchto experimentech jsme předpokládali, že koncentrace na rozhraní hydrogel-roztok je zcela nezávislá na čase. Ovšem z Obr. 53 je patrné, že s rostoucím časem dochází k poklesu koncentrace na rozhraní hydrogel-roztok. Změna koncentrace na rozhraní hydrogel-roztok v případě neustálených difúzních procesů může být způsobena časovým vývojem koncentrace volného a vázaného solutu. K ověření této hypotézy byly realizovány také desorpční experimenty formou sekvenční extrakce vázaného barviva v hydrogelu ve vodě a kyselině chlorovodíkové. Vycházeli jsme z předpokladu, že množství barviva, které přejde do vody po extrakci, představuje volnou mobilní fázi, která není nijak vázaná na huminové kyseliny a je pouze součástí pórů agarózových hydrogelů, zatímco zbylá část (včetně koncentrace barviva, kterou nelze vyextrahovat ani použitím kyseliny chlorovodíkové) přestavuje nejsilněji vázanou frakci barviva na huminové kyseliny. Výsledky z frakční extrakce jsou uvedeny na Obr. 69 pro barvivo MB a nativní lignitické respektive metylované lignitické huminové kyseliny a na Obr. 70 pro barvivo RH. Z níže uvedených grafů lze vyvodit několik zajímavých poznatků. Nejvyšší relativní množství barviva představuje nejsilněji vázaná frakce, která je kupodivu dominantní také v případě referenčního vzorku v podobě čistého agarózové hydrogelu. Relativní množství nejsilněji vázané frakce se pohybuje v rozmezí 51 - 67 rel. % nezávisle na tom, zda se jedná o nativní či modifikované HK. Z těchto výsledků lze usuzovat, že interakce mezi zvolenými barvivy a agarózovými řetězci je relativně silná. HCl

zbylá frakce 100%

90%

90%

80%

80%

relativní obsah MB (%)

relativní obsah MB (%)

voda 100%

70% 60% 50% 40% 30%

70% 60% 50% 40% 30%

20%

20%

10%

10%

0%

0%

0,000% 0,002% 0,005% 0,010% koncentrace LHK (hm. %)

0,000% 0,002% 0,005% 0,010% koncentrace MHK (hm. %)

Obr. 69: Relativní zastoupení methylenové modři v hydrogelech při desorpčních experimentech. Vlevo – lignitické huminové kyseliny, vpravo – metylované lignitické huminové kyseliny.

Dalším zajímavým faktem je, že s rostoucí koncentrací huminových kyselin v agarózovém hydrogelu dochází k poklesu vodou extrahovatelné frakce barviva nezávisle na tom, zda se jedná o LHK případně MHK. Na druhou stranu při pohledu na Obr. 69 je patrné, že s rostoucí koncentrací LHK či MHK v hydrogelu dochází k nárůstu frakce 129

VÝSLEDKY A DISKUZE


barviva, která je extrahovatelná kyselinou chlorovodíkovou. Stejný trend poklesu vodou extrahovatelné frakce a naopak nárůstu kyselinou extrahovatelné frakce vybraného barviva byl pozorován také pro rhodamin 6G (viz. Obr. 70). Lze tedy tvrdit, že relativní obsah volných molekul obou barviv klesá s rostoucí koncentrací HK v hydrogelech, vzhledem k tomu, že dochází ke specifické interakci mezi barvivem a HK. Mírné rozdíly v jednotlivých frakcích lze pozorovat i ze srovnání LHK a MHK, ovšem v tomto případě jsou tyto rozdíly na úrovni chybových úseček, proto nejsou zcela signifikantní. HCl

zbylá frakce

100%

100%

90%

90%

80%

80%

relativní obsah RH (%)

relativní obsah RH (%)

voda

70% 60% 50% 40% 30% 20% 10%

70% 60% 50% 40% 30% 20% 10%

0%

0% 0,000% 0,002% 0,005% 0,010% koncentrace LHK (hm. %)

0,000% 0,002% 0,005% 0,010% koncentrace MHK (hm. %)

Obr. 70: Relativní zastoupení rhodaminu 6G v hydrogelech při desorpčních experimentech. Vlevo – lignitické huminové kyseliny, vpravo – metylované lignitické huminové kyseliny.

Závěrem lze říci, že i v případě rovnovážných sorpčních experimentů lze pozorovat a usuzovat o pozitivní afinitě huminových kyselin vůči kladně nabitým organickým barvivům. Odlišnosti mezi LHK a MHK ovšem pozorovatelné nejsou a to z toho důvodu, že tyto vlivy jsou silně zastíněny interakcí organických barviv s řetězci gelačního činidla – agarózy (nutno říci, že ve všech použitých hydrogelech je koncentrace agarózy minimálně 100× vyšší ve srovnání s koncentrací HK). 6.5.2

Adsorpční experimenty na pevných huminových kyselinách

Adsorpční experimenty realizované v suspenzi na pevných částicích huminových kyselin jsou nepostradatelnou a hojně rozšířenou metodou pro studium reaktivity a sorpčních vlastností huminových kyselin. Klučáková a kol. [207 - 209] se ve svých publikacích mimo jiné rozsáhle věnuje sorpčním experimentům kovových iontů (především pak Cu2+) na huminových kyselinách. Zjistili, že rychlost adsorpčních a desorpčních procesů je nezávislá na pH systému. Studovali také vliv modifikace huminových kyselin na jejich sorpční vlastnosti. Na tyto publikace bylo navázáno i v rámci této předložené dizertační práce, ovšem jako zdroj iontů, které byly sorbovány, nebyly zvoleny ionty kovů, ale jako v celé dizertační práci, organická barviva. Výsledky z adsorpčních procesů na pevné LHK respektive MHK byly korelovány s výstupy z výše uvedených difúzních experimentů. Tyto adsorpční experimenty poskytly vskutku zajímavé výsledky v případě srovnání sorpčních 130

VÝSLEDKY A DISKUZE


charakteristik LHK a MHK. Modifikované vzorky lignitických huminových kyselin vykazovaly mnohem vyšší schopnost odbarvovat roztoky barviv (v obou případech, jak pro MB, tak také RH) ve srovnání s nativními LHK. Tyto rozdíly se ještě více prohlubovaly, v případě, že byly zvoleny vyšší koncentrace barviva. Rozdílnost v sorpčním chování LHK a MHK sumarizuje Obr. 71. LHK

0,16

0,05

MHK nasorbované množství RH (gRH/gHK)

nasorbované množství MB (gMB/gHK)

0,14 0,12 0,10 0,08 0,06 0,04 0,02 0,00 0,00

0,05

0,10

0,15

koncentrace barviva

0,04

0,03

0,02

0,01

0,00 0,00

0,20

(g·dm–3)

0,05

0,10

0,15

koncentrace barviva

0,20

(g·dm–3)

Obr. 71: Nasorbované množství barviva vztažené na gram pevných huminových kyselin v závislosti na původní koncentraci barviva v roztoku. Vlevo – methylenová modř, vpravo – rhodamin 6G.

V případě modifikovaných huminových kyselin dochází k nárůstu nasorbovaného množství MB v závislosti na původní koncentraci barviva v roztoku, zatímco u LHK dochází k nárůstu nasorbovaného množství pouze do koncentrace barviva 0,05 g·dm-3, poté při vyšších koncentracích je již nasorbované množství nezávislé na původní koncentraci barviva. Z tohoto tvrzení lze usuzovat, že sorpční kapacita LHK je již zcela vyčerpána při nižších koncentracích barviva, zatímco modifikované HK jsou schopny adsorbovat až trojnásobně větší množství MB. V případě druhého používaného barviva (RH) sice není nárůst nasorbovaného množství v případě MHK lineární jako v předešlém případě, ale i zde je očividné, že modifikované huminové kyseliny mají vyšší sorpční kapacitu ve srovnání s nativními lignitickými. Tyto výsledky jsou v rozporu vůči závěrům dedukovaným z dynamických difúzních experimentů, kde byly pozorovány pouze mírné odchylky v difúzních parametrech pro obě zkoumané huminové kyseliny. Dokonce v případě LHK byla pozorována vyšší afinita vůči barvivům v porovnání s MHK. Hlavní rozdílnost spočívá v tom, že u dynamických experimentů v difúzních celách a kyvetách byly huminové kyseliny homogenně dispergovány v agarózové matrici, tím pádem k interakci s barvivy mohlo docházet v celém objemovém elementu hydrogelu, zatímco u adsorpčních experimentů je možná interakce limitována pouze na povrch huminových kyselin. Důležitou roli tedy v adsorpčních experimentech budou hrát specifický povrch a změna texturních vlastností, které vznikají při modifikaci LHK. Odlišnosti v texturních vlastnostech byly diskutovány v kapitole věnující se charakterizaci pomocí skenovací elektronové mikroskopie (viz. kap. 131

VÝSLEDKY A DISKUZE


6.1.3). Při stanovení specifického povrchu huminových kyselin bylo zjištěno, že MHK disponují dvojnásobně vyšším specifickým povrchem ve srovnání s LHK. Důvod zvýšení specifického povrchu HK metylací může být způsoben tím, že při esterifikaci karboxylových skupin ve struktuře HK dochází k ovlivnění interakce celé molekuly s okolní vodou, vzhledem k tomu, že karboxylové skupiny jsou hlavními hydrofilními strukturami v huminových kyselinách. Z tohoto důvodu je zřejmé, že selektivní modifikace karboxylových skupin bude významným způsobem ovlivňovat stupeň hydratace huminových kyselin. Právě toto může být důvodu, proč mají lignitické huminové kyseliny „hladší“ povrch ve srovnání s modifikovanými HK. Samozřejmě se jedná pouze o hypotézu, kterou je nutné experimentálně ověřit jinými metodami.

132

ZÁVĚR

7


ZÁVĚR

Předložená dizertační práce se zaměřuje na základní výzkum v oblasti studia reaktivity, transportních a bariérových vlastností biokoloidních a syntetických polymerních látek. V rámci řešení dizertační práce byly vyvinuty jednoduché laboratorní difúzní techniky, které byly úspěšně optimalizovány pro stanovení uvedených kritérií širokého spektra substancí. Studium reaktivity a bariérových vlastností výše zmiňovaných látek bylo prováděno v hydrogelových médiích, jakožto vhodné matrici pro realizaci difúzních experimentů, především z hlediska matematického popisu difúze. Výhoda hydrogelů spočívá v tom, že lze připravit materiál přesně definovaných vlastností (rozměry, tvar, velikost pórů, aj.), což je nezbytné pro vytvoření vhodného matematického aparátu pro popis penetračních experimentů. Další výhoda hydrogelů tkví v relativně vysokém obsahu vody, díky kterému lze simulovat přirozené podmínky výše uvedených biokoloidních látek a tím pádem se přiblížit tomu, jak se tyto látky chovají v přirozeném prostředí – příroda. Úspěšně bylo ověřeno, že vyvinuté difúzní techniky v podobě metody difúzních cel a neustálené difúze v kyvetách lze zdárně využít pro studium reaktivity a bariérových vlastností širokého spektra látek počínaje látkami přírodního charakteru, až po syntetické polymery. Pomocí těchto difúzních technik lze také poměrně jednoduchým způsobem stanovovat dopad základních fyzikálně-chemických parametrů na transportní a bariérové vlastnosti zkoumaných látek jako je například vliv teploty, pH, iontové síly případně modifikace materiálu. Úspěšně bylo také prokázáno, že modifikací zkoumaného materiálu (selektivním blokováním kyselých funkčních skupin) lze ovlivnit jeho reaktivitu, což bylo potvrzeno odlišnostmi ve fundamentálních difúzních parametrech při porovnání nativní a modifikované substance. Vyvinuté difúzní techniky v sobě skrývají obrovský potenciál pro jejich případné široké využití v oblasti studia reaktivity, transportních a bariérových vlastností rozličných látek při různých experimentálních podmínkách, ať už se jedná o vliv již zmiňovaných fyzikálně-chemických parametrů či modifikaci materiálu. Vzhledem k tomu, že se jedná o poměrně jednoduché, ekonomicky nenáročné a uživatelsky přívětivé metody, lze tyto difúzní techniky využít na mnohých vědeckých pracovištích pro rychlé avšak poměrně spolehlivé stanovení míry interakcí mezi zvolenou aktivní látkou a difúzním médiem. Tato dizertační práce představuje jakýsi odrazový můstek pro další výzkum, který je nezbytně nutné realizovat, v problematice studia reaktivity, bariérových a transportních vlastností biokoloidních látek. Propojení těchto difúzních technik s jinými metodami vhodnými pro studium interakcí jako například termická analýza případně spektrofotometrické metody zcela jistě poskytne ucelený náhled na reaktivitu a bariérové vlastnosti zkoumaných látek. Je nutné také rozšířit spektrum substancí, které lze pomocí těchto metod studovat o jiné (bio)polymerní, (bio)koloidní či syntetické sloučeniny. Dalším pohledem na studium interakcí v hydrogelových médiích může být korelace naměřených difúzních charakteristik s teoretickými modely vytvořenými pomocí počítačových simulací ve vhodném softwaru. Existuje spoustu možností, kam se může další výzkum ubírat. Předložená dizertační práce představuje pouze zlomek toho, co nás čeká v navazujícím výzkumu v oblasti studia bariérových a transportních vlastností koloidních látek. Tak s chutí do toho! 133

SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY


8


[1]

STEVENSON, F. Humus chemistry: genesis, composition, reactions. 2nd ed. New York: John Wiley and Sons, c1994. ISBN 04-715-9474-1.

[2]

SZALAY, Alex. Cation exchange properties of humic acids and their importance in the geochemical enrichment of UO2 and other cations. Geochimica et Cosmochimica Acta. 1964, vol. 28, no. 10-11, pp. 1605-1614. ISSN 0016-7037.

[3]

JANSEN, Susan, Mark MALATY, Sarah NWABARA, Ernestine JOHNSON, Elham GHABBOUR, Geoffrey DAVIES a James VARNUM. Structural modelling in humic acids. Materials Science and Engineering: C. 1996, vol. 4, no. 3, pp. 175-179. ISSN 0928-4931.

[4]

BERG, B. a C. MCCLAUGHERTY. Plant litter: decomposition, humus formation, carbon sequestration. 2nd ed. Berlin: Springer, c2008. ISBN 35-407-4923-3.

[5]

WAKSMAN, S. A. Humus: origin, chemical composition, and importance in nature. 2nd ed. Baltimore: The Williams and Wilkins company, c1938. ISBN -

[6]

KANG, Shimin, Xianglan LI, Juan FAN a Jie CHANG. Hydrothermal conversion of lignin: A review. Renewable and Sustainable Energy Reviews. 2013, vol. 27, no. 11, pp. 546-558. ISSN 1364-0321.

[7]

KHAN, S. a M. SCHNITZER. Soil organic matter. 1st ed. Amsterdam: Elsevier Scientific Pub. Co. c1975. ISBN 00-808-6975-0.

[8]

GRIMALT, Joan a Cesáreo, SÁIZ-JIMÉNEZ. Lipids of soil humic acids. I. The hymatomelanic acid fraction. Science of the Total Environment. 1989, vol. 81-82, no. 6, pp. 409-420. ISSN 0048-9697.

[9]

ACHARD, Franz Karl. Untersuchung des Torfs. Crell’s Chemische Annalen. 1786, vol. 2, no. 1, pp. 391-403. ISSN -.

[10]

SPRENGEL, C. Die Bodenkunde oder die Lehre vom Boden nebst einer vollständigen Anleitung, Leipzig, 2013. ISBN 978-588-398-415-9.

[11]

BERZELIUS, J. J. Lehrbuch der Chemie, 3rd ed. Dresden and Leipzig, 1839. ISBN -.

[12]

WEBER, James a Stephen WILSON. The isolation and characterization of fulvic acid and humic acid from river water. Water Research. 1975, vol. 9, no. 12, pp. 1079-1084. ISSN 0043-1354.

[13]

DAVIES, Geoffrey, Amjad FATAFTAH, Robert RAFFAUF, Elham GHABBOUR a Susan JANSEN. Isolation of humic acid from the terrestrial plant Brugmansia sanguinea. Science of The Total Environment. 1997, vol. 201, no. 1, pp. 79-87. ISSN 0048-9697.

[14]

GRØN, Christian a Björn RABEN-LANGE. Isolation and characterization of a haloorganic soil humic acid. Science of the Total Environment. 1992, vol. 113, no. 3, pp. 281-286. ISSN 0048-9697.

[15]

KUMADA, K. Chemistry of soil organic matter. 1st ed. New York: Elsevier, c1987. ISBN 04-449-8936-6.

134



[16]

RICE James a Patrick MACCARTHY. Statistical evaluation of the elemental composition of humic substances. Organic Geochemistry. 1991, vol. 17, no. 5, pp. 635648. ISSN 0146-6380.

[17]

TANAKA, Tadeo. Functional groups and reactivity of size-fractionated Aldrich humic acid. Thermochimica Acta. 2012, vol. 532, no. 3, pp. 60-64. ISSN 0040-6031.

[18]

SUTTON, Rebecca a Garrison SPOSITO. Molecular structure in soil humic substances: the new view. Environmental Science and Technology. 2005, vol. 39, no. 23, pp. 90099015. ISSN 0013-936X.

[19]

HALIM, Mohammed, Riccardo SPACCINI, Edith PARLANTI, Abdelilah AMEZGHAL, Alessandro PICCOLO a Mohammed AGDAL. Differences in fluorescence properties between humic acid and its size fractions separated by preparative HPSEC. Journal of Geochemical Exploration. 2013, vol. 129, no. 6, pp. 23-27. ISSN 0375-6742.

[20]

SWAIN, F. M. Geochemistry of humus In. ENGEL M. H. a S. A. MACKO, Organic geochemistry 1st ed. New York: Pergamon Press, c1963. pp. 81-147 ISBN 978-1-46136252-4.

[21]

PICCOLO, Alessandro. The supramolecular structure of humic substances: A novel understanding of humus chemistry and implications in soil science. Advances in Agronomy. 2002, vol. 75, no. 4, pp. 57-134. ISSN 0065-2113.

[22]

SCHULTEN, Hans Rolf a Morris SCHNITZER. A state of the art structural concept for humic substances. Naturwissenschaften. 1993, vol. 80, no. 1, pp. 29-30. ISSN 0028-1042.

[23]

VRBA Vladimír a Ludvík HULEŠ. Humus-půda-rostlina (2) Humus a půda. Biom.cz. 2006, ISSN 1801-2655.

[24]

LUGATO, Emanuele, Gianluca SIMONETTI, Francesco MORARI, Serenella NARDI, Antonio BERTI a Luigu GIARDINI. Distribution of organic and humic carbon in wetsieved aggregates of different soils under long-term fertilization experiment. Geoderma. 2010, vol. 157, no. 3-4, pp. 80-85. ISSN 0016-7061.

[25]

HAJNOS, Mieczyslaw, Aneta CALKA a Grzegorz JOZEFACIUK. Wettability of mineral soils. Geoderma. 2013, vol. 206, no. 11, pp. 63-69. ISSN 0016-7061.

[26]

KALINA, Michal, Martina KLUČÁKOVÁ a Petr SEDLÁČEK. Utilization of fractional extraction for characterization of the interactions between humic acids and metals. Geoderma. 2013, vol. 207-208, no. 10, pp. 92-98. ISSN 0016-7061.

[27]

STERN, Jennifer, Dionysis FOUSTOUKOS, Jeroen SONKE a Vincent SALTERS. Humic acid complexation of Th, Hf and Zr in ligand competition experiments. Chemical Geology. 2014, vol. 363, no. 1, pp. 241-249. ISSN 0009-2541.

[28]

TANG, Wang-Wang, Guang-Ming ZENG, Ji-Lai GONG, Jie LIANG, Piao XU, Chang ZHANG a Bin-Bin HUANG. Impact of humic/fulvic acid on the removal of heavy metals from aqueous solutions using nanomaterials: A review. Science of the Total Environment. 2014, vol. 468-469, no. 1, pp. 1014-1027. ISSN 0048-9697.

135



[29]

MA, Bomou, Aiwen QIN, Xiang LI, Xinzhen ZHAO a Chunju HE. Structure and properties of chitin whisker reinforced chitosan membranes. International Journal of Biological Macromolecules. 2014, vol. 64, no. 3, pp. 341-346. ISSN 0141-8130.

[30]

KHOR, Eugene a Lee Yong LIM. Implantable applications of chitin and chitosan. Biomaterials. 2003, vol. 24, no. 13, pp. 2339-2349. ISSN 0142-9612.

[31]

SYNOWIECKI, Józef a Nadia AL-KHATEEB. Production, properties, and some new applications of chitin and its derivatives. Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 2003, vol. 43, no. 2, pp. 145-171. ISSN 1040-8398.

[32]

KURITA, Keisuke. Chitin and chitosan: functional biopolymers from marine crustaceans. Marine Biotechnology. 2006, vol. 8, no. 3, pp. 203-226. ISSN 1436-2228.

[33]

ISLAM, Atif, Tariq YASIN a Ihtesham REHMAN. Synthesis of hybrid polymer networks of irradiated chitosan/poly(vinyl alcohol) for biomedical applications. Radiation Physics and Chemistry. 2014, vol. 96, no. 3, pp. 115-119. ISSN 0969-806X.

[34]

HADWIGER, Lee. Multiple effects of chitosan on plant systems: solid science or hype. Plant Science. 2013, vol. 208, no. 7, pp. 42-49. ISSN 0168-9452.

[35]

KEEGAN, Gemma, John SMART, Matthew INGRAM, Lara-Martine BARNES a Gareth REES. Chitosan microparticles for the controlled delivery of fluoride. Journal of Dentistry. 2012, vol. 40, no. 3, pp. 229-240. ISSN 0300-5712.

[36]

DODANE, Valérie a Vinod VILIVALAM. Pharmaceutical applications of chitosan. Pharmaceutical Science and Technology. 1998, vol. 1, no. 6, pp. 246-253. ISSN 09755772.

[37]

BURKATOVSKAYA, Martina, George TEGOS, Emilia SWITLIK, Tatiana DEMIDOVA, Ana CASTANO a Michael HAMBLIN. Use of chitosan bandage to prevent fatal infections developing from highly contaminated wounds in mice. Biomaterials. 2006, vol. 27, no. 22, pp. 4157-4164. ISSN 0142-9612.

[38]

LI, Guicai, Luzhong ZHANG, Caiping WANG, Xueying ZHAO, Changlai ZHU, Yanhong ZHENG, Yaling WANG, Yahong ZHAO a Yumin YANG. Effect of silanization on chitosan porous scaffolds for peripheral nerve regeneration. Carbohydrate Polymers. 2014, vol. 101, no. 9, pp. 718-726. ISSN 0144-8617.

[39]

GORCZYCA, Grzegorz, Robert TYLINGO, Ewa AUGUSTIN, Maria SADOWSKA a Sławomir MILEWSKI. Preparation and characterization of genipin cross-linked porous chitosan–collagen–gelatin scaffolds using chitosan–CO2 solution. Carbohydrate Polymers. 2014, vol. 102, no. 11 pp. 901-911. ISSN 0144-8617.

[40]

ALLOUCHE, Fella-Naouel, Eric GUIBAL a Nabil MAMERI. Preparation of a new chitosan-based material and its application for mercury sorption. Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects. 2014, vol. 446, no. 4 pp. 224-232. ISSN 0927-7757.

[41]

ZEBROWSKI, Beth a Gerry FULLER. Rheo-optical studies of concentrated polystyrene solutions subjected to transient simple shear flow. Journal of Polymer Science. 1985, vol. 23, no. 3, pp. 575-589. ISSN 0449-2978.

136



[42]

SEN, Kumar, Sandip ROY a Vinay JUVEKAR. Effect of structure on solution and interfacial properties of sodium polystyrene sulfonate (NaPSS). Polymer International. 2007, vol. 56, no. 2, pp. 167-174. ISSN 0959-8103.

[43]

YEAGER, Howard a Anthony STECK. Cation and water diffusion in nafion ion exchange membranes: influence of polymer structure. Journal of The Electrochemical Society. 1981, vol. 128, no. 9, pp. 1880-1884. ISSN 0013-4651.

[44]

BALDWIN, R. S. Metal Ion Complexation by Sodium Polystyrenesulfonate and Sodium Polyphosphate and the Effects of Complexation on Ion-exchange Selectivity. 1st ed. Buffalo: State University of New York, c1978. ISBN -.

[45]

STERNS, Richard, Maria ROJAS, Paul BERNSTEIN a Sreedevi CHENNUPATI. Ionexchange resins for the treatment of hyperkalemia: Are They Safe and Effective? Journal of the American Society of Nephrology. 2010, vol. 21, no. 5, pp. 733-735. ISSN 10466673.

[46]

PINERI, M. a A. EISENBERG. Structure and properties of ionomers. 1st ed. Netherlands: Springer, c1987. ISBN 978-90-277-2458-8.

[47]

DAUTZENBERG, H. Polyelectrolytes: formation, characterization and application. 1st ed. Mnichov, New York, Cincinnati: Hanser Publishers, Hanser/Gardner, c1994. ISBN 156990-127-9.

[48]

STANFORD, E. A new substance obtained from some of the commoner species of marine algae. The American Journal of Pharmacy. 1883, vol. 55, no. 12, pp. -. ISSN 0326-2383.

[49]

KIM, Hee, Choul LEE a Eun LEE. Alginate lyase: structure, property and application. Biotechnology and Bioprocess Engineering. 2011, vol. 11, no. 10, pp. 843-851. ISSN 1976-3816.

[50]

MCHUGH, D. A guide to the seaweed industry. 1st ed. Řím: Food and Agriculture Organization of the United Nations, c2003. ISBN 92-5-104958-0.

[51]

http://www.seaweed.ie/descriptions/laminaria_digitata.php

[52]

JENSEN, Georg, Christian KNUDSEN, Nanna VIERECK, Mette KRISTENSEN a Arne ASTRUP. Functionality of alginate based supplements for application in humic appetite regulation. Food Chemistry. 2012, vol. 132, no. 2, pp. 823-829. ISSN 0308-8146.

[53]

RHIM, Jongwhan. Physical and mechanical properties of water resistant sodium alginate films. LWT – Food Science and Technology. 2004, vol. 37, no. 3, pp. 323-330. ISSN 0023-6438.

[54]

OLIVAS, Guadalupe a Gustavo BARBOSA-CÁNOVAS. Alginate–calcium films: Water vapor permeability and mechanical properties as affected by plasticizer and relative humidity. LWT – Food Science and Technology. 2008, vol. 41, no. 2, pp. 359-366. ISSN 0023-6438.

[55]

BENAVIDES, Sergio, Ricardo VLLALOBOS-CARVAJAL a Juan REYES. Physical, mechanical and antibacterial properties of alginate film: Effect of the crosslinking degree

137



and oregano essential oil concentration. Journal of Food Engineering. 2012, vol. 110, no. 2, pp. 232-239. ISSN 0260-8774. [56]

AKCAKOCA KUMBASAR, Perrin a Martin BIDE. Reactive dye printing with mixed thickeners on viscose. Dyes and Pigments. 2000, vol. 47, no. 1-2, pp. 189-199. ISSN 0143-7208.

[57]

ŠOŠTAR TURK, Sonja a Reinhold SCHNEIDER. Printing properties of a high substituted guar gum and its mixture with alginate. Dyes and Pigments. 2000, vol. 47, no. 3, pp. 269-275. ISSN 0143-7208.

[58]

VORA, Nishant a Vikas RANA. Preparation and optimization of mouth/orally dissolving tablets using a combination of glycine, carboxymethyl cellulose and sodium alginate: a comparison with superdisintegrants. Pharmaceutical Development and Technology. 2008, vol. 13, no. 3, pp. 233-243. ISSN 1083-7450.

[59]

MANDEL, Kenneth, Bruce DAGGY, David BRODIE a Henry JACOBY. Review article: alginate-raft formulations in the treatment of heartburn and acid reflux. Alimentary Pharmacology and Therapeutics. 2000, vol. 14, no. 6, pp. 669-690. ISSN 0269-2813.

[60]

WANG, David, Chingchun CHEN, Pauline HUYNH a Joshu CHANG. Exploring the potential of using algae in cosmetics. Bioresource Technology. 2015, vol. 184, no. 5, pp. 355-362. ISSN 0860-8524.

[61]

VENKATESAN, Jayachandran, Ira BHATNAGAR, Panchanathan MANIVASAGAN, Kyonghwa KANG a Kwon KIM. Alginate composites for bone tissue engineering: A review. International Journal of Biological Macromolecules. 2015, vol. 72, no. 1, pp. 269-281. ISSN 0141-8130.

[62]

KIRDPONPATTARA, Suchata, Arnon KHAMKEAW, Neeracha SANCHAVANAKIT, Prasit PAVASANT a Muenduen PHISALAPHONG. Structural modification and characterization of bacterial cellulose–alginate composite scaffolds for tissue engineering. Carbohydrate Polymers. 2015, vol. 132, no. 7, pp. 146-155. ISSN 0144-8617.

[63]

WEISSMANN, Bernard a Karl MEYER. The structure of hyalobiuronic acid and of hyaluronic acid from umbilical cord. Journal of the American Chemical Society. 1954, vol. 76, no. 7, pp. 1753-1757. ISSN 0002-7863.

[64]

LEE, Janet a Andrew SPICER. Hyaluronan: a multifunctional, megaDalton, stealth molecule. Current Opinion in Structural Biology. 2000, vol. 12, no. 5, pp. 581-586. ISSN 0955-0674.

[65]

SWANN, David, Eric RADIN, Martin NAZIMIEC, Paul WEISSER, Nathan CURRAN a George LEWINNEK. Role of hyaluronic acid in joint lubrication. Annals of the Rheumatic Diseases. 1974, vol. 33, no. 4, pp. 318-326. ISSN 0003-4967.

[66]

FALCONE, Samuel, David PALMERI a Richard BERG. Rheological and cohesive properties of hyaluronic acid. Journal of Biomedical Materials Research – Part A. 2006, vol. 76, no. 4, pp. 721-728. ISSN 1549-3296.

138



[67]

BANSAL, Jyoti, Suresh KEDIGE a Samir ANAND. Hyaluronic acid: a promising mediator for periodontal regeneration. Indian Journal of Dental Research. 2010, vol. 21, no. 4, pp. 575-578. ISSN 0970-9290.

[68]

LEACH, Jennie, Kathryn BIVENS, Charles PATRICK a Christine SCHMIDT. Photocrosslinked hyaluronic acid hydrogels: natural, biodegradable tissue engineering scaffolds. Biotechnology and Bioengineering. 2003, vol. 82, no. 5, pp. 578-589. ISSN 0006-3592.

[69]

SAETTONE, Marco, Patrizia CHETONI, Maria TILDE TORRACCA, Susi BURGALASSI a Boris GIANNACCINI. Evaluation of muco-adhesive properties and in vivo aktivity of ophthalmic vehicles based on hyaluronic acid. International Journal of Pharmaceutics. 1999, vol. 51, no. 3, pp. 203-212. ISSN 0378-5173.

[70]

HUSKISSON, Edward a Simon DONNELLY. Hyaluronic acid in the treatment of osteoarthritis of the knee. Rheumatology. 1999, vol. 38, no. 7, pp. 602-607. ISSN 14620324.

[71]

KOGAN, Grigorij, Ladislav ŠOLTÉS, Robert STERN a Peter GEMEINER. Hyaluronic acid: a natural biopolymer with a broad range of biomedical and industrial applications. Biotechnology Letters. 2007, vol. 29, no. 1, pp. 17-25. ISSN 0141-5492.

[72]

RENN, Donald. Agar and agarose: indispensable partners in biotechnology. Industrial and Engineering Chemistry Product Research and Development. 1984, vol. 23, no. 1, pp. 17-21. ISSN 0196-4321.

[73]

SAMBROOK, J. a D. RUSSELL. Molecular cloning: a laboratory manual. 3rd. ed. New York: Cold spring harbor laboratory press, c2001. ISBN 978-0-87969577-4.

[74]

MORRIS, Edwin, Katsuyoshi NISHINARI a Marguerite RINAUDO. Gelation of gellan – a review. Food Hydrocolloids. 2012, vol. 28, no. 2, pp. 373-411. ISSN 0268-005X.

[75]

FUJII, Tomoyuki, Toshimasa YANO, Hitoshi KUMAGAI a Sato MIYAWAKI. Scaling analysis of the concentration dependence on elasticity of agarose gel. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 2000, vol. 64, no. 8, pp. 1618-1622. ISSN 0916-8451.

[76]

MATSUO, Masaru, Toshie TANAKA a Lin MA. Gelation mechanism of agarose and κcarrageenan solutions estimated in terms of concentration fluctuation. Polymer. 2002, vol. 43, no. 19, pp. 5299-5309. ISSN 0032-3861.

[77]

STELLWAGEN, John a Nancy STELLWAGEN. Internal structure of the agarose gel matrix. The Journal of Physical Chemistry. 1995, vol. 99, no. 12, pp. 4247-4251. ISSN 1089-5639.

[78]

GRIESS, Gary, Kenneth GUISELEY a Philip SERWER. The relationship of agarose gel structure to the sieving of spheres during agarose gel electrophoresis. Biophysical Journal. 1993, vol. 65, no. 1, pp. 138-148. ISSN 0006-3495.

[79]

ATTWOOD, Teresa, Brenda NELMES a Robert SELLEN. Electron microscopy of beaded agarose gels. Biopolymers. 1988, vol. 27, no. 2, pp. 201-212. ISSN 1097-0282.

139



[80]

HA, Yongchan a Philip BARTER. Rapid separation of plasma lipoproteins by gel permeation chromatography on agarose gel Superose 6B. Journal of Chromatography B. 1985, vol. 341, no. 1, pp. 154-159. ISSN 1570-0232.

[81]

CHUNG, Jinhwa, James WOLLACK, Marisa HOVLID, Ayse OKESLI, Yan CHEN, Joachim MUELLER, Mark DISTEFANO a Andrew TATON. Purification of prenylated proteins by affinity chromatography on cyclodextrin-modified agarose. Analytical Biochemistry. 2009, vol. 386, no. 1, pp. 1-8. ISSN 0003-2697.

[82]

PUÉRTOLAS, José, José VADILLO, Sandra SÁMCHEZ-SALCEDO, Antonio NIETO, Enrique GÓMEZ-BARRENA a María VALLET-REGÍ. Compression behaviour of biphasic calcium phosphate and biphasic calcium phosphate-agarose scaffolds for bone regeneration. Acta Biomaterialia. 2011, vol. 7, no. 2, pp. 841-847. ISSN 1742-7061.

[83]

BHAT Sumrita a Ashok KUMAR. Cell proliferation on three-dimensional chitosanagarose-gelatin cryogel scaffolds for tissue engineering applications. Journal of Bioscience and Bioengineering. 2012, vol. 114, no. 6, pp. 663-670. ISSN 1389-1723.

[84]

GAO, Mingyong, Paul LU, Bridget BEDNARK, Dan LYNAM, James CONNER a Jeff SAKAMOTO. Templated agarose scaffolds for the support of motor axon regeneration into sites of complete spinal cord transection. Biomaterials. 2013, vol. 34, no. 5, pp. 1529-1536. ISSN 0142-9612.

[85]

STEPHEN, A., G. PHILLIPS a P. WILLIAMS. Food polysaccharides and their applications. 2nd ed. Boca Raton, Florida: CRC Press Taylor & Francis Group, c2006. ISBN 978-0-82475922-3.

[86]

VILJOEN, Christopher, Brenda WINGFIELD a Michael WINGFIELD. Agar, an alternative to agarose in analytical gel electrophoresis. Biotechnology Techniques. 1993, vol. 7, no. 10, pp. 723-726. ISSN 1573-6784.

[87]

NISHINARI, K. a E. DOI. Food Hydrocolloids: structures, properties and functions. 1st ed. New York: Springer, c1993. ISBN 978-1-4615-2486-1.

[88]

POUCHLÝ, J. Fyzikální chemie makromolekulárních a koloidních soustav. 3rd ed. Praha: Vydavatelství VŠCHT, c2008. ISBN 978-80-7080-674-6.

[89]

BARTOVSKÁ, L. a M. ŠIŠKOVÁ. Fyzikální chemie povrchů a koloidních soustav. 5th ed. Praha: Vydavatelství VŠCHT, c2005. ISBN 80-7080-579-X.

[90]

ATKINS, P. a J. DE PAULA. Fyzikální chemie. 1st ed. Praha: Vydavatelství VŠCHT, c2013. ISBN 978-80-7080-830-6.

[91]

LI, H. Smart hydrogel modelling. 1st ed. Heidelberg: Springer, c2009. ISBN 978-3-64202367-5.

[92]

BARTOVSKÁ, Lidmila a Marie ŠIŠKOVÁ. Co je co v povrchové a koloidní chemii [online]. Praha: Vydavatelství VŠCHT, 2005.

[93]

AHMED, Enas. Hydrogel: preparation, characterization and applications: a review. Journal of Advanced Research. 2015, vol. 6, no. 2, pp. 105-121. ISSN 2090-1232.

140



[94]

MAITRA, Swati a Kolli REDDY. Estimation of critical stress in jointed concrete pavement. Procedia – Social and Behavioral Sciences. 2013, vol. 104, no. 12, pp. 208217. ISSN 1877-0428.

[95]

HIEMENZ, P. Principles of colloid and surface chemistry. 3rd ed. New York: Marcel Dekker, Inc., c1997. ISBN 08-247-9397-8.

[96]

MASARO, Laurent a Xiaoxia ZHU. Physical models of diffusion for polymer solutions, gels and solids. Progress in Polymer Science. 1999, vol. 24, no. 5, pp. 731-775. ISSN 0079-6700.

[97]

FICK, Adolph. On liquid diffusion. Journal of Membrane Science. 1995, vol. 100, no. 1, pp. 33-38. ISSN 0376-7388.

[98]

ROSSITER, B. a R. BAETZOLD. Physical methods of chemistry, volume 6, determination of thermodynamic properties. 2nd ed. New York: John Wiley and Sons, c1992. ISBN 978-0-471-57087-5.

[99]

CUSSLER, E. Diffusion mass transfer in fluid systems. 2nd ed. Oxford: Oxford University Press, c1975. ISBN 05-215-6477-8.

[100]

CRANK, J. The mathematics of diffusion. 2nd ed. Cambridge: Cambridge University Press, c2000. ISBN 978-0-19-853411-2.

[101]

SOTAK, Christopher. Nuclear magnetic resonance (NMR) measurement of the apparent diffusion coefficient (ADC) of tissue water and its relationship to cell volume changes in pathological states. Neurochemistry International. 2004, vol. 45, no. 4, pp. 569-582. ISSN 0197-0186.

[102]

BARDOW, André a Alfred LEIPERTZ. On the interpretation of ternary diffusion measurements in low-molecular weight fluids by dynamic light scattering. Fluid Phase Equilibria. 2007, vol. 251, no. 2, pp. 579-618. ISSN 0378-3812.

[103]

IVANOV, Dmitri, Thomas GROSSMAN a Joachim WINKELMANN. Comparison of ternary diffusion coefficients obtained from dynamic light scattering and Taylor dispersion. Fluid Phase Equilibria. 2005, vol. 228-229, no. 2, pp. 293-291. ISSN 03783812.

[104]

THOMAS, William a Ian FURZER. Diffusion measurements in liquid by the Gouy method. Chemical Engineering Science. 1962, vol. 17, no. 2, pp. 115-120. ISSN 00092509.

[105]

HRABE, Jan, Gurijinder KAUR a David GUIFOYLE. Principles and limitations of NMR diffusion measurements. Journal of Medical Physics. 2007, vol. 32, no. 1, pp. 34-42. ISSN 0971-6203.

[106]

GARCÍA-GUTIÉRREZ, Miguel, José CORMENZANA, Tiziana MISSANA, Ursula ALONSO. Diffusion of strongly sorbing cations (60Co and 152Eu) in compacted FEBES bentonite. Physics and Chemistry of the Earth, Parts A. 2011, vol. 36, no. 17-18, pp. 1708-1713. ISSN 1474-7065.

141



[107]

FALK, Stephen, Stephen GARRAMONE a Satya SHIWKUMAR. Diffusion coefficient of paracetamol in chitosan hydrogel. Materials Letters. 2004, vol. 58, no. 26, pp. 32613265. ISSN 0167-577X.

[108]

IBRAHIM, Rania a Gerald KASTING. Partitioning and diffusion of parathion in human dermis. International Journal of Pharmaceutics. 2012, vol. 435, no. 1, pp. 33-37. ISSN 0378-5173.

[109]

LAKATOS, István a Irene LAKATOS. Diffusion of chromium ions in polymer/silicate gels. Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects. 1998, vol. 141, no. 3, pp. 425-434. ISSN 0927-7757.

[110]

LAKATOS, István a Irene LAKATOS. Diffusion of H+, H2O and D2O in polymer/silicate gels. Colloids and Surface A: Physicochemical and Engineering Aspects. 2004, vol. 246, no. 1-3, pp. 167-172. ISSN 0927-7757.

[111]

HLAVÁČ, Jan. Základy technologie silikátů. 2nd ed. Praha: SNTL, c1981. ISBN 0482681.

[112]

WAGGONER, Allen a Frank BLUM. Dependence of the solvent diffusion coefficient on concentration in polymer solutions. Macromolecules. 1993, vol. 26, no. 25, pp. 68416848. ISSN 0024-9297.

[113]

THOMAS, Henry. Self-diffusion studies of gel hydration and the obstruction effect. The Journal of Physical Chemistry. 1971, vol. 75, no. 12, pp. 1821-1826. ISSN 1089-5639.

[114]

MACKIE, J. a P. MEARES. The diffusion of electrolytes in a cation-exchange resin membrane. II. Experimental. Proceedings of the Royal Society A: Mathematical, Physical and Engineering Sciences. 1955, vol. 232, no. 1191, pp. 510-518. ISSN 1471-2946.

[115]

BROWN, Wyn, Peter STILBS a Robert JOHNSEN. Self-diffusion and sedimentation of dextran in concentrated solutions. Journal of Polymer Science B: Polymer Physics. 1982, vol. 20, no. 10, pp. 1771-1780. ISSN 1099-0488.

[116]

OGSTON, Alexander, Barry PRESTON a John WELLS. On the transport of compact particles through solutions of chain-polymers. Proceedings of the Royal Society A: Mathematical, Physical and Engineering Sciences. 1973, vol. 333, no. 1594, pp. 297-316. ISSN 1471-2946.

[117]

FOYE, W., T. LEMKE a D. WILLIAMS. Principles of medicinal chemistry. 4th ed. Baltimore: Williams & Wilkins, c1995. ISBN 978-0-683-03323-6.

[118]

JOHANSSON, Lennart a Pia HEDBERG. Diffusion and interaction in gels and solutions. 5. Nonionic micellar systems. The Journal of Physical Chemistry. 1993, vol. 97, no. 3, pp. 747-755. ISSN 1089-5639.

[119]

LAGGNER, P. a O. GLATTER. Trends in Colloid and Interface Science VII. 1st ed. Steinkopff, c1993. ISBN 978-3-7985-0955-9.

[120]

CUKIER, Robert. Diffusion of Brownian spheres in semidilute polymer solutions. Macromolecules. 1984, vol. 17, no. 2, pp. 252-255. ISSN 0024-9297.

142



[121]

ALTENBERGER, Andrzej a Matthew TIRRELL. On the theory of self-diffusion in a polymer gel. The Journal of Chemical Physics. 1984, vol. 80, no. 5, pp. 2208-2213. ISSN 1089-7690.

[122]

PETIT, Jean, Benoit ROUX, Xiaoxia ZHU a Peter MACDONALD. A new physical model for the diffusion of solvents and solute probes in polymer solutions. Macromolecules. 1996, vol. 29, no. 18, pp. 6031-6036. ISSN 0024-9297.

[123]

PHILLIES, George. Numerical interpretation of the concentration dependence of micelle diffusion coefficients. Journal of Colloid and Interface Science. 1987, vol. 119, no. 2, pp. 518-523. ISSN 0021-9797.

[124]

PHILLIES, George. The hydrodynamic scaling model for polymer dynamics. Journal of Non-crystalline Solids. 1991, vol. 131-133, no. 2, pp. 612-619. ISSN 0022-3093.

[125]

DE GENNES, Pierre. Reptation of a polymer chain in the presence of fixed obstacles. The Journal of Chemical Physics. 1971, vol. 55, no. 2, pp. 572-578. ISSN 0021-9606.

[126]

VRENTAS, James, Christine VRENTAS a John DUDA. Comparison of free-volume theories. Polymer Journal. 1993, vol. 25, no. 1, pp. 99-101. ISSN 0014-3057.

[127]

LIANG, Songmiao, Jian XU, Lihui WENG, Hongjum DAI, Xiaoli ZHANG a Lina ZHANG. Protein diffusion in agarose hydrogel in situ measured by improved refractive index method. Journal of Controlled Release. 2006, vol. 115, no. 2, pp. 189-196. ISSN 0168-3659.

[128]

WENG, Lihui, Songmiao LIANG, Lina ZHANG, Xianmin ZHANG a Jian XU. Transport of glucose and poly(ethylene glycol)s in agarose gels studied by the refractive index method. Macromolecules. 2005, vol. 38, no. 12, pp. 5236-5242. ISSN 0024-9297.

[129]

GOLMOHAMADI, Mahmood, Thomas DAVID a Kevin WILKINSON. Diffusion and partitioning of cations in an agarose hydrogel. The Journal of Physical Chemistry A. 2012, vol. 116, no. 25, pp. 6505-6510. ISSN 1089-5639.

[130]

LEAD, Jamie, Konstantin STARCHEV a Kevin WILKINSON. Diffusion coefficients of humic substances in agarose gel and in water. Environmental Science and Technology. 2003, vol. 37, no. 3, pp. 482-487. ISSN 0013-936X.

[131]

GUTENWIK, Jan, Bernt NILSSON a Anders AXELSSON. Determination of protein diffusion coefficients in agarose gel with a diffusion cell. Biochemical Engineering Journal. 2004, vol. 19, no. 1, pp. 1-7. ISSN 1369-703X.

[132]

WESTRIN, Bengt a Anders AXELSSON. A diaphragm diffusion cell applied to ethanol diffusion in agarose gel: a reproducibility study. Biotechnology Techniques. 1991, vol. 5, no. 4, pp. 303-306. ISSN 0951-208X.

[133]

SHACKELFORD, Charles a Stephanie MOORE. Fickian diffusion of radionuclides for engineered containment barriers: diffusion coefficients, porosities and complicating issues. Engineering Geology. 2013, vol. 152, no. 1, pp. 133-147. ISSN 0013-7952.

[134]

SEDLÁČEK, Petr, Jiří SMILEK a Martina KLUČÁKOVÁ. How the interactions with humic acids affect the mobility of ionic dyes in hydrogels – results from diffusion cells.

143



Reactive and Functional Polymers. 2013, vol. 73, no. 11, pp. 1500-1509. ISSN 13815148. [135]

SEDLÁČEK, Petr, Jiří SMILEK a Martina KLUČÁKOVÁ. How the interactions with humic acids affect the mobility of ionic dyes in hydrogels – 2. Non-stationary diffusion experiments. Reactive and Functional Polymers. 2014, vol. 75, no. 2, pp. 41-50. ISSN 1381-5148.

[136]

SMILEK, Jiří, Petr SEDLÁČEK, Michal KALINA a Martina KLUČÁKOVÁ. On the role of humic acids‘ carboxyl groups in the binding of charged organic compounds. Chemosphere. 2015, vol. 138, no. 11, pp. 503-510. ISSN 0045-6535.

[137]

SEDLÁČEK, Petr a Martina KLUČÁKOVÁ. Simple diffusion method applied in evaluation of metal transport in model humic matrices. Geoderma. 2009, vol. 153, no. 12, pp. 11-17. ISSN 0016-7061.

[138]

KLUČÁKOVÁ, Martina, Michal KALINA, Petr SEDLÁČEK a Laurent GRASSET. Reactivity and transport mapping of Cu(II) ions in humic hydrogels. Journal of Soils and Sediments. 2014, vol. 14, no. 2, pp. 368-376. ISSN 1439-0108.

[139]

BEDDOW, Jamie, Robert PETERSON, John HEPTINSTALL a David WALTON. Electrochemical characterisation of the diffusion of a biomolecule through a hydrogel. Journal of Electroanalytical Chemistry. 2003, vol. 544, no. 3, pp. 107-112. ISSN 15726657.

[140]

MADIHALLY, Sundararajan a Howard MATTHEW. Porous chitosan scaffolds for tissue engineering. Biomaterials. 1999, vol. 20, no. 12, pp. 1133-1142. ISSN 0142-9612.

[141]

MAO, Jin, Li ZHAO, Yu YIN a Kang DE YAO. Structure and properties of bilayer chitosan-gelatin scaffolds. Biomaterials. 2003, vol. 24, no. 6, pp. 1067-1074. ISSN 01429612.

[142]

COPELLO, Guillermo, Andrea MEBERT, Maria RAINERI, Mariela PESENTI a Eduardo DÍAZ. Removal of dyes from water using chitosan hydrogel/SiO2 and chitin hydrogel/SiO2 hybrid materials obtained by the sol-gel method. Journal of Hazardous Materials. 2011, vol. 186, no. 1, pp. 932-939. ISSN 0304-3894.

[143]

DOTTO, Luiz, Jaqueline MOURA, Tito CADAVAL a Luiz PINTO. Application of chitosan films for the removal of food dyes from aqueous solutions by adsorption. Chemical Engineering Journal. 2013, vol. 214, no. 1, pp. 8-16. ISSN 1385-8947.

[144]

HARIKISHORE, Reddy a Lee SEUNG-MOK. Application of magnetic chitosan composites for the removal of toxic metal and dyes from aqueous solutions. Advances in Colloid and Interface Science. 2013, vol. 201-202, no. 12, pp. 68-93. ISSN 0001-8686.

[145]

WANSAIME, Ngah, Lee TEONG a Megat HANAFIAH. Adsorption of dyes and heavy metal ions by chitosan composites: a review. Carbohydrate Polymers. 2011, vol. 83, no. 4, pp. 1446-1456. ISSN 0144-8617.

[146]

IQBAL, Javed, Feroza WATTOO, Mahammad WATTOO, Rukhsana MALIK, Syed TIRMIZI, Muhammad IMRAN a Allah GHANGRO. Adsorption of acid yellow dye on

144



flakes of chitosan prepared from fishery wastes. Arabian Journal of Chemistry. 2011, vol. 4, no. 4, pp. 389-395. ISSN 1878-5352. [147]

DOTTO, Luiz a Luiz PINTO. Adsorption of food dyes acid blue 9 and food yellow 3 onto chitosan: stirring rate effect in kinetics and mechanism. Journal of Hazardous Materials. 2011, vol. 187, no. 1-3, pp. 164-170. ISSN 0304-3894.

[148]

YOSHIDA, Cristiana, Carlos BASTOS a Telma FRANCO. Modelling of potassium sorbate diffusion through chitosan films. LWT – Food Science and Technology. 2010, vol. 43, no. 4, pp. 584-589. ISSN 0023-6438.

[149]

GARCÍA-APARICIO, Carlos, Isabel QUIJADA-GARRIDO a Leoncio GARRIDO. Diffusion of small molecules in a chitosan/water gel determined by proton localized NMR spectroscopy. Journal of Colloid and Interface Science. 2012, vol. 368, no. 1, pp. 14-20. ISSN 0021-9797.

[150]

GUY, David, Robert NARINE a Simon DESILVA. Organocation speciation. I. A comparison of the interactions of methylene blue and paraquat with bentonite and humic acid. Canadian Journal of Chemistry. 1980, vol. 58, no. 6, pp. 547-554. ISSN 0008-4042.

[151]

CHAUDHUR, Manju, M. PAL. Conductometric titrations of anionic polyelectrolytes with metachromatic dyes and effects of organic solvents. Macromolecular Chemistry and Physics. 2003, vol. 133, no. 1, pp. 151-160. ISSN 1521-3935.

[152]

JANOŠ, Pavel. Sorption of Basic Dyes onto Iron Humate. Environmental Science and Technology. 2003, vol. 37, no. 24, pp. 5792-5798. ISSN 0013-936X.

[153]

GOLMOHAMADI, Mahmood, Thomas DAVIS a Kevin WILKINSON. Diffusion and partitioning of cations in an agarose hydrogel. Journal of Physical Chemistry A. 2012, vol. 116, no. 25, pp. 6505-6510. ISSN 1089-5639.

[154]

FATIN-ROUGE, Nicolas, Antoine MILON, Jacques BUFFLE, Richard GOULET a André TESSIER. Diffusion and partitioning of solutes in agarose hydrogels: The relative Influence of Electrostatic and Specific Interactions. Journal of Physical Chemistry B. 2003, vol. 107, no. 44, pp. 12126-12137. ISSN 1520-6106.

[155]

GOLMOHAMADI, Mahmood a Kevin WILKINSON. Diffusion of ions in a calcium alginate hydrogel-structure is the primary factor controlling diffusion. Carbohydrate Polymers. 2013, vol. 94, no. 1, pp. 82-87. ISSN 0144-8617.

[156]

JANOŠ, Pavel, Pavel ŠEDIVÝ, Milena RÝZNAROVÁ a Sylvie GRÖTSCHELOVÁ. Sorption of basic and acid dyes from aqueous solutions onto oxihumolite. Chemosphere. 2005, vol. 59, no. 6, pp. 881-886. ISSN 0045-6535.

[157]

JANOŠ, Pavel, Pavel MICHÁLEK a Lukáš TUREK. Sorption of ionic dyes onto untreated low-rank coal – oxihumolite: a kinetic study. Dyes and Pigments. 2007, vol. 74, no. 2, pp. 363-370. ISSN 0143-7208.

[158]

FERNANDES, Andreia, Carlos ALMEIDA, Crislaine MENEZES, Angelo DEBACHER a Maria SIERRA. Removal of methylene blue from aqueous solution by peat. Journal of Hazardous Materials. 2007, vol. 144, no. 1-2, pp. 412-419. ISSN 0304-3894.

145



[159]

SALEM, Jamil, Omar MELAD a Rajai BARAKA. Interaction between sodium polystyrenesulfonate and Triton X-100 in aqueous solution. Journal of Dispersion Science and Technology. 2004, vol. 25, no. 6, pp. 755-758. ISSN 0193-2691.

[160]

XIANHUA, Feng, Liu SHIZHONG a Song HUITING. Studies on interaction between N,N-dimethyldodecylamine oxide and sodium polystyrenesulfonate via light scattering method. Chemical Journal of Chinese Universities. 2003, vol. 24, no. 5, pp. 924-927. ISSN 0251-0790.

[161]

ZHANG, Qian, Wenpei KANG, Dezhi SUN, Jie LIU a Xilian WEI. Interaction between cationic surfactant of 1-methyl-3-tetradecylimidazolium bromide and anionic polymer of sodium polystyrene sulfonate. Applied Surface Science. 2013, vol. 279, no. 10, pp. 353359. ISSN 0169-4332.

[162]

ISHIGURO, Munehide a Luuk KOOPAL. Binding of alkylpyridinium chloride surfactants to sodium polystyrene sulfonate. Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects. 2009, vol. 347, no. 1-3, pp. 69-75. ISSN 0927-7757.

[163]

YOSHIMURA, Tomokazu, Yukiko NAGATA a Kunio ESUMI. Interactions of quaternary ammonium salt-type gemini surfactants with sodium poly(styrene sulfonate). Journal of Colloid and Interface Science. 2004, vol. 275, no. 2, pp. 618-622. ISSN 00219797.

[164]

DOROS, Marios, Maria JERZYKIEWICZ a Yiannis DELIGIANNAKIS. H-binding groups in lignite vs. soil humic acids: NICA-Donnan and spectroscopic parameters. Journal of Colloid and Interface Science. 2009, vol. 332, no. 1, pp. 78-84. ISSN 00219797.

[165]

MILNE, Christopher, David KINNIBURGH, Johannes DE WIT , Wilem VAN RIEMSDIJK a Luuk KOOPAL. Analysis of proton binding by a peat humic acid using a simple electrostatic model. Geochimica et Cosmochimica Acta. 1995, vol. 59, no. 6, pp. 1101-1112. ISSN 0016-7037.

[166]

KOPPLIN-SCHMITT, Phillipe, Norbert HERTKORN, Hans-Rolf SCHULTEN a Antonius KETTRUP. Structural changes in a dissolved solid humic acid during photochemical degradation processes under O2 and N2 atmosphere. Environmental Science and Technology. 1998, vol. 32, no. 17, pp. 2531-2541. ISSN 0013-936X.

[167]

STEELINK, Cornerlius, Gordon TOLLIN, John BERRY, Anthony HO a Harold NORDBY. Alkaline degradation products of soil humic acid. Scientific Proceedings of the Royal Dublin Society. 1960, pp. 59-67. ISSN 0080-4339.

[168]

SWIFT, R. S. IHSS: Isolation of IHSS Soil Fulvic and Humic Acids. In: IHSS: Natural Organic Matter Research [online]. 2013 [cit. 2015-09-30]. Available from: http://www.humicsubstances.org/soilhafa.html)

[169]

KALINA, Michal, Jiří SMILEK a Martina KLUČÁKOVÁ. Light scattering techniques applied for the study of aging of biopolymers and biocolloids. CEITEC Annual Conference - "Frontiers in Materials and Life Sciences". Brno: Masarykova univerzita, 2014. pp. 143-143. ISBN: 978-80-210-7159- 9

146



[170]

RIGGLE, Jeremy a Ray VON WANDRUSZKA. Conductometric characterization of dissolved humic materials. Talanta. 2002, vol. 57, no. 3, pp. 519-526. ISSN 0039-9140.

[171]

SCHNITZER, M. a KHAN, S. U. Humic substances in the environment. 1st ed. New York: Marcel Dekker, c1972. ISBN 08-247-1614-0.

[172]

HERBERT, Harned a Ralph NUTTALL. The diffusion coefficient of potassium chloride in dilute aqueous solution. Journal of American Chemical Society. 1947, vol. 69, no. 4, pp. 736-740. ISSN 0002-7863.

[173]

STOKES, William. Integral diffusion of potassium chloride solutions for calibration of diaphragm cells. Journal of American Chemical Society. 1951, vol. 73, no. 7, pp. 35273528. ISSN 0002-7863.

[174]

SÁNCHEZ-MONEDERO, Miguel, Asunción ROIG, Juan CEGARRA, María BERNAL a Concepción PAREDES. Effect of HCL-HF purification treatment on chemical composition and structure of humic acids. European Journal of Soil Science. 2002, vol. 53, no. 3, pp. 375-381. ISSN 1351-0754.

[175]

ALBÉR, Cathrine, Johan ENGBLOM, Peter FALKMAN a Vitaly KOCHERBITOV. Hydration of hyaluronan: effects on structural and thermodynamic properties. Journal of Physical Chemistry B. 2015, vol. 119, no. 11, pp. 4211-4219. ISSN 1520-6106.

[176]

WAGNER, Gerhard a Frank STEVENSON. Structural arrangement of functional groups in soil humic acid as revealed by infrared analyses. Soil Science Society of America Journal. 1965, vol. 29, no. 1, pp. 43-48. ISSN 1435-0661.

[177]

PICCOLO, Alessandro a Frank STEVENSON. Infrared spectra of Cu2+ Pb2+ and Ca2+ complexes of soil humic substances. Geoderma. 1982, vol. 27, no. 3, pp. 195-208. ISSN 0016-7061.

[178]

LIU, Aiguo a Richard GONZÁLEZ. Modeling adsorption of copper(II), cadmium(II) and lead(II) on purified humic acid. Langmuir. 2000, vol. 16, no. 8, pp. 3902-3909. ISSN 0743-7463.

[179]

GUAN, Xiaohong, Hao CHEN a Chii SHANG. Combining kinetic investigation with surface spectroscopic examination to study the role of aromatic carboxyl groups in NOM adsorption by aluminum hydroxide. Journal of Colloid and Interface Science. 2006, vol. 301, no. 2, pp. 419-427. ISSN 0021-9797.

[180]

DE PAOLIS, Fabrizio a Jussi KUKKONEN. Binding of organic pollutants to humic and fulvic acids: influence of pH and the structure of humic material. Chemosphere. 1997, vol. 34, no. 8, pp. 1693-1704. ISSN 0045-6535.

[181]

ANDJELKOVIC, Tatjana, Jelica PEROVIC, Milovan PURENOVIC, Srdjan BLAGOJEVIC, Ruzica NIKOLIC, Darko ANDJELKOVIC a Aleksandar BOJIC. A direct potentiometric titration study of the dissociation of humic acid with selectively blocked functional groups. Ecletica Quimica. 2006, vol. 31, no. 3, pp. 39-46. ISSN 01004670.

[182]

ANDJELKOVIC, Tatjana, Jelica PEROVIC, Milovan PURENOVIC, Srdjan BLAGOJEVIC, Ruzica NIKOLIC, Darko ANDJELKOVIC a Aleksandar BOJIC.

147



Spectroscopic and potentiometric studies on derivatized natural humic acid. Analytical Sciences. 2006, vol. 22, no. 12, pp. 1553-1558. ISSN 0910-6340. [183]

LEAIST, Derek. The effects of aggregation, counterion binding, and added NaCl on diffusion of aqueous methylene blue. Canadian Journal of Chemistry. 1988, vol. 66, no. 9, pp. 2452-2457. ISSN 0008-4042.

[184]

HORI, Tomiei, N. KAMON, Hiroaki KOJIMA, Rolf ROHNER a Heinrich ZOLLINGER. Structure correlation between diffusion coefficients of simple organic compounds and of anionic and cationic dyes in water. Journal of the Society of Dyers and Colourists. 1987, vol. 103, no. 7-8, pp. 265-270. ISSN 0037-9859.

[185]

HOGAN, Michael, J. WANG, Robert AUSTIN, Constance MONITTO a S. HERSHKOWITZ. Molecular motion of DNA as measured by triplet anisotropy decay. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 1982, vol. 79, no. 11, pp. 3518-3522. ISSN 0027-8424.

[186]

SAMIEY, Babak a Fatemeh ASHOORI. Adsorptive removal of methylene blue by agar: effects of NaCl and ethanol. Chemistry Central Journal. 2012, vol. 6, no. 1, pp. 14-27. ISSN 1752-153X.

[187]

AYMARD, Pierre, Dave MARTIN, Kevin PLUCKNETT, Tim FOSTER, Allan CLARK a Ian NORTON. Influence of thermal history on the structural and mechanical properties of agarose gels. Biopolymers. 2001, vol. 59, no. 3, pp. 131-144. ISSN 0006-3525.

[188]

FERNÁNDEZ, Emiliano, Daniel LÓPEZ, Carmen MIJANGOS, Miroslava DUŠKOVÁSMRČKOVÁ, Michal ILAVSKÝ a Karel DUŠEK. Rheological and thermal properties of agarose aqueous solutions and hydrogels. Journal of Polymer Science, Part B: Polymer Physics. 2008, vol. 46, no. 3, pp. 322-328. ISSN 0887-6266.

[189]

SAN BIAGIO, P., Donatella BULONE, Antonio EMANUELE, M. PALMAVITTORELLI a Marcela PALMA. Spontaneous symmetry-breaking pathways: timeresolved study of agarose gelation. Food Hydrocolloids. 1996, vol. 10, no. 1, pp. 91-97. ISSN 0268-005X.

[190]

MIDDENDORF, H., Daniela DI COLA, Fabrizio CAVATORTA, Antonio DERIU A Cohn CARLILE. Water dynamics in biopolymer gels by quasi-elastic neutron scattering. Biophysical Chemistry. 1994, vol. 53, no. 1-2, pp. 145-153. ISSN 0301-4622.

[191]

GENDRON, Paul, Fabrice AVALTRONI a Kevin WILKINSON. Diffusion coefficients of several rhodamine derivatives as determined by pulsed field gradient–nuclear magnetic resonance and fluorescence correlation spectroscopy. Journal of Fluorescence. 2008, vol. 18, no. 6, pp. 1093-1101. ISSN 1053-0509.

[192]

DARÉ-DOYEN, S., Denis DOIZI, Philippe GUIBAUD, Florence DJEDAINI-PILARD, Bruno PERLY a Philippe MILLIÉ. Dimerization of xanthene dyes in water: experimental studies and molecular dynamic simulations. Journal of Physical Chemistry B. 2003, vol. 107, no. 50, pp. 13803-13812. ISSN 1520-6106.

[193]

FERNANDES, Andreia, Carlos ALMEIDA, Angelo DEBACHER a Maria SIERRA. Isotherm and thermodynamic data of adsorption of methylene blue from aqueous solution

148



onto peat. Journal of Molecular Structure. 2010, vol. 982, no. 1-3, pp. 62-65. ISSN 00222860. [194]

SENESI, Nicola, Valeria D’ORAZIO a Teodoro MIANO. Adsorption mechanisms of striazine and bipyridylium herbicides on humic acids from hop field soils. Geoderma. 1995, vol. 66, no. 3-4, pp. 273-283. ISSN 0016-7061.

[195]

IGLESIAS, Ana, Rocío LÓPEZ, Dora GONDAR, Juan ANTELO, Sarah FIOL a Florencio ARCE. Effect of pH and ionic strength on the binding of paraquat and MCPA by soil fulvic and humic acids. Chemosphere. 2009, vol. 76, no. 1, pp. 107-113. ISSN 0045-6535.

[196]

MASZKOWSKA, Joanna, Marta WAGIL, Katarzyna MIODUSZEWSKA, Jolanta KUMIRSKA, Piotr STEPNOWSKI a Anna BIALK-BIELINSKA. Thermodynamic studies for adsorption of ionizable pharmaceuticals onto soil. Chemosphere. 2014, vol. 111, no. 9, pp. 568-574. ISSN 0045-6535.

[197]

ZANINI, Graciela, Marcelo AVENA, Sarah FIOL a Florencio ARCE. Effects of pH and electrolyte concentration on the binding between humic acid and an oxazine dye. Chemosphere. 2006, vol. 63, no. 3, pp. 430-439. ISSN 0045-6535.

[198]

DUNMIRE, Erik, Audra PLENYS a David KATZ. Spectrophotometric analysis of molecular transport in gels. Journal of Controlled Release. 1999, vol. 57, no. 2, pp. 127140. ISSN 0168-3659.

[199]

OSTERGAARD, Jesper, Emil MENG-LUND, Susan LARSEN, Claus LARSEN, Karsten PETERSSON, Jim LENKE a Henrik JENSEN. Real-time UV imaging of nicotine release from transdermal patch. Pharmaceutical Research. 2010, vol. 27, no. 12, pp. 2614-2623. ISSN 0724-8741.

[200]

YE, Fengbin, Anan YAGHMUR, Henrik JENSEN, Susan LARSEN, Claus LARSEN a Jesper OSTERGAARD. Real-time UV imaging of drug diffusion and release from Pluronic F127 hydrogels. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 2011, vol. 43, no. 4, pp. 236-243. ISSN 0928-0987.

[201]

GHOSH, Kumar a Pasupati MUKERJEE. Multiple association equilibria in the selfassociation of methylene blue and other dyes. Journal of the American Chemical Society. 1970, vol. 92, no. 22, pp. 6408-6412. ISSN 0002-7863.

[202]

SARIRI, Reyhaneh, Mohammad ZAKERHAMIDI, K. BAHARPAIMA a Ali GHANADZADEH. The anion effect and molecular association of rhodamine dyes in isotropic and anisotropic solvents. Journal of Molecular Liquids. 2004, vol. 115, no. 1, pp. 55-61. ISSN 0167-7322.

[203]

WENG, Huang a Fong PAN. Adsorption of a cationic dye (methylene blue) onto spent activated clay. Journal of Hazardous Materials. 2007, vol. 144, no. 1-2, pp. 355-362. ISSN 0304-3894.

[204]

ZAKER, Y., M. HOSSAIN a T. ISLAM. Effect of various factors on the adsorption of methylene blue on silt fractionated from Bijoypur soil, Bangladesh. International Research Journal of Environment Sciences. 2013, vol. 2, no. 6, pp. 1-7. ISSN 2319-1414.

149



[205]

MARSCHNER, Bernd. Sorption von polyzyklischen aromatischen Kohlenwasserstoffen (PAK) und polychlorierten Biphenylen (PCB) im Boden. Journal of Plant Nutrition and Soil Science. 2000, vol. 162, no. 1, pp. 1-14. ISSN 1522-2624.

[206]

NARAYANAN, Janaky, Jun XIONG a Xiang LIU. Determination of agarose gel pore size: absorbance measurements vis a vis other techniques. Journal of Physics: Conference Series. 2006, vol. 28, no. 83-86, pp. 83-86. ISSN 1742-6596.

[207]

KLUČÁKOVÁ, Martina a Miloslav PEKAŘ. New model for equilibrium sorption of metal ions on solid humic acids. Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects. 2006, vol. 286, no. 1-3, pp. 126-133. ISSN 0927-7757.

[208]

KLUČÁKOVÁ, Martina a Ladislav OMELKA. Sorption of metal ions on lignite and humic acids. Chemical Papers. 2004, vol. 58, no. 3, pp. 170-175. ISSN 0366-6352.

[209]

KLUČÁKOVÁ, Martina, Michal KALÁB, Miloslav PEKAŘ a Lubomír LAPČÍK. Study of the structure and properties of humic and fulvic acids. II. Study of adsorption of Cu2+ ions to humic acids extracted from lignite. Journal of Polymer Materials. 2002, vol. 19, no. 3, pp. 287-294. ISSN 0970-0838.

[210]

POLEXE, Ramona a Thierry DELAIR. Elaboration of stable and antibody functionalized positively charged colloids by polyelectrolyte complexation between chitosan and hyaluronic acid. Molecules. 2013, vol. 18, no. 7, pp. 8563-8578. ISSN 1420-3049.

[211]

GARG, H.G. a HALES, C.A. Chemistry and Biology of Hyaluronan. London: Elsevier Science & Technology, c2004. ISBN 978-008-044-382-9.

[212]

WALTER, R.H. a TAYLOR S. Polysaccharide dispersions: chemistry and rechnology in food. Massachusetts: Academic Press, Inc., c1997. ISBN 978-012-733-865-1.

[213]

MOYER, B.A. Ion exchange and solvent extraction: a series of advances. Florida: CRC Press, c2009. ISBN 978-142-005-969-4.

[214]

BANSAL, Jyoti, Suresh KEDIGE a Samir ANAND. Hyaluronic acid: a promising mediator for periodontal regeneration. Indian Journal of Dental Research. 2010, vol. 21, no. 4, pp. 575-578. ISSN 0970-9290.

[215]

MAZUR, Kamila, Richard BÜCHNER, Mischa BONN a Johannes HUNGER. Hydration of sodium alginate in aqueous solution. Macromolecules. 2014, vol. 47, no. 2, pp. 771776. ISSN 0024-9297.

[216]

KLUČÁKOVÁ, Martina a Michal KALINA. Diffusivity of Cu(II) ions in humic gels – influence of reactive functional groups of humic acids. Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects. 2015, vol. 483, no. 10, pp. 162-170. ISSN 0927-7757.

[217]

KLUČÁKOVÁ, Martina, Michal KALINA, Petr SEDLÁČEK a Laurent GRASSET. Reactivity and transport mapping of Cu(II) ions in humic hydrogels. Journal of Soil and Sediments. 2014, vol. 14, no. 2, pp. 368-376. ISSN 1439-0108.

150

PŘEHLED ZKRATEK

9


PŘEHLED ZKRATEK

HL

huminové látky

SOM

půdní organická hmota (z anglického Soil Organic Matter)

HK

huminové kyseliny

FK

fulvinové kyseliny

HU

huminy

Da

Dalton

HMK

hymatomelanové kyseliny

CHIT

chitosan

PSS

polystyrensulfonát

NaPSS

polystyrensulfonát sodný

MA

manurát

GU

guluronát

WHO

světová zdravotnická organizace

ALG

alginát

HYA

kyselina hyaluronová

AG

agaróza

GPC

gelová permeační chromatografie

ERF

chybová funkce

MB

methylenová modř

RH

rhodamin 6G

AMD

amidočerň

UV-VIS

ultrafialová a viditelná spektrofotometrie

ITC

isotermální titrační kalorimetrie

DLS

dynamický rozptyl světla

REO

reologie, reometrie, reometr

SEM

skenovací elektronová mikroskopie

FT-IR

infračervená spektrofotometrie s Fourierovou transformací

EA

elementární analýza

DDAO

lauryldimethylamin oxid

RPM

počet otáček za minutu (z anglického round per minute)

LHK

lignitické huminové kyseliny

151

PŘEHLED ZKRATEK


MHK

metylované lignitické huminové kyseliny

IHSS

Mezinárodní společnost pro huminové látky

IHSS HK

standard huminových kyselin izolovaný z leonarditu

IHSS MHK

metylovaný standard huminových kyselin izolovaný z leonarditu

TMS

trimethylsilyldiazometan

ATR

zeslabený úplný odraz (z anglického attenuated total reflectance)

LVO

lineární viskoelastická oblast

PBS

fosfátový pufr (z anglického phosphate buffered saline)

PEG

polyetylenglykol

PVA

polyvinylalkohol

BET

Branauer-Emmett-Teller analýza

IS

iontová síla

152

SEZNAM POUŽITÝCH SYMBOLŮ

10



Q

stupeň nabotnání

m1

hmotnost botnajícího hydrogelu

[m]

m0

počáteční hmotnost xerogelu

[m]

t

čas

ρ

hustota kapaliny

∆V

rozdíl objemu před a po botnání

Φ

objemový koeficient botnání

W

práce

µ

chemický potenciál

x

prostorová souřadnice

[m]

p

tlak

[Pa]

T

termodynamická teplota

[K]

F

síla

[N]

J

difúzní tok

A

plocha

j

hustota difúzního toku

D

difúzní koeficient

c

molární koncentrace

[mol·m-3]

cAK

akumulovaná koncentrace

[mol·m-3]

rin

hmotnostní bilance do materiálu

[a.u.]

rout

hmotnostní bilance z materiálu

[a.u.]

∆z

tloušťka tenké membrány

c10

počáteční koncentrace v čase 0

[mol·m-3]

c1

koncentrace v čase Y

[mol·m-3]

c1l

koncentrace v čase Y ve filmu o tloušťce l

[mol·m-3]

l

tloušťka filmu

Deff

efektivní difúzní koeficient

H

b

rozdělovací koeficient

[a.u.]

chybová funkce

[a.u.]

s

entropie

ru

[a.u.]

[s] [kg·m-3] [m3] [a.u.] [J] [J·mol-1]

[mol·s-1] [m2] [mol·m-2·s-1] [m2·s-1]

[m]

[m] [m2·s-1]

[J·K-1]

rychlostní konstanta chemické reakce

153

[mol·dm-3·s-1]



K

rovnovážná konstanta chemické reakce

c2

koncentrace solutu, který podstoupil chem. reakci

ϕ

porozita

[a.u.]

τ

tortuozita

[a.u.]

kB

Boltzmannova konstanta

[J·K-1]

f

frikční koeficient

[kg·s-1]

µ0

viskozita systému

[m2·s-1]

R0

poloměr

β

konstanta difúzní cely

V

objem

D0

difúzní koeficient v čistém prostředí

ϕ

objemová frakce polymeru

[%]

ϕ’

objemová frakce polymer + nedifundující rozpouštědlo

[%]

χ ¯

faktor závisející na tvaru molekuly

[a.u.]

parametr závisející na tvaru a fyz. vlastnostech polymeru

[a.u.]

RH

hydrodynamický poloměr

[m]

rV

efektivní poloměr řetězce polymeru

[m]

E1

exponenciální integrál

ζL

frikční koeficient pro tyčinku

[kg·s-1]

η

dynamická viskozita systému

[Pa·s]

zL

poměrné zastoupení tyčinkových molekul

[a.u.]

poměrné zastoupení kulovitých molekul

[a.u.]

ν

parametr závisející na molekulové hmotnosti

[a.u.]

M

molekulová hmotnost

[g·mol-1]

Ea

aktivační energie

[J·mol-1]

wi

hmotnostní frakce komponenty

[%]

specifický objem

[m3]

γi

překryvový faktor

[a.u.]

Tg

teplota skelného přechodu

[K]

k11 – k22

parametry volného objemu

[a.u.]

ξ

zeta potenciál

[mV]

f

frekvence oscilací

zC∗

∗ Ì % #

[a.u.] [mol·dm-3]

[m] [a.u.] [m3]

154

[m2·s-1]

[a.u.]

[Hz]



γu

amplituda deformace

[%]

G

vodivost

[S]

G'

elastický (paměťový) modul

[Pa]

G''

viskózní (ztrátový) modul

[Pa]

G*

komplexní modul

[Pa]

η*

komplexní viskozita

δ

ztrátový úhel

λmax

vlnová délka odpovídající maximální absorbanci

ε

molární extinkční koeficient

A

absorbance

d

optická dráha (délka)

[m]

β

konstanta difúzní cely

[m-2]

cd

koncentrace ve zdrojové části difúzní cely

[g·dm-3]

ca

koncentrace v přijímací části difúzní cely

[g·dm-3]

εxyy

[Pa·s] [°] [nm] [dm3·mol-1·cm-1] [a.u.]

efektivní porozitní faktor

[a.u.]

Tm

tortuozita

[a.u.]

∆cgel

rozdíl koncentrací na obou stranách gelu

L

tloušťka gelu

[m]

Le

skutečná vzdálenost, kterou barvivo urazí

[m]

Da

zdánlivý difúzní koeficient

α

“rock capacity factor”

[a.u.]

Kapp

zdánlivá rovnovážná konstanta

[a.u.]

tL

čas průchodu

w

hmotnostní koncentrace

[hm. %]

Svol

množství volného solutu

[mol]

Ssor

množství nasorbovaného solutu

[mol]

cvol

koncentrace volného solutu

[g·dm-3]

csor

koncentrace nasorbovaného solutu

[g·dm-3]

cvol,x=0

časově nezávislá koncentrace ve zdrojovém médiu

[g·dm-3]

A

předexponencionální factor

cs

koncentrace na rozhraní hydrogel-roztok

¶

[g·dm-3]

[m2·s-1]

[s]

koeficient zahrnující hydrodyn. interakce

155

[dm3·mol-1·s-1] [g·dm-3]

[a.u.]

SEZNAM OBRÁZKŮ

11


SEZNAM OBRÁZKŮ

Obr. 1

Mechanismus formování huminových látek.

Obr. 2

Schématické znázornění ligninové teorie tvorby huminových látek.

Obr. 3

Vlastnosti jednotlivých frakcí huminových látek.

Obr. 4

Schéma frakcionace půdní organické hmoty (humus).

Obr. 5

Hypotetická struktura huminových kyselin podle Flaiga.

Obr. 6

Strukturní vzorek huminových kyselin podle Steelinka.

Obr. 7

Stevensonův strukturní model huminových kyselin.

Obr. 8

Strukturní vzorek huminových kyselin podle Schultena a Schnitzera.

Obr. 9

Rozdíl ve struktuře chitinu a chitosanu.

Obr. 10

Schématické znázornění vzniku polystyrensulfonátu sulfonací polystyrenu.

Obr. 11

Vznik finálního produktu s hydroxidem sodným.

Obr. 12

Strukturní vzorec alginátu (vlevo) a hnědá řasa Laminaria digitata (vpravo).

Obr. 13

Základní chemická struktura kyseliny hyaluronové.

Obr. 14

Strukturní vzorec lineárního polysacharidu – agaróza.

Obr. 15

Vznik chemicky síťovaného hydrogelu reakcí polymeru obsahujícího hydroxylové skupiny s glutaraldehydem.

Obr. 16

Tixotropní chování gelů (časová závislost viskozity, červená křivka symbolizuje proměnnou viskozitu, zatímco černá křivka značí impuls aplikovaného napětí neboli deformace).

Obr. 17

Příklad difúze s naznačením Brownova pohybu.

Obr. 18

Difúze skrz tenký film.

Obr. 19

Příklad zakřivení trajektorie difundujících částic (tortuozita).

Obr. 20

Princip neustálené difúze.

Obr. 21

Schématické znázornění difúzní cely v horizontálním uspořádání.

Obr. 22

Nekonečný pár. Dva pevné vzorky o různých koncentracích spojené dohromady (v čase t = 0 – nahoře a v čase t = t1 – dole).

Obr. 23

Zředěný roztok polymeru (vlevo), středně koncentrovaný roztok polymeru (uprostřed) a koncentrovaný roztok polymeru (vpravo).

Obr. 24

Schéma gelace agarózových hydrogelů (termoreverzibilní proces).

Obr. 25

Teflonová forma pro přípravu agarózových hydrogelů (vlevo) a 1 hm. % agarózový hydrogel (vpravo).

polystyrensulfonátu

156

sodného

neutralizační

reakcí

SEZNAM OBRÁZKŮ


Obr. 26

Vzorky 1 hm. % agarózových hydrogelů s různou koncentrací huminových kyselin (LHK) v následujících procentuálních zastoupeních (zleva – 0,000 hm. %, 0,002 hm. %, 0,005 hm. % a 0,010 hm. %, vždy po dvou vzorcích).

Obr. 27

Kyvety s 1 hm. % agarózovým gelem lišící se koncentrací alginátu ponořeny v barvivu methylenová modř respektive rhodamin (vlevo). Speciální polohovatelné zařízení určené pro měření UV-VIS spekter v různé vzdálenosti od rozhraní kyvetaroztok (vpravo).

Obr. 28

Příklad naměřených UV-VIS profilů v surové podobě (vlevo) a po vyhlazení (vpravo) v programu Origin 8.

Obr. 29

Ukázka odečtu základní linie agarózy od píku methylenové modři (λmax = 665 nm).

Obr. 30

Příklad kalibrační závislosti pro 1 hm. % + 0,005 hm. % alginátu sodného.

Obr. 31

Koncentrační profily pro 1 hm. % agarózový gel bez přídavku PSS (vlevo) a 1 hm. % agarózový gel s přídavkem 0,01 hm. % PSS (vpravo).

Obr. 32

Difúzní cela při penetraci methylenové modři přes 1 hm. % agarózový hydrogel s 0,01 hm. % IHSS HK.

Obr. 33

Příklad časové závislosti koncentrace barviva v přijímací části difúzní cely.

Obr. 34

Ukázka realizace sorpčních experimentů na agarózové hydrogely. Vlevo sorpce na hydrogelech, vpravo adsorpce na pevných částicích huminových kyselin.

Obr. 35

Příklad termogravimetrické křivky pro polystyrensulfonát sodný.

Obr. 36

Infračervená spektra lignitických respektive metylovaných lignitických huminových kyselin.

Obr. 37

Snímky pořízené pomocí SEM analýzy pro lignitické huminové kyseliny (vlevo) a metylované lignitické huminové kyseliny (vpravo) při zvětšení 1000× (nahoře) respektive 100 000× (dole).

Obr. 38

Závislost viskoelastických modulů (G' – plné symboly a G'' – prázdné symboly) na amplitudě deformace při konstantní frekvenci 1 Hz (vlevo) a závislost viskoelastických modulů na frekvenci oscilací při konstantní amplitudě deformace 0,1 % (vpravo) pro různě agarózové hydrogely lišící se svou koncentrací.

Obr. 39

Závislost viskoelastických modulů (G' – plné symboly a G'' – prázdné symboly) na amplitudě deformace při konstantní frekvenci 1 Hz (vlevo) a závislost viskoelastických modulů na frekvenci oscilací při konstantní amplitudě deformace 0,1 % (vpravo) pro 1 hm. % agarózový gel. Porovnání viskoelastických modulů v závislosti na stáří hydrogelu.

Obr. 40

Amplitudový test při konstantní frekvenci 1 Hz. Porovnání viskoelastických modulů (G' – plné symboly a G'' – prázdné symboly) pro 1 hm. % agarózový gel s přídavkem vybraných aktivních látek.

Obr. 41

Frekvenční test s konstantní amplitudou deformace 0,1 %. Porovnání viskoelastických modulů (G' – plné symboly a G'' – prázdné symboly) pro 1 hm. % agarózový gel s přídavkem vybraných aktivních látek.

157

SEZNAM OBRÁZKŮ


Obr. 42

Změna koncentrace methylenové modři v přijímací části difúzní cely jako funkce času (vlevo), vypočítaná funkce LN jako funkce času při různých teplotách (vpravo).

Obr. 43

Závislost přirozeného logaritmu difúzního koeficientu na převrácené hodnotě termodynamické teploty.

Obr. 44

Závislost difúzního toku pro různě koncentrované agarózové hydrogely při různých teplotách (vlevo) a závislost přirozeného logaritmu efektivního difúzního koeficientu na inverzní termodynamické teplotě (vpravo).

Obr. 45

Rozdělovací koeficient (H) v závislosti na koncentraci agarózy v hydrogelu pro methylenovou modř.

Obr. 46

Efektivní porozita agarózových hydrogelů při různých teplotách (vlevo) a tortuozita agarózových hydrogelů lišících se koncentrací (vpravo).

Obr. 47

Časová závislost koncentrace difúzní sondy (methylenová modř – vlevo, rhodamin 6G – vpravo) pro 1 hm. % AG gel s proměnným přídavkem LHK.

Obr. 48

Zdánlivá rovnovážná konstanta (Kapp) pro 1 hm. % AG gely s přídavkem LHK. Vlevo – methylenová modř při teplotě 30, 40 a 50 °C, vpravo – rhodamin 6G, pouze při teplotě 30 °C.

Obr. 49

Difúzní tok pro AG hydrogely s různým přídavkem LHK respektive MHK. Vlevo – methylenová modř, vpravo – rhodamin 6G.

Obr. 50

Zdánlivé difúzní koeficienty (Da) pro AG gely s přídavkem LHK respektive MHK. Vlevo – methylenová modř, vpravo – rhodamin 6G.

Obr. 51

Čas průchodu zvolených barviv přes AG hydrogely s různým přídavkem LHK respektive MHK. Vlevo – methylenová modř, vpravo – rhodamin 6G.

Obr. 52

Difúze MB do struktury 1 hm. % AG hydrogelu s přídavkem LHK po 72 hodinách. Přídavek LHK zleva: 0,000 hm. %, 0,002 hm. %, 0,005 hm. % a 0,010 hm. %. Vždy po dvou vzorcích.

Obr. 53

Vývoj koncentrace MB v závislosti na vzdálenosti od rozhraní hydrogel-roztok pro 1 hm. % agarózové hydrogely s různou koncentrací lignitických huminových kyselin.

Obr. 54

Zdánlivý difúzní koeficient pro 1 hm. % AG hydrogely s přídavkem LHK při teplotách 30, 40 a 50 °C. Vlevo – methylenová modř, vpravo – rhodamin 6G.

Obr. 55

Zdánlivá rovnovážná konstanta Kapp pro agarózové hydrogely s různým přídavkem LHK při proměnné teplotě. Vlevo – methylenová modř, vpravo – rhodamin 6G.

Obr. 56

Hodnoty koncentrace na rozhraní hydrogel-roztok cs (vlevo) a rozdělovacího koeficientu H (vpravo) a pro 1 hm. % AG hydrogel bez přídavku respektive s 0,01 hm. % LHK při různém pH.

Obr. 57

Poměrová závislost zdánlivých difúzních koeficientů pro AG hydrogely s různou koncentrací LHK respektive MHK vztažená na referenční 1 hm. % AG hydrogel. Vlevo – methylenová modř, vpravo – rhodamin 6G.

158

SEZNAM OBRÁZKŮ


Obr. 58

Poměrová koncentrace barviva na rozhraní hydrogel-roztok pro AG hydrogely s různou koncentrací LHK respektive MHK vztažená na referenční 1 hm. % AG hydrogel. Vlevo – methylenová modř, vpravo – rhodamin 6G.

Obr. 59

Difúzní tok v závislosti na koncentraci HK v 1 hm. % AG hydrogelu. Vlevo – metylenová modř, vpravo – rhodamin 6G.

Obr. 60

Čas průchodu barviva skrz 1 hm. % AG hydrogel v závislosti na koncentraci HK. Vlevo – methylenová modř, vpravo – rhodamin 6G.

Obr. 61

Závislost Da,HK/Da,AG na koncentraci IHSS HK v 1 hm. % AG hydrogelu. Vlevo – methylenová modř, vpravo – rhodamin 6G.

Obr. 62

Závislost koncentrace na rozhraní hydrogel-roztok vztažené na referenční koncentraci na rozhraní pro 1 hm. % AG hydrogel v závislosti na koncentraci IHSS HK v hydrogelu. Vlevo – methylenová modř, vpravo – rhodamin 6G.

Obr. 63

Difúzní tok Jd (vlevo) a čas průchodu barviva tL (vpravo) pro 1 hm. % AG hydrogely s různou koncentrací alginátu. Výsledky z difúzní cely.

Obr. 64

Nasorbované množství barviva ns (vlevo) a efektivní difúzní koeficient Deff (vpravo) pro 1 hm. % AG hydrogely s různou koncentrací alginátu. Výsledky z difúzní cely.

Obr. 65

Zdánlivý difúzní koeficient (vlevo) a koncentrace na rozhraní hydrogel-roztok (vpravo) pro 1 hm. % AG hydrogely s různým množstvím chitosanu při použití AMD jako difúzního média. Výsledky z neustálené difúze v kyvetách.

Obr. 66

Zdánlivý difúzní koeficient Da (vlevo) a koncentrace na rozhraní hydrogel-roztok cs (vpravo) pro AG hydrogely s různým přídavkem PSS. Výsledky z neustálené difúze v kyvetách.

Obr. 67

Difúze methylenové modři do AG hydrogelu s přídavkem polystyrensulfonátu sodného (vlevo) a kyseliny hyaluronové (vpravo) po 72 hodinách. Zleva – 0,000 hm. %, 0,002 hm. %, 0,005 hm. % a 0,010 hm. % aktivní látky.

Obr. 68

Rovnovážné koncentrace barviva v AG hydrogelech s různou koncentrací HK.

Obr. 69

Relativní zastoupení methylenové modři v hydrogelech při desorpčních experimentech. Vlevo – lignitické huminové kyseliny, vpravo – metylované lignitické huminové kyseliny.

Obr. 70

Relativní zastoupení rhodaminu 6G v hydrogelech při desorpčních experimentech. Vlevo – lignitické huminové kyseliny, vpravo – metylované lignitické huminové kyseliny.

Obr. 71

Nasorbované množství barviva vztažené na gram pevných huminových kyselin v závislosti na původní koncentraci barviva v roztoku. Vlevo – methylenová modř, vpravo – rhodamin 6G.

159

SEZNAM TABULEK

12


SEZNAM TABULEK

Tab. 1

Specifické vlastnosti chitosanu.

Tab. 2

Dělení disperzních soustav dle skupenství disperzního prostředí a disperzního podílu.

Tab. 3

Elementární analýza vybraných látek (zastoupení jednotlivých prvků je uvedeno v atomových procentech) včetně stanovení vlhkosti a popelu.

Tab. 4

Stanovení celkové a karboxylátové kyselosti pomocí titračních metod.

Tab. 5

Experimentálně stanovené difúzní parametry pro difúzi methylenové modři přes agarózové hydrogely lišící se svou koncentrací při různých teplotách.

Tab. 6

Efektivní difúzní koeficient, koncentrace na rozhraní hydrogel-roztok, rozdělovací koeficient a efektivní porozita pro agarózové hydrogely při různých teplotách (jako difúzní sonda byla použita MB).

Tab. 7

Efektivní difúzní koeficient, koncentrace na rozhraní hydrogel-roztok, rozdělovací koeficient a efektivní porozita pro agarózové hydrogely při různých teplotách (jako difúzní sonda byla použit RH).

Tab. 8

Hodnoty difúzního koeficientu volné difúze pro methylenovou modř a rhodamin 6G při proměnných experimentálních podmínkách (pH, teplota a iontová síla).

Tab. 9

Experimentálně stanovené difúzní parametry pro difúzi methylenové modři přes 1 hm. % agarózový hydrogel s přídavkem lignitických huminových kyselin při různých teplotách.

Tab. 10

Experimentálně stanovené difúzní parametry pro difúzi rhodaminu 6G přes 1 hm. % agarózový hydrogel s přídavkem lignitických huminových kyselin při 30 °C.

Tab. 11

Vypočtené difúzní parametry pro 1 hm. % AG gel s různým množstvím LHK pro methylenovou modř.

Tab. 12

Vypočtené difúzní parametry pro 1 hm. % AG gel s různým množstvím LHK pro rhodamin 6G.

Tab. 13

Difúzní parametry pro IHSS HK. Jako difúzní sonda použita MB.

Tab. 14

Difúzní parametry pro IHSS HK. Jako difúzní sonda použit RH.

Tab. 15

Vypočtené difúzní parametry pro 1 hm. % AG hydrogel s přídavkem kyseliny hyaluronové. Difúze methylenové modři realizovaná v difúzní cele při 30 °C.

Tab. 16

Difúzní parametry pro AG hydrogely s odlišným množstvím kyseliny hyaluronové (1 250 kDa) při difúzi methylenové modři při 30 °C. Nestacionární difúze v kyvetách.

Tab. 17

Sumarizované difúzní parametry pro agarózové hydrogely s přídavkem alginátu sodného pro difúzi methylenové modři při 30 °C. Neustálené difúzní experimenty realizované v kyvetách.

Tab. 18

Difúzní parametry pro AG hydrogely s přídavkem PSS pro difúzi MB. Výsledky z měření v difúzní cele.

160

VĚDECKÁ A PUBLIKAČNÍ ČINNOST


13


13.1

Články v impaktovaném časopise

SMILEK, J., SEDLÁČEK, P., KALINA, M., KLUČÁKOVÁ, M. On the role of humic acids' carboxyl groups in the binding of charged organic compounds. CHEMOSPHERE. 2015. 138(11). s. 503 - 510. ISSN 0045-6535. DOI:10.1016/j.chemosphere.2015.06.093 IF = 3,854. SEDLÁČEK, P., SMILEK, J., KLUČÁKOVÁ, M. How the interactions with humic acids affect the mobility of ionic dyes in hydrogels – 2. Non-stationary diffusion experiments. REACTIVE & FUNCTIONAL POLYMERS. 2014. 75(1). s. 41 - 50. ISSN 1381-5148. DOI: 10.1016/j.reactfunctpolym.2013.12.002 IF = 2,535. SEDLÁČEK, P., SMILEK, J., KLUČÁKOVÁ, M. How the interactions with humic acids affect the mobility of ionic dyes in hydrogels – Results from diffusion cells. REACTIVE & FUNCTIONAL POLYMERS. 2013. 73(11). s. 1500 - 1509. ISSN 1381-5148. DOI: 10.1016/j.reactfunctpolym.2013.07.008 IF = 2,535.

13.2

Konferenční příspěvky indexované v databázi Web of Science

SMILEK, J., SEDLÁČEK, P., KLUČÁKOVÁ, M. New Approach for Characterization and Study on Reactivity of Biomaterials. Nanocon 2014 Conference Proceedings. 1. Ostrava, Tanger Ltd. 2014. s. 808 - 813. ISBN 978-80-87294-53-6. SEDLÁČEK, P., SMILEK, J., KLUČÁKOVÁ, M. Role of humic acids in transport of charge organic compounds as revealed by combination of simple laboratory diffusion techniques. Abstracts of papers of the American Chemical Society. San Francisco, CA, American Chemical Society. 2015. 248(430-ENVR). s. 154 - 154. ISSN 0065-7727.

13.3

Příspěvky na mezinárodních konferencích

SMILEK, J., KYNCLOVÁ, H., SEDLÁČEK, P., PRÁŠEK, J., KLUČÁKOVÁ, M. Specific permeability of nanoporous alumina membranes studied by diffusion cell technqiues. Nanocon 2015 Conference Proceedings. Ostrava, Tanger Ltd. 2015. s. 102 – 109. ISBN 978-80-87294-59-8. KYNCLOVÁ, H., SMILEK, J., PRÁŠEK, J., KLUČÁKOVÁ, M., SEDLÁČEK, P., HUBÁLEK, J. Study of nanoporous alumina membranes by electrochemical method. Nanocon 2015 Conference Proceedings. Ostrava, Tanger Ltd. 2015. s. 1 - 6. ISBN 978-8087294-59-8. KRATOCHVÍLOVÁ, R., KLUČÁKOVÁ, M., SEDLÁČEK, P., SMILEK, J., KRÁČALÍK, M. Rheological approach for agricultural hydrogels. Nanocon 2015 Conference Proceedings. Ostrava, Tanger Ltd. 2015. s. 83-88. ISBN 978-80-87294-59-8. LAŠTŮVKOVÁ, M., SMILEK, J., KLUČÁKOVÁ, M., SEDLÁČEK, P. Characterization of hydrogels for diffusion experiments. Nanocon 2015 Conference Proceedings. Ostrava, Tanger Ltd. 2015. s. 90 - 95. ISBN 978-80-87294-59-8.

161



SMILEK, J., KLUČÁKOVÁ, M., SEDLÁČEK, P., KALINA, M. The Impact of Methylation of IHSS Humic Acids on the Reactivity Studied by Diffusion Techniques. Natural Organic Matter: Structure-Dynamics Innovative Applications. Ioannina. 2014. s. 152 - 153. SMILEK, J., SEDLÁČEK, P., KLUČÁKOVÁ, M., KALINA, M., ENEV, V. Methylation of humic acids - the impact on the reactivity studied by diffusion techniques. XIV. pracovní setkání fyzikálních chemiků a elektrochemiků - Sborník příspěvků. Brno, Masarykova univerzita. 2014. s. 137 - 141. ISBN 978-80-210-6842-1. SMILEK, J., KOLESA, P., SEDLÁČEK, P., KLUČÁKOVÁ, M. Studium reaktivity kationaktivního biopolymeru interakcí s anionaktivními barvivy. Studentská vědecká konference 2014. Ostrava, Česká republika. 2014. s. 1 - 4. ISBN 978-80-7464-359-0. SMILEK, J., SEDLÁČEK, P., KLUČÁKOVÁ, M. Utilization of Diffusion Cell Technique for Study on Reactivity of Humic Acids (Impact of Methylation). Studentská konference Chemie je život Sborník příspěvků. Brno, FCH VUT. 2013. s. 332 - 337. ISBN 978-80214-4823-0. SMILEK, J., SEDLÁČEK, P., KLUČÁKOVÁ, M. Study on reactivity of humic acids by innovative diffusion techniques. 17th Conference on Environment and Mineral Processing. Ostrava, VŠB Technical University of Ostrava. 2013. s. 279 - 284. ISBN 978-80-2483000-1. SMILEK, J., SEDLÁČEK, P., KLUČÁKOVÁ, M. Utilization of diffusion techniques for study on reactivity of modified humic acids. XIII. Pracovní setkání fyzikálních chemiků a elektrochemiků - Sborník příspěvků. Brno, Mendelova univerzita v Brně. 2013. s. 167 168. ISBN 978-80-7375-757-1. SMILEK, J., SEDLÁČEK, P., KLUČÁKOVÁ, M. Study on reactivity of humic acids under varying conditions by diffusion techniques. Studentská konference Chemie je život Sborník příspěvků. Brno, Vysoké učení technické v Brně, Fakulta chemická, Purkyňova 464/118, 612 00 Brno. 2012. s. 421 - 428. ISBN 978-80-214-4425-6. KYNCLOVÁ, H., SMILEK, J., SEDLÁČEK, P., PRÁŠEK, J., KLUČÁKOVÁ, M., HUBÁLEK, J. Fabrication of nanoporous alumina membranes for electrochemical sensors. Brno. 2015. s. 107 - 110. KOLESA, P., SMILEK, J., KLUČÁKOVÁ, M. Vliv polyelektrolytových biopolymerů na transport iontů. Chemie je život, Studentská konference. Brno, Vysoké učení technické v Brně, Fakulta chemická, Purkyňova 464/118, 61200 Brno. 2014. s. 95 - 100. ISBN 978-80214-5078-3. LAŠTŮVKOVÁ, M., SEDLÁČEK, P., SMILEK, J., KLUČÁKOVÁ, M. Simple diffusion techniques for determination of substances penetrated through plant cuticles. Chemie je život - Studentská konference. Brno, Vysoké učení technické v Brně, Fakulta chemická. 2014. s. 315 - 321. ISBN 978-80-214-5078-3. SEDLÁČEK, P., SMILEK, J., KLUČÁKOVÁ, M. On the role of humic acids'carboxyl groups in binding charged organic compounds. Natural Organic Matter: StructureDynamics Innovative Applications. Ioannina. 2014. s. 146 - 147.

162



KALINA, M., SMILEK, J., KLUČÁKOVÁ, M. Aging of biopolymers and biocolloids studied by light scattering techniques. Studentská konference Chemie je život - Sborník příspěvků. Brno, VUT v Brně. 2013. s. 300 - 305. ISBN 978-80-214-4823-0. KOLESA, P., SMILEK, J., SEDLÁČEK, P., KLUČÁKOVÁ, M. Studium reaktivity kationaktivního biopolymeru jednoduchými laboratorními technikami - neustálená difúze v kyvetách. Studentská konference Chemie je život Sborník příspěvků. Brno, FCH VUT. 2013. s. 89 - 93. ISBN 978-80-214-4823-0. PŘÍTULOVÁ, M., SMILEK, J., KLUČÁKOVÁ, M., SEDLÁČEK, P. Vliv pH na bariérové schopnosti huminových kyselin. Studentská konference Chemie je život Sborník příspěvků. Brno, FCH VUT. 2013. s. 161 - 166. ISBN 978-80-214-4823-0. LAŠTŮVKOVÁ, M., SEDLÁČEK, P., SMILEK, J. Využití difúzních technik pro studium transportu lignohumátů přes rostlinné kutikuly. Studentská konference Chemie je život Sborník příspěvků. Brno, FCH VUT. 2013. s. 109 - 114. ISBN 978-80-214-4823-0. KALINA, M., KLUČÁKOVÁ, M., MAYET, N., SMILEK, J. Behaviour of Humic Acids in Aqueous Solutions. XIII. Pracovní setkání fyzikálních chemiků a elektrochemiků sborník příspěvků. Brno, Mendelova univerzita v Brně. 2013. s. 171 - 172. ISBN 978-807375-757-1. SEDLÁČEK, P., KARÁSEK, J., SMILEK, J. Shape-optimalization of controlled-release systems using finite element method. XIII. Pracovní setkání fyzikálních chemiků a elektrochemiků - Sborník příspěvků. Brno, Mendelova univerzita v Brně. 2013. s. 142 142. ISBN 978-80-7375-757-1. LAŠTŮVKOVÁ, M., SEDLÁČEK, P., SMILEK, J. Návrh a testování metody studia transportu kapalných humátů skrz rostlinné kutikuly. Studentská konference Chemie je život - Sborník příspěvků. Brno, Vysoké učení technické v Brně, Fakulta chemická, Purkyňova 464/118, 612 00 Brno. 2012. s. 168 - 174. ISBN 978-80-214-4425-6. SEDLÁČEK, P., SMILEK, J., KLUČÁKOVÁ, M. Study on mobility of methylene blue in the presence of humic acids. Functions of Natural Organic Matter in Changing Environment. Zhejiang, China, Springer- Verlag GmbH. 2012. s. 321 - 323. ISBN 978-94007-5633-5. SEDLÁČEK, P., SMILEK, J., KLUČÁKOVÁ, M. Comparison of barrier properties of modified humic acids. 16th Conference on Environment and Mineral Processing. Ostrava, Czech Republic, VŠB - Technical University of Ostrava. 2012. s. 109 - 113. ISBN 978-80248-2688-2. SEDLÁČEK, P., SMILEK, J., KLUČÁKOVÁ, M. Diffusion Of Organic Dyes in Aqueous Solutions and Agarose Gels Studied by Method of Horizontal Diffusion Cells. Chemické listy. Brno, Czech Chemical Society. 2011. 105(18). s. 889 - 890. ISSN 0009-2770. (IF=0,529). SEDLÁČEK, P., SMILEK, J., KLUČÁKOVÁ, M. Humic Acids In Hydrogel Forms. 15th Conference on Environment and Mineral Processing, Part II. Ostrava, Publishing services department, VŠB - Technical University of Ostrava. 2011. s. 133 - 138. ISBN 978-80-2482388-1.

163



SEDLÁČEK, P., SMILEK, J., KLUČÁKOVÁ, M. Novel reactivity-mapping technique for characterization of polyelectrolyte biopolymers. Sborník příspěvků - XI. pracovní setkání fyzikálních chemiků a elektrochemiků. Brno, Mendelova univerzita v Brně. 2011. s. 246 248. ISBN 978-80-210-4234-6.

13.4

Abstrakty

SMILEK, J., KALINA, M., LAŠTŮVKOVÁ, M., TÜRKEOVÁ, I., SEDLÁČEK, P., KLUČÁKOVÁ, M. Reactivity-mapping tool based on diffusion techniques for characterization of biocolloids. Chemistry and Life 2015 – Book of Abstracts. Brno 2015. s. 60 - 60. ISBN 978-80-214-5228-2. SMILEK, J., KYNCLOVÁ, H., SEDLÁČEK, P., PRÁŠEK, J., KLUČÁKOVÁ, M. Characterization of nanoporous membranes with controlled permeability. Chemistry and Life 2015 – Book of Abstracts. Brno 2015. s. 165 – 166. ISBN 978-80-214-5228-2. SMILEK, J., SEDLÁČEK, P., KLUČÁKOVÁ, M. Diffusion Techniques as Reactivity Mapping Tool of Biocolloids. 15th European Student Colloid Conference - Book of abstracts. Krakow, Poland. 2015. s. 31 - 31. SMILEK, J., SEDLÁČEK, P., KALINA, M., LAŠTŮVKOVÁ, M., KLUČÁKOVÁ, M. Barrier properties of natural biopolymers studied by innovative diffusion techniques. Ceitec PhD Retreat. Brno. 2015. s. 76 - 76. ISBN 978-80-210-7825-3. SMILEK, J., KOLESA, P., SEDLÁČEK, P., KLUČÁKOVÁ, M. The Reactivity of Cationic Biopolymer Studied by Interactions with Organic Dyes. Frontiers in material and life sciences. Brno, CEITEC. 2014. s. 216 - 216. ISBN 978-80-210-7159-9. SMILEK, J., SEDLÁČEK, P., KLUČÁKOVÁ, M. Reactivity of modified humic acids studied by diffusion techniques in diffusion cell. ORGANIC GEOCHEMISTRY: TRENDS FOR THE 21st CENT., Vol. 2, Book of abstracts. Tenerife, Španělsko. 2013. s. 197 - 198. SMILEK, J., NOVÁČKOVÁ, K., KISLINGER, J., KLUČÁKOVÁ, M., PEKAŘ, M. Characterization of SOM from South Moravian Soils. Conference proceedings 'Frontiers in Biochemistry' 20th International Symposium on Environmental Biogeochemistry. Istanbul, Turecko. 2011. s. PSII-34. ENEV, V., KLUČÁKOVÁ, M., SMILEK, J.; DOSKOČIL, L. Methylation of humic acids – the impact on the reactivity, chemical composition and properties of HAs studied by spectrometric techniques. 15th European Student Colloid Conference – Book of abstract. Kraków, Poland, EU, European Colloid & Interface Society. 2015. s. 111 - 111. LAŠTŮVKOVÁ, M., SEDLÁČEK, P., KLUČÁKOVÁ, M., SMILEK, J. Characterization of plant cuticles for a study of foliar fertilizers. CEITEC Ph.D. Retreat. Brno, Masarykova univerzita. 2015. s. 62 - 62. ISBN 978-80-210-7825-3. LAŠTŮVKOVÁ, M., SEDLÁČEK, P., SMILEK, J. Studium transportu huminových látek skrz rostlinné kutikuly. Sborník anotací diplomových prací o přírodě, krajině a environmentálně příznivém životním stylu. Brno. 2014. s. 27. ISBN 978-80-87604-68-7.

164



LAŠTŮVKOVÁ, M., SEDLÁČEK, P., SMILEK, J., KLUČÁKOVÁ, M. Penetration of fertilizers based on humic substances through plant cuticles. Nanocon 2014 Conference proceedings. Ostrava. 2014. s. 125 - 125. ISBN 978-80-87294-55-0. KALINA, M., SMILEK, J., KLUČÁKOVÁ, M. Light Scattering Techniques Applied for the Study of Aging of Biopolymers and Biocolloids. CEITEC Annual Conference "Frontiers in Materials and Life Sciences". Brno, Masaryk University. 2014. s. 143 - 143. ISBN 978-80-210-7159-9. LAŠTŮVKOVÁ, M., SEDLÁČEK, P., SMILEK, J., KLUČÁKOVÁ, M. Optimization of transport liquid substances through natural porous material. Frontiers in Material and Life Sciences. Brno, CEITEC. 2014. s. 167 - 167. ISBN 978-80-210-7159-9. SEDLÁČEK, P., SMILEK, J., KLUČÁKOVÁ, M. Barrier Properties of Natural Polyelectrolytes Studied by Diffusion Experiments in Model Hydrogels. ECIS 2013 Abstracts - Complex Fluids and Environmental Colloid Science. Sofia, Bulgaria. 2013. s.8. SEDLÁČEK, P., SMILEK, J., KLUČÁKOVÁ, M. Reactivity of biopolymers as observed by simple diffusion experiments. Elektronický sborník. Berlín, TU Berlín. 2011. (1 p.). SEDLÁČEK, P., KLUČÁKOVÁ, M., SMILEK, J. Diffusion techniques for characterization of dynamic humic systems. Book of Abstracts and Field Session Guide. Wroclaw, Poland, Polskie Towarzystwo Substancji Humusowych. 2011. s. 20 - 20.

13.5

Přednášky na zahraničních konferencích

17th Conference on Environment and Mineral Processing & Exhibition (Ostrava, Česká republika) 13rd Workshop of Physical Chemists and Electrochemists (Brno, Česká republika) 17th Meeting of International humic Substances Society (Ioannina, Řecko) 15th European Student Colloid Conference (Krakov, Polsko)

13.6

Postery na zahraničních konferencích

20 th International Symposium for Environmental Biogeochemistry (Istanbul, Turecko) 26th International Meeting on Organic Geochemistry (Costa Adeje, Španělsko) 6th International Conference on Nanomaterials (Brno, Česká republika) 14th International Conference on Environmental Science and Technology (Rhodos, Řecko) 7th International Conference on Nanomaterials (Brno, Česká republika) 6th Meeting on Chemistry and Life (Brno, Česká republika)

13.7

Seznam řešených projektů

Autor dizertační práce byl v akademickém roce 2015/2016 hlavním řešitelem mezifakultního juniorského projektu ve spolupráci s FEKT VUT s názvem Vývoj senzorů na bázi nanoporézních membrán s řízenou iontovou propustností (FCH/FEKT-J-15-2663).

165


13.8


Absolvované stáže

09/2011 – 01/2012

Stáž na turecké univerzitě v Istanbulu (Yildiz Technical University) prof. Nergis Arsu

07/2014 – 08/2014

Stáž na nizozemské univerzitě ve Wageningenu (Wageningen Uni.) prof. Herman P. van Leeuwen

05/2015 – 06/2015

Stáž na rakouské univerzitě v Linci (Johannes Kepler University) prof. Milan Kracalik

11/2015 – 12/2015

Stáž na rakouské univerzitě v Linci (Johannes Kepler University) prof. Milan Kracalik

166

SEZNAM PŘÍLOH

14


SEZNAM PŘÍLOH

Příloha č. 1

Článek v impaktovaném časopise

SEDLÁČEK, P., SMILEK, J., KLUČÁKOVÁ, M. How the interactions with humic acids affect the mobility of ionic dyes in hydrogels – Results from diffusion cells. REACTIVE & FUNCTIONAL POLYMERS. 2013. 73(11). s. 1500 - 1509. ISSN 1381-5148. DOI: 10.1016/j.reactfunctpolym.2013.07.008 IF = 2,535.

Reactive & Functional Polymers 73 (2013) 1500–1509

Contents lists available at ScienceDirect

Reactive & Functional Polymers journal homepage: www.elsevier.com/locate/react

How the interactions with humic acids affect the mobility of ionic dyes in hydrogels – Results from diffusion cells Petr Sedlácˇek ⇑, Jirˇí Smilek, Martina Klucˇáková Brno University of Technology, Faculty of Chemistry, Materials Research Centre CZ.1.05/2.1.00/01.0012, Purkynˇova 118, 612 00 Brno, Czech Republic

a r t i c l e

i n f o

Article history: Received 21 January 2013 Received in revised form 12 July 2013 Accepted 13 July 2013 Available online 20 July 2013 Keywords: Reactivity Diffusion Polyelectrolytes Hydrogel

a b s t r a c t The complexation of charged compounds by humic acids represents the process of exceptional environmental importance. Nevertheless, traditional methods utilized in the complexation studies do not address the way, how these interactions affect the transport of ions in humic-rich environments. To overcome this dilemma, the diffusion cells technique is proposed as an innovative reactivity mapping technique. Using this method, the diffusion of methylene blue was studied in aqueous solutions and in agarose gels with and without the addition of humic acids. Experimental results clearly illustrate the immobilizing effects of humic acids on the transport of methylene blue in gels. The partitioning of methylene blue at the solution-gel interface and the specific interactions between methylene blue and humic acids is discussed on the basis of experimental data. Effective structural parameters of hydrogels (effective porosity, tortuosity factor) were calculated, as well as some standard diffusion and interaction parameters (diffusion and partition coefficients and apparent equilibrium constants). Ó 2013 Elsevier Ltd. All rights reserved.

1. Introduction Humic acids (HA) represent the crucial component of many non-living parts of nature, such as soils, waters and sediments, where they – in diverse colloidal forms – play numerous irreplaceable environmental roles. In soils and sediments, precipitated humic acids impact the porosity and act as sorbents and reservoirs of water and different kinds of chemicals [1], while, in water aquifers, dissolved HA serve as important colloidal carriers of solutes [2,3]. HA also represent a promising raw material. Many potential applications of HA in agriculture, industry, environmental engineering and even in medicine are proposed [4–6]. Exact structure of humic acids is still unknown – controversy lasts on whether HA are of macromolecular or supramolecular (i.e. aggregate) nature [7] – anyway, high content of diverse functional groups (e.g. carboxyls, phenols, aromatic rings) gives to these compounds an outstanding ability to bind solutes of various chemical nature. It is generally accepted, that the mobility of ionic compounds in soils and waters is affected by their interaction with negatively charged dissolved or precipitated humic acids (HA) [4,8,9]. Ion– HA interactions are thus essentially of an electrostatic origin, but due to diverse degree of structural complexity of HA, it is not possible to explain or predict the destiny of ions in humic matrices ⇑ Corresponding author. Tel.: +420 54114 9486; fax: +420 54114 9398. E-mail addresses: [email protected] (P. Sedlácˇek), [email protected] (J. Smilek), [email protected] (M. Klucˇáková). URL: http://www.materials-research.cz/en (P. Sedlácˇek). 1381-5148/$ - see front matter Ó 2013 Elsevier Ltd. All rights reserved. http://dx.doi.org/10.1016/j.reactfunctpolym.2013.07.008

universally. For the experimental study of ion–HA interaction, the inspiration can be drawn from the studies on ion binding by standard polyelectrolytes (e.g. charged biopolymers like chitosan, hyaluronan or others). Many works were published on theoretical modeling of interaction between low-molecular ions and such compounds on the molecular scale [10–12], nevertheless, to our best knowledge, there is no standard experimental methodology utilized routinely in the observation and quantification of ionpolyelectrolyte matrices and their influence on the rate of transport in these systems. The most widespread experimental approaches are still based on simple adsorption experiments [13–16], nevertheless, the batch sorption approach brings several serious drawbacks as far as humic substances are utilized. For example, the size of colloidal humic particles is of a great importance; the homogenous distribution of particle sizes in such colloidal forms as sols or suspensions is always questionable and the interactions/sorption in such systems can be limited just to the surface of the particle. The actual experimental conditions – e.g. the rate of agitation of the mixture – play a crucial role as well. Simple experimental techniques for the study on solutediffusion in hydrogels prepared from humic acids put forward an interesting experimental alternative, as was discussed in details in our previous works [17–20]. Such diffusion processes are easily realizable; the mathematical apparatus for the data evaluation is well explained [21] and provides some reasonable parameters – e.g. apparent diffusion coefficients – the values of which involve the interactions in the system. A comprehensive handlist of several simple laboratory methods is presented in [22,23] for the

P. Sedlácˇek et al. / Reactive & Functional Polymers 73 (2013) 1500–1509

1501

Nomenclature

a b

eeff U Uapp

g A c

D0 De Da EA f |G*| Jd k

rock capacity factor (–) cell constant (m2) effective porosity (–) partition coefficient (–) apparent partition coefficient (–) dynamic viscosity (Pa s) pre-exponential factor for diffusion coefficient (m2 s1) molar concentration (subscript D refers to the donor solution, subscript A to the acceptor solution and subscript ‘‘gel’’ represents the concentration inside hydrogel) (mol m3) free solution diffusion coefficient (m2 s1) effective diffusion coefficient (m2 s1) apparent diffusion coefficient (m2 s1) activation energy of diffusion (J mol1) oscillation frequency (Hz) complex modulus magnitude (Pa) steady-state diffusion flux (mol m2 s1) Boltzmann constant (J K1)

experimental arrangement of the diffusion experiment. For the routine determination of diffusion coefficients in semi-solid samples (like hydrogels), the method of the diffusion cells (alternatively called the diaphragm, Stokes or Franz cells) represents the method of choice [24–27]. The main objective of this work was to test the applicability of the method of diffusion cells to study the interactions between humic acids (HA) and the model organic dye – methylene blue. In our previous works, several laboratory techniques were used in order to study the diffusion of ions in gel prepared from controlled coagulation of alkaline humic acids solutions simply by the decrease of their pH [17–20]. This humic gel reasonably modeled natural environments with homogenously distributed, partially dissolved, partially highly swelled solid humic substances. On the other hand, this hydrogel form was not suitable for the in-depth studies on the interactions between the humic content of gel and a diffusing solute, because such elementary properties of gels as the inner pH or relative content of HA were difficult to control. The preparation of interpenetrating polymer network (IPN) gels [28] from humic acids in a supporting gel-forming polymer is proposed to overcome these difficulties. Agarose (linear polysaccharide of red algae, made up of the repeating monomeric unit of agarobiose) was used as a supporting polymer in the experiments presented in this paper. The network of agarose chains is interpenetrated by molecules of HA at higher temperatures where both compounds are dissolved (>60 °C) and the mixture is then easily gelled by cooling to normal temperature (20 °C). The mechanical and textural properties of agarose hydrogels as well as the gelation mechanism are well understood [29–31]. In the IPN hydrogels used in the presented paper, HA are immobilized and their reactive groups are homogenously distributed in the supporting agarose matrix. The diffusion in agarose gels has already been subjected to a vast concern. Golmohamadi et al. [32] studied the self- and mutual- diffusion of Cd2+ and organic cations in agarose hydrogel by means of fluorescence correlation spectroscopy and the diffusion cell method, respectively. The gel’s Donnan potential was measured and used for the explanation of discrepancy between the results of the mutual and self-diffusion measurements and of the pronounced enhancement of cation concentrations in hydrogel. For agarose hydrogels, the diffusion cells were utilized in determining the diffusion coefficient of e.g. humic acids [33], proteins

Kapp L Le n r R t

tL

t T Tm w x

apparent equilibrium constant (–) sample thickness (m) actual distance traveled by diffusant (m) total solute mass absorbed in gel (mol) Stokes–Einstein radius of solute (m) ideal gas constant (J mol1 K1) time (s) (for better comprehensibility, the time unit is changed from seconds (s) to hours (h) in the figures and tables) time lag (s) (for better comprehensibility, the time unit is changed from seconds (s) to hours (h) in the figures and tables) temperature (°C) absolute temperature (K) tortuosity factor (–) weight concentration ( wt.%) direction of diffusion (m)

[34] or ethanol [35]. Other authors subjected agarose gels to other techniques for determining the diffusion coefficients such as the refractive index measurement [36], electronic speckle pattern interferometry [37], fluorescence correlation spectroscopy [38] or fluorescence recovery after photobleaching [39]. Methylene blue (MB) is well-known cationic organic dye, commonly used for dying cotton, wood and silk. As can be generalized for all organic dyes, its transport in nature is the matter of concern from both toxicological and aesthetical point of view. Many works focused on the sorption of methylene blue and other cationic dyes on humics and humic-rich materials in last decades. Guy et al. in their study on organocation speciation in natural waters [40] determined the sorption isotherms for MB on humic acids at different solution pH values and KNO3 concentrations. The variation of pH was not found to play an important role during the sorption process. In the desorption studies it was found, that more than 50 wt.% of MB remains bound to HA at pH = 1 on contrary to other sorbates (paraquat, Cu2+). Sheng et al. introduced a new photometric method which evaluates the adsorption capability of humic acids for another cationic dye – toluidine blue – from the difference between visible spectra of dye and dye-HA complex [41]. Contrary to previous authors, they found the pH and ionic strength to strongly influence the dye sorption on humics. Zhou et al. [42] presented a considerable enhancement of both the adsorption rate and the capacity of Fe3O4 nanoparticles for the MB sorption by coating these particles with humic acids. Moreover, the MB desorption ability and the reused performance of Fe3O4/HA nanoparticles were also excellent. Janoš [43] proposed iron humate as a cost-effective sorbent of basic dyes. Experimental data on sorption of several dyes including MB were evaluated by the multisite Langmuir isotherm model and gave the sorption capacities ranging from 0.01 to 0.09 mmol/g for individual dyes (0.03 mmol/g for MB). The leachability of dye from the loaded sorbent was found to be very low, especially in water. The sorption of methylene blue was only slightly affected by pH and the presence of inorganic salts, the presence of anionic surfactant (sodium dodecyl sulfate), however, dramatically enhanced the sorption of MB. In other works [44,45], the author studied the sorption of cationic and anionic dyes on oxihumolite – kind of oxidatively altered young brown coal that originated on the surface of lignite deposits by post-sedimentary oxidation. This material is composed of up to

1502


70 wt.% by humic substances. The authors identified the interparticle diffusion processes as the main mechanism controlling the rate of the dye sorption. Fernandes et al. analyzed the removal of MB from aqueous solutions by peat, another humic-rich material [46]. The kinetics studies and the determination of adsorption isotherms were performed at different initial concentrations of MB and at three different temperatures. Fast equilibration of the sorption process was found – after 4.5 h, the equilibrium was reached at all studied temperatures. All the above mentioned examples clearly illustrate that the interactions between humic acids and organic dyes are a topic of an outstanding concern. The comprehensive reviews can be found summarizing the relative studies on the application of peat, coal and other diverse biomaterials as low-cost sorbents for removal of organic dyes [47,48] or MB in particular [49].

2. Theory The method of diffusion cell (or through-diffusion method) represents one easy way to study the diffusion experimentally. In the presented work, the diffusion cell apparatus (see Fig. 1) was applied in order to study the diffusion of charged compound (methylene blue) in aqueous solution and in polyelectrolyte hydrogels, respectively. In order to determine the diffusion coefficient of a solute in water (or other solvent), one compartment of the diffusion cell is filled with a solution of known concentration of the solute and the other with the solvent. The compartments are separated with a porous diaphragm – a glass frit, special membrane or even a piece of filter paper. The solute concentration in the compartments then changes with time according to equation (see e.g. [23]).

ln

ðcD cA Þt ¼ bD0 t ðcD cA Þ0

ð1Þ

where D0 is the diffusion coefficient of a solute in the solvent (commonly called free solution diffusion coefficient), (cD–cA)0 and (cD–cA)t represent the difference between molar concentrations of diffusing matter in donor and acceptor compartments at time 0 and t, respectively. Coefficient b is the geometrical parameter (called ‘cell constant’) which specifies the apparatus and the membrane. In order to determine an unknown diffusion coefficient of studied solute in water, the diffusion cell apparatus is at first calibrated with an aqueous solution of a solute with well-known diffusivity. For this

purpose, KCl is commonly used (the method of calibrating the cell with KCl is described in details in [50]). From the value of free solution diffusion coefficient D0, the Stokes–Einstein radius r of the diffusing solute can be calculated as follows

D0 ¼

kT 6pgr

ð2Þ

where k is the Boltzmann constant, T is the temperature and g is the viscosity of the solvent. Besides, from the dependence of D0 on the temperature, the activation energy of diffusion EA can be calculated according to the general Arrhenius equation

EA D0 ¼ A exp RT

ð3Þ

The diffusion cell apparatus can simply be utilized also in the experimental studies on solute diffusion in porous materials. In these experiments, the diffusion cell compartments are separated by the studied porous specimen and the solute concentration in the acceptor compartment is measured as a function of time. Fig. 2 shows typical breakthrough curve obtained experimentally. As can be seen, the breakthrough curve shows two distinct parts, in the first part, which corresponds to the transient stage of the diffusion process, the solute penetrates from the donor compartment through the porous specimen – i.e. through a hydrogel in this work. Therefore, the concentration of the diffusant in the acceptor compartment is initially equal to zero and then (after its penetration through the hydrogel) slowly increases. At this stage, the transport of solute is driven by the time-dependent concentration gradient across the hydrogel, which comes from the unequal initial concentrations of the solute in both compartments of the diffusion cell apparatus. In the diffusion cell experiments, the transient stage of the process is characterized by the time lag tL representing the x-axis intercept of the steady state portion of data, see Fig. 2). Soon after the penetration of solute through the hydrogel, its concentration in the acceptor cell starts increasing linearly as the second – steady-state – stage of the diffusion process comes into act. At this period, the concentration difference between the opposite boundaries of the hydrogel specimen remains constant and a linear concentration profile of the solute across the gel is established. Due to the constant concentration difference, also the value of diffusive flux Jd, (i.e. the rate of change in the mass of solute per unit cross-sectional area perpendicular to the direction of transport; in mol m2 s1) is time-independent during the stationary diffusion stage.

Fig. 1. Schematic representation of applied diffusion cell apparatus (drawing not to scale).


The transient stage of the through-diffusion process follows different rules than the steady-state stage. While in the steady-state stage the hydrogel is partially saturated by the diffusant and its distribution in the hydrogel does not change, the transient diffusion is affected by specific interactions between the solute and solid phase. The interactions proceed gradually with the movement of the diffusion front through the hydrogel and only after its breakthrough into the acceptor compartment the chemical equilibrium can be established in the whole hydrogel volume. Modified Fick’s second law for the diffusion in porous media can be written as follows

5 Steady - State Stage

c (mmol·m-3)

4

1503

Transient Stage 3 2 tL 1 0 0

5

10

15

@c De @ 2 c @2c ¼ ¼ Da 2 @t @x a @x2

20

t (h) Fig. 2. Concentration of the solute in acceptor compartment as function of time (1 wt.% agarose hydrogel, 25 °C).

For the processing data from the diffusion cell experiments with porous materials, the theoretical model summarized by Shackelford and Moore (see [51]) was applied in this work. This theory is based on the assumption that the porous character of medium essentially affects the diffusion of a solute in two general ways. First, reduced cross-sectional area is available for the diffusive mass flux of the solute relative to the macroscopic cross-sectional area (because we assume that solute simply cannot penetrate into solid phase). Second, the existence of impenetrable solid phase results in more tortuous transport (solute pathway meanders through the medium). As a result, modified Fick’s first law gives the formula for the steady-state diffusive flux of the solute through the porous specimen (the flux which stays constant during the second stage of the diffusion cell experiment):

eeff

Dcgel Dcgel Jd ¼ D0 ¼ De Tm L L

ð4Þ

D0 is the free solution diffusion coefficient, Dcgel is the constant difference of molar concentration of the solute across the hydrogel specimen of thickness L, eeff is the effective porosity of the medium and Tm is the tortuosity factor, defined as follows

Tm ¼

2 Le L

ð5Þ

where Le is the actual distance, traveled by a molecule of solute when overcoming a macroscopic distance L. Both structural effects are summarized in the value of effective diffusion coefficient De. The concentration difference between the opposite boundaries of gel is not necessarily equal to the concentration difference between the solutions in donor and acceptor compartments, because hydrogel in a fact represents different phase than aqueous solution and a phase-equilibrium is established at the solution – gel interface. When the partitioning of the solute takes place between the two phases, a discontinuity in the concentration of solute at the interface occurs (see e.g. [52]), described by the following condition of phase equilibrium:

cgel ¼U c

ð6Þ

where the partition coefficient U describes the distribution of solute between solution (molar concentration c) and hydrogel (molar concentration cgel) at both boundaries of the specimen. The steadystate diffusion flux can be then expressed in the terms of constant difference between solute concentrations in the donor and acceptor solutions (Dc = cD–cA)

J d ¼ UDe

Dc L

ð7Þ

ð8Þ

This equation introduces the apparent diffusion coefficient Da and the rock capacity factor a, which represents the ability of hydrogel to interact with the diffusant and to immobilize it in the internal hydrogel structure [51]. If the linear, reversible and instantaneous sorption of the solute on the solid content is assumed, the rock capacity factor can be expressed in the terms of apparent equilibrium constant of the sorption

a ¼ eeff ð1 þ K app Þ

ð9Þ

where the apparent equilibrium constant Kapp represents a sorbedto-free solute mass ratio. In the through-diffusion experiments, the transient stage of the diffusion process is characterized by the time lag tL, which is inversely proportional to the apparent diffusion coefficient according to (for the exact derivation, see [53])

tL ¼

L2 6Da

ð10Þ

Eqs. (9) and (10) are based on the following assumptions (for details, see Ref. [51]): if the solute cannot penetrate into the solid phase and diffuses only in the hydrogel pores filled by a solution, the time lag is not dependent on the pore cross-sectional area but only on the shape and real length of diffusion pathway in the internal pore structure of the hydrogel and the migration can be accompanied by specific interactions between the solute and the solid phase. In this case, the diffusant (small in comparison with pore size) behaves like the particle inside the ‘tube’ of complicated shape (with potentially reactive walls) and the duration of its migration through the tube is not affected by the tube diameter (the porosity inside the tube is equal to 1) but only by its effective length expressed by the tortuosity factor Tm and the chemical affinity of diffusant with solid phase around the tube represented by the apparent equilibrium constant Kapp. Because the Fick’s first law (Eq. (4)) is valid for the steady-state diffusive flux of the solute through the whole hydrogel specimen, the value of its effective porosity eeff as the portion available for the diffusion has to be used for the definition of the hydrogel rock capacity factor a (see [51]). From the presented mathematical model, it can be seen, how the information about the chemical interactions between the solute and solid content of the porous medium can be extracted from through-diffusion data: at first, the values of apparent and effective diffusion coefficients are determined from the transient and steady-state stages of the breakthrough curve and, from their ratio, Kapp is calculated if the effective porosity of the medium is known. 3. Materials and methods 3.1. Chemicals Agarose (routine use class, <10 wt.% moisture content) and methylene blue hydrate (C.I. Basic Blue 9, dye content, P95 wt.%) were purchased from Sigma–Aldrich and used without further

1504


purification. Humic acids were isolated by alkaline extraction from South-Moravian lignite [17,19,54]. The total acidity and the content of carboxylic groups in HA were determined by means of potentiometric and conductometric titration on Schott TitroLine Alpha utilizing the methods of Riggle and von Wandruszka [55] and the standard Ca-acetate method [56], respectively. More details on the chemical structure of both the original lignite matrix and isolated HA (elemental and spectroscopic analysis), can be found in previously published papers [54,57].

3.5. Diffusion cell apparatus The water-jacketed side-by-side diffusion cell apparatus by Permegear Inc. was utilized in the experimental work. The schematic diagram of the apparatus is shown in Fig. 1. The cell volumes were 60 cm3 and the diameter of the circular orifice was 40 mm. A circulating water bath was used in order to perform the experiments at specific temperatures. The continuous stirring of solutions in the donor and acceptor compartments at constant rate (250 RPM) was arranged by magnetic stirrer.

3.2. Preparation of hydrogels

3.6. Determination of diffusivity in aqueous solutions

All hydrogels, utilized in subsequent diffusion experiments, were prepared via the thermoreversible gelation of aqueous solution of agarose. Agarose hydrogels (without addition of HA) were prepared from the aqueous solution of agarose (1, 2 and 4 wt.%), while agarose/HA gels from the aqueous solution of both agarose (1 wt.%) and HA (0.002, 0.005 and 0.010 wt.%). A simple gelation procedure was applied: accurately weighted amount of agarose powder was dissolved in deionized water (preparation of agarose gels) or in aqueous solution of HA of the corresponding concentration (preparation of agarose/HA gels), respectively. The mixture was slowly heated when stirring continuously to 80 °C, maintained at the temperature until the occurence of the transparent solution. The solution was subsequently degassed in ultrasonic bath for 1 min. (at 80 °C) and slowly poured between two glass slides placed on the opposite sides of plastic ring mold (the mold and the slides were pre-heated to 80 °C to prevent rapid cooling of the mixture at the contact with the mold). Upon the cooling to room temperature, the mixture gradually solidified into the cylindrical hydrogel plate sample (40 mm in diameter and 5 mm thick). The removal of the glass slides after the solidification resulted in obtaining the hydrogel sample, fixed in the plastic mold, with two smooth circular surfaces in contact with surrounding environment. To verify that HA would not be released from the agarose/HA samples during the diffusion experiments, UV–VIS spectra were taken at different times of leaching of the hydrogels in deionized water. It was determined that less than 5% of the original content of HA is released during 5 days of the leaching experiment.

Before the determination of diffusivity of methylene blue in aqueous solution, the apparatus was calibrated with a 100 mol m3 KCl solution; the diffusion proceeded from the KCl solution (donor compartment) to deionized water (acceptor compartment) at 25 °C through the Spi-pore™ polycarbonate membrane with 2 lm pore size. This membrane is suitable for the diffusion experiments, because it contains uniform cylindrical pores preferentially etched into the membrane, allowing an even distribution of a diffusing compound in one plane across the entire exposed membrane surface. The conductivity in the cells was measured in order to observe the changes in KCl concentration. In the next step, the diffusion coefficients of methylene blue in aqueous solutions were determined at 25, 40 and 50 °C, respectively. In these experiments, 10 g m3 solution of MB was used as a donor solution and the VIS absorption spectra were collected automatically in the acceptor solution (initially deionized water) by the fiber spectrometer USB 2000+ (Ocean Optics, Inc.) equipped with the optical fiber dip probe. No samples were taken from the cells and the total volumes of the solutions hence stayed constant during the diffusion experiment. The Spi-pore™ membrane was applied in these experiments, again.

3.3. Rheometric characterization of hydrogels To compare the viscoelastic properties of all prepared hydrogels, 1 mm thick samples of gel were introduced into AR-G2 rheometer (TA Instruments Ltd.) equipped with a Peltier plate for the temperature control using a plate-plate geometry (titanium, 40 mm diameter) and the Rheology Advantage Instrument Control AR software. Silicon oil was used to prevent drying of gels and gels were left to relax for 5 min. The rheometric parameters (the storage and the loss moduli) were then measured at 25 °C, at the strain of 0.05% and for the frequency range of 0.01–1 Hz.

3.4. Diffusion experiments The diffusion studies presented in this paper were divided into three separate experimental sections. In the first one, the diffusion of the model low-molecular dye – methylene blue – was studied in aqueous solution by the method of diffusion cell using well-defined inert membrane as a diffusion barrier. In the following steps, the diffusion cell experiments with methylene blue were repeated with the application of non-reactive (agarose) and reactive (agarose/HA) hydrogels, respectively, as the diffusion barriers.

3.7. Through-diffusion experiments with hydrogels The diffusion experiments with the hydrogel samples (both agarose and agarose/HA) were performed in the similar way, only the membrane was replaced by the 5 mm thick hydrogel sample fixed in the plastic mold, tightened in the apparatus by the silicon seal. 10 g m3 MB solution was used as a source of diffusing MB and the VIS absorption spectra of the acceptor solution were continuously collected, again. After the termination of the diffusion experiment, the absorbance was measured in both cells. For every experiment, the values of the steady-state diffusion flux and the time lag were derived from linear regression of the line part of the break-through curve. Besides, the total mass of methylene blue absorbed in the hydrogel specimen was determined from the mass balance in the diffusion cell compartments at the initial and the final state. The reproducibility of the method of diffusivity determination in hydrogels was tested by repeated (5) experimental determination of the steady-state diffusion flux and the time lag of MB using 1 wt.% agarose hydrogel (without addition of HA). The standard relative deviation of the diffusive coefficient was about 5%. 5. Results and discussion Presented diffusion experiments were designed in order to describe separately the three major effects which act together giving an overall influence on the transport of ionic solutes in reactive hydrogels. These effects are: (i) partitioning of the solute at the solution/gel boundary, (ii) lower permeability caused by porous character of the hydrogels, and finally (iii) specific physico-


chemical interactions between the solute and reactive content of the solid hydrogel network (e.g. sorption). For this purpose, the diffusion of the model dye – methylene blue – was studied separately in water, in hydrogels which can be regarded as non-reactive (agarose hydrogels) and in hydrogels with small addition of a highly reactive humic component (agarose/HA hydrogels). The differences in determined diffusion characteristics of these environments can be used for the evaluation of relative significance of the individual above-mentioned effects.

ln D0

3.0 -20.0

1505

3.1

3.2

3.3

3.4

-20.5

R2 = 0.9993

5.1. Diffusivity of methylene blue in aqueous solutions

-21.0

In Fig. 3, the time dependence of the solute concentration in acceptor compartment (i.e. the breakthrough curve) is shown both for KCl (reference solute) and MB. The values of the free solution diffusion coefficient D0 of MB, calculated using Eq. (1) were (8.44 ± 0.09) 1010 m2 s1 (25 °C), (1.29 ± 0.01) 109 m2 s1 (40 °C) and (1.64 ± 0.01) 109 m2 s1 (50 °C). The standard error values were determined from the error of linear regression in the single experiment. The values of diffusivity agree with the values determined by Leaist [58] and by Hori [59] by means of conductometry and the modified diaphragm cell method, respectively. The diffusivity in water can be utilized in calculating apparent Stokes radius of MB using the fundamental Stokes–Einstein equation (Eq. (2)). The calculated value (0.27 ± 0.02 nm) is consistent with the molecular dimensions of MB (0.5 0.1 0.3 nm) as well as with the experimental value which Hogan determined by means of triplet anisotropy decay (0.36 nm, [60]). As can be seen in Fig. 4, the increase of diffusivity with the temperature fits the linearized Arrhenius relation (Eq. (3)) which allows the determination of activation energy of the diffusion. Calculated value of the energy (21.4 kJ mol1) is in good agreement again with the published value (19.5 kJ mol1 calculated by Hori [59]). Hori interprets the value as the energy required to form a hole for a diffusion ‘‘jump’’ to take place in the diffusion medium (water).

5.2. Diffusivity of methylene blue in the agarose hydrogels

45 40 35 30 25 20 15 10 5 0

As evident from Table. 1, the value of the steady-state diffusion flux (calculated from the slope of linearly increasing branch of a breakthrough curve) gradually falls with the dry solid content of the hydrogel, while the time lag seems to be independent of the dry solid content of the gel for all three studied temperatures. Besides, hydrogels with higher dry solid content show evident increase in total absorbed dye. The amount of dye in hydrogels related to the mass unit of dry agarose decreases with increasing solid content, which is caused by structural changes of hydrogels with the higher agarose content. Deeper processing of the data according to the model described in chapter 2 (Theory) is necessary for the explanation of these experimental results in the following text. First of all, the steady-state diffusion flux is proportional to the stationary concentration difference between the diffusion cell compartments Dc (Eq. (7)), which is essentially different from the initial concentration difference between the donor and the acceptor compartments, because an appreciable amount of the solute had been transported from the donor cell into the hydrogel before the start of the steady-state stage of the experiment. The exact value of the Dc can be determined by continuous measurement of solute concentration in both solutions. When the solute concentration is measured only in acceptor compartments (like in presented experiments), Dc can be determined even at the end of the experiment if the experiment is terminated still at the steady-state stage of the diffusion process. The exact value of Dc differed for hydrogels with different dry content of agarose. The value of steady-state diffusion flux also depends on the solute partitioning between the solution and gel. The partition coefficient U was calculated directly from the mass of the solute absorbed in the gel, determined experimentally at the end of experiment. In a fact, this coefficient equals to the ratio of mean solute concentration in the gel and arithmetic average of the solute concentrations in donor and acceptor solutions at the end of

15

cMB (mmol·m-3)

cKCl (mol·m-3)

For the purposes of this work, agarose hydrogels were used as a model porous medium, in which no or little specific chemical interactions between the diffusing solute and the solid content are expected. This presumption is difficult to verify directly, nevertheless, it is supported by the very few published works on the sorption of similar solutes on agarose (to our knowledge, only the authors of [61] have dealt with the topic) and by the results of diffusion experiments discussed in [32]. As will be explained later in this section, our experimental data indicate the correctness of this presumption as well.

Fig. 4. Arrhenius plot for the estimation of activation energy of diffusion (diffusion of methylene blue in aqueous solution).

10

5

0 0

1

2

3

t (h)

4

5

0

1

2

3

4

5

t (h)

Fig. 3. Breakthrough curves of KCl (left) and MB (right) for diffusion through SPI-Pore membrane. Line represents the theoretical model, scatter plot show the experimental data at 25 °C (), 40 °C (+) and 50 °C (}).


1506

Table 1 Experimental results for the diffusion of methylene blue through hydrogels with different agarose weight content. wagarose ( wt.%)

t (°C)

Jd 109 (mol m2 s1)

tL (h)

1

25 40 50

4.39 6.02 8.02

6.5 2.6 1.7

2

25 40 50

3.83 6.15 7.29

4

25 40 50

1.73 3.84 6.08

n 107 (mol)

De 1010 (m2 s1)

Da 1010 (m2 s1)

wHA ( wt.%)

t (°C)

Jd 109 (mol m2 s1)

4.9 2.9 3.3

1.42 3.28 3.87

1.80 4.48 6.66

0

25 40 50

4.39 6.02 8.02

6.5 2.6 1.7

6.3 2.8 1.9

9.5 6.1 5.8

0.64 1.59 1.96

1.84 4.21 6.07

0.002

25 40 50

4.11 5.64 6.50

7.8 2.6 1.5

13.3 10.7 8.7

0.20 0.56 1.10

1.48 4.40 7.63

0.005

25 40 50

0.010

25 40 50

experiment. As it can be seen from Fig. 5, strong partitioning of MB in agarose was observed. This is not an unexpected finding, the partitioning of solutes in agarose hydrogels was thoroughly discussed in literature [52,32]. Golmohamadi et al. in [32] attribute high partitioning of Cd2+ and rhodamine cations in agarose hydrogels to non-specific Donnan effects linked with the hydrogel charge rather than to any direct effects on the diffusion of charged probes. An alternative explanation of the increasing total absorbed mass of MB in hydrogels with higher dry agarose content could be based on consideration of some specific chemical interactions between agarose and MB despite the initial presumption. Nevertheless, this kind of interactions should significantly affect the transient stage of the diffusion, resulting in increased time lag (see Eqs. (8) and (10)), which would also be probably dependent on the total amount of binding sites – i.e. on the dry agarose content. Evidently, this is not the case for agarose hydrogels (compare with the time lags of agarose/HA gels in Table. 2), from which we can deduce that the presumption of no specific interactions between MB and agarose was used reasonably. On the other hand, the total amount of absorbed MB related to the dry mass in the hydrogels decreases with the agarose content, which points to the decrease of its partitioning ability. It is probably caused by the denser network of more concentrated hydrogels and corresponding changes in the conformation of agarose chains and porous structure. As the agarose content increases, the number of polymer–polymer interactions between helices increases, which results in more compact structure [30,31]. Some authors [62,63] investigated that the mechanism of gel formation depends on the agarose concentration and the gelation proceeds from the homogenous solutions only if the agarose content is higher than 2 wt.%. The change of mechanism influenced significantly the gel structure

50 40 30 20 10 0 0%

1%

Table 2 Experimental results for the diffusion of methylene blue through 1 wt.% agarose hydrogels with different weight content of HA.

2%

3%

4%

5%

wagarose (% wt.) Fig. 5. Partition coefficient for the methylene blue partitioning at the boundary of agarose hydrogels at 25 °C (), 40 °C (+) and 50 °C (}).

De 1010 (m2 s1)

Da 1010 (m2 s1)

4.9 2.9 3.3

1.42 3.28 3.87

1.80 4.48 6.66

7.5 3.6 2.2

6.6 5.7 5.7

1.39 3.68 3.70

1.55 3.22 5.31

2.76 5.40 6.87

11.2 4.7 3.7

7.6 8.0 8.6

1.11 4.22 4.94

1.03 2.44 3.11

1.73 2.88 6.95

20.2 8.3 4.8

10.5 9.6 10.5

0.76 2.62 6.03

0.57 1.40 2.42

tL (h)

n 107 (mol)

and its final properties, which could be one of reasons of the lower partitioning ability related to the gel dry mass. Similarly, the agarose content affected the effective (and slightly also the apparent) diffusion coefficients. Their values were calculated from the experimental data using Eqs. (7) and (10), (see Table. 1). As expected, the effective diffusion coefficient of MB in agarose gels decreases with the dry agarose content (see Table. 1) In [64], the linear decrease in relative diffusion coefficient (De/D0) with the dry solid content of the gel is shown for the diffusion of small cations (Na+ and Cs+) in agar hydrogels. Our results with MB showed that the decrease is not linear and it is steeper for low agarose content. As the network gets denser, the diffusivity of MB in the hydrogel decreases slowly as a result of structural and conformational changes. From the comparison of De and Da, the crucial structural parameters of eeff and Tm can be calculated (see Eqs. 4, 8, and 9; note that for the no-reaction presumption the Kapp = 0 in Eq. (9)). The calculated values are shown in Fig. 6. As it was mentioned above, the network of agarose chains becomes more densely packed with increasing weight content of agarose in the gels, which strongly affects the mechanical and textural properties of the hydrogels (e.g. viscoelastic characteristics, pore size). These effects are described in detail [30,31] and were experimentally confirmed for used hydrogel samples by measuring their viscoelastic properties (see Fig. 7). The complex modulus increases with the agarose content of hydrogel in whole measuring range, which indicates more densely cross-linked network of hydrogels with higher concentration of agarose giving a decrease in the pore size. We can see that the complex modulus is frequency independent for the agarose content 1 wt.% and the dependence was observed only for more concentrated hydrogels. The obtained results correspond both with our diffusion data and with the rheological behavior described in other works [30,62]. In order to estimate the actual pore sizes, a simplespectrophotometric method published by Aymard et al. [65] was utilized in calculating the effective pore size as a function of agarose concentration in the gel. Calculated pore sizes of all utilized hydrogels (0.36 lm, 0.16 lm and 0.09 lm for 1 wt.%, 2 wt.% and 4 wt.% of agarose hydrogels, respectively) exceed significantly the Stokes hydrodynamic radius of MB. The total porosities of gels can be estimated from the weight concentration assuming ideal mixing of agarose and water, dry agarose density can be found in literature [66]. For the utilized agarose hydrogels, these estimated values are very close to unity (0.976–0.994 for gels with decreasing dry agarose content). It is evident, that the experimentally determined values of eeff are significantly lower. According to the applied model, the effective porosity differs from the total porosity of the medium, because


1.0

8

0.8

6

0.6

Tm

ε eff

1507

4

0.4 2

0.2 0.0

0 0%

1%

2%

3%

4%

5%

0%

1%

2%

3%

4%

5%

wagarose (% wt.)

wagarose (% wt.)

Fig. 6. Calculated effective porosities and tortuosity factors of agarose hydrogels at 25 °C (), 40 °C (+) and 50 °C (}).

not all the pores of medium are equally available for a mass transport (e.g. some pores can form ‘‘dead ends’’) [51]. The value of eeff decreases with increasing dry agarose content of the hydrogels as expected in connection with above described results. The changes in the density of hydrogel network together with the increase of its rigidity, the changes in water dynamics and the hydration of agarose chains are probably the reasons of the observed discrepancy between the effective porosity eeff and the weight content of water in the used hydrogels [67]. Nevertheless, mainly for more concentrated agarose hydrogels, the actual difference between estimated total and calculated effective porosity is so great that it deserves a detailed verification in future experiments. The calculated values of tortuosity factor Tm indicate significant meandering of actual solute pathway. At 25 °C, the actual distance traveled by the solute molecules when penetrating the hydrogel specimen is about twice longer than the gel thickness (see Eq. (5)). This is quite surprising finding, because the tortuosity effects are not commonly considered in the case of agarose hydrogels. Diluted agar and agarose gels (about 0.5 wt.%) are used even as reference medium with a unit tortuosity in determining transport properties of some tissues [68,69]. The published values of tortuosity factors of highly porous hydrogels are predominantly close to unity [70]. Also the model, proposed by Tao and Nicholson [71], which considers a simple relationship between tortuosity and porosity of a medium, gives the estimation of Tm insignificantly shifted from unity. Experimental results also show the decrease of Tm with the temperature, which indicates that the diffusion pathway is straightened at higher temperatures. 5.3. Diffusivity of methylene blue in the agarose/humic acids hydrogels As can be seen from experimental data shown in Table. 2 and Fig. 8, a small addition of humic acids as a reactive component into the agarose hydrogels resulted in a significant change in the barrier

properties of the gels. Like in the case of dry agarose content, increasing content of humic acids in the gel led to a considerable increase in absorbed amount of MB in the gel and to the decrease in steady-state diffusion flux. Nevertheless, note that similar effect on these two parameters is caused by 1000 lower addition of HA compared to agarose. Furthemore, unlike agarose, the total content of humic acids significantly affected also the value of time lag, which indicates extensive physico-chemical interactions between diffusing MB and humic acids contained in the gel. For the subsequent data analysis, a following presumption is applied: neither the structural properties of the agarose hydrogels nor the partitioning at the solution/hydrogel boundary is affected by added HA. The presumption takes into account very small total content of HA in the gel. The invariance of the structural parameters was supported by the rheological characterization of the hydrogels – no significant difference in rheometrical parameters was found for 1 wt.% agarose gels with and without HA (see smaller graph in Fig. 7). The assumption of similar partitioning of solute at the boundary between the solution and agarose gel with and without HA was required to calculate the value of De from the steady-state diffusion flux, because the partition coefficient U cannot be derived directly from the absorbed amount of the solute (the absorbed amount represents the sum of free and bound solute, while the partitioning takes only the concentration of free solute into account). Anyway, the experimental verification of this assumption should be taken as a scope of the future work. From the values of steady-state diffusion flux and time lag, the effective and apparent diffusion coefficients for the diffusion of methylene blue in the humic-containing hydrogels were calculated in the same manner as above. The effective diffusion coefficient characterizes the steady-state stage of the diffusion process which should not be affected by any specific interactions between the solute and the reactive sites of the medium (the reaction equilibrium in the gel is already established at the beginning of this stage).

4

1000000

(mmol·m-3)

10000 1000 100 10 1 0.01

1% agarose 20000 2% agarose 4% agarose 1% agarose + 0.002% HA 1% agarose + 0.005% HA 1% agarose + 0.010% HA 10000 0.01

cMB

|G*| (Pa)

100000

0.1

1

3

2

1

10

0 0.1

1

10

f (Hz) Fig. 7. Rheometric analysis of all utilized hydrogels (smaller graph shows detail on gels with various HA content).

0

10

20

30

40

50

t (h) Fig. 8. Breakthrough curves of MB for the diffusion at 25 °C through 1 wt.% agarose hydrogels with 0 wt.% (), 0.002 wt.% (+), 0.005 wt.% (}) and 0.010 wt.% (s) of HA.


1508

Therefore, for a given temperature, the effective diffusion coefficient is expected to be independent of a small addition of reactive component into the hydrogel. Nevertheless, small differences were found between De of the agarose/HA hydrogels and the respective agarose gel (see Table. 2). As was already discussed, the value of De was calculated according to Eq. (7) using the value of U determined for respective agarose gel without HA. This discrepancy thus indicates that the presumption of negligible effect of HA on the partitioning of MB at the boundary is not actually met perfectly. Unlike the effective diffusivity, the apparent diffusion coefficient characterizes the transient stage of the diffusion process and, therefore, its value involves the effect of specific interactions between the solute and the medium. It can be seen that the interactions between MB and HA in the hydrogels significantly suppress the mobility of methylene blue, resulting in increased time lag and decreased Da (see Fig. 8 and Table. 2). For a deeper insight into the interactions of MB with HA during the diffusion process, let us consider, that these interactions can be modeled by instantaneous (i.e. very fast in comparison with the diffusion) reversible sorption, summarized by the reaction scheme MBfree M MBbound. This sorption mechanism (resulting in a linear sorption isotherm) is applicable in the systems, where a high excess of reactive sites on the sorbent is assumed. This presumption is suitable for the systems with binding sites distributed homogenously in the whole volume (like in reactive hydrogels), unlike e.g. the sorption experiments in suspensions, where the sorption is restricted to the surface of solid sorbent particles. Nevertheless, in presented experiments, the presumption is questionable because of small addition of reactive component (HA) to the gel. The apparent equilibrium constant Kapp of the reversible sorption can be calculated from the value of Da (see Eq. (9)) using the value of eeff determined for respective agarose gel without HA. It can be seen in Fig. 9 that the value of Kapp significantly increases with higher content of HA in gel. Higher temperature has a positive effect on the sorption as characterized by an increase of Kapp with temperature. This indicates the endothermic nature of the interactions, which agrees with the results of MB sorption on humic-rich peat, published by Fernandes et al. [46,72]. This temperature effect can be attributed to the changes in conformation of HA causing higher availability of their binding sites for MB sorption at higher temperatures. In general, strong interaction between HA and cationic solutes is commonly attributed to a high content of acid functional groups. As the results of potentiometric and conductometric titration show, the total acidity of the utilized HA is 5.28 mmol g1 and the content of carboxylic groups is 2.12 mmol g1. The high content of carboxylic and phenolic groups were also confirmed by the results of detailed elemental and spectroscopic analysis (for detailed results, see [17,57]).

4

Kapp

3

2

1

0 0.000%

0.002%

0.004%

0.006%

0.008%

0.010%

wHA (% wt.) Fig. 9. Apparent equilibrium constant for the sorption of methylene blue in agarose/HA gels at 25 °C (), 40 °C (+) and 50 °C (}).

The value of Kapp, which corresponds to the defined sorption model, can be estimated also from the total absorbed amount of MB in the gels. As was already discussed, the total amount of MB in the gel represents the sum of free and bound fractions. If we introduce the parameter Uapp as a ratio of mean total concentration of MB in the gel and the arithmetic average of concentrations in both compartments of the diffusion cell at the end of a diffusion experiment, then for the ratio of this parameter and corresponding partition coefficient (determined by the experiments with agarose gel without HA), the following equation can be derived:

Uapp cðfreeÞ þ cðboundÞ ¼ ¼ 1 þ K app cðfreeÞ U

ð11Þ

It was found, that the values of Kapp, calculated using Eq. (11) were always higher than those calculated from Da (usually two to three times). This discrepancy is another sign that even the small addition of humic acids affects the partitioning of MB at solution/gel boundary and that using the partition coefficients determined for pure agarose gels for the description of transport in agarose/HA gels is not completely correct. 6. Conclusions Experimental results, presented in the paper, clearly illustrate the effect of interactions between humic acids and methylene blue on the transport of this ionic dye in model aqueous environments provided by agarose hydrogels. It can be seen, that the binding of methylene blue by humic acids strongly decelerates its transport, which is characterized by higher time needed to penetrate the samples with higher concentration of humic acids. These findings are of the crucial importance in the case of humic substances, whose barrier behavior in natural environments, so important for playing their irreplaceable environmental role, cannot be reliably predicted just from the results of traditional batch sorption experiments. The diffusion techniques, successfully applied in these experiments, hence represent an interesting alternative approach for the traditional reactivity mapping studies in the systems containing humic substances and similar reactive compounds. The method is not equipment-demanding and can be applied with minor modifications for various semi-solid or solid samples. Numerous structural (effective porosity, tortuosity factor) and interaction parameters (apparent reaction equilibrium constants) are calculated easily, as was illustrated for the studied systems. The method is also well applicable for the study on the effects of adjustable conditions such as temperature (as presented in this paper) or others (e.g. pH or ionic strength). The pilot experiments, introduced in the paper, represent the first step towards a broader utilization of the diffusion techniques in the studies on reactivity and barrier ability of humic acids. The potential applicability of the presented method is great – without any significant modification of the experimental procedure, the technique can be utilized in order to compare the barrier properties of the humic acids toward various solutes. As well, the diffusion experiments can be used to assess the solute-immobilization effects of diverse humic substances (e.g. humic acids of the different origin or specifically chemically modified humic substances) or the similar compounds. Nevertheless, some questions remain unanswered. As was discussed, the diffusion of methylene blue through agarose gel did not always provide the expected results (as is represented by obviously too high value of the calculated tortuosity). It seems likely that, contrary to the initial expectations, methylene blue interacts to some degree with the applied agarose. To suppress this effect, utilization of either a different agarose (with the carefully


characterized key properties like the charge structure) or diffusing compound should be considered in the future study. Besides, it was also illustrated that the experiments in diffusion cells do not provide complete info about the partitioning of a studied solute at the boundary between the solution and the reactive medium. The non-stationary diffusion experiments are hence recommended as the next step of the method development – these experiments are based on the direct determination of solute concentration at different distances in the diffusion medium which gives easy distinguishing of the diffusion and the partitioning effects. Acknowledgements This work was supported by Czech Science Foundation, project P106/11/P697, and by the project ‘‘The Centre for Materials Research at Brno University of Technology, Faculty of Chemistry’’ No. CZ.1.05/2.1.00/01.0012 from ERDF. References [1] S.A. Jansen, M. Malaty, S. Nwabara, E. Johnson, E. Ghabbour, G. Davies, Mater. Sci. Eng. C – Biol. Sci. 4 (1996) 175–179. [2] S.N. Bolan, C.D. Adriano, A. Kunhikrishnan, T. James, R. McDowell, N. Senesi, Adv. Agron. 110 (2011) 1–75. [3] J.F. McCarthy, J.M. Zachara, Environ. Sci. Technol. 23 (1989) 496–502. [4] M. Schnitzer, S.U. Khan, Humic Substances in the Environment, Marcel Dekker, Inc., New York, 1972. ˇ a-Méndez, J. Havel, J. Patocˇka, J. Appl. Biomed. 3 (2004) 13–24. [5] E.M. Pen [6] R. Klocking, B. Helbig, Biopolymers 1 (2001) 379–392. [7] R. Sutton, G. Sposito, Environ. Sci. Technol. 39 (2005) 9009–9015. [8] E. Tipping, Cation Binding by Humic Substances, Cambridge University Press, Cambridge, 2002. [9] W. Kördel, M. Dassenakis, J. Lintelmann, S. Padberg, Pure Appl. Chem. 69 (1997) 1571–1600. [10] M. Borkovec, G.J.M. Koper, C. Piguet, Curr. Opin. Colloid. Interface 11 (2006) 280–289. [11] N.B. Ferapontov, L.R. Parbuzina, V.I. Gorshkov, N.L. Strusovskaya, A.N. Gagarin, React. Funct. Polym. 45 (2000) 145–153. [12] A.V. Dobrynin, M. Rubinstein, Prog. Polym. Sci. 30 (2005) 1049–1118. [13] M. Klucˇáková, M. Pekarˇ, J. Polym. Mater. 20 (2003) 145–154. [14] M. Klucˇáková, Environ. Chem. Lett. 8 (2010) 145–148. [15] C. Mizuno, S.H. Bao, T. Hinoue, et al., Anal. Sci. 21 (2005) 281–286. [16] W.S. Wan Ngah, L.C. Teong, M.A.K.M. Hanafiah, Carbohydr. Polym. 83 (2011) 1446–1456. [17] P. Sedlácˇek, M. Klucˇáková, Geoderma 153 (2009) 11–17. [18] P. Sedlácˇek, M. Klucˇáková, Collect. Czech. Chem. Commun. 74 (2009) 1323– 1340. [19] M. Klucˇáková, M. Pekarˇ, Study of diffusion of metal cations in humic gels, in: E.A. Davies (Ed.), Humic Substances: Nature’s Most Versatile Materials, Taylor & Francis, New York, 2004, pp. 263–273. [20] M. Klucˇáková, M. Pekarˇ, J. Polym. Mater. 20 (2003) 155–162. [21] J. Crank, The Mathematics of Diffusion, Clarendon Press, Oxford, 1956. [22] M. García-Gutiérrez et al., J. Iber. Geol. 32 (2006) 37–54. [23] E.L. Cussler, Diffusion Mass: Transfer in Fluid Systems, Cambridge University Press, Cambridge, 1984. [24] B. Falk, S. Garramone, S. Shivkumar, Mater. Lett. 58 (2004) 3261–3265. [25] R. Ibrahim, G.B. Kasting, Int. J. Pharm. 435 (2012) 33–37.

1509

[26] R.B. Mustapha, C. Lafforgue, N. Fenina, J.P. Marty, Indian J. Pharmacol. 43 (2011) 157–162. [27] M.A. Pellett, A.C. Watkinson, J. Hadgraft, K.R. Brain, Int. J. Pharm. 154 (1997) 205–215. [28] M. Schulz, H.L. Frisch, J. Chem. Phys. 107 (1997) 2673–2683. [29] J.Y. Xiong, J. Narayanan, et al., J. Phys. Chem. – US 109 (2005) 5638–5643. [30] L.M. Barrangou, C.R. Daubert, et al., Food Hydrocolloids 20 (2006) 184–195. [31] L.M. Barrangou, C.R. Daubert, et al., Food Hydrocolloids 20 (2006) 196–203. [32] M. Golmohamadi, T.A. Davis, et al., J. Phys. Chem. A 116 (2012) 6505–6510. [33] J.R. Lead, K. Starchev, et al., Environ. Sci. Technol. 37 (2003) 482–487. [34] J. Gutenwik, B. Nilson, et al., Biochem. Eng. J. 19 (2004) 1–7. [35] B.A. Westrin, A. Axelsson, Biotechnol. Tech. 5 (1991) 303–306. [36] S.M. Liang, J. Xu, et al., J. Controlled Release 115 (2006) 189–196. [37] S.X. Tan, H.J. Dai, et al., J. Biomed. Opt. 14 (2009) 050503. [38] J. Labille, N. Fatin-Rouge, et al., Langmuir 23 (2007) 2083–2090. [39] A. Pluen, P.A. Netti, et al., Biophys. J. 77 (1999) 542–552. [40] R.D. Guy, D.R. Narine, S. DeSilva, Chemistry 58 (1980) 547–554. [41] Guo-Ping Sheng, Meng-Lin Zhang, Yu. Han-Qing, J. Colloid Interface Sci. 331 (2009) 15–20. [42] C. Zhou, Z. Wu, W. Zhang, M. Xia, et al., Funct. Mater. Lett. 4 (2011) 373–376. [43] P. Janoš, Environ. Sci. Technol. 37 (2003) 5792–5798. [44] P. Janoš, P. Šedivy´, M. Ry´znarová, S. Grötschelová, Chemosphere 59 (2005) 881–886. [45] P. Janoš, P. Michálek, L. Turek, Dyes Pigm. 74 (2007) 363–370. [46] A.N. Fernandes, C.A.P. Almeida, C.T.B. Menezes, N.A. Debacher, M.M.D. Sierra, J. Hazard. Mater. 144 (2007) 412–419. [47] G. Crini, Bioresour. Technol. 97 (2006) 1061–1085. [48] V.K. Gupta, J. Environ. Manage. 90 (2009) 2313–2342. [49] M. Rafatullah, O. Sulaiman, R. Hashim, A. Ahmad, J. Hazard. Mater. 177 (2010) 70–80. [50] R.H. Stokes, J. Am. Chem. Soc. 73 (1951) 3527–3528. [51] C.D. Shackelford, S.D. Moore, Eng. Geol. 152 (2013) 133–147. [52] N. Fatin-Rouge, A. Milon, J. Buffle, R.R. Goulte, A. Tessier, Phys. Chem. B 107 (2003) 12126–12137. [53] H.L. Frisch, J. Phys. Chem. 61 (1957) 93–95. [54] M. Klucˇáková, M. Pekarˇ, Colloids Surf., A 252 (2005) 157–164. [55] J. Riggle, R. von Wandruszka, Talanta 57 (2002) 519–526. [56] F.J. Stevenson, Humus Chemistry: Genesis, Composition, Reactions, second ed., Wiley-Interscience Publ., New York, 1982. [57] J. Peuravuori, P. Zˇbánková, K. Pihlaja, Fuel Process. Technol. 87 (2006) 829– 839. [58] G.D. Leaist, Can. J. Chem. 66 (1988) 2452–2456. [59] T. Hori, N. Kamon, et al., J. Soc. Dyers Colour. 103 (1987) 265–270. [60] M. Hogan, J. Wang, R.H. Austin, C.L. Monitto, S. Hershkowitz, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79 (1982) 3518–3522. [61] S. Babak, F. Ashoori, Chem. Cent. J. 6 (2012) 14–27. [62] E. Fernández, D. López, C. Mijangos, M. Duskova-Smrckova, M. Ilavsky, K. Dusek, J. Polym. Sci. Polmer. Phys. 46 (2008) 322–328. [63] P.L. San Biagio, D. Bulonel, A. Emanuele, M.B. Palma-Vittorelli, M.U. Palma, Food Hydrocolloid 10 (1996) 91–97. [64] C. Nicholson, Rep. Prog. Phys. 64 (2001) 815–884. [65] P. Aymard, D.R. Martin, et al., Biopolymers 59 (2001) 131–144. [66] T.C. Laurent, Biochim. Biophys. Acta 136 (1967) 199–205. [67] A. Deriu, F. Cavatorta, D. Cabrini, C.J. Carlile, H.D. Middendorf, Europhys. Lett. 24 (1993) 351–357. [68] C. Nicholson, L. Tao, Biophys. J. 65 (1993) 2277–2290. [69] C. Nicholson, J.M. Phillips, J. Physiol. 321 (1981) 225–257. [70] P. Lesny´, J. De Croos, M. Prádny´, J. Vacík, J. Michálek, S. Woerly, E. Syková, J. Chem. Neuroanat. 23 (2002) 243–247. [71] L. Tao, C. Nicholson, J. Theor. Biol. 229 (2004) 59–68. [72] A.N. Fernandes, C.A. Policiano Almeida, N.A. Debacher, M.M. de Souza Sierra, J. Mol. Struct. 982 (2010) 62–65.

Příloha č. 2


SEDLÁČEK, P., SMILEK, J., KLUČÁKOVÁ, M. How the interactions with humic acids affect the mobility of ionic dyes in hydrogels – 2. Non-stationary diffusion experiments. REACTIVE & FUNCTIONAL POLYMERS. 2014. 75(1). s. 41 - 50. ISSN 1381-5148. DOI: 10.1016/j.reactfunctpolym.2013.12.002 IF = 2,535.

Reactive & Functional Polymers 75 (2014) 41–50


Reactive & Functional Polymers journal homepage: www.elsevier.com/locate/react

How the interactions with humic acids affect the mobility of ionic dyes in hydrogels – 2. Non-stationary diffusion experiments Petr Sedlácˇek ⇑, Jirˇí Smilek, Martina Klucˇáková Brno University of Technology, Faculty of Chemistry, Materials Research Centre CZ.1.05/2.1.00/01.0012, Purkynˇova 118, 612 00 Brno, Czech Republic1

a r t i c l e

i n f o

Article history: Received 7 October 2013 Received in revised form 11 November 2013 Accepted 7 December 2013 Available online 12 December 2013 Keywords: Reactivity Diffusion Humic acids Hydrogel

a b s t r a c t Non-stationary diffusion of two cationic dyes (Methylene Blue and Rhodamine 6G) was studied in hydrogels with different content of agarose and humic acids (HA). A simple spectrophotometrical method was utilized in the in situ measurement of dye concentration in the gel samples at different distances from the boundary. The effect of temperature, pH and ionic strength was investigated. The results confirmed the considerable partitioning of both dyes in agarose gels as well as the strong immobilization of dyes caused by their sorption on HA. The apparent diffusion coefficients of both dyes decreased with increasing solid content in gels. In the case of agarose gels without the addition of HA, this decrease was attributed to increased tortuosity of diffusion caused by denser agarose network. The apparent equilibrium constant of the sorption of dyes on HA in agarose/HA gels was calculated from their apparent diffusion coefficients. The value of the equilibrium constant increased with the content of HA in gel and, surprisingly, also with decreasing pH inside gel. Ó 2013 Elsevier Ltd. All rights reserved.

1. Introduction Humic substances form the key organic component of soils, sediments and young coals. From the chemical point of view, they represent complex heterogeneous mixtures of polydispersed materials with the complicated structural skeleton and can be divided operatively into three main fractions: humic acids (HA), fulvic acids and humin. Humic and fulvic acids are extracted from soil and other solid phase sources using a strong base. HA are insoluble at low pH, and they are precipitated by adding strong acid. Humin cannot be extracted with either a strong base or a strong acid [1]. Although they are well known to stand behind the crucial environmental phenomena (e.g. the carbon sequestration or self-detoxification of soils), even after more than two centuries of substantial research, the basic chemical nature, biosynthetic pathways, and the reactivity of humic substances and soil organic matter are still poorly understood [2]. The key feature of natural behavior and of function of humics lies in their outstanding ability to bind compounds of diverse chemical nature. This process is of an exceptional biological, environmental and even industrial importance. In soils, sediments and in water aquifers, binding on solid or dissolved humic substances determines the local concentrations and the fluxes of ⇑ Corresponding author. Tel.: +420 54114 9486; fax: +420 54114 9398. E-mail addresses: [email protected] (P. Sedlácˇek), [email protected] (J. Smilek), [email protected] (M. Klucˇáková). 1 http://www.materials-research.cz/en 1381-5148/$ - see front matter Ó 2013 Elsevier Ltd. All rights reserved. http://dx.doi.org/10.1016/j.reactfunctpolym.2013.12.002

bound compounds, which crucially affects the dynamics of essentially all other components of the systems. Hereby, the presence of humic substances controls the ecotoxicity of harmful pollutants and the bioavailability of essential nutrients in soils at the same time. Therefore, a considerable experimental effort has been directed towards describing the interactions of humic substances with the diverse model pollutants – e.g. heavy metals [3], radionuclides [4], pesticides [5] or pharmaceuticals [6] – and as well with some typical nutrients [7]. Moreover, the development of some humics – based sorbents and artificial barriers for various environmental and industrial applications has become a subject of vast concern [8,9]. Practically all the above referenced reviews summarize the studies which focus on the common batch sorption experiments, aiming at the detailed description of the sorption equilibrium and the sorption kinetics in the solute–humics systems. The experimental procedures are always similar and the individual studies usually differ just in the preferred combination of solute and humics and often also in the level of complexity of the mathematical model used for the interpretation of sorption data (compare various models reviewed in [10]). On the other hand, in our recent works, simple diffusion studies were put forward as the reasonable experimental alternative which better describes the actual effects of the humics–solute interactions on the transport of a solute in humics-containing matrices [11–16]. In these papers, a hydrogel form of humic acids is utilized both as a reasonable model of native humic environments and also because a semi-solid hydrogel sample provides

42


better feasibility of the diffusion experiments. In the most recent work [16], the diffusions of Methylene Blue (as a model cationic organic dye) in aqueous solutions and in agarose gels with and without the addition of humic acids were studied by the method of diffusion cells. The method is based on the measurement of time needed by the solute to penetrate through the studied porous specimen and, after the penetration, of the steady-state flux of the solute. The results of these experiments clearly showed the barrier effect of humic acids on the transport of Methylene Blue in gels. The experimental results were processed using the comprehensive theoretical model, summarized by Shackelford and Moore [17] for the description of the diffusion of solutes in the porous media, in order to calculate some diffusion and interaction parameters of the studied systems. Nevertheless, apart from the obvious illustration of reactivity and barrier properties of humic acids, the experiments in the diffusion cells proved the insufficiency for an adequate separation of the two independent effects, acting simultaneously in the systems: (i) of the partitioning (i.e. unequal distribution caused by a phaseequilibrium) of free solute at the solution–gel boundary and (ii) of the immobilization of solute in gel caused by some specific solute – HA interactions (for details, see [16]). To address the two effects independently, the non-stationary diffusion studies could provide an improved experimental tool (a comprehensive handlist of the non-stationary diffusion models with the basic experimental layout can be found e.g. in [18]). In the non-stationary experiments, the actual concentration of diffusing solute is measured in the studied material at different times and different distances from the solute source. The diffusion coefficients of solute are then calculated either from the time change of the solute concentration profile in the sample or from the solute total diffusion flux. Diverse sophisticated analytical techniques were applied previously in the measurement of solute concentration profiles in gels, e.g. fluorescence microscopy [19], nuclear magnetic resonance techniques [20] or ultrasonic acoustics [21]. Some of the uncomplicated non-stationary diffusion techniques were also utilized in our preliminary study on the transport of cupric ions in the model humic matrices [11–15]. The experiments presented here improve the previous studies of humic matrices by introducing a direct, non-destructive, spectrophotometric method of determination of the solute concentration profiles in the supporting hydrogels loaded with different amounts of humic acids. It utilizes the characteristic visible light absorption of the solutes (charged organic dyes) in order to measure their concentration when diffusing in the appropriately selected hydrogel materials which allow the transmission of light. This method features the advantage of great availability – UV– VIS spectroscopy represents the routine laboratory method with low equipment demands. Moreover, it can be used for a wide range of model hydrogels and solutes. Direct in situ imaging of the concentration profile of solutes in hydrogels was already used as a powerful tool in the diffusion studies; Dunmire et al. [22] developed and evaluated automated UV spectrophotometric method for analyzing molecular transport of several test molecules into gels with a relevance to the design of controlled drug-delivery systems, similar techniques for UV or visible imaging of a solute diffusion in optical transparent hydrogels were utilized also in other pharmaceutical [23–25] or food engineering studies [26,27]. The experiments presented in this paper focus on the diffusion of two solutes – Methylene Blue and Rhodamine 6G – in agarose hydrogels loaded with different amounts of lignite-derived humic acids. Both selected solutes represent positively charged organic dyes with well-known affinity to bind on the humic substances [28,29]. Methylene Blue was included, inter alia, to provide a basis for the comparison with results of our previously published diffusion-cell experiments, Rhodamine 6G was added because its diffusion in hydrogels have been extensively studied by several authors

[30–32]. Experimentally determined concentration profiles of solutes were subjected to the least-square regression with a suitable mathematical model in order to calculate the diffusion and partition coefficients of solutes. Moreover, the influence of pH and ionic strength on the diffusion process was analyzed as well. 2. Materials and methods 2.1. Chemicals Agarose (routine use class, <10 wt.% moisture content), Methylene Blue hydrate (C.I. Basic Blue 9, dye content, P95 wt.%) and Rhodamine 6G (C.I. Basic Red 1, dye content, P95 wt.%) were purchased from Sigma–Aldrich and used without further purification. Humic acids were isolated by alkaline extraction from South-Moravian lignite [11,33]. The details on the chemical structure of both the original lignite matrix and isolated HA (total and carboxylic acidity, elemental and spectroscopic analysis), can be found in previously published papers [16,33,34]. Phosphate buffer saline (PBS), used for the adjustment of pH of the dye solution and of inner pH of hydrogels (Section 5.3), was prepared by the dissolution of accurate amount of Na2HPO42H2O and NaH2PO42H2O (p.a., Sigma–Aldrich) in deionized water. Three different pH values (3, 7 and 11) and two buffer ionic strengths (10 mM and 200 mM) were used. 2.2. Preparation of hydrogels All hydrogels, utilized in subsequent diffusion experiments, were prepared via the same method of thermoreversible gelation of aqueous solution of agarose as in previous work [16]. Agarose hydrogels (without the addition of HA, dry agarose content in gel: 0.5 wt.%, 1 wt.%, 2 wt.% and 4 wt.%) gelatinized from the solution of agarose in water (Section 5.1) or in the respective buffer solution (Section 5.3), while agarose/HA gels did from the solution of both agarose (1 wt.%) and HA (0.002 wt.%, 0.005 wt.% and 0.010 wt.%) in water (Section 5.2) or in the buffer solution (Section 5.3). A simple gelation procedure was applied: accurately weighted amount of agarose powder was dissolved in deionized water or in the buffer solution (preparation of agarose gels) or in the solution of HA of the corresponding concentration (preparation of agarose/HA gels), respectively. The mixture was slowly heated when stirring continuously to 80 °C and maintained at the temperature until the occurrence of transparent solution. The solution was degassed in ultrasonic bath for 1 min. (at 80 °C) and slowly poured into the PMMA spectrophotometric cuvette (inner dimensions: 10 10 45 mm). The cuvette orifice was immediately covered with pre-heated plate of glass to prevent drying and shrinking of gel. Flat surface of the boundary of resulting hydrogels was provided by wiping an excess solution away. Gentle cooling of cuvettes at the laboratory temperature led to the gradual gelation of the mixture. 2.3. Diffusion experiments The non-stationary diffusion experiments with hydrogels were performed as follows: Pre-prepared hydrogel samples in the PMMA cuvettes were immersed in horizontal positions in 0.01 g dm3 aqueous solution of the respective dye (Methylene Blue or Rhodamine 6G, four cuvettes in one container filled with 250 cm3 of the dye solution). The dye solution was stirred continuously by the magnetic stirrer and the dye was left to diffuse from the solution into the gel samples through the square orifices of the cuvettes. Each experiment was duplicated. In selected time


intervals, the cuvettes were taken out of the solution and the UV– VIS spectra were measured at various distances from the orifice on Varian Cary 50 UV–VIS spectrophotometer equipped with the special accessory providing controlled fine vertical movement of the cuvette in the spectrophotometer. From the collected UV–VIS spectra, the concentration of the dye was determined at different positions in gels. For this purpose the UV–VIS spectra were calibrated for hydrogels with known concentration of the dye, homogenously distributed in the whole volume of gel. These hydrogels samples were prepared using exactly the same preparation procedure as for the samples for the diffusion experiments; only the precise amount of the dye was added to the solution before gelatinization. In this way, the reference samples, covering at least three different concentrations of the dye, were prepared for all tested hydrogel compositions. When testing the influence of pH and ionic strength (Section 5.3), the non-stationary diffusion experiments were repeated using buffered dye solutions and buffered gels (1 wt.% agarose gels). PBSs were used as a standard tool for the pH adjustment (see Section 2.2). Agarose hydrogels (1 wt.% of agarose) with 0 wt.% HA and 0.01 wt.% HA were utilized in these experiments. The desired values of the inner pH of the resulting hydrogels were experimentally verified using the spearhead pH electrode designed for measurements in semi-solid samples (Metrohm, Inc.). Difference between the pH values of the buffer solution and the resulting hydrogel never exceeds 0.1. The preparation of the reference samples for all buffered hydrogels and the collection of UV–VIS spectra were performed in the way described above. 3. Nomenclature

ous medium, the transport of the solute is complicated by two major effects: (i) reduced cross-sectional area is available for the diffusive mass flux of the solute relative to the macroscopic crosssectional area (because we assume that solute simply cannot penetrate into solid phase), and (ii) the existence of impenetrable solid phase results in more tortuous transport (solute pathway meanders through the medium). As a result, modified Fick’s equations describe the transport of the solute through the porous specimen. The exact mathematical model for the description of such diffusion processes is discussed in details by Shackelford and Moore [17] and summarized briefly in our previous paper [16]. Furthermore, when the solute interacts specifically with the solid content of the porous medium, the Fick’s equation (1) must be supplemented by a reaction rate component which depends on the actual interaction mechanism. Simple reversible immobilization of the solute on the solid content of the porous medium is commonly presumed as a first approximation. The interaction mechanism can be expressed as K app

Sfree ! Ssorbed

effective porosity (–) partition coefficient (–) concentration of the solute (g dm3)a diffusion coefficient (m2 s1) free solution diffusion coefficient (m2 s1) apparent diffusion coefficient (m2 s1) complementary error function apparent equilibrium constant (–) time (s) tortuosity factor (–) weight concentration (wt.%) direction coordinate (m)

U c D D0 Da erfc Kapp t Tm w x

a Particular concentration variants are distinguished by the corresponding subscripts and explained in the text.

4. Theory When a solute diffuses in a medium, the rate of its molecular transport is governed by the solute’s concentration gradient. For the simplest case of one-dimensional fickian diffusion (along the x-axis), neglecting other effects such as the concentration flux induced by the temperature gradient or the concentration changes caused by the interaction between the solute and the medium, the governing equation for the transient diffusion can be expressed by the renowned Fick’s second law 2

@c @ c ¼D 2 @t @x

ð1Þ

if the diffusion coefficient of the solute in the medium D is time and concentration independent. When the diffusion proceeds in a por-

ð2Þ

where Sfree and Ssorb represent the free and the sorbed solute, respectively, and the apparent equilibrium constant Kapp represents a sorbed-to-free solute mass ratio at the equilibrium:

K app ¼

csorbed cfree eq

ð3Þ

For the porous systems where the interactions between the solid content and the solute follow the above proposed mechanism, the apparent diffusion coefficient of the solute is defined in the following way:

Da ¼ eeff

43

D0 T m ð1 þ K app Þ

ð4Þ

where Tm is the tortuosity factor (for the used definition of the tortuosity factor, see [16]) and the Second Fick’s law for the transport of free solute can then be simply rearranged:

@cfree @ 2 cfree ¼ Da @t @x2

ð5Þ

The analytic solution of the last equation according to the corresponding experimental arrangement gives the relation which describes the time-spatial dependence of the free solute concentration in the medium. One commonly used experimental arrangement represents the ‘constant source in-diffusion technique’. In this case, the free solute concentration at the boundary of the diffusion medium is kept constant during the experiment. Eq. (5) can be easily processed by the Laplace transformation and the time development of the concentration profile of diffusing solute in the porous medium is given by the following equation:

x cfree ¼ cfree; x¼0 erfc pffiffiffiffiffiffiffiffiffiffi 4Da t

ð6Þ

where cfree, x = 0 is the time-independent concentration of the free solute at the boundary from the side of porous medium. Because the concentration profile of the bound (sorbed) fraction of the solute can easily be derived from Eqs. (3) and (6), the total concentration of the solute in gel follows the equation:

x ctot ¼ cfree þ csorbed ¼ cfree; x¼0 ð1 þ K app Þ erfc pffiffiffiffiffiffiffiffiffiffi 4Da t

ð7Þ

The solute partitioning (non-equal distribution) often takes place at the boundary between two phases (e.g. the solute solution and the porous medium which the solute diffuses into) which results in a discontinuity in the concentration of free solute at the


44

interface (see e.g. [31]). The partition coefficient U then describes the distribution of the free solute between the solution and the porous medium at the boundary:

cfree; x¼0 porous U¼ cfree;x¼0

ð8Þ

solution

and Eq. (7) transforms as follows:

x ctot ¼ ctot;x¼0 porous erfc pffiffiffiffiffiffiffiffiffiffi 4Da t x ¼ Ucfree;x¼0 solution ð1 þ K app Þ erfc pffiffiffiffiffiffiffiffiffiffi 4Da t

ð9Þ

where the boundary concentration of the free solute from the solu tion side cfree; x¼0 solution equals the bulk concentration of the solution when the solution is stirred sufficiently. Consequently, the determination of the total concentration of solute across the porous medium at various times and the processing of data using Eq. (9) result in the determination of the two crucial parameters which describe the partition and the interaction effects independently – i.e. the partition coefficient U and the apparent equilibrium constant Kapp. 5. Results and discussion The diffusion experiments, presented in this paper, follow the previous work, which investigated the barrier effects of humic acids on the transport of Methylene Blue by means of the diffusion cells method [16]. Main disadvantage of those experiments was the inability to directly distinguish the relative impacts of the solute partitioning and the solute binding on the solid content, which proceed in gel simultaneously. The non-stationary experiments overcome this trouble in a simple and highly illustrative way. Because the utilized agarose matrix is transparent, the effects of small additions of a reactive component on the transport of a colored compound can be estimated even visually and the quantitative assessment by means of spectrophotometry poses no problems. 5.1. Diffusion in agarose hydrogels To provide a comprehensive comparison with the previously published stationary diffusion experiments, the transient diffusion of the dyes in hydrogels with different dry contents of agarose was investigated before turning our attention to hydrogel with the addition of HA. Fig. 1 shows the concentration profiles of Methylene Blue in gels at 30 °C. The profiles indicate that the penetration of Methylene Blue into gel is only slightly decelerated by increased agarose weight content. This finding is not surprising because the small overall content of agarose is not anticipated to restrict the solute motion considerably. It also corresponds well to the results of diffusion cells experiments. More interesting finding concerns the total concentration of dye at the boundary of gel. The results indicate that gels with higher content of agarose show higher concentration of dye near the boundary. This partitioning effect of agarose in hydrogels is well known and was discussed elaborately [31–35]. The agarobiose backbone of agarose usually contains ionic impurities like sulfonates, ester sulfates, pyruvates and carboxylic groups [36] and the resulting Donnan potential of the agarose network is commonly addressed in the explanation of the enhancement of cation concentrations in hydrogel. Similar concentration profiles as those shown for Methylene Blue in Fig. 1 were determined also when the diffusion of Rhodamine 6G was investigated. In order to evaluate the above discussed effects quantitatively, the experimental data were processed using the in-diffusion model, presented in Section 4. Measured concentration profiles were

Fig. 1. Experimental (points) and theoretical (lines) concentration profiles of Methylene Blue in agarose gels at 30 °C (the corresponding weight content of agarose is shown above each graph).

fitted by Eq. (9) via the least square method using the Solver add-in in Microsoft Excel. The regression characterized by the solid lines in Fig. 1 resulted in two parameters, i.e. the total concentration of the dye at the boundary ctot,x=0 and the apparent diffusion coefficient Da. The standard errors of the diffusion parameters for individual gels were calculated from minimally six determined values (duplicated experiments at three diffusion times). As can be seen in Fig. 2, the decrease in the diffusivity with increasing agarose content in hydrogel was found for both dyes. This confirms the trend revealed in our previous work by the diffusion cells method [16], although the actual values of Da are about two times higher here. To explain this difference, it is worth mentioning that in the diffusion cells method, Da is calculated indirectly from the time needed by solute to penetrate through the hydrogel specimen of known thickness. This time is estimated by the extrapolation of linear part of the break-through curves of the solute although the concentration of the solute in compartment behind hydrogel gradually increases even before (see Fig. 2 in Ref. [16]). By contrast, the non-stationary diffusion method is better suited for the description of the transient stage of the diffusion process, because the time-development of the concentration profiles can be observed repeatedly over the long period of time which significantly reduces the experimental error. For deeper insight into the meaning of Da, it is illustrative to compare its value with the diffusion coefficient which describes the transport of the solute in the respective solution (i.e. with the free solution diffusion coefficient D0). The values of free solution diffusion coefficient D0 of both dyes were determined by the diffusion cells method (the exact experimental procedure is described in [16]) at all studied temperatures. The determined values of D0 are shown in Tables 1 and 2, together with the free diffusion coefficients of the dyes in the buffer solutions (will be discussed later). Determined free solution diffusivity of Methylene Blue agrees with published values [37,38]. On the other hand, literature values of D0 for Rhodamine 6G vary by nearly an order of magnitude (for the summary of the values determined by different methods, see [39]). The poorly characterized values of diffusion coefficient of Rhodamine dyes in water are usually attributed to concentration effects caused by molecular aggregation [40]. The diffusion cells experiment provided the value of D0 at high end of the interval of literature values. It was found that the diffusivity of both dyes in agarose hydrogels were close to their diffusion coefficients in water (see the halffilled points in Fig. 2). This is the well-expected result for hydrogels


45

Fig. 2. Apparent diffusion coefficients of Methylene Blue (left) and Rhodamine 6G (right) in hydrogels with different weight content of agarose at 30 °C (s), 40 °C (}) and 50 °C (4). Half – filled points represent the free solution diffusion coefficients.

Table 1 Free solution diffusion coefficients D0 of Methylene Blue in all tested solutions (determined by the diffusion cells method; standard error calculated from the triplicated experiment). t (°C)

pH

D0 1010 (m2 s1)

Water

30 40 50

–

9.66 ± 0.08 12.95 ± 0.01 16.41 ± 0.07

10 mM PBS

30

3 7 11

8.74 ± 0.05 7.34 ± 0.23 9.20 ± 0.62

200 mM PBS

30

3 7 11

8.88 ± 0.02 8.50 ± 0.09 11.24 ± 0.06

Table 2 Free solution diffusion coefficients D0 of Rhodamine 6G in all tested solutions (determined by the diffusion cells method; standard error calculated from the triplicated experiment). t (°C)

pH

D0 1010 (m2 s1)

Water

30 40 50

–

9.94 ± 0.02 11.84 ± 0.05 14.44 ± 0.05

10 mM PBS

30

3 7 11

7.45 ± 0.05 6.07 ± 0.01 6.25 ± 0.04

200 mM PBS

30

3 7 11

6.98 ± 0.01 7.12 ± 0.03 6.90 ± 0.03

with no specific interactions between diffusing solute and solid content of gel, where the transport of solute is restricted only by more tortuous diffusion pathway caused by the solid content of gel. Higher standard errors of Da values of both dyes at 50 °C are evident in Fig. 2; this could imply some structural changes of gel induced by elevated temperature which could bring confusion into the diffusion results. The temperature-controlled phase transition behavior of agarose gels is well known and described in the literature [41]. Nevertheless, it is reasonable to expect that any important structural and textural differences should be associated with the considerable changes in mechanical properties of gels and negligible changes of the viscoelastic characteristics at higher temperatures were revealed by the results of rheometric analysis of gels (see Supporting Info). Because no specific interactions between the diffusing dyes and the solid content of agarose gels are expected, the decrease in the diffusivity of dyes in agarose gels can be attributed fully to the tortuosity effect and the determined boundary concentration of dye in gel clearly characterizes the partitioning effect described by Eq. (8).

Substituting Kapp = 0 in Eqs. (4) and (8), the values of tortuosity factor Tm and of partition coefficient U can be calculated from the determined values of Da and ctot,x = 0, respectively. As can be seen in Fig. 3, the partition coefficient of studied dyes increases with the content of agarose in gel and for Methylene Blue also with the temperature. It complies with the similar tendency, determined previously by the diffusion cells method [16]. Nevertheless, the actual values of U are, again, significantly lower (in average about three times lower) than those derived from the steady-state experiments in the diffusion cells. The explanation of the difference is very much the same as in the case of Da. In the diffusion cells experiment, the partitioning coefficient is estimated from the loss of dye from the solution assuming the linear concentration profile of dye in the gel sample. Unfortunately, this assumption cannot be verified experimentally, which burdens the results of increased uncertainty. At 30 °C, the values of U in 1 wt.% agarose hydrogel are close to unity for Methylene Blue which means that the dye is almost equally distributed between the source solution and hydrogel in equilibrium. Rhodamine concentrates slightly more in agarose gel, as indicated by the value of U = 2.4. In more concentrated agarose hydrogels, the value of U for both dyes in most cases does not exceed 10. The values of U obtained in this work are in better agreement with the published results than those determined previously in [16]. Fatin-Rouge et al. [31] focused on partitioning of different solutes including Rhodamine 6G in gels with the agarose content of about 1 wt.%. They determined the partition coefficients of Rhodamine in the range from 1 to 4, depending on the pH. Also the values of U determined in another work for various inorganic and organic low-molecular ions in agarose hydrogel usually fall within the range from 1 to 10 [30]. In general, higher standard errors of U were found for the higher temperature, again. Furthermore, the standard errors of the values of U determined for Methylene Blue at 40 °C and 50 °C in the 4 wt.% agarose gel were so high (relative error higher than 50 %) that these values were excluded from Fig. 3. To understand this deviation, note that in the concentration profiles shown in Fig. 1, the points representing the concentration values near the boundary are missing for gels with higher weight content of agarose; this is caused by increased turbidity of hydrogels with higher solid content, which in combination with increased concentration of the dye made the values of absorbance close to the interface too high to be assessed properly. Fewer experimental points are therefore subjected to the non-linear regression and the resulting parameters are less precise. Also the values of tortuosity factor Tm differ from those calculated from the diffusion cells experiments (they are about two times lower here). As can be seen in Fig. 4, the tortuosity factors for both dyes in all agarose gels are not distant from unity which indicates almost straight movement of the solute in gels (consider that Tm represents the square of actual distance traveled by the solute relative to the macroscopic distance). This fact matches the

46


Fig. 3. Partition coefficients of Methylene Blue (left) and Rhodamine 6G (right) in hydrogels with different weight content of agarose at 30 °C (s), 40 °C (}) and 50 °C (4).

Fig. 4. Tortuosity factors for the diffusion of Methylene Blue (left) and Rhodamine 6G (right) in hydrogels with different weight content of agarose at 30 °C (s), 40 °C (}) and 50 °C (4).

published results again, because little tortuosity effects are commonly considered in the case of agarose hydrogels [42]. Dilute agar and agarose gels (about 0.5 wt.%) are even used as reference medium with a unit tortuosity in determining the transport properties of some tissues [43,44]. The value of Tm decreases with increasing temperature, indicating that the solid network of gel obstructs less the transport of the solute at higher temperatures. Looking back to Figs. 2–4, it can also be concluded that both cationic dyes – Methylene Blue and Rhodamine 6G – do not differ essentially in their partitioning and diffusive behavior in agarose hydrogels. It indicates that both effects are driven primarily by the total charge of the solute and slight differences in its other structural parameters (e.g. molecular weight and shape) play no crucial role. 5.2. Diffusion in agarose/HA hydrogels The central intent of the presented work was to shed a new light on the effects of interactions between humic acids and ionic dyes on the transport of the dyes in humics-containing systems. The main set of experiments therefore focused on the comprehensive investigation of diffusive transport of the dyes in agarose hydrogels (1 wt.% of agarose) with various small additions of humic acids, homogeneously spread in the hydrogel matrix. Under all tested experimental conditions, the addition of humic acids into the gel matrix resulted in a strong change in transport properties of the studied dyes, as is clearly shown in Fig. 5. As is evident from the concentration profiles shown in Fig. 6, a small content of humic acids, more than two orders of magnitude lower in comparison with agarose, leads to the obvious slowdown of the dye penetration in gel as well as to the significant increase in total concentration of dye near the boundary. This is in perfect agreement with the strong enhancement of the barrier properties of gels, found for Methylene Blue in the previous diffusion cells experiments [16]. The observed slowdown of the diffusion process was quantitatively expressed by the shift in apparent diffusivity, calculated

Fig. 5. Picture of the gel samples after 24 h of diffusion of Methylene Blue at 30 °C (four duplicates from left to right: 0 wt.%, 0.002 wt.%, 0.005 wt.% and 0.010 wt.% HA in 1 wt.% agarose gel).

from the least-square fitting of the concentration profiles by Eq. (9). The values of Da for both cationic dyes decrease considerably with the content of humic acids in gels. As can be seen in Eq. (4), two possible effects can be addressed in searching for the explanation of this interesting behavior. Strong increase in the tortuosity factor could result in the important drop in apparent diffusivity. Nevertheless, the total added amount of humic acids is so small that no significant effect on the structural and mechanical properties of gel should be expected, as was also experimentally proved by the measurement of viscoelastic properties of gels in the previous work [16]. Therefore, it is more reasonable to attribute the observed decrease of Da entirely to the effect of specific interactions between the diffusing dyes and the humic content of gel. As far as no changes in tortuosity are expected as a result of small HA addition to agarose hydrogel, the apparent equilibrium constant Kapp of the reversible sorption can be calculated from the corresponding value of Da (see Eq. (4)). As can be seen in Fig. 7, the value of Kapp for most of the studied systems is higher


Fig. 6. Experimental (points) and theoretical (lines) concentration profiles of Methylene Blue in 1 wt.% agarose gels with the addition of humic acids at 30 °C (the corresponding weight content of HA is shown above each graph).

than one, which means that the sorption equilibrium, described by the reaction mechanism proposed in Eq. (3), is shifted to the side of products. The immobilization of both solutes is strong enough to affect the overall transport crucially. An interesting difference between both dyes can be seen in Fig. 7. The results of the diffusion experiments indicate that while the sorption of Methylene Blue is strongly suppressed by increasing temperature, no distinct temperature effect was observed on the sorption of Rhodamine 6G. The temperature dependence observed for Methylene Blue is in contradiction with the results of diffusion cells experiments, where the values of Kapp, calculated indirectly from the breakthrough times, indicated the opposite – the increase of Kapp with the temperature. This discrepancy in the determination of the exo- versus endo-thermic character of the HA-MB interactions deserves further investigation in the follow-up experiments, possibly by means of a specialized method for the determination of the heat of reaction (e.g. by isothermal calorimetry). Fig. 8 illustrates the effect of HA on the partitioning of the dyes. It can be seen, that the addition of HA rather suppresses the partitioning of the free solute as compared with respective agarose gel without HA (except for the diffusion of Methylene Blue in hydrogels with 0.002 wt.% HA, where the higher value of U was determined at 40 °C and 50 °C). This implies that the effect of specific solute binding on HA over dominates the attraction of the free solute by Donnan potential of gel. While the fall in U with the weight content of HA is gradual for Methylene Blue, in the case of Rhodamine 6G, all tested additions of HA led to almost the same reduction in U. The differences between both dyes in their temperaturedependent partitioning resemble the above-mentioned depen-

47

dences of Kapp. The increase in temperature from 30 °C to 40 °C resulted in noticeable increase in the partition coefficient of Methylene Blue in agarose/HA gels. Interestingly, this trend was not kept when the temperature was further increased from 40 °C to 50 °C. For the partitioning of Rhodamine 6G, the influence of the temperature was not so important. As was already mentioned, the non-stationary diffusion experiments allow more reasonable investigation of the partitioning phenomena than the steady-state experiments in diffusion cells. Nevertheless, when the partitioning of solute which interacts specifically with the solid content of gel is described using the diffusion model introduced in Section 4, one should bear in mind several issues which may complicate the assessment of accurate values of U. Maybe the most critical problem is the experimental differentiation of free and bound form of the solute. Various analytical techniques can specifically quantify the concentration of the respective fraction. In the presented experiments, we assume that the introduced spectrophotometric technique provides the total concentration – i.e. the sum of both forms – at different positions of gel. Of course, the visible spectrum of free and bound dye will differ. We tried to overcome this complication by evaluating the spectra using simple calibration technique based on the measurement of the visible spectra of reference samples with known total concentration of the dye, added to the agarose mixture prior to its gelation. This approach is based on the expectation that the distribution of the solute between free and bound forms is the same regardless of whether the solute is incorporated in gel during the preparation or is transported to the already gelatinized sample. The experimental verification of this expectation is problematic, but the utilization of a fractional extraction method like those applied in the study of metal transport in hydrogels made from coagulated humic acids [14] may offer an interesting experimental option for the follow-up work. Anyway, it was found that the absorbance of either Methylene Blue or Rhodamine 6G at the characteristic wavelengths, after the subtraction of the background spectrum of respective hydrogel (the gel free of the dyes), is directly proportional to the total amount of the dye added to the gelling mixture. This zero-intercept linear trend was confirmed for all tested hydrogels, only the slope of the line differed with altered content of agarose and HA in gel and with the different inner pH and ionic strength (results of the later will be discussed in Section 5.3). It is worth mentioning that the linear character of this dependence reduces the experimental problems like inappropriate calibration just to the determination of the nominal value of the solute concentration (and hence the partitioning coefficient U), but the shape of the concentration profile (and consequently the calculated Da) is not affected. Another crucial point of the method is represented by the selection of an appropriate diffusion model. The model used in this work presumes constant concentration of the solute at the solution/gel interface. To verify the correctness of the presumption, the decrease in total amount of the dye in the source solution

Fig. 7. Apparent equilibrium constants for the diffusion of Methylene Blue (left) and Rhodamine 6G (right) in 1 wt.% agarose hydrogels with different weight content of HA at 30 °C (s), 40 °C (}) and 50 °C (4).

48


Fig. 8. Partition coefficients for the diffusion of Methylene Blue (left) and Rhodamine 6G (right) in 1 wt.% agarose hydrogels with different weight content of HA at 30 °C (s), 40 °C (}) and 50 °C (D).

Fig. 9. Apparent equilibrium constants for the diffusion of Methylene Blue (left) and Rhodamine 6G (right) in 1 wt.% agarose hydrogels with 0.01 wt.% of HA at various pH values and ionic strengths at 30 °C.

was determined after the diffusion experiments. It was found that in none of the experiments (including those discussed in Section 5.3) the decrease was higher than 5 rel.%, which together with continuous agitation of the solution guarantees the constant concentration of the dye at the solution side of the boundary during the whole diffusion experiment. Anyway, as was indicated by some determined concentration profiles in gels (see Figs. 1 and 6) the boundary concentration of the solute in some gels seems to vary somewhat with the time. Two possible explanations of the timedependent solute concentration at the boundary can be proposed. First, the enhanced uptake of the solute from solution, caused by its partitioning at the interface, may lead to the local decrease in the solution concentration near the boundary even when the solution is continuously stirred. Second, partitioning of the solute can vary in time in contradiction with the model. This can happen e.g. as a result of changing Donnan potential of the gel as the charged functional groups in the gel are gradually blocked by the specific interactions with the solute. Nevertheless, any quest to include the time-variability of the boundary concentration in the model would result in severely complex mathematical apparatus, inconvenient for the straightforward data evaluation. A final question concerns the selected sorption mechanism, included in the model and characterized by Eqs. (2) and (3). This sorption mechanism (resulting in a linear sorption isotherm) represents a common approximation, routinely applied in diffusion studies in reactive porous media [17]. It is best applicable in the systems, where a high excess of reactive sites on the sorbent is assumed. This presumption is suitable for the systems with binding sites distributed homogenously in the whole volume (like in reactive hydrogels), unlike e.g. the sorption experiments in suspensions, where the sorption is restricted to the surface of solid sorbent particles. However, in the presented experiments, the presumption of the sufficient excess of reactive sites is questionable because of a very small content of the reactive component (HA) in gel. It should also be noted that any discrepancy between the model and the actual interaction mechanism will affect also the determined partition coefficient, because the value of Kapp is in-

volved in the calculation of U from the experimentally determined value of ctot, x = 0 (see Eq. (9)). More complex sorption isotherms can be taken into account when compiling the diffusion model. Nevertheless, their involvement inevitably results in the concentrationdependent value of apparent diffusion coefficient of the sorbing solute [45], which will significantly complicate any subsequent data processing. From this perspective, the linear sorption mechanism, utilized in this study, represents a reasonable approximation for the first insight into the specific HA-solute interactions. 5.3. Influence of pH and ionic strength If the interactions between cationic solutes and humic acids (rich in diverse negatively charged functional groups) were considered as the electrostatic attraction at the first approximation, we should expect important changes in the diffusion of the solutes with different experimental conditions such as pH or ionic strength. Therefore, the non-stationary diffusion experiments were repeated using the dye solutions and hydrogel samples with carefully adjusted values of pH and ionic strength. 1 wt.% agarose hydrogel with no addition of HA and with the highest tested addition (0.01 wt.% HA), respectively, were used in this section. In order to allow the subsequent processing of the data by the diffusion model presented in Section 4, it was necessary to obtain the values of free solution diffusion coefficients of both dyes in the buffer solutions. In Tables 1 and 2, the values of D0, determined by the means of the diffusion cells experiments, are shown. It can be seen, that the diffusivities of both dyes in the buffer solutions are slightly suppressed in comparison with their diffusive transport in water. This is not an unexpected finding – the decrease of Methylene Blue diffusivity in ternary mixtures with water and NaCl was thoroughly explained [37]. Methylene Blue and Rhodamine 6G are planar molecules which can bear positive charge. For such solutes, the molecular aggregation to dimers, trimers or larger aggregates will significantly affect the solute’s diffusivity in a solution. The aggregation of Methylene Blue was confirmed spectrophotometrically during the diffusion experiment (dimers of Methylene Blue


49

Fig. 10. Partition coefficients for the diffusion of Methylene Blue (left) and Rhodamine 6G (right) in 1 wt.% agarose hydrogels with 0.01 wt.% of HA at various pH values and ionic strengths at 30 °C.

absorb strongly at 605 nm while monomers at 665 nm [46]). When the repulsive electrostatic forces between the like charges of the solute’s molecules are shielded by higher ionic strength, the aggregation is supported and the apparent size of the diffusing aggregate increases. The self-aggregation of Methylene Blue, Rhodamine 6G and also some other dyes was thoroughly studied mainly by Mukerjee in late 1960s (see e.g. [47,48]) or by others more recently [40,49]. Surprisingly, at pH = 7 and at high ionic strength, Methylene Blue shows even higher diffusivity than in water. This finding is difficult to explain merely on the basis of diffusion cells data and deserves a detailed investigation in the future work. The main aim of this experimental part was to assess the influence of pH and ionic strength on the specific interactions between diffusing dyes and humic acids. The sorption of cationic dyes – and of the Methylene Blue in particular – on humics and humic-rich materials was subjected to the vast concern in last decades, as was reviewed in our last paper [16]. The effects of pH and low molecular electrolytes were investigated thoroughly. Although the increase in pH usually enhances the sorption of Methylene Blue on the surface of other acidic environmental sorbents like clay [50] or silt [51], the sorption of MB on some humate-based sorbents was found to be only slightly pH-dependent [28,29]. The results of the non-stationary diffusion experiments, presented here, showed even more surprising finding – the immobilizing power of humic acids for both tested cationic dyes decreased with increasing pH, as is characterized by decreasing value of Kapp in Fig. 9. This result indicates that the dominating interactions in the systems are not necessarily those of the electrostatic origin. Apart from the usually emphasized dissociable groups (carboxylic and phenolic), humic acids possess plenty of other structural units (e.g. aromatic rings, aliphatic alcohols) which offer the suitable binding sites for complex organic molecules like the used dyes. For example, the sorption of polycyclic aromatic hydrocarbons to aromatic residues in the structure of humic acids by a hydrophobic stacking is well known [52] and was found to be crucial for the biodegradation of these harmful species (e.g. [53]). Such interactions themselves are less sensitive to a shift in pH or ionic strength than the electrostatic ones; nevertheless, some pH-dependent changes in the conformation of humic acids might play an important role for example by affecting the spatial availability of the hydrophobic sites to the diffusing solute. Furthermore, the aggregation of the dyes should be taken into account yet again. The dimerization of Methylene Blue at the pH = 11 was confirmed from significant change in UV–VIS spectra of the dye in gel. In Fig. 9, it can be seen that only at this pH, the increase in the buffer strength resulted in the enhancement of sorption of MB in gel. Higher ionic strength of the solution is known to enhance the dimerization of MB [54]. Therefore, the results in Fig. 9 indicate that, at the pH = 11, aggregated MB is bound to humic acids preferentially and the increase in aggregation

(caused e.g. by higher ionic strength) may support this binding. In the case of Rhodamine 6G, the enhancement in the Kapp by increased ionic strength was found at all pH values. The aggregation of this dye seems to play even more important role, as can be deduced also from the comparison of the results shown in Figs. 7 and 9. It can be seen that while the value of Kapp for Methylene Blue is significantly lower in buffered hydrogels as compared to unbuffered ones (at 30 °C, the value of Kapp in 0.01 wt.% HA hydrogels without the adjustment of pH was as high as 10), for Rhodamine 6G at the pH = 3 and 7, comparable values of Kapp were determined in unbuffered gel (Kapp = 2.8) and in that with the use of 10 mM buffers (3.0 and 2.5 at the pH = 3 and 7, respectively) and even higher values Kapp were obtained with 200 mM buffers. Only at the pH = 11, the sorption of Rhodamine 6G on humic acids was suppressed, as indicated by the values of Kapp lower than 1. As can be seen in Fig. 10, the effect of pH and ionic strength on the partition coefficient U is even more complex and hardly explainable. Again, Methylene Blue behaves extraordinarily at the pH = 11. While at other pH values, both the ionic strength and the HA content elevate the partitioning of the free solute, the effect of ionic strength at the pH = 11 is opposite. The explanation of this finding may be found in the aggregation behavior of the dye once again. The same holds also for Rhodamine 6G. Both, the sorption of Rhodamine 6G in gel, as well as the partitioning of its free fraction are suppressed at the pH = 11. The partitioning behavior of Rhodamine at the pH = 3 and 7 is so incomprehensible that it should be further addressed in a future work. The above discussed variation in the diffusion and partitioning characteristics of gels at different pH and ionic strength cannot be attributed to the changes in the structural and textural properties, because all tested gels show very similar viscoelastic properties (see Supporting Info). 6. Conclusions The results of the non-stationary diffusion experiments, presented in the paper, clearly confirmed the crucial influence of the presence of humic acids in a system on the molecular transport of cationic solutes. Outstanding sorption ability of humic acids results in the strong decrease in mobility of the solutes, more pronounced for the systems with higher content of humic acids. As was indicated by the experiments, performed at various pH values and ionic strengths, the interaction between the humic content and the oppositely charged organic dyes are more complex than expected and should not be considered as just simple electrostatic attraction. Apart from the immobilizing effects of humic acids, one famous feature of agarose hydrogels – the considerable partitioning of low-molecular cations in gels – was confirmed once again. The diffusion technique, introduced in the presented experiments, represent the next step in the development of a thorough diffusion methodology, applicable universally in the study on reac-

50


tivity and barrier ability of reactive and functional polymers of a biological, environmental or industrial concern. The non-stationary diffusion experiments complement the previously used method of diffusion cells reasonably. While the experiments in diffusion cells focus on the steady-state stage of the diffusion process and illustrate primarily the barrier properties of a material after its penetration by the solute, the transient stage of the process is described by the non-stationary experiments more elaborately, enabling the further insight into particular effects which define the rate of the solute transport. Some of these essential effects, like partitioning or specific interactions of the solute on diffusion movement, are observable in so illustrative way that the method should be appreciated also for educative purposes. Nevertheless, in the evaluation of the results from either the steady-state or non-stationary diffusion experiments, the selection of a suitable mathematical model and careful compliance with the corresponding experimental conditions represent the necessary requirement in order to obtain the data of the sufficient quality. As is discussed above, an extensive experimental work should follow to prove the validity of some assumptions applied in the utilized model – mainly the time-independent partitioning of the dyes at the solution/gel boundary and the simplified linear mechanism of the sorption process. Acknowledgements This work was supported by Czech Science Foundation, project P106/11/P697, and by the project ‘‘The Centre for Materials Research at Brno University of Technology, Faculty of Chemistry’’ No. CZ.1.05/2.1.00/01.0012 from ERDF. Appendix A. Supplementary material Supplementary data associated with this article can be found, in the online version, at http://dx.doi.org/10.1016/ j.reactfunctpolym.2013.12.002. References [1] IHSS What are Humic Substances? Official website of International Humic Substances Society. (2007) Accessed: August 2013. [2] M. Schnitzer, C.M. Monreal, Adv. Agron. 113 (2011) 139–213. [3] H.B. Bradl, J. Colloid. Interf. Sci. 277 (2004) 1–18. [4] X.L. Tan, M. Fang, et al., Molecules 15 (2010) 8431–8468. [5] B. Gevao, K.T. Semple, et al., Environ. Pollut. 108 (2000) 3–14.

[6] [7] [8] [9] [10] [11] [12] [13] [14] [15]

[16] [17] [18] [19] [20] [21] [22] [23] [24] [25] [26] [27] [28] [29] [30] [31] [32] [33] [34] [35] [36] [37] [38] [39] [40] [41] [42] [43] [44] [45] [46] [47] [48] [49] [50] [51] [52] [53] [54]

J. Tolls, Environ. Sci. Technol. 35 (2001) 3397–3406. C.N. Guppy, N.W. Menzies, et al., Aust. J. Soil Res. 43 (2005) 189–202. M. Havelcova, J. Mizera, et al., Chem. Listy 105 (2011) 913–917. M.M. Scherer, S. Richter, et al., Crit. Rev. Env. Sci. Technol. 30 (2000) 363–411. H.M. Selim, H. Zhang, J. Environ. Qual. 42 (2013) 640–653. P. Sedlácˇek, M. Klucˇáková, Geoderma 153 (2009) 11–17. P. Sedlácˇek, M. Klucˇáková, Collect. Czech. Chem. Commun. 74 (2009) 1323– 1340. M. Klucˇáková, M. Pekarˇ, Colloids Surfaces A 349 (2009) 1–3. M. Kalina, M. Klucˇáková, P. Sedlácˇek, Geoderma 207–208 (2013) 92–98. M. Klucˇáková, M. Kalina, P. Sedlácˇek, L. Grasset, J. Soil. Sediment (2013) in press (Available online: 26 June 2013), http://dx.doi.org/10.1007/s11368-0130730-2. P. Sedlácˇek, J. Smilek, M. Klucˇáková, React. Funct. Polym. 73 (2013) 1500– 1509. http://dx.doi.org/10.1016/j.reactfunctpolym.2013.07.008. C.D. Shackelford, S.D. Moore, Eng. Geol. 152 (2013) 133–147. M. García-Gutiérrez et al., J. Iber. Geol. 32 (2006) 37–54. B.T. Henry, J. Adler, et al., J. Pharm. Pharmacol. 44 (1992) 543–549. S.J. Gibbs, E.N. Lightfoot, et al., J. Phys. Chem. 96 (1992) 7458–7462. A.W. Wang, B.J. Costello, et al., Anal. Chem. 65 (1993) 1639–1642. E.N. Dunmire, A.M. Plenys, et al., J. Control. Release 57 (1999) 127–140. J. Ostergaard, E. Meng-Lund, et al., Pharm. Res. 27 (2010) 2614–2623. F.B. Ye, A. Yaghmur, et al., Eur. J. Pharm. Sci. 43 (2011) 236–243. F.B. Ye, S.W. Larsen, et al., Eur. J. Pharm. Sci. 46 (2012) 72–78. K. Samprovalaki, P.T. Robbins, et al., J. Food Eng. 110 (2012) 441–447. K. Samprovalaki, P.T. Robbins, et al., J. Food Eng. 111 (2012) 537–545. R.D. Guy, D.R. Narine, S. DeSilva, Chemistry 58 (1980) 547–554. P. Janoš, Environ. Sci. Technol. 37 (2003) 5792–5798. M. Golmohamadi, T.A. Davis, et al., J. Phys. Chem. A 116 (2012) 6505–6510. N. Fatin-Rouge, A. Milon, J. Buffle, R.R. Goulte, A. Tessier, Phys. Chem. B 107 (2003) 12126–12137. M. Golmohamadi, K.J. Wilkinson, Carbohyd. Polym. 94 (2013) 82–87. M. Klucˇáková, M. Pekarˇ, Colloids Surface A 252 (2005) 157–164. J. Peuravuori, P. Zˇbánková, K. Pihlaja, Fuel Process. Technol. 87 (2006) 829– 839. E.M. Johnson, D.A. Berk, et al., Biophys. J. 68 (1995) 1561–1568. S. Dumitriu, Polysaccharides: Structural Diversity and Functional Versatility, second edition., CRC Press, 2004. G.D. Leaist, Can. J. Chem. 66 (1988) 2452–2456. T. Hori, N. Kamon, et al., J. Soc. Dyers Colour. 103 (1987) 265–270. P.O. Gendron, F. Avaltroni, et al., J. Fluoresc. 18 (2008) 1093–1101. S. Dare-Doyen, D. Doizi, et al., J. Phys. Chem. B 107 (2003) 13803–13812. M.F. Lai, C.Y. Lii, Int. J. Biol. Macromol. 21 (1997) 123–130. A.N. Fernandes, C.A. Policiano, J. Mol. Struct. 982 (2010) 62–65. P. Lesny´, J. De Croos, M. Prádny´, J. Vacík, J. Michálek, S. Woerly, E. Syková, J. Chem. Neuroanat. 23 (2002) 243–247. L. Tao, C. Nicholson, J. Theor. Biol. 229 (2004) 59–68. N.F.E.I. Nestle, R. Kimmich, J. Phys. Chem. 100 (1996) 12569–12573. K. Bergmann, C.T. Okonski, J. Phys. Chem. 67 (1963) 2169–2177. A.K. Ghosh, P. Mukerjee, J. Am. Chem. Soc. 92 (1970) 6408–6412. A.K. Ghosh, P. Mukerjee, J. Am. Chem. Soc. 92 (1970) 6413–6415. R. Sariri, M.S. Zakerhamidi, et al., J. Mol. Liq. 115 (2004) 55–61. C.H. Weng, Y.F. Pan, J. Hazard. Mater. 144 (2007) 355–362. Y. Zaker, M.A. Hossain, T.S.A. Islam, Int. Res. J. Environ. Sci. 2 (2013) 1–7. B. Marschner, J. Plant Nutr. Soil Sci. 162 (1999) 1–14. K.E.C. Smith, M. Thullner, et al., Environ. Sci. Technol. 43 (2009) 7205–7211. J.B. Ghasemi, M. Miladi, J. Chin. Chem. Soc. – Taip. 56 (2009) 459–468.

Příloha č. 3


SMILEK, J., SEDLÁČEK, P., KALINA, M., KLUČÁKOVÁ, M. On the role of humic acids' carboxyl groups in the binding of charged organic compounds. CHEMOSPHERE. 2015. 138(11). s. 503 - 510. ISSN 0045-6535. DOI:10.1016/j.chemosphere.2015.06.093 IF = 3,854.

Chemosphere 138 (2015) 503–510


Chemosphere journal homepage: www.elsevier.com/locate/chemosphere

On the role of humic acids’ carboxyl groups in the binding of charged organic compounds Jirˇí Smilek ⇑,1, Petr Sedlácˇek 1, Michal Kalina, Martina Klucˇáková Brno University of Technology, Faculty of Chemistry, Materials Research Centre CZ.1.05/2.1.00/01.0012, Purkynˇova 464/118, 612 00 Brno, Czech Republic

h i g h l i g h t s HAs–organic dyes interactions were studied by diffusion and sorption experiments. The interactions strongly affect mobility of the dyes in humics-containing systems. The interactions are not constrained by the presence of –COOH in structure of HAs.

a r t i c l e

i n f o

Article history: Received 19 February 2015 Received in revised form 26 June 2015 Accepted 30 June 2015

Keywords: Reactivity Polyelectrolytes Diffusion Humic acids Hydrogel

a b s t r a c t Interactions of humic acids (HAs) with two cationic dyes (methylene blue and rhodamine 6G) were studied using a unique combination of diffusion and partitioning studies in HAs, containing hydrogels and batch sorption experiments. In order to investigate the involvement of carboxyl groups of HAs in these interactions, all experiments were performed for both, the original lignite HAs and HAs with selectively methylated carboxyls. The results of the diffusion experiments confirm that the interactions between the solute and humic substances have a strong impact on the rate of diffusion process. Surprisingly, the effect is almost equally approved for original and methylated HAs. On the other hand, the results of batch sorption experiments show strong improvement of the sorption capacity (methylated HAs), which is explained by changed morphology of alkylated HAs. The comparison of the results of diffusion and adsorption experiments shows that the diffusion experiments simulate the transport of solutes in natural humics containing environment more reasonably. Ó 2015 Elsevier Ltd. All rights reserved.

1. Introduction Humic acids (HAs) represent the key constituent of natural organic matter in the sense of the pollutant binding. In the present view, which have replaced the traditional macromolecular concept of HAs, these substances are postulated as large self-assemblies of relatively small and heterogeneous molecules, stabilized mainly by weak dispersive forces, e.g. van der Waals, p–p and CH-p (Piccolo, 2002; Sutton and Sposito, 2005). Resulting complex supramolecular structure with great diversity of functional groups results in universal binding ability of humic acids. The irreplaceable role of polar structural moieties (mainly carboxyls and alcoholic/phenolic hydroxyls) in binding the hydrophilic solutes (Liu and Gonzalez, 2000) and surfaces (Guan et al., 2006) has been widely reported. On the other hand, the sorption capacity for non-polar compounds such as polycyclic aromatic hydrocarbons has been for correlated ⇑ Corresponding author. 1

E-mail address: [email protected] (J. Smilek). These authors contributed equally to this work.

http://dx.doi.org/10.1016/j.chemosphere.2015.06.093 0045-6535/Ó 2015 Elsevier Ltd. All rights reserved.

mainly with the content of hydrophobic moieties i.e. with the aromaticity of humic matter (De Paolis and Kukkonen, 1997) or with the content of aliphatic carbon groups (Ran et al., 2007). Recently, a great deal of attention has been focused also on description of the molecular mechanism of HAs’ interactions with low-molecular compounds of amphiphillic (combined hydrophilic and hydrophobic) nature e.g. with charged aromatic solutes. This represents a crucial aspect of the environmental role of humic substances because such combined molecular structure is common for numerous compounds of considerable ecological importance like pesticides, growth retardants, and industrial waste materials (e.g. surfactants, disinfectants or dyes). Senesi et al. (1995) applied a combination of spectroscopic methods to investigate the adsorption mechanism of N-rich atrazine and bipyridylium herbicides with humic acids. The results demonstrated the interactions of diverse origin (ionic, charge-transfer and hydrogen bonds) between the herbicide and suitable complementary groups of HAs. Iglesias et al. (2009) investigated the effect of pH and ionic strength on the binding of basic (paraquat) and acidic (MCPA) pesticides by soil fulvic and humic acids. They applied a simple

504

J. Smilek et al. / Chemosphere 138 (2015) 503–510

electrostatic model in the description of these interactions providing hereby an excellent reproduction of the experimental isotherms. Similarly, binding affinities of charged organic dyes (Janos, 2003), ionizable pharmaceuticals (Maszkowska et al., 2014) or polar aromatic compounds (Liu et al., 2008; Shi et al., 2010) for either whole soils or isolated HAs has been determined experimentally. Generally, the works mentioned above are confined to describing the sorption kinetics and the equilibrium in the systems where a solute binds to HAs in the form of suspension of solid particles. This approach, although widely accepted, provides only limited information on the effect of studied interactions on the mobility of solutes in real environments. More reasonable experimental approach was proposed in the works of Goss, who designed and optimized a HPLC system for comprehensive sorption studies on soils and its constituents (see e.g. Droge and Goss, 2013). In our recent works (Sedlacek and Klucakova, 2009a,b; Klucakova and Pekar, 2009), we have introduced the laboratory diffusion experiments as an alternative methodology, which provides direct experimental tracking of a manifestation of intermolecular interactions in altered mobility of the solutes in model humic matrices. Humic-based hydrogels were proposed as a diffusion medium which reasonably corresponds to the natural form of humic substances and facilitates the design of the diffusion experiments at the same time. The interactions between diffusing solute and humic acids, contained in hydrogels, result in changed partitioning of the solute between the solution and gel and also in a shift in diffusivity of the solute. Additionally, in our most recent experiments, we have also implemented selective esterification of HAs carboxyl groups in order to discuss their involvement in the solute (Cu2+ ions in particular) binding (Klucakova et al., 2014). The work presented here combines both original approaches in the study on interactions between lignite-derived humic acids and two representatives of amphiphilic compounds, charged organic dyes methylene blue (CI 52015) and rhodamine 6G (CI 45160). The previously declared benefits of the diffusion-tracking methodology are verified via the comparison of diffusion and batch-sorption experiments. Two complementary types of diffusion experiments were performed in order to cover the transport dynamics in the systems as comprehensively as possible: the through-diffusion experiments in the diffusion cells and the in-diffusion experiments. Furthermore, an involvement of carboxylic groups of humics in studied interactions is discussed on the basis of comparison of the behavior of raw humic acids with those with carboxyl groups masked by means of selective methylation with TMS-diazomethane.

2. Materials and methods 2.1. Chemicals Agarose (routine use class, <10 wt.% moisture content), methylene blue hydrate (MB, CI basic blue 9, dye content, P95 wt.%) and rhodamine 6G (R6G, CI Basic red 1, dye content, P95 wt.%) were purchased from Sigma–Aldrich and used without further purification. Humic acids were isolated by alkaline extraction from South-Moravian lignite (Klucakova and Pekar, 2005). The details on the chemical structure of both, the original lignite matrix and isolated lignite humic acids (LHAs) can be found in previously published papers (Peuravuori et al., 2006). Methylated humic acids (MHAs) were prepared from LHAs using trimethylsilyldiazomethan as a methylation agent and the alkylation procedure described in (Klucakova et al., 2014). In the same work, complete and selective esterification of carboxylic groups was evidenced

by means of acid-base titrations and chemical and structural analyses. 2.2. Preparation of hydrogels All hydrogels, utilized in subsequent diffusion experiments, were prepared via the method of thermoreversible gelation of aqueous solution of agarose described in our previous works (Sedlacek et al., 2013, 2014). Blank agarose hydrogel (without the addition of HAs) gelatinized from the 1 wt.% solution of agarose in water, while agarose/HAs gels did from the solution of both agarose (1 wt.%) and HAs (LHAs or MHAs, dry concentration of HAs: 0.002 wt.%, 0.005 wt.% and 0.010 wt.%). For the diffusion cells experiments, the cylindrical gel samples (40 mm in diameter, 5 mm in thickness) were fixed in the supporting plastic ring. The samples for non-stationary diffusion were prepared directly in PMMA spectrophotometric cuvettes (inner dimensions: 10 10 45 mm) and for equilibrium partitioning experiments in small glass tubes (inner diameter 10 mm, thickness 10 mm). 2.3. Diffusion experiments The diffusion studies presented in this paper were divided into three separate experimental sections, steady-state throughdiffusion experiments in the diffusion cells, non-stationary in-diffusion experiments and equilibrium partitioning experiments. In the first section, the diffusion of MB and R6G through the agarose or agarose/HAs gels was studied in the water-jacketed side-by-side diffusion cell. This through-diffusion technique gives the basic information on both of the two dissimilar steps of the diffusion process which take place when a solute diffuses through a studied medium, i.e. the transient stage (before the solute breaks through the medium) and the steady-state stage (after the breaking-through). In general, any interactions between diffusing solute and penetrated medium have an impact on both stages of the transport process. While the former stage is influenced directly because binding of the solute will indispensably decrease the rate of its passing through the medium, an indirect effect on the later stage is caused by changed concentration gradient along the gel. The gradient is changed by both, already bound amount of the solute and also all changes in its solution–gel partitioning. The fundamental experimental data, which characterize respective stages of the diffusion process, are the break-through time (alternatively called the lag time) and the steady-state diffusion flux of the solute through the sample. They are determined from fitting o the linear part of the break-through curves (see Fig. 1), where the break-through time (tBT) is calculated from the x-axis intercept and the steady-state diffusion flux (Jd) from the slope of the regression. The diffusion cells were purchased from Permegear Inc. The schematic diagram of the diffusion apparatus including the most important dimensions was published in (Sedlacek et al., 2013) and is provided in Supplementary Materials (Fig. S1). A circulating water bath was used in order to maintain the experiments at 25 °C. Continuous stirring of solutions in the donor and acceptor compartments at constant rate (250 RPM) was arranged by magnetic stirrer. Aqueous solution of dye (MB or R6G, concentration: 10 g m3) was used as a source of diffusing solute and the VIS absorption spectra of the acceptor solution were continuously collected. All experiments were performed in duplicates. The non-stationary in-diffusion experiments with hydrogels were performed as follows: the hydrogel samples in the cuvettes were immersed in horizontal positions in 10 g m3 aqueous solution of respective dye (MB or R6G). Four cuvettes were placed simultaneously in a single container filled with 250 cm3 of the dye solution, one cuvette for each weight content of HAs in gel


505

the respective dye solution (MB or R6G, concentration range 25– 150 g m3) in closed vessel and the samples were continuously rotated end-over-end 40 RPM for 72 h. Adsorbed amount of dye was calculated from UV–VIS spectra of the initial and final solutions. For all spectrophotometric analyses, the absorbances at 665 nm and 525 nm were evaluated for MB and R6G, respectively.

3. Results and discussion 3.1. Diffusion experiments

Fig. 1. Break-through curves from the diffusion cell experiments. The curves show the concentration of MB in acceptor cell as a function of time for the diffusion through 1 wt.% agarose gel with 0 wt.% HAs (s), 0.01 wt.% MHAs (+) and 0.01 wt.% LHAs ().

(0 wt.%, 0.002 wt.%, 0.005 wt.% and 0.010 wt.%, respectively). The dye solution was stirred continuously by the magnetic stirrer (250 RPM). Subsequently the dye was left to diffuse from the solution to the gel samples through the square opening of a cuvette. Each experiment was duplicated. In selected time intervals, the cuvettes were taken out of the solution and the UV–VIS spectra were measured at various distances from the opening of the cuvette on Varian Cary 50 UV–VIS spectrophotometer equipped with the special accessory providing controlled fine vertical movement of the cuvette in the spectrophotometer. From collected spectra, the concentration of dye was determined at different positions in gels. The concentration can be quantified via fitting the experimental profiles by an appropriate theoretical model. According to this model, total solute concentration csolute at the distance x in gel follows the equation:

pffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffi csolute ¼ cb;solute erfc x= 4Dsolute t

ð1Þ

where cb,solute is the solute concentration at the gel/solution boundary (from the side of hydrogel if there is a step change in the concentration at the boundary) and Dsolute is the apparent diffusion coefficient of the solute in gel (for detailed definition and explanation of different forms of diffusion coefficients, see e.g. (Shackelford and Moore, 2013). The exact way, in which the Dsolute implicates the effects of specific interactions between the solute and the solid content of gel, is discussed in (Sedlacek et al., 2014). Finally, the equilibrium partitioning experiments were performed as follows: each of the cylindrical gel samples (10 mm in diameter, 10 mm in length), filled in supporting glass tubes, were placed separately in 10 cm3 of the dye solution (10 g m3). The gel samples were kept in the solutions for 7 days in order to reach the equilibrium amount of absorbed dye. Then the samples were taken out, placed in 10 cm3 of water for another 7 days. Finally, the samples were taken out and they were placed in 10 cm3 of 1 M HCl for the final 7 days. UV–VIS spectra of the initial and equilibrium dye solutions as well as the water and HCl extracts were measured and the amount of dye absorbed in gel, and further released to water and extracted by HCl were calculated from the mass balance of dye. 2.4. Adsorption study Simple batch adsorption experiment was also involved in this study. 50 mg of solid HAs (MHAs or LHAs) were put in 50 cm3 of

The results of all diffusion experiments are summarized in Tables 1 and 2. In general, these results confirmed that positively charged dyes interact strongly with humic acids. From the results of through-diffusion experiments, it is evident that the value of the break-through time increased with the content of HAs in gel which manifests how the binding to the humic content of gel decelerates the penetration of dye through the gel sample. While the penetration of MB through the sample of 1 wt.% agarose gel took about 4 h, more than 14 h were needed for the same gel containing 0.01 wt.% LHAs., the break-through time decreased only partially (to about 11 h in average) when the same amount of esterified humic acids (MHAs) was incorporated in the agarose gel. The diffusion of R6G shows practically the same dependency on the content of LHAs and MHAs, respectively. This finding is contradictory to the assumption that the interactions between HAs and positively charged organic dyes are primarily caused by the electrostatic attraction of carboxyl groups with oppositely charged ionic groups. Instead, it points to the fact that the actual involvement of other structural moieties of the HAs molecule in these interactions is much more important than generally accepted. On the other hand, this conclusion is in agreement i.a. with the recent work of Maszkowska et al. (2014) who performed thermodynamic calculations for sorption of model pharmaceutical compounds onto soil. The results of this work indicate that even for organic cations, other forces (weaker than ion-exchange) may affect the sorption process to a great extent. Furthemore, from the comparison of more than 1000 natural organic matter (NOM)/air partitioning coefficients covering polar and nonpolar organic compounds measured in 10 different humic and fulvic acids, Niederer concluded that in their sorption characteristics, diverse NOM samples differ in the number of available sorption sites per mass rather than in the chemical characteristics of these sites. Therefore, even NOM samples with much different content of polar binding sites may show similar sorption affinities toward polar solutes (Niederer et al., 2007). Similar deduction can be derived from the dependence of the steady-state diffusion flux on the concentration of LHAs and MHAs, respectively. Here, the attractive interactions between the solute and the HAs content of penetrated sample are represented by decreasing steady-state diffusion flux in the case of hydrogels with HAs in comparison with blank agarose gels. Because our previous work (Sedlacek et al., 2013) confirmed that no significant changes in the hydrogel structure emerge from the addition of HAs, we can assume that the differences in the diffusion fluxes are primarily caused by changed solute concentration gradient between the pair of diffusion cells separated by hydrogel sample. There are two possible explanations of the shift in the concentration gradient. Above all, the bound amount of solute inside the gel sample decreases its actual concentration in the donor diffusion cell at the moment of breaking-through into the acceptor cell. Apart from this, the partitioning of free solute between gel and solution is sensitive to any changes in physico-chemical properties of gel, mainly in its Donnan potential. Adding a polyelectrolyte component (such as HAs) to the gel matrix will definitely

506


Table 1 Results of the diffusion and partitioning experiments for the diffusion of methylene blue in 1 wt.% agarose hydrogels with different weight content of HAs.a wHAs (wt.%)

HAs

Steady-state diffusion 9

2

Jd,MB 10 (mol m 0% 0.002% 0.005% 0.010%

– LHAs MHAs LHAs MHAs LHAs MHAs

s

Transient diffusion 1

)

4.54 ± 0.30 3.45 ± 0.23 3.61 ± 0.30 1.76 ± 0.32 2.38 ± 0.31 1.54 ± 0.18 1.78 ± 0.18

Partitioning experiment

tBT,MB (h)

DMB,HAs/DMB,0

cb,MB,HAs/cb,MB,0

c1,MB,HAs/c1,MB,0

4.03 ± 0.11 5.92 ± 0.32 5.87 ± 0.05 9.02 ± 1.16 8.20 ± 0.74 14.54 ± 0.71 11.29 ± 1.80

– 0.33 ± 0.04 0.36 ± 0.03 0.16 ± 0.01 0.26 ± 0.02 0.09 ± 0.02 0.23 ± 0.02

– 3.21 ± 0.44 2.96 ± 0.47 4.66 ± 0.70 3.97 ± 0.86 4.45 ± 1.23 3.44 ± 1.08

– 0.82 ± 0.26 0.89 ± 0.23 1.05 ± 0.26 0.96 ± 0.26 1.44 ± 0.27 1.20 ± 0.24

a Jd,MB: steady-state diffusion flux (diffusion of MB through hydrogels with various content of HAs). tBT,MB: break-through time (diffusion of MB through hydrogels with various content of HAs). DMB: apparent diffusion coefficient of MB in the corresponding gel (agarose hydrogels with and without HAs are referenced using respective subscripts ‘‘HAs’’ and ‘‘0’’). cb,MB: concentration of MB at the gel/solution boundary (agarose hydrogels with and without HAs are referenced using respective subscripts ‘‘HAs’’ and ‘‘0’’). c1,MB: equilibrium concentration of MB in gel (agarose hydrogels with and without HAs are referenced using respective subscripts ‘‘HAs’’ and ‘‘0’’).

Table 2 Results of the diffusion and partitioning experiments for the diffusion of Rhodamine R6G in 1 wt.% agarose hydrogels with different weight content of HAsa. wHAs (wt.%)

HAs

Steady-state diffusion 9

2

Jd,R6G 10 (mol m 0% 0.002% 0.005% 0.010%

– LHAs MHAs LHAs MHAs LHAs MHAs

2.67 ± 0.04 1.29 ± 0.10 1.60 ± 0.20 1.25 ± 0.07 1.29 ± 0.31 1.05 ± 0.01 1.33 ± 0.16

s

Transient diffusion 1

)

Partitioning experiment

tBT,R6G (h)

DR6G,HAs/DR6G,0

cb,R6G,HAs/cb,R6G,0

c1,R6G,HAs/c1,R6G,0

4.84 ± 0.20 6.69 ± 0.20 5.51 ± 0.13 8.30 ± 0.03 7.71 ± 0.18 13.93 ± 0.10 9.54 ± 0.46

– 0.36 ± 0.02 0.47 ± 0.01 0.28 ± 0.01 0.40 ± 0.03 0.21 ± 0.01 0.37 ± 0.05

– 1.78 ± 0.23 1.69 ± 0.27 2.82 ± 0.41 2.41 ± 0.36 4.05 ± 0.48 3.24 ± 0.57

– 0.91 ± 0.23 0.81 ± 0.22 1.07 ± 0.24 1.00 ± 0.22 1.28 ± 0.33 1.10 ± 0.27

a Jd,R6G: steady-state diffusion flux (diffusion of R6G through hydrogels with various content of HAs). tBT,R6G: break-through time (diffusion of R6G through hydrogels with various content of HAs). DR6G: apparent diffusion coefficient of R6G in the corresponding gel (agarose hydrogels with and without HAs are referenced using respective subscripts ‘‘HAs’’ and ‘‘0’’). cb,R6G: concentration of R6G at the gel/solution boundary (agarose hydrogels with and without HAs are referenced using respective subscripts ‘‘HAs’’ and ‘‘0’’): c1,R6G: equilibrium concentration of R6G in gel (agarose hydrogels with and without HAs are referenced using respective subscripts ‘‘HAs’’ and ‘‘0’’).

affect these properties of gel. Unfortunately, the method of diffusion cell is not suitable for a reasonable experimental tracking of these effects. The interactions directly affect the transient step of the solute diffusion. In order to investigate this phase of the transport process more deeply, the non-stationary in-diffusion experiments were carried out. The changes in concentration of the diffusing solute inside the gel sample are continuously monitored during these experiments. The main advantage, as compared to the diffusion cells experiment, is better ability to directly distinguish the relative impacts of the solute partitioning and the solute binding to the solid content, which proceed in gel simultaneously. The prime experimental outcome is represented by the concentration profile of the diffusing solute in gel such as those presented in Fig. 2. This figure clearly shows how the content of humic acids (LHAs) in gel affects the mobility of charged organic solute (MB). Two effects are illustrated by the changes in shape of the concentration profile. Although the diffusion proceeds from the same source solution, total concentration of the solute in gel near its boundary gets significantly higher at the presence of LHAs. In our previous work, we have demonstrated that this increase in overall solute concentration involved partly the fraction of solute bound to LHAs, partly the increased partition coefficient of free solute (Sedlacek et al., 2014). The other effect is manifested in obvious slowdown of solute penetration in gel. It is evident from Fig. 2, that the fall of the solute concentration with the distance from the gel boundary is much steeper in gels where HAs were added. A simplified idea, sufficient for the purposes of the discussion of current experimental results, is that the more intensive attractive interactions between the solute and the interior of gel, the lower the value of the diffusion coefficient. The results of regression of experimental concentration profiles are shown in Tables 1 and 2. Unlike the standard diffusion cells

Fig. 2. Concentration profiles of methylene blue in 1 wt.% agarose gels with 0 wt.% LHAs (s) and 0.01 wt.% LHAs () after 72 h of the in-diffusion experiment.

apparatus, the experimental arrangement for in-diffusion experiment is more susceptible for inevitable artifacts, such as random change in the solution temperature, and uneven stirring of the source solutions. Nevertheless, the undesirable effect of these experimental artifacts is minimized when the particular results of the transient diffusion experiments (diffusion coefficients, boundary concentrations) are given in the normalized form i.e. divided by the same parameter determined for the blank agarose hydrogels. The reason is that the solute diffuses into the blank (i.e. HAs-free) and HAs-containing gels simultaneously from the single source solution and under the identical experimental conditions. The relative diffusion coefficients shown in Table 1 indicate that even the smallest addition of HAs resulted in more than 50% reduction in the diffusivity of solute (both MB and R6G) as compared to


blank agarose hydrogel (Dsolute,HAs/Dsolute,0 < 0.5). This decrease can undoubtedly be attributed to the binding of the solute to HAs, contained in gel. Interestingly, similar effect is shown also for esterified humic acids. Actually, some differences in the effects of LHAs and MHAs can be seen; the decrease of the solute diffusivity in hydrogels with the addition of LHAs is higher to some extent than in MHAs-containing hydrogels. This finding is in contrast to our previously published experiments (Klucakova et al., 2014), where we studied the diffusion of Cu2+ in physically cross-linked humic hydrogels with different ratios of LHAs/MHAs content. There, we evidenced the decrease in apparent diffusivity of Cu2+ ions in gels with higher relative content of MHAs. Nevertheless, the effect was explained by specific influence of LHAs/MHAs ratio on the structure of gel. Similar structural effect is unlikely for the agarose/HAs hydrogels where the gel structure is practically independent on the HAs content in the studied range, as was evidenced by means of rheometry and SEM (not published). Nevertheless, the effect of esterification of carboxylic groups is, once again, less pronounced than expected. As was already indicated by the results of through-diffusion experiments, it seems that the majority of attractive interactions is not influenced by the transformation of HAs’ carboxyls into the non-dissociable form. Therefore, the common notion of cation binding to HAs preferentially by means of Coulomb attraction or proton-exchange interaction on dissociated or protonized carboxyl groups is not fully acceptable in the case of complex organic cations. This represents a significant original finding on the reactivity of HAs, which can be of the principal importance in explaining and predicting the fate of organic pollutants in nature. The involvement of structural moieties other than carboxyl groups in the binding of charged organic compounds has already been proposed e.g. by Zanini et al. (2006) who have confirmed strong and rather non-electrostatic binding of oxazine dye to humic acids. Nevertheless, the results of our experiments show that the participation of this kind of interactions is much more important than expected so far. Moreover, our results also directly demonstrate how the changed interaction influences the solute mobility in humics-containing systems. LHAs and MHAs behave in surprisingly similar way also regarding the above mentioned increase in the boundary concentration of the solute in the gel. Although a slightly lower concentration shift was determined for esterified humic acids, the overall partitioning effect is almost equal. These results can easily be translated into the terms of thermodynamics. Similar partitioning of the solute in LHAs and MHAs containing gels indicates that the chemical potential of humic acids is not substantially changed by blocking the carboxyl groups. These groups must hence contribute to the overall chemical potential of HAs much less than previously assumed. 3.2. Solute partitioning experiments The above discussed diffusion studies, give in addition to the fundamental information on the solute mobility also a basic survey of the partitioning phenomena, i.e. of distribution of the solute between the solution and hydrogel at the interface of these two phases. More specifically, they characterize the dynamic partitioning, i.e. the partitioning under the out-of-equilibrium circumstances. To obtain a complete view on the partitioning in the studied systems, the equilibrium absorption of the solute was investigated as well. In these experiments, the diffusion proceeded from the solution through both circular surfaces of small cylindrical hydrogel sample. The results of these experiments are shown in Tables 1 and 2. It can be seen, that unlike the boundary concentration in the course of dynamic experiments, the equilibrium concentration of the solute in gel is not affected considerably by the presence of either

507

LHAs or MHAs. The minor effect of HAs on the total solute concentration in gel at equilibrium is not as inconsistent with the results of dynamic diffusion experiments as it might seem at the first sight. For the in-diffusion experiments, the solute concentration at the boundary was expected to be time-independent in applied diffusion model. Nevertheless, it was found that in fact, it gradually decreased with time. Similar decrease of boundary concentration was also found and discussed in our previous work (Sedlacek et al., 2014). One reasonable explanation of the variable partitioning of solute between solution and gel could work on the presumption of the time-dependent free-to-bound solute concentration ratio in gel. To verify this hypothesis, we subjected the gel samples, with the equilibrium concentration of absorbed solute, to the sequential extraction by water and hydrochloric acid. These two leaching agents were chosen on the basis of our previous experience with fractional extraction of solutes according to the strength of binding to HAs (Kalina et al., 2013). We assume that water-extractable amount represents the fraction of freely mobile form, while the residual amount of solute (i.e. non-extractable even by HCl) is the most strongly bound to the solid content of hydrogel. Fig. 3 illustrates the equilibrium fractionation of absorbed solute in all studied gels according to the strength of binding in gel. The data reveal two interesting facts. First, the major portion of equilibrium content of the solute is represented by the most strongly bound fraction, which is surprisingly dominant also in the case of blank agarose hydrogel. This finding indicates the binding of solute to the agarose backbone which is relatively strong but at the same time the reaction rate is so low that its influence grows and becomes significant mainly at later (near equilibrium) stages of the diffusion process. These interactions probably also stand behind the well-known partitioning effects of dilute agarose hydrogels, discussed e.g. in Golmohamadi et al. (2012). Another interesting finding of the sequential extraction experiments is that the presence of HAs influences mainly the relative content of mobile (I) and less strongly bound (II) fractions. The water-extractable amount of solute decreases as a consequence of its binding to HAs while the amount of HCl-extractable form increases correspondingly. Similar distribution of absorbed solute was found also for hydrogels with the presence of esterified MHAs. The above mentioned general findings from the partitioning experiments are common to both tested solutes (MB and R6G). Some particular differences between the partitioning of the solutes can be found in Fig. 3, however, these are not significant concerning the data uncertainty (see error bars in Fig. 3). In general, these results show that the interactions with HAs are preserved also at the equilibrium. Nevertheless, their relative effect is markedly suppressed by an emergent binding of the solute to agarose chains (note that agarose is in a substantial excess over HAs in hydrogel).

3.3. Adsorption of the solutes on solid HAs In our recent works, we have proposed the diffusion experiments as more reasonable alternative to traditional sorption experiments. Therefore, another objective of present work was to search for a potential correlation between the immobilizing effects of HAs on tested solutes, as evidenced by the diffusion study, and their sorption performance, revealed by simple batch sorption study. It should be noted, that the performed experiments did not aim at exhaustive description of the adsorption of studied solutes on HAs which other authors have already dealt with (Crini, 2006). Therefore, just a basic experiment was performed where a solute (MB or R6G) was adsorbed on solid HAs particles from aqueous solutions with various initial concentrations.

508


Fig. 3. Distribution of the equilibrium content of the solute in hydrogels into three fractions according to the binding strength: water extractable (I), HCl-extractable (II) and residual (III).

The sorption experiment provided highly surprising results regarding the sorption performance of LHAs and MHAs, respectively. MHAs showed obviously higher ability to decolorize the solutions of either MB or R6G. The difference became more evident as the initial concentration of the solution increased. Dissimilar sorption behavior of LHAs and MHAs is clearly illustrated by the specific amounts of adsorbed solutes, shown in Fig. 4. For instance, while the mass of MB, absorbed on MHAs, increases almost linearly with the initial concentration of MB in the solution, the amount adsorbed on LHAs does not change significantly over a wide range of concentrations. This indicates that the sorption capacity of LHAs gets exhausted in more concentrated solutions where MHAs adsorb significantly higher amounts of the solute. Analogous enhancement of sorption capacity of humic acids as a result of esterification of carboxylic groups was already described by Andelkovic et al. (2010) for the adsorption of cadmium. When comparing results obtained for the two solutes involved in the study (MB and R6G), it is evident that both LHAs and MHAs show higher affinity for MB than for R6G. Furthermore, the non-linearity of the dependence of MHAs-bound amount of R6G on the initial concentration indicates that the corresponding binding sites in MHAs become depleted for the more concentrated solutions of R6G. These particular differences in adsorption behavior of MB and R6G probably result from dissimilarities in the molecular weight and the level of hydrophilicity of the two solutes (Li and Yalkowsky, 1994). In general, the results of the sorption experiment are in strong disagreement with the formerly discussed effects of LHAs and MHAs on the mobility of the same solutes in the hydrogel form, where the raw and esterified HAs showed only minor differences and slightly higher solute-immobilizing power was provided by LHAs. When discussing this discrepancy, it is necessary to take into account the fundamental distinctions between both experimental approaches. Above all, the crucial point is represented by the

different colloidal form of humic acids in the sorption and diffusion experiments. While the interpenetration of dissolved HAs in the agarose network provides a homogenous matrix where the HAs molecules are homogeneously distributed and fully accessible to the diffusing solute, the dispersion of solid HAs in the solute solution represents a heterogeneous system where the HAs, solute interactions are limited just to the surface of HAs particles and any changes in the textural and morphological properties of a sorbent will significantly affect the process. Therefore, we turned our attention to the surface characteristics of solid MHAs and LHAs particles in order to explain their unexpected differences in their adsorption behavior. The crucial experimental finding was obtained from the determination of the surface of particles in the aqueous dispersion. As determined by the gas-adsorption technique (Nova 2200, Quantachrome), MHAs have more than twice the specific surface area of LHAs (241 m2 g1 vs 109 m2 g1, while the distribution of particle sizes, determined by the light scattering method, was practically the same (see Fig. S2 in the Supplementary Materials). As revealed by scanning electron microscopy, the dissimilar surface area is caused by the different texture of LHAs and MHAs particles. The microphotographies of solid HAs particles at various magnifications (see Fig. S3 in Supplementary Materials) show greater microporosity of MHAs particles, whereas the surface of LHAs is obviously less rugged. The origin of this difference is not yet clear. It is highly probable, that the esterification of carboxylic groups will affect the association of the HAs molecules. Nevertheless, no important changes in the molecular size or shape of LHAs and MHAs were evidenced by the light scattering methods in the previous work (Klucakova et al., 2014). Apart from the interactions among HAs molecules themselves, the esterification will definitely influence also the way how these molecules interact with surrounding water, as the carboxylic groups are the most hydrophilic moieties in the structure of HAs. It is also well evidenced, that the


509

Fig. 4. Specific amount of MB (left) and R6G (right) adsorbed on solid LHAs (s) and MHAs (d) from aqueous solutions with different initial concentrations.

hydration level can strongly affect both the supramolecular structure (Schaumann and Bertmer, 2008) and the sorption performance of NOM (Graber et al., 2007). Perhaps, the surface of LHAs particles may be ‘smoothed’ by the presence of water molecules, strongly bound on the hydrophilic carboxyl or carboxylate groups. More strongly hydrated surface can consequently be less accessible for the binding of solutes by non-specific interactions (e.g. hydrophobic or van der Waals). Anyway, the hypothesis that enhanced sorption performance of methylated HAs is a consequence of changed hydration requires further experimental confirmation. To summarize, the comparison of the results of diffusion and adsorption experiments clearly shows that the diffusion experiments model the transport of solutes in natural humicscontaining environment much more reasonably. The interactions between flowing solute and humic substances have strong impact on the rate of diffusion process. Surprisingly, it was evidenced that these interactions do not involve carboxyl groups to such extent as commonly expected. It seems that, rather than a simple electrostatic attraction between oppositely charged compounds, the interactions between aromatic moieties in the molecular structure of the solute and humic substances play a major role. Nevertheless, a detailed study on these interactions is still needed. For this purpose, some advanced structural e.g. FTIR (Guan et al., 2006), or X-ray techniques (Manceau and Matynia, 2010) and thermal analysis techniques like ITC (Tan et al., 2009) represent the methods of choice as they have already been successfully utilized in revealing the exact mechanism of interactions between HAs and various compounds. Acknowledgements This work was supported by the project ‘‘Materials Research Centre at FCH BUT – Sustainability and Development’’ No. LO1211 of the Ministry of Education, Youth and Sports of the Czech Republic. Appendix A. Supplementary material Supplementary data associated with this article can be found, in the online version, at http://dx.doi.org/10.1016/j.chemosphere. 2015.06.093. References Andelkovic, T., Nikolic, R., Bojic, A., Andelkovic, D., Nikolic, G., 2010. Binding of cadmium to soil humic acid as a function of carboxyl group content. Maced. J. Chem. Chem. Eng. 29, 215–224. Crini, G., 2006. Non-conventional low-cost adsorbents for dye removal: a review. Bioresour. Technol. 97, 1061–1085.

De Paolis, F., Kukkonen, J., 1997. Binding of organic pollutants to humic and fulvic acids: influence of pH and the structure of humic material. Chemosphere 34, 1693–1704. Droge, S.T.J., Goss, K.U., 2013. Development and evaluation of a new sorption model for organic cations in soil: contributions from organic matter and clay minerals. Environ. Sci. Technol. 47, 14233–14241. Golmohamadi, M., Davis, T.A., Wilkinson, K.J., 2012. Diffusion and partitioning of cations in an agarose hydrogel. J. Phys. Chem. A 116, 6505–6510. Graber, E.R., Tsechansky, L., Borisover, M., 2007. Hydration-assisted sorption of a probe organic compound at different peat hydration levels: the link solvation model. Environ. Sci. Technol. 41, 547–554. Guan, X.H., Chen, G.H., Shang, C., 2006. Combining kinetic investigation with surface spectroscopic examination to study the role of aromatic carboxyl groups in NOM adsorption by aluminum hydroxide. J. Colloid. Interf. Sci. 301, 419–427. Iglesias, A., Lopez, R., Gondar, D., Antelo, J., Fiol, S., Arce, F., 2009. Effect of pH and ionic strength on the binding of paraquat and MCPA by soil fulvic and humic acids. Chemosphere 76, 107–113. Janos, P., 2003. Sorption of basic dyes onto iron humate. Environ. Sci. Technol. 37, 5792–5798. Kalina, M., Klucakova, M., Sedlacek, P., 2013. Utilization of fractional extraction for characterization of the interactions between humic acids and metals. Geoderma 207–208, 92–98. Klucakova, M., Pekar, M., 2005. Solubility and dissociation of lignitic humic acids in water suspension. Colloid. Surface. A 252, 157–164. Klucakova, M., Pekar, M., 2009. Transport of copper(II) ions in humic gels – new results from diffusion couple. Colloid. Surface. A 349, 96–101. Klucakova, M., Kalina, M., Sedlacek, P., Grasset, L., 2014. Reactivity and transport mapping of Cu(II) ions in humic hydrogels. J. Soil. Sediment. 14, 368–376. Li, A., Yalkowsky, S.H., 1994. Solubility of organic solutes in ethanol–water mixtures. J. Pharm. Sci. 83, 1735–1740. Liu, A., Gonzalez, R.D., 2000. Modeling adsorption of copper(II), cadmium(II) and lead(II) on purified humic acid. Langmuir 16, 3902–3909. Liu, P., Zhu, D., Zhang, H., Shi, X., Sun, H., Dang, F., 2008. Sorption of polar and nonpolar aromatic compounds to four surface soils of eastern China. Environ. Pollut. 156, 1053–1060. Manceau, A., Matynia, A., 2010. The nature of Cu bonding to natural organic matter. Geochim. Cosmochimica. Acta 74, 2556–2580. Maszkowska, J., Wagil, M., Mioduszewska, K., Kumirska, J., Stepnowski, P., BialkBielinska, A., 2014. Thermodynamic studies for adsorption of ionizable pharmaceuticals onto soil. Chemosphere 111, 568–574. Niederer, C., Schwarzenbach, R.P., Goss, K.U., 2007. Elucidating differences in the sorption properties of 10 humic and fulvic acids for polar and nonpolar organic chemicals. Environ. Sci. Technol. 41, 6711–6717. Peuravuori, J., Zbankova, P., Pihlaja, K., 2006. Aspects of structural features in lignite and lignite humic acids. Fuel Process. Technol. 87, 829–839. Piccolo, A., 2002. The supramolecular structure of humic substances. A novel understanding of humus chemistry and implications in soil science. Adv. Agron. 75, 57–134. Ran, Y., Sun, K., Yang, Y., Xing, B., Zeng, E., 2007. Strong sorption of phenanthrene by condensed organic matter in soils and sediments. Environ. Sci. Technol. 41, 3952–3958. Schaumann, G.E., Bertmer, M., 2008. Do water molecules bridge soil organic matter molecule segments? Eur. J. Soil. Sci. 59, 423–429. Sedlacek, P., Klucakova, M., 2009a. Diffusion experiments as a new approach to the evaluation of copper transport in humics-containing systems. Collect. Czech. Chem. C. 74, 1323–1340. Sedlacek, P., Klucakova, M., 2009b. Simple diffusion method applied in evaluation of metal transport in model humic matrices. Geoderma 153, 11–17. Sedlacek, P., Smilek, J., Klucakova, M., 2013. How the interactions with humic acids affect the mobility of ionic dyes in hydrogels – results from diffusion cells. React. Funct. Polym. 73, 1500–1509. Sedlacek, P., Smilek, J., Klucakova, M., 2014. How the interactions with humic acids affect the mobility of ionic dyes in hydrogels – 2. Non-stationary diffusion experiments. React. Funct. Polym. 75, 41–50.

510


Senesi, N., Dorazio, V., Miano, T.M., 1995. Adsorption mechanisms of s-triazine and bipyridylium herbicides on humic acids from hop field soils. Geoderma 66, 273– 283. Shackelford, C.D., Moore, S.M., 2013. Fickian diffusion of radionuclides for engineered containment barriers: diffusion coefficients, porosities, and complicating issues. Eng. Geol. 152, 133–147. Shi, X., Ji, L.L., Zhu, D., 2010. Investigating roles of organic and inorganic soil components in sorption of polar and nonpolar aromatic compounds. Environ. Pollut. 158, 319–324.

Sutton, R., Sposito, G., 2005. Molecular structure in soil humic substances: the new view. Environ. Sci. Technol. 39, 9009–9015. Tan, W.F., Koopal, L.K., Norde, W., 2009. Interaction between humic acid and lysozyme, studied by dynamic light scattering and isothermal titration calorimetry. Environ. Sci. Technol. 43, 591–596. Zanini, G.P., Avena, M.J., Fiol, S., Arce, F., 2006. Effects of pH and electrolyte concentration on the binding between a humic acid and an oxazine dye. Chemosphere 63, 430–443.

Příloha č. 4

Manuskript článku v impaktovaném časopise

SEDLÁČEK, P., SMILEK, J., LAŠTŮVKOVÁ, M., KALINA, M., KLUČÁKOVÁ, M. Hydrogels: invaluable experimental tool for demonstration of diffusion phenomena in chemical laboratory courses. Journal of Chemical Education. ISSN: 0021-9584. IF = 1,106

Submitted to the Journal of Chemical Education

This document is confidential and is proprietary to the American Chemical Society and its authors. Do not copy or disclose without written permission. If you have received this item in error, notify the sender and delete all copies.

Hydrogels: invaluable experimental tool for demonstration of diffusion phenomena in chemical laboratory courses

Journal: Manuscript ID Manuscript Type: Date Submitted by the Author: Complete List of Authors:

Keywords:

Journal of Chemical Education Draft Article n/a Sedlacek, Petr; Brno University of Technology, Faculty of Chemistry, Materials Research Centre Smilek, Jiri; Brno University of Technology, Faculty of Chemistry, Materials Research Centre Lastuvkova, Marcela; Faculty of Chemistry, Materials Research Centre Kalina, Michal; Faculty of Chemistry, Materials Research Centre Klucakova, Martina; Brno University of Technology, Institute of Physical and Applied Chemistry, Faculty of Chemistry Upper-Division Undergraduate < Audience, Physical Chemistry < Domain, Inquiry-Based / Discovery Learning < Pedagogy, Transport Properties < Topics, Colloids < Topics

ACS Paragon Plus Environment

Page 1 of 25

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60


Hydrogels: invaluable experimental tool for demonstration of diffusion phenomena in chemical laboratory courses Petr Sedláček*, Jiří Smilek, Marcela Laštůvková, Michal Kalina, Martina Klučáková 5

Brno University of Technology, Faculty of Chemistry, Materials Research Centre, Purkyňova 118/464, 612 00 Brno, Czech Republic ABSTRACT Original experimental methodology, which provides both qualitative and quantitative insights into fundamental diffusion processes, is introduced and proposed to be

10

involved in laboratory chemical education. In proposed experiments, transient and stationary diffusion flow of a colored solute is studied in aqueous solution entrapped in an agarose gel matrix. Furthermore, the demonstration of effect of the reaction between the solute and the gel matrix is involved by the addition of a reactive component into the gel structure. The proposed methodology is intended for higher-undergraduate

15

laboratory classes of physical chemistry. ABSTRACT GRAPHIC

Journal of Chemical Education

10/21/15


Page 1 of 19


1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60

Page 2 of 25

KEYWORDS upper-division undergraduate; physical chemistry; colloids; transport properties; inquiry20

based/discovery learning INTRODUCTION Apart from the comprehensive theoretical knowledge on specific physical and chemical phenomena, the profile of a graduate of physical chemistry at a high-quality university requires also the ability to apply such knowledge to practical experience and

25

to the problems of daily life. The diffusion represents a good example when discussing these two sides of teaching and learning physical chemistry. On one hand, as a ubiquitous phenomenon affecting both living and non-living nature as well as vast majority of diverse technological procedures, the diffusion is undoubtedly sensed as an essential topic in theoretical courses on physical chemistry, where it is usually hated by

30

students for its complicated and incomprehensible mathematical apparatus. On the other hand, practical familiarization of students with the diffusion phenomena, e.g. in laboratory courses, is rather scarce. Experimental demonstration of a diffusion process is usually performed either in liquids or gases, where the typical diffusion rates are high enough to be observable in

35

available timeframe. Hence, the diffusion phenomena is often demonstrated on simple experiments like placing few crystals of a colored substance (e.g. copper sulfate) at the bottom of water-filled beaker and observing the consequent gentle spreading of the color throughout the bottle. Unfortunately, such experiments always entail some inevitable interfering processes such as the convective flow of the liquid caused by the

40

inhomogenities in temperature or density of the solution. Furthermore, these experiments usually provide only little opportunity for the investigation of the diffusion in a quantitative way and thus confront the experiment with hard-earned knowledge on the diffusion mathematics. Several attempts have been made to optimize the solution diffusion experiments for the under-graduate chemical courses. For instance, King1


10/21/15


Page 2 of 19

Page 3 of 25

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60

45


proposed a simple laser refraction technique for the measurements of the diffusion coefficients of liquids. The method is rapid, accurate and offers a good visualization of the diffusion process. Serious drawbacks of the above mentioned demonstrations can be circumvented by carrying out the diffusion experiments in a hydrogel medium instead of liquid.

50

Hydrogels combine their solid (continuous network of polymer molecules or colloidal particles) and liquid fraction (aqueous solution) into unique overall structure which possesses beneficial properties from the diffusion-related point of view. Because the major weight proportion of gels is made by an aqueous solution, corresponding diffusion rate is almost as high as in the solution alone. Nevertheless, in comparison

55

with solution, convective flow is markedly suppressed by dispersed solid network of gel. Hydrogel media are already commonly applied in the demonstrations of some special diffusion-related phenomena such as those presented in Figure 1.

60

Figure 1. Common practical demonstrations of diffusion-related phenomena in hydrogels: chemical gardens (above), Liesegang rings (below)


10/21/15


Page 3 of 19


1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60

Page 4 of 25

Chemical gardens, the phenomenon discovered more than three centuries ago,2 represents not only a popular chemical experiment for the middle-school lessons of chemistry, but nowadays it also faces growing interest in disciplines as varied as 65

chemistry, physics, nonlinear dynamics and materials science.3 The Liesegang rings, periodical bands or ring patterns formed by inorganic precipitation in polymer gel medium, have attracted the scientific attention of chemists, geologists and biologists, in trails for understanding the natural patterning. Although numerous qualitative and mathematically formulated models have been suggested, complete explanation of both

70

phenomena is still missing.4 In the current paper, we extend the traditional use of hydrogel in educative diffusion demonstrations by introducing simple experimental methodology which provides both qualitative and quantitative insight into two fundamental diffusion processes: transient and stationary diffusion flow of a colored solute in aqueous solution entrapped in an

75

agarose gel matrix. Furthermore, the demonstration of effect of reaction between the solute and the gel matrix is involved by the addition of a reactive component into the gel structure. The proposed methodology is intended for use in higher-undergraduate laboratory classes of physical chemistry. In Experimental section, we present a general experimental design, which allows the adaptation to particular requirements of the

80

laboratory course supervisor e.g. as far as the selection of used chemicals is concerned. The proposed methodology was tested and optimized emplying agarose hydrogels as diffusion media, cationic organic dyes as diffusing compounds and model synthetic and natural polymers as reactive components of the gel. Selected experimental data, determined for these systems, are presented in Results and Discussion.


10/21/15


Page 4 of 19

Page 5 of 25

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60

85


THEORY Hydrogels The term hydrogel describes three-dimensional network structure obtained from a class of synthetic/natural polymers which can absorb and retain significant amount of water. Hydrogels are defined as substantially diluted cross-linked systems formed by

90

three-dimensional polymeric networks.5 Hydrogel is a colloid dispersion system, in which the dispersion phase (solid) combines with the dispersion medium (liquid) to produce a semisolid material. Hydrogels can be prepared by changing the physical conditions of solutions (temperature, pH, and level of electrolyte); covalent hydrogels can be prepared by means of chemical reactions. Covalently cross-linked hydrogels

95

have better mechanical properties than physically cross-linked ones. Another method of hydrogel preparation is swelling (the addition of dispersion medium to a compact xerogel – the dispersion phase without the dispersion medium). In spite of the fact that the majority of the hydrogel volume is formed by water, it has the properties of the solid state (mechanical properties, diffusivity).

100

Diffusion The diffusion is a molecular transport process caused by random Brownian motion of molecules. The rate of transport of molecules is related to the diffusion coefficient (D), a parameter dependent on the nature of substance, defined by Fick’s first law 𝐽 = 𝐴𝑗 = −𝐴𝐷

105

𝜕𝑐

(1)

𝜕𝑥

where J is the total flux of molecules along the distance x, A is the area across which the diffusion occurs, j is the flux per unit area and c is the concentration of the solute.6 Note that the form of Fick’s First law, shown in Equation 1 is valid only when the diffusive flow is one-dimensional and D is constant. Depending on whether the gradient of concentration along the dimension of

110

diffusive flux of the compound is constant, we differentiate the stationary (steady state)


10/21/15


Page 5 of 19


1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60

Page 6 of 25

and non-stationary (transient) diffusion. According to Equation 1 the steady-state diffusive flux is time-independent; in contrast, the diffusive flux is time-variable for the non-stationary diffusion which is governed by the Second Fick’s law in the form (valid for the above mentioned assumptions): 115

𝜕𝑐 𝜕𝑡

= 𝐷(

𝜕2 𝑐 𝜕𝑥 2

)

(2)

According to exact initial and boundary conditions, which correspond to the particular system, the solution of this partial differential equation provides the timespatial dependence of the concentration of diffusing solute in the medium. If the diffusion proceeds in a porous medium, e.g. in hydrogel, it is complicated by 120

two inevitable effects: (i) reduced cross-sectional area, available for the diffusive flux compared to the macroscopic cross-sectional area (assuming that the compound cannot penetrate into the solid phase), and (ii) more tortuous transport of the compound in the pores of medium. As a result, modified Fick’s equations describe the transport of solute through the porous specimen. Furthermore, the diffusing compound may also interact

125

with or even bind to the solid phase of porous medium (e.g. with the polymer network in the hydrogel). The appropriate mathematical model for the description of diffusion in porous media, including both above mentioned effects, is discussed in details by Shackelford and Moore7 and summarized briefly in our previous papers.8-10

130

EXPERIMENTAL SECTION Preparation of hydrogels for the diffusion experiments Model hydrogels, proposed here for the diffusion experiments, are prepared from agarose, commercially available polysaccharide extracted from sea algae. From the chemical point of view, agarose is made up from repeating units of agarobiose, disaccharide consisting of galactose and 3,6-anhydrogalactose. Nevertheless, alternative

135

hydrogel systems which meet the requirements of proposed methodology (optical transparency, ability to interpenetrate reactive polymer additive, dimensional stability


10/21/15


Page 6 of 19

Page 7 of 25

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60


in utilized diffusion apparatuses) can be easily found in the literature (e.g. gelatin11, chitosan gels12, waterglass gels13). Particular experimental procedure of the thermoreversible gelation of agarose is outstandingly simple14 as described in the next 140

section. In order to prepare the hydrogel with improved binding affinity toward the diffusing compound, small amount of a water soluble polymer carrying appropriate functional groups is dissolved in water prior to the addition of solid agarose. The remaining steps of the gelation are left unchanged. Proper polymer functionality is selected with respect to the chemical nature of diffusing compound, i.e. according to the

145

charge of ionic compounds, H-bond donor/acceptor character and so forth. Sufficiently low concentration of added polymer compared to agarose is selected in order to ensure that major mechanical and structural parameters of the gel are not affected by the polymer component so that the observed differences in determined diffusion parameters can be attributed unambiguously to the effect of binding of diffusing compound to the

150

reactive additive. The molecular weight of reactive polymer needs to be high enough to keep the polymer molecules immobilized in the hydrogel network. Possible release of the polymer from the gel during the diffusion experiments should be verified experimentally as a part of the diffusion methodology implementation and optimization.

155

Selection of the diffusing solute In the proposed methodology, the concentration of diffusing solute within the gel (in-diffusion experiments) and in the diffusion-cells apparatus (through-diffusion experiments), respectively, is measured by means of spectrophotometry (see below). Therefore, a colored substance with high solubility in water represents a suitable candidate for the diffusing compound. As far as the molecular structure of the solute is

160

concerned, ionic compounds additionally possess great binding affinity towards polyelectrolytes, which can be employed in the demonstration of an effect of binding on the diffusion process. Moreover, because the anion-active polyelectrolytes are much


10/21/15


Page 7 of 19


1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60

Page 8 of 25

more common than the cation-active ones, positively charged low-molecular compounds are better utilizable for the purpose. Both inorganic and organic cations with high molar 165

absorption coefficient in aqueous solution can be used, for instance copper (absorption maximum 810 nm), nickel (390 and 720 nm) or cobalt (510 nm) ions as inorganic ions and methylene blue (665 nm), rhodamine 6G (525 nm) or other basic dyes from organic solutes.

170

Through-diffusion experiments in diffusion cells The method of diffusion cell (alternative referred to as “Franz cell” or “throughdiffusion method”) represents one easy way to study the diffusion experimentally. Experimental principle of the method is obvious from the schematic drawing of the horizontal diffusion cell apparatus used in the trial experiments discussed in details in the next section (see Figure 2).

175 Figure 2. Schematic drawing of the commercial diffusion cells apparatus utilized in the through-diffusion experiments (not to scale).

As the solute diffuses through a studied sample positioned between the donor and acceptor cells of the apparatus, its concentration is continuously measured either in 180

one or both of the cells. When the diffusing solute is colored, its penetration through the sample is easily observable even visually. However, the process can be easily


10/21/15


Page 8 of 19

Page 9 of 25

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60


studied in a quantitative way employing the spectrophotometry as an available analytical tool routinely used in basic courses of physical and analytical chemistry. The through-diffusion experiment proposed here for the undergraduate laboratory 185

classes of physical chemistry proceeds as follows: Agarose gel is prepared by in-situ gelation in a ring holder like that shown in Figure S1 in Supplementary information. After complete solidification of gel, the holder is fixed in the middle of the diffusion cells apparatus. At the same time, the cells of the apparatus are filled with the same volume of a source solution of the diffusing substance and deionized water, respectively. Single-

190

wavelength absorbance or whole absorption spectra of the acceptor solution (water initially) are recorded on spectrophotometer either after the manual sampling or by means of the optical-fiber dip probe. The evaluation of experimental data is based on the linear regression of increasing part of the time dependency of concentration of the solute into “acceptor” cell of the

195

apparatus (breakthrough curve). The x-axis intercept of the line provides the time, needed by the solute to break through the gel (i.e. the lag time). From the slope of the line, the steady-state diffusion flux jd (in mol.m–2.s–1) is calculated. This parameter represents the molar amount of solute transported through the unit area of gel sample per second and it depends on the gel thickness L and the effective diffusivity De of solute

200

in the gel according the equation 𝑗𝑑 = 𝐷𝑒

∆𝑐𝑔𝑒𝑙

(3)

𝐿

The effective diffusivity of solute provides interesting information about the gel structure as it embraces the effects of gel porosity and tortuosity of the solute flow in gel (for detail, see8). 205

In-diffusion experiments in cuvettes Because the diffusion-cells experiment describes quantitatively mainly the later step of the diffusion process when the whole gel sample is already permeated by the


10/21/15


Page 9 of 19


1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60

Page 10 of 25

diffusing solute, it is reasonable to combine this experiment with additional one that focuses on the initial stage of the solute penetration into the sample. For this purpose, 210

simple study can be performed where the gel is prepared via the in-situ gelation in the cuvettes for UV-VIS spectrometry. The gel-filled cuvettes are then immersed in the source solution of diffusing solute with the volume of the solution high enough to maintain the concentration of solute at approximately constant value during the diffusion experiment. In the course of the diffusion experiment, the cuvettes are taken

215

from the solution in selected time intervals and the UV-VIS spectra are recorded at different positions from edge of cuvette. For this purpose, a vertical positioner of the cuvette (i.e. the cuvette holder equipped with fine controlled vertical movement) is needed. An example of such accessory (authors-made) is shown in Figure S2 in Supplementary information. This leads to the determination of the solute concentration

220

profiles in gel at different time invervals. The calculation of apparent diffusion coefficient Da is allowed the comparison of these profiles with corresponding solution of the Second Fick’s law in the following form 𝑐 = 𝑐𝑠 ∙ 𝑒𝑟𝑓𝑐

𝑥

(4)

√4𝐷𝑒 𝑡

where c symbolized the concentration of basic organic dye in various distances from 225

boundary, cs is the concentration on hydrogel-solution interface, erfc is the error function and t is the time from the beginning of diffusion process. In comparison with effective diffusion coefficient, the apparent diffusion coefficient involves also any effect of interactions between diffusing solute and gel medium.

230

Testing the methodology in trial laboratory experiments The methodology, generally described in the previous section, was implemented into trial laboratory experiments. For these experiments, agarose (AG, routine use class, < 10 wt. % moisture content), methylene blue hydrate (MB, CI Basic blue 9, dye content ≥ 95 wt. %), poly(sodium 4-styrenesulfonate) (PSS, purity >99 wt. %) and alginate (ALG,


10/21/15


Page 10 of 19

Page 11 of 25

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60


purity >99 wt. %) were purchased from Sigma-Aldrich. Leonardite Humic Acid Standard 235

(HA, 1S104H) were purchased from International Humic Substances Society (www.humicsubstances.org). All compounds were used without further purification. Agarose was selected as a standard gel-forming agent, methylene blue as a model positively charged low molecular solute and other compounds as anionic polymers of natural (ALG and HA) and synthetic (PSS) origin.

240

Reference agarose hydrogel was gelatinized from 1 wt. % solution of AG in water. In this process, accurately weighted amount of solid agarose was dispersed in water and the dispersion was slowly heated under continuous stirring to 80 °C. Then, the mixture was maintained at this temperature until it turned clear and transparent as agarose dissolved. The solution was then degassed (e.g. in ultrasonic bath) at still elevated

245

temperature. The hydrogel was formed from this solution during gentle cooling to ambient temperature. Gels with their binding capacity improved by the addition of polyelectrolytic component were prepared as follows: specific amounts of solid AG and respective polyelectrolyte (PSS, ALG or HA) were dissolved in water in order to prepare the

250

solutions of 1 wt. % content and 0.01 wt. % content of AG and the polyelectrolyte, respectively. The solutions were then gelatinized via the same method as described above. For the diffusion experiments, warm solutions of AG or AG – polyelectrolyte mixture were poured into appropriate containers in order to prepare the gels in requested

255

proportions. In case of experiments in diffusion cells, the container was constituted from the plastic ring holder placed between two glass plates (see Figure S3 in Supplementary information). Cylindrical gels (40 mm in diameter and 5 mm thick) were prepared by this procedure. For the in-diffusion experiments, the solution was left gelatinizing in standard cuvettes for spectrophotometry (inner dimensions: 10 × 10 × 45


10/21/15


Page 11 of 19


1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60

260

Page 12 of 25

mm), covered by glass to prevent the evaporation and shrinking of sample during the gelation. Through-diffusion experiments were performed in standard diffusion cells purchased from PermeGear, Inc. (see Figure 2 and Figure S4 in Supplementary information). The gel sample in the plastic ring holder was fixed between donor and

265

acceptor cell of the apparatus. The donor cell was filled with 60 cm3 of 0.01 g.dm–3 aqueous solution of methylene blue and the acceptor cell with the same volume of deionized water. VIS absorption spectra were collected automatically in the acceptor solution by USB 2000+ fiber spectrometer (Ocean Optics, Inc.) equipped with optical fiber dip probe. No samples were taken from the cells and the total volumes of the

270

solutions hence stayed constant during the diffusion experiment. After the termination of the diffusion experiment, the absorbance was measured in both cells. For every measurement, the values of steady-state diffusion flux and time lag were derived from the linear regression of linea part of the break-through curve. Furthermore, the total mass of methylene blue absorbed in the hydrogel specimen was determined from the

275

mass balance in the diffusion cell compartments at initial and final stage. In-diffusion experiments with hydrogels were performed as follows: the hydrogel samples in transparent cuvettes were immersed in horizontal positions in 0.01 g dm–3 aqueous solution of methylene blue in a container filled with 250 cm 3 of the dye solution. The dye solution was stirred continuously by the magnetic stirrer and the dye

280

was left to diffuse from the solution into the gel samples through the square orifices of the cuvettes. In selected time intervals (24, 48 and 72 hours), the cuvettes were taken out of the solution and the UV–VIS spectra were measured at various distances from the orifice on Varian Cary 50 UV–VIS spectrophotometer equipped with special accessory providing controlled fine vertical movement of the cuvette in the


10/21/15


Page 12 of 19

Page 13 of 25

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60

285


spectrophotometer (see Figure S2 in Supplementary information). From collected UV– VIS spectra, the concentration of dye was determined at different positions in gels. RESULTS AND DISCUSSION The general concept of the implementation of proposed experiments into undergraduate laboratory courses is to provide students with practical demonstration of

290

diffusion phenomena. The main emphasis is placed on illustrative nature of the experiments, easy transfer of obtained the knowledge into practice and low technical demands on experimental design. Therefore, only the instrumentation widely accessible in a common university/commercial lab is used. Furthermore, the diffusion cells apparatus represents a standard analytical tool routinely used in practice e.g. for skin-

295

penetration experiments in pharmacy or cosmetics. From the viewpoint of requested illustrativeness, the combination of transparent hydrogel medium and colored diffusing substances results in a fact that the diffusion of the solute can be observed even visually (see Figure 3).

300

Figure 3. Photo of the gel samples with different content of PSS after 72 h of diffusion of Methylene Blue (from left to right: 0 wt.%, 0.002 wt.%, 0.005 wt.% and 0.010 wt.% PSS in 1 wt.% AG gel).

Figure 4 shows the results of through-diffusion experiments performed in the diffusion cells. The breakthrough curves (the time dependencies of diffusing solute concentration in the acceptor cell) are shown for the reference agarose gel as well as for


10/21/15


Page 13 of 19


1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60

305

Page 14 of 25

the gels with added content of reactive polyelectrolyte. It is evident how the improved binding capacity of gel for the diffusing compound affects the penetration of the compound through the gel.

310

Figure 4. Results of the through-diffusion experiments; breakthrough curves of MB for reference agarose hydrogel (AG) and for gels with respective polyelectrolyte component (ALG, HA and PSS, respectively).

The lag time is increased for all tested polyelectrolyte components of the gel in comparison with the reference agarose gel, while the steady-state diffusion flux is decreased correspondingly (see Table 1). 315

Table 1. Main fitting parameters, calculated for the diffusion of methylene blue in reference agarose gels (AG) and in gels with respective polyelectrolyte component (ALG, HA, PSS, respectively) from through-diffusion and in-diffusion experiments through-diffusion experiments hydrogel composition

steady state diffusion flux JD × 109

absorbed amount of MB in gel n × 107

lag time

AG

5.39  0.09

AG + ALG

2.50  0.02

AG + HA AG + PSS

in-diffusion experiments

tLT

apparent diffusion coefficient Da

boundary concentration cs

3.8  0.4

3.9  0.6

3.5  0.3

33  8

3.8  0.4

4.9  0.1

1.6  0.2

14  4

0.560  0.001

16.6  0.1

9.3  0.1

1.71  0.01

55  4

0.240  0.002

24.5  1.5

9.0  0.5

0.18  0.04

622  64

(mol∙m-2∙s-1)

(mol)

(hrs)

(m2∙s-1)

(mol∙m-3)

Although a detailed explanation of these results is out of the scope of this paper (for corresponding discussion including mathematical evaluation of data, see8), this general 320

finding represents clear illustration of the way how the binding of solute affects its mobility within the gel. Hence, a small addition of the polyelectrolyte component (note


10/21/15


Page 14 of 19

Page 15 of 25

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60


that the dry weight of agarose in the gel is 100× higher than that of polyeletrolyte) can result in more than 100 % increase in the lag time. The effect is qualitatively similar for all tested polyelectrolytes – humic acids as important reactive compound from non325

living nature (soil, sediments), alginate as a model biopolymer and poly(styrenesulphonate) as a representative of synthetic polymers. Obviously, a wide variety of solute-polyelectrolyte combinations is available for the demonstration of this effect and particular choice can be made e.g. with respect to specific focus of the study program etc. From the mass balance in the diffusion cell compartments at initial and

330

final stage the total concentration of methylene blue absorbed in the hydrogel specimen was determined. It can be seen that ALG deviates from the general rule that a polyelectrolyte component enhances the absorption of solute within the gel (see Table 1). The primary experimental outcome of the in-diffusion experiments is illustrated in

335

Figure 5.

Figure 5. Results of the in-diffusion experiments; experimental (scattered points) and theoretical (solid lines) concentration profiles of MB in reference agarose hydrogel (AG) and in gels with respective polyelectrolyte component (ALG, HA and PSS, respectively). 340

Here, the experimental concentration profiles of gels (scattered points) are shown together with the theoretical ones (solid lines), which were determined by the least-


10/21/15


Page 15 of 19


1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60

Page 16 of 25

square fitting of experimental data with Equation 4 using the Solver tool in Microsoft Excel. The main results of this regression (apparent diffusion coefficient and boundary concentrations of the solute) are listed in Table 1. Again, binding of the solute with 345

polyelectrolyte component strongly affects the experimental data. The decrease in the rate of diffusion resulting from this binding is characterized by lower apparent diffusion coefficient in gels with added polyelectrolyte, contrary to the reference agarose gel. Qualitatively, this effect can be observed visually as lower depth of sample penetration by colored substance at given time (see Figure 3). Furthermore, the addition of reactive

350

component often affects also the solution – gel partitioning of the diffusing solute and corresponding boundary concentration of the solute within the gel (for the details, see9). A substantial increase in the boundary concentration was confirmed for PSS and HA in comparison with reference AG gels, while the boundary concentration of MB was reduced significantly in hydrogels with added ALG (note the analogy with the results

355

from the through-diffusion experiments). This difference in the behavior of diverse polyelectrolytes illustrates the complex character of the solution – gel partitioning as another important physico-chemical phenomena involved in the performed experiments. It also shows the wide scope of these experiments from the viewpoint of application of students’ theoretical knowledge from diverse areas of physical chemistry.

360

SUMMARY From an educational point of view, the proposed methodology allows the undergraduate students to support their theoretical knowledge on the diffusion and related physico-chemical phenomena with highly-illustrative practical demonstrations. The attractiveness of the experiments is supported also by the involvement of

365

preparation of hydrogels – a procedure with great practical applicability in everyday life. The evaluation of experimental data provides an opportunity to employ the diffusion mathematics in a gentle and practical way. As far as the complete duration of these


10/21/15


Page 16 of 19

Page 17 of 25

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60


experiments is in the order of days, it is better suited for the block-taught laboratory courses; nevertheless, they can be implemented also to standard weakly-taught courses 370

e.g. by dividing the workflow into two subsequent steps. From a scientific point of view, this paper clearly shows that the proposed diffusion techniques provides an innovative approach to the study of binding and barrier properties of diverse natural or synthetic compounds. The diffusion techniques can be utilized as an interesting alternative to traditional reactivity mapping methods e.g. the

375

batch sorption experiments. The diffusion cell technique should be a universal method for the study of reactivity or barrier properties of various systems, especially biopolymers in hydrogel form. Furthermore, the proposed methodology enables broadening of experimental scope of the study by involving the binding-affecting parameters like pH, ionic strength or temperature.

380

ASSOCIATED CONTENT Preparation of chemical garden: the glass container was filled up by waterglass (sodium silicate). On the bottom of the container the solid crystals of multivalent ions of metals (cobalt chloride, copper chloride, nickel chloride, magnesium chloride or ferric sulphate) were added.

385

Preparation of Liesegang rings: 2 wt. % agarose hydrogel with addition of 0.002 M potassium dichromate (C) or 0.2 M cobalt chloride (D) was prepared in glass tubes. On the top of the glass tubes, 0.1 M silver nitrate (C) or concentrated ammonia (D) was poured. As the ions diffuse from the respective solution into the hydrogel, sharp concentric rings of insoluble hexaamminecobalt(II) ions (C) or silver chromate (D) are

390

formed wherever concentration of the produced salt exceeds the respective solubility product constant. AUTHOR INFORMATION Corresponding author *E-mail: [email protected]


10/21/15


Page 17 of 19


1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60

395

Page 18 of 25

ACKNOWLEDGEMENT This work was supported by Materials Research Centre at FCH VUT – Sustainability and Development, REG LO1211, with financial support from National Program for Sustainability I (Ministry of Education, Youth and Sports) and by project COST LD15047. Furthermore, authors gratefully appreciate the excited help from students on

400

the implementation of the methodology. REFERENCES 1.

King, E. M.; Pitha, R. W.; Sontum, S. F. A laser refraction method for measuring liquid diffusion coefficients. Journal of Chemical Education. 1989, 66 (9), 787-790.

2.

Glauber, J. R. Furni novi philosophici, 1st ed.; Johan Jansson: Amsterdam, Netherland, 1658; pp 186-189.

405

3.

Glaab, F.; Kellermeier, M.; Kunz, W.; Morallon, E.; Garcia-Ruiz, J. M. Formation and evolution of chemical gradients and potential differences across self-assmbling inorganic membranes. Angewandte Chemie International Edition. 2012, 51 (18), 4317-4321.

4.

Kopinsky, J.; Rutherford, A.; Cussler, E. L. Theories of precipitation induced by dissolution. Aiche Journal. 1988, 34 (12), 2005-2010.

410

5.

Lyon, A.; Serpe, M. J. Hydrogel micro and nanoparticles, 1st ed.; Wiley-VCH: Weinheim, Germany, 2012; pp 406-407.

6.

Cussler, E. L. Diffusion mass transfer in fluid systems, 3rd ed.; Cambridge University Press: Cambridge, United Kingdom, 2009; pp. 550-551.

415

7.

Shackelford, Ch. D.; Moore, S. M. Fickian diffusion of radionuclides for engineered containment barriers: diffusion coefficients, porosities, and complicating issues. Engineering Geology. 2013, 152 (1), 133-147.

8.

Sedláček, P.; Smilek, J.; Klučáková, M. How the interactions with humic acids affect the mobility of ionic dyes in hydrogels – results from diffusion cells. Reactive and Functional Polymers. 2013, 73 (11), 1500-1509.

420

9.

Sedláček, P.; Smilek, J.; Klučáková, M. How the interactions with humic acids affect the mobility of ionic dyes in hydrogels – 2. Non-stationary diffusion experiments. Reactive and Functional Polymers. 2014, 75 (2), 41-50.

10. Smilek, J.; Sedláček, P.; Kalina, M.; Klučáková, M. On the role of humic acids’ carboxyl 425

groups in the binding of charged organic compounds. Chemosphere. 2015, 138 (11), 503510. 11. Hoffman, A. S. Hydrogels for biomedical applications. Advanced Drug Delivery Reviews. 2012, 64 (12), 18-23. 12. Falk, B.; Garamone, S.; Shivkumar, S. Diffusion coefficient of paracetamol in a chitosan

430

hydrogel. Materials Letters. 2004, 58 (26), 3261-3265.


10/21/15


Page 18 of 19

Page 19 of 25

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60


13. Knoblich, B.; Gerber, T. Aggregation in SiO2 sols from sodium silicate solutions. Journal of Non-Crystalline Solids. 2001, 283 (1-3), 109-113. 14. Lee, P. Y.; Costumbrado, J.; Hsu, C. Y.; Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. Journal of Visualized Experiments. 2012, 20 (62), 3923-3923.


10/21/15


Page 19 of 19


1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60

Graphical abstract 22x16mm (600 x 600 DPI)


Page 20 of 25

Page 21 of 25

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60


Common practical demonstrations of diffusion-related phenomena in hydrogels: chemical gardens (above), Liesegang rings (below) 50x38mm (300 x 300 DPI)



1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60

Schematic drawing of the commercial diffusion cells apparatus utilized in the through-diffusion experiments (not to scale). 229x130mm (96 x 96 DPI)


Page 22 of 25

Page 23 of 25

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60


Photo of the gel samples with different content of PSS after 72 h of diffusion of Methylene Blue (from left to right: 0 wt.%, 0.002 wt.%, 0.005 wt.% and 0.010 wt.% PSS in 1 wt.% AG gel). 722x541mm (72 x 72 DPI)



1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60

Results of the through-diffusion experiments; breakthrough curves of MB for reference agarose hydrogel (AG) and for gels with respective polyelectrolyte component (ALG, HA and PSS, respectively). 234x156mm (96 x 96 DPI)


Page 24 of 25

Page 25 of 25

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60


Results of the in-diffusion experiments; experimental (scattered points) and theoretical (solid lines) concentration profiles of MB in reference agarose hydrogel (AG) and in gels with respective polyelectrolyte component (ALG, HA and PSS, respectively). 150x100mm (150 x 150 DPI)


Příloha č. 5

Konferenční příspěvek indexovaný v databázi Web of Science

SMILEK, J., SEDLÁČEK, P., KLUČÁKOVÁ, M. New Approach for Characterization and Study on Reactivity of Biomaterials. Nanocon 2014 Conference Proceedings. 1. Ostrava, Tanger Ltd. 2014. s. 808 - 813. ISBN 978-80-87294-53-6.

th

th

Nov 5 – 7 2014, Brno, Czech Republic, EU

NEW APPROACH FOR CHARACTERIZATION AND STUDY ON REACTIVITY OF BIOMATERIALS Jiří SMILEK, Petr SEDLÁČEK, Martina KLUČÁKOVÁ Brno University of Technology, Faculty of Chemistry, Materials Research Centre, Purkynova 118/464, 612 00 Brno, Czech Republic, e-mail: [email protected]

Abstract New method for study on reactivity and transport ability of biomaterials based on combination of innovative diffusion techniques and advantages of hydrogels was developed. Stationary penetration experiments (diffusion cells) were applied for biomaterials (anionic humic acids and cationic chitosan) in supported hydrogel matrix. Linear polysaccharide – agarose – was used as non-reactive matrix, which was characterized from mechanical and structural point of view. The reactivity and transport properties of chosen biomaterials were studied by the interactions with simple organic dyes (Methylene Blue C.I. 52015 and Chicago Sky Blue 6B C.I. 24410). The rate of interaction of organic dyes with biomaterials in the case of stationary experiments (break-through technique) was compared by fundamental diffusion parameters (effective diffusion coefficient, lag time and binding capacity). Results obtained from stationary diffusion technique clearly illustrate the immobilizing effect of chitosan (humic acids, respectively) on the transport of organic dye in hydrogel. The influence of concentration of biomaterials on the transport of organic dye and the reactivity of biomaterials was studied as well. Presented diffusion technique (together non-stationary diffusion techniques) in combination with excellent transport properties of hydrogels (diffusion is not disturbed by convection, characterization can be done very easily, etc.) seem to be suitable universal preliminary reactivity-mapping tool for wide range of biomaterials at changing experimental conditions. Keywords Biomaterials, hydrogel, reactivity, transport, polyelectrolytes 1.

INTRODUCTION

1.1.

Humic acids

Humic acids (HA) are fundamental components of natural organic matter (NOM) in the soil and water as well as sediments, peats or coal. HA are complex and heterogeneous mixture of polydispersed materials; they were formed during decades as a result of microorganism activity [1]. HA represent highly reactive material, which plays crucial environmental role in natural ecosystems, such as soils, waters and sediments. They have outstanding affinity to interact with nearly any substances [2]. HA are one of the fractions of humic substances, which are soluble at alkali conditions, but insoluble in acids unlike fulvic acids, which are soluble in both solutions. HA are very important component of soil; this valuable biomaterial is responsible for complexation of pollutants (e.g. heavy metal ions or pesticides) [3], [4]. The positive effect of HA on the on the soil fertility is known very well for decades [5]. Lots of scientific groups are interested in the chemistry of HA. Nevertheless, simple universal method for study on reactivity and transport ability of this biocompatible material is still missing. The reactivity and binding capacity of HA is mostly studied by classical sorption experiments [6]. Sorption experiments are very useful for determination of fundamental sorption parameters such as binding capacity of HA towards to cationic natural compounds. However this classical approach does not illustrate the real environment of HA (soil or water). Because of this fact, we are able determined sorption kinetics and equilibrium, but the

th

th

Nov 5 – 7 2014, Brno, Czech Republic, EU information about the nature of interactions between HA and pollutants in natural environment are limited. The universal reactivity-mapping tool for natural organic matter is needed because of lacks of classical sorption experiments which were mentioned above. Progressive methods aimed on the study on reactivity and binding capacity of natural HA are mentioned in our recent works [7], [8]. 1.2.

Chitosan

Chitosan is the most important derivative of chitin. It can be obtained by deacetylation of chitin, which it is a natural component of shrimp or crab shells [9]. Chitosan is linear polysaccharide with unique properties. It is one of the cationic natural polysaccharide and thus, chitosan finds many applications. Chitosan is insoluble in aqueous solutions, but it is soluble in acetic aqueous solutions (e.g. mineral acids). The solubility of chitosan is given by the degree of deacetylation. Chitosan consists –NH2 functional groups, which can be protonated in acetic aqueous solutions and after that the chitosan becomes soluble. The cationic nature of chitosan is primarily responsible for electrostatic interactions with anionic charged molecules such as proteoglycans [10] or organic dyes [11]. Chitosan is composed of glucosamine and N-acetyl glucosamine units linked by (1-4) glycosides’ bonds. The content of glucosamine units is called the degree of deacetylation [12]. Chitosan is appreciated mainly because of presence of amino groups and the biocompatibility, biodegradability and bioactivity. Nowadays, chitosan is mostly used in tissue engineering [13], [14]. Materials based on chitosan are commonly used for removal of food dyes from aquatic solutions by sorption processes. The positive affinity of chitosan towards to anionic organic dyes is known very well. [15], [16]. In spite of the fact, that the interaction of chitosan with organic dyes is well proofed, the mechanism and the determination of the rate interaction is often difficult. 1.3.

Theory of diffusion

Proposal article presented two diffusion techniques which are used for study on reactivity of biomaterials. Diffusion cell technique (break-through method) is related with 1. Fick’s law [17] (stationary diffusion). The effective diffusion coefficient, as the fundamental diffusion parameter can be calculated from changes of concentration of diffusion probe in acceptor chamber of diffusion cell with time according equation 1 [7].

ln

c D  c A t c D  c A 0

   D  t

(1)

where cD is the concentration of organic dye in source chamber, cA is the concentration in acceptor compartment, β symbolized the geometrical parameter (diffusion cell constant) determined experimentally [7] and t is the time of diffusion. The values of steady-state diffusion flux and the lag time were determined from linear region of the break-through curve (the concentration of organic dye as the function of time). Typical break-through curve has two regions. In first few hours (depend on amount of biomaterials and agarose concentration), the changes of concentration of organic dye as the time function is equal to zero. During this transition step, the sorption stage and penetration of organic dye through hydrogel occurs. Therefore, the concentration of organic dye in acceptor compartment is equal to zero. After some time (lag time or break through time), the concentration of organic dye increases linearly in acceptor chamber. The slope of this increase is proportional to effective diffusion coefficient (the main important diffusion parameter). 2.

EXPERIMENTAL

2.1.

Determination of pore size

Pore size of agarose hydrogels was determined by ultraviolet-visible spectroscopy. Utilization of this spectroscopic method for determination of agarose pore size is clearly described in [18]. Agarose hydrogels with exact concentration were prepared in PMMA cuvettes. The ultraviolet-visible spectra were of these agarose hydrogels were collected on double beam spectrophotometer (Hitachi U3900) at given range of

th

th

Nov 5 – 7 2014, Brno, Czech Republic, EU wavelength (700 – 800 nm). Average absorbance was calculated in whole range of wavelengths. Logarithm of turbidity was plotted as a function logarithm of wavelength. Turbidity was calculated according equation 2.

 λ 

2.3  A  λ  L

(2)

where A is the absorbance and L is the optical length (1 cm in this case). Wavelength exponent was obtained from linear regression of logarithm of turbidity as a function of logarithm of wavelength. According theoretical assumptions (Aymard et al. [19]), the wavelength exponent is proportional of correlation length, pore size respectively. Pore size of 1 wt. % agarose hydrogel was determined by unconventional method (UV-VIS spectroscopy). The main aim of this determination was choosing of the appropriate concentration of agarose in the hydrogel. Higher concentration of agarose causes the reduction of pore size. On the other hand, if the concentration of agarose in hydrogel is not sufficient, the mechanical properties of these hydrogels will not be satisfying. Optimal pore size of agarose hydrogel is very important parameter, because biomaterials, which are studied, must be immobilized in the structure of hydrogel, which can be done only, when the pore size is sufficiently small. Because of these facts, the determination of pore size was realized for 4 samples (0.5 wt. %, 1 wt. %, 2 % wt. and 4 wt. %) agarose hydrogels. 2.2.

Rheology

Differences in mechanical properties of agarose hydrogels were compared by oscillatory measurements on Rheometer AR-G2 TA Instruments. Mechanical properties of agarose hydrogels with/without addition of biomaterials were determined by frequency sweep (constant strain) and strain sweep (constant frequency of oscillation) oscillatory tests. First of all, the strain sweep of each agarose hydrogel was realized at constant frequency of oscillation (1 Hz). Mechanical response of hydrogels was measured in given range of strain (0.1 % − 100 %). Normal force used during compression of sample was maintained under 2 N. Second oscillatory test – frequency sweep was done at these conditions: constant strain (0.1 %), range of oscillation frequencies (0.1 – 20 Hz), measured with downward trend, maximal normal force during compression was 2 N. Both oscillation tests were realized at constant temperature (25 °C) by using flow thermostat (Haake DC5). The sensor used for determination of mechanical properties of agarose gels was plate/plate 40 mm (steel). Layer thickness of measured sample was 1 000 m in all cases. Measurements were repeated three times. 2.3.

Diffusion cell technique

Agarose hydrogels were prepared via thermo reversible gelation of aqueous solution of agarose (routine use class, < 10 wt. % moisture content). The concentration was chosen as 1 wt. %. Four hydrogels samples with different concentration of biomaterial were prepared. The concentration of biomaterial in the final hydrogel was 0.002 wt. %, 0.005 wt. % and 0.010 wt. %. The fourth sample was 1 wt. % agarose hydrogel without addition of biomaterial, as reference. Accurately weighted amount of agarose powder was dissolved in distillated water or in aqueous solution of HA, chitosan respectively. This mixture was heated to 85 °C; the transparent solution of agarose was degassed in ultrasonic bath for 1 minute at 85 °C. The hot solution after degassing was poured into the PTFE mold (40 mm in diameter and 5 mm thickness). Upon the cooling to the laboratory temperature liquid mixture gradually solidified into the cylindrical hydrogel sample. The hydrogel in the mold was placed between two chambers of diffusion cell. Source chamber was filled up by basic organic dye (Methylene Blue C.I. 52015 and Chicago Sky Blue 6B C.I. 24410) and on the other side (acceptor chamber) was distillated water. The change of concentration of organic dye was determined by UV-VIS fiber spectrometer USB 2000+ (Ocean Optics, Inc.) in the acceptor chamber of diffusion cell. The UV-VIS spectra were collected continuously at given time intervals. The water-jacketed side-by-side diffusion cell was 3 purchased by Permegear Inc. The diffusion cell volume of each solution was 60 cm . The stirring of solutions in source and acceptor chambers of diffusion cell was realized on magnetic stirrer (250 RPM).

th

th

Nov 5 – 7 2014, Brno, Czech Republic, EU 3.

RESULTS AND DISCUSSION

3.1.

Pore size determination

Pore size of 1 wt. % agarose hydrogel was determined by unconventional method (UV-VIS spectroscopy). Results obtained from this analysis clearly illustrate exponential decrease of pore size distribution with increasing concentration of agarose in hydrogel. Table 1 Pore size of agarose hydrogels with different concentration determined by UV-VIS spectroscopy Concentration of agarose (wt. %)

Wavelength exponent

Pore size (nm)

0.5

-2.40

800  12

1.0

-2.59

380  10

2.0

-3.06

160  8

4.0

-3,82

90  7

1 wt. % agarose hydrogel was chosen as optimal concentration of agarose in final hydrogel with respect to pore size distribution and mechanical properties. Average particle size of HA determined by dynamic light scattering was 459  8 nm [20], Because of this fact, the pore size of agarose hydrogels must be lower than average particle size of HA. 3.2.

Oscillatory measurements

viscoelastic modules (Pa)

The mechanical properties of agarose hydrogels with/without addition of HA/chitosan were compared by basic rheological parameters (storage modules (G’) and loss modules (G’’)). First of all, the strain sweep test was done. The main aim of this test is the determination of linear viscoelastic region (LVR). In this region, both modules (storage and loss) are independent on the amplitude of strain, the structure of hydrogel is able to resist to applied stress (reversible deformation). After overcome of LVR, hydrogels nodes are irreversible destroyed. The end of LVR is noticeable, when the storage module (G’) rapidly decrease and loss module (G’’) also decrease after slight increasing. The end of LVR is characterized by critical value of strain amplitude (last point when modules are independent on strain amplitude). Critical strain amplitude is similar for 1 wt. % agarose hydrogel in comparison with 1 wt. % agarose hydrogel with addition of HA. Enormous difference in mechanical properties of agarose hydrogels are seen after addition of chitosan. 1 % agarose 1 % agarose+0.01 % humic acids 1 % agarose+0.01 % chitosan

20000 16000 12000 8000 4000 0 0,01

0,1

1 10 strain amplitude (%)

100

Fig 1 Strain sweep test and of 1 wt. % agarose hydrogel with addition of HA respectively chitosan. Full symbols represent storage modules (G’) and empty symbols represent loss modules (G’’). Transport properties of final materials are significantly influenced by mechanical properties of agarose hydrogels. The transport properties of agarose hydrogel with addition of HA are not influenced by changes of mechanical properties. Changes in fundamental diffusion parameters at diffusion experiments are given only

th

th

Nov 5 – 7 2014, Brno, Czech Republic, EU by interactions of HA with organic dyes. However, transport properties of agarose hydrogels with addition of chitosan can be significantly influenced by changes in mechanical properties. The end of LVR in the case of chitosan is almost 10 times higher in comparison with agarose hydrogels with/without addition of HA. 3.3.

Stationary diffusion experiments

Our previous publication [7] clearly illustrate the effect of interactions between HA and Methylene Blue on the transport of this ionic dye in model aqueous environments provided by agarose hydrogel. The data presented in this paper continues with the same experimental approach. The reactivity of IHSS (International Humic Substances Society) standard HA (1S104H) is studied by interactions with Methylene Blue.

10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0

effective diffusion coefficient (m2∙s-1)

humic acids chitosan

0,000 0,002 0,005 0,010 concentration of biomaterial (wt. %)

break through time (hours)

First of all, the influence of concentration of IHSS HA was studied by diffusion cell technique. It is obvious that the small increase of concentration of HA in 1 wt. % agarose hydrogel slows down the rate of diffusion processes of Methylene Blue. Figure 2A summarized the effective diffusion coefficients for IHSS HA and for chitosan. In the case of chitosan, the different organic dye was used (Chicago Sky Blue 6B). This dye has higher molecular weight, therefore effective diffusion coefficient for pure agarose without addition of chitosan is lower in comparison with effective diffusion coefficient of Methylene Blue. The decrease of effective diffusion coefficients for Chicago Blue in the case of chitosan is not so significant in comparison with HA. Interaction of anionic compounds (organic dyes) with cationic chitosan is given mainly through amino groups in dissociated state. The presence of these functional groups is responsible for the fact, that chitosan is cationic biopolymer, which is able to immobilize and interact with different compounds, especially anionic. 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0

humic acids chitosan

0,000 0,002 0,005 0,010 concentration of biomaterial (wt. %)

Fig 2 Effective diffusion coefficients of organic dye as function of biomaterial concentration (A). Lag time of diffusion process as the function of biomaterial concentration (B) for chitosan and HA in both cases. Increasing content of HA in the hydrogel samples led to a considerable increase in absorbed amount of chosen dye in the hydrogel and to the decrease in steady-state diffusion flux. The total content of HA significantly affected also the value of lag time (Figure 2B) which indicates extensive physic-chemical interactions between diffusing organic dyes and HA contained in the hydrogel. When the binding capacity is depleted all of binding sites are occupied by molecules of organic dye. Lag time is indirectly connected with ability of samples to retain active compounds. 4.

CONCLUSIONS

The presented diffusion approach to study on reactivity of biomaterials provided comprehensive illustration of the influence of interaction between HA and cationic organic dyes (chitosan and anionic organic dyes) on barrier properties of these biomaterials and represent valuable approach in order to better understanding the behavior of these valuable compounds in their natural environment. Presented diffusion techniques should also become an universal method applicable for wide range of ionic compounds especially biomaterials at changing experimental conditions (temperature, ionic strength, modification of biomaterials etc.).

th

th

Nov 5 – 7 2014, Brno, Czech Republic, EU 5.

ACKNOWLEDGEMENT This work has been supported by Ministry of Education, Youth and Sports, Project LO1211.

6.

REFERENCES

[1]

STEVENSON, F. Humus chemistry: genesis, composition, reactions. 2. ed. New. York: John Wiley and Sons, 1994, 496 p.

[2]

MURPHY, E. M., ZACHARA, J. M., SMITH, S. C., PHILLIPS, J. L., WIETSMA, T. W. Interaction of Hydrophobic Organic Compounds with Mineral-Bound Humic Substances. Environmental Science. 1994, year 28, nr. 7, pages 1291-1299.

[3]

KALINA, M., KLUČÁKOVÁ, M., SEDLÁČEK, P. Utilization of fractional extraction for characterization of the interactions between humic acids and metals. Geoderma. 2013, year 207-208, pages. 92-98.

[4]

SENESI, N. Binding mechanisms of pesticides to soil humic substances. Science of The Total Environment. 1992, year 123-124, pages 63-76.

[5]

DELFINE, S., TOGNETTI, R., DESIDERIO, E., ALVINO, A. Effect of foliar application of N and humic acids on growth and yield of durum wheat. Agronomy for Sustainable Development. 2005, year 25, nr. 2, pages 183-191.

[6]

MARTYNIUK, H., WIECKOWSKA, J., DESIDERIO, E., ALVINO, A. Adsorption of metal ions on humic acids extracted from brown coals. Fuel Processing Technology. 2003, year 84, nr. 1-3, pages 23-26.

[7]

SEDLÁČEK, P., SMILEK, J., KLUČÁKOVÁ, M. How the interactions with humic acids affect the mobility of ionic dyes in hydrogels – Results from diffusion cells. Reactive and Functional Polymers. 2013, year 73, nr. 11, pages 1500-1509.

[8]

SEDLÁČEK, P., SMILEK, J., KLUČÁKOVÁ, M. How the interactions with humic acids affect the mobility of ionic dyes in hydrogels – 2. Non-stationary diffusion experiments. Reactive and Functional Polymers. 2014, year 73, pages 41-50.

[9]

RINAUDO, M. Chitin and chitosan: Properties and applications. Progress in Polymer Science. 2006, year 31, pages 603-632.

[10]

DI MARTINO, A., SITTINGER, M., RISBUD, M. V. Chitosan: A versatile biopolymer for orthopedic tissueengineering. Biomaterials. 2005, year 26, nr. 30, pages 5983-5990.

[11]

ESQUERDO, V. M., CADAVAL, T. R. S., DOTTO, G.L., PINTO, L.A.A. Chitosan scaffold as an alternative adsorbent for the removal of hazardous food dyes from aqueous solutions. Journal of Colloid and Interface Science. 2014, year 424, pages 7-15.

[12]

KIM, I.-J., SEO, S.-J., MOON, H.-S. YOO, M.-K., PARK, I.-Y., KIM, B.-C., CHO, C.-S. Chitosan and its derivatives for tissue engineering applications. Biotechnology Advances. 2008, year 26, nr. 1, pages 1-21.

[13]

MADIHALLY, S. V., MATTHEW, H. W. T. Porous chitosan scafolds for tissue engineering. Biomaterials. 1999, year 20, nr. 12, pages 1133-1142.

[14]

SUH, J.-K., MATHEW, H. W.T. Application of chitosan-based polysaccharide biomaterials in cartilage tissue engineering: a review. Biomaterials. 2000, year 21, nr. 24, pages 2589-2598.

[15]

DOTTO, G. L., MOURA, J. M., CADAVAL, T. R. S., PINTO, L. A. A. Application of chitosan films for the removal of food dyes from aqueous solutions by adsorption. Chemical Engineering Journal. 2013, year 214, pages 8-16.

[16]

REDDY, D., KUMAR, H., LEE, S.-M. Application of magnetic chitosan composites for the removal of toxic metal and dyes from aqueous solutions. Advances in Colloid and Interface Science. 2013, year 201-202, pages 68-93.

[17]

CRANK, J. The mathematics of diffusion. 2. ed., Oxford: Oxford University Press, 1975, 424 p.

[18]

ARAYANAN, J., JUN-YING, X., XIANG-YANG, L. Determination of agarose gel pore size: Absorbance measurements vis a vis other techniques. Journal of Physics. 2006, year 28, pages 83-86.

[19]

AYMARD, P., MARTIN, D. R., PLUCKNETT, K., FOSTER, T. J., CLARK, A. H., NORTON, I. T. Influence of thermal history on the structural and mechanical properties of agarose gels. Biopolymers. 2001, year 59, nr. 3, pages 31-44.

[20]

KALINA, M., KLUČÁKOVÁ, M., ENEV. V. Influence of Different Sources of Humic Acids, Applied Pre-treatment and Modifications on Their Behaviour in Aqueous Solutions. Natural Organic Matter: Structure-Dynamics Innovative Application. Ioannina: Greece. 2014, pages 275-276.

NOVÉ METODY STUDIA REAKTIVITY A TRANSPORTNÍCH VLASTNOSTÍ BIOKOLOIDŮ

Recommend Documents