KLASICKÉ A ALTERNATIVNÍ METODY STUDIA STRUKTURY A INTERAKCÍ BIOMOLEKUL

KLASICKÉ A ALTERNATIVNÍ METODY STUDIA STRUKTURY A INTERAKCÍ BIOMOLEKUL NÁVODY KE CVIČENÍM

VÁCLAV BRÁZDA BIOFYZIKÁLNÍ ÚSTAV AV ČR, V.V.I. 2. 3. – 6. 3. 2015

OPVK – Praktický kurz, 2015

KLASICKÉ A ALTERNATIVNÍ METODY STUDIA STRUKTURY A INTERAKCÍ BIOMOLEKUL NÁVODY KE CVIČENÍM

BIOFYZIKÁLNÍ ÚSTAV AV ČR, V.V.I. 2. 3. – 6. 3. 2015

ROZVOJ MODERNÍCH TRENDŮ V EXPERIMENTÁLNÍ BIOLOGII: VÝZNAM BIMOLEKULÁRNÍCH INTERAKCÍ PRO FUNKCI BUNĚČNÝCH STRUKTUR

OPERAČNÍ PROGRAM VZDĚLÁVÁNÍ PRO KONKURENCESCHOPNOST ČÍSLO PROJEKTU: CZ.1.07/2.3.00/30.0019

-3-


KLASICKÉ A ALTERNATIVNÍ METODY STUDIA STRUKTURY A INTERAKCÍ BIOMOLEKUL návody ke cvičením Václav Brázda Vydal: Biofyzikální ústav Akademie věd České republiky, v.v.i., Královopolská 135, 612 65 Brno, Česká republika Brno 2015 Česká Republika První vydání ISBN: 978-80-87541-06-7

-4-


Obsah Obsah ......................................................................................................................... 5 Kapitola 1: Transfekce savčích buněk, detekce genové exprese pomocí reporterových genů ..................................................................................................... 7 Transfekce savčích buněk ...................................................................................... 7 ELISA stanovení GFP ............................................................................................. 9 Detekce luciferázy ................................................................................................. 11 Kapitola 2: Polymerázová řetězová reakce........... Chyba! Záložka není definována. Izolace mRNA .................................................... Chyba! Záložka není definována. Reverzní transkripce .......................................... Chyba! Záložka není definována. qRT-PCR ........................................................... Chyba! Záložka není definována. Kapitola 3: Transformace, selekce a kultivace bakterií, izolace plazmidové DNA – restrikční analýza ...................................................................................................... 17 Transformace, selekce a kultivace bakterií ........................................................... 17 Izolace plazmidové DNA a restrikční analýza ....................................................... 19 Kapitola 4: Detekce strukturních přechodů v DNA pomocí CD spektroskopie ......... 21 I. B-A přechod ....................................................................................................... 21 II. B-Z přechod ...................................................................................................... 22 Kapitola 5: Aplikace elektrochemické analýzy v kombinaci s redox značením pro detekci specifických sekvencí a genové exprese ..................................................... 24

-5-


-6-


Kapitola 1: Transfekce savčích buněk, detekce genové exprese pomocí reporterových genů Garant: Václav Brázda

Transfekce savčích buněk Princip a cíl: Transfekcí je označován přenos cizorodého genetického materiálu do eukaryotických buněk. Existuje celá řada metodik transfekce, mezi nejstarší a nejčastěji používané patří chemická metodika transfekce fosforečnanem vápenatým. Použitá metodika transfekce fosforečnanem vápenatým je modifikací původní metodiky. Principem metody je vznik sraženiny fosforečnanu vápenatého s DNA, která je pohlcována endocytosou. Sraženina následně částečně uniká z endozomů nebo lysozomů a vstupuje do cytoplasmy, odkud prostupuje do jádra. Metoda transfekce fosforečnanem vápenatým je efektivní způsob zavedení DNA do buňky v mnoha systémech, nicméně v jiných může být zcela neefektivní. Nejlépe funguje v buněčných liniích, které rostou přisedlé, například u buněk Hela, U2OS, SAOS2, Ada a NPC-KT lze získat transfekční účinnost od 20% do 100% v závislosti na buněčné línii a podmínkách transfekce. Metoda funguje dobře pro vytváření jak tranzientní transformace, tak i pro generování stabilních buněčných linií. Metoda je citlivá na množství použitého plazmidu. Celkové množství transfekované DNA musí být cca 30g (pro 100mm misky). Pro efektivní transfekci je vhodné použít jako nosič plazmid bez eukaryotického promotoru (například pBluescript). Pro typické transaktivační pokusy používáme mezi 50- 500 ng transfekovaného plazmidu a cca 29 µg nosičového plazmidu. Nicméně pro funkční tranfekci je někdy nutné poměr upravit až na 5-10 µg příslušného expresního vektoru a 20-25 µg nosičové DNA. Je třeba mít na paměti několik důležitých aspektů. DNA přechází přes jadernou membránu pouze během mitózy. Nedojde tedy k expresi genu, dokud buňka neprojde mitózou. Po transfekci dochází k synchronizaci buněk, ty by se měli analyzovat nejméně 24 hodin po transfekci. Cílem je připravit buněčné línie 293F s reporterovými plazmidy a tak sledovat účinnost transformace: A) s luciferázovým expresním systémem pCNA3wtp3 a pMDM2-APP; B) s GFP proteinem pBRCA-GFP360-759. -7-


Pracovní postup: Pro tranfekci použijeme 6ti jamkové desky. 1. Den před transfekcí naředíme kulturu konfluentních buněk (70-90%) v poměru 1:10 do 1:15 (poměr závisí na buněčných liniích, které jsou transfekovány, rychleji rostoucí buněčné linie ředíme více, velmi pomalu rostoucí buněčné linie mohou být rozředěny méně než 1:10). 2. Druhý den ráno odlejte medium (DMEM (10% FBS, + pen / strep)) a přidejte 2ml čerstvého média. 3. Vlastní transfekce 5g celkové DNA s různým množstvím efektorového plazmidu dle tabulky (dopočítejte množství plazmidu pro transfekci).

A1

A2

A3

B1

B2

B3

Deska A1-A3 (plazmid s GPF) GFP plazmid

Označení

pBluescript

2400g/ml

A1

0

5 g

A2

20 ng

5 g

A3

1000 ng

4 g

Deska B1-B3 (plazmid s luciferázovým expresním systémem) Označení

pCNA3wtp53

pMDM2-ADP2

857g/ml

51g/ml

pBluescript

B1

0

500 ng

4,5 g

B2

100 ng

500 ng

4,4 g

B3

1000 ng

500 ng

3,5 g

-8-


4. Pro každou transfekci dejte 86 l 1X HBS do sterilní zkumavky. 5. Přidejte odpovídající množství DNA do každé zkumavky a promíchejte. 6. Přidejte do každé zkumavky 5 l 2,5M CaCl2 a promíchejte. 7. Inkubujte 20 minut při pokojové teplotě. 8. Přidejte k buňkám transfekční směs po kapkách a mírně míchejte - nemixujte! 9. Vložte do CO2 inkubátoru. 10. Další den vyměňte médium. 11. Pro stadium transientní exprese jsou buňky použity po 48-72 hodinách. Seznam chemikálií: 1X HBS 1 litr HEPES 5 g NaCl 8 g Dextróza 1 g KCl 3,7 g Na2HPO4 (7H2O) 10 ml zásobního roztoku 1. Přidejte H2O do cca 900 ml. 2. Upravte pH na 7,1 přesně. 3. Přidejte H2O do 1 litru. 4. Přefiltrujte přes sterilní filtr (0.2 m. 5. Rozdějte na alikvoty do sterilních zkumavek a uložte na -20°C. Na2HPO4 (7H2O) zásobní roztok = 0,94 g Na2HPO4 (7H2O) v 50 ml H2O 2.5M CaCl2 100ml CaCl2 27,75 g bezvodého CaCl2 nebo CaCl2 36,75 g CaCl2 (2H2O) Rozdělte na alikvoty do sterilních zkumavek 15 ml (10 ml do každé) a uložte v mrazničce.

ELISA stanovení GFP

-9-


Pro stanovení účinnosti transfekce je možné využít citlivé měření na ELISA readeru. Fluorescence GFP je ale rychle zhášena, proto se pro citlivé stanovení používá zpravidla fluorescenčně značená monoklonální protilátka proti GFP. V našem případě se pokusíme změřit přímo fluorescenci buněk při 509 nm a srovnáme intenzity signálu se stanovením transformantů s luciferázovým expresním systémem. Pracovní postup: 1. Odstraň médium z kultury buněk. 2. Omyj buňky 1x PBS. 3. Přidej k buňkám 1x Trypsin – 200 l na jednu jamku v 6-ti jamkové desce, (900 l na 100 mm misku 20 l na jamku v 96-ti jamkove desce) – a nech působit cca 5 minut. 4. Odsaj buňky s 1 ml média do zkumavky a stoč (mikrocentrifuga - 2000rpm 5min.). 5. Resuspenduj buňky ve 100 l média a dej na 96-ti jamkovou ELISA desku. 6. Připrav blank (100 l média). 7. Změř fluorescenci na ELISA readeru.

Seznam chemikálií a potřeb: PBS Trypsin Centrifuga ELISA reader s možností měření fluorescence

- 10 -


Detekce luciferázy Pro studium procesů spojených s genovou expresí se často používájí reporterové systémy. Dají se použít ke studiu expresní aktivity receptoru, intracelulární signální transdukce, skládání proteinů a studium interakcí. Luciferázový systém je používán zejména z následujích důvodů: • Aktivita transfekovaného genu je k dispozici ihned po překladu do proteinu a nevyžaduje její posttranslační zpracování. • Test je velmi citlivý a použité systémy nemají žádnou vnitřní luminiscenci. • Test je rychlý, vyžaduje pouze několik sekund na vzorek. Světlo je produkováno přeměnou chemické energie oxidací luciferinu prostřednictvím elektronového přechodu při tvorbě oxyluciferinu. Luciferáza katalyzuje oxidaci luciferinu pomocí ATP a Mg2+. Promega systém pro detekci luciferázy obsahuje koenzym A pro zlepšení kinetiky, což umožňuje větší enzymatickou výtěžnost a zvýšení světlelné intenzity a stability signálu po dobu nejméně jedné minuty. Při optimálních podmínkách je možné detekovat okolo 10-20 molů luciferázy.

Cílem je změřit chemiluminiscenci u pokusných vzorků připravených transformací plazmidů s luciferázovým expresním systémem.

- 11 -


Pracovní postup: 1.

Odstraň médium z kultury buněk.

2.

Omyj buňky 1x PBS (2ml).

3.

Nalej na buňky 1x lysis reagent –

200 l

na jednu jamku v 6-ti jamkové

desce

(900 l na 100 mm misku 20 l na

jamku

v 96jamkove desce). 4.

Seskřábni bunky z misky, přenes

buňky

do mikrozkumavky a odstraň

debris

(zbytky buněk na dně zkumavky) 5.

jemnou centrifugací (15s short

spin).

Přenes 20l supernatantu na

ELISA

desku. 6.

Připrav blank (20l 1x lysis reagent).

7.

Přidej 100l Luciferase Assay Reagent.

8.

Změř intenzitu chemiluminiscence ELISA readeru.

Seznam chemikálií a potřeb: Promega E1500 Luciferase Assay Systém PBS Škrabka Centrifuga ELISA reader s možností měření chemiluminiscence

- 12 -

na


Kapitola 2: Polymerázová řetězová reakce Garant: Václav Brázda

Princip a cíl úlohy Polymerázová řetězová reakce (PCR, Polymerase Chain Reaction) je enzymatická metoda umožňující zmnožení úseku DNA její replikací. PCR slouží k vytvoření až mnoha milionů kopií fragmentu DNA, což umožňuje provést analýzu DNA i z velmi malého vzorku. PCR probíhá v termocykleru, který dokáze během několika sekund zvýšit nebo snížit teplotu o několik desítek stupňů Celsia. Výsledkem PCR je obrovské množství kopií původní sekvence DNA. Metoda je tak citlivá, že dokáže v ideálním případě odhalit i jedinou molekulu DNA ve vzorku. Reverzní transkripční PCR (RT-PCR) se používá pro zmnožení DNA z RNA. Reverzní transkriptáza přepíše sekvenci RNA do cDNA. Tato metoda je používaná pro stanovení exprese genů. Pokud je známa genomová sekvence, může se tato metoda použít také pro mapování exonů a intronů. Kvantitativní PCR (qPCR) slouží k měření množství cílové sekvence. Zpravidla se využívají fluorescenčně značené sondy nebo značení DNA fluorescenční barvou, například SYBR Green pro měření signalu DNA v reálném čase. Pracovní postup – qPCR:

Izolace mRNA MagMAX-96 total RNA isolation kit AM1830 AB-Ambion Homogenizce vzorku 1. Připrav Lysis/Binding Solution -140 l na reakci (1 jamka na miske) - vždy čerstvý. Poměr LysisBinding Solution Concentrate: 100% izopropanolu 11:9). 2. Odstraň z buněk (2,5x102 – 2x106) médium a přidej 140 l Lysis/Binding Solution. 3. Míchej 1 minutu a poté dej zlyzované buňky do ELISA desky na izolaci. Purifikace nukleových kyselin 1. Připrav „Bead mix“ – smíchej 10 l RNA Binding Beads s 10 l Lysis/Binding Enhancer (množství na 1 reakci).

- 13 -


2. Přidej 20 l Mag-Bead Mix ke vzorku, míchej 5 min. 3. Vlož do magnetu a nech dokud se magnetické partikule s RNA neusadí (cca 2-3 minuty), poté odstraň opatrně supernatant. 4. Promyj 150 l Wash Solution 1, 1 minutu za míchání. 5. Vlož do magnetu a nech dokud se magnetické partikule s RNA neusadí (cca 2-3 minuty), poté opatrně odstraň supernatant. 6. Promyj 150 l Wash Solution 2 a dej míchat. 7. Dej do magnetu a nech dokud se magnetické partikule s RNA neusadí (cca 23 minuty), poté opatrně odstraň supernatant. 8. Připrav ředění TURBO DNase – 49 l MagMAX TURBO DNase Buffer + 1 l TURBO DNase (množství na 1 reakci).

Štepení DNA a čištění RNA 1. Přidej 50 l TURBO DNasy a míchej 10-15 min. při pokojové teplotě (bez magnetu!). 2. Přidej 100 l RNA Rebinding Solution, míchej 3 minuty. 3. Dej do magnetu a nech dokud se magnetické partikule s RNA neusadí (cca 23 minuty), poté opatrně odstraň supernatant. 4. Omyj 2x 150 l Wash solution 2 a dej míchat. 5. Dej do magnetu a nech dokud se magnetické partikule s RNA neusadí (cca 23 minuty), poté opatrně odstraň supernatant. 6. Vysuš Beads mícháním 2 minuty. 7. Přidej 50 l Elution buffer a míchej 3 minuty. 8. Dej do magnetu a nech dokud se magnetické partikule s RNA neusadí (cca 23 minuty), poté supernatant s mRNA přepipetuj do zkumavky pro další použití. 9. Změř vyizolovanou RNA na nanodropu.

- 14 -


Reverzní transkripce High Capacity RNA-to-cDNA Kit (PN 4387406) Použij až 2 g celkové RNA do 20 l reakce Nech kit rozmrznout na ledu, na reakci : 2x RT buffer

10 l

20x RT Enzyme mix

1 l

Nuclease free H20

do 20 l

Vzorek

až 9 l

1. Rozpipetuj reakční směs do zkumavek. 2. Uzavři zkumavky. 3. Stoč a dej na led. 4. Naprogramuj thermal cycler: a. Krok 1 – 37°C 60min. b. Krok 2 – 95°C 5min. c. Krok 3 – 4°C do nekonečna 5. Nastav objem reakce na 20 l. 6. Vlož stripy do cykleru. 7. Spusť. 8. Po ukončení reverzní transkripce přečistíme cDNA pomocí QIAquick Nucleotide Removal Kitu (Quiagene, 28306). 9. Změříme koncentraci cDNA na nanodropu. Uložení – do 24hod. 2-8°C, dlouhodobě -15 až -25°C

PŘEČIŠTĚNÍ PRODUKTU reverzní transkripce pomocí kitu (15 minut)

- 15 -


qRT-PCR na AB 7300 Příprava PCR reakce – SYBR Select Master Mix Připrav cDNA, pro optimální q-PCR použij množství cDNA do 100ng na 20l vzorek. Promýchej SYBR Select Master Mix před použitím. Pro optimální výsledky je doporučeno provést reakci ve čtyřech opakováních. Reakce pro 96-ti jamkovou desku: SYBR Select Master Mix

10 l

Primery (150-400nM) cDNA template (10 a 100ng) Celkem

20 l

Zamíchejte a opatrně stočte, aby byl vzorek bez bublin. Přeneste na PCR desku a uzavřete PCR vršky, lehce stočte, aby ve vzorcích nebyly bublinky (vlastní PCR by se měla jet do 72 hodin, vzorky uchovávejte ve tmě). Dejte do termocykleru AB 7300. Nastavte PCR reakci dle teploty tání (Tm) vašich primerů. 1. Aktivace

-

Hold 50°C 2 min.

2. Aktivace polymerázy

Hold 95°C 2 min.

3. 40 cyklů

Denaturace

95°C 15 sec.

4.

Anneal/Extend

60°C 1 min.

Nastavte dissociační krok. Nastavte objem reakce na 20 l. Spusťte „run“.

- 16 -


Kapitola 3: Transformace, selekce a kultivace bakterií, izolace plazmidové DNA – restrikční analýza Garant: Petr Šebest

Transformace, selekce a kultivace bakterií Princip úlohy: Transformace je přenos DNA (v našem případě se jedná o plazmidovou DNA) do hostitelských bakteriálních buněk. Bakteriální buňky musejí být nejprve uvedeny do stavu kompetence, ve kterém jsou schopny cizorodou DNA přijmout. Stav kompetence lze u buněk Escherichia coli navodit působením chloridu vápenatého za nízké teploty (0 °C). Po přidání DNA a zahřátí na 42 °C a následném ochlazení na 0 °C (teplotní šok) přechází transformující DNA do buněk. Transformované buňky se selektují na agarových plotnách obsahujících příslušné antibiotikum. Vyselektované buňky se přeočkují do média s antibiotikem a inkubují se přes noc při teplotě 37 °C. Úspešnost transformace je udávaná 1x109 cfu/µg superhelikální DNA. Pracovní postup: 1. den: 50 min. - 3 hod. přestavka – 10 min. 2. den: 15 min. Po celou dobu pracujte sterilně a se sterilním materiálem (špičky, hokejky, ependorfky). 1. Kompetentní buňky E. coli TOP10 udržujte na ledu a napipetujte do ependorfky 10 µl. 2. Přidejte příslušnou DNA (500 ng) – pBSK nebo pPGM1. 3. Nechejte 30 min. na ledu. 4. Rozehřejte termoblok na 42°C. 5. Transformace teplotním šokem: 45 sec. na 42°C a poté 5 min. na ledu. 6. Nechejte termoblok zchladnout na 37°C. 7. Přidejte 50 µl SOC média a nechejte kultivovat na termobloku 3 hod. při 37°C a 400 rpm. - 17 -


8. Vysejte na misky s Amp (napipetovat na misku a rozetřít hokejkou). 9. Inkubujte přes noc v termostatu při 37°C. 10. Z nejlepší kolonie odebrat špičkou buňky a přeočkovat do tekutého média s Amp, inkubujte na třepačce do druhého dne při 37°C

- 18 -


Izolace plazmidové DNA a restrikční analýza Princip úlohy: Plazmidy jsou mimochromozómové genofory tvořené kružnicovou dsDNA. V bakteriálních buňkách se vyskytují v jedné až několika tisících kopií na buňku a jsou snadno dostupným zdrojem homogenní DNA. V přirozeném stavu v buňce mají plazmidy zpravidla negativní nadšroubovicové vinutí. Pro izolaci plazmidů pBluescript a pPGM1 použijeme metodu alkalické lýze s přídavkem SDS (Invisorb Spin Plazmid Mini Two kit), která vede k uvolnění vnitřního obsahu buněk. Plazmidová DNA, chromozomální DNA a proteiny jsou denaturovány a v dalším kroku dochází k jejich precipitaci kromě plazmidové DNA, která je renaturována a zůstává v roztoku. Následně je zachycena na koloně a nakonec uvolněna elučním pufrem. Pro další analýzy plazmidů použijeme restrikční endonukleázy. Restrikční endonukleázy jsou součástí tzv. restrikčně modifikačních mechanismů bakterií. Tento systém je zajišťován dvěma druhy enzymových aktivit – metylační a restrikční. Enzymy s metylační aktivitou specificky modifikují (metylují) vlastní buněčnou DNA, čímž ji chrání před degradací restrikčními enzymy. Restrikční endonukleázy jsou bakteriemi využívány ke štěpení cizorodé DNA, která není v příslušných sekvencích metylována. Restrikční endonukleázy rozpoznávají krátké sekvence dvouřetězcové DNA a štěpí ji ve specifických místech nebo poblíž nich. V našem případě použijeme RE PvuII, která štepí námi izolovanou DNA ve 2 místech, takže získáme 2 fragmenty.

Obr.: Plazmidy použité při transformaci

- 19 -


Pracovní postup: 3. den: 3 hod. 1. 2 ml bakteriální kultury přenést do mikrocentrifugační zkumavky (ependorfky). 2. Centrifugujte v ependorfce 1 min. 13000 rpm a odlijte supernatant. 3. Rozsuspendujte pelet v 250 µl roztoku A vortexováním nebo pipetováním, tak aby nebyly viditelné žádné shluky buněk. 4. Přidejte 250 µl roztoku B, a zamíchejte opatrně otočením ependorfky 5 krát (ne však déle než 5 minut). Nevortexovat! 5. Přidejte 250 µl roztoku C a zamíchejte jemně ale důkladně zatřepáním 4 až 6krát. Centrifugujte 5 minut při otáčkách 13000 rpm. Nevortexovat! 6. V průběhu centrifugace si připravte čisté ependorfky a umístěte do nich vazebnou kolonu. 7. Přelijte supernatant na kolonu a inkubujte 1 min. Centrifugujte 1 min. při 10300 rpm. 8. Vylijte filtrát a přidejte 750 µl promývacího roztoku (wash solution). Centrifugujte 1 min. při 10300 rpm. Vylijte filtrát. 9. Stočte 3 min. při 13000 rpm, aby došlo ke kompletnímu odstranění zbytkového etanolu. 10. Umístěte kolonku do nové ependorfky a přidejte 50-100 µl elučního pufru. Inkubujte 1 min. (až 10 min.) při pokojové teplotě a nechejte centrifugovat 1 min. 10300 rpm. 11. Změřte koncentraci DNA na nanodropu. 12. 1 µg superhelikální DNA napipetujeme do čisté zkumavky. 13. Přidejte 1/10 objemu pufru z celkového výsledného objemu pro danou RE a 2U RE PvuII a vodu do výsledného objemu 20 µl. 14. Promýchejte a dejte na 37 °C/1 hodinu. 15. V mezičase připravte 1,3% agarózový gel s 1x TAE pufrem. 16. Naneste vzorky na agarózový gel 10 µl + 1ul nanášecího pufru. 17. Zapněte elektroforézu na 100 V na 45 minut.

- 20 -


Kapitola 4: Detekce strukturních přechodů v DNA pomocí CD spektroskopie Garant: Iva Kejnovská

Princip a cíl: Spektroskopická metoda cirkulárního dichroismu (CD) je velmi citlivá ke vzájemné orientaci bazí ležících nad sebou ve šroubovici nukleových kyselin. Jednotlivé struktury poskytují charakteristická spektra CD. Postupným přidáváním činidel je možné vyvolat přechod z jedné uspořádané struktury do druhé. Kooperativnost přechodu spočívá v tom, že v úzkém rozmezí měnících se podmínek dojde ke změně natočení bazí a přitom je překonána energetická bariéra mezi lokálními enegetickými minimy. Příkladem kooperativního přechodu je přechod mezi dvoušroubovicí formy B do formy A působením dehydratačního účinku trifluoretanolu (TFE). V závislosti na primárním složení DNA, tedy na obsahu bazí, je možné vyvolat stejným činidlem přechod do jiné stuktury. Ve druhé úloze s DNA složenou z opakující se CG sekvence působením TFE dojde k přechodu do levotočivé formy Z.

I. B-A přechod Pracovní postup: (120 minut) 1.

Do křemenné kyvety s optickou dráhou 1 mm napipetujte 60 l připraveného heteroduplexu DNA: GCGGCGACTGGTGAGTACGC . GCGTACTCACCAGTCGCCGC a přidejte 90 l 100% TFE. Opatrně promíchejte a změřte CD spektrum.

2.

V programu zadejte v General rozmezí vlnových délek 200–330 nm, krok 0,5 nm, s rychlostí posuvu 100 nm/min, 3 akumulace. Dále zvolte Information a do Sample name vepište název ukládaného souboru, např. T1.

- 21 -


3. Během měření vypočítejte koncentraci přidaného TFE dle vzorečku: V1c1 = V2c2 : V1 - přidaný objem TFE, c1 - % koncentrace přidanéhoTFE, V2 - celkový objem v kyvetě c2 - je koncentrace TFE v kyvetě 4. Pokračujte v přidávání TFE podle tabulky a měřte jednotlivá CD spektra s názvy Tn.

Přídavek TFE

Suma přidaného

l]

TFE l]

Celkový objem Koncentrace TFE Název CD spektra v kyvetě l]

[%]

90 30 30 35 45 Výsledek 1: poslední CD spektra odpovídají DNA ve formě A, výchozí formě B.

II. B-Z přechod Pracovní postup: (120 minut) 1. Do křemenné kyvety s roztoku oligonukleotidu (CG)4 a přidejte 84 l 100% TFE. Opatrně promíchejte a změřte CD spektrum. 2. V programu zadejte v General rozmezí vlnových délek 200–330 nm, krok 0,5 nm, s rychlostí posuvu 100 nm/min, 3 akumulace. Dále zvolte Information a do Sample name vepište název ukládaného souboru, např. Z1.

- 22 -


3. Během měření vypočítejte koncentraci přidaného TFE dle vzorečku: V1c1 = V2c2 : V1 - přidaný objem TFE, c1 - % koncentrace přidanéhoTFE, V2 - celkový objem v kyvetě c2 - je koncentrace TFE v kyvetě 4. Pokračujte v přidávání TFE podle tabulky a měřte jednotlivá CD spektra s názvy Zn.

Přídavek TFE

Suma přidaného

l]

TFE l]

Celkový objem Koncentrace TFE Název CD spektra v kyvetě l]

[%]

84 20 30 40 50 Výsledek 1: poslední CD spektra odpovídají DNA ve formě Z, výchozí formě B. Seznam potřebného vybavení a chemikálií:  dichrograf  křemenné kyvety  oligonukleotidy  trifluoretanol

- 23 -


Kapitola 5: Aplikace elektrochemické analýzy v kombinaci s redox značením pro detekci specifických sekvencí a genové exprese Garant: Jan Špaček

Princip a cíl: Detekce hybridizace DNA (analýza nukleotidových sekvencí) a analýza genové exprese patří mezi důležité úkoly moderní molekulární diagnostiky. Elektrochemické metody mohou hrát významnou roli ve vývoji nových detekčních technik v této oblasti. DNA je elektroaktivní biopolymer poskytující na různých pracovních elektrodách řadu analyticky využitelných signálů. V některých případech se jeví jako výhodnější přístup využití značení DNA elektroaktivnímy značkami, které poskytují vlastní elektrochemické signály. Aplikace těchto značek v analýze nukleotidových sekvencí je zvláště výhodná, neboť umožňuje velmi selektivně detekovat cílovou DNA (specifickou DNA) v nadbytku ostatní (nespecifické DNA). Jednou z metod, jak připravit takto značenou DNA je inkorporace chemicky modifikovaných nukleotid trifosfátů do DNA pomocí Polymerázové řetězové reakce (PCR). Tato úloha bude zaměřena na přípravu DNA obsahující 7-deazaguanin (dG*) a 7-deazaguanin modifikovaný nitrofenylem v poloze 7 (dGNO2) pomocí PCR a jejich následnou elektrochemickou detekci. O

dG*TP

HN H2N

O O O HO P O P O P O OOO-

N

O

NO2

dG N

TP

HN H2N

O O O HO P O P O P O OOO-

N

O OH

OH

- 24 -

NO2

O N


Pro procvičení před začátkem úlohy doplňte obrázek pojmy z tabulky: 5‘

elongace

templát

5‘

polymeráza

dNTP

3‘

annealing

3‘

primer

PCR Každá skupina připraví dvě reakční směsi značenou DNA a kontrolu k ní: 1. skupina: Reakční směs: PCR s dGNO2TP Reakční směs o celkovém objemu 100 µl bude obsahovat: 1 ng/µl templátové DNA (bluescript = plazmidová DNA) 3 U Pfu polymerázy 1x Pfu pufr 1 µM primery 0,2 mM dATP, dCTP, dTTP 0,1 mM dGTP a 0,1 mM dGNO2TP nebo 0,2 mM dGTP (kontrolní vzorek)

2. skupina: Reakční směs: PCR s dG*TP Reakční směs o celkovém objemu 100 µl bude obsahovat: 1 ng/µl templátové DNA (cDNA připravená v předchozí úloze) 3 U Pfu polymerázy - 25 -


1x Pfu pufr 1 µM primery 0,2 mM dATP, dCTP, dTTP 0,1 mM dGTP a 0,1 mM dG*TP nebo 0,2 mM dGTP (kontrolní vzorek) Takto připravené směsi rozdělte do malých, PCR, zkumavek po 30 µl. Reakční směsi v PCR zkumavkách umístěte do thermocycleru a spusťte program: 30 cyklů: Denaturace: 94°C, 90 s Nasedání primerů: 60°C, 30 s Prodlužování řetězců: 72°C, 180 s Počítací úloha Spočítejte, kolik molekul dATP je v každé PCR zkumavce (NA = 6,022·1023 mol-1) a jakou hmotnostní koncentraci mají oba primery dohromady v 30 µl výše popsané reakční směsi (délka 20 bazí, průměrná hmotnost nukleosid monofosfátu je 330 g·mol-1).

dATP =

koncentrace primerů =

Analýza PCR produktů na agarózovém gelu: Úspěšnost reakce zjistíme pomocí elektroforézy v 1 % agarózovém gelu (100 V / 30 min, 1x TAE pufr), následným obarvením gelu v ethidium bromidu a vyfocením po ozáření UV světlem.

- 26 -


Přečištění produktů PCR Produkt PCR je po dokončení reakce stále ve směsi s přebytkem nukleotidů a primerů, které by znemožnily elektrochemickou analýzu. Proto je nutné provést přečištění. To provedeme PCR purification kitem od firmy Qiagen podle standardního protokolu, který je součástí kitu.

Elektrochemické měření 1) PCR produkty značené dG* + kontrola: Analýza bude prováděna pomocí adsorptivní přenosové rozpouštěcí square wave voltametrie na „tužkové“ uhlíkové elektrodě v 0,2 M acetátovém pufru pH 5. Parametry měření: doba akumulace:

1 min

počáteční potenciál:

0,3 V

konečný potenciál:

1,5 V

frekvence:

200 Hz

2) PCR produkty značené dGNO2 + kontrola: Analýza bude prováděna pomocí adsorptivní přenosové rozpouštěcí cyklické voltametrie na visící rtuťové kapkové elektrodě ve 0,3 M fosfátovém pufru s mravenčanem amonným pH 7. Parametry měření: doba akumulace:

1 min

počáteční potenciál:

0V

potenciál bodu obratu:

-1,85 V a -0,75 V

konečný potenciál:

0 V a 0,1 V

rychlost posuvu potenciálu:

1 V/s

- 27 -

KLASICKÉ A ALTERNATIVNÍ METODY STUDIA STRUKTURY A INTERAKCÍ BIOMOLEKUL návody ke cvičením Václav Brázda Vydal: Biofyzikální ústav Akademie věd České republiky, v.v.i., Královopolská 135, 612 65 Brno, Česká republika Brno 2015 Česká Republika První vydání ISBN: 978-80-87541-06-7

Labolatoř molekulárních komplexů chromatinu

CEITEC a Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita

3. praktický

Kurz pokročilých mikroskopických technik 24. - 27. února 2015 Praktické seznámení s pokročilými mikroskopickými technikami, které jsou využitelné v laboratořích se zaměřením na experimentální biologii, biochemii a biofyziku. Budou představeny • Pokročilé mikroskopické techniky FRAP, FLIM, FRET, FCS • Účastníci se seznámí s konfokální mikroskopií a jejím využití pro in vivo experimenty a mikroskopii v reálném čase Místo konání Brno, Univerzitní kampus Bohunice, blok A2, seminární místnost 2.11 praktická výuka bude probíhat v laboratořích UKB Přihlášení Zájemci se přihlásí prostřednictvím e-mailu na [email protected] Ctirad Hofr, Ph.D. Seminář je organizován v rámci projektu OP VK Rozvoj moderních trendů v experimentální biologii: význam biomolekulárních interakcí pro funkci buněčných struktur CZ.1.07/2.3.00/30.0019.

www.modexbio.cz

Kurz pokročilých mikroskopických technik

9-10

Den 1

Den2

Úvodní přednáška metody konfokální mikroskopie a organizace kurzu

Přednáška: Teoretické základy časově rozlišené mikroskopie (FLIM)

Praktické seznámení s konfokálním mikroskopem Tipy a triky pro optimální nastavení

10-12

pozorování vzorků Úvod do analýzy obrazu v programu Photoshop Skupina A (5 osob) Photoshop Skupina B (5 osob) mikroskop Zeiss

Pozorování vzorků in vitro za použití časově rozlišené mikroskopie mikroskop Zeiss Skupina A (5 osob) Vyhodnocení výsledků in vitro měření FLIM Výuka software na kvantifikaci doby dohasínání Skupina B (5 osob) záměna skupin A a B

oběd

13-15

Základní nastavení pro FCS měření in vitro Příprava vzorků proměření za použití fluorescenční korelační spektroskopie mikroskop Zeiss Skupina A (5 osob)

Pozorování vzorků in vivo za použití časově rozlišené mikroskopie mikroskop Zeiss Skupina A (5 osob)

Analýza obrazu v programu Photoshop záměna skupin A a B

Vyhodnocení výsledků in vivo měření FLIM Výuka software na kvantifikaci doby dohasínání Skupina B (5 osob) záměna skupin A a B

Kurz pokročilých mikroskopických technik

9-10

10-12

Den 3

Den 4

Přednáška: Teoretické základy rezonančního přenosu energie a aplikace ve fluorescenční mikroskopii (FRET)

Přednáška: fluorescenční korelační spektroskopie FCS

Pozorování vzorků in vitro za použití rezonančního přenosu energie FRET Skupina A (5 osob) mikroskop Zeiss Skupina B (5 osob) mikroskop Olympus Vyhodnocení výsledků in vitro měření FRET Výuka software na kvantifikaci doby dohasínání Skupina B (5 osob) záměna skupin A a B

Základní nastavení pro FCS měření in vitro Příprava vzorků proměření za použití fluorescenční korelační spektroskopie mikroskop Zeiss Skupina A (5 osob)

oběd

13-15

Pozorování vzorků in vivo za použití kombinace FLIM a FRET Skupina A (5 osob) mikroskop Zeiss

Pozorování vzorků živých buněk metodou FCS mikroskop Zeiss Skupina A (5 osob)

Vyhodnocení výsledků in vivo měření FRET Výuka software na kvantifikaci doby dohasínání Skupina B (5 osob) záměna skupin A a B

Vyhodnocení výsledků měření FCS Výuka software ImageJ Skupina B (5 osob) záměna skupin A a B

Autofluorescence – an intrinsic property of cells arising from endogenous fluorophores (pyridinic and flavin coenzymes, aromatic amino acids, lipopigments) Specific fluorescence - fluorescent signals obtained by adding exogenous markers (fluorescent stains)

Patrycja Klos, PhD



http://zeiss-campus.magnet.fsu.edu/tutorials/basics/axioobserver/index.html

[email protected]

1

Patrycja Klos, PhD

Patrycja Klos, PhD, LifeB Laboratory

Autofluorescence – an intrinsic property of cells arising from endogenous fluorophores (pyridinic and flavin coenzymes, aromatic amino acids, lipopigments)



http://zeiss-campus.magnet.fsu.edu/tutorials/basics/axioobserver/index.html

Specific fluorescence - fluorescent signals obtained by adding exogenous markers (fluorescent stains)



Microscopy U

Pinhole


Photomultiplier tube


1









Fixation – stabilization/preservation of cells as close to lifelike as possible. Cross-linking fixation – chemical fixative (formaldehyde) binds to reactive groups on proteins and lipids and holds them in the same position as in living cells

SpectraViewer



Permeabilization – to allow antibodies/dyes to penetrate inside the fixed cells (detergents: Triton X-100, non-ionic) Blocking – to prevent the inappropriate binding of antibodies/compounds to nonspecific binding sites (BSA – bovine serum albumine – nonantigenic, binds charged sites) Patrycja Klos, PhD, LifeB Laboratory

 



No fixation/permeabilization Using dyes that can enter the cells without killing them (no antibody conjugates!) Expression of fluorescently-tagged proteins (GFP, EGFP, RFP, mCherry, YFP, etc...)






 

Similar spectral characteristics (358/461 vs. 346/460, when bound to DNA) UV-excited, minor groove-binding Hoechst 33342 can pass the cell membrane DAPI – passes the membranes less effectively in live cells DAPI – violet Hoechst 33342 - cyan



[email protected]

2

Manual for a course in advanced microscopic techniques, February 2015: 24. - 25.2.2015 Lectures: 

introduction to confocal microscopy and other advanced microscopy techniques  confocality  differences between wide field and confocal microscopy  advanced microscopy techniques (FRET, FLIM, FRAP, SPIM)  fluorescence correlation and cross-correlation spectroscopy (FCS/FCCS)

Practical session (Zeiss LSM 780 system): 

 

tips and tricks for optimal visualization of a sample  laser power  pinhole size  PMT voltage (gain)  offset  digital offset  averaging z-stack of Zygnema FCS single-color calibration experiment (Alexa Fluor 488 and Alexa Fluo 633, separately)

26. - 27.2.2015 Lectures: 

introduction to FCCS experiment in living cells

Practical session (Zeiss LSM 780 system):    

two-color calibration (Alexa Fluor 488 and Alexa Fluo 633, mixed) FCCS experiment: visualization of telomeric protein interactions (TRF2-TIN2) in living HEK293T cells analysis of autocorrelation and cross-correlation curve interpretation of acquired data (diffusion coefficient and diffusion time, triplet state, structural parameter).

KLASICKÉ A ALTERNATIVNÍ METODY STUDIA STRUKTURY A INTERAKCÍ BIOMOLEKUL

Recommend Documents