METODY STUDIA PROTEINŮ

METODY STUDIA PROTEINŮ Mgr. Vlasta Němcová [email protected]

OBSAH PŘEDNÁŠKY 1) Stanovení koncentrace proteinu 2) Stanovení AMK sekvence proteinu • •

Hmotnostní spektrometrie Edmanovo odbourávání

3) Obecné principy specifické detekce molekul 4) Vizualizace proteinů pomocí mikroskopických technik • • •

Imunohistochemie Fluorescenční a konfokální mikroskopie Elektronová mikroskopie

5) Stanovení míry exprese proteinu • • •

ELISA Průtoková cytometrie SDS-PAGE + Western blot

6) Stanovení fyziologické role proteinu • • •

Genový knock-out Genový knock-down pomocí siRNA Overexprese proteinu

1

1) STANOVENÍ KONCENTRACE PROTEINŮ

 založené na spektrofotometrickém stanovení (měření absorbance) • metoda podle Bradfordové • BCA metoda (Bicinchoninová metoda) • stanovení z UV spektra • atd.

2

METODA PODLE BRADFORDOVÉ (Bradford assay)  princip: kolorimetrická reakce po smíchání Bradfordova činidla s roztokem obsahujícím proteiny  Bradfordovo činidlo obsahuje barvivo Coomassie Brilliant Blue - váže se na bazické a aromatické aminokyselinové zbytky v proteinech (Arg, Phe, Try, Pro)  změna barvy roztoku z hnědé na modrou  detekce při 595 nm

Blank Koncentrace proteinu

BCA METODA (BCA assay)  detekční činidlo obsahuje BCA (bicinchoninic acid)  kolorimetrická reakce založena na interakci činidla přímo s peptidovou vazbou (a ne pouze s určitými AMK)

 purpurové zbarvení detekovatelné při 562 nm

Blank Koncentrace proteinu

3

PRINCIP STANOVENÍ KONCENTRACE PROTEINŮ  nutno vytvořit kalibrační křivku ze série roztoků o známé koncentraci proteinu

Absorbance (A595 nm)

 nejčastěji je používán bovinní sérový albumin (=BSA) 0.500 y = 0.2286x + 0.0008 R² = 0.9996

0.400

Změřená hodnota absorbance 0.300 0.200 0.100

Zjištěná koncentrace proteinu 0.000 0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

1.6

1.8

2

2.2

BSA (ug/ul)

STANOVENÍ Z ABSORBANCE V UV OBLASTI  proteiny absorbují v UV spektru (260 - 280 nm) díky přítomnosti aromatických aminokyselin (tyrosin a tryptofan, méně cystein)  není nutná kalibrační křivka  výpočet dle rovnice [Protein] (mg/mL) = 1.55*A280 - 0.76*A260

 všechny metody založené na přítomnosti pouze určitých aminokyselin předpokládají stejné zastoupení těchto AMK ve vzorcích !!!

4

2) STANOVENÍ AMINOKYSELINOVÉ SEKVENCE PROTEINŮ  Edmanovo odbourání  Hmotnostní spektrometrie

EDMANOVO ODBOURÁNÍ  označení N-koncové AMK a její odštěpení od zbytku AMK řetězce  identifikace AMK pomocí chromatografie anebo elekroforézy  limitace délkou peptidového řetězce – max. cca 30 AMK (delší proteiny nutno nejdříve naštěpit na kratší fragmenty)

5

HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETRIE  mass spectrometry  detekce molekulové hmotnosti proteinových fragmentů

HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETRIE

 porovnání hmotnostního spektra získaného analýzou vzorku s dostupnými databázemi proteinů  nalezení AMK sekvence proteinu (nebo identifikace neznámého proteinu)

6

3) OBECNÉ PRINCIPY SPECIFICKÉ DETEKCE MOLEKUL (nejen proteinů)  zajištění specifické detekce  možnosti detekce signálu

ZAJIŠTĚNÍ SPECIFICKÉ DETEKCE  „nalezení“ detekované molekuly ve vzorku – na základě známé a specifické interakce jiné molekuly s detekovanou molekulou Touto molekulou umožňující detekci může být: 1. malá organická molekula – molekula, která se specificky váže k cílovému proteinu (např. phaloidin k F-aktinu, DAPI a ethidium bromid k DNA)

2. protein, o kterém je známo, že interaguje s detekovaným proteinem ( např. DNáza I s G-aktinem) 3. protilátka specificky rozpoznávající detekovaný protein (IMONODETEKCE) - nejčastěji používaný systém pro detekci proteinů, protože protilátku lze připravit proti jakémukoliv proteinu

7

PŘÍMÁ A NEPŘÍMÁ IMUNODETEKCE Přímá detekce

Nepřímá detekce detekovatelný produkt

detekovatelný produkt substrát

substrát

amplifikace signálu enzym

enzym

sekundární protilátka primární protilátka

 značená primární protilátka

 neznačená primární protilátka + značená sekundární protilátka (sekundární protilátka interaguje s Fc fragmentem primární protilátky  váže se na všechny protilátky vytvořené určitým živočišným druhem)

MOŽNOSTI DETEKCE SIGNÁLU  s detekovanou molekulou interagující molekula obvykle není schopna produkovat detekovatelný signál  detekující molekula konjugována s jinou molekulou umožňující vizualizaci Touto molekulou umožňující detekci může být:

1. těžký kov 2. fluorofor 3. enzym, jehož enzymová aktivita umožňuje vizualizaci detekované molekuly

8

MOŽNOSTI DETEKCE SIGNÁLU  s molekulou použitou pro detekci cílového proteinu může být konjugován:

1) těžký kov - nejčastěji koloidní zlato („imunogold labeling“)

 Somatostatin v D buňkách pankreatu

MOŽNOSTI DETEKCE SIGNÁLU  s molekulou použitou pro detekci cílového proteinu může být konjugován: 2) fluorofor = molekula schopná absorbovat záření určité vlnové délky a vyzářit (emitovat) záření jiné vlnové délky (=detekovaný signál) - při použití různých fluoroforů– možnost sledování kolokalizace molekul (výskyt na stejné buňce nebo stejném místě v buňce)

 Pr: detekce cirkulujících nádorových buněk odvozených od epiteliálních nádorů (DNA barvená DAPI, anti-CD45 -FITC, anti-cytokeratin -TRITC)

9

MOŽNOSTI DETEKCE SIGNÁLU  s molekulou použitou pro detekci cílového proteinu může být konjugován:

3) enzym – vizualizace detekované molekuly po reakci se substrátem  chemiluminiscence – jako enzym se obvykle používá křenová peroxidáza (= horse radish peroxidase = HRP) – štěpí luminol za vzniku světla, které je detekováno  chromogenní (barevná reakce) – vzniká barevný produkt - míra zbarvení může být měřena  kvantifikace detekované molekuly - např. enzym alkalická fosfatáza (= AP) •

•

produkt reakce musí být nerozpustný, pokud chceme vidět lokalizaci detekované molekuly produkt reakce musí být rozpustný, pokud chceme měřit intenzitu vzniklého zabarvení v roztoku

3) VIZUALIZACE PROTEINŮ POMOCÍ MIKROSKOPICKÝCH TECHNIK  imunohistochemie  fluorescenční a konfokální mikroskopie  elektronová mikroskopie

10

IMUNOHISTOCHEMIE  detekce v mikroskopickém preparátu (obvykle tenký řez tkáně)  obvykle pomocí specifických protilátek a barevné reakce za vzniku nerozpustného produktu

FLUORESCENČNÍ MIKROSKOPIE

 excitační filtr umožňuje výběr vlnové délky pro excitaci fluoroforu, světlo jiné vlnové délky je emitováno fluoroforem a je propuštěno bariérovým filtrem do okuláru  lze detekovat signál vždy jen od jednoho fluoroforu, při vícenásobném značení se musí obraz do vícenásobného skládat počítačově)

11

FLUORESCENČNÍ vs. KONFOKÁLNÍ MIKROSKOPIE  fluorescenční mikroskop – do okuláru se dostává signál z celé vrstvy tkáně (nebo z celé „výšky“ buňky), nelze spolehlivě detekovat vzájemnou pozici molekul, protože signál z různých vrstev vzorku se překrývá

FLUORESCENČNÍ vs. KONFOKÁLNÍ MIKROSKOPIE  konfokální mikroskop – do okuláru se díky konstrukci mikroskopu dostává signál pouze z jedné roviny preparátu (tzv. konfokální roviny) – možnost detekce vzájemné lokalizace molekul

12

FLUORESCENČNÍ vs. KONFOKÁLNÍ MIKROSKOPIE

 modrá – DNA barvená DAPI  zelená– volný aktin (G-aktin) barvený pomocí konjugátu DNázy I s fluoroforem AlexaFluor 488  červená – polymerizovaný aktin (F- aktin) barvený konjugátem phaloidinu s fluoroforem TRITC  volba typu mikroskopie závisí na tom, co chceme pozorovat a jakou informaci chceme získat

GFP = green fluorescent protein  protein s přirozenou schopností fluorescence, izolovaný původně z medúzy Aequorea victoria (zelená fluorescence po osvícení modrým světlem)  používán jako reporterový protein pro studium lokalizace proteinů a jejich dynamiky i v živých buňkách (sekvence DNA kódující tento protein vložena za gen kódující zkoumaný protein tak, aby došlo k expresi zkoumaného proteinu s připojeným GFP)  v takto upravených buňkách/tkáních lze po excitaci příslušnými vlnovými délkami detekovat signál GFP, který ukazuje lokalizaci zkoumaného proteinu  podařilo se vyrobit organismy, které mají expresi GFP ve všech molekulách těla

13

ELEKTRONOVÁ MIKROSKOPIE  Protilátka obvykle značená koloidním zlatem

 Somatostatin v D buňkách pankreatu

4) STANOVENÍ MÍRY EXPRESE PROTEINŮ  ELISA  SDS-PAGE + Western blot  Průtoková cytometrie (bude vysvětleno v přednáškách Ústavu imunologie)

 metody založené nejčastěji na použití specifických protilátek

14

ELISA = enzyme-linked immunosorbent assay = EIA (= enzyme immunoassay)

 používaná zejména v imunologii  první rutinně používaná metoda pro detekci HIV infekce  umožňuje detekci i kvantifikaci antigenu nebo protilátky ve vzorku – tělesná tekutina (plazma, sérum, moč, …)  detekce založená na interakci antigen-protilátka provedené in-vitro, obvykle v 96-jamkové destičce  předchůdce – metoda RIA (=radioimmunoassay) – nutné použití radioaktivně značených antigenů nebo protilátek

ELISA  použití:  detekce hladin protilátek (alergie, vakcinace, …)  detekce virových infekcí (hepatitis B, hepatitis C, HIV-1, HIV-2, pohlavně přenosné choroby)  detekce hladin hormonů (HCG v těhotenství, LH, TSH, T3, T4)  detekce prozánětlivých markerů v krvi (cytokiny)  …

15

ELISA – jak vznikl název metody (enzyme-linked immunosorbent assay)

 imobilizace antigenu/protilátky na plastik 96-jamkové destičky (…sorbent… vazba na plastik zjednodušuje veškeré promývání)  vazba detekované molekuly ze vzorku na imobilizovaný antigen/protilátku  vazba specifické protilátky konjugované s enzymem umožňujícím detekci na tuto molekulu (….imuno… - protilátka umožnuje specifickou detekci)  detekce signálu po přidání substrátu enzymatické reakce (enzyme-linked … - signál vzniká a je zesílen pomocí enzymem katalyzované reakce)

ELISA - TYPY  přímá (detekované agens je imobilizováno přímo na plast destičky, primární protilátka je značena enzymem umožňujícím detekci)

 nepřímá (detekované agens je imobilizováno přímo na plast destičky, sekundární protilátka je značena enzymem umožňujícím detekci)

 sendvičová (detekované agens se váže na specifickou protilátku imobilizovanou v destičce, poté je detekováno kombinací neznačené primární a značené sekundární protilátky)

 kompetitivní (detekované agens je smícháno s totožným agens, které je značeno enzymem umožňujícím detekci – dochází ke kompetici agens značeného a neznačeného (ze vzorku) o vazbu na protilátku imobilizovanou na destičce, signál po přidání substrátu vytváří jen agens značené – čím více detekovaného agens ve vzorku, tím větší kompetice se značeným agens, tím méně značeného agens se váže na destičku, tím méně signálu)

16

ELISA - TYPY Substrate Substrate Substrate Secondary antibody conjugate

Primary antibody conjugate

Primary antibody

přímá

Capture antibody

nepřímá

sendvičová

ELISA – TYPY kompetitivní ELISA

17

KVANTIFIKACE DETEKOVANÉ MOLEKULY • detekce intenzity zabarvení jamek pomocí spektrofotometru (ELISA reader) – detekce absorbance při příslušné vlnové délce • intenzita barvy odpovídá přímo úměrně množství detekovaného antigenu nebo protilátky (pouze u kompetitivní ELISy se jedná o nepřímou úměrnost) • nutná kalibrace testu – použití ředicí řady standardů (antigen nebo protilátka totožné s detekovanými) – z hodnot známých koncentrací standardů a jim příslušejících absorbancí se sestaví závislost (graf), ze které se vypočítá koncentrace detekovaného antigenu/protilátky

SDS-PAGE  separace proteinů podle molekulové hmotnosti  = sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis  proteiny nutno před separací denaturovat – za pomoci denaturačních činidel (SDS, merkaptoethanol nebo dithiotreitol, a tepla)

 separaci postupují jednotlivé polypeptidové řetězce proteinů (zachovaná pouze primární struktura)

18

SDS-PAGE  SDS dává proteinům homogenní záporný náboj (stejný na jednotku délky proteinu)  separace proteinů víceméně pouze podle molekulové hmotnosti  proteiny jsou záporně nabité – pohyb v elektrickém poli ke kladné elektrodě (ANODA)

SDS-PAGE

_ +

 záporně nabité proteiny taženy ke kladné elektrodě  čím delší polypeptidový řetězec, tím více inhibován při průchodu gelem  kratší proteiny doputují dále než delší

19

SDS-PAGE  molekulová hmotnost detekovaného proteinu jde zjistit porovnáním jeho velikosti s markerem molekulových hmostností = komerčně dostupná směs proteinů o známých velikostech

 jednotka molekulové hmotnosti používaná pro proteiny je Dalton (1 000 Da = 1 kDa)  1 Da odpovídá hmotnosti atomu vodíku

WESTERN BLOT  použití nejčastěji pro porovnání míry exprese proteinů  přenos proteinů separovaných pomocí SDS-PAGE na povrch vázající proteiny (nitrocelulózová nebo PVDF membrána)  pohyb záporně nabitých proteinů v elektrickém poli z gelu na membránu

 proteiny přeneseny na membránu ve stejné vzájemné pozici –vzniká „otisk“ (blot) gelu na mebráně  detekce proteinu na membráně pomocí specifických protilátek (membrána umožňuje jednoduchou manipulaci )

20

WESTERN BLOT

 detekce konkrétních proteinů obvykle pomocí specifických protilátek a chemiluminiscence nebo barevné reakce za vzniku nerozpustného produktu

BiP

P-c-Jun

PARP

Aktin

Aktin

Aktin

0.2 mM OA

1 mM SA + 0.2 mM OA

1 mM SA

Control

0.2 mM OA

1 mM SA + 0.2 mM OA

1 mM SA

Control

0.2 mM OA

1 mM SA + 0.2 mM OA

1 mM SA

Control

WESTERN BLOT – příklady detekce

 pro porovnání exprese mezi jednotlivými vzorky je nutné analyzovat stejné množství proteinu ve všech vzorcích  průkaz stejné nanášky detekcí některého housekeeping proteinu (aktin, tubulin, GAPDH, …)

21

2D-ELEKTROFORÉZA  kombinace 2 typů separace 1) isoelektrická fokusace 2) SDS-PAGE

5) STANOVENÍ FYZIOLOGICKÉ ROLE PROTEINU  Genový knock-out  Genový knock-down pomocí siRNA  Overexprese proteinu

22

GENOVÝ KNOCK-OUT  obě alely určitého genu odstraněny nebo nefunkční

 studium „loss-of-function“ mutací“ - sledování změn fenotypu, jaké orgány postiženy, …  ztráta některých genů je letální už v embryonálním vývoji  vs. transgenní organismus - vnesen gen

Knock-out kaspázy 9 u myši  defekt vývoje mozku

GENOVÝ KNOCK-DOWN A siRNA TECHNOLOGIE  siRNA = small interfering RNA  snížení exprese proteinu využitím buněčných mechanismů obrany proti dsRNA (mechanismy protivirové obrany)  transfekce buněk dsRNA o délce cca 20 nt (sekvence vychází ze sekvence genu, jehož exprese je inhibována)  sledován efekt výrazného snížení exprese příslušného proteinu

23

OVEREXPRESE PROTEINU  sledování efektu nadbytku určitého proteinu (nebo jeho konstitutivně aktivní či inaktivní formy)  za účelem purifikace proteinu pro jinou metodu, např. pro zjištění enzymové kinetiky, 3D struktury  nutno transfekovat buňky expresním vektorem obsahujícím sekvenci kódující příslušný protein  k pomnožení expresních vektorů lze využít bakteriální buňky (transformace expresním vektorem)

STUDIJNÍ LITERATURA & UŽITEČNÉ ODKAZY Základní literatura: Alberts B. et al: Molecular Biology of the Cell, 5. vydání, str. 517-522, 566568, 585-593, 604-607

Další materiály k fluorescenci a průtokové cytometrii pro zájemce: http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/support/Tutorials.html

24