Signalizace heterotrimerními G-proteiny u rostlin

Univerzita Karlova v Praze Katedra experimentální biologie rostlin

Signalizace heterotrimerními G-proteiny u rostlin

Josef Šonka

Vedoucí práce RNDr. Miroslav Srba

Bakalářská práce 2012

Prohlašuji, že jsem předloženou práci vypracoval samostatně pod vedením školitele RNDr. Miroslava Srby. Literární zdroje přejatých informací jsou citovány V Praze dne:

Podpis:

Poděkování

Tímto chci velmi poděkovat svému školiteli RNDr. Miroslavu Srbovi za odpovědné vedení, trpělivost a cenné konzultace. Dále bych rád poděkoval rodině a svým blízkým za podporu a vytvoření dobrého zázemí.

Abstrakt G-proteinová signalizace je klíčovým mechanizmem interakce buněk s okolním prostředím. U živočichů, hub a hlenek má velký význam pro koordinaci buněčného dělení a diferenciaci buněk. Výzkum toho typu signalizace má i značný význam v klinické praxi. Předkládaná práce shrnuje poznatky o významu a principech signalizace heterotrimerními G-proteiny u rostlin, publikované od prvních záznamů po rok 2012.

Klíčová slova: AtRGS1, NtRGS1, AGB1, AGG1, RGS, G-protein, receptor vázaný na G-proteiny, regulátor G-proteinové signalizace, cévnaté rostliny, vývoj rostlin, morfogeneze, diferenciace, buněčný cyklus, dělení, Arabidopsis thaliana, Nicotiana tabaccum

Abstract G-protein signalling is a key mechanism of cells interaction with the environment. It has a great significance for the coordination of cell division and differentiation in animals, Fungi and Mycetozoa. The research of this type of signalling has also a large consequence in clinical practise. This work summarizes the findings of the importance and principles of heterotrimeric G-proteins signalling in plants which have been published since the first records up to 2012.

Key words: AtRGS1, NtRGS1, AGB1, AGG1, RGS, G-protein, G-protein coupled receptor, Regulator of G-protein signalling, vascular plants, plant development, morphogenesis, differentiation, cell cycle, proliferation, Arabidopsis thaliana, Nicotiana tabaccum

Obsah

1. Úvod ....................................................................................................................................... 7 2. Základní model G-proteinové signalizace .............................................................................. 8 3. Monomerní G-proteiny (malé GTPázy) ............................................................................... 10 4. Podjednotka Gα .................................................................................................................... 11 5. Podjednotka Gβ .................................................................................................................... 18 6. Podjednotky Gγ .................................................................................................................... 22 7. Receptory vázané na G-proteiny .......................................................................................... 25 8. Regulártor G-proteinové signalizace .................................................................................... 27 9. Závěr..................................................................................................................................... 31 10. Seznam použité literatury ................................................................................................... 33

Seznam použitých zkratek ABA

kyselina abscisová

AK

aminokyselina

BY-2

odvozená linie tabákových buněk

cDNA

komplementární DNA

FRET

z anglického Fluorescence Resonance Energy Transfer

GA3

kyselina giberelinová

GAP

protein aktivující GTPázovou aktivitu

GDP

guanosindifosfát

GEF

faktor ovlivňující výměnu nukleotidů

GPCR

receptor G-proteinové signalizace

GTP

guanosintrifosfátu

Gα

α podjednotka heterotrimerního G-proteinu

Gαβγ

heterotrimer G-proteinu

Gβ

β podjednotka heterotrimerního G-proteinu

Gβγ

heterodimer βγ

Gγ

γ podjednotka heterotrimerního G-proteinu

ORF

otevřený čtecí rámec

PLDα1

fosfolipáza D alfa 1

RGS

regulátor G-proteinové signalizace

1. Úvod Buňka je základním stavebním prvkem všech živých organismů. Pro vznik, vývoj a správné fungování mnohobuněčného organismu je klíčové zpracování vnějších signálů buňkami a vzájemná koordinace buněčného dělení a diferenciace. V případě živočichů (Metazoa) a jim příbuzných vyšších taxonů, jako jsou houby (Fungi) a hlenky (Mycetozoa) hraje jednu z nejvýznamnějších rolí v příjmu těchto signálů komplex heterotrimerních G-proteinů. Poruchy v této signalizaci mají i významné klinické důsledky (některé typy diabetu, alergie, slepoty a rakovinného bujení) (přehled viz. Lodish et al., 2008). Výzkumu G-proteinové signalizace je proto přikládán velký význam. O důležitosti G-proteinové signalizace svědčí také udělení Nobelovy ceny za medicínu a fyziologii Martinu Rodbellovi a Alfredu G. Gilmanovi v roce 1994. Ti objasnili regulaci aktivity adenylát cyklázy pomocí G-proteinů. Cílem této práce je shrnutí současných poznatků o významu a principech signalizace heterotrimerními G-proteiny u rostlin.

7

2. Základní model G-proteinové signalizace Jeden z mnoha mechanizmů interakce buňky s prostředím je kromě jiného zprostředkován pomocí heterotrimerních G-proteinů. Jedná se o proteiny, skládající se ze tří podjednotek, Gα, Gβ a Gγ, přičemž Gβ a Gγ spolu vytváří trvalý heterodimer. Název G-protein je odvozen od jeho schopnosti vázat guaninové nukleotidy (guanosintrifosfát - GTP a guanosindifosfát GDP). Za vazbu těchto nukleotidů je odpovědná Gα podjednotka, na které je vazebné místo. V případě, že je na Gα navázáno GDP asociuje tato podjednotka s heterodimerem Gβγ a vytváří tak heterotrimer. Ten je lokalizován v plazmatické membráně. Výměna GDP za GTP na Gα je iniciována navázáním ligandu na specifický receptor GPCR (G-protein coupled receptor). Tento receptor má specifickou strukturu. Jedná se o 7 transmembránových smyček s N- koncem v extracelulárním prostoru a s C- koncem v cytosolu. Po vazbě ligandu z extracelulárního prostoru na receptor dochází k jeho konformační změně a k asociaci s heterotrimerem, na jehož Gα podjednotce je navázáno GDP. To je vyměněno za GTP a dochází k disociaci Gα podjednotky a komplexu Gβγ. Dále dochází k asociaci buď Gα podjednotky, anebo komplexu Gβγ, případně obou, s efektorovým proteinem, který se tím aktivuje. Díky schopnosti Gα podjednotky hydrolyzovat GTP, které má na sobě navázané, dochází k autoregulaci aktivity Gα. Po hydrolýze GTP na GDP dochází opět k asociaci s dimerem Gβγ. K hydrolýze přispívají také regulátory G-proteinové signalizace RGS (receptor of G-protein signaling) (přehled viz. Lodish et al., 2008). Tyto regulátory se vyskytují většinou volně v cytoplazmě, ovšem u vyšších rostlin je tento regulátor spojen s membránovou doménou, připomínající živočišné receptory GPCR (Chen et al., 2003). Regulátory zvyšují rychlost hydrolýzy GTP navázaného na Gα podjednotce a tím zprostředkovaně i katalyzují reasociaci s dimerem Gβγ. Celkově tak regulátory zvyšují dynamiku reakce při odpovědi na navázáný ligand (přehled viz. Lodish et al., 2008).

8

Extracelulární prostor

Plasmatická membrána Efektor Enzym Iontový kanál Intracelulární prostor

Druzí poslové

Obr. 1: Obecné schéma znázorňující GPCR s komplexem heterotrimerního G-proteinu a následnou disociaci Gα podjednotky po její aktivaci navázáním GTP (Cell Mosaic, dostupné z http://www.cellmosaic.com/gpcr-reagent-tools/).

9

3. Monomerní G-proteiny (malé GTPázy) Tato práce je zaměřená na heterotrimerní G-proteiny, a proto je zde pojednání o monomerních G-proteinech jen velmi stručné. Nicméně vzhledem k jisté podobnosti malých GTPáz s Gα podjednotkou heterotrimerních G-proteinů, je nutné se o nich alespoň zmínit. Malé GTPázy byly nalezeny u všech organismů. Stejně jako Gα podjednotky heterotrimerních G-proteinů, malé GTPázy přepínají mezi aktivním a neaktivním stavem. Navázáním GTP se aktivují a jeho hydrolýzou na GDP se inaktivují. Na rozdíl od Gα podjednotek vykazují monomerní GTPázy nižší GTPázovou aktivitu. Monomerní G-proteiny vykazují velkou konzervovanost napříč všemi organismy, od kvasinek až po savce. Tyto proteiny ovlivňují například integritu některých organel, endo a exocytické procesy, rozšiřování endoplasmatického retikula, tvorbu váčků na Golgiho aparátu, cytoskeletární procesy, aktivaci lipáz a kontrolu transkripce (přehled viz. Bischoff et al., 1999). Nadrodina monomerních G-proteinů se dá rozdělit na rodiny Ras, Rab, Arf/Sar, Rho, Ran. Rodina proteinů Ras je striktně vázaná k plasmatické membráně a je zakomponována převážně v regulaci buněčného růstu a dělení. Rab ovlivňují směr a specifitu transportu váčků, tedy endo a exocytické děje. Rodina Arf/Sar obsahuje 2 skupiny GTPáz, Arf hrají roli v membránovém transportu a aktivaci fosfolipázy D (PLD), Sar se nejvíce podobají Gα podjednotkám heterotrimerních G-proteinů a rovněž ovlivňují membránový transport. Rho se účastní regulace buněčných pohybů přes organizaci aktinového cytoskeletu, také jsou schopny aktivovat PLD. Ran se účastní ve spolupráci s dalšími proteinovými komplexy na importu proteinů se signalizační sekvencí do jádra (přehled viz. Bischoff et al., 1999).

10

4. Podjednotka Gα U cévnatých rostlin byl doposud objeven pouze jeden gen kódující α podjednotku Gproteinového heterotrimeru (Gα). Například u Arabidopsis (GPA1), tabáku (NtGA1) nebo u rýže (RGA1). Kódované Gα proteiny jsou na aminokyselinové úrovni z 30 – 40 % podobné nerostlinným Gα proteinům (Jones & Assmann, 2004). Vzájemná identita rostlinných proteinů je pak podstatně vyšší. U tabáku vykazuje 75,5 – 99,8% homologii s ostatními rostlinnými proteiny. (Ando et al., 2000). Počet aminokyselin v primární struktuře proteinu se pohybuje okolo necelých 400. U Arabidopsis thaliana je to 383 aminokyselin (Hong et al., 1990), u Nicotina tabacum 384 (Ando et al., 2000). Zajímavý byl také objev dvou velice podobných genů kódujících Gα podjednotku v genomu rostlin tabáku (NtGA1 a NtGA2). Vysvětlení tohoto objevu s největší pravděpodobností tkví v tom, že rostliny tabáku jsou tetraploidní.

Vznikly

mezidruhovým

křížením

Nicotiana

sylvestris

a

Nicotiana

tomentosiformis. Geny jsou tedy blízkými homology odvozenými od obou rodičovských druhů tetraploidního genomu Nicotiana tabacum (Ando et al., 2000). Gα podjednotka obsahuje 2 důležité domény. Doménu α-helikální a doménu GTPásovou. Dále se dají rozlišit konkrétní vazebná místa podjednotky. Oblast pro interakci s receptorem. Oblast pro interakci s efektorovým proteinem a oblast pro interakci s dimerem Gβγ. Kontakt dimeru Gβγ je zajištěn N-terminální helikální oblastí, malým úsekem smyčky I a vnějším obloukem smyčky II. Za interakci s receptorem je zodpovědný C-konec proteinu. V jeho blízkosti se vyskytuje oblast zprostředkovávající interakci s efektorovým proteinem. N-konec umožňuje interakci s dimerem Gβγ. Oblast GTPásové domény vykazuje velkou strukturální homologii s Ras proteiny a dalšími monomerními G-proteiny (Millner, 2001). Gα podjednotka je lokalizována jak v plazmatické membráně tak v endoplozmatickém retikulu (Weiss et al., 1997). Vazba Gα podjednotky na membrány je zajištěna lipidickou vazbou přes posttranslační modifikace proteinu zahrnující S-acetylaci a myristylaci (připojení zbytku kyseliny myristové ke koncovému glycinu proteinu). Mutace proteinu v místech příslušných modifikací způsobí uvolnění Gα podjednotky z plazmatické membrány (Temple & Jones, 2007; Adjobo-Hermans et al., 2006). Výměna guanosindifosfátu (GDP) a guanosintrifosfátu (GTP) na Gα podjednotce je aktivována navázáním ligandu na receptor G-proteinové signalizace (GPCR). Když na receptoru není ligand navázán, Gα podjednotka má na sobě navázáno GDP a je asociována s heterodimerem Gβγ. Navázáním ligandu na receptor (GPCR) dojde ke konformační změně 11

cytosolických smyček receptoru a tím se umožní navázání Gα podjednotky na receptor. Asociace receptoru a Gα podjednotky způsobí uvolnění GDP z vazebného místa na Gα podjednotce. Receptor s navázaným ligandem působí tedy pro Gα podjednotku jako faktor ovlivňující výměnu guaninových nukleotidů (GEF – guanin nucleotide-exchange factor). Po uvolnění GDP dojde velice rychle k navázání GTP na prázdném vazebném místě pro guaninové nukleotidy. Navázání GTP způsobí konformační změnu Gα podjednotky, tím dojde k disociaci jak Gα podjednotky od receptoru tak Gα podjednotky od heterodimeru Gβγ. Poté může dojít k interakci Gα podjednotky s efektorovým proteinem. Vzhledem ke schopnosti Gα podjednotky hydrolyzovat GTP, dochází po určitém čase k hydrolýze na GDP, což vede ke konformační změně Gα podjednotky do podoby před navázáním GTP. Hydrolýzovou aktivitu mají i některé efektorové proteiny, ty dokáží proces hydrolýzy urychlit. Působí tedy jako GTPázové aktivační proteiny (GAP – GTPase-activating protein). Tato schopnost pomáhá buňce předejít příliš silné reakci na určitý podnět. Dále hydrolýzu podporují speciální proteiny, regulátory G-proteinové signalizace (RGS) (přehled viz. Lodish et al., 2008). Ačkoliv je výše popsané schéma dějů probíhajících na Gα podjednotkách platné u živočichů i rostlin, vykazují rostlinné podjednotky odlišnosti v některých klíčových biochemických parametrech. Nezávisle bylo několikrát změřeno, že GEF aktivita rostlinné Gα podjednotky je mimořádně vysoká v porovnání s živočišnými homology. Naopak GTPázová aktivita je velmi nízká (Kcat = 0,12 s-1). Zatímco u živočichů je kontrolním/regulačním bodem cyklu Gα podjednotky pomalá výměna GDP za GTP (katalyzováno navázaným receptorem GPCR), rostlinná Gα podjednotka je regulována především GAP aktivitou regulátoru RGS (viz. kapitola 8). Celkově je u rostlinných Gα podjednotek výměna guaninových nukleotidů přibližně stokrát rychlejší, než hydrolýza GTP (Temple & Jones, 2007; Urano et al., unpublished). Některé výsledky naznačují, že GEF aktivita receptoru není rostlinnou Gα podjednotkou vyžadována vůbec (Johnston et al., 2007). Vlastní GEF aktivita podjednotky Gα je natolik vysoká, že je schopna samovolně přecházet do aktivovaného stavu (vázající GTP) (Temple & Jones, 2007).

12

Obr. 2: Nukleotidová a aminokyselinová sekvence cDNA tabákové Gα podjednotky (Ando et al., 2000).

13

Obr. 3: Fylogenetický strom Gα podjednotky. Založen na rostlinných Gα podjednotkách (Ando et al., 2000).

Prvotní výsledky studia Gα podjednotky izolované z Arabidopsis thaliana (GPA1) naznačovaly význam tohoto proteinu v regulaci buněčného dělení a diferenciace (Weiss et al., 1993). Pozdější studie pak nastínily další možné funkce Gα podjednotky. Mutantní rostliny Arabidopsis, kterým chyběl gen pro GPA1, měly omezené buněčné dělení při formování hypokotylu a listů. Naopak zvýšená exprese tohoto genu měla za následek ektopické dělení buněk zahrnující masivní zvýšení tvorby meristémů (Jones, 2002). U rajčete Gα podjednotka aktivuje Ca2+ kanály v plasmatické membráně (Aharon et al., 1998). Mutantní rostliny rýže s chybějícím RGA1 vykazovaly trpasličí vzrůst způsobený zkrácením internodií, vytvářely malá kulatá semena a měly tmavě zelené listy. Tyto projevy vedly k objevu, že známý trpasličí rýžový mutant Daikoku d1 má mutaci v rga1 genu (Ashikari et al., 1999; Fujisawa et al., 1999).

14

Normální kultivar

Daikoku d1

Normální kultivar

Daikoku d1

Obr. 4: Srovnání normálního kultivaru rýže a mutantní rostliny rýže v genu rga1 (Daikoku d1) (Fujisawa et al., 2001).

Z výzkumu porovnávajícího reakci normálního kultivaru rýže a mutanta Diakoku d1 v reakci na giberelin (GA3), byla vyslovena hypotéza, že by G-proteinová signalizace mohla být zapojena do signalizační kaskády při nízkých koncentracích GA3, ale nikoli při vysokých (více než 10-7M) (Fujisawa et al., 2001).

15

Heterotrimerní G-protein

GA signalizace . Obr. 5: Schéma možnosti zapojení G-proteinové signalizace do signalizační kaskády při nízké koncentraci GA3 a její nevyužití v případě vyšší koncentrace GA3 (Fujisawa et al., 2001).

Při křížení mutanta rýže Daikoku d1 a mutanta sln (štíhá rýže, s mutací v genu kódující protein, který funguje jako negativní regulátor giberelinové signalizace) bylo zjištěno, že heterotrimerní G-proteiny jsou součástí giberelinové signalizace (Fujisawa et al., 2001). Při výzkumu, kde se využíval auxin jako stimulant dělení, se ukázalo, že buňky kterým chyběla Gα podjednotka, se dělí. Z toho vyplývá, že odpověď na auxin není spojena pouze s G-proteiny. Ovšem G-proteinově mutantní rostliny mají velice pozměněnou citlivost k auxinu. Je tedy možné, že G-proteiny ovlivňují jinou signální cestu ovlivňující citlivost k auxinu (Jones, 2002). Bylo také zjištěno, že různé typy buněk mohou mít odlišné mechanismy reakce na stejný hormon (Ullah et al., 2002). Průvodní buňky průduchů u rostlin Arabidopsis mutantních v genu gpa1 nejsou citlivé ke kyselině abscisové (ABA), avšak semena stejných mutantů jsou k ABA citlivé stejně jako kontrolní rostliny Arabidopsis (Jones, 2002). Semena těchto rostlin jsou však stokrát méně citlivá ke kyselině giberelinové (GA3) a zcela necitlivé k brasinosteroidům. Naopak semena, u kterých došlo ke zvýšené expresi GPA1 jsou milionkrát citlivější ke giberelinům než semena kontrolních rostlin. Nicméně i takto citlivá 16

semena ke klíčení gibereliny potřebují. Z toho se vyvozuje, že GPA1 se nepřímo podílí na regulaci klíčení právě ovlivněním citlivosti ke giberelinům. Je známo, že brasinosteroidy regulují citlivost ke giberelinům. Semena se sníženým množstvím giberelinů, ale ošetřená brasinosteroidy jsou schopna normálně vyklíčit. Ukázalo se, že mutantní rostliny v syntéze a odpovědi na brasinosteroidy (bri1-5 a det2-1) mají stejně sníženou citlivost ke giberelinům jako rostliny s mutací v gpa1. Brasinosteroidy byly naprosto neúčinné pro navození klíčení při snížené hladině giberelinů u semen rostlin mutantních v genu gpa1. Bylo také pozorováno, že schopnost reagovat na gibereliny chybí v kořenech a hypokotylu rostlin s mutací v gpa1. To poukazuje na to, že přenos signálu brasinosteroidů je pravděpodobně spojen s G-proteinovou signalizací v různých bodech rostlinného vývoje (Ullah et al., 2002).

17

5. Podjednotka Gβ Stejně jako v případě Gα podjednotky byl u cévnatých rostlin nalezen pouze jeden gen kódující Gβ podjednotku. Byl izolován z kukuřice (ZGB1), Arabidopsis (AGB1) (Weiss et al., 1994), bramboru (StGB1 a StGB2) (Kang et al., 2002), tabáku (NtGB1 a NtGB2) (Ando et al., 2000), a dalších cévnatých rostlin. Kódované proteiny kukuřice a Arabidopsis jsou na aminokyselinové úrovni ze 71 % vzájemně identické a ze 41 % nebo více identické nerostlinným Gβ podjednotkám (Weiss et al., 1994). Gβ podjednotka bramboru vykazuje 8392% identitu s dalšími rostlinnými Gβ podjednotkami. U bramboru se Gβ podjednotka skládá z 377 aminokyselin (Kang et al., 2002). U Arabidopsis je protein složen také z 377 aminokyselin a u kukuřice je to pak 380 aminokyselin (Weiss et al., 1994). Jelikož je brambor i tabák, tetraploidní, vyskytují se u nich, ze stejného důvodu jako u Gα podjednotky tabáku, 2 blízce homologní geny (StGB1 a StGB2) a (NtGB1 a NtGB2), produkty StGB1 a StGB2 jsou si vzájemně identické z 92%. Bramborový protein kódovaný StGB2 vykazuje rovněž 89% identitu s tabákovým (NtGB2) (Kang et al., 2002).

Obr. 6: Nukleotidová a aminokyselinová sekvence cDNA tabákové Gβ podjednotky (Ando et al., 2000).

18

Obr. 7: Fylogenetický strom Gβ podjednotek. Založen na rostlinných a lidských Gβ podjednotkách a na rostlinných proteinech obsahující WD-40 motiv (GBLP) (Ando et al., 2000).

Gβ podjednotka obsahuje oblast, kde se sedmkrát opakuje takzvaný WD-40 motiv, přičemž WD znamená zbytky tryptofanu a asparagové kyseliny (Weiss et al., 1994). Tato oblast je konzervovaná v rostlinných, lidských i kvasinkových Gβ podjednotkách (Ando et al., 2000). Jedná se o oblast odpovědnou za interakci Gβ podjednotky s Gα podjednotkou (Jones & Assmann, 2004). Také obsahuje oblast, která je odpovědná za interakci s Gγ podjednotkou. Tato oblast je na N-konci proteinu a má specifickou strukturu stočené spirály (coiled-coil). Díky této struktuře vytváří Gβ a Gγ podjednotky heterodimery (Ando et al., 2000).

19

Obr. 8: WD40 motiv typický pro Gβ podjednotku (Song Tan, Penn State University, dostupné z http://www.personal.psu.edu/sxt30/gallery_proteins.html).

Gβ podjednotka je lokalizována v plazmatické membráně (Obrdlik et al., 2000). Dále pak u tabákových buněk v jádře, i přes absenci sekvence navádějící protein do jádra. Nevyskytuje se v chloroplastech a mitochondriích. Prvotní práce ukázaly, že Gβ podjednotka nemá ve své struktuře zakomponovánu hydrofóbní část, kterou by byla zakotvena v plazmatické membráně. Přesto se z membrány odstranilo jen malé množství proteinu po aplikaci vysoké koncentrace solí. Větší množství proteinu se podařilo z membrány odstranit až po aplikaci detergentu. To ukazuje, že Gβ podjednotka je s membránou spojena silnou hydrofobní interakcí (Peškan & Oelmüller, 2000). Gβ podjednotka by mohla být připojena k plazmatické membráně pomocí, u rostlin neobjevené, Gγ podjednotky obdobně jako u živočišných Gβ podjednotek (Obrdlik et al., 2000). Správnost této domněnky potvrdilo pozdější objevení Gγ podjednotky u rostlin (viz. kapitola 5) (Mason & Botella, 2000). Na organismální úrovni byla zjištěna zvýšená koncentrace proteinu v mladých listech tabáku (dělící se pletiva). Koncentrace slábne s postupující úrovní vývoje listu. Tyto výsledky naznačují, že signalizace vedoucí přes Gβ podjednotku má určitý význam při tvorbě nových listů (Peškan & Oelmüller, 2000). Na základě zjištění, že produkty genů StGA2 a StGB2 (geny pro Gα a Gβ podjednotky u bramboru) se vyskytují v pletivech zakládajících se hlíz, se zdá, že Gβ i Gα podjednotka hrají významnou roli při procesu ranné tuberizace u bramboru. Výskyt produktů ovšem nebyl 20

dokázán u vyvinutých a dormantních hlíz. Je tedy možné, že přechod hlíz do dormance a umlčení exprese výše zmíněných genů spolu určitým způsobem souvisí (Kang et al., 2002). Rozdílné fenotypové projevy utváření laterálních kořenů u rostlin Arabidopsis thaliana s mutacemi v gpa1 a v agb1 genu ukazují, že spíše Gβ společně s Gγ podjednotkou (tedy ve formě dimeru Gβγ) ovlivňují signalizační kaskádu auxinu více než Gα podjednotka. Ztrátou Gα podjednotky vznikne velké množství volného dimeru Gβγ, který může interagovat s efektorovým proteinem a posílit tím signál. Naopak ztráta Gβ podjednotky vede k utlumení signálu. Závislost tvorby postranních kořenů na auxinu je podložena tím, že rostliny exprimující bakteriální auxin lyázu (enzym štěpící auxin) mají méně laterálních kořenů než kontrolní rostliny. Mutantní rostliny s chybějící Gα podjednotkou tvoří méně laterálních kořenů než rostliny s chybějící Gβ podjednotkou. Gen AGB1 je tedy negativním regulátorem auxinem navozeného dělení buněk. Je zjištěno, že v obou případech, jak u mutantních rostlin v genu pro Gα podjednotku tak pro Gβ podjednotku, dochází k odpovědi na auxin, ikdyž u každého s jinou citlivostí. To ukazuje, že G-proteinová signalizace není jedinou výhradní signalizační cestou pro auxin, který ovlivňuje buněčné dělení (Ullah et al., 2003).

21

6. Podjednotky Gγ První publikace, která popisuje rostlinnou Gγ podjednotku vyšla v roce 2000. Jednalo se tedy o poslední

objevenou

součást

celého

G-proteinového heterotrimeru. Protein

byl

charakterizován u Arabidopsis thaliana a pojmenován AGG1 (Mason & Botella, 2000). O rok později vyšla od stejných autorů publikace, charakterizující druhou Gγ podjednotku u A. thaliana AGG2. Protein AGG2 vykazuje na aminokyselinové úrovni 48% identitu a 59% podobnost s proteinem AGG1 (Mason & Botella, 2001). Protein se skládá z 98 aminokyselin u AGG1, ze 100 aminokyselin u AGG2. Více než třetinu proteinu zaujímá oblast, zodpovědná za coiled-coil formaci, nezbytná pro interakci s Gβ podjednotkou a tvorbou heterodimeru. Konkrétně je to oblast v blízkosti N-konce proteinu (17 – 53 AK) u AGG1, (16 – 57 AK) u AGG2. Na C-konci proteinu je lokalizována prenylová skupina, takzvaný CAAX box (C je cystein, A alifatická aminokyselina, X jakákoli jiná aminokyselina), který je zodpovědný za lokalizaci v plazmatické membráně pomocí hydrofobní interakce (Mason & Botella, 2000; Mason & Botella, 2001). Tyto 4 C-terminální aminokyseliny jsou nezbytné pro správné fungování celého G-proteinového heterotrimeru (Chakravorty & Botella, 2007).

Obr. 9: Nukleotidová a aminokyselinová sekvence cDNA AGG1, Gγ podjednotky Arabidopsis thaliana. Podtrženě je vyznačena oblast CAAX boxu (Mason & Botella, 2000). 22

V in vitro experimentech zaměřených na interakci Gγ podjednotek s Gβ podjednotkami byly využity zkrácené verze jednotlivých proteinů. Bylo zjištěno, že s mutovanou Gβ podjednotkou, které chybí coiled-coil doména, není protein AGG1 ani AGG2 schopen navázat interakci. To potvrzuje, že je tato doména na Gβ esenciální pro interakci s Gγ. Se samotnou coiled-coil doménou Gβ podjednotky ovšem také není AGG1 ani AGG2 schopen silně interagovat. Lze tedy předpokládat, že samotná coiled-coil doména není dostačující pro interakci mezi podjednotkami Gγ a Gβ. Za sílu interakce podjedntek mohou být zodpovědné mnohonásobné interakce mezi skupinami aminokyselin na obou podjednotkách heterodimeru Gβγ. Zkrácení proteinů i v jiných částech tedy může narušit správnou a kompaktní formaci heterodimeru Gβγ. Dále bylo zjištěno, že při odstranění Nkoncové coiled-coil domény na AGG1 byla oslabena síla interakce s Gβ, nicméně nebyla uplně zrušena. Při odstranění N-koncové coiled-coil domény na AGG2 nebyla pozorována žádná interakce s Gβ. Tento rozdíl může být způsoben malým rozdílem ve skladbě proteinu. Dále to naznačuje, že existence dvou různých Gγ podjednotek dává vzniku dvěma různým komplexům G-proteinového heterotrimeru. Ty pak mohou být využity v různých signalizačních cestách, případně kombinovat svou funkci (Mason & Botella, 2000; Mason & Botella, 2001).

Obr. 10: Srovnání aminokyselinových sekvencí proteinů AGG1 a AGG2. * značí identické a – značí podobné aminokyselinové zbytky. V rámečcích jsou konzervované oblasti mezi savčími Gγ podjednotkami. Tučně je zvýrazněna oblast CAAX boxu (Mason & Botella, 2001).

23

Zajímavý výsledek studia expresních profilů AGG1 a AGG2 byl prezentován v práci Temple & Jones, 2007. Ukázalo se, že exprese každého z těchto proteinů je orgánově specifická a vzájemně se nepřekrývá. Celkově se však oba expresní profily překrývají s expresí genu AGB1 (Gβ podjednotka), což potvrzuje AGG1 a AGG2 jako obligátní interaktory. Zároveň se jedná o první publikovaný výsledek, který naznačuje možnou diverzifikaci signálních drah vedených přes heterotrimerní G-proteiny (Temple & Jones, 2007). Recentním příspěvkem k poznání rostlinných Gγ podjednotek je práce Chakravorty a kolektivu (2011), která přináší charakterizaci proteinu kódovaného genem Arabidopsis thaliana - At5g20635. Publikace přináší doklady o interakci tohoto proteinu s Gβ podjednotkou v podmínkách in vitro, in vivo a též komplementaci v dvouhybridním kvasinkovém modelu. Překvapivým zjištěním je, že molekulová hmotnost tohoto proteinu je přibližně dvojnásobná oproti

dříve charakterizovaným

AGG1 a

AGG2. Rovněž

aminokyselinová podobnost je velmi nízká a soustředěna především v C-terminální, cysteinem bohaté části proteinu. Ačkoli přesný způsob interakce s Gβ podjednotkou zatím není znám, rozhodli se autoři definovat tento protein jako třetí Gγ podjednotku s označením AGG3 a vytvořit pro ni novou rodinu Gγ podjednotek specifických pro rostliny bez známých homologů u živočichů (Chakravorty et al., 2011). Fyziologický a morfogenetický význam tohoto proteinu je dále diskutován v práci Thung et al., 2012. Autoři obhajují zařazení výše popsaného proteinu jako nové Gγ podjednotky především na základě porovnání s mutanty v agb1. Vzhledem k tomu, že podjednotky Gβ a Gγ vytváří nedělitelný heterodimer, měly by všechny známé mutace v Gγ pokrývat fenotypové projevy mutantů v Gβ. Projevy mutantů agg1 a agg2 však celou škálu mutantních projevů nepokrývají. Tato skutečnost vedla k předpovězení existence třetího typu Gγ podjednotky, kterou by měla být právě AGG3 (Thung et al., 2012). Otázkou zůstává nakolik je takto položená charakterizace zcela nově vypadající Gγ podjednotky konzistentní s výše popsaným modelem expresních profilů (AGG1 + AGG2) = AGB1.

24

7. Receptory vázané na G-proteiny Receptor G-proteinové signalizace (GPCR – G-protein coupled receptor) je u živočichů typický svou strukturou. Je to protein sedmkrát procházející plasmatickou membránou. Vyznačuje se schopností interakce a aktivace Gα podjednotky po navázání ligandu. Funguje tedy pro Gα jako GEF (guanin nucleotide-exchange factor), faktor ovlivňující výměnu GDP za GTP (přehled viz. Lodish et al., 2008). Na existenci rostlinných receptorů G-proteinové signalizace (GPCR) nejsou jednotné názory. První objev domnělého receptoru GCR1 byl popsán u Arabidopsis thaliana (Plakidou et al., 1998). Druhým objeveným receptorem, rovněž u A. thaliana, byl GCR2. GCR2 měl být receptorem pro kyselinu abscisovou (ABA) (Liu et al., 2007). Charakterizace GCR2 jakožto rostlinného transmembránového receptoru byla ale zpochybněna. Mělo se jednat o chybnou charakterizaci rostlinného homologu bakteriální lanthionin syntetázy (Johnston et al., 2007). Odezvou na toto zpochybnění byla publikace, podporující tvrzení, že GCR2 funguje jako receptor pro ABA a také, že je GCR2 schopen interagovat s Gα podjednotkou, nicméně nevyvrací možnost, že se jedná o homolog s bakteriální lanthionin syntetázou. Autoři přisuzují GCR2 i možné další vlastnosti, které nejsou typické pro jiné GPCR. Může se tedy jednat o nový typ GPCR (Liu et al., 2007). GCR1 je schopen regulovat hormonální signalizaci i jiným způsobem než výhradně přes komplex G-proteinového heterotrimeru (Chen et al., 2004). U A. thaliana GCR1 ani GCR2 nevykazují GEF aktivitu vůči Gα podjednotce. Ovšem vzhledem k unikátní velké GEF a nízké GAP aktivitě rostlinné AtGPA1 může GCR1 regulovat Gα podjednotku jiným mechanizmem, nezávislým na GEF aktivitě (Johnston et al., 2007).

25

Extracelulární prostor

Intracelulární prostor

Obr. 11: Schéma heptahelikální transmembránové domény GCR1 (Plakidou et al., 1998).

Obr. 12: Nukleotidová a aminokyselinová sekvence GCR1 cDNA Arabidopsis thaliana. Sedm transmembranových domén je označeno čarou nad sekvencí aminokyselin (Plakidou et al., 1998). 26

8. Regulártor G-proteinové signalizace Regulátor G-proteinové signalizace (RGS) je protein, který ovlivňuje (urychluje) schopnost Gα podjednotky hydrolyzovat GTP (přehled viz. Lodish et al., 2008). Charakterizace prvního rostlinného zástupce RGS byla publikována v roce 2003. Příslušný protein Arabidopsis thaliana byl označen jako AtRGS1 (Chen et al., 2003). Poznatky o struktuře a funkci AtRGS1 pomohly k lepšímu pochopení fungování celého komplexu rostlinných heterotrimerních G-proteinů a také změnily původní představy o existenci a podobě receptorů spřažených s G-proteiny (GPCR) u rostlin. Z výzkumů vyplývá, že u Arabidopsis thaliana AtRGS1 stimuluje GTPázovou aktivitu Gα podjednotky (AtGPA1) a tím působí proti rychlé výměně nukleotidů právě na Gα podjednotce (Jones et al., 2011). Před charakterizací proteinu AtRGS1 byly identifikovány proteiny s heptahelikální transmembránovou strukturou, ovšem nebylo potvrzeno jejich výhradní spřažení s G-proteiny (viz. kapitola 7) (Jones, 2002; Hooley, 1999; Josefsson & Rask, 1997). Analýzou databáze otevřených čtecích rámců (ORFs – open reading frames) Arabidopsis podle domén na N- a Ckonci proteinu AtRGS1, se nenašly žádné další homology. Díky tomu se zdá, že AtRGS1 představuje jediného člena této rodiny (Chen et al., 2003). Protein AtRGS1 se skládá z 459 aminokyselin. Celkovou strukturou se značně odlišuje od všech známých RGS jiných organismů. Kromě typické regulační domény, tzv. RGS box (AK 283 – 412), je protein opatřen poměrně velkou N-terminální α-helikální doménou (247 AK), která sedmkrát prochází plazmatickou membránou (7TM domain) (Chen et al., 2003). N-konec peptidu je extracelulární. Přes nízkou sekvenční podobnost vykazuje tato transmembránová doména nápadnou strukturní podobnost s živočišnými receptory GPCR, pro které je typická právě α-helikální struktura sedmkrát procházející plasmatickou membránou (přehled viz. Lodish et al., 2008). Nejvyšší podobnost je s živočišnými GPCR rodiny C. U AtRGS1 ovšem chybí velké vazebné místo pro ligandy na extracelulárním N-konci proteinu, které je charakteristické pro celou podskupinu GPCR (Chen et al., 2003). Na rozdíl od většiny živočišných GPCR, má AtRGS1 extrémně zkrácenou třetí intracelulární smyčku. Ta má u živočišných receptorů esenciální roli v interakci s G-proteinovým komplexem. Fakt, že je tato smyčka u rostlinného AtRGS1 tak krátká, ovlivňuje funkci tohoto proteinu jakožto GEF (guanin nucleotide-exchange factor). Z toho jsou vyvozovány otázky, zdali je AtRGS1 GEF nebo GAP (GTPase-activating protein) nebo obojí (Temple & Jones, 2007). Jinými slovy zda AtRGS1 zastává funkci GPCR nebo RGS, popřípadě obojí. 27

Obr. 13: Topologické schéma regulátoru AtRGS1, červeně extracelulární oblasti proteinu, modře intracelulární a šedě transmembránové (Chen et al., 2003). Kromě transmembránové a RGS domény obsahuje AtRGS1 dva úseky zatím neznámé funkce. Jedná se o aminokyselinové zbytky 248 – 282 a C-terminální 413 – 459. Tyto úseky by mohly být hypoteticky považovány za málo významné spojky větších domén proteinu. Jejich AK sekvence je mezi různými skupinami krytosemenných rostlin velmi dobře konzervována, což indikuje, že jejich přítomnost může mít nezanedbatelný funkční význam (Fischer & Srba, osobní sdělení). Recentně bylo navíc potvrzeno, že C-terminální „přívěsek“ AK 413 – 459 připomíná zvýšeným výskytem serinových zbytků C-terminální konec GPCR obratlovců a je významný pro fosforylace a následný transport proteinu v buňce (Urano et al., unpublished). Fyziologický význam AtRGS1 byl předpovězen na základě experimentálního ošetření atrgs1 mutantních semenáčů Arabidopsis thaliana D-glukózou. Kontrolní rostliny po aplikaci 6% glukózy přestávají růst s přibližně 50% frekvencí. Mutantní rostliny atrgs1 jsou však k takovému ošetření tolerantní. Rostliny A. thaliana s mutantní (nefunkční) Gα podjednotkou jsou naopak k danému ošetření hypersenzitivní. To naznačuje, - 1) že oba proteiny jsou začleněny ve stejné signální dráze, 2) že nativní Gα podjednotka se převážně nachází v aktivovaném stavu a 3) že D-glukózou aktivovaný AtRGS1 Gα podjednotku převádí do inaktivní formy (vázáno GDP). V souladu s tím rostliny se zvýšenou expresí AtRGS1 se stávají ke glukóze hypersenzitivní a rostliny nesoucí mutaci v obou genech jsou rovněž hypersenzitivní (Johnston et al., 2007). Jasně a reprodukovatelně pracující systém „glukózových“ testů byl použit pro vyřešení otázky výše popsané duální povahy AtRGS1. Rostlinám s nefunkčním atrgs1 byla mutace komplementována jak přirozeným AtRGS1, tak modifikovaným AtRGS1 (E320K), který má narušenou GAP aktivitu. Zatímco rostliny s uměle navýšenou expresí přirozeného AtRGS1 se staly hypersenzitivní vůči glukóze, rostliny komplementované modifikovaným proteinem AtRGS1 (E320K) měly signální dráhu stále narušenou. Ukázalo se tedy, že AtRGS1 funguje jako glukózou aktivovaný GAP. Pokud vůbec vykazuje nějakou GEF aktivitu, pak tato není

28

pro další G-proteinovou signalizaci významná vzhledem k vysoké vlastní GEF aktivitě Gα podjednotky (Johnston et al., 2007). Hypotéza, že protein AtRGS1 figuruje jako extracelulární receptor pro D-glukózu, byla potvrzena technikou FRET (Förster/Fluorescence resonance energy transfer) (Johnston et al., 2007; Grigston et al., 2008). Pomocí multi-array analýzy bylo zjištěno, že příslušná signalizace ovlivňuje expresi některých genů centrálního metabolismu. Jmenovitě At1g52000, At1g52040, At1g54020, At2g39330, At5g48850, receptorovou kinázu At1g35710, MYB transkripční faktor At1g56650, trehalóza 6-P fosfatáza At1g78090 a dva proteiny neznámé funkce At4g01080, At5g48850. Primární data příslušných analýz jsou k dispozici jako elektronická příloha publikace Grigston et al., 2008. V metodickém článku (Huang et al., 2012), byla testována kompatibilita rostlinného AtRGS1 s živočišnou Gαi podjednotkou. V podmínkách in vitro reakce autoři prokázali schopnost rostlinného regulátoru podporovat GTPázovou aktivitu jak rostlinné, tak živočišné Gα podjednotky. Dále byla testována kompatibilita živočišného RGS s rostlinnou Gα podjednotkou. Zde již pozitivní interakce nebyla detekována. Tyto výsledky dále potvrzují představu, že rostlinná i živočišná signalizace přes G-proteinový komplex probíhá na stejných principech, přičemž největším rozdílem jsou biochemické parametry rostlinné Gα podjednotky. Kromě těchto věcných sdělení článek přináší optimalizované metody pro detekci interakce RGS a Gα v podmínkách in vitro (Huang et al., 2012). Recentně bylo též dokumentováno, že D-glukóza je odpovědná za internalizaci AtRGS1 na cytologické úrovni. L-glukóza tyto změny neindukuje. Z pokusů vyplývá, že účinek D-glukózy na AtRGS1 je specifický a závislý na dávce a času. Zjištění, že při aplikaci různých dávek D-glukózy až po ošetření 6% dávkou ani po delším čase nedochází k internalizaci Gα podjednotky (AtGPA1), vedlo k závěru, že D-glukóza je zodpovědná za fyzické oddělení rostlinné Gα podjednotky (AtGPA1) od regulátoru AtRGS1. Tato představa byla potvrzena experimentem s mutantním AtRGS1 – zbytek kyseliny glutamové 320 nahrazen lyzinem. Tento mutovaný protein AtRGS1 (E320K) není schopen interagovat s Gα podjednotkou (AtGPA1). Cílem bylo zjistit, zda je interakce mezi AtRGS1 a AtGPA1 nezbytná pro internalizaci AtRGS1. U buněk s mutantním regulátorem nebyla D-glukózou internalizace AtRGS1 (E320K) navozena, zatímco u kontrolní varianty ano. Proto lze považovat interakci mezi AtRGS1 a AtGPA1 za esenciální pro navození internalizace AtRGS1. Aby byla vyvrácena možnost, že k internalizaci nedochází z důvodu neschopnosti 29

regulátoru zrychlit hydrolýzu GTP na Gα podjednotce, byl využit protein pro Gα podjednotku AtGPA1(Q222L) s mutací, jež zapříčiňuje, že její základní stav je konstitutivně aktivní. U kontrolních (wild type) buněk zapříčinila mutovaná Gα podjednotka

AtGPA1(Q222L)

internalizaci AtRGS1 nezávislou na přidání D-glukózy. U buněk s mutantním AtRGS1 (E320K) mutovaná Gα podjednotka AtGPA1(Q222L) nedokázala iniciovat internalizaci ani po ošetření D-glukózou. To potvrzuje, že interakce mezi AtRGS1 a AtGPA1 je opravdu esenciální pro internalizaci AtRGS1, a naopak poukazuje na to, že cyklování AtGPA1 mezi aktivní a neaktivní formou není pro internalizaci AtRGS1 důležité (Urano et al., unpublished). Dále bylo experimentálně zjištěno, že regulátor u Arabidopsis AtRGS1 je během procesu internalizace fosforylován a má svou vlastní kynázu. Testováno bylo více kandidátských enzymů, ale ukázalo se, že ze všech testovaných byla pouze kynáza AtWNK8 schopna fosforylovat AtRGS1. Pro fosforylaci AtRGS1 a jeho interakci s AtWNK8 je nezbytně nutný C-konec proteinu AtRGS1. Také RGS box hraje v těchto procesech důležitou strukturální roli. Vzhledem k faktu, že pro internalizaci živočišných receptorů (GPCR) je nutná jejich fosforylace, byl proveden pokus, který měl potvrdit tento princip u internalizace rostlinného proteinu AtRGS1. V pokusu byly využity mutantní proteiny regulátoru (AtRGS1-∆CtSA) zkrácené na jeho C-konci. Zkrácením proteinu na C-konci byly zrušeny serinové zbytky, které jsou cílem příslušných fosforylací. Zatím co kontrolní buňky s nezkráceným AtRGS1 po ošetření D-glukózou regulátor internalizovaly, u buněk s mutovaným AtRGS1-∆CtSA zůstal regulátor lokalizovaný v plazmatické membráně. Při aplikaci calyculinu A, který inhibuje serin/threoninové fosfatázy vzrůstala hladina fosforylovaného regulátoru. U buněk se zkráceným regulátorem AtRGS1-∆CtSA (odstraněny serinové zbytky) toto pozorováno nebylo. Z toho vyplývá, že karboxylový konec regulátoru AtRGS1 je jediné místo, kde dochází k fosforylaci a dále, že právě fosforylace karboxylového konce proteinu je potřebná pro internalizaci regulátoru AtRGS1 (Urano et al., unpublished). Z pohledu živočišně/klinicky zaměřeného výzkumu se zdá být protein, který spojuje vlastnosti receptoru a regulátoru G-proteinové signalizace, nanejvýš bizarní. Takové hodnocení lze pochopit, vzhledem k tomu, že živočichové žádné podobné chimérní proteiny nemají. U hub (Fungi) a Protozoa však byly nalezeny proteiny podobné AtRGS1 a předběžné výsledky ukazují, že u těchto organismů mají význam pro vnímání glukózy a regulaci buněčného dělení, podobně jako u rostlin (Johnston et al., 2007). 30

9. Závěr Současné poznatky ukazují, že základní schéma G-proteinové signalizace je konzervováno mezi rostlinami a živočichy (Jones et al., 2011). Pravděpodobně nejvýznamnější odlišností je rozdílná kynetika štěpení GTP a výměna GDP probíhající na Gα podjednotce. GTPázová aktivita rostlinných Gα podjednotek je nízká, GEF aktivita je na rozdíl od živočišných mimořádně vysoká (Temple & Jones, 2007). S touto odlišností dále souvisí pozměněné principy aktivace a regulace G-proteinového komplexu u rostlin. Ačkoliv bylo nalezeno několik rostlinných kandidátů receptorů vázaných na G-proteiny (viz. kapitola 7), jediným proteinem u kterého byla prokázána tato funkce je AtRGS1, respektive tabákový NtRGS1. Jedná se o bizarní protein, který svou N-terminální doménou připomíná klasické živočišné GPCR, ale navíc obsahuje C-terminální doménu, která pracuje jako regulátor Gα podjednotky (RGS). Dosavadní výsledky naznačují, že tento protein slouží jako receptor D-glukózy, případně dalších oligosacharidů. Celkově je nejlépe zdokumentovaný význam G-proteinového systému Gαβγ právě v cukerné signalizaci, auxinové signalizaci a též aktivaci fosfolipázy D (PLDα1), která interaguje přímo s Gα podjednotkou (Temple & Jones, 2007). Literární údaje poskytují informace o dalších signálních drahách a procesech, které se zdají být spjaty s Gproteinovou signalizací. Lze si ale těžko představit, že málo diverzifikovaný G-proteinový komplex, tak jak je zatím popsán u rostlin, byl zapojen do tak široké škály signálních kaskád. Spíše by se dalo uvažovat o funkci G-proteinů ve smyslu jakési křižovatky složitějších signálních drah. Stále je toho v problematice rostlinných heterotrimerních G-proteinech mnoho neobjasněno. Chybí především údaje o efektorech heterotrimerních G-proteinů. Má proto určitě velký význam se výzkumem těchto komplexů v budoucnosti dále zabývat. Metodicky byla provedena většina experimentů na modelu Arabidopsis thaliana případně jiných celých rostlinách. Reakce komplexního rostlinného organismu jsou pochopitelně rozmanité, což komplikuje jednoznačnou interpretaci pozorovaných dějů. Experimenty využívající protoplasty nebo buněčné kultury, které umožňují přímé a definované experimentální ošetření, byly použity pouze v omezeném rozsahu. Je zde proto značný prostor pro doplnění našich poznatků o významu G-proteinové signalizace na buněčné úrovni, zejména pak v regulaci dělení a diferenciace buněk. Za perspektivní směr experimentální práce lze považovat dokumentování vazby NtRGS1 na Gαβγ a míry aktivace G-proteinového komplexu v podmínkách ošetření růstovými regulátory a modifikovanými podmínkami cukerného zásobení rostlinných buněk. Vhodným modelem pro takový výzkum je buněčná linie tabáku BY-2. 31

Jak již bylo dříve uvedeno, nejvýznamnějším okruhem působení G-proteinového komplexu je cukerná signalizace. Existují též doklady o tom, že aktivita Gα podjednotky dramaticky ovlivňuje citlivost rostlinných pletiv ke giberelinům (Tepmle & Jones, 2007). Hladina giberelinů společně s kvalitativními změnami v cukerném zásobení stonkového meristému ovlivňuje u bramboru tvorbu hlíz (Fischer, 2005; Viola et al., 2001). Dalo by se tedy uvažovat o tom, že G-proteinová signalizace hraje roli i v procesu tuberizace u bramboru.

32

10. Seznam použité literatury Adjobo-Hermans, M.J.W., Goedhart, J., Gadella, T.W.J. (2006) Plant G protein heterotrimers require dual lipidation motifs of G alpha and G gamma and do not dissociate upon activation. Journal of Cell Science 119, 5087-5097

Aharon, G.S., Gelli, A., Snedden, W.A., and Blumwald, E. (1998) Activation of a plant plasma membrane Ca2+ channel by TG alpha 1, a heterotrimeric G protein alpha-subunit homologue. FEBS Letters 424, 17-21

Ando, S., Takumi, S., Ueda, Y., Ueda, T., Mori, N., Nakamura, C. (2000) Nicotiana tabacum cDNAs encoding α and β subunits of a heterotrimeric GTP-binding protein isolated from hairy root tissues. Genes & Genetic Systems 75, 211-221

Ashikari, M., Wu, J.Z., Yano, M., Sasaki, T., Yoshimura, A. (1999) Rice gibberellin-insensitive dwarf mutant gene Dwarf 1 encodes the alpha-subunit of GTP-binding protein. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 96, 10284-10289

Bischoff, F., Molendijk, A., Rajendrakumar, C.S.V., Palme, V. (1999) GTP-binding proteins in plants. Cellular and Molecular Life Sciences 55, 233-256 Fischer, L. (2005) Tuberizace bramboru (Solanum tuberosum L.) , doktorská dizertační práce, PřF UK Praha, 152pp

Fujisawa, Y., Kato, H., Iwasaki, Y. (2001) Structure and function of heterotrimeric G proteins in plants. Plant and Cell Physiology 42, 789-794

Fujisawa, Y., Kato, T., Ohki, S., Ishikawa, A., Kitano, H., Sasaki, T., Asahi, T., Iwasaki, Y. (1999) Suppression of the heterotrimeric G protein causes abnormal morphology, including dwarfism, in rice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 96, 7575-7580

Grigston, J.C., Osuna, D., Scheible, W.R., Liu, C., Stitt, M., Jones, A.M. (2008) D-Glucose sensing by a plasma membrane regulator of G signaling protein, AtRGS1. FEBS Letters 582, 3577–3584 Hong, Yanofsky, M., F., Meyerowitz, E. (1990) Molecular cloning and characterization of GPA1, a G protein α subunit gene from Arabidopsis thaliana. Proceedings of the

Hooley, R. (1999) A role for G proteins in plant hormone signaling?. Plant Physiology and Biochemistry 37, 393-402

33

Huang, P.S., Yeh, H.S., Yi, H.P., Lin, C.J., Yang, C.S. (2012) Fluorescence-based assay probing regulator of G protein signaling partner proteins. Analytical Biochemistry 423, 133-140

Chakravorty, D., Botella, J.R. (2007) Over-expression of a truncated Arabidopsis thaliana heterotrimeric G protein gamma subunit results in a phenotype similar to alpha and beta subunit knockouts. GENE 393, 163-170

Chakravorty, D., Trusov, Y., Zhang, W., Acharya, B.R., Sheahan, M.B., McCurdy, D.W., Assmann, S.M., Botella, J.R. (2011) An atypical heterotrimeric G-protein gamma-subunit is involved in guard cell K+-channel regulation and morphological development in Arabidopsis thaliana. Plant Journal 67, 840-851

Chen, J.G., Pandey, S., Huang, J., Alonso, J.M., Ecker, J.R., Assmann, S.M., Jones, A.M. (2004) GCR1 acts independently of heterotrimeric G protein in response to brassinosteroids and gibberellins in Arabidopsis seed germination. Plant Physiology 135, 907-915

Chen, J.G., Pandey, S., Huang, J., Alonso, J.M., Ecker, J.R., Assmann, S.M., Jones, A.M. (2004) GCR1 Can Act Independently of Heterotrimeric G-Protein in Response to Brassinosteroids and Gibberellins in Arabidopsis Seed Germination. Plant Physiology 135, 907-915

Chen, J.G., Willard, F.S., Huang, J., Liang, J., Chasse, S.A., Jones, A.M., Siderovski, D.P. (2003) A seventransmembrane RGS protein that modulates plant cell proliferation. Science 301, 1728-1731

Johnston, C.A., Taylor, J.P., Gao, Y., Kimple, A.J., Grigston, J.C., Chen, J.G., Siderovski, D.P., Jones, A.M., Willard, F.S. (2007) GTPase acceleration as the rate-limiting step in Arabidopsis G protein-coupled sugar signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 104, 17317-17322

Johnston, C.A., Temple, B.R., Chen, J.G., Gao, Y.J., Moriyama, E.N., Jones, A.M., Siderovski, D.P., Willard, F.S. (2007) Comment on "A G protein-coupled receptor is a plasma membrane receptor for the plant hormone abscisic acid". Science 318, 10.1126/science.1143230

Jones, A.M. (2002) G-protein-coupled signaling in Arabidopsis. Current Opinion in Plant Biology 5, 402-407

Jones, A.M., Assmann, S.M. (2004) Plants: the latest model system for G-protein research. EMBO reports 5, 572-578

Jones, J.C., Temple, B.R.S., Jones, A.M., Dohlman, H.G. (2011) Functional Reconstitution of an Atypical G Protein Heterotrimer and Regulator of G Protein Signaling Protein (RGS1) from Arabidopsis thaliana. Journal of Biological Chemistry 286, 13143-13150

Josefsson, L.G., Rask, L.(1997) Cloning of a Putative G-Protein-Coupled Receptor from Arabidopsis thaliana. European Journal of Biochemistry 249, 415-420

34

Kang, S.G., Lee, H.J., Park, E.H., Suh, S.G. (2002) Molecular cloning and characterization of cDNAs encoding heterotrimeric G-protein α and β subunits from potato (Solanum tuberosum L.). Molecules and Cells 13, 99-106

Liu, X., Yue, Y., Li, B., Nie, Y., Li, W., Wu, W.H., Ma, L. (2007) A G Protein-Coupled Receptor Is a Plasma Membrane Receptor for the Plant Hormone Abscisic Acid. Science 315, 1712-1716 Liu, X., Yue, Y., Li, W., Ma, L. (2007) Responce to coment on “A G protein-coupled receptor is a plasma membrane receptor for the plant hormon abscisic acid“. Science 318, 914d

Lodish, H., Berk, A., Kaiser, C.A., Krieger, M., Scott, M.P., Bretscher, A., Ploegh, H., Matsudaira, P. Molecular Cell Biology, 6th ed., New York, W.H. Freeman and Company, 2008, ISBN 978-0716776017, 1150pp

Mason, M.G., Botella J.R. (2000) Completing the heterodimer: isolation andcharacterization of an Arabidopsis thaliana G protein γ-subunit cDNA. Proc Natl Acad Sci USA 97, 14784–14788

Mason, M.G., Botella, J.R. (2001) Isolation of a novel G-protein gamma-subunit from Arabidopsis thaliana and its interaction with G beta. Biochim.Biophys.Acta. 1520, 147-153

Milner, P.A. (2001) Heterotrimeric G-proteins in plant cell signaling. New Physiologist 151, 165-174 National Academy of Sciences of the USA 87, 3821-3825

Obrdlik, P., Neuhaus, G., Merkle, T.(2000) Plant heterotrimeric G protein beta subunit is associated with membranes via protein interactions involving coiled-coil formation. FEBS Letters 476, 208-212

Peskan, T., Oelmuller, R. (2000) Heterotrimeric G-protein beta-subunit is localized in the plasma membrane and nuclei of tobacco leaves. Plant Molecular Biology 42, 915-922

Plakidou-Dymock, S., Dymock, D., Hooley, R. (1998) A higher plant seven-transmembrane receptor that influences sensitivity to cytokinins. Current Biology 8, 315-324

Temple, B.R.S., Jones, A.M. (2007) The plant heterotrimeric G-protein complex. Annual Review of Plant Biology 58, 249-266

Thung, L., Trusov, Y., Chakravorty, D., Botella, J.R. (2012) G gamma 1+G gamma 2+G gamma 3=G beta: The search for heterotrimeric G-protein gamma subunits in Arabidopsis is over. Journal of Plant Physiology 169, 542-545

Ullah, H., Chen, J.G., Temple, B,. Boyes, D.C., Alonso, J.M., Davis, K.R., Ecker, J.R., Jones, A.M. (2003) The beta-subunit of the Arabidopsis G protein negatively regulates auxin-induced cell division and affects multiple developmental processes. Plant Cell 15, 393-409

35

Ullah, H., Chen, J.G., Wang, S.C., Jones, A.M. (2002) Role of a heterotrimeric G protein in regulation of Arabidopsis seed germination. Plant Physiology 129, 897-907

Urano, D., Phan, N., Jones, J.C., Yang, J., Huang, J., Grigston, J., Taylor, P., Jones, A.M. (unpublished; submitted 2012) Endocytosis of Seven-Transmembrane RGS Protein Activates G-protein Coupled Signaling in Arabidopsis. 36 pp.

Viola, R., Roberts, A.G., Haupt, S., Gazzani, S., Robert D. Hancock, R.D., Marmiroli, N., Gordon C. Machray, G.C., Oparka, K.J. (2001) Tuberization in Potato Involves a Switch from Apoplastic to Symplastic Phloem Unloading. The Plant Cell 13, 385-398

Weiss, C.A., Garnaat, C.W., Mukai, K., Hu, Y., Ma, H. (1994) Isolation of cDNAs encoding guanine nucleotidebinding protein β-subunit homologues from maize (ZGB1) and Arabidopsis (AGB1). Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 91, 9554-9558 Weiss, C.A., Huang, H., and Ma, H. (1993) Imunolocalization of the G protein α subunit encoded by the GPA1 gene in Arabidopsis. Plant Cell 5, 1513-1528. Weiss, C.A., White, E., Huang, H., Ma, H. (1997) The G protein α subunit (GPα1) is associated with ER and the plasma membrane in meristematic cells of Arabidopsis and cauliflower. FEBS Letters 407, 361-367

36