Analýza DNA
Co zjišťujeme u DNA genetickou podstatu konkrétních proteinů mutace – bodové, sekvenční delece/inzerce nukleotidů, chromosomové aberace (numerické, strukturální) polymorfismy – konkrétní mutace, které se vyskytují v populaci s frekvencí vyšší než 1% podobnost DNA mezi druhy organismů koncentraci, čistotu, chemické vazby s proteiny, funkci a ACGGTCGACTGCGATGAACTCCC mnoho dalších vlastností
ACGGTCGACTGCGATCAACTCCC ACGGTCGACTGCGATTTGAACTCCC
DNA
izolace detekce DNA specifické analýzy DNA struktury hlavní metody pro práci s DNA: PCR sekvenace RFLP DNA hybridizace - blotting
PCR – polymerase chain reaction
Nobelova cena za její objev v roce 1984
obdoba DNA replikace, která se odehrává v buňkách
amplifikace (zmnožení) vybraných úseků DNA
u oblasti, kterou se snažíme amplifikovat musíme znát sekvenci koncových částí
cyklické střídání těchto teplotních kroků:
denaturace – dvoušroubovice se oddělí na jednotlivá vlákna (vliv teploty či chemických činidel) annealing (čti anýlink)– ke koncové oblasti vybraného úseku se přiloží primery (cca 20bp dlouhé oligonukleotidy – jednovláknové řetězce) elongace – prodloužení primeru vkládáním jednotlivých dNTP (A,G,C,T) podle komplementarity k templátové DNA
3´ 5´
5´ 3´
primer
Princip PCR Teplotní denaturace
Annealing primerů
Elongace
Teplotní denaturace
Annealing primerů
Elongace
PRINCIP METODY PCR
1. CYKLUS
5´ 3´
3´ 5´
5´
3´
3´
5´
(1 MOLEKULA) DENATURACE
PRIMERY 5´
3´
3´
5´ Taq POLYMERÁZA
5´ 3´ 5´ 3´
3´ 5´ 3´ 5´
(2 MOLEKULY) DENATURACE PRIMERY
2. CYKLUS
Taq POLYMERÁZA
(4 MOLEKULY)
3. CYKLUS
DENATURACE PRIMERY Taq POLYMERÁZA
(8 MOLEKUL) 4. CYKLUS
(16 MOLEKUL)
5. CYKLUS
(32 MOLEKUL)
PCR v reakci: templát (DNA), Taq-polymeráza (teplotně stabilní), primery, dNTP (jednotlivé nukleotidy) a vhodný pufr z jednoho cílového lokusu pro dané primery vznikne po 1 cyklu denaturace, annealingu a elongace vždy dvojnásobek DNA fragmentů (velikost fragmentu je dána primery) možno vyjádřit matematicky 2n – kde n je počet cyklů
Kolik bude DNA fragmentů po 8 PCR cyklech? 28= 256
Elektroforéza metoda, která slouží k rozdělení naamplifikovaných DNA fragmentů o nestejné délce DNA má celkově slabě negativní náboj a v elektrickém poli putuje ke kladné elektrodě rychlost putování je závislá na její celkové délce gel (agaróza, polyakrylamid) je ponořen do vhodného pufru mezi elektrody – v gelu u záporné elektrody jsou jamky, do kterých se dává vzorek DNA – pustí se elektrický proud – po čase se fragmenty rozdílných délek rozdělí – vizualizace fragmentů se provádí například ethidiumbromidem (interkalačního činidla), které svítí v UV světle
Sekvenace zjištění konkrétní sekvence vybraného úseku DNA řetězce Sangerova metoda s použitím chemicky modifikovaných dNTP – ddNTP (dideoxynukleotidy) do PCR reakce se dá: produkt předchozí PCR, primer z jedné strany, pufr, polymeráza a mix normálních dNTP a značených ddNTP za ddNTP si při elongaci už nemůže přisednout žádný normální nukleotid a dojde tedy k terminaci elongace při vhodných podmínkách sekvenační PCR se syntetizují řetězce všech možných velikostí ddNTP jsou fluorescenčně značené (každý nukleotid A,G,T,C jinak) a při specifické elektroforéze udávají sekvenci DNA řetězce
Sekvenace - Sanger AAGTCCGATCGTTAGCTTCCGAATTGCATGGCAACTGCAGATCGATGCAAGTGCCGATC TTCAGGCTAGCAATCGAAGGCTTAACGTACCGTTGACGTCTAGCTACGTTCACGGCTAG začne probíhat sekvenační PCR s mixem dNTP a fluoresčenčně značenými ddNTP AAGTCCGATCGTTAGCTTC AAGTCCGATCGTTAGCTTCC AAGTCCGATCGTTAGCTTCCG AAGTCCGATCGTTAGCTTCCGA AAGTCCGATCGTTAGCTTCCGAA AAGTCCGATCGTTAGCTTCCGAAT AAGTCCGATCGTTAGCTTCCGAATT AAGTCCGATCGTTAGCTTCCGAATTG AAGTCCGATCGTTAGCTTCCGAATTGC nejkratší fragment ve schématu bude svítit červenou barvou a nejdelší také červenou
speciální elektroforéza s laserovou detekcí fluorescenčně barvených ddNTP
Restrikční endonukleázy - restriktázy enzymy, které štípou dvouvláknovou molekulu DNA uvnitř řetězce a to vždy v konkrétní pozici, charakteristické pro danou restriktázu např. Eco R1 – restriktáza izolovaná z Escherichia coli, která specificky štípe v sekvenci G^AATTC
AATGCTAATGCCTAGTCAAGCTTTCATCGAGAATTCCAGTCGAA TTAGCTTTACGGATCAGTTCGAAAGTAGCTCTTAAGGTCAGCTT
AATGCTAATGCCTAGTCAAGCTTTCATCGAG TTAGCTTTACGGATCAGTTCGAAAGTAGCTCTTAA
AATTCCAGTCGAA GGTCAGCTT
Identifikace restrikčních míst Na uvedeném vlákně najděte restrikční místa pro nabídnuté enzymy
restrikční místo Alu I
AG / CT
Sau 3AI
/ GTAC
Msp I
C / CGG
5´G.G.G.C.G.T.A.C.A.T.A.G.C.T.A.A.T.G.G.C.A.A.G.C.T.A.T.G.G.T.3´
8
RFLP – restriction fragment length polymorphism charakteristické fragmenty pro každého jedince po naštípání celkové DNA restriktázami jednotlivé cílové sekvence vybraných restriktáz mohou být mutovány, nebo v rámci jiných delecí/inzercí posunuty každý člověk má proto charakterictické rozložení restrikčních míst pro určitou restriktázu (restrikční mapy) Mendelovská dědičnost délky restrikčních fragmentů EcoRI – štípání fragmentů 2 jedinců AGAATTCGCCGATCGATCGATCGATCGATCGATCGATCGATTGAGCTCGAATTCC AGAATTCGCCGATCGATCGATCGATCGATCGATCGATCGATCGATTGAGCTCGAATTCC
na elektroforéze bude mít druhý jedinec delší fragment
RFLP – restriction fragment length polymorphism
Southern - blotting jméno po objeviteli Southernovi v doslovném překladu pijákování – tzn. nasátí PCR produktů z elektroforetického gelu na membránu (nylonovou) a jejich následná analýza hybridizace = spojení dvou jednovláknových DNA podle pravidla komplementarity gel se denaturuje v chemickém činidlu – tím se denaturuje i dvouvláknová DNA a na membránu jsou blottována jen jednořetězcová vlákna a to v takovém uspořádání, v jakém byla na elektroforetickém gelu následuje hybridizace s radioaktivně značenou próbou – membrána je ponořena do roztoku s jednovláknovým radioaktivně značeným řetězcem DNA na základě komplementarity buď dojde nebo nedojde k hybridizaci nenavázaná próba je odmyta – v případě úspěšné hybridizace svítí na membráně v určité oblasti dvoušroubovice tvořená jedním vláknem ze studované DNA a jedním vláknem próby umožňuje z velkého množství fragmentů podobných délek (např. po štěpení celkové DNA restrikčními endonukleázami) specificky detekovat DNA fragment
Southern - blotting
Southern blot – hybridizace sondy DNA
Sonda
Zahřátí (denaturace) Ochlazení (renaturace)
12
Fenylketonurie
defekt genu pro fenylalanin hydroxylázu (PAH) – AR onemocnění PAH – 13 exonů mnoho mutací (více než 400 známých v roce 2000)
Fenylketonurie
PAH gen • Mutace - např. delece v 2. exonu
• detekce systémem restrikční endonukleázy (viz obrázek) Při negativním výsledku vyšetření jednoho exonu → vyšetření mutací v dalších exonech
RFLP metoda
Autosomálně recesivní onemocnění (např. cystická fibróza, fenylketonurie)
Vyšetření je informativní Druhá dcera má genotyp Aa
RFLP – prenatální vyšetření Fenylketonurie - AR A)
B)
Vyšetření je informativní Plod heterozygot - zdravý
RFLP metoda Polycystická choroba ledvin - AD Vyšetření je informativní Druhá dcera má genotyp aa
RFLP metoda GR onemocnění – hemofilie (obdobné pro barvoslepost)
Dcera zdravá Genotyp X+Xh Přenašečka
Polymorfismy lidské DNA využívané ve vazebné analýze, přímé a nepřímé diagnostice
Mikrosatelity (syn. krátké tandemové repetice) STR…short tandem repeats, SSR…simple sequence repeats
TAGCCATCGGTACACACACACACACACAGTGCTTCAGTAGC TAGCCATCGGTACACACACACACAGTGCTTCAGTAGCGTAG Pokud se detekovatelný polymorfismus nachází dostatečně blízko lokusu, ve kterém se vyskytuje kauzální mutace pro sledovanou chorobu, bude tento polymorfismus ve vazbě s mutovanou alelou a ve většině případů bude současně s ní předáván z rodičů na potomky (kosegregace) a bude možné jej využít jako marker i bez znalosti molekulární podstaty daného onemocnění. 3
Polymorfismus typu (CA)n Variabilní místa mikrosatelitů (STRP – short tandem repeat polymorphism) Mapování lidského genomu, nepřímá diagnostika Vysoká variabilita – vysoká informativita (v rodinách je 80 % heterozygotů v CA repeticích) Vazebné mapy lidského genomu → 2-3 tisíce STRP FAP – AD onemocnění Gen APC ( tumor-supresor) leží v oblasti 5q21: v rodině s výskytem FAP byl pomocí PCR vyšetřen polymorfismus (CA)n v lokusu D5S346, který leží 30 – 70 kb za APC genem → na základě tohoto vyšetření bylo posouzeno nosičství mutované alely
Polymorfismus typu (CA)n
I
1
II
2
1
III
2
1
alely 6 9 10 11 12
2
3
3
4
5
4
5
DNA čipy - microarrays moderní metoda analýzy DNA v několika lokusech současně genové čipy obsahují velké množství sond, které hybridizují s různými oblastmi genomu rovněž využívá hybridizace využití nanotechnologií – manipulace se vzorky probíhá převážně roboticky a vyhodnocení je softwarové
