STRUKTURA DNA
GENETIKA BAKTERIÍ DNA
transkripce retroviry
replikace
RNA
translace
PROT.
RNA viry
T
A
G
Ade
Thy
Cyt
O 5' HO P O O-
3' O O P O O-
5'
Gua
5' 3' O O P O O-
G-C
O
O
O
O
C
3'
5'
OH P P P O
3'
OH
• ŘETĚZEC ssDNA • PÁROVÁNÍ BASÍ – DVOUŠROUBOVICE dsDNA
• REPLIKACE – SEMIKONZERVATIVNÍ
A-T
CENTRÁLNÍ DOGMA
MIKROBIÁLNÍ DNA • CHROMOSOMÁLNÍ DNA: – VELIKOST: E.coli 1,4mm Člověk 1,8m – BEZ JADERNÉ MEMBRÁNY – UZAVŘENÝ KRUH DVOUŠROUBOVICE Borrelia: lineární molekula DNA – NADŠROUBOVICOVÉ USPOŘÁDÁNÍ – INTERAKCE S BAZICKÝMI PROTEINY (ne histony)
•
EXTRACHROMOSOMÁLNÍ DNA: – PROFÁGY – PLASMIDY – TRANSPOSOMY
REPLIKACE DNA • RYCHLOST: – E.coli 750-1000bp/s (1) – Euk. 50-100bp/s (103-104)
• JEDEN REPL. POČÁTEK • MODEL Y-VIDLICE – OBOUSMĚRNÁ ( Θ-struktura) – VIDLICE + REPLIKAČNÍ ENZYMY JSOU ASOCIOVÁNY S PLAZMATICKOU MEMBRÁNOU (oddělení chromosomů)
• MODEL ROTUJÍCÍHO KOLEČKA (rolling-circle) – KONJUGACE – FÁG ΦX174
1
SCHEMA REPLIKACE
MECHANISMUS REPLIKACE
T
A
G
Ade
Thy
Cyt
O O P O O3'
5' O O P O O-
3'
3'
5'
Gua O
O
O
O O 5' HO P O O-
C
5'
OH P P P O
3'
OH
• DNA POLYMERASA – – – – – –
•
SYNTHESA DNA v 5´ B 3´ SMĚRU (volný 3´-OH) DNA TEMPLÁT (3´ B 5´ vlákno), dXTP DNApol I (doplnění DNA po primeru, OPRAVY, 400 molek/buň) DNApol II (SOS opravy DNA, 100 molekul/buňku) DNApol III (REPLIKACE, 10 molekul/buňku) Chyba 3x10-5
HELIKASA – ROZPLÉTÁNÍ DVOUŠROUBOVICE – RYCHLOST 75-100kbp/s, ATP-dependentní
• SSB proteiny (single-strand DNA binding proteins) • TOPOISOMERASA – UVOLŇOVÁNÍ NADŠROUBOVICOVÉ STRUKTURY
MECHANISMUS REPLIKACE
TRANSKRIPCE A TRANSLACE • TĚSNĚ NÁSLEDUJÍCÍ PROCESY
• DNA GYRASA
– STRUKTURA GENOMU, BEZ MEMBRÁNY – REGULACE ATENUACÍ (Trp-operon E.coli)
– TVORBA NADŠROUBOVICOVÉ STRUKTURY
• PRIMOSOM-PRIMASA
• TRANSKRIPCE (PŘEPIS GEN.INFORMACE DO RNA)
– SYNTHESA RNA PRIMERU
– RNA polymerasa
• RNasa H – ODSTRANĚNÍ PRIMERU
• DNA LIGASA – SPOJENÍ OKAZAKIHO FRAGMENTŮ – BAKTERIE (NAD+ dep.), EUK. (ATPdep)
• ANTIBIOTIKA – – – –
R
AKTINOMYCIN D H H N O O N
• TRANSLACE (PŘEKLAD GEN.INFORMACE mRNA DO SEKVENCE PROTEINU) R
N O
RIFAMPICIN: blokace primasy (RNApol), β-subj. CH3 KYS. NALIDIXOVÁ: inhibice α-subjednotky gyrasy COUMERMYCIN: inhibice β-subjednotky gyrasy (ATPasa) CHROMOMYCIN, AKTINOMYCIN D: interkaláty DNA
– RIBOSOM PRIBNOW BOX
O CH3
OBLAST -35
TTGACA
OBLAST -10
SHINE-DALGARN Seq. ATG
TATAAT
11-15 7 PROMOTOR RNApol
GENE
18-24
4-9 3-9 2-11 INICIACE TRANSKRIPCE INICIACE TRANSLACE mRNA 16S rRNA/RIBOSOM
PROTEIN
2
TRANSKRIPCE
•
•
– Katalytická část: α2 ββ´ – Regulace: σ-faktor
RNA polymerasa
CH3 CH3
O HO RNA polymerasa H3C O H3C – E.coli 20-5000aktivních/7000molekul H3C – Rychlost 40nk/sec při 37C, chyba 10-5 H3CO H3C 480kDa, podjednotky: O
OH O OH OH
O
• Terminace transkripce tvorbou vlásenky
CH3 NH
CH3
• 480kDa, podjednotky: • Katalytická část: α2 ββ´
– α - rozpoznání promotoru a regulace – β - vazba ribonukleotidů – β´- vazba DNA – ω - správná struktura enzymu a asociace podjednotek – σ-faktor (rozpozná počátek genu, promotor, a po počátku transkripce oddisociuje)
OH N N
O N
H3C
– Vlásenka a 6U – PolyU a ρ-faktor
• Rifampicin: vazba na β-podjednotku
Terminace transkripce • Vlásenka a 6U • PolyU a ρ-faktor
REGULACE TRANSKRIPCÍ • modifikace RNApol (sigma podjednotky, ADP-ribosilace) • variace promotoru (rozdílná vazebná interakce) • Genová indukce – katabolická indukce β-galaktosidasy laktosou
•
Genová represe – katabolická represe Glc – Trp- operon, His-operon
TRANSCRIBED GENES REG
P O
GENES
lac-operonu, DIAUXIE (dvojrůst) TRANSCRIBED GENES REG
inducer
inactive represor
mRNA active represor
inactive represor
P O active represor
GENES
mRNA
NOT TRANSCRIBED GENES
NOT TRANSCRIBED GENES REG
P O
REG
GENES
NO mRNA
P O active represor
inactive represor
GENES NO mRNA
corepresor
3
Teorie
lac-OPERONU •
NC1965, F Jacob, A Lwoff, J Monod "for their discoveries concerning genetic control of enzyme and virus synthesis"
•
E.coli lac transtription-control genes – – –
- laktosa, + glukosa • dostatek ATP + laktosa, + glukosa • dostatek ATP -glukosa, + laktosa • nedostatek ATP • ATP se štěpí na cAMP • interakce cAMP s CAP proteinem (catabolite activator protein), vazba na promotor • zesílení interakce RNApol s promotorem
Lac-OPERON CAPsite
P
O
GENES
RNApol
aCAP cAMP
nCAP
mRNA
INICIACE TRANSLACE • INICIAČNÍ FAKTORY IF-1, IF-2, IF-3 • mRNA (AUG) • PODJEDNOTKY RIBOSOMU • fMet-tRNA • GTP) • Tetracyklin – reversibilní vazba na 30S, ne AA-tRNA
•
Aminoglykosid – ireversibilní vazba na 30S, ne IK
• PŘEKLAD – – – – •
TRANSLACE
KODON BAMINOKYSELINA 64 kodonů = 61aa + 3STOP STOP: UAA, UAG, UGA START: Methionin AUG • Občas prok. GUG/euk. CUG
NC1968, RW Holley, HG Khorana, MW Nirenberg"for their interpretation of the genetic code and its function in protein synthesis"
• mRNA • 20 aa-tRNA syntetáz • RIBOSOM – 70S (2,8milDa) – MALÁ PODJEDNOTKA: 30S (16SrRNA, 21 PROTEINŮ) – VELKÁ PODJEDNOTKA: 50S (5SrRNA, 23SrRNA, 31 PROTEINŮ)
TRANSLACE: elongace a terminace • ELONGAČNÍ FAKTORY – EF-Tu, EF-Ts (GTP, aa-tRNA) – EF-G (GTP, posun po mRNA)
• Chloramfenikol: reversibilní vazba na 50S, ne transpeptidace • Makrolidy a linkosamidy: ireversibilní vazba na 50S, ne translokace po mRNA • TERMINAČNÍ FAKTORY – RF-1, RF-2 (vazba UAA, UAG, UGA) – RF-3 (GTP, štěpení proteintRNA)
4
• REGULACE SOUHROU TRANSKRIPCE S TRANSLACÍ • Trp-OPERON
ATENUACE
– 4 MÍSTA PRO TVORBU VLÁSENKY – MÍSTO 1 OBSAHUJE Trp KODONY – VLÁSENKA 3-4 a polyU TERMINACE
• (a) BEZ RIBOSOMU, VLÁSENKA 1-2 A 3-4, TERMINACE • (b) NEDOSTATEK TrptRNA, POMALÁ TRANSLACE, VLÁSENKA 2-3, TRANSLACE PROBĚHNE • (c) DOSTATEK Trp-tRNA, VLÁSENKA 3-4, TERMINACE
REGULACE ENZYMOVÝCH REAKCÍ •
RYCHLOST SYNTÉZY ENZYMU: – transkripce: teorie OPERONU • modifikace RNApol (sigma podjednotky) • variace promotoru (rozdílná vazebná interakce) • negativní regulace represorem (indukce lac-operon, represe his-operon) • positivní regulace na promotoru (katabolická represe Glc, DIAUXIE) – translace: interakce mRNA a ribosomu (frekvence iniciace rozdílnou komplementaritou mRNA s 3´koncem 16SrRNA) – Souhra transkripce a translace: atenuace (syntéza Trp)
REGULACE ENZYMOVÝCH REAKCÍ • FEED BACK – 1954 Novick, Szilard: syntesa Trp v E.coli) zpětnovazebná inhibice E1 produktem D, A Ö(E1) Ö B Ö(E2) Ö C Ö(E3) Ö D + indukce E1 katabolitem A
•
ALLOSTERIE
•
KOVALENTNÍ MODIFIKACE
– 1963 Monod, Changuex, Jacob: allosterie (E1 má regulační místo pro D) – fosforylace/defosf. – adenylace: glutamin syntetasa E.coli, vstup amonných iontů do metabolismu – ADP-ribosylace: alfa podjednotka RNApol do 4minut po infekci E.coli T4fágem – ox./red. SH-skupin: pyruvát lyasa E.coli
• RYCHLOST DEGRADACE – diferenciace (sporulace), hladovění, stres (ATPdependentní proteasy)
CHYBY DNA • CHYBY PŘI REPLIKACI: – E.coli: 10-9/REPLIKOVANÉ bp, – 10-6/GEN/GENERACE
• CHYBĚJÍCÍ BASE: DEPURINACE • ZMĚNA BASE NA ŠPATNOU – SPONTÁNNÍ DEAMINACE • C BU • A B hypoxanthine
• UV-INDUKOVANÉ PIRIMIDIN DIMERY – cyclobutan nebo 6-4 fotoprodukt
• ŠPATNÁ REPLIKACE (inkorporace) – tautomerní formy basí – imino forma adeninu - cytosin – enol forma thyminu - guanin
5
PREREPLIKAČNÍ OPRAVNÉ SYSTÉMY DNA
POSTREPLIKAČNÍ OPRAVY DNA • POSTREPLIKAČNÍ EXCISE
• FOTOREAKTIVACE
– ENDONUKLEASY uvrABCD ATPdep (uvrAB-scan, UvrBCexonukleasa/12-13bp, UvrD-helikasa) – DNApol I a LIGASA
– DNA FOTOLYASA ŠTĚPÍCÍ TT- PYRIMIDIN DIMER – NUTNÉ UV – FADH2
• ŠPATNÉ PÁROVÁNÍ: mutHLS – methylace Ade v sekvenci GATC – DNA adenin methylasa (dam)
• ODSTRANĚNÍ ŠPATNÉ INKORPORACE (U)
• EXCISE DNApol III
– Uracil-DNA N-glycosylasa a APIRIMIDINOVA endonukleasa – DNApol I A LIGASA
– 3´5´EXONUKLEASOVÁ AKTIVITA ε- PODJ. DNApol III – LIGASA
• ODSTRANĚNÍ REPLIKAČNÍ MEZERY REKOMBINACÍ – PROTEIN recA: VAZBA VOLNÉ ssDNA, NAJITÍ SESTERSKÉ DNA, ŠTĚPÍ HOMOLOGNÍ REGION – DNApol I A LIGASA
• INDUCIBILNÍ SOS OPRAVY – PROTEIN recA VÁŽE ssDNA A STÁVÁ SE PROTEOLYTICKY AKTIVNÍ K REPRESORU lexA REGULUJE (recA, uvrA,B,C,...) – OPRAVA NÁCHYLNÁ K ZMĚNÁM: MUTACE>> ZASTAVENÍ
REKOMBINACE
mutHLS versus SOS • Dle legitimity
– LEGITIMNÍ • MÍSTO HOMOLOGIE DNA • PRODUKTY recGENŮ – NELEGITIMNÍ • HOMOLOGIE TRANSPONOVATELNÝCH ELEMENTŮ
• Dle výměny ss/dsDNA – OBOUSTRANNÁ (HOLLIDAY MODEL) – JEDNOSTRANNÁ (BĚHEM TRANSFORMACE)
• PODMÍNKY REKOMBINACE – BAKTERIE: HAPLOIDNÍ, ASEXUÁLNÍ DĚLENÍ, BEZ MEIOSY – REPLIKACE – PRŮNIK DONOROVÉ DNA (ZABRÁNĚNÍ DEGRADACE ENDONUKLEASAMI) • Integrace do genomu (homologie) • Simulace genomu (plasmid)
6
JEDNOSTRANNÉ REKOMBINACE • PŘI PŘENOSU DNA – ASOCIACE HOMOLOGNÍCH SEKVENCÍ (RecA) – SEPARACE A PÁROVÁNÍ ŘETĚZCŮ – ŠTĚPENÍ ENDONUKLEASOU – DOPLNĚNÍ MEZER (DNApol-I) A LIGACE
• PŘENOS DNA – KONJUGACE (přenos mezi bakteriemi) – TRANSFORMACE (průnik fragmentu volné DNA) – TRANSDUKCE (transport DNA bakteriofágem)
TRANSFORMACE • KOMPETENTNÍ BUŇKY – APARÁT PRO PŘENOS FRAGMENTU DNA DO BUŇKY – INDUKCE EXTRACEL. Ca2+
KONJUGACE • 1946 J.Ledeberg, E.L.Tatum • Plasmid F+ – – – –
Polární nereciproční přenos F+ donor D F- akceptor Častá frekvence, bez přenosu genomu host. Extrachromosomální F faktor (plasmid) • Nositel genů pro F-pilus a přenos plasmidu (tra- operon) • Replikace rolling-circle • (?) Přenos přes pilus X jiný mechanismus
• Plasmid Hfr (high frequency of recombination) – Rekombinace a integrace F-plasmidu do chromosomu hostitele – Častý přenos chromosomu hostitele – 100min/E.coli D nekompletní přenos F-fakt. D F- akceptor
• F´konjugace – – – – –
Integrace plasmidu do chromosomu host. Špatné vyštěpení plasmidu: F´plasmid, přenos několika genů hostitele Po přenosu akceptor (recipient) částečně diploidní merozygot Přednostní přenos některých genů (sexdukce) Užití pro gen. mapping (studium uspořádání genů v chromosomu)
PLASMIDY • 1949 Cavali-Sforza a Heston • Kruhová dsDNA (106-108Da, 103-105nk, 3-100 genů) – geny vlastní replikace, distribuce do dceřiných b., konjugační pili (u autonomě přenosných plasmidů)
• Ovlivnění fenotypu nositele – Kryptické: geny pouze pro plasmid – Ovlivňující fenotyp hostitele • F (fertilisační faktor: sex pilus, konjugace) • R (resistence na ATB) • Col (bakteriociny: coliciny, vibriony, pesticiny, pyociny), • Tox (toxiny) • Vir (adherační fimbrie, kolonizační faktory) • Hly (hemolysiny) • Deg (kuriozní zdroje C, siderofory, redukce těžkých kovů)
• Inkompatibilita (neslučitelnost podobných plasmidů)
7
• TRANSPORT DNA bakteriofágem • PŘI SBALOVÁNÍ HLAVIČKY (2% NAVÍC) • REKOMBINACE S GENOMEM A SBALENÍ VĚTŠÍ ČÁSTÍ GENOMU • GENOVÉ IN.: VNESENÍ DNA DO HOSTITELE
VIRY
• PŘEDNÁŠKA VIROLOGIE • SYSTÉM: s obálkou
bez obálky
Plasmaviridae (L2)
Corticoviridae (PM2) Tectiviridae (PRD1)
TRANSDUKCE
SSV1 group Lipothrixviridae
DNA
dsDNA
dsDNA
Myoviridae, isomeric head (P2) Myoviridae, elongated head (T2, T4)
Siphoviridae (λ, T5) Podoviridae (T3, T7)
ssDNA Cystoviridae (o6)
RNA
Metody molekulární biologie
dsRNA
Microviridae (ΦX174) Inoviridae, Plectrovirus (L51) Inoviridae, Inovirus (fd) Leviviridae (MS2, Qβ)
ssRNA
Restrikční endonukleasy - bakterie
Vlastnosti DNA/RNA
• –
– – –
párování bazí, ds/ss, rekombinace (NC1980, P.Berg "for his fundamental studies of the biochemistry of nucleic acids, with particular regard to recombinant-DNA„) ELEKTROFORÉZA V AGAROZOVÉM GELU SOUTHERN BLOT+NOTHERN BLOT sekvenace (NC1980, W. Gilbert, F. Sanger "for their contributions concerning the determination of base sequences in nucleic acids")
•
– Naštěpení cizorodé DNA, odbourání pomocí exonukleas – Ochrana vlastní DNA methylací: Ade-NH-CH3, Cyt-(5)-CH3
•
–
–
• Štěpí (náhodně?) v místě vzdáleném od rozpoznávané sekvence nejméně 1000 bp – Typ III (endonukleasa + methyltransferasa)
endo/exonukleasy, ligasy, (NC1978 W. Arber, D. Nathans, H. O. Smith "for the discovery of restriction enzymes and their application to problems of molecular genetics") polymerasy (PCR, RT-PCR) (NC1993, Kary B. Mullis "for his invention of the polymerase chain reaction (PCR) method")
• Štěpí v místě vzdáleném od rozpoznávané sekvence nejméně 22-26 bp – Typ II (endonukleasa only)
• Štěpí v místě rozpoznávané sekvence
Vektory
• – –
⇒ manipulace s DNA insertem plasmidy, fágy/kosmidy, YAC
Multienzymové komplexy:
• – – –
Proteosynthesa (in vivo, in vitro) ⇒ rekombinantní protein Replikace DNA v plasmidu (mini/maxi prep) ⇒ cDNA insertu Genomová knihovna ⇒ uchováni a selekce genu/insertu
Typy RE (3) – Typ I (endonukleasa + methyltransferasa)
Enzymy
•
Ochrana před virovou (fágovou) infekcí
– EcoRI: E – rod, co – druh, R – sérotyp/kmen (kmen RY13), I – pořadí objevu – Četnost mist v genomu: 4n = počet nukleotidůpočet nukleotidů v rozpoznávací sekvenci
•
Palindromová sekvence – většina rozpoznávaných sekvencí
8
Nosiče – klonovací vektory • Plasmidy –
kruhová dsDNA 1-200kbp
– max 10kbp insert (díky času replikace, náhodné delece) • MINI/MAXI PREP • KLONOVACÍ/SEKVENAČNÍ/EXPRESNÍ PLASMID • TRANSFORMACE DEFINOVANÝCH KMENŮ
• Bakteriofágy –
lin./circ. dsDNA , do hlavičky 36-51kbp)
– bakteriofág λ (48,5kbp):
• max 16 kbp insertu do střední části fágu – Kosmidy: sekvence 14bp na obou koncích, důležité při balení DNA
• max 49kbp insertu – bakteriofág M13: circ. ssDNA
• max 1kbp insertu
• YAC (yeast artificial chromosome) – lin dsDNA, max insert 100kbp
9
