KERAGAMAN BAKTERI TANAH MINERAL PADA PERKEBUNAN KELAPA SAWIT MENGGUNAKAN TEKNIK TERMINAL TERMINAL RESTRICTION FRAGMENT LENGTH POLYMORPHISM (TRFLP) (Bacterial Diversity in Oil Palm Plantation Mineral Soil by using Terminal Restriction Fragment Length Polymophism (TRFLP)). Irman Januar1, Oom Komala2, Elizabeth C Situmorang3 1.2 Program Studi Biologi FMIPA Universitas Pakuan ABSTRAK Tanah mineral merupakan tanah yang banyak digunakan sebagai lahan pertanian dan perkebunan kelapa sawit. Namun, komunitas bakteri yang ada di dalam tanah mineral masih banyak yang belum dipahami dan perlu diidentifikasi. Oleh karena itu, perlu dilakukan identifikasi terhadap komunitas bakteri tanah mineral tersebut. Tujuan dari penelitian ini adalah menginvestigasi keragaman komunitas bakteri tanah mineral pada perkebunan kelapa sawit PT. SMART Tbk. Metode Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism (TRFLP) dengan enzim restriksi MspI, dan HhaI Metode TRFLP menunjukkan 14,5% komunitas bakteri dapat dikultur dan 85,5% komunitas bakteri belum dapat dikultur. Selain itu, metode TRFLP juga dapat menunjukkan genus bakteri dominan dalam tanah. Genus bakteri dominan tersebut adalah Bacillus, Aeromonas, Deinococcus, Pseudomonas, Burkholderia, Marinobacter, Flavobacterium, Maribacter, Tannerella, Exiguobacterium. Kata kunci: tanah mineral, TRFLP, kelapa sawit, komunitas bakteri, enzim restriksi ABSTRACT Mineral soil is used as agriculture and oil palm plantation. However there are many kind of bacterial communities in mineral soil which have to be understood and investigated. The identification is needed toward diversity of microbial community in mineral soil.The aim in this study is investigated the diversity of microbial community in mineral soil of oil palm plantation at PT SMART Tbk. TRFLP method using HhaI and MspI enzymes showed that the percentage of cultured bacteria was 14.5% and uncultured bacteria was 85.5%. TRFLP method can also elucidate dominant genera of bacteria in was soil. They were Bacillus, Aeromonas, Deinococcus, Pseudomonas, Burkholderia, Marinobacter, Flavobacterium, Maribacter, Tannerella, Exiguobacterium. Keyword: Mineral Soil, TRFLP, Oil Palm, Bacterial Community, Restriction Enzime
PENDAHULUAN Tanah merupakan suatu ekosistem yang mengandung berbagai jenis mikroba dengan morfologi dan sifat fisiologi yang berbeda-beda. Jumlah tiap kelompok mikroba sangat bervariasi, ada yang hanya terdiri atas beberapa individu, ada pula yang jumlahnya mencapai jutaan per gram tanah. Mikroorganisme dalam tanah memegang peranan penting dalam siklus biogeokimia, siklus nutrisi, penguraian bahan organik dan pembentukan tanah. Berbagai jenis mikroba tanah dalam hal ini bakteri telah diketahui berpotensi sebagai pupuk hayati, indikator kualitas dan kesuburan tanah. Bakteri yang umum dijumpai adalah Rhizobium, Azobacter, Azosprilium, Nitrosomonas, Pseudomonas, dan Bacillus (Sutanto, 2002). Bakteri tanah sangat menarik untuk dipelajari dalam rangka memahami keragaman dan manfaat dari bakteri tanah tersebut. eksplorasi dan telaah pemanfaatan bakteri tanah perlu ditunjang oleh suatu penuntun analisis yang memadai agar data yang dihasilkan dapat diandalkan dalam menyusun teknologi pengelolaan tanah yang tepat. Struktur bakteri berdasarkan uji molekuler dilakukan menggunakan Polymerase Chain Reaction (PCR) untuk analisis gen 16S rRNA. Gen ini adalah gen yang mengkodekan RNA ribosomal pada sub unit kecil ribosom dan memiliki urutan khas dan berbeda pada setiap bakteri sehingga bisa dijadikan penanda molekuler untuk proses identifikasi. Metode TRFLP digunakan pada penelitian kali ini karena dapat menganalisa sampel dalam jumlah
besar dengan waktu yang efisien, database banyak tersedia, serta tidak dibutuhkan keahlian maupun kemampuan khusus untuk pelaku operasi alat tersebut (Mulyo, 2009). TRFLP memiliki beberapa keuntungan dibandingkan metode sidik jari genetik lain, seperti memberikan sidik jari ulangan yang sama (Osbom et al., 2000), resolusi yang lebih tinggi (Mars, 1999), serta lebih sensitif. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk memperoleh keragaman bakteri pada tanah mineral dengan menggunakan teknik TRFLP. METODE PENELITIAN Penelitian dilaksanakan di laboratorium teknologi Mikrobiologi mikrobioma PT SMART Tbk pada bulan Maret-Juni 2014. 1. Pengambilan Sampel Sampel tanah yang digunakan berasal dari perkebunan PT SMART Tbk yang terletak di lampung. Sampel tanah diambil pada bagian permukaan dengan kedalaman 0-20 cm. Teknik pengambilan sampel yang digunakan cara acak sesuai dengan kententuan dari Balittanah (Husen, 2004). Pengambilan sampel dilakukan dengan sistem acak, diambil 9 titik untuk mewakili satu area. 2. Ekstraksi DNA DNA bakteri dalam tanah diekstraksi menggunakan MOBIO PowerSoil@ Isolation kit mengikuti langkah-langkah dasar yang ada pada lembar protokol. Setelah DNA berhasil diisolasi, DNA diuji kuantitatif menggunakan spektofotometer NanoDrop dan uji kualitatif dengan metode elektroforesis.
3. Amplifikasi Gen 16S rRNA Bakteri Hasil isolasi genom diamplifikasi menggunakan teknik PCR menggunakan mesin Thermal Cycler ESCO. Bahan yang digunakan adalah KAPPA2G™ Robust PCR kit. Komposisi PCR mix terdiri dari 5X KAPPA2G Buffer B sebanyak 10 µl, Enhanher sebanyak 10 µl, dNTP Mix 10mM sebanyak 1 µl, DNA Polymerase 0,24 µl, primer yang digunakan sebagai Forward adalah 8F berlabel Fluoresent (5’/56FAM/AGAGTTTGATCCTGGCTC AG-3’) dan Reverse 1510R (5’GGTTACCTTGTTACGACTT-3’) masing-masing sebanyak 3 µl, sampel DNA sebanyak 2 µl dan ddH2O hingga mencapai 50 µl kedalam tabung PCR. Hasil mix PCR diletakan didalam mesin PCR Thermal Cycler dengan kondisi yang di atur yaitu pre-denaturation 95°C selama 5 menit, denaturation 95°C selama 30 detik, annealing 60°C selama 15 detik, extention 72°C selama 1 menit, post extention 72°C selama 10 menit, dan suhu penyimpanan 4°C selama waktu yang tidak ditentukan dengan total siklus sebanyak 35 siklus. 4. Purifikasi PCR Product PCR Product dipurifikasi menggunakan MOBIO Powersoil@ DNA Purification Kit . Hasil purifikasi diuji kuantitatif menggunakan spektrofotometer NanoDrop. 5. Pemotongan Gen 16S rRNA DNA hasil purifikasi selanjutnya direstriksi menggunakan enzim restriksi HhaI dan MspI. Dalam campuran reaksi 25µl terdiri atas 12 µl
purified PCR product, 2,5 µl Buffer 10x, 0,5 enzim restriksi, dan ddH2O hingga mencapai volume 25 µl. Untuk enzim HhaI Campuran diinkubasi pada suhu 37°C selama 120 menit dan suhu dinaikan menjadi 65°C selama 20 menit untuk menghentikan reaksi, sedangkan untuk enzim MspI suhu inkubasi 37°C selama 120 menit. Visualisasi menggunkan gel agarose 1% dengan perbandingan sampel dan loading dye 1 : 1 (100V, 50-60 menit). 6. Analisis Data Fragment DNA Hasil restriksi dikirim ke First Base Laboratories Malaysia untuk dilakukan elektroforesis kapiler. Data yang diperoleh berupa peak dan ukuran fragmen DNA yang disebut elektroferogram. Elektroferogram dianalisis menggunakan database MiCA III pada situs http://mica.ibest.uidaho.edu/, dengan menggunakan database MiCA III diperoleh data mengenai keragaman bakteri. HASIL DAN PEMBAHASAN 1. Hasil Uji Kuantitatif dan Kualitatif Isolat Genom Berdasarkan hasil isolasi genom bakteri tanah mineral dengan menggunakan kit MOBIO PowerSoil@ DNA isolation kit, diperoleh hasil DNA yang berkualitas baik yang ditunjukan dengan adanya pita DNA genom. Hasil elektroforesis menunjukan fragmen pita DNA yang dihasilkan berukuran lebih dari 10000 base pair (Gambar 2) dengan konsentrasi genom yang berbeda dari 9 isolat, seperti pada Tabel 1. Dari hasil pengukuran diperoleh rata-rata konsentrasi genom 20,4 ng/µl. Menurut Wilkerson et al.
Dalam Mulyani (2011), bahwa konsentrasi genom yang baik untuk PCR berkisar antara 0,5 sampai 6,5 µg/ml.
Gambar 2. Profil Isolat Genom Menggunakan Elektroforesis Gel Agarose
Tabel 1. Konsentrasi Genom Dari 9 Isolat Tanah Mineral Perkebunan Kelapa Sawit. No
Kode Sampel
Asal
Konsentrasi (ng/ul)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 RataRata
1 2 3 4 5 7 43 45 46
Lampung Lampung Lampung Lampung Lampung Lampung Lampung Lampung Lampung
4,6 26,1 13,8 12,2 11,7 8,8 12,2 36,1 57,7 20,4
Dari data Tabel 1 bahwa konsentrasi isolat genom yang didapatkan pada penelitian ini sudah dapat digunakan untuk tahap PCR. Jika nilai konsentrasi terlalu tinggi harus dilakukan pengenceran hingga konsentrasi tertentu agar dapat digunakan pada proses PCR (Mulyani et al., 2011). 2. Hasil Amplifikasi Gen 16S rRNA Berdasarkan penelitian yang telah dilakukan gen 16S rRNA dari 9
genom berhasil diamplifikasi menggunakan primer 8F berlabel fluoresens FAM dan 1510R dengan ukuran fragmen sebesar 1500-2000 bp (Gambar 3a). Pada hasil elektroforesis memperlihatkan adanya pita terang tebal sejajar satu sama lain (Gambar 3a). Munculnya pita tersebut menunjukan bahwa pasangan primer yang digunakan bersifat spesifik hanya menempel pada posisi yang diharapkan. Ketebalan pita DNA yang beragam dari 9 isolat hal ini disebabkan oleh konsentrasi DNA yang dihasilkan pada tiap-tiap sampel berbeda (Mulyani, 2011). Munculnya pita DNA ganda dari 9 isolat (Gambar 3a) pada hasil uji kualitatif dikarenakan proses PCR pada tahap annealing suhu terlalu tinggi sehingga terbentuk pita DNA yang tidak spesifik (Asy’ari dan Saifuddin, 2005). Setelah suhu diturunkan dari 60°C menjadi 56°C pada tahap annealing didapatkan satu pita DNA tunggal (Gambar 3b).
Gambar 3a. Amplifikasi Gen 16S rRNA.
3. Hasil Purifikasi Pengukuran kemurnian DNA dilakukan dengan metode
spektrofotometri UV-Vis pada panjang gelombang 260nm. Dalam penelitian ini menggunakan alat spektrofotometri NanoDrop. Hasil pengukuran rasio A260/280 terhadap DNA purification Product dari 9 isolat diperoleh kadar kemurnian yang beragam seperti yang ditunjukan pada Tabel 2. Menurut Sambrook et al. Dalam Mulyani (2011) DNA murni untai ganda mempunyai nilai rasio A260/A280 sebesar 1,8-2,0.
Gambar 3b. Optimasi PCR Mendapatkan Satu Pita DNA Tunggal
Tabel 2. Konsentrasi purification Product Dari 9 Isolat Tanah Mineral Perkebunan Kelapa Sawit No. 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Kode Sampel 1 2 3 4 5 7 31 45 46
kemurnian
Konsentrasi (ng/ul)
1,94 1,93 1,78 1,74 1,75 1,89 1,95 1,87 1,83
31,4 68,0 27,0 28,5 31,2 48,3 49,3 68,0 40,8
Dalam penelitian ini diperoleh beberapa purification product kode sampel 3,4,5 dengan nilai rasio yang lebih rendah dari rasio 1,8 hal ini menunjukan purification product
tersebut masih terdapat kontaminan, sangat penting untuk menghilangkan substansi-substansi pengotor seperti primer, nukleotida, dan garam yang akan mengganggu pada proses restriksi. 4.Hasil Restiksi dengan Enzim HhaI dan MspI Fragmen DNA yang dipotong oleh enzim restriksi HhaI dan MspI dapat ditentukan berapa besar ukurannya dengan menggunakan eklektroforesis gel agarose. Hasil purifikasi tersebut berhasil di restriksi oleh enzim HhaI (Gambar 4) dan MspI (Gambar 5), sehingga menunjukan pita DNA yang berbedabeda. Masing-masing enzim restriksi menunjukan ukuran fragmen yang beragam. Hasil restriksi dianalisa lebih lanjut menggunakan elektroforesis kapiler oleh First Base Laboratory untuk pembacaan yang lebih spesifik mengenai ukuran dari sekuen DNA yang telah diidentifikasi. Kedua enzim restriksi tersebut (HhaI dan MspI) menghasilkan fragmen-fragmen 16S rRNA untuk membedakan beberapa kelompok strain bakteri.
Gambar 4. Pita DNA Hasil Pemotongan Enzim Restriksi HhaI
Analisis Data Data DNA yang dihasilkan elektroforesis kapiler berupa peak
yang disebut elektroferogram. Data sampel yang didapatkan berupa Terminal Restriction Fragment (TRF) dalam satuan base pair (bp) dan tinggi/luas area puncak untuk masing-masing TRF dalam elektroferogram.
Gambar 5. Hasil Pemotongan Enzim MspI
Satu TRF dalam elektroferogram dianggap sebagai satu filotipe, sementara luas area dibawah puncak menunjukan kelimpahan relatif dari TRF tersebut (Pangastuti 2008). Setiap data TRF dapat diidentifikasi dengan mencocokan ukuran TRF dengan database. Database yang digunakan adalah MiCA III. Hasil dari analisis keragaman bakteri dengan metode TRFLP menggunakan enzim HhaI dan MspI menunjukan keragaman yang berbeda (Gambar 4 dan 5). Untuk enzim restriksi HhaI menunjukan presentase 12,47% untuk bakteri yang dapat dikulturkan dan 87,39% untuk bakteri yang tidak dapat dikulturkan, 0,10% untuk yang tidak dapat teridentifikasi, dan 0,04% yang tidak diketahui. Sedangkan untuk enzim MspI presentase yang didapat untuk bakteri yang dapat dikulturkan 16,43% dan 83,57% untuk bakteri
yang tidak dapat dikulturkan, 0,19% tidak teridentifikasi, dan 0,02% yang tidak diketahui (Gambar 6). Hasil analisa menggunakan database MiCA III menunjukan ada beberapa genera dominan untuk masingmasing enzim restriksi. Untuk genera yang dominan menggunakan enzim restriksi HhaI menurut hasil analisis dari database MiCA III yaitu Pseudomonas, Flavobacterium, Mycoplasma, Ochrobactrum, Sulfitobacter, Exiguobacterium, Bacillus, Helicobacter, Desulfovibrio, Microbacterium, Leuconostoc, Clostridium dengan kelimpahan yang bervariasi (Gambar 7). Berdasarkan database MiCA III Untuk enzim MspI genera bakteri yang dominan Bacillus Aeromonas, Deinococcus, Burkholderia, Pseudomonas, Maribacter Tannerella, Marinobacter, Enterobacter, Cardinium, dengan kelimpahan tertinggi genus Bacillus (Gambar 8) mencapai 44.8%. Hasil kombinasi kedua enzim restriksi tersebut menunjukan bahwa genera dominan yang terdapat di tanah mineral yaitu Bacillus, Aeromonas, Deinococcus, Pseudomonas, Burkholderia, Marinobacter, Flavobacterium, Maribacter, Tannerella, Exiguobacteriu. Berdasarkan hasil penelitian ini Metode TRFLP terbukti lebih efisien, mudah dilaksanakan, dan dapat menganalisis komunitas bakteri tanah secara langsung dalam jumlah besar jika dibandingkan dengan metode pengkulturan. Hal ini sesuai dengan pernyataan Mulyo (2009) bahwa metode TRFLP dapat menganalisis sampel dalam jumlah besar dengan waktu yang efisien, dan
database banyak tersedia. Data yang diperoleh dari metode TRFLP terbukti lebih sistematis dan terperinci dengan jelas sehingga hasil data mudah dimengerti. Pada penelitian ini metode TRFLP memiliki kelebihan jika dibandingkan dengan metode pengkulturan, karena metode TRFLP dapat menganalisis bakteri yang belum dapat dikultur, berbeda dengan metode pengkulturan yang
%
100.00%
%
87.39% 12.47%
0.00%
terbatas hanya dapat menganalisis bakteri yang dapat dikultur. Dari hasil analisis TRFLP lebih lanjut menggunakan database MiCA III diperoleh genera bakteri dominan dari setiap enzim restriksi. Genera bakteri dominan yang terdeteksi oleh kedua enzim yang digunakan memiliki beberapa perbedaan. Hal ini dikarenakan bahwa setiap enzim restriksi memiliki situs pemotongan yang berbeda-beda (Kent et al. 2003).
cultured
83.36% 0.10% 0.04%
uncultured HhaI
16.43%
unidentified
0.19% 0.02% Enzim unknown MspI
Gambar 6. Distribusi Kelimpahan Bakteri yang Terkultur dan Tidak Terkultur . 6% 6% 7% 6% 4% 4% 5% 3% 3% 4% 2% 2% 2% 2% 2% 2% 3% 2% 1% 0%
Genera
%
Gambar 7. Kelimpahan Genera Bakteri pada Enzim HhaI 50.0% 40.0% 30.0% 20.0% 10.0% 0.0%
44.8% 12.4% 11.1% 13.0%
9.0%
6.8%
6.5%
5.9%
5.1%
4.6%
Genera Gambar 8. Kelimpahan Genera Bakteri pada Enzim MspI
KESIMPULAN DAN SARAN Kesimpulan
Hasil dari penelitian ini menunjukan bahwa metode TRFLP
dapat menyingkapkan keragaman komunitas bakteri yang beragam. Persentase rata-rata bakteri yang dapat dikultur yaitu 14,4% dan yang tidak dapat dikultur 85,5%. Metode TRFLP dapat menentukan beberapa genus bakteri yang dominan berdasarkan kelimpahan yang tertinggi pada tanah mineral perkebunan kelapa sawit yaitu Bacillus, Aeromonas, Deinococcus, Pseudomonas, Burkholderia, Marinobacter, Flavobacterium, Maribacter, Tannerella, Exiguobacterium. Saran Perlu digunakan enzim restriksi lain seperti HinfI, HaeIII dan enzim restriksi lain untuk mendapatkan keragaman bakteri yang lebih akurat, dan perlu dilakukan penelitian lebih lanjut untuk pemanfaatan bakteri pada tanah mineral DAFTAR PUSTAKA Asy’ari M, Saifuddin N. 2005. Optimasi Konsentrasi MgCl2 dan Suhu Annealing pada Proses Amplifikasi Multifragmens mtDNA Dengan Metoda PCR. JKSA 8(1). Kent AD, Smith DJ, Benson BJ, Triplett EW. 2003. Webbased phylogenetic assignment tool for analysis of terminal restriction fragment length polymorphism profiles of microbial communities. J Microbiol 69:11. Marsh TL. 1999. Terminal restriction fragment lenght polymorphism (T-RFLP): an emerging method for characterizing diversity
among homologous population of amplification products. Curr Opin Microbiol 2:323-327. Mulyani Y et al. 2011. Perbandingan beberapa metode isolasi DNA untuk deteksi dini koi herpes virus (KHV) pada ikan mas (Cyprinus carpiol). Universitas Padjajaran Vol 2(1). Mulyo LA. 2009. Reproduksibilitas Teknik Terminal Restriction Fragment Lenght Polymorphism Untuk Analisis Komunitas Bakteri. J Microbiol 1:1. Osborn AM, Moore ERB, Timmis KN. 2000. An evaluation of terminal-restriction fragment lenght polymorphism (TRFLP) analysis for the study of microbial community structure and dynamics. Environ Microbiol 2:39-50. Pangastuti A. 2008. Analisis Komunitas Bakteri Selama Tahapan Perkembangan Larva Udang Putih (Litopenaeus Vannamei). [DISERTASI]. Bogor. Sekolah Pasca Sarjana Institut Pertanian Bogor. Saraswati R, Husen E, Simanungkalit RDM. 2007. Metode Analisis Biologi Tanah. Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Sumber Daya Lahan Pertanian. Bogor. Sutanto R. 2002. Penerapan Pertanian Organik. Kanisius. Yogyakarta.
