FACULTEIT GENEESKUNDE EN GEZONDHEIDSWETENSCHAPPEN
Academiejaar 2010 - 2011
IN VITRO STUDIE NAAR HET PRO- EN/OF ANTI-INFLAMMATOIR EFFECT VAN UREMISCHE RETENTIESTOFFEN OP LEUKOCYTEN: ROL VAN POLYOLEN
Ruben CLAEYS
Promotor: Prof. Dr. R. Vanholder Co-promotor: Dr. G. Glorieux
Scriptie voorgedragen in de 2de Master in het kader van de opleiding tot
MASTER IN DE GENEESKUNDE
4
FACULTEIT GENEESKUNDE EN GEZONDHEIDSWETENSCHAPPEN
Academiejaar 2010 - 2011
IN VITRO STUDIE NAAR HET PRO- EN/OF ANTI-INFLAMMATOIR EFFECT VAN UREMISCHE RETENTIESTOFFEN OP LEUKOCYTEN: ROL VAN POLYOLEN
Ruben CLAEYS
Promotor: Prof. Dr. R. Vanholder Co-promotor: Dr. G. Glorieux
Scriptie voorgedragen in de 2de Master in het kader van de opleiding tot
MASTER IN DE GENEESKUNDE
4
Inhoudstafel Abstract
1
Inleiding
2
Renale functies
2
Chronisch nierfalen
2
Therapie
5
Hart- en vaatziekten en inflammatie bij CKD
6
D0e polyolen
9
Oxidatieve stress bij CKD
13
Principe van de bursttest
14
Flowcytometrische analyse
15
Methodologie
21
Reagentia
21
Experimentele setup
21
Bloedcollectie
22
Osmolaliteitsmeting
22
Endotoxine concentratie
23
Leukocyten telling
23
Oxidatieve burst
24
Statistiek
25
Resultaten
26
Osmolaliteitsmeting
26
Endotoxine concentratie
26
Leukocyten telling
26
Oxidatieve burst activiteit van leukocyten
27
Discussie
31
Referenties
34
5
Abstract Achtergrond: Het uremisch syndroom wordt gekenmerkt door de retentie van uremische toxines in het bloed bij CKD patiënten. Een bepaalde klasse van toxines zijn de polyolen, waartoe myoinositol, erythritol, sorbitol, mannitol, arabitol en threitol behoren. Dit zijn allen suikeralcoholen waarvan tot op heden weinig gekend is over hun effecten bij uremische concentraties. Deze studie onderzoekt of de polyolen een effect hebben op de oxidatieve burst activiteit van leukocyten, en op die manier kunnen bijdragen tot enerzijds een toegenomen inflammatie leidend tot vasculaire complicaties en anderzijds een verhoogde vatbaarheid voor infecties (indien een antiinflammatoir effect) die kunnen optreden bij CKD patiënten. Dit onderzoek is een onderdeel van de studie van de EUTox werkgroep die op een gestandaardiseerde manier onderzoekt welke uremische toxines verantwoordelijk zijn voor de verstoorde immuunrespons. Methoden:Via het uitvoeren van de bursttest en flowcytometrische analyse ervan wordt het effect van de polyolen op de oxidatieve burst activiteit van de 3 hoofdtypes leukocyten nagegaan, zowel basaal als na stimulatie met fMLP, E. Coli en PMA Resultaten: De polyolen erythritol en myoinositol vertonen een stimulerend effect op de monocyten, zowel basaal als na matige stimulatie met fMLP. Ze vertonen eveneens een stimulerend effect op de lymfocyten na sterke stimulatie met E. Coli en PMA. Arabitol daarentegen vertoont een inhiberend effect op de monocyten, zowel basaal als na fMLP stimulatie en een inhiberend effect op de granulocyten en lymfocyten onder basale omstandigheden. Arabitol vertoont eveneens een stimulerend effect op de lymfocyten na PMA en E. Coli stimulatie. Threitol heeft een inhiberend effect op de basale vrije radicalen productie van zowel de monocyten, granulocyten en lymfoctyen en een stimulerend effect op de lymfocyten na PMA stimulatie. Conclusie: De polyolen hebben wel degelijk een effect (zowel pro- als anti-inflammatoir) op de oxidatieve burst activiteit van de leukocyten en kunnen zo bijdragen tot de verhoogde inflammatie en het verhoogde risico op cardiovasculair lijden bij CKD.
1
Inleiding Renale functies
De voornaamste functie van de nieren is de homeostatische controle [1]. Ze zuiveren het bloed van afvalstoffen en metabolieten en elimineren deze samen met water onder de vorm van urine [2]. Daarnaast hebben ze ook een belangrijke endocriene functie. De nieren staan onder meer in voor de secretie van het erythropoïetine dat de aanmaak van de rode bloedlichaampjes stimuleert. Het renine dat via een effect op het renine-angiotensine-aldosteron systeem instaat voor de bloeddrukregeling, wordt eveneens door de nieren gesecreteerd [2]. Een derde hormoon dat door de nieren wordt gesecreteerd is het 1,25 dihydroxyvitamine D. Bovendien hebben de nieren ook een indirecte invloed op de concentraties van andere hormonen in het lichaam via de klaring ervan (bv. humaan choriongonadotrofine bij zwangere vrouwen) [1].
Chronisch nierfalen (CKD: Chronic Kidney Disease)
Chronisch nierfalen wordt beschreven als een progressieve vermindering van de glomerulaire filtratiesnelheid (GFR : glomerular filtration rate). De aandoening wordt gediagnosticeerd aan de hand van volgende criteria: een GFR waarde kleiner dan 60 ml/min/1.73m² of tekenen van nierschade zoals afwijkende bloedwaarden ( bv. hematocriet, creatinine, ureum, urinezuur, ionogram) of urinetests ( bv. urineonderzoek en sediment, urinestrips voor eiwit of bloed) of afwijkingen zichtbaar bij beeldvormende onderzoeken ( bv. echo nieren) en dit minstens reeds 3 maanden [2]. Klinisch wordt CKD ingedeeld in 5 stadia. De onderverdeling staat vermeld in tabel 1.
Tabel 1: Indeling stadia CKD [2]. Stadium
GFR (ml/min/1.73m²)
1 Nierschade met normale of gestegen GFR
> 90
2 Nierschade met milde daling van de GFR
60-89
3 Matige daling van de GFR
30-59
4 Ernstige daling van de GFR
15-29
5 Eindstadium nierfalen
< 15 of dialyse
2
Op termijn evolueert CKD naar een uremisch syndroom. Dit ontstaat als gevolg van de retentie van stoffen die onder normale omstandigheden door de nieren geklaard worden. Sommige van deze stoffen vertonen een biologische of biochemische activiteit en worden dan ook uremische toxines genoemd. De uremische retentiestoffen worden klassiek ingedeeld op basis van hun moleculair gewicht (MW) en hun eiwit bindende eigenschappen [3]. Er bestaan 3 grote klassen: een eerste klasse zijn de laag moleculair gewicht moleculen die worden gekarakteriseerd door een MW lager dan 500 dalton zoals bijvoorbeeld ureum en creatinine [3]. Indien het MW hoger is dan 500 dalton, spreekt men over de ―middel‖ moleculen. Voorbeelden hiervan zijn het parathyroïd hormoon (PTH) en het cystatine C. Een derde klasse die voornamelijk bestaat uit laag moleculair gewicht moleculen zijn de eiwit gebonden moleculen. Er bestaan echter ook ―middel‖ moleculen die eiwit gebonden zijn zoals leptine en RBP (retinol binding protein).
De typische symptomen bij het uremisch syndroom zijn nausea, braken, hoofdpijn, duizeligheid, gezichtsstoornissen, coma en convulsies, maar de weerslag op het lichaam kan veel uitgebreider zijn. De voornaamste klinische manifestaties staan vermeld in tabel 2.
3
Tabel 2: Het uremisch syndroom: Klinische manifestaties [3/4]. Cardiovasculair
Atheromatose
systeem
Hematogeen
Anemie
systeem/Coagulatie Arteriosclerose
Bloeding
Cardiomyopathie
Hypercoagulabiliteit
Gedaalde diastolische
Immunologisch
Inadequate antilichaam
compliantie
systeem
vorming
Hyper-/hypotensie
Stimulatie van inflammatie
Pericarditis
Meer vatbaar voor infectie
Zenuwstelsel
Concentratiestoornissen Krampen
Endocrinologie
Dyslipedimie
Dementie
Glucose intolerantie
Depressie
Groei retardatie
Vermoeidheid
Hyperparathyroidisme
Hoofdpijn
Hypogonadisme
Motorische zwakte
Impotentie
Polyneuritis
Huid
Melanose
Restless legs
Pruritus
Slaapstoornissen
Uraemic frost
Stupor, Coma
Gastro-intestinaal
Hogere kans op kanker
Ademhalingsstelsel
Pleuritis
Gedaalde sociabiliteit
Longoedeem
Anorexie
Slaap apnoe syndroom
Dyspepsie
Varia
Hypothermie
GI ulcera
Dorst
Hik
Uremische foetor
Pancreatitis
Gewichtsverlies
Nausea, braken
4
Therapie
De therapeutische mogelijkheden bij CKD bestaan uit twee grote groepen, naast de algemene levensstijlaanpassingen zoals rookstop, meer lichaamsbeweging, vermagering en dieet [2]. Enerzijds is er de farmacologische aanpak en anderzijds de nierfunctie vervangende aanpak, deze laatste bestaat uit niertransplantatie of nierdialyse. Indien de patiënt zich in stadium 2 tot 5 van CKD bevindt, zal men starten met een medicamenteuze therapie die als doel heeft de complicaties van CKD op lange termijn te beperken. Een voorbeeld hiervan is de bloeddrukverlagende medicatie. Indien de patiënt het vijfde stadium van CKD heeft bereikt, zal men overschakelen op nierfunctie vervangende therapie, waarbij men de keuze heeft tussen hemodialyse, peritoneale dialyse of niertransplantatie.
Het principe van de hemodialyse is gebaseerd op de combinatie van ultrafiltratie voor de verwijdering van overtollige vloeistoffen waarbij ook een kleine fractie uremische toxines wordt meegenomen enerzijds en diffusie voor de verwijdering van opgeloste stoffen anderzijds. De bloedbaan van de patiënt wordt via een fistel gekoppeld aan een extracorporele kunstnier of dialysator. Doorheen de dialysator kruisen het bloed van de patiënt en het dialysaat elkaar in tegenovergestelde richting met tussen beide een semipermeabele membraan. Doordat het dialysaat vrij is van afvalstoffen, ontstaat een concentratiegradiënt over het membraan die zorgt voor de diffusie van de afvalstoffen uit het bloed naar het dialysaat. Het dialysaat heeft een hogere concentratie van bicarbonaat buffer waardoor het tekort aan bicarbonaat in het bloed wordt gecompenseerd door de diffusie. Daarnaast wordt er een drukgradiënt over het membraan gecreëerd die ervoor zorgt dat overtollig water eveneens uit de bloedbaan naar het dialysaat vloeit door ultrafiltratie en bovendien een aantal opgeloste stoffen mee verwijdert via het principe van convectie. Het netto resultaat hiervan is een verwijdering van overtollige vloeistof en afvalstoffen uit het bloed. De functie van de nieren wordt als het ware vervangen. Hemodialyse vindt plaats in een gespecialiseerde setting en bestaat uit 3 sessies per week die minimaal 4 uur duren. Deze kan zowel in het ziekenhuis als thuis plaatsvinden.
Een andere vorm van dialyse is de peritoneale dialyse, waarbij men gebruik maakt van het peritoneum als semipermeabel membraan, en het dialysaat via een catheter in de buikholte wordt ingebracht. De verwijdering van overtollige vloeistof en uremische retentiestoffen wordt hier veroorzaakt door diffusie. Het dialysaat bevat een hoge concentratie aan glucose, wat zorgt voor een osmotische gradiënt waardoor vloeistof wordt aangetrokken naar de buikholte.
Een derde vorm van nierfunctie vervangende therapie is de niertransplantatie, die kan worden uitgevoerd indien een geschikte donornier beschikbaar is.
5
Hart- en vaatziekten en inflammatie bij CKD
Onder de klinische manifestaties die kunnen optreden bij CKD patiënten, zoals vermeld in tabel 2, resulteren hart- en vaatziekten zoals angina pectoris, myocardinfarct en CVA in de hoogste morbiditeit en mortaliteit [2].
Uit studies is gebleken dat patiënten die worden behandeld via hemodialyse meer kans hebben op cardiovasculaire problemen en een versnelde en ernstige atherosclerose vertonen [45]. Recent werd aangetoond dat er bij een mild nierfalen (GFR < 60 ml/min/1.73m²) reeds sprake is van een verhoogd cardiovasculair risicoprofiel [47/48]. Een andere studie bewees dat hemodialyse patiënten een grotere kans hebben op cardiovasculaire aandoeningen in vergelijking met de normale populatie [46].
Het cardiovasculair risicoprofiel wordt klassiek bepaald aan de hand van een aantal risicofactoren. Enkele hiervan zijn de leeftijd en geslacht van de patiënt, het rookgedrag, lipidenafwijkingen, diabetes en hypertensie. In het geval van CKD zijn er naast deze factoren echter risicofactoren aanwezig die een grotere rol hebben in het ontstaan van de cardiovasculaire problemen bij deze patiënten dan de klassieke risicofactoren. Voorbeelden van deze risicofactoren zijn inflammatie, oxidatieve stress, malnutritie, vasculaire calcificatie en endotheliale dysfunctie [49/50/51/52].
De cardiovasculaire problemen die optreden bij CKD zijn meestal het gevolg van atherosclerose. Atherosclerose is een aandoening van de arteriële bloedvatwand en leidt tot bloedvatvernauwingen ten gevolge van plaquevorming. Het wordt veroorzaakt door het proces van atherogenese, wat reeds kan beginnen vooraleer nierfunctie vervangende therapie noodzakelijk is [53].
Naast de atherosclerose kan er ook arteriosclerose optreden, wat leidt tot een verminderde elasticiteit van de bloedvatwand en op die manier kan verantwoordelijk zijn voor het ontstaan van hypertensie.
Atherosclerose is een inflammatoire aandoening en de fysiopathologie verloopt in 3 stadia, zoals weergegeven in figuur 1. In een eerste stadium is het endotheel onderhevig aan een schuifspanning (shear stress). Dit is een tangentiële kracht die wordt uitgeoefend door de bloedstroom op het endotheel en die het grootst is ter hoogte van arteriële vertakkingen en bochten. Deze schuifspanning leidt tot het ontstaan van microtraumata in het endotheel van de vaatwand. Als reactie op deze beschadigingen zullen de endotheelcellen overgaan tot de expressie van VCAMs (vascular cell adhesion molecules) en kan er eveneens een migratie optreden van serumlipiden naar de subendotheliale ruimte.
6
In een tweede fase worden circulerende monocyten vastgehouden op de plaats van de microtraumata en migreren naar de subendotheliale ruimte. De T-cellen prolifereren en laten cytokines vrij. De monocyten differentiëren vervolgens tot macrofagen, nemen geöxideerde LDL cholesterol op en worden schuimcellen. Een tweede bron van schuimcellen zijn de gladde spiercellen, die migreren van de media naar de intima, zich vermenigvuldigen en ook worden omgevormd tot schuimcellen. Wanneer deze schuimcellen samenklitten, vormen ze subendotheliale vetlagen, beter gekend als fatty streaks. In een derde fase ten slotte nemen deze vetrijke letsels calcium op en kunnen ze evolueren naar instabiliteit, zijnde snelle groei, plaque-ruptuur en trombose van het bloedvat.
Figuur 1: Grafische weergave van de fysiopathologie van atherosclerose volgens Ross [58].
Afhankelijk van het aangetaste bloedvat worden andere organen aangetast ten gevolge van de atherosclerose. Een aantasting van de coronairen kan de oorzaak zijn van angor pectoris, AMI en hartfalen. Een aantasting van de bloedvaten van de onderste ledematen kan leiden tot claudicatio, ulceraties en gangreen. Vernauwingen van de nierslagaders kunnen leiden tot renovasculaire hypertensie en nierinsufficiëntie. Analoog aan deze voorbeelden kunnen nog andere organen worden aangetast zoals de hersenen en het gastro-intestinaal stelsel.
7
Het verband tussen CKD en atherosclerose is de inflammatie. Patiënten met CKD worden gekenmerkt door een chronische micro-inflammatie. Het bewijs hiervan zijn de verhoogde serumwaarden van de inflammatoire merkers zoals CRP, IL-6 en WBC, die aanwezig zijn bij deze patiënten [54]. De inflammatie op zich is een uiting van oxidatieve stress, endotheliale dysfunctie, vasculaire calcificatie en dus atherosclerose [55]. Een overdreven basale immuunreactie draagt bij tot atherosclerose die aanleiding geeft tot de cardiovasculaire problematiek bij CKD. Parallel hiermee kan er ook een verzwakte immuunrespons na stimulatie optreden als gevolg van CKD, dit leidt dan tot een verhoogde vatbaarheid voor infecties en maligniteit. Deze duale immuunrespons in CKD vindt zijn oorzaak in het feit dat bepaalde uremische retentiestoffen een pro-inflammatoir karakter (bv. symmetrisch dimethylarginine en paracresylsulfaat) en andere een anti-inflammatoir karakter (bv. purines en methylguanidine) vertonen. Het is ook mogelijk dat stoffen de WBC basaal stimuleren, maar dat daardoor hun respons op een bijkomende stimulus afzwakt. Op deze wijze dragen uremische retentiestoffen zowel bij tot hart- en vaatziekten als tot de verhoogde vatbaarheid voor infecties van de uremische patiënt.
In het kader van de studies van de EUTox (European Uremic Toxins) werkgroep wordt op een gestandaardiseerde manier onderzocht welke uremische toxines verantwoordelijk zijn voor de verstoorde immuunrespons. Zo werden reeds van verschillende uremische retentiestoffen, zoals guanidinen, homocysteïne, indoxylsulfaat, fenolen en andere, pro-inflammatoire effecten beschreven [3]. Het uiteindelijke doel is om tot een overzicht te komen van de mogelijke toxische effecten van alle uremische retentiestoffen en in functie hiervan de bestaande therapieën te optimaliseren via selectieve verwijdering van uremische toxines, of nieuwe, meer specifieke therapieën, met name medicamenteuze therapie die de specifieke complicaties van het uremisch toxine tegengaat, te ontwikkelen [44].
8
De polyolen
De uremische retentiestoffen die hier worden bestudeerd, behoren allen tot de klasse van de polyolen en zijn laag moleculair gewicht moleculen [43]. Polyolen zijn gehydrogeneerde carbohydraten (suikeralcoholen) en worden voornamelijk gebruikt als suikervervangers. Ze bezitten in vergelijking met de koolhydraten een aantal gezondheidsbevorderende eigenschappen. De polyolen zijn niet schadelijk voor de tanden en veroorzaken geen tandcariës. Daarnaast zorgen ze voor een beperktere stijging van zowel de glycemie als de insulinemie in vergelijking met koolhydraten en zijn ze dus potentieel gezondheidsbevorderend bij diabetes patiënten en bij patiënten met cardiovasculaire aandoeningen enerzijds en bij obese patiënten anderzijds [5]. De polyolen worden traag verteerd en gefermenteerd in het colon en zorgen hierdoor voor een anaërobe en zure omgeving in het colon [5]. Deze gunstige omgeving zorgt ervoor dat er meer anaërobe organismen kunnen groeien en zo in competitie gaan met de groei van de meer schadelijke aëroben die endotoxisch en pathogeen zijn [5/6/7/8/9/10/11/12/13/14/37]. De vertraagde digestie wordt veroorzaakt door de aanwezigheid van de alcoholgroep bij de polyolen ter vervanging van de carbonyl groep bij de koolhydraten [5]. Om deze gezondheidsbevorderende redenen worden de polyolen de laatste jaren meer en meer in voedingswaren gebruikt, ter vervanging van suikers [5/15].
Deze gezondheidsbevorderende eigenschappen zijn echter enkel aangetoond bij normale concentraties in het lichaam, die worden bekomen via de orale inname van lage hoeveelheden polyolen in de voeding. Bij nierfalen zal de concentratie van de polyolen in het lichaam toenemen door ofwel retentie ofwel door een verminderde metabolisatie en zal de concentratie op die manier de uremische concentratie benaderen [43] (zie tabel 4). Deze uremische concentratie zou een schadelijke invloed kunnen hebben op het lichaam. Deze studie bestudeert meer specifiek het effect van hoge concentraties poylolen in het bloed op de oxidatieve burst van leukocyten. Een activatie van de oxidatieve burst heeft primair een gunstig fysiologisch effect, met name het doden van bacteriën bij infecties en het vernietigen van lichaamsvreemd materiaal.
Indien er echter zonder infectie een toename van de basale oxidatieve burst activiteit van de leukocyten optreedt, kan dit bijdragen tot een chronische inflammatie van de uremische patiënt. Dit veroorzaakt op zijn beurt vaatschade en schade aan andere weefsels. Bij een afname van de oxidatieve burst activiteit van de leukocyten is er mogelijk een verminderde immuunrespons aanwezig die aanleiding kan geven tot recidiverende infecties. Beide zijn nadelig voor de patiënt.
9
Tabel 3: Fysische eigenschappen van de bestudeerde polyolen. Moleculair gewicht Polyol
Molecuulformule IUPAC
Myoinositol C₆H₁₂O₆
(g/mol)
(cis-1,2,3,5-trans-4,6-Hexahydrocyclohexaan
180,16
Erythritol
C₄H₁₀O₄
(2R,3S)-Butaan-1,2,3,4-Tetraol
122,12
Sorbitol
C₆ H₁₄O₆
(2R,3R,4R,5S)-Hexaan-1,2,3,4,5,6-Hexol
182,17
Mannitol
C₆ H₁₄O₆
(2R,3R,4R,5R)-Hexaan-1,2,3,4,5,6-Hexol
182,18
Arabitol
C₅H₁₂O₅
(2R,4R)-Pentaan-1,2,3,4,5-Pentol
152,15
Threitol
C₄H₁₀O₄
(2R,3R)-Butaan-1,2,3,4-Tetraol
122,12
Arabitol
Erythritol
Mannitol
Myoinositol
Sorbitol
Threitol
Figuur 2: Structuren van de bestudeerde polyolen.
10
Myoinositol De molecuulformule van myoinositol is C₆H₁₂O₆ en het moleculair gewicht bedraagt 180,16 g/mol. Uit studies is gebleken dat myoinositol geassocieerd is met het ontstaan van de polyneuropathie die kan optreden bij patiënten met chronische uremie [16]. Uit dezelfde studie is eveneens gebleken dat myoinositol een inhibitie veroorzaakt van de zenuw regeneratie die optreedt na perifere zenuwbeschadiging [16]. Het mechanisme dat hiervoor verantwoordelijk is, is een door myoinositol geïnduceerde suppressie van de Schwann cel mitose op een dosis afhankelijke manier [16]. Het is echter nog niet helemaal duidelijk hoe een gedaalde Schwann cel proliferatie bijdraagt tot de pathogenese van uremische neuropathie [16].
Erythritol De molecuulformule van erythritol is C₄H₁₀O₄ en het moleculair gewicht bedraagt 122,12 g/mol. Erythritol is een krachtige zoetstof en bezit ongeveer 60 tot 70% van de zoetende kracht van sucrose [17]. De voornaamste toepassing van erythritol is als laag-calorische zoetstof in kauwgom en frisdranken [18]. Het wordt eveneens teruggevonden in enkele natuurlijke producten zoals wijn, bier, peren en andere [19/20/21/22/23/24/25]. Zestig tot 90 procent van het erythritol wordt geabsorbeerd door de dunne darm via passieve diffusie[26/27/28/29/30/31/32/33/34/35/36]. Deze fractie wordt vervolgens niet gemetaboliseerd en dus onveranderd geëxcreteerd via de urine [30/33/36]. De overige 10-40 % die niet wordt geabsorbeerd door de dunne darm, kan worden gefermenteerd in het colon. Uit studies is gebleken dat erythritol niet verantwoordelijk is voor gastro-intestinale bijwerkingen (met uitzondering van een tijdelijk laxatief effect), veranderingen in waterhuishouding, osmolariteitswijzigingen of wijzingen van het elektrolieten evenwicht bij de inname van een eenmalige orale dosis tot 0.8 mg/kg lichaamsgewicht [31/32]. Deze inname zorgt eveneens niet voor een wijziging van de serumwaarden van insuline en glucose [31/32]. Een studie van Kanai et al toont aan dat erythritol dat via de voeding wordt toegediend aan ratten met een verminderde nierfunctie (na nefrectomie), geen significante effecten op mortaliteit, lichaamsgewicht of voedingsinname uitoefent [69]. De enige effecten die kunnen worden gezien bij hoge orale inname zijn fysiologisch van aard en niet toxicologisch en bestaan voornamelijk uit tijdelijke laxatieve effecten, gestegen waterinname en bijgevolg gestegen urinevolume [31/32]. Deze effecten zijn echter verwaarloosbaar en de veiligheid van de patiënt bij inname van erythritol bevattende voedingswaren kan worden gegarandeerd [31/32].
Sorbitol De molecuulformule van sorbitol is C₆ H₁₄O₆ en het moleculair gewicht bedraagt 182,17 g/mol. Ongeveer 80 % van het oraal ingenomen sorbitol wordt geabsorbeerd en vervolgens bijna volledig gemetaboliseerd in het lichaam, slechts een kleine fractie wordt geëxcreteerd [38]. Sorbitol heeft een laxatieve werking die bij overdosering aanleiding kan geven tot osmotische diarree [5]. 11
Mannitol De molecuulformule van mannitol is C₆ H₁₄O₆ en het moleculair gewicht bedraagt 182,18 g/mol. Mannitol wordt slechts gedeeltelijk geabsorbeerd door de dunne darm en kan leiden tot osmotische diarree [39]. Een gedeelte van het geabsorbeerde mannitol wordt gemetaboliseerd, de rest wordt onveranderd afgescheiden door de urine [39/40]. Mannitol heeft een zoetende kracht van 50 % ten opzichte van sucrose [41]. Een belangrijke toepassing van mannitol is de IV toediening bij de behandeling van oedeem bij volwassenen. Mannitol wordt eveneens als osmotisch diureticum gebruikt of als laxativum. Een minder onderzochte toepassing is het gebruik van per oraal mannitol bij patiënten met oedeem die onvoldoende reageren op de klassieke therapie (diuretica) [42].
Arabitol De molecuulformule van arabitol is C₅H₁₂O₅ en het moleculair gewicht bedraagt 152,15 g/mol.
Threitol De molecuulformule van threitol is C₄H₁₀O₄ en het moleculair gewicht bedraagt 122,12 g/mol.
Zowel over arabitol als over threitol is weinig tot geen literatuur terug te vinden en zijn er geen biologische effecten gekend.
12
Oxidatieve stress bij CKD
Wanneer het lichaam wordt blootgesteld aan invasieve organismen zal het immuunsysteem hierop reageren en dit zal aanleiding geven tot de activatie van een inflammatoire respons. Een belangrijke stap in deze activatie is de generatie van ROS (reactive oxygen species). De vrijstelling van ROS wordt in fysiologische omstandigheden gemodulleerd door anti-oxidantia. Een overproductie van ROS of een tekort aan anti-oxidantia kunnen beide aanleiding geven tot oxidatieve stress, die op zijn beurt verantwoordelijk is voor weefselschade.
Een belangrijke bron van ROS productie zijn de leukocyten. Deze worden geïnduceerd tot de aanmaak van ROS in het geval van een infectie of na stimulatie via stimuli. Dit proces is de respiratorische burst (zie figuur 3). De zuurstofconsumptie van de leukocyten verhoogt en leidt tot een activatie van het nicotinamide adenine dinucleotide fosfaat (NADPH) oxidase complex. Zuurstofmoleculen worden gereduceerd tot superoxide anionen door tussenkomst van dit membraan gebonden enzym complex. Het instabiele superoxide anion wordt vervolgens omgezet tot waterstof peroxide via het superoxide dismutase (SOD). Zowel het superoxide anion als het waterstofperoxide zijn precursoren voor de productie van oxidantia. Superoxide anion gaat de interactie aan met nitric oxide (NO) en vormt op die manier hoog reactieve nitrogen species. Waterstof peroxide daarentegen interageert met ijzer en vormt hydroxyl radicalen die een rol spelen in de degradatie van celmembraanlipiden, eiwitaggregatie en DNA schade. Daarnaast kan waterstof peroxide ook interageren met chloride onder invloed van het myeloperoxidase enzyme en vormt op die manier waterstofhypochloriet, dat zorgt voor de oxidatie van een aantal moleculen zoals vetten en proteoglycanen [2/56/57].
Figuur 3: Schematische voorstelling van de respiratorisch burst reacties.
13
Principe van de bursttest
De bursttest wordt uitgevoerd om een kwantitatieve bepaling te krijgen van de oxidatieve burst activiteit van leukocyten in basale toestand en na activatie. In dit onderzoek wordt de bursttest uitgevoerd op gehepariniseerd humaan vol bloed.
De test bepaalt enerzijds het percentage leukocyten die reactieve oxidantia produceren en anderzijds de gemiddelde ROS productie per cel (MFI: mean fluorescence intensity). Om deze 2 parameters te kunnen bepalen, voegt men een fluorogeen substraat (dihydrorhodamine 123: DHR 123) aan de stalen toe. De omzetting van dit DHR 123 tot rhodamine (RDH 123) gebeurt onder invloed van de geproduceerde reactieve oxidantia door de leukocyten. De bepaling van het percentage positieve cellen en de gemiddelde ROS productie per cel gebeurt met behulp van flow cytometrie.
14
Flowcytometrische analyse
Na opzuigen van de stalen met behulp van de FACScan® flow cytometer worden de bekomen resultaten geanalyseerd. In een eerste stap worden de vensters correct geplaatst op basis van de lichtverstrooiing. Op figuur 4 is zichtbaar hoe de vensters worden geplaatst op de 3 leukocytensubpopulaties. Op de X-as wordt de voorwaartse lichtverstrooiing weergegeven die een indicatie is voor de grootte van de cel. Op de Y-as wordt de zijwaartse lichtverstrooiing (90°)(SSC) weergegeven die een maat is voor de granulariteit van de cel. 00 1
gran ul ocyten
l ymfo cyten mon ocyten 0
20 0
40 0 60 0 Fo rward S catter
80 0
10 00
Figuur 4: Dotplot FSC/SSC met geplaatste vensters op de 3 hoofdtypes leukocyten (monocyten, granulocyten en lymfocyten) op basis van hun lichtverstrooiingseigenschappen.
De leukocyten passeren één voor één de Argon laser (488 nm) en afhankelijk van de grootte en granulariteit van de cel zal de mate van verstrooiing van het licht variëren. De grootste cellen met de meeste granulariteit bevinden zich rechts bovenaan en bestaan voornamelijk uit granulocyten (blauwe cluster). De kleinste cellen met de minste granulariteit bevinden zich links onderaan en bestaan voornamelijk uit lymfocyten (groene cluster). Daartussen bevinden zich de monocyten (rode cluster). Bij het plaatsen van de vensters is het belangrijk om de clusters van cellen met dezelfde eigenschappen volledig te omvatten.
De vorming van reactieve oxidantia tijdens de oxidatieve burst kan worden aangetoond aan de hand van de toevoeging en oxidatie van DHR 123 en de kwantificering is gebaseerd op de omzetting van DHR 123 naar RDH 123.
15
In een tweede stap wordt op basis van de fluorescentie de merker geplaatst (zie figuur 5). Bij het plaatsen van de merker is het belangrijk om maximaal 5 % van de cellen toe te laten binnen de merker (% gated M1) en dit om de hoofdpiek, die te wijten is aan achtergrondfluorescentie, uit te sluiten. De cellen die nu positief bevonden worden (en zich binnen de merker bevinden), vertonen een fluorescente activiteit die kan worden verklaard door de stimulatie van de leukocyten.
Monocyten
Granulocyten
00 1
00 1
M1
100
101
Lymfocyten
M1
102 103 rdh 12 3
104
Fi l e: 0 01 A cqu is iti on Date: 2 6-Feb -0 4 Gate: G5 Marker E vents % Ga te d A ll 91 4 10 0.00 M1 35 3.83
00 1
100
101
M1
102 103 rdh 12 3
104
Fi l e: 0 01 A cqu is iti on Date: 2 6-Feb -0 4 Gate: G6 Mean 1.08 1.73
Marker E vents % Ga te d A ll 49 65 10 0.00 M1 22 1 4.45
100
101
102 103 rdh 12 3
104
Fi l e: 0 01 A cqu is iti on Date: 2 6-Feb -0 4 Gate: G7 Mean 1.72 15 .9 4
Marker E vents % Ga te d A ll 34 61 10 0.00 M1 13 0.38
Mean 1.05 1.30
Figuur 5: Histogram (rdh 123/aantal cellen) illustreert de vrije radicalen productie per subtype van leukocyten. De merker (M1) excludeert de achtergrondfluorescentie. De statistiek duidt de gemiddelde fluorescentie per cel aan evenals het percentage positieve cellen.
Het propidiumiodide dat in een laatste stap van de bursttest wordt toegevoegd aan de stalen is een DNA kleuringsoplossing. Op figuur 6 is op de Y-as zichtbaar of het DNA al dan niet werd aangekleurd met propidiumiodide en de hoeveelheid DNA die werd aangekleurd. De intacte cellen liggen binnen het venster. De beschadigde cellen of de bacteriën met beschadigd DNA liggen onder het venster en worden uitgesloten bij de analyse.
16
001
R4
100
101
102 rdh 123
103
104
Figuur 6: Dotplot (rdh 123/PI) illustreert de vrije radicalen productie (rdh 123 positief) van alle intacte leukocyten (PI positief). Rode cluster = monocyten, blauwe cluster = granulocyten, groene cluster = lymfocyten.
Naast een meting van de basale vrije radicalen productie worden de cellen ook gestimuleerd door middel van fMLP, E. Coli en PMA. Afhankelijk van de gebruikte stimulus is er een verandering van het percentage cellen die reactieve oxidantia produceren en de gemiddelde fluorescentie-intensiteit zoals geïllustreerd op de grafieken in figuur 7. Dit kan verklaard worden door het werkingsmechanisme van de verschillende stimuli, meer bepaald in de manier waarop het proteine kinase C (PKC) wordt geactiveerd. In het geval van de basale stalen en de stalen na activatie met fMLP wordt het percentage positieve cellen geanalyseerd. Na stimulatie met E. Coli en met PMA zal het percentage positieve cellen steeds de 100 % benaderen en wordt de gemiddelde fluorescentieintensiteit in beschouwing genomen.
In het geval van de basale stalen is er geen tot slechts een beperkte activatie van PKC en zal het waargenomen percentage cellen die reactieve oxidantia produceren laag zijn.
Bij de stimulatie met fMLP worden de cellen via de fMLP-receptor geactiveerd, wat vervolgens leidt tot de activatie van het PKC, er is sprake van een zwakke activatie van de oxidatieve burst met een toename van het percentage positieve cellen ten opzichte van de basale stalen. De fMLP-receptor is echter niet aanwezig bij de lymfocyten, dit is zichtbaar op figuur 7B als een gebrek aan stimulatie bij de lymfocyten ten opzichte van de monocyten en de granulocyten.
17
Bij de stimulatie met E. Coli is er een sterke activatie. Het werkingsmechanisme is gebaseerd op de fagocytose van het E. Coli partikel en de activatie van co-factoren die zorgen voor een activatie van het PKC. Dit is merkbaar op de grafiek door een stijging van de gemiddelde fluorescentie-intensiteit.
In het geval van de stimulatie met PMA tenslotte, is er eveneens sprake van een sterke activatie en dit via een rechtstreeks activatie van het PKC. Op figuur 8 zijn de verschillende pathways die leiden tot de activatie van het PKC zichtbaar [73].
18
A. Basaal Monocyten
Granulocyten
001
Lymfocyten
001
001
001
M1
M1
M1
R4
10 0
10 1
10 2 rdh 123
10 3
10 4
File: 001 Acquisition Date: 26-Feb-04 Gate: G5 Marker All M1
10 0
10 1
10 2 rdh 123
10 3
10 4
10 0
File: 001 Acquisition Date: 26-Feb-04 Gate: G6
Events % Gated 914 100.00 35 3.83
Mean 1.08 1.73
Marker All M1
10 1
10 2 rdh 123
10 3
10 4
File: 001 Acquisition Date: 26-Feb-04 Gate: G7
Events % Gated 4965 100.00 221 4.45
Mean 1.72 15.94
Marker All M1
Events % Gated 3461 100.00 13 0.38
Mean 1.05 1.30
100
101
102 rdh 123
103
104
B. fMLP Stimulatie 009 009
009
009
M1
M1
M1
R4
10 0
10 1
10 2 rdh 123
10 3
10 4
File: 009 Acquisition Date: 26-Feb-04 Gate: G5 Marker All M1
10 0
10 1
10 2 rdh 123
10 3
10 4
10 0
File: 009 Acquisition Date: 26-Feb-04 Gate: G6
Events % Gated 718 100.00 45 6.27
Mean 1.34 5.75
Marker All M1
10 1
10 2 rdh 123
10 3
10 4
File: 009 Acquisition Date: 26-Feb-04 Gate: G7
Events % Gated 4686 100.00 610 13.02
Mean 3.56 20.21
Marker All M1
Events % Gated 3886 100.00 13 0.33
Mean 1.04 1.35
100
101
102 rdh 123
103
104
C. E Coli Stimulatie 015 015
015
M1
015
M1
M1
R4
10 0
10 1
10 2 rdh 123
10 3
10 4
File: 015 Acquisition Date: 26-Feb-04 Gate: G5 Marker All M1
Events % Gated 603 100.00 573 95.02
10 0
10 1
10 2 rdh 123
10 3
10 4
File: 015 Acquisition Date: 26-Feb-04 Gate: G6 Mean 96.52 101.52
Marker All M1
Events 3744 3729
% Gated 100.00 99.60
10 0
10 1
10 2 rdh 123
10 3
10 4
File: 015 Acquisition Date: 26-Feb-04 Gate: G7 Mean 596.38 598.78
Marker All M1
Events % Gated 3779 100.00 920 24.35
Mean 1.30 2.09
100
101
102 rdh 123
103
104
19
D. PMA Stimulatie
022
022
022
022
M1
M1
M1
R4 10 0
10 1
10 2 rdh 123
10 3
10 4
File: 022 Acquisition Date: 26-Feb-04 Gate: G5 Marker Events % Gated All 660 100.00 M1 660 100.00
10 0
10 1
10 2 rdh 123
10 3
10 4
File: 022 Acquisition Date: 26-Feb-04 Gate: G6 Mean 143.12 143.12
Marker All M1
Events 2283 2283
% Gated 100.00 100.00
10 0
10 1
10 2 rdh 123
10 3
10 4
File: 022 Acquisition Date: 26-Feb-04 Gate: G7 Mean 1393.96 1393.96
Marker Events All 4252 M1 4235
% Gated 100.00 99.60
Mean 24.59 24.69
100
101
102 rdh 123
103
104
Figuur 7: Histogrammen (rdh 123/aantal cellen), links en dot plots, rechts, illustreren de vrije radicalen productie per subtype van intacte leukocyten. De merker (M1) omvat de positieve leukocyten. De statistiek duidt de gemiddelde fluorescentie per cel aan evenals het percentage positieve cellen, zowel basaal (A), als na stimulatie met fMLP (B), E. Coli (C) en PMA (D).
Figuur 8. Verschillende pathways voor de activatie, door verschillende stimuli, van PKC [73].
20
Methodologie Reagentia
Arabitol, myo-inositol, sorbitol en mannitol werden allen aangekocht bij Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, MO, USA) en kunnen op kamertemperatuur worden bewaard. De overige twee toxines, threitol en erythritol, werden eveneens bij Sigma-Aldrich aangekocht maar kunnen enkel op een temperatuur lager dan 0°C bewaard worden en zijn bovendien irriterend voor ogen, slijmvliezen en huid. De zes toxines behoren allen tot de klasse van de polyolen of suiker alcoholen [5].
Experimentele setup
Het testen van het effect van uremische retentiestoffen gebeurt volgens een gestandaardiseerd protocol gepubliceerd door de EUTOX werkgroep. De eerste stap is het bereiden van de toxine stockoplossing aan een maximale uremische concentratie (Cmax). Deze Cmax waarde werd teruggevonden in een publicatie uit 2003 betreffende classificatie, concentratie en inter-individuele variabiliteit van uremische toxines [43]. Hiervoor wordt van de toxines een bepaalde hoeveelheid afgewogen en opgelost in een fysiologische zoutoplossing 0,9% natriumchloride (Baxter, Lessines, Be). Tot slot worden de stockoplossingen ingevroren bij -80°C.
Na het uitvoeren van een eerste serie (8 herhalingen) van de bursttest met de 6 polyolen aan de Cmax concentratie, werd aan de hand van de bekomen resultaten besloten om over te gaan tot een dosisantwoord experiment met de polyolen threitol, arabitol, myoinositol en erythritol. Van deze 4 polyolen werden stockoplossingen bereid met een concentratie van 10 maal Cu (gemiddelde uremische concentratie) en 1 maal Cu. Hierna werd een totaal van 16 herhalingen voor de fysiologische en de Cmax condities in beschouwing genomen.
21
Tabel 4: Concentraties van de verschillende polyolen in de bereide stockoplossingen [43]. Toxine
10 x Cmax
10 x Cu
1 x Cu
Myoinositol
2320 mg/L
940 mg/L
94 mg/L
Erythritol
370 mg/L
98 mg/L
9.8 mg/L
Sorbitol
73 mg/L
n.v.t.
n.v.t.
Mannitol
760 mg/L
n.v.t.
n.v.t.
Arabitol
330 mg/L
150 mg/L
15 mg/L
Threitol
56.974 mg/L
9.9 mg/L
0.99 mg/L
Bloedcollectie
Het donorbloed wordt afgenomen bij gezonde vrijwilligers. De exclusiecriteria zijn roken of gestopt met roken de voorbije 3 maanden, zwangerschap, infectie en gebruik van anti-inflammatoire medicatie. Bijzondere aandacht gaat uit naar de griepvaccinaties: personen die gedurende twee weken voorafgaand aan de studie een vaccin kregen toegediend, worden eveneens geëxcludeerd uit de studie. Deze exclusiecriteria worden nagegaan door middel van een korte anamnese en een telling van het aantal witte bloedcellen. De studie kent de goedkeuring van het plaatselijk ethisch comité en de afname van het donorbloed gebeurt steeds na schriftelijk informed consent. Het bloed wordt gecollecteerd in een natrium heparine BD Vacutainer® bloedbuis (BD Vacutainer systems, Plymouth, UK) om de bloedstolling te inhiberen en het in een tweede tijd mogelijk te maken om het plasma na centrifugatie te analyseren.
Osmolaliteitsmeting
Door middel van een osmolaliteitsmeting wordt het effect van de geteste toxines op de osmolaliteit nagegaan. Hiertoe wordt 150 μl toxine stockoplossing aan 1350 μl gehepariniseerd bloed van een gezonde donor toegevoegd. Een controleoplossing bestaande uit 150 μl fysiologische oplossing met 1350 μl bloed wordt eveneens bereid. De stalen worden vervolgens 10 minuten gecentrifugeerd aan 2500 rpm, waarna de osmolaliteit van het plasma wordt gemeten met een freezing point osmometer (The Advanced™ Osmometer, Advanced Instruments, Norwood USA).
22
Endotoxine concentratie
Om een eventuele contaminatie met endotoxine van de stockoplossingen aan te tonen, wordt een Limulus Amebocyte Lysate (LAL) Kinetic QCL Test (Cambrex Bio Science Walkersville, Inc.) uitgevoerd. Het LAL werd geproduceerd uit de amoebocyten van de Limulus Polyphemus (Degenkrab) in combinatie met een synthetisch substraat. Indien het LAL reagens in contact komt met endotoxine, grijpt een enzymatische reactie plaats die het p-nitroaniline vrijstelt, wat op zich verantwoordelijk is voor de gele verkleuring. Deze gele verkleuring is een maat voor het aanwezige endotoxine. De concentratie endotoxine en de snelheid waarmee de gele verkleuring optreedt, zijn recht evenredig verdeeld. De concentratie van het endotoxine kan aldus worden bepaald door de reactietijd van de testoplossing te vergelijken met de reactietijd van oplossingen waarvan de endotoxine concentratie reeds is gekend.
Leukocyten telling
Het aantal witte bloedcellen wordt bepaald ter indicatie van een eventuele infectie (cfr. exclusiecriteria). Hiervoor wordt 10 μl bloed toegevoegd aan 10 ml isotone oplossing. Na lysis van de rode bloedcellen door toevoeging van 3 druppels Zap-Oglobin II Lytic reagent worden de leukocyten geteld met behulp van de Beckman Coulter deeltjesteller. De referentiewaarden binnen dewelke het aantal leukocyten moet liggen, bedraagt 4000-9000 WBC/mm³.
23
Oxidatieve burst
De bursttest (Phagoburst®, Orpegen Pharma, Heidelberg, Germany) wordt uitgevoerd op gehepariniseerd vol bloed om een kwantitatieve bepaling te krijgen van oxidatieve burst van leukocyten. De kit bevat ongelabelde geopsoniseerde E. Coli-bacteriën en de proteïnekinase-C-ligand forbol-12-myristaat-13-acetaat (PMA), beide als sterke stimuli en de chemotactische peptide Nformyl-Met-Leu-Phe (fMLP) als zwakke fysiologische stimulus. Daarnaast bevat de kit eveneens dihydrorhodamine (DHR) 123 als een fluorogeen substraat.
In een eerste stap worden de toxine stockoplossingen, met een concentratie van 10 x Cmax, 10 x Cu en Cu , met een hoeveelheid van 50 μl toegevoegd aan 450 μl gehepariniseerd vol bloed van een gezonde donor in Falcon® polystyreen buisjes (Beckton Dickonson). Op deze manier wordt de concentratie van de toxines in het bloed verdund naar Cmax, Cu en 1:10 Cu. Er wordt eveneens een controlestaal voorzien: 50 μl fysiologische oplossing in 450 μl bloed. De stalen worden vervolgens geïncubeerd in een 37°C warmwaterbad gedurende 10 minuten en nadien afgekoeld in een ijsbad, eveneens gedurende 10 minuten. In een volgende stap worden de stalen uitverdeeld in 4 Falcon® polystyreen buisjes (100 μl per buisje) en worden de stimuli toegevoegd: 20 μl wasoplossing als controle, 20 μl fMLP als zwakke stimulus en 20 μl E.Coli en PMA als sterke stimuli. Deze buisjes worden vervolgens opnieuw geïncubeerd aan 37°C gedurende 10 minuten. Vervolgens wordt 20 μl substraat (DHR 123) toegevoegd aan de buisjes, gevolgd door een laatste incubatie onder dezelfde condities als voorheen. Hierna wordt 2 ml lysebuffer toegevoegd met als doel de erytrocyten te lyseren en de leukocyten te fixeren. Na toevoeging van de lysebuffer worden de buisjes gevortexed en gedurende 20 minuten geïncubeerd op kamertemperatuur, waarna ze 5 minuten worden gecentrifugeerd aan 1200 rpm bij 4°C. De buisjes worden na de centrifugatie afgegoten en er wordt 3 ml wasoplossing toegevoegd ter spoeling, gevolgd door een centrifugatie aan 1200 rpm bij 4°C gedurende 5 minuten. Tenslotte worden de stalen opnieuw afgegoten en 100 μl DNA kleuringsoplossing (prodidiumiodide) wordt toegevoegd. De stalen zijn nu klaar om te worden geanalyseerd met behulp van de FACScan® flow cytometer (Beckton Dickinson). Afhankelijk van de aard van de toegevoegde stimulus wordt een andere parameter in beschouwing genomen. Bij niet-gestimuleerde en fMLP gestimuleerde stalen wordt het percentage rhodamine positieve cellen geëvalueerd. Bij E. Coli en PMA gestimuleerde stalen wordt de MFI (mean fluorescence intensity per cel) geëvalueerd.
24
Statistiek
De meetwaarden worden allen weergegeven als gemiddelde waarden ±SEM. In eerste instantie wordt nagegaan of de waarden Gaussiaans verdeeld zijn om in functie hiervan te bepalen welke test moet worden uitgevoerd. In het geval van een Gaussiaanse verdeling wordt een gepaarde T-test uitgevoerd. Een P waarde kleiner dan 0.05 wijst op een significant verschil tussen de meetwaarden van de fysiologische controle en de meetwaarden van het geanalyseerde toxine.
25
Resultaten
Osmolaliteitsmeting
De resultaten van de uitgevoerde osmolaliteitsmeting worden weergegeven in tabel 5. Er kan worden besloten dat de additie van de polyolen geen effect heeft op de osmolaliteit van het plasma.
Tabel 5: Osmolaliteit van het plasma na toevoeging van een Cmax concentratie van de individuele polyolen. Staal
Osmolaliteit (mosm/kg)
Controle
297
Myoinositol
299
Erythritol
297
Sorbitol
301
Mannitol
307
Arabitol
296
Threitol
304
Endotoxine concentratie
De geteste stalen hebben allen een endotoxine concentratie die kleiner is dan 0.005 EU/ml (Endotoxine Units / ml). Men kan besluiten dat de waargenomen resultaten volledig te wijten zijn aan het effect van de toxines en niet worden veroorzaakt door een contaminatie van de stalen.
Leukocyten telling
Het aantal leukocyten in het bloed van de geïncludeerde donoren viel steeds binnen de referentiewaarden van 4000-9000 WBC/mm³. Dit is een basisvoorwaarde opdat het bloed bruikbaar zou zijn voor de bursttest. Basale inflammatie bij de gezonde donor is nefast voor een goed resultaat in de bursttest (cfr. exclusiecriteria).
26
Oxidatieve burst activiteit van leukocyten
Zoals in de methoden beschreven werd initieel het effect van de polyolen op de oxidatieve burst van leukocyten getest aan een Cmax concentratie. Enkel van de componenten waarvan een beduidend effect werd bekomen, werd de dosis afhankelijkheid van het effect nagegaan.
Effect van de geteste polyolen op de basale oxidatieve burst activiteit van leukocyten.
Zoals geïllustreerd in figuur 9, verhogen myoinositol en erythritol het percentage vrije radicalen producerende monocyten op significante wijze, zij het enkel bij een Cmax concentratie. Hiermee in tegenstelling, vertonen threitol aan een uremische concentratie en arabitol aan een uremische CU en 1:10 CU concentratie een inhiberend effect met een daling in het aantal rhodamine positieve monocyten. In tegenstelling tot het stimulerend effect waargenomen bij monocyten, daalt in aanwezigheid van uremische concentraties erythitol het percentage rhodamine positieve granulocyten. Ook threitol en arabitol vertonen een inhiberend effect op het percentage rhodamine positieve granulocyten en lymfocyten en dit bij alle geteste concentraties.
Baseline
Figuur 9. Basaal effect van de polyolen op de oxidatieve burst activiteit van monocyten, granulocyten en lymfocyten. De data worden weergegeven als percentage positieve cellen (mean±SEM). * P < 0.05 ** P < 0.01 *** P < 0.001. n = 8 of n=16 zoals beschreven in de methoden. (grijze balken benadrukken de significante effecten).
27
Effect van de geteste polyolen op de gestimuleerde oxidatieve burst activiteit van leukocyten.
Ook na fMLP-stimulatie, is het percentage rhodamine positieve monocyten verhoogd in aanwezigheid van erythritol en myoinositol aan de Cmax concentratie zoals geïllustreerd in figuur 10. Arabitol daarentegen vertoont een inhiberend effect op de monocyten aan de CU concentratie. Er werd geen effect van de geteste polyolen waargenomen na fMLP-stimulatie van de granulocyten en lymfocyten.
Stimulatie met fMLP
Figuur 10. Effect van de polyolen op de oxidatieve burst activiteit van monocyten, granulocyten en lymfocyten na stimulatie met fMLP. De data worden weergegeven als percentage positieve cellen (mean±SEM). * P < 0.05 ** P < 0.01 *** P < 0.001. n = 8 of n=16 zoals beschreven in de methoden. (grijze balken benadrukken de significante effecten).
28
De lymfocyten vertonen, na stimulatie met E. Coli en na stimulatie met PMA, een matige maar significante toename van de gemiddelde vrije radicalen productie per cel in aanwezigheid van een Cmax concentratie van arabitol, myoinositol en erythritol.
Stimulatie met E. Coli
Figuur 11. Effect van de polyolen op de oxidatieve burst activiteit van monocyten, granulocyten en lymfocyten na stimulatie met E. Coli. De data worden weergegeven als de MFI (mean fluorescence intensity)(mean±SEM). * P < 0.05 ** P < 0.01 *** P < 0.001. n = 8 of n=16 zoals beschreven in de methoden. (grijze balken benadrukken de significante effecten).
29
Na stimulatie met PMA, wordt daarenboven ook significante toename van de gemiddelde vrije radicalen productie per lymfocyt waargenomen in aanwezigheid van een Cmax concentratie threitol. Na E. Coli of PMA stimulatie wordt geen effect van de geteste polyolen op de monocyten, noch de granulocyten geobserveerd.
Stimulatie met PMA
Figuur 12. Effect van de polyolen op de oxidatieve burst activiteit van monocyten, granulocyten en lymfocyten na stimulatie met PMA. De data worden weergegeven als de MFI (mean fluorescence intensity)(mean±SEM). * P < 0.05 ** P < 0.01 *** P < 0.001. n = 8 of n=16 zoals beschreven in de methoden. . (grijze balken benadrukken de significante effecten).
30
Discussie Deze studie evalueert het biologische effect van zes polyolen, met name myoinositol, erythritol, sorbitol, mannitol, arabitol en threitol, waarvan gekend is dat hun serumconcentraties toenemen bij patiënten met nierfalen [43]. Hiertoe wordt hun effect, aan voor uremie relevante concentraties, op de vrije radicalen productie van leukocyten in vol bloed nagegaan door middel van een flowcytometrische evaluatie van de bursttest, basaal en na stimulatie met fMLP, E. Coli en PMA. Afhankelijk van de geteste component worden zowel stimulerende als inhiberende effecten op de oxidatieve burst van leukocyten waargenomen om op die manier hun bijdrage tot het ontstaan van vasculaire aandoeningen (stimulatie) of recurrente infecties (inhibitie) bij CKD patiënten na te gaan. Onder baseline condities verhogen zowel myoinositol als erythritol het percentage vrije radicalen producerende monocyten, bij een Cmax concentratie. Threitol bij een uremische concentratie zorgt voor een daling van het percentage vrije radicalen producerende monocyten, net als arabitol bij een uremische CU en een 1:10 CU concentratie, men spreekt hier van een inhiberend effect. Eveneens bij baseline hebben zowel threitol als arabitol een inhiberend effect op het percentage vrije radicalen producerende granulocyten en lymfocyten en dit bij alle geteste concentraties. Na de matige stimulatie met fMLP is er eveneens een verhoogd percentage vrije radicalen producerende monocyten bij zowel myoinositol als erythritol bij een Cmax concentratie. Arabitol vertoont een inhiberend effect op de monocyten aan de CU concentratie. Na de sterke stimulatie met E. Coli en PMA is er een matige maar significante toename van de gemiddelde vrije radicalen productie per lymfocyt bij een Cmax concentratie van arabitol, myoinositol en erythritol. Bovendien is er na stimulatie met PMA ook een toename van de gemiddelde vrije radicalen productie per lymfocyt bij een Cmax concentratie van threitol. Samenvattend kan men stellen dat zowel erythritol als myoinositol een stimulerend effect vertonen op de monocyten, zowel basaal als na matige stimulatie met fMLP. Ze vertonen eveneens een stimulerend effect op lymfocyten na sterke E. coli en PMA stimulatie. Arabitol daarentegen vertoont een inhiberend effect op de monocyten zowel basaal als na matige stimulatie met fMLP en eveneens een inhiberend effect op de granulocyten en lymfocyten bij baseline. Arabitol vertoont echter ook een stimulerend effect op de lymfocyten bij PMA en E. Coli stimulatie. Threitol heeft een inhiberend effect op zowel monocyten, granulocyten en lymfocyten bij basale stimulatie en een stimulerend effect op de lymfocyten na PMA stimulatie.
31
Deze resultaten suggereren dat vooral erythritol en myoinositol, omwille van hun stimulerend effect op de productie van vrije radicalen, kunnen bijdragen tot de basale inflammatie die karakteristiek is voor patiënten met nierfalen en zo tot het verhoogde risico op vasculaire complicaties die optreden bij CKD patiënten. Bij zowel threitol als arabitol is het moeilijker om een eenzijdige conclusie te trekken aangezien deze toxines zowel een inhiberend als een stimulerend effect kunnen vertonen, afhankelijk van het geteste celtype en de gebruikte stimulus. Het is moeilijk om deze bevindingen terug te koppelen naar de literatuur aangezien er geen relevante artikels zijn geschreven omtrent de effecten van polyolen op leukocyten. Bovendien werden er nog geen studies over het effect van de polyolen bij een uremische concentratie op leukocyten uitgevoerd. Van myoinositol is reeds gekend dat het kan bijdragen tot de polyneuropathie die kan optreden bij chronische uremie zoals reeds aangehaald in de inleiding. Studies toonden aan dat hoge concentraties erythritol bij ratten met verminderde nierfunctie geen schadelijke effecten veroorzaken [69]. Sorbitol en mannitol hebben een laxatieve werking ter hoogte van darm, maar over de effecten van verhoogde serumconcentraties is nog niets geweten, net als bij arabitol en threitol. Men kan de resultaten van deze studie echter wel vergelijken met studies die het effect van bepaalde klassen toxines die bij CKD aanwezig zijn, hebben onderzocht. Zo toonde een studie van Bernheim et al aan dat de ‗Advanced glycation end products‘ (AGE) zorgen voor een toename van de basale leukocyten respons, terwijl de geactiveerde respons na infectieuze stimuli wordt geïnhibeerd [59]. Deze resultaten zijn suggestief voor een duale respons, er kan dus zowel atherosclerose als een verhoogde vatbaarheid voor infecties optreden [60]. Dit is vergelijkbaar met de bekomen resultaten in deze studie omtrent arabitol en threitol (zie resultaten). AGE worden gevormd uit glucose en andere reducerende suikers. Voorbeelden van AGE zijn imidazolone en pentosidine. Ze zijn zowel aanwezig bij chronisch nierfalen, als bij diabetes mellitus en veroudering [61]. Uit een studie van Hirayama et al is gebleken dat een aantal samen voorkomende guanidino componenten een inhibitie van de vrije radicalen productie van granulocyten veroorzaken [62]. Voorts toonde een studie van Glorieux et al aan dat specifieke guanidines zorgen voor een stimulatie van de basale leukocytaire vrije radicalen productie, die kan bijdragen tot voor cardiovasculaire complicaties [63]. Guanidines zijn structurele metabolieten van het aminozuur arginine. De voornaamste leden van deze klasse zijn creatinine en guanidine. Een derde voorbeeld van eerder bestudeerde toxines is het homocysteïne (Hcy). Hcy is verantwoordelijk voor een verhoogde proliferatie van vasculaire gladde spiercellen en op die manier rechtstreeks gecorreleerd met toegenomen atherosclerose [64]. Er bestaat evidentie voor het feit dat hyperhomocysteïnemie verantwoordelijk zou kunnen zijn voor endotheliale dysfunctie en generatie van ROS (reactive oxygen species) [65]. Hyperhomocysteïnemie werd beschreven als risicofactor voor cardiovasculair lijden bij CKD stage 5 patiënten [66,67]. 32
Een ander voorbeeld is de geconjugeerde vorm van p-cresol, p-cresylsulfaat. Uit een studie van Schepers et al is gebleken dat ook p-cresylsulfaat een matige toename van de basale leukocyten oxidatieve burst activiteit veroorzaakt en op die manier kan bijdragen tot de vasculaire complicaties bij CKD [68]. Een laatste uremisch toxine dat hier wordt besproken, is het indoxyl sulfaat. Uit studies is gebleken dat een orale toediening ervan aan ratten, zorgt voor een snellere vooruitgang van glomerulaire sclerose en nierfalen [70]. Het indoxyl sulfaat kan eveneens leiden tot een vertraagd endotheliaal herstel na schade en induceert endotheliale vrije radicalen productie [71/72]. Het uiteindelijke doel van deze studies is om een gerichtere therapie te ontwikkelen die specifiek bepaalde toxines kan elimineren via gerichte dialyse en/of adsorptie, of neutraliseren via specifieke medicatie. Men moet wel rekening houden met het feit dat deze studie in vitro experimenten omvat die enkel mogelijke in vivo effecten kan suggereren. Ten eerste is de contactduur van het toxine met het bloed in vitro veel korter dan bij CKD patiënten. Er is dus eerder sprake van acute in vitro effecten, dan van chronische lange termijn effecten. Ten tweede worden de effecten van de individuele toxines bestudeerd en wordt er dus geen rekening gehouden met eventuele cumulatieve effecten die zouden kunnen optreden bij chronische uremie. Concluderend kan men stellen dat de polyolen wel degelijk een effect (zowel pro- als antiinflammatoir) uitoefenen op de oxidatieve burst activiteit van de leukocyten en zo kunnen bijdragen tot de verhoogde inflammatie en het verhoogde risico op cardiovasculair lijden bij CKD. Verdere onderzoeken naar het effect van de uremische retentiestoffen, waarvan een in vitro biologisch effect kon worden aangetoond, op bloed van CKD patiënten (uremische cellen) of door middel van dierenproeven zouden nuttig kunnen zijn om mogelijke betrokken pathofysiologische mechanismen te ontrafelen.
33
Referenties 1. Wills M.R. Uremic toxins and their effect on intermediary metabolism. Clin. Chem. 1985; 31(1): 5-13.
2. Schepers E. In vitro research for the patho-physiological mechanisms of uremic retention solutes on leukocytes in relation to chronic inflammation and accelerated atherosclerosis in chronic kidney disease. SCRIPTIE voorgedragen als doctoraatsthesis in het kader van de opleiding tot dokter in de medische wetenschappen. Universiteit Gent 2009; 17-223.
3. Vanholder R.C., Glorieux G., Schepers E. Uremic toxins in chronic renal failure. Prizoli. 2007; 28(1): 173-204.
4. Vanholder R.C., Glorieux G., De Smet R., Lameire N.H. In: Complications of chronic kidney disease : Uremic toxicity.
5. Livesey G. Health potential of polyols as sugar replacers, with emphasis on low glycaemic properties. Nutr. Res. Rev. 2003; 16(2): 163-91.
6. Hawksworth G., Drasar B.S., Hill M.J. Intestinal bacteria and the hydrolysis of glycosidic bonds. J Med Microbiol. 1971; 4(4): 451-459.
7. Bown R.L., Gibson J.A., Sladen G.E., Hicks B., Dawson A.M. Effects of lactulose and laxatives on ileal and colonic pH as measured by a radiotelemetry device. Gut. 1974; 15(12): 999-1004.
8. Gracey M. Intestinal microflora and bacterial overgrowth in early life. J Pediatr Gastroenterol Nutr. 1982; 1(1): 13-22.
9. Hill M.J. Bacteria and colorectal adenomas. Topics in Gastroenterology. 1985; 13: 237252.
10. Hill M.J., Melville D.M., Lennard-Jones J.E., Neale K., Ritchie J.K. Faecal bile acids, dysplasia, and carcinoma in ulcerative colitis. Lancet. 1987; 2(8552): 185-186.
34
11. Rowland I.R. Nutrition and gut microflora metabolism. In: Nutrition, Toxicity, and Cancer. Boston MA. 1991; 113-136.
12. Mitsuoka T. Intestinal flora and aging. Nutr Rev. 1992; 50(12): 438-446.
13. Screvola D., Bottari G., Oberto L., Monzillo V., Perversi L., Marone P. Intestinal bacterial toxins and alcohol liver damage: effect of lactitol, a synthetic disaccharide. La Clinica Dietologica. 1993; 20: 297-314.
14. Mital B.K., Garg S.K. Anticarcinogenic, hypocholesterolemic, and antagonistic activities of Lactobacillus acidophilus. Crit Rev Microbiol. 1995; 21(3): 175-214.
15. Grabitske H.A., Slavin J.L. Low-digestible carbohydrates in practice. J Am Diet Assoc. 2008; 108(10): 1677-1681.
16. Niwa T., Sobue G., Maeda K., Mitsuma T. Myoinositol inhibits proliferation of cultured Schwann cells: evidence for neurotoxicity of myoinositol. Nephrol Dial Transplant. 1989; 4(7): 662-666.
17. Goossens J., Röper H. Erythritol: A new bulk sweetener. Food Sci Technol Today. 1994; 8(3): 144-149.
18. Munro I.C., Berndt W.O., Borzelleca J.F. et al. Erythritol: an interpretive summary of biochemical, metabolic, toxicological and clinical data. Food Chem Toxicol. 1998; 36(12): 1139-1174.
19. Dubernet M.O., Bertrand A., Ribéreau-Gayon P. Constant presence in wines of erythritol, arabitol and mannitol. C R Acad Sci Hebd Seances Acad Sci D. 1974; 279(18): 15611564.
20. Onishi H., Saito S. Polyalcohols in soy sauce. Hakko Kogaku Zasshi. 1959; 37: 457-461.
21. Onishi H., Saito S. Polyalcohols in sake. Hakko Kogaku Zasshi. 1959; 38: 536-538.
35
22. Shindou T., Sasaki Y., Miki H., Eguchi., Hagiwara K., Ichikawa T. Identification of erythritol by HPLC and GS-MS quantitative measurement in pulps of various fruits. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 1989; 37: 1474-1476.
23. Shindou T., Sasaki Y., Miki H., Eguchi., Hagiwara K., Ichikawa T. Determination of erythritol in fermented foods by high performance liquid chromatography. Shokuhin Eiseigaku Zasshi. 1988; 29: 419-422.
24. Sponholz W.R., Dittrich H.H. Alditols and myoinositol in wines and sherries. Vitis. 1985; 24: 97-105.
25. Sponholz W.R., Lacher M., Dittrich H.H. The formation of alditols by the yeast of wine. Chemie Mikrobiologie Technologie der Lebensmittel. 1986; 10: 19-24.
26. Höber R., Höber J. Experiments on the absorption of organic solutes in the small intestine of rats. Journal of Cellular and Comparative Physiology. 1937; 10: 401-422.
27. Lauwers A.M., Daumerie C., Henquin J.C. Intestinal absorption of sorbitol and effects of its acute administration on glucose homeostasis in normal rats. Br J Nutr. 1985; 54(1): 5362.
28. Winne D., Görig H., Müller U. In vivo studies of mucosal-serosal transfer in rat jejenum. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 1985; 329(1): 70-76.
29. WinneD., Görig H., Müller U. Closed rat jejunal segment in situ: role of pre-epithelial diffusion resistance in the absorption process and model analysis. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 1987; 335(2): 204-215.
30. Oku T., Noda K. Influence of chronic ingestion of newly developed sweetener, erythritol on growth and gastrointestinal function of the rats. Nutrition Research. 1990; 10: 987-996.
31. Bornet F.R., Blayo A., Dauchy F., Slama G. Plasma and urine kinetics of erythritol after oral ingestion by healthy humans. Regul Toxicol Pharmacol. 1996; 24(2): 280-285.
36
32. Bornet F.R., Blayo A., Dauchy F., Slama G. Gastrointestinal response and plasma and urine determinations in human subjects given eruthritol. Regul Toxicol Pharmacol. 1996; 24(2): 296-302.
33. Hiele M., Ghoos Y., Rutgeerts P., Vantrappen G. Metabolism pf erythritol in humans: comparison with glucose and lactitol. Br J Nutr. 1993; 69(1): 169-176.
34. Noda K., Nakayama K., Oku T. Serum glucose and insulin levels and erythritol balance after oral administration of erythritol in healthy subjects. Eur J Clin Nutr. 1994; 48(4): 286-292.
35. Tetzloff W., Dauchy F., Medimagh S., Carr D., Bär A. Tolerance to subchronic, high-dose ingestion of erythritol in human volunteers. Regul Toxicol Pharmacol. 1996; 24(2): 286295.
36. Bernt W.O., Borzecella J.F., Flamm G., Munro I.C. Errythritol: a review of biological and toxicological studies. Regul Toxicol Pharmacol. 1996; 24(2): 191-197.
37. Screvola D. et al. The role of lactitol in the regulation of intestinal microflora in liver disease. Giornale di Malattie Infettive e Parassitarie. 1993; 45: 906-918.
38. Adcock L.H., Gray C.H. The metabolism of sorbitol in the human subject. Biochem J. 1957; 65(3): 554-560.
39. Mäkinen K.K. Effect of long-term, peroral administration of sugar alcohols on man. Swed Dent J. 1984; 8(3): 113-124.
40. Nasrallah S.M., Iber F.L. Mannitol absorption and metabolism in man. Am J Med Sci. 1969; 258(2): 80-88.
41. Poulton A., Winterborn M.H. Oral mannitol in control of fluid balance. Arch Dis Child. 1987; 62(7): 729-731.
42. James J.W., Evans R.A. Use of oral mannitol in the oedematous patient. Br Med J. 1970; 21(5694): 463-465.
37
43. Vanholder R.C., De Smet R., Glorieux G. et al. Review on uremic toxins: classification, concentration, and interindividual variability. Kidney Int. 2003; 63(5): 1934-1943.
44. Vanholder R.C., Baurmeister U., Glorieux G. et al. A bench to bedside view of uremic toxins. J Am Soc Nephrol. 2008; 19(5): 863-870.
45. Lindner A., Charra B., Sherrard D.J., Scribner B.H. Accelerated atherosclerosis in prolonged maintenance hemodialysis. N Engl J Med. 1974; 290(13): 697-701.
46. Foley R.N., Parfrey P.S., Sarnak M.J. Clinical epidemiology of cardiovascular disease in chronic renal disease. Am J Kidney Dis. 1998; 32: 112-119.
47. Van Biesen W., De Bacquer D., Verbeke F., Delanghe J., Lameire N., Vanholder R.C. The glomerular filtration rate in an apparently healthy population and its relation with cardiovascular mortality during 10 years. Eur Heart J. 2007; 28(4): 478-483.
48. Vanholder R.C., Massy Z., Argiles A. et al. Chronic kidney disease as cause of cardiovascular morbidity and mortality. Nephrol Dial Transplant. 2005; 20(6): 1048-1056.
49. Cheung A.K., Sarnak M.J., Yan G. et al. Atherosclerotic cardiovascular disease risks in chronic hemodialysis patients. Kidney Int. 2000; 58(1): 359-362.
50. Himmelfarb J., Stenvinkel P., Ikizler T.A., Hakim R.M. The elephant in uremia: oxidant stress as a unifying concept of cardiovascular disease in uremia. Kidney Int. 2002; 62(5): 1524-1538.
51. Muntner P., Hamm L.L., Kusek J.W., Chen J., Whelton P.K., He J. The prevalence of nontraditional risk factors for coronary heart disease in patients with chronic kidney disease. Ann Intern Med. 2004; 140(1): 9-17.
52. Muntner P., He J., Astor B.C., Folsom A.R., Coresh J. Traditional and nontraditional risk factors predict coronary heart disease in chronic kidney disease: results from the atherosclerotic risk in communities study. J Am Soc Nephrol. 2005; 16(2): 529-538.
38
53. Guérin A.P., Pannier B., Métivier F., Marchais S.J., London G.M. Assessment and significance of arterial stiffness in patients with chronic kidney disease. Curr Opin Nephrol Hypertens. 2008; 17(6): 635-641.
54. Stenvinkel P., Alvestrand A. Inflammation in end-stage renal disease: sources, consequences, and therapy. Semin Dial. 2002; 15(5): 329-337.
55. Stenvinkel P., Ketteler M., Johnson R.J. et al. IL-10, IL-6, and TNF-alpha: central factors in the altered cytokine network of uremia—the good, the bad and the ugly. Kidney Int. 2005; 67(4): 1216-1233.
56. Stenvinkel P., Carrerro J.J., Axelsson J., Lindholm B., Heimbürger O., Massy Z. Emerging biomarkers for evaluating cardiovascular risk in the chronic kidney disease patient: how do new pieces fit into the uremic puzzle. Clin J Am Soc Nephrol. 2008; 3(2): 505-521.
57. Locatelli F., Canaud B., Eckhardt K.U., Stenvinkel P., Wanner C., Zoccali C. Oxidative stress in end-stage renal disease: an emerging threat to patient outcome. Nephrol Dial Transplant. 2003; 18(7): 1272-1280.
58. Ross R. Atherosclerosis—an inflammatory disease. N Engl J Med. 1999; 340: 115–126.
59. Bernheim J., Rashid G., Gavrieli R., Korzets Z., Wolach B. In vitro effect of advanced glycation end-products on human polymorphonuclear superoxide production. Eur J Clin Invest. 2001; 31: 1064-1069.
60. Glorieux G., Vanholder R., Lameire N. Advanced glycation and the immune system: stimulation, inhibition or both? Eur J Clin Invest. 2001; 31: 1015-1018.
61. Thorpe S.R., Baynes J.W. Role of the Maillard reaction in diabetes mellitus and diseases of aging. Drugs Aging. 1996; 9: 69-77.
62. Hirayama A., Noronha-Dutra A.A., Gordge M.P., Neild G.H., Hothersall J.S. Inhibition of neutrophil superoxide production by uremic concentrations of guanidine compounds. J Am Soc Nephrol. 2000; 11: 684-689.
39
63. Glorieux G.L., Dhondt A.W., Jacobs P et al. In vitro study of the potential role of guanidines in leukocyte functions related to atherogenesis and infection. Kidney Int. 2004; 65: 2184-2192.
64. Tsai J.C., Perrella M.A., Yoshizumi M. et al. Promotion of vascular smooth muscle cell growth by homocysteine: a link to atherosclerosis. Proc Natl Acad Si U.S.A. 1994; 91: 6369-6373.
65. Massy Z.A., Ceballos I., Chadefaux-Vekemens B. et al. Homocystine, oxidative stress, and endothelium function in uremic patients. Kidney Int Suppl. 2001; 78: S243-245.
66. Bostom A.G., Shemin D., Lapane K.L. et al. Hyperhomocysteinemia and traditional cardiovascular disease risk factors in end-stage renal disease patients on dialysis: a casecontrol study. Atherosclerosis. 1995; 114: 93-103.
67. Robinson K., Gupta A., Dennis V. et al. Hyperhomocysteinemia confers an independent increased risk of atherosclerosis in end-stage renal disease and is closely linked to plasma folate and pyridoxine concentrations. Circulation. 1996; 94: 2743-2748.
68. Schepers E., Meert N., Glorieux G. et al. P-cresylsulphate, the main in vivo metabolite of p-cresol, activates leukocyte free radical production. Nephrol Dial Transplant. 2007; 22: 592-596.
69. Kanai M., Yamamoto H., Takahashi T., Onishi T., Shigeki Y. A 4-week feeding toxicity study on erythritol in rats with reduced renal function. Division of toxicology, Ohmiya research laboratory, Nikken chemicals Co, Ltd Japan (internal report).
70. Niwa T., Ise M. Indoxyl sulfate, a circulating uremic toxin, stimulates the progression of glomerular sclerosis. J Lab Clin Med. 1994; 124: 96-104.
71. Dou L., Bertrand E., Cerini C. et al. The uremic solutes p-cresol and indoxyl sulfate inhibit endothelial proliferation and wound repair. Kidney Int. 2004; 65: 442-451.
72. Dou L., Jourde-Chiche N., Faure V. et al. The uremic solute indoxyl sulfate induces oxidative stress in endothelial cells. J Thromb Haemost. 2007; 5: 1302-1308.
40
73. Vanholder R., Lameire N., Waterloos M.A. et al. Disturbed host defence in peritoneal cavity during CAPD: characterization of responsible factors in dwell fluid. Kidney Int. 1996; 50: 643-652.
41
