THE EFFECT of CEREMAI (Phyllanthus acidus (L.) Skeels.) LEAVES EXTRACT TOWARD O TITTER WIDAL and TEMPERATURE of Balb/c MICE INFECTED by Salmonella typhi
Niken Dyah Ariesti, Sikni Retno Karminingtyas, Janutiar Sunaringtyas
ABSTRACT
Typhoid fever attacks the population in all of country and still becomes a public health problem caused by Salmonella typhi bacterium. Ceremai (Phyllanthus acidus (L.) Skeels.) leaves contain flavonoids, saponins and tannin that are expected to be used as a treatment of typhoid fever. The aim of this research is to determine that the extract of ceremai leaves can affect O titter widal in Balb / c mice body temperature that were infected by Salmonella typhi. The research was pure experimental study (true experimental) and the study design used Pre and Post Test Only Group Design, using 28 mice divided into 4 groups. On day 1 they were injected by Salmonella typhi, on day 2 the blood was taken to check the O titter widal. The next day, the negative control was given by distilled water, the positive control was given by ciprofloxacin, and the other groups were given by extract of ceremai leaves with the concentration of 37% w / v and 42% w / v. On day 8 the blood was taken again to recheck O titter widal, during the treatment, the body temperature of mice was checked by using thermometer in the morning and afternoon. The data of the derease of titter widal were measured by using one way ANOVA with 95% confidence level. The test result showed that there were significance differences in O titter widal with p 0,007 . The result showed that extract of ceremai leaves (Phyllanthus acidus (L.) Skeels.) at level of 42% had the greatest influence in O titter widal which could affect the mice infected by Salmonella typhi.
Keywords
: Leaves of ceremai (Phyllanthus acidus (L.) Skeels.), Flavonoids, Saponins, Tannins, O Widal titer.
1
2
EFEK PEMBERIAN EKSTRAK DAUN CEREMAI (Phyllanthus acidus (L.) Skeels.) TERHADAP TITER WIDAL O dan SUHU TUBUH MENCIT Balb/c YANG DIINFEKSI Salmonella typhi
Niken Dyah Ariesti, Sikni Retno Karminingtyas, Janutiar Sunaringtyas
INTISARI
Demam tifoid menyerang penduduk di semua negara dan masih menjadi masalah kesehatan dalam masyarakat yang disebabkan oleh bakteri Salmonella typhi. Daun ceremai (Phyllanthus acidus (L.) Skeels.) mengandung senyawa flavonoid, saponin dan tanin yang diduga dapat digunakan sebagai pengobatan pada penyakit demam tifoid. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengetahui bahwa ekstrak daun ceremai dapat mempengaruhi titer widal dan suhu tubuh mencit Balb/c yang diinfeksi Salmonlla typhi. Jenis penelitian ini adalah penelitian eksperimental murni (true experimental) dan rancangan penelitian menggunakan Pre and Post Test Test Only Group Design menggunakan 28 ekor mencit dibagi dalam 4 kelompok, pada hari ke-1 diinjeksi dengan Salmonella typhi, pada hari ke-2 diambil darah untuk pengecekan titer widal, hari selanjutnya diberi perlakuan masing-masing kelompok kontrol negatif (aquadest), kontrol positif (ciprofloxacin), ekstrak daun ceremai kadar 37% b/v, dan 42% b/v. Pada hari ke-8 diambil darah untuk pengecekan titer widal kembali, selama perlakuan suhu tubuh mencit diukur menggunakan termometer pada pagi dan sore hari. Data penurunan titer widal dianalisa menggunakan ANAVA satu jalan dengan taraf kepercayaan 95%. Hasil uji menunjukkan adanya perbedaan signifikan antara berbagai perlakuan terhadap titer widal O dengan p 0,007. Hal ini menunjukkan bahwa ekstrak daun ceremai (Phyllanthus acidus (L.) Skeels.) pada kadar 42% dapat mempengaruhi titer widal O yang paling besar pada mencit yang diinfeksi dengan Salmonella typhi.
Kata Kunci : Daun
ceremai
(Phyllanthus
Saponin,Tanin,titer widal.
acidus
(L.)
Skeels.),
Flavonoid,
3
PENDAHULUAN Salmonella typhi adalah bakteri Gram negatif yang dapat menginfeksi manusia. Bakteri ini mampu menginvasi jaringan di luar usus, menyebabkan demam tifoid (Dzen dkk, 2010). Infeksi tifoid mengenai sistem retikuloendotelial, kelenjar limfe saluran cerna, dan kandung empedu dapat menular melalui jalur fekal-oral. Demam tifoid menyerang penduduk di semua negara. Seperti penyakit menular lainnya, tifoid banyak ditemukan di negara berkembang dimana higienis pribadi dan sanitasi lingkungan kurang baik. Sampai saat ini demam tifoid masih menjadi masalah kesehatan dalam masyarakat. Di Indonesia demam tifoid masih bersifat endemik. Berdasarkan data dari Profil Kesehatan Indonesia (2010) dari 10 penyakit terbanyak pada pasien rawat inap di Rumah Sakit di Indonesia, demam tifoid menduduki peringkat ke-3 dengan jumlah kasus mencapai 41.081 pasien dan 274 diantaranya meninggal. Diperkirakan insiden demam tifoid adalah 800 penderita per 100.000 penduduk per tahun, dengan angka kematian 2% (Widoyono, 2011). Pemilihan tanaman obat yang bermanfaat untuk mengobati demam tifoid dalam penelitian ini menggunakan daun ceremai (Phyllanthus acidus (L.) Skeels.) sebagai bahan uji karena berdasarkan penelitian secara in vitro telah terbukti bahwa daun ceremai (Phyllanthus acidus (L.) Skeels.) memiliki efektivitas sebagai antimikroba terhadap bakteri Salmonella typhi yang menghasilkan Kadar Hambat Minimum ( KHM ) pada konsentrasi 22% dan menghasilkan Kadar Bunuh Minimum ( KBM ) pada konsentrasi 26% (Lestari, 2013). Berdasarkan hasil penapisan fitokimia terhadap ekstrak daun ceremai menunjukkan adanya steroid/terpenoid, karotenoid, asam lemak kuat, tanin katekuat, senyawa pereduksi, steroid glikosid, flavonoid dan saponin (Handayani, 2007). Dari uraian di atas ekstrak daun ceremai (Phyllanthus acidus (L.) Skeels.) diduga dapat mempengaruhi titer widal O dan suhu tubuh pada mencit yang diinfeksi dengan Salmonella typhi.
METODE PENELITIAN Alat erlenmeyer, cawan petri, pinset, bejana maserasi, penangas air, corong, neraca analitik, blender, pipet tetes, gelas ukur , beaker glass, ayakan nomor 30 mesh, Spuit oral, spuit injeksi, tabung reaksi, micro hematokrit, termometer digital.
4
Bahan Daun ceremai (Phyllanthus acidus (L.) Skeels.), bakteri Salmonella typhi, mencit jantan galur Balb/c umur 6-8 minggu sehat dengan berat badan 20-25 gram, etanol 70%, ciprofloxacin, aquadest, serum mencit. Prosedur Penelitian Determinasi Determinasi dilakukan di Laboratorium Ekologi dan Biosistematik Jurusan Biologi Fakultas Sains dan Matematika Universitas Diponegoro Semarang. Daun ceremai tersebut diperoleh dari daerah Karangjati, Semarang Daun
ceremai
(Phyllanthus
acidus
(L.)
Skeels.)
dimaserasi
dengan
menggunakan etanol 70% kemudian diuapkan pada suhu tidak lebih dari 60 ℃ sampai didapatkan ekstrak kental kemudian dibuat menjadi 2 konsentrasi yaitu 37% b/v dan 42% b/v. Identifikasi bebas etanol Identifikasi bebas etanol secara kualitatif dilakukan dengan menambah 2 tetes H2SO4 pekat dan 1 ml larutan kalium dikromat, adanya kandungan etanol dalam ekstrak ditandai dengan terjadinya perubahan warna mula – mula dari jingga menjadi hijau kebiruan. Identifikasi flavonoid Uji reaksi warna flavonoid dengan cara tiga tetes sampel dalam tabung reaksi ditambahkan 1 tetes FeCl3 1% kemudian warna dicatat, hasil positif dari penambahan pereaksi ini menghasilkan warna hijau, merah, ungu, hitam, dan biru. Tiga tetes sampel dalam tabung reaksi ditambahkan 1 tetes NaOH 4% kemudian warna dicatat, pereaksi ini menghasilkan warna jingga-merah pada khalkon, merah-violet pada auron, kuning pada flavon dan isoflavon, kuning pucat menjadi coklat pada flavonol, dan kuning-jingga merah bila dipanaskan pada flavanon. Sebanyak 0,1 g ekstrak ditambah metanol sampai terendam lalu dipanaskan, filtratnya ditambah H2SO4 pekat, terbentuknya warna merah karena penambahan H2SO4 pekat menunjukkan adanya flavonoid. Identifikasi saponin Uji busa senyawa saponin dengan cara sampel dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang telah berisikan aquades 5 ml, dikocok dan ditambahkan 1 tetes larutan HCl 2N. Tabung reaksi tersebut didiamkan dan diperhatikan ada atau tidak adanya busa stabil. Sampel mengandung saponin jika terbentuk busa stabil dengan ketinggian 1-3 cm selama 30 detik.
5
Identifikasi tanin Uji reaksi warna tanin dengan meneteskan larutan FeCl3 1% ke dalam ekstrak kental, yang akan menimbulkan warna hijau, merah ungu, biru, atau hitam yang kuat, selain itu juga dapat diidentifikasi menggunakan larutan Amonia (NH4OH) dan kalium ferri cianida (K3Fe (CN) 6) akan menghasilkan warna coklat. Perlakuan hewan uji : penelitian ini menggunakan 28 mencit jantan galur Balb/c dibagi tiap kelompok 7 ekor sebanyak 4 kelompok. Hari ke-1 tiap mencit diinjeksi dengan Salmonella typhi dosis 107 CFU/ml per intraperitoneal. Hari ke-2 darah mencit diambil untuk tes widal O pertama. Hari ke-2 sampai ke-8 masing-masing kelompok diberi perlakuan. Kelompok I kontrol negatif diberi aquadest, kelompk II kontrol positif diberi ciprofloxacin dosis 182 mg/kg, kelompok perlakuan III dan IV diberi masingmasing ekstrak daun ceremai 37% b/v dan 42% b/v peroral. Selama perlakuan suhu tubuh mencit dicek menggunakan termometer digital setiap pagi dan sore. Hari ke-8 darah diambil untuk tes widal O yang kedua.
ANALISA DATA Data yang diperoleh dari selisih titer widal O dan AUC suhu tubuh mencit dianalisa secara statistik parametrik yang didasarkan pada hasil normalitas dan homogenitas dilanjutkan dengan uji ANAVA satu jalan menggunakan SPSS 18,0 for Windows dengan tarif kepercayaan 95%.
HASIL Determinasi : 1b, 2b, 3b, 4b, 12b, 13b, 14b, 17b, 18b, 19b, 20b, 21b, 22b, 23b, 24b, 25a........................ Famili 99 : Euphorbiaceaea, 1b, 3b, 4b, 6b, 57a, 58b, 62b, 64a, 65b, 66a....... Genus 8 : Phyllanthus 1a, 6b, 8a, 9a.................................. Species : Phyllanthus acidus (L.) Skeels. Berdasarkan hasil determinasi dapat diperoleh kepastian bahwa tumbuhan yang digunakan dalam penelitian ini adalah Phyllanthus acidus (L.) Skeels atau ceremai. Reaksi yang didapatkan pada uji bebas etanol ekstrak kental daun ceremai terbentuk warna coklat, sehingga ekstrak tersebut dinyatakan bebas etanol.
6
Uji reaksi warna flavonoid dengan FeCl3 1% terbentuk warna hitam, dengan NaOH 4% terbentuk warna kuning kecoklatan, dengan metanol dan H2SO4 pekat, terbentuknya warna merah.
Uji busa saponin terbentuk busa setinggi 2 cm, setelah ditambahkan HCl 2N busa tidak hilang dengan ketinggian 2 cm selama 5 menit.
Identifikasi senyawa tanin dengan FeCl3 1% menghasilkan warna hijau kehitaman.
Tabel I. Penurunan Titer Widal, dan Mean Kelompok Perlakuan K(-) K(+) P 37% P 42%
Penurunan Titer Widal Mencit I Mencit II Mencit III Mencit IV Mencit V Mencit VI -160 20 -80 -40 -60 -160 20 120 -20 40 -40 -40 -40 -60 0 -40 -40 0 0 40 -20 0 20 80
Mean -80 13,3 -30 20,0
SD 70,4 61,5 24,5 35,8
Tabel II. Total AUC Tiap Kelompok Perlakuan Kelompok Perlakuan
Mencit I
K(-) K(+) P37% P42%
548,9 528,2 518,6 522,5
Mencit II 541,9 535,0 519,4 515,6
Mencit III 538,0 521,7 516,1 526,4
Nilai Total AUC Mencit Mencit IV V 537,9 529,9 529,9 535,6 518,5 514,8 527,5 520,4
Tabel III. Uji LSD Titer Widal O Pasangan Perlakuan Kontrol Negatif vs Kontrol Positif Kontrol Negatif vs Kadar 37% Kontrol Negatif vs Kadar 42% Kontrol Positif vs Kadar 37% Kontrol Positif vs Kadar 42% Kadar 37% vs Kadar 42%
Sig. 0,005 0,108 0,003 0,161 0,825 0,108
Kesimpulan Berbeda signifikan Berbeda tidak signifikan Berbeda signifikan Berbeda tidak signifikan Berbeda tidak signifikan Berbeda Tidak signifikan
Mencit VI 540,5 534,8 523,3 535,5
Mean
SD
539,5 530,9 518,4 524,6
6,2 5,4 2,9 6,8
7
Tabel IV. Uji LSD AUC Suhu Pasangan Perlakuan Kontrol Negatif vs Kontrol Positif Kontrol Negatif vs Kadar 37% Kontrol Negatif vs Kadar 42% Kontrol Positif vs Kadar 37% Kontrol Positif vs Kadar 42% Kadar 37% vs Kadar 42%
Sig. 0,014 0,000 0,000 0,001 0,067 0,067
Kesimpulan Berbeda signifikan Berbeda signifikan Berbeda signifikan Berbeda signifikan Berbeda tidak signifikan Berbeda tidak signifikan
Keterangan : Jika p-value < 0,05 berbeda signifikan Jika p-value > 0,05 berbeda tidak signifikan
PEMBAHASAN Determinasi tanaman bertujuan untuk menghindari penggunaan tanaman yang salah dan dapat mencegah kemungkinan tercampurnya tanaman yang akan diteliti dengan tanaman lain. Berdasarkan hasil determinasi dapat diperoleh kepastian bahwa tanaman yang digunakan dalam penelitian ini adalah Phyllanthus acidus (L.) Skeels atau ceremai. Hasil identifikasi bebas etanol terbentuk warna coklat yang menunjukkan bahwa ekstrak bebas etanol. Dilakukan identifikasi bebas etanol dikarenakan etanol 70% merupakan desinfektan yang dapat membunuh bakteri yang dapat mempengaruhi efek antibakteri dari ekstrak yang akan diteliti. Berdasarkan perubahan warna yang terbentuk pada identifikasi flavonoid menunjukkan bahwa dalam daun ceremai positif mengandung flavonoid dengan reaksi kimia sebagai berikut :
Flavonoid
Hitam
Gambar 1. Reaksi Kimia Flavonoid dengan FeCl3
Flavonoid
Kuning kecoklatan
Gambar 2. Reaksi Kimia Flavonoid dengan NaOH
Flavonoid
Merah
Gambar 3. Reaksi Kimia Flavonoid dengan Metanol dan H2SO4
8
Terbentuknya busa pada identifikasi saponin menunjukkan bahwa dalam daun ceremai positif mengandung saponin dengan reaksi kimia sebagai berikut : H3C
CH3
H3C
CH 3
+ HCl
CH3
+ Cl-
CH3 CH3
CH 3
H HO
HO
Saponin
Sapogenin
Gambar 4. Reaksi Saponin dengan HCl Pada identifikasi tanin, menghasilkan warna hijau kehitaman menunjukkan dalam daun ceremai positif mengandung tanin dengan reaksi kimia sebagai berikut : HO OH
OH
+ Fe3+
+ Fe(OH)3
OH
OH HO
HO HO
Tanin
HO
Hijau kehitaman
Gambar 12. Reaksi Kimia Tanin dengan FeCl3 Parameter yang digunakan pada penelitian ini yaitu penurunan titer widal O mencit dan suhu tubuh. Titer widal yang diperiksa adalah antigen O karena merupakan pemeriksaan infeksi akut, sedangkan untuk infeksi masa lampau, tifoid carrier dan vaksinasi dibutuhkan pemeriksaan antigen H maupun Vi. Selain itu juga dikarenakan darah yang dapat diambil dari mencit hanya sedikit sehingga tidak mencukupi untuk memeriksa seluruh antigen. Pengukuran suhu tubuh dipilih sebagai parameter karena semua penyakit yang dikarenakan penyakit infeksi biasanya ditandai dengan peningkatan suhu tubuh. Berdasarkan tabel uji LSD titer widal O di atas menunjukkan bahwa kontrol negatif (aquadest) dengan kontrol positif (ciprofloxacin 182 mg/kg) dan kadar 42% b/v berbeda signifikan yang berarti bahwa terdapat perbedaan dalam menurunkan titer widal O. Namun pada kadar 37% b/v berbeda tidak signifikan dengan kontrol negatif dengan Sig. 0,108 > 𝛼(0,05) yang berarti bahwa pada kadar 37% b/v tidak mempengaruhi titer widal, tetapi jika dilihat dari data mentah pada kadar 37% b/v memiliki penurunan titer widal O yang lebih besar dari kontrol negatif walaupun tidak sebagus kontrol positif. Pada kontrol positif dengan kadar 37% b/v dan kadar 42% b/v didapatkan berbeda tidak signifikan, meskipun sama-sama berbeda tidak signifikan tetapi jika dilihat dari Sig. yang
9
terbesar adalah pada kadar 42% b/v, sehingga dapat disimpulkan bahwa yang mempengaruhi titer widal paling besar adalah kadar 42% b/v, sedangkan pada kadar 37% b/v mempengaruhi titer widal tetapi relatif kecil. Pada tabel uji LSD AUC suhu tubuh di atas menunjukkan bahwa kontrol negatif dengan kontrol positif, kadar 37%, dan kadar 42% berbeda signifikan yang menunjukkan terdapat perbedaan efek antar kelompok tersebut. Hal ini berarti terdapat perbedaan dalam memberikan efek penurunan suhu. Kontrol positif dengan kadar 42% Sig. 0,067 > 𝛼 (0,05) yang menunjukkan berbeda tidak signifikan dan kadar 37% dengan kadar 42% Sig. 0,067 > 𝛼(0,05) yang juga menunjukkan berbeda tidak signifikan. Namun karena perubahan suhu tubuh tidak sesuai dengan karakteristik demam tifoid yaitu suhu pagi lebih rendah atau normal, sedangkan sore dan malam lebih tinggi, sehingga dapat disimpulkan bahwa ekstrak daun ceremai tidak ada pengaruhnya terhadap penurunan suhu tubuh mencit yang diinfeksi Salmonella typhi. Hal ini terjadi dimungkinkan akibat masa inkubasi dari bakteri Salmonella typhi yang kurang lama yaitu hanya 1 hari walaupun penginjeksian sudah diberikan secara intraperitoneal, sedangkan menurut Nelwan (2012), periode inkubasi demam tifoid terjadi antara 7-14 hari yang penularannya melalui fekal-oral. Berdasarkan penelitian ini terbukti bahwa ekstrak daun ceremai (Phyllanthus acidus (L.) Skeels.) dapat mempengaruhi titer widal O pada mencit balb/c yang diinfeksi Salmonella typhi, hal ini sejalan dengan penelitian yang dilakukan oleh Lestari yang membuktikan bahwa daun ceremai (Phyllanthus acidus (L.) Skeels.) secara in vitro memiliki efektivitas sebagai antimikroba terhadap bakteri Salmonella typhi yang menghasilkan Kadar Hambat Minimum ( KHM ) pada konsentrasi 22% dan Kadar Bunuh Minimum ( KBM ) pada konsentrasi 26% karena daun ceremai mengandung flavonoid yang memiliki mekanisme kerja mendenaturasi sel bakteri dan merusak membran sel, saponin yang mengganggu permeabilitas membran sel bakteri, dan tanin yang dapat mengikat rantai polipeptida bakteri sehingga dinding sel bakteri rusak.
KESIMPULAN dan SARAN Kesimpulan 1. Pemberian ekstrak daun ceremai (Phyllanthus acidus (L.) Skeels.) mempengaruhi titer widal O pada mencit Balb/c yang diinfeksi dengan Salmonella typhi. 2. Pemberian ekstrak daun ceremai (Phyllanthus acidus (L.) Skeels.) tidak mempengaruhi suhu tubuh mencit Balb/c yang diinfeksi dengan Salmonella typhi.
10
Saran 1. Untuk penelitian lebih lanjut perlu diperhatikan lama masa inkubasi bakteri Salmonella typhi di dalam tubuh. 2. Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut tentang kemungkinan adanya efek samping pemberian ekstrak daun ceremai (Phyllanthus acidus (L.) Skeels.).
UCAPAN TERIMA KASIH 1. Laboratorium Farmasi STIKES NGUDI WALUYO Ungaran. 2. Laboratorium Gizi PSPG Universitas Gadjah Mada Yogyakarta.
DAFTAR PUSTAKA
1. Dzen, S.M., Winarsih, S., Roekitiningsih, D., Santoso, S., Sumarno, Islam, S., Noorhamdani, Murwani, S., dan Santosaningsih, D., 2010, Bakteriologi Medik, 223-234, Putra Media Nusantara, Surabaya. 2. Widoyono, 2011, Penyakit Tropis, 41-46, Erlangga, Jakarta. 3. Lestari, P.F., 2013, Uji Efektivitas Ekstrak Daun Ceremai (Phyllantus acidus (L.) Skeels.) sebagai Antimikroba terhadap Bakteri Salmonella thypi Secara In Vitro, Skripsi, Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya, Malang. 4. Handayani, S., 2007 Penapisan Fitokimia dan Uji Aktivitas Berbagai Ekstrak Daun Ceremai Secara BSLT, Tesis, Fakultas Farmasi Universitas Pancasila, Jakarta.
