NGS testen in de neuro-oncologie uitdagingen en (on)mogelijkheden

NGS testen in de neuro-oncologie uitdagingen en (on)mogelijkheden Erik Jan Dubbink Klinisch Moleculair Bioloog in de Pathologie Department of Pathology Erasmus MC, Rotterdam [email protected]

9e Bijeenkomst Werkgroep "Moleculaire Diagnostiek in de Pathologie" 16-01-15, Utrecht

Disclosure belangen spreker GEEN

Histologische classificatie van gliomas

• Glioblastoma • Oligodendroglioma • Astrocytoma

Moleculaire classificatie van gliomas Oligodendrogliomas

Glioblastomas

Astrocytomas

Killela P J et al. PNAS 2013;110:6021-6026

Moleculaire diagnostiek van het glioom • Diagnostisch – mutatiespectrum + co-deletie 1p/19q • Prognostisch – co-deletie 1p/19q • Predictief – co-deletie 1p/19q, MGMT methylering, EGFR amplificatie, intragene EGFR deletie, PTEN deletie

Gecombineerde mutatie en copy-number-variatie detectie

NGS analyse – one size fits all

Custom-made neuro-oncologie panel  Complete genen ATRX, CIC, EGFR, FUBP1, NOTCH1, PTEN, TP53  Hot spots regio’s BRAF, H3F3A, IDH1, IDH2, PIK3CA  Genomische regio’s 1p, 7p, 7q, 10q, 19q

Detectie van MGMT methylering nog niet mogelijk

Methodes van diagnostische detectie van LOH  FISH – fluorescentie in situ hybridisatie  MLPA – multiplex ligation-dependent probe amplification  Microsatelliet, nucleotide repeat, analyse

Microsatelliet analyse  NGS en repeats

SNP analyse met NGS – Ion Torrent platform

Ion Torrent platform

Single nucleotide polymorphisms (SNPs) –”SNIPs”  Single nucleotide polymorphisms (SNPs) zijn een type polymorfismen, natuurlijk voorkomende variaties die betrekking hebben op één basenpaar

AAGCCTAGCAC Allel 1 TTCGGATCGTG AAGCTTAGCAC Allel 2 TTCGAATCGTG

Single nucleotide polymorphisms (SNPs) –”SNIPs”  Single nucleotide polymorphisms (SNPs) zijn een type polymorfismen, natuurlijk voorkomende DNA variaties die betrekking hebben op één basenpaar  Ongeveer 1 op ~300 nucleotiden  Frequentie waarin varianten voorkomen verschilt per SNP  Hoog polymorfe SNPs: minor allel frequentie 0,45-0,50  SNP dichtheid: dichtheid SNPs per kb

Custom-made neuro-oncologie panel  Complete genen ATRX, CIC, EGFR, FUBP1, NOTCH1, PTEN, TP53  Hot spots regio’s BRAF, H3F3A, IDH1, IDH2, PIK3CA  Genomische regio’s 1p, 7p, 7q, 10q, 19q Totaal 526 amplicons

SNP selectie • dbSNP • Hoog polymorf • Dichtheid 1 SNP per 2-3 mb

LOH analyse mbv de PGM LOH op basis van SNPs  Selectie hoog polymorfe SNPs in regio van interesse (dbSNP) (bv chromosoom 1p en 19q)

niet informatief

G G informatief

G C

 Genotype bepalen mbv NGS analyse niet informatief

 Berekenen van percentage variante allel (B-allel of minor allel frequentie)

C C

LOH analyse mbv de PGM

LOH analyse mbv de PGM G

G Homozygous Variant

G

Heterozygous

G C

Homozygous Reference

C

C C

LOH analyse mbv de PGM G Loss Reference Allele

G C

G Loss Variant Allele

C

G C C

LOH analyse mbv de PGM G

G Amplification Variant Allele

G C

G Amplification Reference Allele

C

G C C

C

LOH analyse mbv de PGM Loss Reference Allele Amplification Variant Allele

Homozygous Variant

Heterozygous

Loss Variant Allele Amplification Reference Allele

Homozygous Reference

In de praktijk - gevoeligheid

% Variant

Chromosoom 1p, normaal

Chromosomale positie (Mb)

% Variant

Chromosoom 1p verlies, 40% tumor

Chromosomale positie (Mb)

% Variant

Chromosoom 1p verlies, 60% tumor

Chromosomale positie (Mb)

% Variant

Chromosoom 1p verlies, hoog tumor %

Chromosomale positie (Mb)

In de praktijk - voorbeelden

Partieel verlies 1p

Glioblastoom – 80% Chromosoom 7

EGFR locus

Leesdiepte plot – chromosoom 7

Glioblastoom – 80% Chromosoom 10q

PTEN locus

Leesdiepte – chromosoom 10

Conclusies  Lage dichtheid SNP analyse door middel van NGS is een gevoelige methode voor detectie van grote chromosomale afwijkingen imbalance in routine FFPE weefsels  De data zijn makkelijk en in één oogopslag te interpreteren  Normaal referentieweefsel is niet nodig  Zeer goed te combineren met mutatie analyse  De analyse kan worden uitgevoerd op zeer kleine hoeveelheden DNA (3-10 ng)  Breed toepasbaar en makkelijk te implementeren

Uitdagingen  Aantonen van amplificaties van EGFR  Aantonen van (kleine) homozygote deleties  Aantonen van TERT promoter mutaties  Aantonen van MGMT methylering

Winand Dinjens

Ronald van Marion

Rute Pedrosa

Isabelle Meijssen

Ludo Uytdewilligen

Niels Krol

Ina Geurts-Giele

Dorine den Toom

Margot van den Akker

Peggy Atmodimedjo Lotte Douglas-Berger

Carolina Valente

Hein Sleddens

Dank voor uw aandacht