NÁVODY BIOCHEMICKÝCH PRAKTIK I

Biochemické praktikum I, katedra biochemie, PřF UK v Praze, 2015/2016

NÁVODY BIOCHEMICKÝCH PRAKTIK I

Doc. RNDr. Helena Ryšlavá, CSc. RNDr. Jiří Liberda, Ph.D. RNDr. Veronika Hýsková, Ph.D. Doc. RNDr. Václav Martínek, Ph.D. RNDr. Petr Man, Ph.D. RNDr. Petr Novák, Ph.D. Mgr. Daniel Kavan, Ph.D.

Biochemické praktikum I, katedra biochemie, PřF UK v Praze, 2015/2016

Doporučení Před začátkem praktik doporučujeme studentům zopakovat si následující typy výpočtů: - Výpočet navážky pro přípravu roztoku, jehož koncentrace je vyjádřena v mol/l, g/l nebo v % - Výpočet výsledné koncentrace látky ve směsi (směšovací rovnice) - Převod molární koncentrace na % a naopak - Ředění roztoků-např. jak budete roztok ředit 5×, 100×, 500×, 1000×., 1: 2, 1:5... - Ředění roztoků vyjádřených v %, v mol/l - Příprava roztoků kyselin o dané hustotě - Příprava pufrů ze zásobních roztoků

Upozornění - Práce na úloze bude umožněna jen studentům, kteří prokážou dostatečné porozumění principům úloh - Vytištěný protokol je třeba odevzdat nejpozději na začátku příštího praktika, jinak úloha propadá - Po případné dohodě s dozorem praktik je možné odevzdat elektronickou verzi protokolu – poslat emailem nejpozději 24 h před konáním dalšího praktika - V případě oprav musí být protokol bez vad schválen do tří týdnů od vypracování úlohy, jinak úloha propadá - V době zápočtového testu může chybět nejvýše jeden schválený protokol - Pro získání zápočtu je třeba: Experimentálně provést zadané úlohy a nahlásit výsledky Absolvovat prezentaci vybrané úlohy Splnit podmínky závěrečného testu Odevzdat schválené protokoly ke všem úlohám Vrátit klíč od skříňky na chodbě

2

Obsah Biochemické praktikum I, katedra biochemie, PřF UK v Praze, 2015/2016 1.

METODY STANOVENÍ KONCENTRACE PROTEINŮ V ROZTOKU......... 4

2.

IZOLACE PROTEINU ........................................................................................... 6 2.1. 2.2.

3.

SEPARACE LÁTEK POMOCÍ GELOVÉ CHROMATOGRAFIE ................... 19 3.1. 3.2. 3.3. 3.4. 3.5.

4.

GELOVÁ CHROMATOGRAFIE – SEPARACE LÁTEK....................................................... 21 URČENÍ DISTRIBUČNÍHO KOEFICIENTU PRO CYTOCHROM C ....................................... 23 KALIBRACE CHROMATOGRAFICKÉ KOLONY PRO STANOVENÍ RELATIVNÍ MOLEKULOVÉ HMOTNOSTI PROTEINU .............................................................................................. 26 STANOVENÍ RELATIVNÍ MOLEKULOVÉ HMOTNOSTI NEZNÁMÉHO PROTEINU .............. 28 STANOVENÍ RELATIVNÍ MOLEKULOVÉ HMOTNOSTI PEROXIDASY............................... 30 ELEKTROFORETICKÉ METODY................................................................... 32

4.1. 4.2. 4.3. 5.

STANOVENÍ RELATIVNÍ MOLEKULOVÉ HMOTNOSTI PROTEINU ELEKTROFORÉZOU V PROSTŘEDÍ SDS ..................................................................................................... 36 NATIVNÍ ELEKTROFORÉZA ENZYMŮ V POLYAKRYLAMIDOVÉM GELULAKTÁTDEHYDROGENASA ........................................................................................ 40 NATIVNÍ ELEKTROFORÉZA ENZYMŮ V POLYAKRYLAMIDOVÉM GELU- PEROXIDASA .. 42 CHARAKTERIZACE ENZYMŮ ........................................................................ 44

5.1. 5.2. 5.3. 5.4. 5.5. 5.6. 5.7. 5.8. 5.9. 5.10. 5.11. 5.12. 5.13. 5.14. 5.15. 6.

STANOVENÍ MICHAELISOVÝCH KONSTANT ALKOHOLDEHYDROGENASY (ADH) ....... 50 LAKTÁTDEHYDROGENASA – MICHAELISOVY KONSTANTY PRO LAKTÁT A NAD+ ..... 53 LAKTÁTDEHYDROGENASA – STANOVENÍ MICHAELISOVY KONSTANTY PRO LAKTÁT A NAD+ NA MIKROTITRAČNÍ DESTIČCE ........................................................................ 56 STANOVENÍ MICHAELISOVY KONSTANTY KATALASY ................................................ 60 ČASOVÝ PRŮBĚH ŠTĚPENÍ ŽELATINY TRYPSINEM ...................................................... 63 ŠTĚPENÍ KASEINU TRYPSINEM – STANOVENÍ MICHAELISOVY KONSTANTY ........................... 65 INHIBICE TRYPSINU OVOMUKOIDEM .......................................................................... 67 CHARAKTERIZACE TRYPSINU S VYUŽITÍM AZOKASEINU. ........................................... 68 ŠTĚPENÍ ŠKROBU -AMYLASOU – ČASOVÝ PRŮBĚH ENZYMOVÉ REAKCE .............................. 70 ZÁVISLOST RYCHLOSTI ŠTĚPENÍ ŠKROBU -AMYLASOU NA PH ................................. 72 AKTIVACE A INHIBICE ŠTĚPENÍ ŠKROBU -AMYLASOU .............................................. 74 ŠTĚPENÍ SACHAROSY -FRUKTOSIDASOU (SACHARASOU) – ZÁVISLOST NA MNOŽSTVÍ ENZYMU .................................................................................................................... 76 STANOVENÍ MICHAELISOVY KONSTANTY -FRUKTOSIDASY ..................................... 79 ZÁVISLOST AKTIVITY -D-GLUKOSIDASY NA ČASE ................................................... 83 STANOVENÍ PH OPTIMA A MICHAELISOVY KONSTANTY -D-GLUKOSIDASY ............. 85 NUKLEOVÉ KYSELINY..................................................................................... 88

6.1. 7.

IZOLACE LAKTÁTDEHYDROGENASY ZE SRDEČNÍHO SVALU ....................................... 12 IZOLACE ROSTLINNÉ ALKOHOLDEHYDROGENASY ..................................................... 16

IDENTIFIKACE PACHATELE VRAŽDY METODOU DNA FINGERPRINTING ..................... 89 BEZPEČNOSTNÍ PŘEDPISY PRO CHEMICKÉ LABORATOŘE .............. 93

3

1 Metody stanovení koncentrace proteinů v roztoku Biochemické praktikum I, katedra biochemie, PřF UK v Praze, 2015/2016

1. METODY STANOVENÍ V ROZTOKU

KONCENTRACE

PROTEINŮ

Stanovení množství proteinů v roztoku podle Lowryho: V konečném preparátu stanovte množství bílkovin podle Lowryho. Připravte si kalibraci pomocí známých koncentrací hovězího sérového albuminu (BSA). Stanovovaný preparát je pro stanovení bílkovin někdy nutné vhodně zředit destilovanou vodou, aby absorbance nepřesahovala rozsah kalibrační přímky. Metoda je založená na reakci iontů mědi s peptidovou vazbou v alkalických podmínkách (biuretový test) v kombinaci s oxidací postranních řetězců aminokyselin obsažených v proteinu. Cu2+ ionty jsou při reakci s peptidovou vazbou redukovány na Cu+ a ty dále společně s některými postranními řetězci aminokyselin proteinu (především tryptofanu a tyrosinu, částečně i cysteinu) reagují s Folinovým fenolovým reagens. Mechanismus této reakce není dosud plně prozkoumán. Koncentrace redukovaného reagens se pak zjišťuje měřením absorbance v dlouhovlné viditelné oblasti (až k 750 nm). Metoda je empirická a před použitím je nutné sestrojit kalibrační graf pro roztok čisté bílkoviny o známé koncentraci. Chemikálie: Fenolové reagens (Folin-Ciocaltteau): Ředí se 1 : 1 destilovanou vodou! (např. 3 ml reagens + 3 ml destilované vody, pro každý vzorek bude potřeba 0,5 ml) Roztok A: 2% Na2CO3 v 0,1 M NaOH Roztok B: 0,5% CuSO4 v 1% vinanu sodném Roztok C se připraví smísením 50 ml roztoku A a 1 ml roztoku B. Tento roztok je třeba připravovat vždy čerstvý. Hovězí sérový albumin (BSA) Postup: 1. Kalibrace: Standardní roztok bílkoviny připravte rozpuštěním 5 mg hovězího sérového albuminu v 10 ml přesně odměřené destilované vody. Do zkumavek po dokonalém rozpuštění BSA pipetujte: 0; 0,1; 0,2; 0,4; 0,6; 0,8 a 1 ml roztoku bílkoviny, poté doplňte destilovanou vodou na výsledný objem 1 ml. K 1 ml roztoku bílkoviny přidejte 5 ml roztoku C, promíchejte a nechte stát 10 minut za normální teploty. Pak rychle přidejte 0,5 ml zředěného fenolového reagens, promíchejte a nechte stát 30 minut. U všech roztoků změřte spektrofotometricky absorbanci proti slepému vzorku (1. zkumavka kalibrace) při 500 nm. 2. Stanovení bílkovin ve vzorku: 1 ml vhodně zředěného vzorku pipetujte přímo do zkumavek. Přidejte 5 ml roztoku C-promíchejte a nechte stát 10 minut. Pak přidejte 0,5 ml zředěného fenolového reagens, rychle promíchejte a nechte stát 30 minut. Změřte absorbanci proti slepému vzorku při 500 nm. Poznámka Máte-li kalibraci již připravenou z předešlé úlohy, použijte ji, připravte si pouze slepý vzorek. Dodržujte však inkubační časy. Stanovení množství proteinů v roztoku podle Bradforda: V konečném preparátu stanovte množství bílkovin podle Bradforda. Připravte si kalibraci pomocí známých koncentrací hovězího sérového albuminu (BSA). Stanovovaný preparát je pro stanovení bílkovin někdy nutné vhodně zředit destilovanou vodou, aby absorbance nepřesahovala rozsah kalibrační přímky.

4

1 Metody stanovení koncentrace proteinů v roztoku Biochemické praktikum I, katedra biochemie, PřF UK v Praze, 2015/2016 Tato metoda je založena na posunu absorbančního maxima barviva Coomassie Brilliant Blue G-250 po vazbě na protein. Standardně se měří absorbance při 595 nm, větší přesnosti a delší lineární oblasti pak lze dosáhnout měřením poměrů absorbancí při 595 a 450 nm. Mezi výhody metody počítáme jednoduchost, rychlost a jen malou ovlivnitelnost stanovovaným prostředím, mezi nevýhody pak poměrně značnou závislost na proteinovém složení stanovovaných vzorků. Chemikálie Komerčně dostupné činidlo (Coomassie Brilliant Blue G-250, methanol, H3PO4) Hovězí sérový albumin (BSA) Postup 1. Připravte si standrdní roztok bílkoviny rozpuštěním 5 mg BSA v 10 ml destilované vody. Do dalších zkumavek ředěním s vodou připravte roztoky o koncentracích 0; 0,1; 0,2; 0,3 a 0,4 mg/ml. 2. Do mikrotitrační destičky do prvních tří sloupků pipetujte po pěti mikrolitrech standardních roztoků, vždy v triplikátech. Do dalších volných sloupků pipetujte rovněž v triplikátech stanovované vzorky, případně jejich různá ředění (viz schéma) 0 0 0 Vz. 1 Vz. 1 Vz. 1 Vz. 9 Vz. 9 Vz. 9 ... ... ... 0,1 0,1 0,1 Vz. 2 Vz. 2 Vz. 2 ... ... ... ... ... ... 0,2 0,2 0,2 Vz. 3 Vz. 3 Vz. 3 ... ... ... ... ... ... 0,3 0,3 0,3 ... ... ... ... ... ... ... ... ... 0,4 0,4 0,4 ... ... ... ... ... ... ... ... ... 0,5 0,5 0,5 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... Vz. 8 Vz. 8 Vz. 8 ... ... ... ... ... ... 3. Ke každé jamce se vzorkem přidejte 200 µl Bradfordova činidla. 4. Nechte 5-10 min inkubovat a měřte absorbanci při vhodné vlnové délce. 5. Sestrojte kalibrační přímku a odečtěte koncentraci stanovovaných roztoků.

5

2 Izolace proteinu Biochemické praktikum I, katedra biochemie, PřF UK v Praze, 2015/2016

2. IZOLACE PROTEINU Pro izolaci proteinu je třeba zvolit vhodný výchozí materiál, který je dostupný a ve kterém se zvolený protein vyskytuje v dostatečném množství. Strategie izolace závisí na lokalizaci izolovaného proteinu v buňce. Cílem prvního kroku je převést protein do roztoku a odstranit nerozpustné složky. Při purifikaci rozpustných extracelulárních proteinů se musí odstranit buňky a další nerozpustné částice. Roztok proteinů může být dále separován chromatografickými technikami. Pro izolaci intracelulárních proteinů je důležité rozbití buněk a vylití obsahu do vhodného pufru. Při izolaci membránově vázaných proteinů se do extrakčního média přidávají detergenty. Rekombinantní proteiny exprimované v bakteriích tvoří často nerozpustná inkluzní tělíska, proteiny je možno solubilizovat přídavkem močoviny do pufru. Takový protein je však často denaturovány a musí se převézt zpět do nativní formy. HOMOGENIZACE Způsob homogenizace závisí na charakteru výchozího materiálu. Suchý materiál, např. semena, se homogenizují mletím v kulových mlýnech nebo mlýnech s otočnými noži. K homogenizaci živočišných tkání lze využít masového strojku. Pro homogenizaci malých množství měkkých tkání je nejvhodnější homogenizátor podle Pottera a Elvehjema. Tento homogenizátor se skládá ze silnostěnné zkumavky a zabroušeného pístu, který se spojí s elektromotorkem. Do zkumavky se vloží odvážená tkáň (zvláště u tužších materiálů, jako jsou např. srdce nebo ledviny, je vhodné ji předem rozstříhat na menší kousky) a přidá se tolik homogenizačního média, aby vznikl homogenát požadované koncentrace. Pak se do zkumavky vloží píst a spustí se motorek. Zkumavkou se posunuje nahoru – při tomto pohybu rotující píst drtí tkáň, která prochází mezi stěnou zkumavky a pístem nad píst. Pohyb pístu nahoru a dolů se několikrát opakuje, až je materiál zhomogenizován. Homogenizace nemá trvat déle než 30 až 60 sekund, aby se biologický materiál zbytečně nezahříval. Další způsob homogenizace je roztírání materiálu v třecí misce za přídavku písku, skelného prachu nebo jiného abrasiva. Této cesty se nejčastěji využívá při zpracování rostlinných pletiv nebo kvasinek. Homogenizaci lze rovněž provést ve výkonném mixeru. K narušení buněčné stěny a membrány se u mikroorganismů používá ještě některých speciálních metod. Např. působení chemických činidel (detergenty), působení enzymů, které rozkládají buněčnou stěnu (lysozym, celulasa), krátké působení ultrazvuku, opakované zmrazování a rozmrazování ap. EXTRAKCE Při izolaci proteinů nebo jiných biologických makromolekul je třeba tyto látky převést z homogenizovaných tkání do roztoku. Způsob extrakce nebo solubilizace opět závisí na charakteru výchozího materiálu. Eukaryotní buňky pěstované v živném roztoku stačí pouze suspendovat v hypotonickém roztoku, buněčné membrány prasknou a tím se proteiny dostanou z cytoplasmy do roztoku. Proteiny z homogenizovaných živočišných a rostlinných tkání se extrahují 2 – 5 násobným objemem pufru, který by měl mít dostatečně velkou pufrační kapacitu, aby extrakce probíhala při takovém pH, při kterém je izolovaný protein stabilní. Pro většinu proteinů je výhodné pracovat za snížené teploty (4°C), kdy jsou denaturační procesy značně zpomaleny. Nebezpečím pro izolovaný protein mohou být hydrolytické enzymy, především proteasy, které jsou při homogenizaci a extrakci v roztoku rovněž přítomny a mohou velmi ovlivnit úspěšnost izolace. Účinku těchto degradačních enzymů mohou do značné míry zabránit inhibitory proteas, které se přidávají do extrakčního pufru (viz násl. tabulka).

6

2 Izolace proteinu Biochemické praktikum I, katedra biochemie, PřF UK v Praze, 2015/2016 Látka Fenylmethylsulfonylfluorid (PMSF)

Koncentrace 0,1 – 1 mmol/l

Inhibuje serinové proteasy

Aprotinin -aminokapronová kys. Leupeptin Pepstatin A Ethylendiamintetraoctová kys. (EDTA)

0,01 – 0,1 mol/l 2 –5 mmol/l 1 mol/l 1 mol/l 0,5 – 1,5 mmol/l

serinové proteasy serinové proteasy cysteinové proteasy aspartátové proteasy metaloproteasy

Při extrakci proteinů z rostlin je třeba počítat s pevnou buněčnou stěnou rostlinných buněk, která může být rozrušena buď mechanicky (viz kapitola Homogenizace) nebo enzymově celulasami. K inaktivaci proteinů izolovaných z rostlin může vedle výše zmíněných degradačních enzymů vést i množství uvolněných fenolů obsažených v rostlinách. Do extrakčních pufrů se proto přidává polyvinylpolypyrrolidon, který vytváří s fenoly nerozpustné komplexy. Je-li izolovaný protein součástí nějaké subcelulární struktury, např. mitochondrií, je výhodné zbavit se zbytku buňky diferenční centrifugací. Membránové proteiny je třeba izolovat pomocí tenzidů a organických látek rozpouštějících tuky. Při izolaci nukleových kyselin se často využívá extrakce fenolem syceným Tris-HCl pufrem (pH 7,5). Fenol denaturuje proteiny, které precipitují mezi organickou a vodnou fází, ve které jsou přítomny nukleové kyseliny. PRECIPITACE Z vodných roztoků lze bílkoviny vysrážet přídavkem neutrálních solí. Při vysolování jsou bílkovinné molekuly zbavovány solvatačního obalu, protože afinita dipólů vody k iontům soli je vyšší než k bílkovinám. Bílkovinné molekuly zbavené solvatačního obalu se shlukují, až se vysráží z roztoku. Vhodnou koncentrací soli v roztoku lze dosáhnout frakčního vysolení různých druhů bílkovin lišících se právě rozpustností ve vodě. Vysolovací efekt je největší při pH izoelektrického bodu, kdy je výsledný náboj molekuly bílkoviny minimální a rozpustnost malá. Frakcionace směsi bílkovin vysolováním patří mezi nejužívanější techniky dělení těchto směsí. Výhodou metody je, že při ní nedenaturují bílkoviny a že není potřeba žádné speciální laboratorní vybavení. Nejužívanější solí pro tyto účely je síran amonný, ve zvláštních případech se používají ještě síran sodný, chlorid sodný, fosforečnany, síran hořečnatý a citrát sodný. Síran amonný je dobře rozpustný ve vodě a lze tak připravit roztoky o vysoké iontové síle. Sůl je nutné přidávat do roztoků bílkovin buď ve formě nasyceného roztoku, nebo jemně práškovanou, po malých dávkách a za míchání, aby nedocházelo k lokálnímu zvýšení koncentrace soli ve zpracovávaném roztoku. Při práci s enzymy je vhodné celou operaci provádět při teplotě 4°C. Následující tabulka uvádí množství pevného síranu amonného, které je třeba přidat k jednomu litru roztoku, aby se dosáhlo žádané změny v procentech saturace roztoku síranem amonným. Nasycený roztok síranu amonného je při 25°C 4,1 M a připraví se rozpuštěním 767g soli v 1 litru vody.

7

2 Izolace proteinu Biochemické praktikum I, katedra biochemie, PřF UK v Praze, 2015/2016 Výsledná koncentrace síranu amonného (% saturace)

0 10 15

Výchozí koncentrace síranu amonného (%saturace)

20 25 30 33 35 40

10

15

56

84 114 144 176 196 209 243 277 313 351 390 430 472 516 561 610 662 713 767 28

20

25

30

33

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95 100

57

86 118 137 150 183 216 251 288 326 365 406 449 494 540 592 640 694

28

57

88 107 120 153 185 220 256 294 333 373 415 459 506 556 605 657

29

59

78

91 123 155 189 225 262 300 340 382 424 471 520 569 619

30

49

61

93 125 158 193 230 267 307 348 390 436 485 533 583

19

30

62

94 127 162 198 235 273 314 356 401 449 496 546

12

43

74 107 142 177 214 252 292 333 378 426 472 522

31

63

94 129 164 200 238 278 319 364 411 457 506

31

63

97 132 168 205 245 285 328 375 420 469

32

65

99 134 171 210 250 293 339 383 431

33

66 101 137 176 214 256 302 345 392

45 50

33

55

67 103 141 179 220 264 307 353 34

60

69 105 143 183 227 269 314 34

65

70 107 147 190 232 275 35

70

72 111 153 194 237 36

75

74 115 155 198 38

80

77 117 157 39

85

77 118 38

90

77 39

95

CENTRIFUGACE Odstřeďování čili centrifugace bývá často rychlejší a pohodlnější než filtrace a v některých případech vede i k lepšímu oddělení pevné a kapalné fáze při jedné operaci. Slouží k některým speciálním preparativním a analytickým účelům. Je to příprava buněčných struktur gradientovou centrifugací a pomocí analytické ultracentrifugy pak lze stanovit relativní molekulové hmotnosti sloučenin a čistotu izolovaných preparátů. Základní pojmy a technika centrifugace: Při odstřeďování působí na sedimentující částice odstředivá síla (P), kterou lze vyjádřit vztahem: 𝑃 = 𝑚 ∙ 𝑟 ∙ 𝜔2 kde m je hmotnost, r je poloměr otáčení a  je úhlová rychlost. Pro praktické výpočty se používá vzorec: 𝑅 = 1,117 ∙ 𝑟 ∙ 𝑁 2 ∙ 10−5 kde N je počet otáček za minutu a r je poloměr otáčení v cm. Vypočtená hodnota udává relativní odstředivé zrychlení R, které vyjadřuje, kolikrát je toto zrychlení větší než zemské gravitační zrychlení (g = 9,81 m/s2). Je to přesně srovnatelná hodnota pro různé odstředivky s různým poloměrem otáčení a různými otáčkami (obrátkami) za minutu. Je nutno ji uvádět jako hlavní charakteristiku centrifugace. Ze vzorce je zřejmé, že pouhý údaj počtu obrátek za minutu necharakterizuje proces centrifugace. Kyvety odstředivek s výkyvnými rotory, kterých se v základním praktiku nejčastěji užívá, jsou při odstřeďování téměř ve vodorovné poloze. Jak je zřejmé, jsou poloměry otáčení při dané výšce kapaliny různé (minimum u hladiny, maximum u dna). Tím je dána různost relativního odstředivého zrychlení v kyvetě. U centrifug je většinou uváděno maximální

8

2 Izolace proteinu Biochemické praktikum I, katedra biochemie, PřF UK v Praze, 2015/2016 odstředivé zrychlení, tj. při r měřeném od osy otáčení k nejnižšímu místu vnitřní plochy kyvet, tj. ke dnu kyvety. Aby se nemuselo v každém případě vypočítávat relativní odstředivé zrychlení, výrobci často dodávají k odstředivkám diagramy, z nichž se hodnota R snadno odvodí. Běžně se relativní odstředivé zrychlení odečítá také z univerzálního nomogramu (viz obr. na následující stránce). Při provozu odstředivek je nutno z hlediska bezpečnosti práce brát v úvahu sílu, která působí jednak na dno kyvety, jednak na závěsy pouzder s kyvetami. Ke zvýšení odolnosti skleněných kyvet se u nízkootáčkových centrifug vkládají na dno pouzder gumové vložky, čímž se brání deformaci a rozdrcení skla. Zvyšováním otáček a poloměru otáčení se tlak na kyvety a čepy pouzder zvyšuje. Proto je naprosto nutné zatěžovat odstředivku pouze na předepsané hodnoty. Z bezpečnostních důvodů je též rotorový prostor zhotoven z přiměřeně silného pancéřového plechu, aby ho v případě odtržení pouzdra nemohla hmota prorazit. Protilehlé kyvety musejí být staticky a dynamicky vyváženy. Z bezpečnostních důvodů i z hlediska ochrany centrifugy před poškozením je nutné vyvažování protilehlých kyvet věnovat náležitou pozornost. Každá nepřesnost v dynamickém i statickém vyvážení se mnohonásobně projeví zvětšením odstředivého tlaku na jednu stranu osy; osa se nerovnoměrným zatížením snadno ohne, nebo se poškodí ložisko. Při chodu odstředivky se při nepřesném vyvážení projevují silné vibrace. Statického vyvážení protilehlých kyvet se dosáhne tím, že se na technických vahách vyváží protilehlá pouzdra s kyvetami naplněnými suspenzí určenou k centrifugaci. Daleko větší pozornost je třeba věnovat dynamickému vyvážení protilehlých kyvet. Správně vyvážené protilehlé kyvety musejí mít těžiště přesně ve stejné vzdálenosti od osy otáčení. U vysokootáčkových centrifug je tato podmínka zajištěna přesnou výrobou pouzder a kyvet. U všech odstředivek je však nutné, aby protilehlé kyvety měly stejnou hmotnost a rozměry. To platí zvláště o skleněných kyvetách, které mají mít stejně silné a pravidelné stěny. Stejné objemy kapalin musí v protilehlých kyvetách sahat do stejné výšky. Další podmínkou dynamického vyvážení protilehlých kyvet je plnění stejnou suspenzí. Naplní-li se například protilehlé kyvety suspenzí stejné hmotnosti, ale různé hustoty, bude těžiště protilehlých kyvet v různé vzdálenosti od osy otáčení a opět nebude docíleno dynamického vyvážení. Daleko jednodušší práce je s kyvetami z umělých hmot, které mají tenčí, pravidelné stěny a relativně malou hmotnost. U nich zpravidla postačí provést statické vyvážení. Přes veškerou péči věnovanou dynamickému vyvážení může centrifuga při odstřeďování mírně vibrovat, zvláště při tzv. kritických otáčkách. Při těchto otáčkách doba kmitu rotoru odpovídá počtu otáček a tím se vibrace zesilují. Odstředivka se nemá nikdy nechat běžet v kritických otáčkách, při jejich dosaženi se musí otáčky snížit nebo zvýšit. V průběhu rozbíhání centrifugy se mohou vibrace objevit i několikrát. U odstředivek s úhlovým rotorem jsou odstraněny hlavní nedostatky předchozího typu, tj. tření kyvet o vzduch a dlouhá sedimentační dráha částice. Kyvety jsou zasunuty do přesně vyvrtaných otvorů v rotoru tak, že celým vnějším povrchem těsně přiléhají ke stěnám otvorů. Kyvety jsou z umělých hmot, nejčastěji ze silnostěnného polyethylenu. Úhel 45 až 50°, pod kterým jsou kyvety v rotoru uloženy, se během odstřeďování nemění. Oba typy odstředivek mohou být vybaveny chlazením. U odstředivek s výkyvnými rotory slouží chlazení především k tomu, aby pohlcovalo teplo vzniklé třením o vzduch. Chlazené odstředivky (úhlové vysokootáčkové) mají dobře tepelně izolovaný kryt, na jehož vnitřní straně je umístěno chladicí zařízení napájené ze silného chladicího agregátu. Dovolují provádět i delší odstřeďování při teplotě až -15°C.

9

2 Izolace proteinu Biochemické praktikum I, katedra biochemie, PřF UK v Praze, 2015/2016

Nomogram pro přepočet počtu otáček a odstředivého zrychlení

Odstředivky patří v biochemické laboratoři k nejvíce namáhaným přístrojům. Je proto nutné dbát nejen na jejich údržbu, ale především zachovávat některá základní pravidla, jejichž nedodržení může vést k poškození centrifugy a ohrožení okolí.

10

2 Izolace proteinu Biochemické praktikum I, katedra biochemie, PřF UK v Praze, 2015/2016 Postup při práci s centrifugou: 1. Kyvety se seřadí do párů (protilehlé kyvety) podle všech požadavků dynamického a statického vyvažování protilehlých kyvet. 2. Protilehlé kyvety se naplní suspenzí určenou k centrifugaci a vyváží se podle pravidel správného statického a dynamického vyvažování protilehlých kyvet. Pokud se kyvety do rotoru vkládají v pouzdrech, je třeba provést vyvážení s pouzdry. 3. Pouzdra a kyvetami se uloží na odpovídajících místech rotoru tak, aby dokonale seděla v čepech. Centrifuga se uzavře víkem. 4. Před spuštěním centrifugy se posluchači seznámí s instrukcemi danými výrobcem pro konkrétní centrifugu nebo požádají o instruktáž asistenta. V každém případě je nutno dbát, aby se reostat rychlosti otáček posunoval až do potřebných otáček pozvolna a aby se centrifuga nepřetěžovala nad povolenou rychlost. Při jakékoliv poruše se musí centrifuga ihned vypnout. 5. Víko centrifugy se otevře teprve po úplném zastavení rotoru. 6. Po skončené centrifugaci se kyvety dokonale vymyjí a centrifuga se uvede do bezvadného stavu. Chlazené centrifugy se po vypnutí chlazení nechají otevřené, aby vnitřní prostor dobře vyschnul. ODSTRANĚNÍ SOLÍ A DALŠÍCH NÍZKOMOLEKULÁRNÍCH LÁTEK V biochemické praxi je velmi často třeba separovat látky na základě různé velikosti jejich molekul. Lze volit mezi centrifugací, ultrafiltrací, gelovou filtrací a dialýzou, která je nejjednodušší. Dialýza využívá difúze nízkomolekulárních látek polopropustnou membránou z roztoku o vyšší koncentraci do roztoku o koncentraci nižší. Pro velké molekuly a částice je nepropustná. Molekuly bílkovin, jejichž částice mají rozměry od několika nanometrů do 200 nm, mají v roztoku některé vlastnosti koloidů, tj. jejich částice neprocházejí pro svou velikost otvory dialyzačních membrán. Dialýza umožňuje v biochemii např. snadné oddělení soli od roztoku bílkovin (při vysolování bílkovin síranem amonným), uplatňuje se při krystalizaci bílkovin. Nejčastěji se užívá tam, kde chceme vysokomolekulární látky zbavit nízkomolekulárních nečistot, na nichž nám nezáleží. Dříve se používalo k přípravě membrán kolodium, celofán, pergamen anebo i membrány zvířecího původu (střeva, vaječná blanka, různé měchýře). Nyní jsou komerčně dostupné umělé membrány s vhodnou velikostí pórů ve tvaru dlouhé trubice různého průměru. Postup: Potřebný díl dialyzační trubice se odstřihne a ponoří na několik minut do dialyzačního roztoku. Poté se jeden konec uzavře dialyzační svorkou, nebo pevně zaváže. Po naplnění preparátem určeným k dialýze se uzavře i druhý konec trubice a vloží se do 5 nebo 10 litrové nádoby naplněné vodou tak, že oba zavázané konce dialyzační trubice vyčnívají z vody ven. Vždy se snažíme, aby dialýza byla co nejrychlejší. Rychlost dialýzy závisí na koncentračním spádu (zpočátku je nejrychlejší, postupně se zpomaluje), na počtu a velikosti pórů v membráně, na síle membrány, dále též na elektrických, vztazích mezi membránou a difundujícími částicemi, na velikosti plochy membrány a objemu roztoku, na teplotě. Míchání a výměna kapaliny velmi zrychlují postup dialýzy. Aby se zabránilo denaturaci bílkovin a množení mikroorganismů, dialyzuje se při teplotě 0 až 4°C.

11

2 Izolace proteinu Biochemické praktikum I, katedra biochemie, PřF UK v Praze, 2015/2016

2.1.

Izolace laktátdehydrogenasy ze srdečního svalu

Pro izolaci proteinu je třeba zvolit vhodný výchozí materiál, který je dostupný a ve kterém se zvolený protein vyskytuje v dostatečném množství. V počátečních fázích izolačních procesů biopolymerů se většinou používají metody fázové separace, jako jsou precipitace, dialýza či vsádková absorpce, které sice nemají velké rozlišení, avšak umožňují snadné a rychlé koncentrování preparátu pro další selektivnější separační metody. Srážení se provádí buď vysolením pomocí neutrálních solí jako v této úloze, nebo změnou pH, organickými rozpouštědly, či teplotou. Precipitovatelnost určitého proteinu z vodného roztoku je závislá na druhu použité soli, iontové síle, hodnotě pH, teplotě a koncentraci proteinů. Nejčastěji používanou solí pro vysolování biopolymerů je síran amonný. Jeho výhodou je značná rozpustnost, která je jen nepatrně závislá na teplotě, a malý denaturační vliv. Optimální koncentrační rozsah pro frakcionaci daného je nutno najít empiricky. Po přidání takového množství síranu amonného, který odpovídá 30% množství potřebného ke vzniku nasyceného roztoku této soli (v praxi označováno jako 30% nasycení), se srážejí nukleové kyseliny a poměrně málo proteinů. Mezi 30 a 75% nasycení pak precipituje většina proteinů. Precipitát se oddělí centrifugací, a pokud je isolovaný protein obsažen v precipitátu, lze po rozpuštění sraženiny získat jeho poměrně koncentrovaný roztok. Síran amonný se z roztoku oddělí dialýzou nebo gelovou chromatografií. Laktátdehydrogenasa (L-laktát : NAD+ - oxidoreduktasa E.C. 1.1.1.27, zkratka LDH) katalyzuje reverzibilní reakci

Enzym lze extrahovat ze srdečního, popř. kosterního svalu fosfátovým pufrem a částečně přečistit frakcionací síranem amonným. Katalytická aktivita LDH je úměrná množství pyruvátu, vzniklého za časovou jednotku za standardních podmínek. Vzniklý pyruvát reaguje s 2,4-dinitrofenylhydrazinem za vzniku barevného hydrazonu, který lze stanovit spektrofotometricky. Cíle 1. Připravit síranovou frakci laktátdehydrogenasy z hovězího srdečního svalu. 2. V připraveném enzymovém preparátu stanovit aktivitu laktátdehydrogenasy a specifickou aktivitu. Chemikálie 0,2 M Na2HPO4 0,2 M NaH2PO4 0,1 M fosfátový pufr (pH 7,0), připravte sami ze zásobních roztoků: 39 ml 0,2M NaH2PO4 a 61 ml 0,2 M Na2HPO4, upravte na 0,1 M koncentraci. 0,1 M Tris-HCl (pH 9,0) síran amonný 0,9 M laktát sodný 0,3 mM pyruvát sodný 3 mM NAD+ 0,4 M NaOH 0,1 g 2,4-dinitrofenylhydrazinu ve 100 ml 2 M HCl 12

2 Izolace proteinu Biochemické praktikum I, katedra biochemie, PřF UK v Praze, 2015/2016 činidla na stanovení bílkovin podle Lowryho činidlo na stanovení proteinů podle Bradforda Pracovní postup Příprava hrubého extraktu LDH: 30 g hovězího srdce (již zbaveného tuku) nakrájejte na menší kousky a homogenizujte v mixéru se 100 ml 0,1 M fosfátového pufru (pH 7,0). Homogenát nechte 20 minut za občasného míchání extrahovat a pak centrifugujte 20 min. při 4 000 RPM a 4 °C. Získaný supernatant se označuje jako hrubý extrakt. Odpadní sediment likvidujte podle pokynů. Precipitace síranem amonným a dialýza: LDH je přítomna ve frakci, která se sráží při 35 - 60% nasycení síranem amonným. K hrubému extraktu po částech za stálého míchání přidejte pevný síran amonný do 35% nasycení (viz tabulka). Za občasného míchání nechte suspenzi 15 minut stát a poté centrifugujte 15 minut při 4 000 RPM a 4°C. Supernatant znovu srážejte pevným síranem amonným do 60% nasycení za stejných podmínek jako při prvním srážení. Sediment resuspendujte maximálně v 5 ml destilované vody. Tak získáte finální enzymový preparát, ve kterém stanovíte specifickou aktivitu. Preparát lze zbavit síranu amonného dialýzou přes noc proti destilované vodě při 4°C. Po skončené dialýze se případný precipitát odstraní centrifugací. Po odsolení následuje lyofilizace: roztok bílkoviny se namrazí v tenké vrstvě na stěnu destilační baňky otáčením ve směsi pevného CO2 a ethanolu. Takto připravená baňka se nasadí na lyofilizační přístroj. (Pozn.: dialýza i lyofilizace již nejsou součástí úlohy, ale vzorek odevzdejte, po dialýze bude sloužit jako jeden ze vzorků pro SDS elektroforézu). Výsledná koncentrace síranu amonného (% saturace)

0 10 15

Výchozí koncentrace síranu amonného (%saturace)

20 25 30 33 35 40

10

15

56

84 114 144 176 196 209 243 277 313 351 390 430 472 516 561 610 662 713 767 28

20

25

30

33

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95 100

57

86 118 137 150 183 216 251 288 326 365 406 449 494 540 592 640 694

28

57

88 107 120 153 185 220 256 294 333 373 415 459 506 556 605 657

29

59

78

91 123 155 189 225 262 300 340 382 424 471 520 569 619

30

49

61

93 125 158 193 230 267 307 348 390 436 485 533 583

19

30

62

94 127 162 198 235 273 314 356 401 449 496 546

12

43

74 107 142 177 214 252 292 333 378 426 472 522

31

63

94 129 164 200 238 278 319 364 411 457 506

31

63

97 132 168 205 245 285 328 375 420 469

32

65

99 134 171 210 250 293 339 383 431

33

66 101 137 176 214 256 302 345 392

45 50

33

55

67 103 141 179 220 264 307 353 34

60

69 105 143 183 227 269 314 34

65

70 107 147 190 232 275 35

70

72 111 153 194 237 36

75

74 115 155 198 38

80

77 117 157 39

85

77 118 38

90

77 39

95

Příprava vzorku pro stanovení aktivity LDH: Stanovení aktivity proveďte pro finální preparát LDH. Z připravené síranové frakce odeberte aliquot, (100l suspenze a přidejte 900 μl destilované vody, tj. 10x ředěný enzymový preparát), který je třeba pro stanovení enzymové 13

2 Izolace proteinu Biochemické praktikum I, katedra biochemie, PřF UK v Praze, 2015/2016 aktivity a množství bílkovin dále ředit (doporučeno výsledné ředění 100 – 1000x). Rozdíl v absorbanci mezi vzorkem a slepým pokusem by měl být v intervalu 0,05 - 0,3. Stanovení aktivity LDH: Pro každé ředění enzymového preparátu je třeba připravit dvě zkumavky označené vzorek a slepý pokus. Pipetujte roztoky v následujícím pořadí: Roztok Laktát NAD+ Tris-HCl pufr (pH 9,0)

Vzorek 0,1 ml 0,15 ml 0,1 ml

Slepý pokus 0,1 ml 0,15 ml 0,1 ml Vytemperuje se 5 minut na 37 °C. zředěný roztok LDH 0,1 ml --Inkubuje se 15 minut při 37 °C. 2,4-dinitrofenylhydrazin 0,25 ml 0,25 ml zředěný roztok LDH --0,1 ml Nechá se stát při pokojové teplotě 20 minut. NaOH 2,5 ml 2,5 ml Po dalších 20 minutách stání se měří absorbance vzorku proti slepému pokusu na spektrofotometru při vlnové délce 505 nm. Kalibrace množství pyruvátu v reakční směsi: Do pěti 0,3 mM roztok pyruvátu podle následujícího schématu:

zkumavek

pipetujte

nejprve

Zkumavka 1 2 3 4 5 ml pyruvátu 0 0,10 0,20 0,30 0,40 ml vody 0,45 0,35 0,25 0,15 0,05 Do každé zkumavky pak přidejte 0,25 ml roztoku dinitrofenylhydrazinu, promíchejte a nechte stát 20 minut. Pak přidejte 2,5 ml roztoku hydroxidu sodného a po 20 minutách změřte absorbance proti slepému vzorku při 505 nm. Ze získaných hodnot sestavte kalibrační graf závislosti absorbance barevného komplexu na množství pyruvátu. Stanovení množství proteinů v enzymovém preparátu: Postupujte podle příslušných kapitol a stanovte koncentraci proteinů ve svém preparátu metodami podle Lowryho (použijte kalibrační hodnoty z dřívější úlohy) a podle Bradforda. Vyhodnocení výsledků 1. Sestrojte kalibrační graf závislosti absorbance při 505 nm na látkovém množství pyruvátu vyjádřeném v µmol. Pomocí tohoto kalibračního grafu zjistěte aktivitu LDH ve výsledné síranové frakci (v mikromolech vzniklého pyruvátu za 1 minutu na 1 ml enzymového preparátu). 𝜇𝑚𝑜𝑙 pyruvátu 𝑎= ∙ 10 ∙ ř𝑒𝑑ě𝑛í [μmol ∙ min−1 ∙ ml−1 ] 𝑡 t je čas, po který reagoval enzym se substrátem, 10× se násobí vzhledem k tomu, že v reakci je pouze 100 l. 2. Aktivitu LDH vyjádřete i jako specifickou aktivitu vztaženou na množství bílkovin. 3. Vyplňte následující tabulku, která charakterizuje váš enzymový preparát V [ml] aktivita LDH množství bílkovin spec. aktivita LDH [μmol·min-1·ml-1] [mg/ml] [μmol·min-1·mg-1] síranová frakce LDH 14

2 Izolace proteinu Biochemické praktikum I, katedra biochemie, PřF UK v Praze, 2015/2016 Kontrolní otázky: 1. Napište rovnici reakce pyruvátu s 2,4-dinitrofenylhydrazinem. 2. Vysvětlete význam laktátdehydrogenasové reakce v metabolismu aerobních a anaerobních organismů. 3. Jaký je princip frakcionace bílkovin? 4. Jaké metody jsou vhodné pro odsolení enzymových preparátů a jaký je jejich princip? 5. Které další metody byste použili k získání zcela homogenního enzymového preparátu obsahujícího pouze LDH? 6. Jak byste se přesvědčili o homogenitě vámi získaného preparátu?

15

2 Izolace proteinu Biochemické praktikum I, katedra biochemie, PřF UK v Praze, 2015/2016

2.2.

Izolace rostlinné alkoholdehydrogenasy

Pro izolaci proteinu je třeba zvolit vhodný výchozí materiál, který je dostupný a ve kterém se zvolený protein vyskytuje v dostatečném množství. V počátečních fázích izolačních procesů biopolymerů se většinou používají metody fázové separace, jako jsou precipitace, dialýza či vsádková absorpce, které sice nemají velké rozlišení, avšak umožňují snadné a rychlé koncentrování preparátu pro další selektivnější separační metody. Srážení se provádí buď vysolením pomocí neutrálních solí jako v této úloze, nebo změnou pH, organickými rozpouštědly, či teplotou. Precipitovatelnost určitého proteinu z vodného roztoku je závislá na druhu použité soli, iontové síle, hodnotě pH, teplotě a koncentraci proteinů. Nejčastěji používanou solí pro vysolování biopolymerů je síran amonný. Jeho výhodou je značná rozpustnost, která je jen nepatrně závislá na teplotě, a malý denaturační vliv. Optimální koncentrační rozsah pro frakcionaci daného je nutno najít empiricky. Po přidání takového množství síranu amonného, který odpovídá 30% množství potřebného ke vzniku nasyceného roztoku této soli (v praxi označováno jako 30% nasycení), se srážejí nukleové kyseliny a poměrně málo proteinů. Mezi 30 a 75% nasycení pak precipituje většina proteinů. Precipitát se oddělí centrifugací, a pokud je isolovaný protein obsažen v precipitátu, lze po rozpuštění sraženiny získat jeho poměrně koncentrovaný roztok. Síran amonný se z roztoku oddělí většinou dialýzou nebo gelovou chromatografií. Alkoholdehydrogenasa (alkohol : NAD+ - oxidoreduktasa, E.C. 1.1.1.1, zkratka ADH) katalyzuje reverzibilní oxidaci ethanolu, popřípadě vyšších alkoholů:

Redukovaná forma koenzymu, narozdíl od neredukované formy, má absorpční maximum při 340 nm. Toho se využívá při stanovení aktivity ADH; sleduje se tedy změna absorbance reakční směsi za určitou dobu. ADH lze extrahovat z klíčících semen hrachu fosfátovým pufrem a dále frakcionovat srážením síranem amonným, popřípadě chromatografií na DEAE-celulose. Cíle 1. Připravit síranovou frakci alkoholdehydrogenasy ze semen hrachu. 2. V připraveném enzymovém preparátu stanovit aktivitu alkoholdehydrogenasy a specifickou aktivitu, vztaženou na množství proteinu. 3. Sumarizovat výsledek izolace zjednodušenou izolační tabulkou. Chemikálie 0,1 M fosfátový pufr (pH 8,5) obsahující 5 mM merkaptoethanol 0,1 M Tris 2 M kyselina octová 0,5 M merkaptoethanol 20 mM Tris-acetátový pufr (pH 6,5) obsahující 5 mM merkaptoethanol, připravte sami 1 litr ze zásobních roztoků. síran amonný 10 mM NAD+ 1 M ethanol 16

2 Izolace proteinu Biochemické praktikum I, katedra biochemie, PřF UK v Praze, 2015/2016 0,1 M fosfátový pufr (pH 8,5) činidla na stanovení bílkovin podle Lowryho činidlo na stanovení bílkovin podle Bradforda Pracovní postup Příprava hrubého extraktu: Tři dny naklíčená semena hrachu (20 g suchých) homogenizujte v mixéru se 100 ml vychlazeného extrakčního pufru (0,1 M fosfátový pufr pH 8,5 obsahující 5 mM merkaptoethanol). Získaný homogenát přefiltrujte přes 3 vrstvy gázy a centrifugujte 15 minut při 4000 RPM při teplotě 4 °C. Takto získaný supernatant se označuje jako hrubý extrakt. Příprava síranové frakce: Dalším purifikačním krokem je frakcionační srážení síranem amonným. K hrubému extraktu přidávejte po částech za stálého míchání pevný síran amonný do 35% nasycení roztoku (viz tabulka). Po 15 minutách stání směs centrifugujte 15 minut při 4000 RPM při 4°C. Supernatant opatrně slijte a syťte dále síranem amonným do 60% nasycení. Po 15 minutách stání směs opět odstřeďte za stejných podmínek. Supernatant slijte a dále pracujte se sedimentem, ve kterém je přítomna alkoholdehydrogenasa. Sediment resuspendujte v 5 ml 20 mM Tris-acetátového pufru (pH 6,5) obsahujícího 5 mM merkaptoethanol. Tak získáte finální enzymový preparát, ve kterém stanovíte specifickou aktivitu. Preparát lze zbavit síranu amonného dialýzou přes noc proti stejného pufru, v jakém byl sediment rozpuštěn při 4°C. Po skončené dialýze se případný precipitát odstraní centrifugací. (Pozn.: dialýza již není součástí úlohy, ale vzorek odevzdejte, po dialýze bude sloužit jako jeden ze vzorků pro SDS elektroforézu). Výsledná koncentrace síranu amonného (% saturace)

0 10 15

Výchozí koncentrace síranu amonného (%saturace)

20 25 30 33 35 40

10

15

56

84 114 144 176 196 209 243 277 313 351 390 430 472 516 561 610 662 713 767 28

20

25

30

33

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95 100

57

86 118 137 150 183 216 251 288 326 365 406 449 494 540 592 640 694

28

57

88 107 120 153 185 220 256 294 333 373 415 459 506 556 605 657

29

59

78

91 123 155 189 225 262 300 340 382 424 471 520 569 619

30

49

61

93 125 158 193 230 267 307 348 390 436 485 533 583

19

30

62

94 127 162 198 235 273 314 356 401 449 496 546

12

43

74 107 142 177 214 252 292 333 378 426 472 522

31

63

94 129 164 200 238 278 319 364 411 457 506

31

63

97 132 168 205 245 285 328 375 420 469

32

65

99 134 171 210 250 293 339 383 431

33

66 101 137 176 214 256 302 345 392

45 50

33

55

67 103 141 179 220 264 307 353 34

60

69 105 143 183 227 269 314 34

65

70 107 147 190 232 275 35

70

72 111 153 194 237 36

75

74 115 155 198 38

80

77 117 157 39

85

77 118 38

90

77 39

95

17

2 Izolace proteinu Biochemické praktikum I, katedra biochemie, PřF UK v Praze, 2015/2016 Stanovení aktivity ADH: Přímo do spektrofotometrické kyvety pipetujte tyto roztoky: 0,3 ml 0,1 M fosfátového pufru (pH 8,5), 0,1 ml 10 mM NAD+, 0,2 ml 1 M ethanolu, 1,8 ml destilované vody. Enzymovou reakci startujte přidáním 0,1 ml roztoku enzymového preparátu, promíchejte a ihned měřte absorbanci při 340 nm. Absorbanci měřte po dobu 2 minut a její hodnotu odečítejte v patnáctisekundových intervalech. Jestliže přírůstek absorbance není konstantní, musíte enzymový preparát zředit. Aktivitu enzymu (a) (vztaženou na 1 ml enzymového preparátu) vypočítáme podle vzorce 𝑎 = 1000 ∙

∆𝐴340 ∙ 𝑉𝑡 𝜀 ∙ 𝑙 ∙ 𝑉𝑒 ∙ 𝑡

[μmol ∙ min−1 ∙ ml−1 ]

kde Vt je celkový (total) objem reakční směsi v kyvetě (ml), Ve objem enzymového preparátu v kyvetě (ml), t čas (min.), A340 změna absorbance), ke které došlo za čas t a  molární absorpční koeficient NADH = 6 300 mol-1·l·cm-1. Stanovení množství proteinů v enzymovém preparátu: Postupujte podle příslušných kapitol a stanovte koncentraci proteinů ve svém preparátu metodami podle Lowryho (použijte kalibrační hodnoty z dřívější úlohy) a podle Bradforda. Vyhodnocení výsledků 1. Spočítejte aktivitu ADH ve výsledné síranové frakci (v mikromolech vzniklého NADH za 1 minutu na 1 ml enzymového preparátu). 2. Aktivitu ADH vyjádřete rovněž jako specifickou aktivitu vztaženou na množství bílkovin. 3. Sestrojte zjednodušenou izolační tabulku dokumentující průběh izolace V [ml] aktivita ADH množství bílkovin spec. aktivita ADH -1 -1 [μmol·min ·ml ] [mg/ml] [μmol·min-1·mg-1] síranová frakce ADH Kontrolní otázky: 1. Proč se provádí dialýza při pH 6,5, zatímco měření aktivity při pH 8,5?

18

3 Separace látek pomocí gelové chromatografie Biochemické praktikum I, katedra biochemie, PřF UK v Praze, 2015/2016

3. SEPARACE LÁTEK POMOCÍ GELOVÉ CHROMATOGRAFIE Gelová chromatografie je metoda umožňující dělení látek na základě rozdílu ve velikosti a tvaru jejich molekul. Při gelové chromatografii jde v podstatě o distribuci látek obsažených v roztoku mezi rozpouštědlo vně částic gelu a rozpouštědlo uvnitř těchto částic. Látky, jejichž molekuly převyšují svou velikostí velikost pórů gelu, procházejí prostorem mezi částicemi gelu a jsou eluovány nejrychleji. Nízkomolekulární látky vnikají do částic gelu, a tím je jejich rychlost při průchodu snížena. Gelová chromatografie se používá jednak pro účely preparativní (jako například pro frakcionaci látek, oddělení malých molekul od velkých – odsolování), a jednak pro účely analytické (například určení relativní molekulové hmotnosti, určení heterogenity vzorku, studium interakce makromolekulárních látek s ligandem). Dnešní gelově filtrační média pokrývají oblast relativních molekulových hmotností od stovek až ke stovkám milionů, je tedy možné dělit látky od těch nejmenších biomolekul až po obrovské proteinové komplexy. Každé gelově filtrační médium má charakteristickou distribuci velikostí pórů, ze které vyplývá charakteristický rozsah separovaných molekulových hmotností. Tento rozsah lze zjistit v přibalených informačních materiálech. Eluční objem látky, přesněji řečeno distribuční koeficient, je v tomto rozsahu lineárně závislý (platí přibližně v rozsahu Kav=0,1-0,7) na dekadickém logaritmu Mr. Pokud zjistíme eluční objem několika látek s relativní molekulovou hmotností v tomto rozsahu, jsme schopni sestavit přímku, ze které následně můžeme odečíst molekulovou hmotnost neznámé látky podle jejího elučního objemu. Dalším důležitým parametrem je tzv. vylučovací limit, což je Mr molekul tak velkých, že nejsou schopny proniknutí do pórů nosiče. Všechny látky s touto a větší molekulovou hmotností putují kolonou největší možnou rychlostí a tvoří tzv. čelo chromatografie. Kromě správné volby typu média, která je pro úspěšnou gelovou filtraci klíčová, jsou dalšími důležitými parametry objem nanášeného vzorku a rozměry kolony. Oba tyto faktory značně ovlivňují

19

3 Separace látek pomocí gelové chromatografie Biochemické praktikum I, katedra biochemie, PřF UK v Praze, 2015/2016 výsledné rozlišení a tedy kvalitu separace látek. Objem nanášeného vzorku by neměl být větší, než přibližně 1% objemu kolony

Více viz výuková videa: http://www.natur.cuni.cz/chemie/biochem/ke-stazeni/biochemicke-praktikum

20

3 Separace látek pomocí gelové chromatografie Biochemické praktikum I, katedra biochemie, PřF UK v Praze, 2015/2016

3.1.

Gelová chromatografie – Separace látek

Úkolem této úlohy je rozdělit směs látek na makromolekulární frakci a nízkomolekulární frakci. Makromolekulární frakci představuje bílkovina, nízkomolekulární pak barevná sůl. Cíle 1. Separovat vysokomolekulární (proteinovou) složku vzorku od nízkomolekulární pomocí gelové chromatografie. 2. Porovnat množství bílkovin aplikovaných na kolonu s množstvím eluovaným po chromatografii. Chemikálie Nosič: Sephadex G-100 Mobilní fáze: 0,15 M NaCl Směs 2 mg proteinu a 2 mg nízkomolekulární látky v 0,2 ml 0,15 M NaCl Činidla pro stanovení množství bílkovin podle Lowryho Pracovní postup Příprava chromatografické kolony: Sloupec Sephadexu G-100, který je k dispozici, je připraven k aplikaci vzorku. Výtokovou hadičku umístěte do kádinky a nechte vsáknout přebytečnou kapalinu nad gelem tak, aby její hladina právě dosáhla povrchu gelu (nad gelem nesmí zůstat vrstvička kapaliny), ale zároveň nesmí dojít k dalšímu vysychání gelu, tzv. „podtečení sloupce“. Aplikace vzorku a spuštění chromatografie: Na povrch gelu sloupce Sephadexu G-100 aplikujte opatrně automatickou pipetou vzorek tak, aby co nejméně porušil povrch gelu. Dbejte pokynů asistenta. Po vsáknutí vzorku do gelu zvedněte hadičku nahoru a opatrně na povrch gelu napipetujte vrstvu elučního roztoku. Na sloupec nasaďte chromatografickou hlavu se zábrusem. Tato chromatografická hlava je spojena hadičkou s rezervoárem s elučním roztokem. Další objem kapaliny bude protékat do kolony podtlakem přes chromatografickou hlavu z rezervoáru (Erlenmayerova baňka), který je umístěn tak, aby výškový rozdíl mezi hladinou roztoku a ústím hadičky nebyl větší než 30 cm. Výtokovou hadičku umístěte do 1. zkumavky sběrače frakcí a od této chvíle jímejte veškerou kapalinu vytékající ze sloupce. Průběh chromatografie a zpracování rozdělených frakcí: Kapalinu vytékající z chromatografické kolony jímejte do připravených zkumavek v automatickém sběrači. Pomocí kalibrovaných zkumavek si nastavte čas na sběrači tak, aby v každé zkumavce byly přibližně 2 ml. Jímání frakcí ukončete, když je z kolony eluována zóna barevné soli. Změřte absorbanci jednotlivých frakcí postupně při vhodných vlnových délkách. Pro proteiny obecně se nejčastěji používá 280 nm, kdy absorbují aromatické postranní řetězce aminokyselin. Pro barevné proteiny můžete s výhodou využít i charakteristickou vlnovou délku ve viditelném spektru, např. 600 nm pro fykocyanin. Barevnou nízkomolekulární látku stanovte při charakteristické vlnové délce z viditelné oblasti spektra (např. 440 nm pro dvojchroman draselný). Zaznamenejte si i objem každé zkumavky. Stanovení množství proteinu podle Lowryho: Postupujte podle příslušné kapitoly a stanovte koncentraci proteinů v relevantních frakcích metodou podle Lowryho.

21

3 Separace látek pomocí gelové chromatografie Biochemické praktikum I, katedra biochemie, PřF UK v Praze, 2015/2016 Vyhodnocení výsledků 1. Sestrojte eluční graf, ve kterém vynesete hodnoty absorbancí proti příslušnému elučnímu objemu V (tj. např. dvě křivky pro dvě vlnové délky). Do grafu zaznamenáme rovněž koncentraci bílkovin zjištěné podle Lowryho (další křivka). 2. Z grafu určete eluční objem Ve separovaných látek (tzn. celkový objem kapaliny, který prošel kolonou, než bylo dosaženo maxima příslušné látky). 3. Spočítejte množství bílkoviny, které prošlo kolonou (z výsledků stanovení) a porovnejte s množstvím aplikovaným na kolonu. Určete ztráty proteinu během chromatografie. Poznámka: Kalibrační graf pro stanovení množství bílkovin budete potřebovat i pro další úlohy.

22

3 Separace látek pomocí gelové chromatografie Biochemické praktikum I, katedra biochemie, PřF UK v Praze, 2015/2016

3.2.

Určení distribučního koeficientu pro cytochrom c

Gelová chromatografie je metoda umožňující dělení látek na základě rozdílu ve velikosti a tvaru jejich molekul. Při gelové chromatografii jde v podstatě o distribuci látek obsažených v roztoku mezi rozpouštědlo vně částic gelu a rozpouštědlo uvnitř těchto částic. Látky, jejichž molekuly převyšují svou velikostí velikost pórů gelu, procházejí prostorem mezi částicemi gelu a jsou eluovány nejrychleji. Nízkomolekulární látky vnikají do částic gelu, a tím je jejich rychlost při průchodu snížena. Látky, jejichž molekulová hmotnost leží mezi oběma uvedenými extrémy, jsou eluovány ze sloupce v objemu Ve, který je větší než eluční objem látek, které do gelu nepronikají (V0), a na druhé straně je menší než objem nízkomolekulárních látek (přibližně Vt). Gelová chromatografie je tedy chromatografií rozdělovací, a proto je možné tento proces popsat základní rovnicí rozdělovací chromatografie 𝑉𝑒 = 𝑉0 + 𝐾𝑑 ∙ 𝑉𝑖 kde Kd je distribuční koeficient, Ve eluční objem dané látky, V0 objem mobilní fáze obklopující částice gelu (tzv. mrtvý objem), odpovídající elučnímu objemu látek nepronikajících do gelu, Vi objem mobilní fáze uvnitř gelu, Vt celkový objem sloupce, přibližně odpovídající elučnímu objemu nízkomolekulárních látek.

Vzhledem k tomu, že je experimentálně obtížné stanovit Vi, používá se v praxi místo Kd koeficient Kav: 𝐾𝑎𝑣 =

𝑉𝑒 − 𝑉0 𝑉𝑡 − 𝑉0

Pro daný typ chromatografického média (gelu) je Kd / Kav konstanta. Gelová chromatografie se používá jednak pro účely preparativní (jako například frakcionaci látek, oddělení malých molekul od velkých - odsolování, zahušťování), a jednak pro účely analytické (například určení relativní molekulové hmotnosti, určení heterogenity vzorku, studium interakce makromolekulárních látek s ligandem). 23

3 Separace látek pomocí gelové chromatografie Biochemické praktikum I, katedra biochemie, PřF UK v Praze, 2015/2016 Pro dvojici proteinu a daného chromatografického materiálu (Sephadex G 100) můžeme stanovit jeho distribuční koeficient. Tento koeficient reprezentuje podíl pórů částic gelu dostupných pro tento protein. Hodnota distribučního koeficientu charakterizuje chování dané látky na sloupci určitého gelu a je nezávislá na experimentálních podmínkách. V našem praktiku zjišťujeme distribuční koeficient pro cytochrom c. Hodnotu V0 , tak zvaný mrtvý objem kolony, tedy objem roztoku vně částic gelu, stanovíme pomocí látky Blue Dextran. Molekulová hmotnost této látky je dostatečně velká, na koloně se nezadržuje. Vt, neboli celkový objem sloupce, odpovídá elučnímu objemu nízkomolekulární látky, v našem případě dvojchromanu draselnému. Ve je eluční objem bílkoviny, tedy cytochromu c. Cíle 1. Určit distribuční koeficient pro cytochrom c na koloně Sephadex G-100 2. Porovnat množství cytochromu c aplikovaného na kolonu s množstvím eluovaným po chromatografii Chemikálie Nosič: Sephadex G-100 Mobilní fáze: 0,15 M NaCl Směs: 2 mg Blue Dextran, 2 mg cytochrom c a 2 mg dvojchroman draselný v 0,1 ml 0,15 M NaCl Činidla pro stanovení množství bílkovin podle Lowryho Pracovní postup Příprava chromatografické kolony: Sloupec Sephadexu G-100, který je k dispozici, je připraven k aplikaci vzorku. Výtokovou hadičku umístěte do kádinky (pozor na tlak na sloupec) a nechte vsáknout přebytečnou kapalinu nad gelem tak, aby její hladina právě dosáhla povrchu gelu (nad gelem nesmí zůstat vrstvička kapaliny), ale zároveň nesmí dojít k dalšímu vysychání gelu, tzv. „podtečení sloupce“. Aplikace vzorku a spuštění chromatografie: Na povrch gelu sloupce Sephadexu G-100 aplikujte opatrně automatickou pipetou vzorek tak, aby co nejméně porušil povrch gelu. Dbejte pokynů asistenta. Po vsáknutí vzorku do gelu zvedněte hadičku nahoru a opatrně na povrch gelu napipetujte vrstvu elučního roztoku. Na sloupec nasaďte chromatografickou hlavu se zábrusem. Tato chromatografická hlava je spojena hadičkou s rezervoárem s elučním roztokem. Další objem kapaliny bude protékat do kolony podtlakem přes chromatografickou hlavu z rezervoáru (Erlenmayerova baňka), který je umístěn tak, aby výškový rozdíl mezi hladinou roztoku a ústím hadičky nebyl větší než 30 cm. Výtokovou hadičku umístěte do 1. zkumavky sběrače frakcí a od této chvíle jímejte veškerou kapalinu vytékající ze sloupce. Průběh chromatografie a zpracování rozdělených frakcí: Kapalinu vytékající z chromatografické kolony jímejte do připravených zkumavek v automatickém sběrači. Pomocí kalibrovaných zkumavek si nastavte čas na sběrači tak, aby v každé zkumavce byly přibližně 2 ml. Jímání frakcí ukončete, když je z kolony eluována zóna dvojchromanu draselného. Změřte absorbanci jednotlivých frakcí postupně při postupně při 600 nm, která odpovídá absorpčnímu maximu látky Blue-dextran, vlnová délka 440 nm odpovídá dvojchromanu draselnému a vlnová délka 410 nm odpovídá cytochromu c. Zaznamenejte si i objem každé zkumavky. Stanovení množství proteinu podle Lowryho: Postupujte podle příslušné kapitoly a stanovte koncentraci proteinů v relevantních frakcích metodou podle Lowryho.

24

3 Separace látek pomocí gelové chromatografie Biochemické praktikum I, katedra biochemie, PřF UK v Praze, 2015/2016 Vyhodnocení výsledků 1. Sestrojte eluční graf, ve kterém vynesete hodnoty absorbance měřené při 3 vlnových délkách proti příslušnému elučnímu objemu V (tj. tři křivky pro tři vlnové délky). Do grafu zaznamenejte rovněž koncentraci bílkovin zjištěné podle Lowryho (čtvrtá křivka). 2. Z grafu určete eluční objem Ve separovaných látek (tzn. celkový objem kapaliny, který prošel kolonou, než bylo dosaženo maxima příslušné látky). 3. Vypočítejte distribuční koeficient pro cytochrom c. 4. Spočítejte množství bílkoviny, které prošlo kolonou (z výsledků stanovení) a porovnejte s množstvím aplikovaným na kolonu. Určete ztráty proteinu během chromatografie. Poznámka: Kalibrační graf pro stanovení množství bílkovin budete potřebovat i pro další úlohy.

25

3 Separace látek pomocí gelové chromatografie Biochemické praktikum I, katedra biochemie, PřF UK v Praze, 2015/2016

3.3. Kalibrace chromatografické kolony pro stanovení relativní molekulové hmotnosti proteinu Gelovou filtraci lze použít jako analytickou metodu k určení Mr neznámé látky. Z vynesení závislosti elučních objemů standardů na dekadickém logaritmu jejch molekulových hmotností můžeme sestavit kalibrační přímku kolony a z ní pak podle stanoveného elučního objemu neznámé látky vypočítat její přibližnou molekulovou hmotnost. Cíle 1. Separovat bílkoviny o známé relativní molekulové hmotnosti na chromatografické koloně 2. Sestrojit kalibrační graf pro danou kolonu 3. Porovnat množství bílkovin aplikovaných na kolonu s množstvím eluovaným po chromatografii Chemikálie Sephadex G-100 Eluční roztok - 0,15 M NaCl Směs: 2 mg cytochromu c a 2 mg hovězího sérového albuminu (BSA) Činidla pro stanovení množství bílkovin podle Lowryho Pracovní postup Příprava chromatografické kolony: Sloupec Sephadexu G-100, který je k dispozici, je připraven k aplikaci vzorku. Výtokovou hadičku umístěte do kádinky (pozor na tlak na sloupec) a nechte vsáknout přebytečnou kapalinu nad gelem tak, aby její hladina právě dosáhla povrchu gelu (nad gelem nesmí zůstat vrstvička kapaliny), ale zároveň nesmí dojít k dalšímu vysychání gelu, tzv. „podtečení sloupce“. Aplikace vzorku a spuštění chromatografie: Směs 2 mg cytochromu c a 2 mg hovězího sérového albuminu (BSA) rozpusťte v 0,1 ml 0,15 M NaCl. Na povrch gelu sloupce Sephadexu G-100 aplikujte opatrně automatickou pipetou vzorek tak, aby co nejméně porušil povrch gelu. Dbejte pokynů asistenta. Po vsáknutí vzorku do gelu zvedněte hadičku nahoru a opatrně na povrch gelu napipetujte vrstvu elučního roztoku. Na sloupec nasaďte chromatografickou hlavu se zábrusem. Tato chromatografická hlava je spojena hadičkou s rezervoárem s elučním roztokem. Další objem kapaliny bude protékat do kolony podtlakem přes chromatografickou hlavu z rezervoáru (Erlenmayerova baňka), který je umístěn tak, aby výškový rozdíl mezi hladinou roztoku a ústím hadičky nebyl větší než 30 cm. Výtokovou hadičku umístěte do 1. zkumavky sběrače frakcí a od této chvíle jímejte veškerou kapalinu vytékající ze sloupce. Průběh chromatografie a zpracování rozdělených frakcí: Kapalinu vytékající z chromatografické kolony jímejte do připravených zkumavek v automatickém sběrači. Pomocí kalibrovaných zkumavek si nastavte čas na sběrači tak, aby v každé zkumavce byly přibližně 2 ml. Jímání frakcí ukončete, když jsou z kolony eluovány obě bílkoviny. (Cytochrom c má červenohnědou barvu, jeho polohu vidíte na sloupci v průběhu chromatografie.) Změřte absorbanci jednotlivých frakcí postupně při 280 nm (absorbují obě bílkoviny) a 410 nm (absorbuje cytochrom c). Zaznamenejte si i objem každé zkumavky. Stanovení množství proteinu podle Lowryho: Postupujte podle příslušné kapitoly a stanovte koncentraci proteinů v relevantních frakcích metodou podle Lowryho.

26

3 Separace látek pomocí gelové chromatografie Biochemické praktikum I, katedra biochemie, PřF UK v Praze, 2015/2016 Vyhodnocení výsledků 1. Sestrojte eluční graf, ve kterém vynesete hodnoty absorbancí měřené při 2 vlnových délkách proti příslušnému elučnímu objemu V (tj. dvě křivky pro dvě vlnové délky). Do grafu zaznamenáme rovněž koncentraci bílkovin zjištěné podle Lowryho (třetí křivka). 2. Z grafu určete eluční objem Ve separovaných látek (tzn. celkový objem kapaliny, který prošel kolonou, než bylo dosaženo maxima příslušné látky). 3. Sestrojte graf závislost logaritmu relativní molekulové hmotnosti separovaných proteinů na jejich elučním objemu (relativní molekulová hmotnost BSA je 67 000, cytochromu c 13 000). Získáte tak kalibrační graf pro stanovení relativní molekulové hmotnosti neznámého proteinu. 4. Spočítejte množství bílkoviny, které prošlo kolonou (z výsledků stanovení) a porovnejte s množstvím aplikovaným na kolonu. Určete ztráty proteinu během chromatografie. Poznámka: Kalibrační graf pro stanovení množství bílkovin budete potřebovat i pro další úlohy.

27

3 Separace látek pomocí gelové chromatografie Biochemické praktikum I, katedra biochemie, PřF UK v Praze, 2015/2016

3.4. Stanovení relativní molekulové hmotnosti neznámého proteinu Gelovou filtraci lze použít jako analytickou metodu k určení Mr neznámé látky. Z vynesení závislosti elučních objemů standardů na dekadickém logaritmu jejch molekulových hmotností můžeme sestavit kalibrační přímku kolony a z ní pak podle stanoveného elučního objemu neznámé látky vypočítat její přibližnou molekulovou hmotnost. Cíle 1. Zjistit eluční objem neznámé bílkoviny na dané chromatografické koloně 2. Na základě kalibračního grafu zjistit relativní molekulovou hmotnost neznámého proteinu 3. Porovnat množství bílkovin aplikovaných na kolonu s množstvím eluovaným po chromatografii Chemikálie Sephadex G-100 Eluční roztok - 0,15 M NaCl 4 mg neznámého proteinu Činidla pro stanovení množství bílkovin podle Lowryho Pracovní postup Příprava chromatografické kolony: Sloupec Sephadexu G-100, který je k dispozici, je připraven k aplikaci vzorku. Výtokovou hadičku umístěte do kádinky (pozor na tlak na sloupec) a nechte vsáknout přebytečnou kapalinu nad gelem tak, aby její hladina právě dosáhla povrchu gelu (nad gelem nesmí zůstat vrstvička kapaliny), ale zároveň nesmí dojít k dalšímu vysychání gelu, tzv. „podtečení sloupce“. Aplikace vzorku a spuštění chromatografie: 4 mg neznámého proteinu rozpusťte v 0,1 ml 0,15 M NaCl. Na povrch gelu sloupce Sephadexu G-100 aplikujte opatrně automatickou pipetou vzorek tak, aby co nejméně porušil povrch gelu. Dbejte pokynů asistenta. Po vsáknutí vzorku do gelu zvedněte hadičku nahoru a opatrně na povrch gelu napipetujte vrstvu elučního roztoku. Na sloupec nasaďte chromatografickou hlavu se zábrusem. Tato chromatografická hlava je spojena hadičkou s rezervoárem s elučním roztokem. Další objem kapaliny bude protékat do kolony podtlakem přes chromatografickou hlavu z rezervoáru (Erlenmayerova baňka), který je umístěn tak, aby výškový rozdíl mezi hladinou roztoku a ústím hadičky nebyl větší než 30 cm. Výtokovou hadičku umístěte do 1. zkumavky sběrače frakcí a od této chvíle jímejte veškerou kapalinu vytékající ze sloupce. Průběh chromatografie a zpracování rozdělených frakcí: Kapalinu vytékající z chromatografické kolony jímejte do připravených zkumavek v automatickém sběrači. Pomocí kalibrovaných zkumavek si nastavte čas na sběrači tak, aby v každé zkumavce byly přibližně 2 ml. Jímání frakcí ukončete, když je bílkovina z kolony eluována. Změřte absorbanci jednotlivých frakcí při 280 nm (absorbují bílkoviny), v případě růžové barvy vzorku při 570 nm. Zaznamenejte si i objem každé zkumavky. Stanovení množství proteinu podle Lowryho: Postupujte podle příslušné kapitoly a stanovte koncentraci proteinů v relevantních frakcích metodou podle Lowryho.

28

3 Separace látek pomocí gelové chromatografie Biochemické praktikum I, katedra biochemie, PřF UK v Praze, 2015/2016 Vyhodnocení výsledků 1. Sestrojte eluční graf, ve kterém vynesete hodnoty absorbance měřené při 280 nm proti příslušnému elučnímu objemu V (první křivka). Do grafu zaznamenejte rovněž koncentraci bílkovin zjištěné podle Lowryho (druhá křivka). 2. Z grafu určete eluční objem Ve neznámé bílkoviny (tzn. celkový objem kapaliny, který prošel kolonou, než bylo dosaženo maxima příslušné látky). 3. Sestrojte graf závislost logaritmu relativní molekulové hmotnosti proteinů o známé relativní molekulové hmotnosti na jejich elučním objemu Ve (které vám byly sděleny), (relativní molekulová hmotnost BSA je 67 000, cytochromu c 13 000). Získáte tak kalibrační graf pro stanovení relativní molekulové hmotnosti neznámého proteinu. 4. Podle elučního objemu Ve neznámého proteinu určete z kalibračního grafu jeho relativní molekulovou hmotnost. 5. Spočítejte množství bílkoviny, které prošlo kolonou (z výsledků stanovení) a porovnejte s množstvím aplikovaným na kolonu. Určete ztráty proteinu během chromatografie. Poznámka: Kalibrační graf pro stanovení množství bílkovin budete potřebovat i pro další úlohy.

29

3 Separace látek pomocí gelové chromatografie Biochemické praktikum I, katedra biochemie, PřF UK v Praze, 2015/2016

3.5.

Stanovení relativní molekulové hmotnosti peroxidasy

Jestliže použijeme proteiny o známé relativní molekulové hmotnosti, můžeme pak ze závislosti log Mr na elučním objemu stanovit molekulovou hmotnost neznámého proteinu. K detekci proteinu po chromatografii lze využít i jeho biologickou aktivitu, např. enzymovou aktivitu. Peroxidasa (EC 1.11.1.7) katalyzuje oxidaci různých látek (např. fenolů, aminů) peroxidem vodíku podle rovnice RH2 + H2 O2 → R + 2H2 O Tuto reakci využijeme k detekci peroxidasy: substrátem bude derivát benzidinu, který po reakci poskytuje barevnou sloučeninu. Cíle 1. Zjistit eluční objem peroxidasy na dané chromatografické koloně 2. Na základě kalibračního grafu zjistit relativní molekulovou hmotnost peroxidasy 3. Porovnat množství bílkovin aplikovaných na kolonu s množstvím eluovaným po chromatografii Chemikálie a materiál Sephadex G-100 Eluční roztok – 0,15 M NaCl křen Činidla pro stanovení množství bílkovin podle Lowryho Detekční činidlo pro peroxidasu 0,1 M fosfátový pufr 30% H2O2 ethanol Pracovní postup Příprava vzorku: Z malého kousku omytého kořenu křenu nastrouhejte asi 1 g vnější nedřevnaté vrstvy. Nastrouhaný materiál rozetřete v třecí misce s 10 ml 0,15 mol/l roztoku NaCl a přefiltrujte skládaným filtrem. Zbytek vzorku, který vám zůstane po aplikaci na chromatografickou kolonu, uchovejte pro stanovení množství bílkovin Příprava chromatografické kolony: Sloupec Sephadexu G-100, který je k dispozici, je připraven k aplikaci vzorku. Výtokovou hadičku umístěte do kádinky (pozor na tlak na sloupec) a nechte vsáknout přebytečnou kapalinu nad gelem tak, aby její hladina právě dosáhla povrchu gelu (nad gelem nesmí zůstat vrstvička kapaliny), ale zároveň nesmí dojít k dalšímu vysychání gelu, tzv. „podtečení sloupce“. Aplikace vzorku a spuštění chromatografie: Na povrch gelu sloupce Sephadexu G-100 aplikujte opatrně automatickou pipetou 0,1 ml vzorku tak, aby co nejméně porušil povrch gelu. Dbejte pokynů asistenta. Po vsáknutí vzorku do gelu zvedněte hadičku nahoru a opatrně na povrch gelu napipetujte vrstvu elučního roztoku. Na sloupec nasaďte chromatografickou hlavu se zábrusem. Tato chromatografická hlava je spojena hadičkou s rezervoárem s elučním roztokem. Další objem kapaliny bude protékat do kolony podtlakem přes chromatografickou hlavu z rezervoáru (Erlenmayerova baňka), který je umístěn tak, aby výškový rozdíl mezi hladinou roztoku a ústím hadičky nebyl větší než 30 cm. Výtokovou hadičku umístěte do 1. zkumavky sběrače frakcí a od této chvíle jímejte veškerou kapalinu vytékající ze sloupce. Průběh chromatografie a zpracování rozdělených frakcí: Kapalinu vytékající z chromatografické kolony jímejte do připravených zkumavek v automatickém sběrači. Pomocí

30

3 Separace látek pomocí gelové chromatografie Biochemické praktikum I, katedra biochemie, PřF UK v Praze, 2015/2016 kalibrovaných zkumavek si nastavte čas na sběrači tak, aby v každé zkumavce byly přibližně 2 ml. Jímání frakcí ukončete, když je bílkovina z kolony eluována. Přítomnost peroxidasy budete detekovat enzymovou reakcí, a to vznikem barevného komplexu oxidovaného 3,3´-dimethylbenzidinu. Z každé frakce odeberete 1 ml vzorku do nových zkumavek a přidejte 0,25 ml detekčního činidla. Po 5 minutách změřte absorbanci při 430 nm a určete frakci s nejvyšší absorbancí, tedy s největším zastoupením peroxidasy. Používejte výhradně skleněné kyvety. Zaznamenejte si i objem každé zkumavky. Příprava detekčního činidla: 0,01 g 3,3´-dimethylbenzidinu (POZOR KARCINOGEN – vždy používejte ochranné pomůcky) rozpusťte v kalibrované zkumavce v 2,5 ml destilovaného ethanolu, přidejte 7 ml 0,1 mol/l fosfátového pufru pH 7,0; 0,1 ml 30% H2O2; doplňte pufrem na 10 ml a roztok přefiltrujte. Tento roztok si připravte až těsně před použitím. Stanovení množství proteinu podle Lowryho: Postupujte podle příslušné kapitoly a stanovte koncentraci proteinů v relevantních frakcích metodou podle Lowryho. Vyhodnocení výsledků 1. Sestrojte eluční graf, ve kterém vynesete hodnoty absorbance měřené při 430 nm proti příslušnému elučnímu objemu V (první křivka). Do grafu zaznamenejte rovněž koncentraci bílkovin zjištěné podle Lowryho (druhá křivka). 2. Z grafu určete eluční objem Ve peroxidasy (tzn. celkový objem kapaliny, který prošel kolonou, než bylo dosaženo maxima příslušné látky). 3. Sestrojte graf závislost logaritmu relativní molekulové hmotnosti proteinů o známé relativní molekulové hmotnosti na jejich elučním objemu Ve (které vám byly sděleny), (relativní molekulová hmotnost BSA je 67 000, cytochromu c 13 000). Získáte tak kalibrační graf pro stanovení relativní molekulové hmotnosti peroxidasy. 4. Podle elučního objemu Ve peroxidasy určete z kalibračního grafu jeho relativní molekulovou hmotnost. 5. Spočítejte množství bílkovin ve frakcích obsahujících peroxidasu (z výsledků stanovení) a porovnejte s množstvím aplikovaným na kolonu. Poznámka: Kalibrační graf pro stanovení množství bílkovin využijete v dalších úlohách.

31

4 Elektroforetické metody Biochemické praktikum I, katedra biochemie, PřF UK v Praze, 2015/2016

4. ELEKTROFORETICKÉ METODY Jednou z nejvíce používaných elektroforetických technik je elektroforéza gelová využívající porézních gelů (agarosy nebo polyakrylamidového gelu). Tyto gely umožňují separaci látek na principu síťového efektu a zároveň na elektroforetické pohyblivosti dělených látek. Při gelové elektroforéze se však, na rozdíl od gelové chromatografie, velké molekuly zpožďují proti malým molekulám. Běžně používaným nosičem je polyakrylamidový gel, který je inertní, mechanicky pevný, průhledný a skýtá možnost přípravy nosiče různých předem určených vlastností (hustota zesíťování gelu, gradient hustoty gelu aj). Polyakrylamidový gel se připravuje kopolymerací dvou monomerů, akrylamidu a N,N´-methylen-bis(akrylamidu), označovaném v laboratorním žargonu jako „BIS“. Kopolymerace probíhá v roztoku pufru za přítomnosti iniciátoru – peroxodisíranu amonného (v laboratorním žargonu také nazývaný persulfát) nebo riboflavinu. Působením světla se molekuly iniciátoru rozkládají za vzniku volných radikálů, které zahájí vlastní polymerační reakci. Jako stabilizátor volných radikálů se používá tetramethylendiamin „TEMED“ či dimethylaminopropionitril „DMPN“. Polymerační reakcí, probíhající za nepřístupu vzduchu, vzniknou dlouhé lineární řetězce polyakrylamidu, křížově propojené můstky bifunkčního činidla BISu. Polyakrylamidový gel si můžeme představit jako strukturu sestávající se z otevřených pórů určité velikosti, obsahujících kapalinu s pufrem. Je-li velikost těchto pórů srovnatelná s velikostí bílkovinných molekul, pak se tyto molekuly při průchodu gelem setkávají s odporem, v jehož důsledku se pak rozdělí podle své velikosti (princip „molekulového síta“). Chemickou strukturu gelu zachycuje obrázek.

(převzato z www.sdspage123.blogspot.com) Velikost pórů je nepřímo úměrná koncentraci bifunkční složky gelu, tedy N,N´-methylen-bis(akrylamidu). Vzájemný poměr obou složek kopolymeru je velmi důležitý a ovlivňuje fyzikální vlastnosti vzniklého gelu. Vyšší koncentrace obou složek vede k získání gelů tuhých a křehkých, nízká koncentrace naopak ke gelům měkkým. Nejčastější celkové koncentrace akrylamidu jsou 3-15% (značí se %T) a koncentrace N,N´-methylenbisakrylamidu obvykle odpovídá 5% celkového množství akrylamidu (značí se %C): %𝑇 =

𝑎+𝑏 𝑉

∙ 100

%𝐶 =

𝑏 𝑎+𝑏

∙ 100

kde a je navážka akrylamidu v gramech, b je navážka BIS v gramech a V je objem pufru v mililitrech. Uspořádání elektroforézy může být buď v trubičkách, nebo v tenké vrstvě (mezi dvěma skleněnými deskami). Zásadní dělení technik v polyakrylamidovém gelu (PAGE32

4 Elektroforetické metody Biochemické praktikum I, katedra biochemie, PřF UK v Praze, 2015/2016 polyacrylamide gel electrophoresis) není podle typu gelu či jeho tvaru, ale podle toho, zda probíhá v kontinuálním nebo diskontinuálním systému. Diskontinuita může být jak v koncentracích gelu, tak především v pH a iontové síle. Velmi ostré zóny získáme při diskontinuální elektroforéze, která používá dva různé gely a několik odlišných pufrů o různém pH. Dělicí (separační, dolní) gel se překryje asi jednocentimetrovou vrstvou tzv. zaostřovacího (startovacího, horního) gelu s velkými póry. Zaostřovací gel a vzorkový pufr obsahují Tris-HCl pufr, jehož pH 6,8 je asi o dvě jednotky nižší než má pufr dělicího gelu. Elektrodový roztok obsahuje Tris-glycinový pufr pH 8,3. V prostředí zaostřovacího gelu je nejpohyblivějším aniontem chloridový, pohyblivost komponent vzorku (bílkovin) je menší. Za zónou chloridů následují zóny bílkovin seřazené podle elektroforetických pohyblivostí. Poslední zónu tvoří glycin. Hodnota intenzity proudu je nastavena na určitou konstantní velikost. Seřazené zóny se pohybují stejnou rychlostí, dochází ke vzniku ostře ohraničených, za sebou těsně následujících zón iontů (uvedený princip je základem další elektromigrační metody izotachoforézy). Vzhledem k tomu, že rychlost pohybujících se zón je konstantní, vytváří se stupňovitý gradient potenciálu. Projevuje se tzv. „samozaostřovací efekt“. Zpozdí-li se některý ion za „svou“ zónou, tj. zónou odpovídající příslušné pohyblivosti, octne se v prostředí s větší hodnotou potenciálu, který ho okamžitě urychlí tak, aby „dohnal“ svou zónu (a naopak). Po vstupu seřazených iontů do dělicího gelu, který má vyšší hodnotu pH, se glycin stává druhým nejpohyblivějším iontem po chloridových iontech a současně v důsledku různé pohyblivosti v gelové matrici dochází k rozdělení zón od sebe (dělení podle náboje a velikosti molekul). Pohyb čela se indikuje přidáním nízkomolekulárního barviva (bromfenolové modři) ke vzorku, které vytváří ostrý pruh putující s čelem. Jednou z metod, jak lze stanovit relativní molekulové hmotnosti separovaných látek je elektroforéza v koncentračním gradientu polyakrylamidu. Lze připravit diskontinuální i lineární gradient. Diskontinuální gradient polyakrylamidu se vytváří v aparatuře vytvořené ze dvou skel, kde se nejprve nechá polymerovat gel s nejvyšší koncentrací akrylamidu a na něj se postupně polymerují roztoky vždy s nižší koncentrací akrylamidu. Na přípravu takového gelu se používají roztoky obsahující 2 až 30% akrylamidu. K přípravě gelu s lineárním gradientem koncentrace akrylamidu je třeba pouze roztok s nejnižší a nejvyšší koncentrací akrylamidu. Pomocí gradientového mixeru se akrylamidovými roztoky plní předem připravená aparatura. Tenké vrstvy s lineárním gradientem se dají získat také komerčně. Častou variantou PAGE je elektroforéza v přítomnosti dodecylsíranu sodného (SDS), který se váže na bílkoviny v poměru přibližně 1,4 g SDS/1 g bílkoviny a udílí jim uniformní, záporný náboj, který překrývá vlastní náboj proteinu. Proteiny pokryté SDS tak mají shodné poměry počtu nábojů na jednotku hmoty a podobný, válcovitý tvar. Následkem toho se při SDS PAGE bílkoviny dělí především na základě rozdílnosti molekulových hmotností. S přesností na 5-10% lze touto metodou stanovit relativní molekulové hmotnosti běžně velkých proteinů. Relativní pohyblivost (RF) je rovna poměru vzdálenosti zóny proteinu od startu a vzdálenosti čela elektroforézy, tj. zóny bromfenolové modři. Relativní pohyblivost proteinů je lineárně závislá na logaritmu Mr. Vynesením logaritmu Mr proteinů o známé molekulové hmotnosti proti hodnotám jejich relativních pohyblivostí získáme pro daný experiment kalibrační přímku, z níž můžeme odečíst hodnotu molekulové hmotnosti neznámého proteinu. Mnohé proteiny obsahují více než jeden polypeptidový řetězec. Působením SDS se poruší nekovalentní interakce mezi podjednotkami a pokud se přidá redukční činidlo (např. 2-merkaptoethanol), které redukuje disulfidové můstky, lze stanovit molekulovou hmotnost jednotlivých podjednotek. Nevýhodou této metody je skutečnost, že nepodává informace o bílkovinách v nativním stavu. Sledovat proteiny v nativním stavu umožňuje tzv. nativní nedenaturující elektroforéza, ve které je SDS v elektrodovém pufru i v polyakrylamidovém gelu nahrazeno např. glycerolem. Stejně tak vzorkový pufr obsahuje místo SDS glycerol nebo je tvořen pouze např. 20% sacharosou a vzorky nejsou vařeny. Tím nedochází k rozpadu podjednotek proteinu

33

4 Elektroforetické metody Biochemické praktikum I, katedra biochemie, PřF UK v Praze, 2015/2016 a protein se pohybuje ve svém původním oligomerním stavu. Rychlost pohybu proteinu v gelu pak závisí jak na výsledném náboji, tak na jeho tvaru. Nativní elektroforéza umožňuje sledovat také izoenzymové složení studovaného proteinu. Izoenzymy jsou enzymy s kvarterní strukturou, které se v tkáních vyskytují v různých molekulárních formách. Přestože mají stejnou katalytickou funkci, liší se svoji chemickou strukturou a fyzikálně-chemickými vlastnostmi (jako je relativní molekulová hmotnost Mr, izoelektrický bod pI). V praktiku mají studenti možnost separovat izoenzymy živočišné laktátdehydrogenasy (LDH) a rostlinné peroxidasy. Izoelektrická fokusace (IEF) je diskontinuální elektroforéza v prostředí gradientu pH. Gradient pH se v gelu vytváří přirozeným způsobem. Při elektrolýze vody se na katodě vybíjí ionty H+ a na anodě ionty OH-, v důsledku toho se pH snižuje od katody k anodě. pH gradient se stabilizuje přídavkem směsi amfolytů, což může být např. směs nízkomolekulárních oligomerů s molekulovou hmotností 300 až 600 Da, obsahujících alifatické karboxylové skupiny a aminoskupiny. Tyto oligoamino-oligokarboxylové kyseliny mají rozdílné izoelektrické body, pokrývající požadovanou oblast. Gradient pH vzniklý pufrační schnopností amfolytů je v gelu udržován elektrickým polem. Pokud se na takovémto gelu se stabilním gradientem pohybuje v elektrickém poli směs proteinů, každý z putujících se zastaví v místě, kde pH odpovídá jeho izoelektrickému bodu. Molekuly proteinu však mají pochopitelně tendenci difundovat do míst o nižší koncentraci proteinu (rozostření zóny). Tím se ale tyto molekuly dostanou do prostředí s jiným pH a opět získají určitý náboj. Působením elektrického pole jsou však opět vráceny do původního místa, čímž dochází ke kontinuálnímu zaostřování (fokusaci) zón kolem izoelektrického bodu. Od klasického uspořádání IEF v trubičkách nebo na deskách připravovaných v laboratoři se dnes využívají komerčně dodávané proužky gelu (např. Imobilinové stripy). K dokonalému rozdělení proteinové směsi je třeba speciální přístrojové vybavení, které dosahuje napětí až 5000 V. V roce 1975 zkombinoval O´Farrell IEF s SDS PAGE a zavedl tak nový postup separace látek s vysokou rozlišovací schopností: dvourozměrnou elektroforézu. Tato technika umožňuje dělení proteinů na základě rozdílnosti izoelektrických bodů a molekulových hmotností. Prakticky se provádí tak, že se vzorek se směsí proteinů nebo peptidů podrobí IEF, proužek gelu s takto rozdělenou směsí se přenese na desku polyakrylamidového gelu a v kolmém směru se nechá proběhnout SDS PAGE. Výsledkem jsou tzv. dvoudimenzionální mapy (2D-mapy), jejichž porovnáním lze získat informace o vlastnostech a změnách vlastností proteinů v různých biologických systémech. Kapilární elektroforéza (CE) probíhá ve velmi tenkých kapilárách (průměr 1-10 μm) zhotovených z křemene, skla nebo plastu. Tyto tenké kapiláry rychle odvádějí teplo, takže mohou být použita elektrická pole s vysokým napětím (obvykle 100-300 V·cm-1, což je asi 100× víc než u ostatních elektroforéz), čímž sníží čas potřebný pro dělení vzorku na několik minut. Kapiláry mohou být naplněny pufrem (volná elektroforéza), přičemž úzký průměr kapilár zabrání konvenčnímu míchání, a tím rozostřování zón. Mohou být naplněny polymerním gelem a látky se na nich mohou separovat stejným mechanismem jako je tomu u klasické PAGE, SDS PAGE nebo IEF. Metoda CE má velmi vysoký stupeň rozlišení a vzhledem k tomu, že se používají malá množství vzorku, slouží převážně pro analytické účely. K tomu samozřejmě přispívá i fakt, že CE se provádí na zařízeních s automatickým dávkováním vzorků a vyhodnocování. Detekce látek po elektroforéze Proužky jednotlivých látek vzniklé při elektroforetickém dělení se dají na gelu zviditelnit pomocí nejrůznějších technik. Proteiny se obvykle barví ponořením gelu do roztoku obsahujícího alkohol a barvivo nazývané Coomassie modř (Coomassie brilliant blue, CBB). Proteiny jsou v tomto roztoku jednak denaturovány, a tím i fixovány, jednak se vytvářejí

34

4 Elektroforetické metody Biochemické praktikum I, katedra biochemie, PřF UK v Praze, 2015/2016 komplexy barvivo-protein. Přebytek barviva se odstraní buď vymýváním gelu kyselým roztokem, nebo elektroforetickým odbarvením. Tak se dají detekovat mikrogramová množství rozdělených proteinů. Citlivější metodou je barvení stříbrem, kdy je možno detekovat až 0,1 ng proteinu v jednom proužku. V literatuře je popsána celá řada postupů. Všechny jsou založeny na principu redukce stříbrného iontu na kovové stříbro formaldehydem v alkalickém prostředí uhličitanu sodného. Proteiny enzymů, pokud si během nativní elektroforézy uchovají svoji aktivitu, lze někdy vizualizovat stanovením enzymové aktivity přímo v gelu. Gel se ponoří do reakční směsi obsahující vedle pufru o pH optimu daného enzymu také příslušné substráty, případně koenzymy studovaného enzymu spolu s činidlem poskytujícím s produktem reakce nerozpustnou barevnou sloučeninu. Obarvené polyakrylamidové gely se dají uchovávat tak, že se nejprve rehydratují v sušicím roztoku obsahujícím methanol, kyselinu octovou a glycerol. Gely se umístí mezi dvě fólie celofánu (namočeného do sušicího roztoku) a napnou se na rámeček z plexiskla. V současné době se ale spíše uchovávají digitální záznamy, které umožňují zpracování dat počítačovými programy. Proteiny mohou být také z gelu přeneseny na membrány (nitrocelulosa, polyvinylidenfluorid) buď prostou difuzí nebo elektromigrací. Označení této techniky je Western blotting, coby slovní hříčka k názvu Southernovy metody (Southern blotting) přenosu DNA z gelů na membrány. Proteiny mohou být na membránách vizualizovány celou řadou barviv (Coomassie blue, Ponceau S, amidočerň atd.). Velmi často se využívá reakce jednotlivých proteinů na membráně se specifickými protilátkami k jejich imunodetekci, která přímo v gelu není možná. K detekci nukleových kyselin na gelu lze také použít barvení stříbrem, pro DNA se ale více používá ethidium bromid nebo jiná barviva (např. SYBR safe, Fast blast DNA stain). Některá tato barviva interkalují mezi nukleové báze v dvoušroubovici DNA, kde po ozáření UV světlem vykazují silnou fluorescenci. Ke specifické detekci určité sekvence nukleotidů se používá přenosu nukleových kyselin na membránu a poté hybridizace s radioaktivně, fluorescenčně nebo chemiluminiscenčně značenou komplementární DNA (Northern blotting u RNA, Southern blotting u fragmentované genomické DNA).

35

4 Elektroforetické metody Biochemické praktikum I, katedra biochemie, PřF UK v Praze, 2015/2016

4.1. Stanovení relativní molekulové hmotnosti proteinu elektroforézou v prostředí SDS Proteiny se v elektrickém poli pohybují podle svého náboje. V prostředí aniontového tenzidu (detergentu), dodecylsulfátu sodného (SDS), má však každý protein záporný náboj a pohybuje se podle velikosti molekuly, tedy podle relativní molekulové hmotnosti. Vynesením logaritmu relativní molekulové hmotnosti standardů, tj. bílkovin o známé molekulové hmotnosti, proti jejich relativní pohyblivosti získáme kalibrační přímku, z níž můžeme odečíst molekulovou hmotnost neznámého proteinu (podrobněji kap. Elektromigrační metody). Více viz výuková videa: http://www.natur.cuni.cz/chemie/biochem/ke-stazeni/biochemicke-praktikum Cíle 1. Proveďte elektroforetickou separaci standardu, neznámých vzorků CA, TI a LA a svého proteinového izolátu s předchozí úlohy v prostředí SDS. Po provedení separace a následné detekci proteinů, zjistěte jejich relativní pohyblivost Rf. 2. Pomocí Rf standardních proteinů o známé relativní molekulové hmotnosti zjistěte relativní molekulovou hmotnost neznámých vzorků. Chemikálie a materiál 30% Akrylamid/bis: 29,2 g akrylamidu, 0,8 g bis-akrylamidu. Doplnit do 100 ml destilovanou vodou. 1,5 M Tris-HCl, pH 8,8: 18,15 g Tris (Trizma base), 80 ml destilované vody, pH upravit na 8,8 6 M HCl. Doplnit destilovanou vodou do 100 ml. 0,5 M Tris-HCl, pH 6,8: 6 g Tris (Trizma base), 80 ml destilované vody, pH upravit na 6,8 6 M HCl. Doplnit destilovanou vodou do 100 ml. 10% SDS: 10 g SDS, doplnit do 100 ml destilovanou vodou (rozpouštět v teplé vodní lázni). vzorkový pufr redukující: 2,4 ml destilované vody; 2,6 ml 0,5 M Tris-HCl pufru pH 6,8; 2 ml glycerolu; 2 ml 10% SDS; 0,5 ml 2-merkaptoethanolu; 0,5 ml 1% bromfenolové modři. Elektrodový pufr, pH 8,3, pětkrát koncentrovaný: 15 g Tris (trizma base), 72 g glycinu, 5 g SDS. Doplnit do 1 l destilovanou vodou. 10% peroxodisíran amonný: připravte 1 ml z krystalického peroxodisíranu amonného TEMED standard molekulových hmotností: Pierce™ Unstained Protein MW Marker (obrázek) neznámé vzorky bílkovin, odsolený preparát enzymové izolace aparatura na elektroforézu pipety Pracovní postup Nejprve nalijte mezi dvě čisté, suché, event. ethanolem odmaštěné skleněné desky polymerační roztok. Sestavení elektroforetické aparatury i nalévání polymeračního roztoku je více či méně odlišné u výrobků různých firem, vždy je třeba se nejprve seznámit s návodem. Zde je popsán způsob práce s aparaturou firmy Biometra.

36

4 Elektroforetické metody Biochemické praktikum I, katedra biochemie, PřF UK v Praze, 2015/2016 Pracujte opatrně, v rukavicích, akrylamid je neurotoxin! 1. Na čistý filtrační papír položte větší sklo bez výřezu pevnými výstupky („spacery“) nahoru. Pružné silikonové těsnění umístěte na spodní sklo kolem „spacerů“ a dolů. 2. Přiklopte skleněnou desku s výřezem přesně na připravenou spodní desku, výřezem nahoru, kde není těsnění. Obě skla sevřete dole a po obou stranách bílými svorkami. Skleněnou desku postavte na tácek na spodní svorku. Pozor – není příliš stabilní, snadno spadne! 3. Připravte 15% malopórový separační (dělicí) gel podle následujícího schématu: Destilovaná voda 1,35 ml 30% akrylamid/bis 3,0 ml 1,5 M Tris- HCl, pH 8,8 1,5 ml 10% SDS 0,06 ml TEMED 0,005 ml 10% peroxodisíran amonný 0,06 ml Peroxodisíran amonný přidejte jako poslední, promíchejte a okamžitě tento polymerační roztok nalijte mezi skleněné desky tak, aby gel dosahoval výšky 7 cm. 4. Polymerační roztok mezi skly je třeba převrstvit asi 0,5 ml destilované vody. Nechte polymerační roztok 20-30 minut stát při laboratorní teplotě. 5. Po dokonalém ztuhnutí gelu se vytvoří ostré rozhraní mezi vrstvou vody a gelu. Destilovanou vodu odlijte a zbytek odsajte proužkem filtračního papíru. 6. Napipetujte 4% velkopórový (zaostřovací) gel podle následujícího schématu: Destilovaná voda 1,22 ml 30% akrylamid/bis 0,26 ml 0,5 M Tris- HCl, pH 6,8 0,5 ml 10% SDS 0,02 ml TEMED 0,005 ml 10% peroxodisíran amonný 0,02 ml Peroxodisíran amonný přidejte opět jako poslední, promíchejte a okamžitě tento polymerační roztok nalijte na separační gel, vložte šablonu (tzv. hřeben) až k výřezu skleněné desky. Tato šablona vytvoří jamky, do nichž lze aplikovat vzorky. 7. Nechte polymerační roztok stát při laboratorní teplotě asi 20-30 minut. Během polymerace si můžete začít připravovat vzorky (bod 10). 8. Připravte si 500 ml elektrodového pufru (zásobní roztok F, před použitím se pětkrát ředí) a naplňte spodní elektrodový prostor (uvedený objem stačí na celou aparaturu). Jestliže je i velkopórový gel ztuhlý, odstraňte opatrně svorky a silikonové těsnění. Umístěte skleněné desky s gelem do aparatury, deska s výřezem musí být blíže k hornímu elektrodovému prostoru (dovnitř aparatury). Upevněte desky bílými svorkami. 9. Odstraňte hřeben, prostor pro horní elektrodový pufr naplňte pufrem. 10. Příprava vzorků: 20 µl odsoleného enzymového izolátu smíchejte s 20 µl vzorkového pufru, vzorky neznámých proteinů jsou rozpuštěny ve vzorkovém pufru (0,1 mg/ml). Povařte je spolu se standardem 5 minut ve vroucí vodní lázni naplněné destilovanou vodou v kulatém stojánku určeném pro zahřívání mikrozkumavek. Po ochlazení na laboratorní teplotu aplikujte mikrostříkačkou („Hamiltonka“) nebo automatickou pipetou do jedné poloviny jamek 5-15 μl vzorků (tato půlka gelu bude následně barvena Coomassie) a do druhé poloviny 2-5 μl (následně barvena stříbrem). 11. Nasaďte bezpečnostní kryt na aparaturu. Zapojení ke zdroji stejnosměrného proudu provádějte pouze v přítomnosti asistenta. Nastavte počáteční podmínky – napětí 70 V. Když doputuje bromfenolová modř do separačního gelu, zvyšte napětí na 140 V.

37

4 Elektroforetické metody Biochemické praktikum I, katedra biochemie, PřF UK v Praze, 2015/2016 12. Když bromfenolová modř doputuje ke spodnímu okraji separačního gelu, vypněte nejprve zdroj proudu, vyndejte spojovací kabely ze zdroje a teprve potom sundejte kryt elektroforetické aparatury. 13. Uvolněte dvojici skel z aparatury a opatrně (podle instrukcí asistenta!) oddělte skla od sebe. Změřte vzdálenost čela elektroforézy (pruh bromfenolové modři) od začátku separačního gelu. 14. Špachtlí odstraňte velkopórový gel a polovinu separačního gelu vložte do barvicí lázně (0,1% Coomassie Brilliant Blue R-250 ve 40% methanolu a 10% kyselině octové). Nechte gel barvit přes noc. 15. Po barvení se gel odbarvujte v odbarvovací směsi (250 ml ethanolu, 100 ml kyseliny octové, 650 ml destilované vody) a po úplném odbarvení pozadí se gel převede do destilované vody. 16. Druhou polovinu gelu barvěte pomocí následujícího protokolu. Barvení proteinů stříbrem – kyselé Princip: Ionty sříbra Ag+ se vážou k proteinům, hlavně k jejich –SH a –COOH skupinám, kde se pak vyredukovávají do kovového stříbra Ag. Místa, kde se nachází proteiny, jsou pak tmavší. (pozn. změnou redoxních rovnováh v roztoku lze proteiny vyvolat i negativně – tedy jako bílé skvrny na tmavém pozadí). Při příliš silném vybarvení je možné použít zesvětlovače. Obecně existují dvě skupiny protokolů barvení proteinů stříbrem: 1. alkalické metody – jsou zdlouhavější, ale citlivější a s menším pozadím 2. kyselé metody – rychlejší, ale méně citlivé Použití: velice citlivá detekce proteinů po elektroforéze, je možné použít k identifikaci a izolaci proteinů pro hmotnostní spektroskopii (obarvený proužek se vyřízne a odbarví) - thiosíran sodný vytváří se stříbrem rozpustné komplexy - formaldehyd (nebo glutaraldehyd) se používají k prosíťování proteinů (pomocí volných -NH2 skupin). Chemikálie a roztoky: 1. fixační roztok: 50%(v/v) ethanol +12%(v/v) kys.octová + 0,05% formaldehyd 100 ml: 12 ml HAc + 50 ml 96%ethanol + 50 μl 35% formaldehyd, doplnit destilovanou vodou do 100 ml, skladovat při pokojové teplotě 2. promývací roztok: 20%(v/v) ethanol připravte 100 ml, uchovávejte při pokojové teplotě 3. senzitivizující roztok: 0,02%(w/v) Na2 S2O3 100 ml: 20 mg Na2 S2O3, připravit vždy čerstvý 2 ml schovejte pro krok 5 4. barvicí roztok: 0,2% (w/v) AgNO3 + 0,076% formaldehyd 100 ml: 0,2 g AgNO3 + 76 μl 35% formaldehyd Připravit čerstvý, přebytek do druhého dne skladovat v tmavé lahvi a v lednici, používat vychlazený! 5. vyvíjecí roztok: 6%(w/v) Na2CO3+ 0,0004% (w/v) Na2 S2O3 + 0,05% formaldehyd 100 ml: 6 g Na2CO3 + 0,4 mg Na2S2O3 + 50 μl 35% formaldehyd Použijte 2 ml roztoku Na2S2O3 z kroku 3 6. terminační roztok: 12%(v/v) kys.octová

38

4 Elektroforetické metody Biochemické praktikum I, katedra biochemie, PřF UK v Praze, 2015/2016 1000 ml: 120 ml kys octové, doplnit do litru destilovanou vodou, již k dispozici, skladovat při pokojové teplotě Postup: 1. Po elektroforéze odřízněte horní zaostřovací gel, polovinu separačního gelu pak vložte do fixačního roztoku na 20 min (až přes noc). Delší fixace může zvýšit citlivost a snížit pozadí. Fixační roztok zabraňuje proteinům vymýt se z gelu a odstraňuje možné interferující ionty a detergent z gelu. 2. Během 20 min 3× důkladně promyjte přibližně 100 ml promývacího roztoku. V tomto kroku je nutné odstranit interferující kyseliny, ionty a detergenty. 3. Gel ponořte do asi 100 ml senzitivizujícího roztoku na 2 min. 4. Gel 2x promyjte destilovanou vodou, pokaždé aspoň 1 min. 5. Gel vložte do 20 ml vychlazeného barvicího roztoku na dobu 20 min (nelijte barvicí roztok přímo na gel, raději do rohu nádoby, jinak se různé části gelu mohou obarvit různě intenzivně). 6. Po barvení vylijte barvicí roztok a promyjte větším objem vody po dobu maximálně 60 s (delším promýváním se odstraní příliš mnoho iontů Ag, což vede ke snížené citlivosti). 7. Gel ponořte do vyvíjejícího roztoku, rychle vyvíjecí roztok vylijte. 8. Přidejte další část vyvíjecího roztoku a nechte vyvíjet do požadovaného vzhledu (cca 2-5 min) 9. Vyvíjení zastavte přidáním asi 50 ml terminačního roztoku přímo do vyvíjecí lázně. Vyvíjení je ukončeno, jakmile přestanou unikat bublinky. Vyhodnocení výsledků 1. Po převedení gelu do destilované vody změřte vzdálenost, kterou urazily jednotlivé bílkoviny od začátku separačního gelu a vypočtěte jejich Rf. 2. Sestrojte kalibrační graf závislosti log Mr standardních proteinů na jejich relativní pohyblivosti. 3. Z kalibračního grafu určete přibližnou relativní hmotnost neznámých proteinů LA, TI a CA. 4. Pokuste se určit, který pruh izolátu patří vámi izolovanému proteinu. 5. Seznamte se se specializovaným počítačovým programem a pokuste se elektroforézu vyhodnotit s jeho pomocí. Kontrolní otázky: 1. Proč se pro stanovení Mr používá logaritmický výnos? 2. Jak se projeví různé množství aplikovaného proteinu? 3. Jaké další metody stanovení relativní molekulové hmotnosti znáte?

39

4 Elektroforetické metody Biochemické praktikum I, katedra biochemie, PřF UK v Praze, 2015/2016

4.2. Nativní elektroforéza enzymů v polyakrylamidovém gelu- laktátdehydrogenasa Bílkoviny lze separovat v polyakrylamidovém gelu bez tenzidů (SDS) na základě jejich přirozeného náboje. V tomto uspořádání nedochází k denaturaci bílkovin a ke ztrátě enzymové aktivity, která může být využita k detekci příslušného enzymu. LDH je klinicky významný diagnostický enzym infarktu myokardu a hematologických chorob. Je to tetramer, skládající se ze 4 podjednotek. Každá podjednotka je označena buď H (heart) nebo M (muscle). Kombinací těchto podjednotek můžeme dostat 5 různých izoenzymů: LDH-1 (HHHH), LDH-2 (HHHM), LDH-3 (HHMM), LDH-4 (HMMM) a LDH-5 (MMMM). LDH-1 a LDH-2 jsou nejrychleji putující izoenzymy (tzv. anodové formy LDH) a nacházejí se především v srdci a červených krvinkách. Játra a kosterní svaly jsou tkáně, kde se nacházejí převážně pomalu migrující LDH-5 a LDH-4 (katodové formy LDH). Plíce a slezina jsou orgány, ve kterých žádná z izoforem nepřevažuje a mají navíc izoenzym LDH-3 se střední pohyblivostí. Rozdělení izoforem LDH značně přispívá ke zvýšení specifity diagnostiky. V séru zdravých osob převažuje frakce LDH-2, hlavními enzymy spojenými s poškozením myokardu jsou LDH-1 a LDH-2. Laktátdehydrogenasa (L-laktát : NAD+ - oxidoreduktasa E.C. 1.1.1.27) katalyzuje reakci

Vznikající NADH redukuje za přítomnosti jodonitrotetrazoliovou violeť na červený formazan.

N-methylfenazoniummethylsulfátu

Cíle 1. Proveďte nativní elektroforetickou separaci enzymového preparátu laktátdehydrogenasy. 2. V gelu specificky detekujte aktivitu LDH a přítomnost bílkoviny, vyhodnoťte počet proužků Chemikálie pro elektroforézu Zásobní roztok A: již k dispozici (48 ml 1M HCl; 36,6 g Tris a 0,23 ml TEMED bylo doplněno do 100 ml a pH bylo upraveno na 8,9) Zásobní roztok B: již k dispozici (28,0 g akrylamidu a 0,74 g BIS bylo doplněno na 100 ml) (POZOR JED!) 0,14% peroxodisíranu amonného Zásobní elektrodový pufr: (6,0 g Tris; 28,8 g glycinu; doplněno destilovanou vodou na 1 l, pH upraveno na 8,3). Před použitím řeďte 1:9 (50ml zásobního pufru + 450 ml destil. vody) Sacharosa Roztok pro detekci bílkovin: již k dispozici (1g amidočerni ve 100 ml 7% kyseliny octové) Odbarvovací roztok: 7% kyselina octová 0,005% roztok bromfenolové modři v destilované vodě: již k dispozici Enzym: 2 mg LDH rozpusťte ve 150 μl 20% roztoku sacharosy Chemikálie pro detekci LDH 1 M Tris-HCl pufr (pH 8,2): již k dispozici

40

4 Elektroforetické metody Biochemické praktikum I, katedra biochemie, PřF UK v Praze, 2015/2016 0,2 M laktát sodný Roztok I: již k dispozici (153 mg jodonitrotetrazoliové violeti s N-methylfenazoniummethylsulfátem rozpuštěno v 30 ml destilované vody) Roztok II: 10 mg NAD+ rozpusťte v 0,3 ml destilované vody a přidejte 1,7 ml roztoku I. Pracovní postup Příprava gelu: 1,5 ml roztoku A, 3 ml roztoku B, 1,5 ml vody a 6 ml roztoku 0,14 % peroxodisíranu dobře promíchejte a ihned pipetujte do 4 suchých skleněných trubiček zdola dobře uzavřených parafilmem. Polymerační roztok má dosahovat téměř k okraji trubičky a ihned převrstvěte opatrně vodou, aby povrch vzniklého gelu byl rovný. Polymerace probíhá při laboratorní teplotě. Po skončení polymerace odstraňte parafilm ze spodní části trubiček. Provedení elektroforézy: Vodu z polymerovaných gelů odsajte pomocí filtračního papíru. Trubičky opatrně zasuňte do otvorů elektroforetické nádoby a nalijte elektrodový pufr do horní i spodní nádoby tak, aby byly ponořeny oba okraje trubiček. Do horní nádoby přidejte 30 μl bromfenolové modři. Na každou trubičku podvrstvením aplikujte (pipetou) 30 l vzorku, přímo na povrch gelu, který je ponořený pod elektrodovým pufrem. Připravenou nádobu na elektroforézu spojte pod dohledem asistenta se zdrojem stejnosměrného proudu, horní nádobu se záporným pólem, dolní s kladným pólem. Intenzitu proudu nastavte na hodnotu 2 mA na trubičku, po 15 minutách na 5 mA. Po skončení elektroforézy (čelo bromfenolové modři již je na úplném konci trubičky), elektroforézu odpojte opět pod dohledem asistenta. Teprve potom vyjměte trubičky z aparatury a gely uvolněte z trubiček pomocí jehly a injekční stříkačky naplněné vodou. Na dvou gelech detekujte bílkoviny, na dalších dvou gelech specificky pouze enzym. Detekce bílkovin: Gely vložte na 15 minut do roztoku amidočerni (ve zkumavce). Potom amidočerň slijte zpět do zásobní láhve, gely opláchněte vodou a vložte přes noc do odbarvovacího roztoku (7 % kyselina octová ve 400 ml kádince na magnetické míchačce). Bílkoviny gelu zůstávají obarveny amidočerní, zatímco ostatní části gelu se odbarví, která se podle potřeby několikrát vymění. Detekce LDH: Připravte si inkubační roztok následujícího složení: 2 ml 1 M Tris-HCl pufru (pH 8,2); 5 ml 0,2 M laktátu sodného; 1 ml destilované vody a 2 ml roztoku II. V tomto roztoku gely inkubujte ve zkumavkách při 37°C (vodní termostat), dokud se neobjeví proužky značící aktivitu LDH. Enzymovou reakci zastavte vložením do roztoku 0,1 M HCl a po dalších 15 minutách vložte do destilované. Vyhodnocení výsledků 1. Zaznamenejte počet obarvených proužků, odpovídajících přítomnosti bílkovin (po detekci amidočerní), či přítomnosti laktátdehydrogenasy (po specifické detekci aktivity LDH). 2. Změřte vzdálenost jednotlivých proužků od startu a překreslete do protokolu. 3. Diskutujte souvislost počtu proužků s přítomností izoforem LDH v živočišných tkáních. Kontrolní otázky 1. Lze enzym stejným způsobem detekovat v gelu i v případě SDS elektroforézy? 2. V kolika izoenzymech se LDH vyskytuje v živočišných tkáních? Poznámka Elektroforézu v nedenaturujícím prostředí lze rovněž provádět v deskovém uspořádání, gel se pak rozřízne na potřebný počet částí a je možné detekovat i další enzymy. 41

4 Elektroforetické metody Biochemické praktikum I, katedra biochemie, PřF UK v Praze, 2015/2016

4.3. Nativní elektroforéza enzymů v polyakrylamidovém gelu- peroxidasa Bílkoviny lze separovat v polyakrylamidovém gelu bez tenzidů (SDS) na základě jejich přirozeného náboje. V tomto uspořádání nedochází k denaturaci bílkovin a ke ztrátě enzymové aktivity, která může být využita k detekci příslušného enzymu. V rostlinách jako např. v křenu se peroxidasa nachází v celé skupině izoenzymů. Dosud bylo izolováno a charakterizováno 15 izoenzymů, které se rozdělují podle pI na 3 kyselé izoenzymy, 5 neutrálních a 6 bazických. Izoelektrickou fokusací však může být detekováno 42 izoenzymů. Tím, že peroxidasy rozkládají peroxid vodíku na vodu pomocí oxidace různých substrátů, podílejí se především na antioxidační ochraně rostliny před působením oxidativního stresu. Peroxidasa (donor: H2O2-oxidoreduktasa, EC 1.11.1.7) katalyzuje oxidaci různých látek (např. fenolů, aminů) peroxidem vodíku podle rovnice RH2 + H2 O2 → R + 2H2 O Cíle 1. Proveďte nativní elektroforetickou separaci enzymového peroxidasy. 2. V gelu specificky detekujte aktivitu peroxidasy a přítomnost bílkoviny, vyhodnoťte počet proužků. Chemikálie Zásobní roztok A: již k dispozici (48 ml 1M HCl; 36,6 g Tris a 0,23 ml TEMED bylo doplněno do 100 ml a pH bylo upraveno na 8,9) Zásobní roztok B: již k dispozici (28,0 g akrylamidu a 0,74 g BIS bylo doplněno na 100 ml) (POZOR JED!) 0,14% peroxodisíran amonný Zásobní elektrodový pufr: (6,0 g Tris; 28,8 g glycinu; doplněno destilovanou vodou na 1 l, pH upraveno na 8,3). Před použitím řeďte 1:9 (50ml zásobního pufru + 450 ml destil. vody) Sacharosa Roztok pro detekci bílkovin: již k dispozici (1g amidočerni ve 100 ml 7% kyseliny octové) Odbarvovací roztok: 7% kyselina octová 0,001% roztok bromfenolové modři v destilované vodě: již k dispozici Enzym: 1 g nastrouhaného křenu rozetřete s 5 ml 0,15 M NaCl, přefiltrujte přes skládaný filtr a přidejte pevnou sacharosu tak, aby její výsledná koncentrace byla 20 %. Detekční činidlo pro peroxidasu: 0,01 g 3,3´-dimethylbenzidinu (POZOR KARCINOGEN – vždy používejte ochranné pomůcky) rozpusťte v kalibrované zkumavce v 2,5 ml destilovaného ethanolu, přidejte 7 ml 0,1 mol/l fosfátového pufru pH 7,0; 0,1 ml 30% H2O2; doplňte pufrem na 10 ml a roztok přefiltrujte. Tento roztok si připravte až těsně před použitím. Pracovní postup Příprava gelu: 1,5 ml roztoku A, 3 ml roztoku B, 1,5 ml vody a 6 ml roztoku 0,14 % peroxodisíranu dobře promíchejte a ihned pipetujte do 4 suchých skleněných trubiček zdola dobře uzavřených parafilmem. Polymerační roztok má dosahovat asi 1 cm pod okraj trubičky a ihned se převrství opatrně vodou, aby povrch vzniklého gelu byl rovný. Polymerace probíhá při laboratorní teplotě. Po skončení polymerace odstraňte parafilm ze spodní části trubiček.

42

4 Elektroforetické metody Biochemické praktikum I, katedra biochemie, PřF UK v Praze, 2015/2016 Provedení elektroforézy: Vodu z polymerovaných gelů odsajte pomocí filtračního papíru. Trubičky opatrně zasuňte do otvorů elektroforetické nádoby a nalijte elektrodový pufr do horní i spodní nádoby tak, aby byly ponořeny oba okraje trubiček. Do horní nádoby přidejte 0.1 ml bromfenolové modři. Na každou trubičku podvrstvením aplikujte (pipetou) 30 l vzorku, přímo na povrch gelu, který je ponořený pod elektrodovým pufrem. Připravenou nádobu na elektroforézu spojte pod dohledem asistenta se zdrojem stejnosměrného proudu, horní nádobu se záporným pólem, dolní s kladným pólem. Intenzitu proudu nastavte na hodnotu 2 mA na trubičku, po 15 minutách na 5 mA. Po skončení elektroforézy (čelo bromfenolové modři již je na úplném konci trubičky), elektroforézu odpojte opět pod dohledem asistenta. Teprve potom vyjměte trubičky z aparatury a gely uvolněte z trubiček pomocí jehly a injekční stříkačky naplněné vodou. Na dvou gelech detekujte bílkoviny, na dalších dvou gelech specificky pouze enzym. Detekce bílkovin: Gely vložte na 15 minut do roztoku amidočerni (ve zkumavce). Potom amidočerň slijte zpět do zásobní láhve, gely opláchněte vodou a vložte přes noc do odbarvovacího roztoku (7 % kyselina octová ve 400 ml kádince na magnetické míchačce). Bílkoviny gelu zůstávají obarveny amidočerní, zatímco ostatní části gelu se odbarví, která se podle potřeby několikrát vymění. Detekce peroxidasy: Gely vložte do detekčního činidla a inkubujte při 37°C dokud se neobjeví proužek (proužky), značící aktivitu peroxidasy. Po dostatečném obarvení gely převeďte do destilované vody. Vyhodnocení výsledků 1. Zaznamenejte počet obarvených proužků, odpovídajících přítomnosti bílkovin (po detekci amidočerní), či přítomnosti peroxidasy (po specifické detekci aktivity peroxidasy). 2. Změřte vzdálenost jednotlivých proužků od startu a překreslete do protokolu. 3. Diskutujte souvislost počtu proužků s přítomností izoforem peroxidasy v rostlinách. Kontrolní otázky 1. Lze enzym stejným způsobem detekovat v gelu i v případě SDS elektroforézy? 2. V kolika izoenzymech se peroxidasa vyskytuje v křenu? Poznámka Elektroforézu v nedenaturujícím prostředí lze rovněž provádět v deskovém uspořádání, gel se pak rozřízne na potřebný počet částí a je možné detekovat i další enzymy.

43

5 Charakterizace enzymů Biochemické praktikum I, katedra biochemie, PřF UK v Praze, 2015/2016

5. CHARAKTERIZACE ENZYMŮ Enzymy jsou bílkoviny, které katalyzují chemické reakce probíhající v živých organismech. Klasifikace enzymů Vzhledem k tomu, že rychle stoupá počet známých enzymů, byl zaveden mezinárodně uznávaný systém jejich klasifikace i názvosloví. Enzymy byly rozděleny do šesti hlavních tříd podle typu chemické reakce, kterou katalyzují, a každému byl současně přidělen čtyřčíselný kód a systematický název. l. třída: oxidoreduktasy - katalyzují oxidoredukční reakce. 2. třída: transferasy - katalyzují přenos skupin. 3. třída: hydrolasy - katalyzují hydrolytické štěpení vazeb. 4. třída: lyasy (synthasy) - katalyzují nehydrolytické štěpení za vzniku dvojných vazeb nebo naopak adici na dvojné vazby. 5. třída: isomerasy - katalyzují geometrické a strukturální změny uvnitř jedné molekuly. 6. třída: ligasy (synthetasy) - katalyzují slučování molekul spojené s hydrolýzou pyrofosfátové vazby např. v ATP. Příklady názvosloví enzymů uvádí následující tabulka: Triviální název

Systematický název

Laktátdehydrogenasa L-laktát: NAD+ - oxidoreduktasa Hexokinasa

ATP: hexosa - fosfotransferasa

Reakce L − Laktát + NAD+ → pyruvát + NADH + H + ATP + D-Glc → ADP + D-Glc-6-P

Kód 1.1.1.27 2.7.1.1.

Kinetika enzymové reakce Enzymy jako katalyzátory urychlují průběh chemických reakcí v organismu. Je třeba zdůraznit, že pouze urychlují dosažení rovnováhy mezi výchozími látkami (substráty) a produkty tím, že snižují aktivační energii nutnou k tomu, aby reakce proběhla, složení rovnovážné směsi však neovlivňují. Pro enzymové reakce platí obecná pravidla kinetiky chemických reakcí, ale specifickým rysem těchto reakcí je tzv. saturace substrátem. Tento jev, pozorovaný nejprve experimentálně vedl Michaelise a Mentenovou (1913) k navržení nejjednoduššího mechanismu enzymové reakce. Enzymová reakce probíhá tak, že enzym reaguje nejprve se substrátem (S) za vzniku komplexu enzym-substrát (ES), který se teprve ve druhé fázi reakce štěpí na enzym a produkt (P). 𝑘1

𝑘2 → 𝐸+𝑆 𝐸𝑆 → 𝐸 + 𝑃 ← 𝑘−1

Pro počáteční rychlost (v) takové reakce platí za předpokladu, že je reakce v ustáleném stavu, tzn. že koncentrace komplexu ES je konstantní a že koncentrace substrátu S je mnohem větší než koncentrace enzymu E, rovnice Michaelise a Mentenové: 𝑣=

𝑉𝑚𝑎𝑥 ∙ [𝑆] 𝐾𝑚 + [𝑆]

44

5 Charakterizace enzymů Biochemické praktikum I, katedra biochemie, PřF UK v Praze, 2015/2016 kde Vmax je maximální rychlost reakce a 𝐾𝑚 =

𝑘−1 +𝑘2 𝑘1

je tzv. Michaelisova konstanta, která

charakterizuje afinitu enzymu k danému substrátu. Rovnice Michaelise a Mentenové je rovnice hyperboly, která velmi dobře vyhovuje experimentálním zjištěním pro mnoho enzymů.

Důležitý vztah vyplyne v případě, že se rychlost reakce rovná polovině maximální rychlosti: 𝑣=

𝑉𝑚𝑎𝑥

𝑉𝑚𝑎𝑥

2

2

=

𝑉𝑚𝑎𝑥 ∙[𝑆] 𝐾𝑚 +[𝑆]

a z toho plyne, že 𝐾𝑚 = [𝑆]

To znamená, že Km se rovná koncentraci substrátu, při které je počáteční rychlost reakce právě polovina maximální rychlosti. Z toho také vyplývá, že Km odpovídá koncentraci substrátu, při které je enzym právě z poloviny nasycen substrátem. Její rozměr je molarita nebo mol·l-1. V oblasti nízkých koncentrací substrátu, když je [S]<
𝑉𝑚𝑎𝑥 ∙ [𝑆] = 𝑘𝑜𝑛𝑠𝑡 ∙ [𝑆] 𝐾𝑚

což je rovnice pro reakci 1. řádu. Když je koncentrace substrátu vysoká ([S]>>Km), přechází rovnice na: 𝑣=

𝑉𝑚𝑎𝑥 ∙ [𝑆] = 𝑉𝑚𝑎𝑥 = 𝑘𝑜𝑛𝑠𝑡 [𝑆]

Za těchto podmínek má tedy enzymová reakce kinetiku nultého řádu. Když je koncentrace substrátu mezi těmito mezními hodnotami (0,01Km<[S]<100Km), platí pro enzymovou reakci právě rovnice Michaelise a Mentenové a reakce má kinetiku smíšenou 0. a 1. řádu.

45

5 Charakterizace enzymů Biochemické praktikum I, katedra biochemie, PřF UK v Praze, 2015/2016 Grafické určování Km a Vmax

Jednoduchými úpravami lze rovnici Michaelise a Mentenové, tj. rovnici hyperboly převést na rovnici přímky. Tuto užitečnou úpravu navrhli Lineweaver a Burk: 1 𝐾𝑚 1 1 = ∙ + 𝑣 𝑉𝑚𝑎𝑥 [𝑆] 𝑉𝑚𝑎𝑥 Grafické znázornění této rovnice je na obrázku. Směrnice závislosti 1/v na 1/[S] je dána výrazem Km/Vmax; úsek, který přímka vytíná na ose 1/v se rovná 1/Vmax a úsek na ose 1/[S] odpovídá -1/Km. Této metody se často využívá pro stanovení hodnot Km a Vmax zkoumané dvojice enzym-substrát. Přesnější hodnoty lze získat nelineární regresí, pomocí specializovaných programů, případně pomocí programu Excel, doplňku řešitel. Vliv koncentrace vodíkových iontů na enzymovou reakci Koncentrace H+ má značný vliv na rychlost enzymové reakce. U většiny enzymů má závislost rychlosti reakce na pH tvar křivky s maximem. pH odpovídající maximu aktivity se označuje jako pH optimum. Účinek vodíkových iontů na enzymy je záležitost poměrně složitá, zjednodušeně lze však říci, že je podmíněn amfoterním charakterem bílkovinné části enzymové molekuly. Hodnota pH optima pro určitou dvojici enzym - substrát závisí především na pK ionizujících skupin v aktivním centru enzymu a pK funkčních skupin substrátu. Inhibice enzymů Některé látky ovlivňují rychlost enzymových reakcí. Když dojde ke snížení rychlosti, mluvíme o inhibici, při zvýšení rychlosti o aktivaci. V zásadě může být inhibice reversibilní či irreversibilní. Irreversibilní inhibice v podstatě znamená kovalentní modifikaci funkčních skupin enzymu nebo jeho destrukci. Dále se bude mluvit pouze o inhibici reversibilní. U inhibovaných reakcí se uvádí tzv. "stupeň inhibice (i), který je definován vztahem: 𝑣 − 𝑣𝑖 𝑖= 𝑣 kde v je rychlost neinhibované reakce a vi reakce inhibované. Pak mohou nastat tři situace: 1. stupeň inhibice není ovlivňován koncentrací substrátu. Tento typ inhibice se označuje jako nekompetitivní, 2. stupeň inhibice se snižuje, když koncentrace substrátu vzrůstá – inhibice kompetitivní, 46

5 Charakterizace enzymů Biochemické praktikum I, katedra biochemie, PřF UK v Praze, 2015/2016 3. stupeň inhibice se zvyšuje, když koncentrace substrátu vzrůstá – inhibice akompetitivní. Rovnice, které platí pro rychlost inhibovaných reakcí a tvar závislosti 1/v na 1/[S] udává následující obrázek.

Inhibiční konstanta Ki charakterizuje vztah mezi enzymem a inhibitorem, je to vlastně disociační konstanta komplexu enzym-inhibitor (EI). 𝐸 + 𝐼 ↔ 𝐸𝐼, 𝐾𝑖 =

[𝐸] ∙ [𝐼] [𝐸𝐼]

Z tvaru závislosti 1/v na 1/ [S] při různých koncentracích inhibitoru lze i rozhodnout, o jaký typ inhibice jde. Hodnotu inhibiční konstanty je pak nutné vypočítat pomocí příslušné rovnice. 47

5 Charakterizace enzymů Biochemické praktikum I, katedra biochemie, PřF UK v Praze, 2015/2016 Jednotka enzymové aktivity Množství enzymu v roztoku lze určit kvantitativně prostřednictvím jeho katalytické aktivity. Předem je však třeba znát: 1. chemickou podstatu a stechiometrii reakce, kterou enzym katalyzuje, 2. zda enzym vyžaduje pro svou funkci kofaktor, 3. Km pro dvojici enzym - substrát, případně enzym - koenzym, 4. pH optimum enzymu, 5. vliv teploty na aktivitu i stabilitu enzymu, 6. jednoduchou analytickou metodu pro sledování úbytku substrátu nebo vzniku produktu. Aktivita enzymu se má měřit při jeho pH optimu a při saturační koncentraci substrátu, kdy reakce probíhá kinetikou nultého řádu vzhledem k substrátu. Za těchto podmínek je aktivita enzymu (rychlost reakce) úměrná pouze jeho koncentraci. Standardní jednotka enzymové aktivity je takové množství enzymu, které katalyzuje přeměnu l molu (10-6 molu) substrátu za minutu při 25°C a pH optimu. Označuje se U (z angl. unit). Nověji se zavádí pro vyjádření aktivity jednotka katal, definovaná jako takové množství aktivity, které přemění 1 mol substrátu za 1 sekundu. 1 𝑘𝑎𝑡 = 1 𝑚𝑜𝑙 ∙ 𝑠 −1 = 60 𝑚𝑜𝑙 ∙ 𝑚𝑖𝑛−1 = 60 ∙ 106 𝜇𝑚𝑜𝑙 ∙ 𝑚𝑖𝑛−1 , 1 𝑘𝑎𝑡 = 6 ∙ 107 𝑈 Koncentrace enzymu se pak vyjadřuje v jednotkách vztažených na jednotku objemu (U/ml). Mírou čistoty enzymového preparátu je tzv. specifická aktivita vyjádřená v jednotkách aktivity vztažených na množství bílkovin v roztoku (U/mg). U enzymů se známou molekulovou hmotností lze pak ještě zjistit tzv. aktivitu katalytického centra (nebo číslo přeměny – TN z angl. turnover number), které udává počet molekul substrátu přeměněných jednou molekulou enzymu (jedním aktivním centrem) za jednu minutu. Měření aktivity enzymu Počáteční rychlost reakce se měří sledováním úbytku substrátu nebo tvorby produktu s časem. Počáteční rychlost, pro kterou platí rovnice Michaelise a Mentenové, je definována jako rychlost v čase nula, před tím než vznikl jakýkoliv produkt. Experimentálně je velmi obtížné takto určit rychlost z několika důvodů. Čas potřebný k promíchání reakčních složek a změření koncentrace není nikdy nulový. Proto se rychlost určuje jako množství substrátu přeměněného za určitý čas, ale pouze v oblasti času, kdy je změna koncentrace měřené reakční složky s časem lineární. Pouze v čase od 0 do t1 lze měřit počáteční rychlost enzymové reakce.

48

5 Charakterizace enzymů Biochemické praktikum I, katedra biochemie, PřF UK v Praze, 2015/2016

Před zahájením enzymové reakce je nutné 6 až 10 minut vytemperovat odděleně všechny reakční složky směsi na určenou teplotu. Při krátkých dobách inkubace záleží na přesném okamžiku zahájení pokusu. Měření enzymové aktivity může být kontinuální, změna vlastností, ke které dochází při přeměně substrátu na produkty, může být při reakci sledována kontinuálně, například měřením absorbance. V některých případech kontinuální (kinetická) metoda není možná, pak musí být reakce po určité době zastavena a stanovena koncentrace substrátů nebo produktů. Často je při této metodě nutno zařadit další separační krok. Enzymová reakce se zastavuje nejčastěji denaturací enzymu výraznou změnou pH nebo přidáním inhibitoru. Také mnohonásobným zředěním reakční směsi se sníží na minimum rychlost reakce. Není vhodné zastavovat enzymovou reakci povařením, zvláště u velmi aktivních enzymů. V krátkém období, než enzym tepelně denaturuje, probíhá reakce nekontrolovatelnou rychlostí. Proto také při pokusech s tepelně denaturovaným enzymem je třeba vždy zahřívat enzym bez substrátu

49

5 Charakterizace enzymů Biochemické praktikum I, katedra biochemie, PřF UK v Praze, 2015/2016

5.1. Stanovení Michaelisových konstant alkoholdehydrogenasy (ADH) Alkoholdehydrogenasa (alkohol : NAD+ - oxidoreduktasa, E.C. 1.1.1.1) katalyzuje reverzibilní oxidaci ethanolu, popřípadě vyšších alkoholů:

Protože substrát i koenzym jsou v této reakci ve stechiometrickém množství, pro kinetické studie lze tuto reakci považovat za dvousubstrátovou. Pro oba substráty můžeme stanovit Michaelisovu konstantu ze závislosti rychlosti reakce na koncentraci příslušného substrátu, pokud bude druhý substrát v saturační koncentraci. Redukovaný koenzym NADH má, narozdíl od neredukovaného, výrazné absorpční maximum při 340 nm. Rychlost reakce sledujeme jako přírůstek absorbance při 340 nm. Cíl Určit Michaelisovu konstantu a maximální rychlost ADH pro ethanol, NAD+ a propanol. Chemikálie 10 mM NAD+: již připravené množství NAD+ (7 mg) rozpusťte v 1 ml destilované vody 1 M ethanol 1 M propanol 0,1 M fosfátový pufr pH 8,5 suspenze alkoholdehydrogenasy Postup Zjistit vhodné ředění ADH: Enzymový preparát zřeďte 10x (0,5 ml enzymového preparátu a 4,5 ml destilované vody). Přímo do spektrofotometrické kyvety pipetujte tyto roztoky: 0,3 ml 0,1 M fosfátového pufru (pH 8,5), 0,1 ml 10 mM NAD+, 0,2 ml 1 M ethanolu, 1,8 ml destilované vody. Enzymovou reakci startujte přidáním 0,1 ml roztoku zředěného enzymového preparátu, promíchejte a ihned měřte absorbanci při 340 nm. Absorbanci měřte po dobu 2 minut a její hodnotu odečítejte v 15 sekundových intervalech. Jestliže přírůstek absorbance mezi jednotlivými časovými intervaly není konstantní, je třeba enzymový preparát ještě zředit. Takto připravený enzym budete používat pro kinetická měření v této úloze. Stanovení Michaelisovy konstanty ADH pro ethanol: Přímo do spektrofotometrické kyvety pipetujte roztoky podle následující tabulky: č. měření 1. 2. 3. 4. 5. 6.

pufr (ml) 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3

roztok ethanolu (ml) 0,01 0,02 0,05 0,1 0,2 0,3

50

roztok NAD+ (ml) 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1

voda (ml) 1,99 1,98 1,95 1,90 1,80 1,70

5 Charakterizace enzymů Biochemické praktikum I, katedra biochemie, PřF UK v Praze, 2015/2016 Enzymovou reakci iniciujte přidáním 0,1 ml roztoku enzymu, promíchejte a ihned měřte absorbanci při 340 nm. Stejným způsobem proveďte měření pro všechny koncentrace ethanolu. Počáteční rychlost reakce je úměrná změně absorbance za 1 minutu. Stanovení Michelisovy konstanty ADH pro propanol: Přímo do spektrofotometrické kyvety pipetujte roztoky podle následující tabulky: č. Měření 1. 2. 3. 4. 5. 6.

pufr (ml) 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3

roztok propanolu (ml) 0,01 0,02 0,05 0,1 0,2 0,3

roztok NAD+ (ml) 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1

voda (ml) 1,99 1,98 1,95 1,90 1,80 1,70

Enzymovou reakci iniciujte přidáním 0,1 ml roztoku enzymu a postupujte stejně jako při stanovení Michaelisovy konstanty pro ethanol. Stanovení Michaelisovy konstanty pro NAD+: Přímo do spektrofotometrické kyvety pipetujte roztoky podle následující tabulky: č. Měření 1. 2. 3. 4. 5. 6.

pufr (ml) 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3

roztok ethanolu (ml) 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2

roztok NAD+ (ml) 0,01 0,02 0,03 0,05 0,10 0,20

voda (ml) 1,89 1,88 1,87 1,85 1,80 1,70

Enzymovou reakci iniciujte přidáním 0,1 ml roztoku enzymu a postupujte stejně jako při stanovení Michaelisovy konstanty pro ethanol. Zpracování výsledků 1. Zaznamenejte do tabulky rychlost reakce katalyzované ADH při příslušných výsledných koncentracích všech substrátů (ethanol, NAD+, propanol) a to jak v podobě změny absorbance za 2 minuty, tak v mol.min-1.ml-1 (neboli U.ml-1), jestliže znáte molární absorpční koeficient NADH  = 6 300 mol-1.l.cm-1. Rychlost reakce (v) (vztaženou na 1 ml enzymového preparátu) vypočítáme podle vzorce 𝑣 = 1000 ∙

∆𝐴340 ∙ 𝑉𝑡 [μmol ∙ min−1 ∙ ml−1 ] 𝜀 ∙ 𝑙 ∙ 𝑉𝑒 ∙ 𝑡

kde Vt je celkový (total) objem reakční směsi v kyvetě (ml), Ve objem enzymového preparátu v kyvetě (ml), t čas (min.), A340 změna absorbance), ke které došlo za čas t a  molární absorpční koeficient NADH = 6 300 mol-1.l.cm-1. 2. Sestrojte grafy závislosti rychlosti reakce katalyzované ADH na koncentraci ethanolu, NAD+ a propanolu. 3. Určete Michaelisovu konstantu Km a maximální rychlost reakce Vmax ADH pro ethanol, NAD+ a propanol z dvojitého reciprokého vynesení podle Lineweavera a Burka nebo pomocí nelineární regrese.

51

5 Charakterizace enzymů Biochemické praktikum I, katedra biochemie, PřF UK v Praze, 2015/2016 Postup vyhodnocení Km nelineární regresí: V Excelu si připravte 2 buňky pro Km a Vmax, do kterých zadáte odhad (v našem případě buňka B1 a B2). Potom do 1. sloupce (A) vyplňte všechny hodnoty koncentrace substrátu, které jste použili, do 2. sloupce (B) hodnoty příslušné rychlosti reakce, kterou jste pro danou koncentraci substrátu naměřili (případně vypočítali). Do 3. sloupce (C) vložte vzorec pro výpočet rychlosti reakce = Vmax.[S]/(Km+[S]) neboli =$B$2*A4/($B$1+A4) a kopírujte pro všechny hodnoty koncentrace substrátu. Do 4. sloupce (D) vložte vzorec pro výpočet chyby mezi naměřenou a vypočtenou hodnotou = (νteor- ν)^2 neboli (C4-B4)^2. Sečtěte všechny chyby v buňce pod tabulkou (např. buňka D10). Nyní v záložce DATA využijte doplněk řešitel a jako účelovou funkci (ve starších verzích cílovou buňku) zadejte D10 (aby součet všech chyb) byl = 0 měněním buněk B1 a B2 (označíte obě buňky najednou v okně proměnné modelu). Pak už dáte pouze řešit a výsledek by se měl objevit namísto původních odhadů. Vypočtené hodnoty Km a Vmax pak lze využít i k proložení naměřených hodnot. Do jiného sloupce např. E zadáte koncentraci substrátu, tentokrát ale podrobně např. krok 0,01, v sloupci F opět spočítáte rychlost reakce: =$B$2*E4/($B$1+E4) pro všechny zadané hodnoty. Do grafu závislosti rychlosti reakce na koncentraci substrátu (osa x: A, osa y B) pak přidáte další řadu (zdrojová data osa x: E, osa y F, u které nedáte zobrazit body, ale pouze čáru-s dostatečným počtem hodnot bude hladká a bude mít tvar podle Michaelise-Mentenové. A B C D E F 1 Km mM 2 Vmax µmol·min-1·ml-1 3 [S] (mM) ν naměřená ν vypočtená chyba [S] (mM) ν vypočtená Kontrolní otázky 1. Proč je třeba zředit enzymový preparát v případě, že přírůstek absorbance není konstantní? 2. Který z obou alkoholů je lepším substrátem ADH? 3. Víte, zda se ADH rovněž podílí na metabolismu methanolu? Poznámka Nemáme-li k dispozici spektrofotometr pro UV oblast, lze sledovat koncentraci koenzymu NADH i ve skleněných kyvetách při 366 nm, stanovení je však méně citlivé.

52

5 Charakterizace enzymů Biochemické praktikum I, katedra biochemie, PřF UK v Praze, 2015/2016

5.2. Laktátdehydrogenasa – Michaelisovy konstanty pro laktát a NAD+ Laktátdehydrogenasa (L-laktát : NAD+ - oxidoreduktasa E.C. 1.1.1.27) katalyzuje reakci

Protože substrát i koenzym jsou v této reakci ve stechiometrickém množství, pro kinetické studie lze tuto reakci považovat za dvousubstrátovou. Pro oba substráty je možné stanovit Michaelisovu konstantu Km a maximální rychlost Vmax ze závislosti rychlosti reakce na koncentraci příslušného substrátu, pokud bude druhý substrát v saturační koncentraci. Rychlost reakce lze např. určit sledováním tvorby pyruvátu v reakční směsi, která obsahuje laktát, NAD+ a enzym. Pyruvát se stanovuje spektrofotometricky ve formě barevného hydrazonu. Cíl Určit Michaelisovu konstantu a maximální rychlost LDH pro laktát a NAD+. Chemikálie a vybavení 0,9 M laktát sodný 0,3 mM pyruvát 3 mM NAD+ již připravené množství NAD+ rozpusťte ve 3ml destilované vody 0,1 M Tris-HCl pufr (pH 9,0) 0,4 M NaOH. roztok dinitrofenylhydrazinu: 0,1 g 2,4-dinitrofenylhydrazinu rozpusťte ve 100 ml 2 M HCl. roztok enzymu: 4 mg lyofilizované laktátdehydrogenasy z hovězího srdce rozpusťte v 10 ml vody, před použitím tento roztok řeďte 5 - 10 krát. Spektrofotometr, termostatovaná lázeň Postup Kalibrace množství pyruvátu v reakční směsi: Do pěti zkumavek pipetujte nejprve 0,3 mM roztok pyruvátu podle následujícího schématu: Zkumavka 1 2 3 4 5 ml pyruvátu 0 0,10 0,20 0,30 0,40 ml vody 0,45 0,35 0,25 0,15 0,05 Do každé zkumavky pak přidejte 0,25 ml roztoku dinitrofenylhydrazinu, promíchejte a nechte stát 20 minut. Pak přidejte 2,5 ml roztoku hydroxidu sodného a po 20 minutách změřte absorbance proti slepému vzorku při 505 nm. Ze získaných hodnot sestavte kalibrační graf závislosti absorbance barevného komplexu na množství pyruvátu. Stanovení Michaelisovy konstanty pro nikotinamidadenindinukleotid (NAD+): Podle následujícího schématu pipetujte roztoky do zkumavek:

53

5 Charakterizace enzymů Biochemické praktikum I, katedra biochemie, PřF UK v Praze, 2015/2016 č. zkumavky 1 2 3 4 5 6 slepý pokus

roztok laktátu (ml) 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1

roztok NAD+ (ml) 0,02 0,05 0,08 0,10 0,15 0,15

voda (ml) 0,13 0,10 0,07 0,05 -----

pufr (ml) 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1

Zkumavky umístěte do vodní lázně termostatované na 37 °C a nechte 5 minut vytemperovat. Do zkumavek 1 až 5 pak v třicetisekundových intervalech pipetujte 0,1 ml roztoku enzymu a zkumavky inkubujte při 37 °C. Po 15 minutách přesně opět v třicetisekundových intervalech pipetujte do každé zkumavky, včetně slepého pokusu (č. 6), 0,25 ml roztoku dinitrofenylhydrazinu. Nakonec přidejte ještě 0,1 ml roztoku enzymu do zkumavky č. 6. Zkumavky nyní nechte stát při laboratorní teplotě 20 minut a pak do každé přidejte 2,5 ml roztoku NaOH. Po dalších 20 minutách stání změřte absorbanci zkumavek l až 5 proti slepému pokusu při 505 nm. Poznámka: Naměřené hodnoty absorbance se musejí pohybovat v rozmezí 0,05 až 0,30; v případě, že jsou hodnoty vyšší (nad 0,3), je třeba pokus opakovat s roztokem enzymu, který se ještě zředí. V opačném případě je třeba pracovat s méně zředěným roztokem enzymu. Stanovení Michaelisovy konstanty pro laktát: Podle následující tabulky pipetujte roztoky do zkumavek. Poté postupujte jako v předchozím případě. č. zkumavky 1 2 3 4 5 6 slepý pokus

roztok laktátu (ml) 0,01 0,02 0,04 0,05 0,10 0,10

roztok NAD+ (ml) 0,15 0,15 0,15 0,15 0,15 0,15

voda (ml) 0,09 0,08 0,06 0,05 -----

pufr (ml) 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1

Zpracování výsledků 1. Sestrojte kalibrační přímku závislosti absorbance při 505 nm na látkovém množství standardních roztoků pyruvátu vyjádřeném v µmol. 2. Zaznamenejte do tabulky rychlost reakce katalyzované LDH při příslušných koncentracích laktátu a NAD+ v podobě výsledné absorbance při 505 nm a přepočítejte na µmol·min-1·ml-1 (neboli U.ml-1). K přepočtu využijte rovnici lineární regrese kalibrační přímky, ze které zjistíte kolik µmol pyruvátu odpovídá příslušné absorbanci. Rychlost reakce (ν) vztažená na 1 ml odpovídá: 𝜇𝑚𝑜𝑙 pyruvátu 𝑣= ∙ 10 ∙ ř𝑒𝑑ě𝑛í [μmol ∙ min−1 ∙ ml−1 ] 𝑡 t je čas, po který reagoval enzym se substrátem, 10× se násobí vzhledem k tomu, že v reakci je pouze 100 l. 3. Sestrojte grafy závislosti rychlosti reakce katalyzované LDH na koncentraci laktátu a NAD+. 4. Určete Michaelisovu konstantu Km a maximální rychlost reakce Vmax LDH pro laktát a NAD+ z dvojitého reciprokého vynesení podle Lineweavera a Burka nebo pomocí nelineární regrese (např. programem EXCEL). Postup vyhodnocení Km nelineární regresí: V Excelu si připravte 2 buňky pro Km a Vmax, do kterých zadáte odhad (v našem případě buňka B1 a B2). Potom do 1. sloupce (A) vyplňte 54

5 Charakterizace enzymů Biochemické praktikum I, katedra biochemie, PřF UK v Praze, 2015/2016 všechny hodnoty koncentrace substrátu, které jste použili, do 2. sloupce (B) hodnoty příslušné rychlosti reakce, kterou jste pro danou koncentraci substrátu naměřili (případně vypočítali). Do 3. sloupce (C) vložte vzorec pro výpočet rychlosti reakce = Vmax.[S]/(Km+[S]) neboli =$B$2*A4/($B$1+A4) a kopírujte pro všechny hodnoty koncentrace substrátu. Do 4. sloupce (D) vložte vzorec pro výpočet chyby mezi naměřenou a vypočtenou hodnotou = (νteor- ν)^2 neboli (C4-B4)^2. Sečtěte všechny chyby v buňce pod tabulkou (např. buňka D10). Nyní v záložce DATA využijte doplněk řešitel a jako účelovou funkci (ve starších verzích cílovou buňku) zadejte D10 (aby součet všech chyb) byl = 0 měněním buněk B1 a B2 (označíte obě buňky najednou v okně proměnné modelu). Pak už dáte pouze řešit a výsledek by se měl objevit namísto původních odhadů. Vypočtené hodnoty Km a Vmax pak lze využít i k proložení naměřených hodnot. Do jiného sloupce např. E zadáte koncentraci substrátu, tentokrát ale podrobně např. krok 0,01, v sloupci F opět spočítáte rychlost reakce: =$B$2*E4/($B$1+E4) pro všechny zadané hodnoty. Do grafu závislosti rychlosti reakce na koncentraci substrátu (osa x: A, osa y B) pak přidáte další řadu (zdrojová data osa x: E, osa y F, u které nedáte zobrazit body, ale pouze čáru-s dostatečným počtem hodnot bude hladká a bude mít tvar podle Michaelise-Mentenové. 1 2 3

A Km Vmax [S] (mM)

B

ν naměřená

C mM µmol·min-1·ml-1 ν vypočtená

D

E

F

chyba

[S] (mM)

ν vypočtená

Kontrolní otázky 1. Lze sledovat rychlost reakce katalyzované laktátdehydrogenasou jinak než měřením absorbance barevného hydrazonu? 2. V čem tkví hlavní výhoda výpočtu Km pomocí nelineární regrese ve srovnání s linearizovaným dvojnásobně reciprokým výnosem?

55

5 Charakterizace enzymů Biochemické praktikum I, katedra biochemie, PřF UK v Praze, 2015/2016

5.3. Laktátdehydrogenasa – stanovení Michaelisovy konstanty pro laktát a NAD+ na mikrotitrační destičce Laktátdehydrogenasa (L-laktát : NAD+ - oxidoreduktasa E.C. 1.1.1.27) katalyzuje reakci

Protože substrát i koenzym jsou v této reakci ve stechiometrickém množství, pro kinetické studie lze tuto reakci považovat za dvousubstrátovou. Pro oba substráty je možné stanovit Michaelisovu konstantu Km a maximální rychlost Vmax ze závislosti rychlosti reakce na koncentraci příslušného substrátu, pokud bude druhý substrát v saturační koncentraci. Rychlost reakce lze např. určit sledováním tvorby pyruvátu v reakční směsi, která obsahuje laktát, NAD+ a enzym. Pyruvát se stanovuje spektrofotometricky ve formě barevného hydrazonu. Cíl Určit Michaelisovu konstantu a maximální rychlost LDH pro laktát a NAD+. Chemikálie a vybavení 1 M laktát sodný 0,3 mM pyruvát 2,5 mM NAD+ již připravené množství NAD+ rozpusťte ve 3,6 ml destilované vody 0,1 M Tris-HCl pufr (pH 9,0) 0,4 M NaOH. roztok dinitrofenylhydrazinu: 0,1 g 2,4-dinitrofenylhydrazinu rozpuštěno ve 100 ml 2 M HCl, již k dispozici roztok enzymu: 4 mg lyofilizované laktátdehydrogenasy z hovězího srdce rozpusťte v 10 ml vody, tento roztok se dále ředí na vhodnou koncentraci (viz postup). termostat se suchou lázní mikrozkumavky mikrotitrační destička čtečka mikrotitračních destiček Postup Zjištění vhodného ředění enzymu pro další stanovení: Roztok 4 mg lyofilizované laktátdehydrogenasy rozpuštěné v 10 ml vody zřeďte 2×, 5× a 10×. Mikrozkumavky s neředěným, 2×, 5× a 10× ředěným enzymem temperujte asi 10 minut při 37°C v termostatu se suchou lázní. Do 8 Eppendorfových mikrozkumavek pipetujte základní reakční směs pro stanovení aktivity LDH: 20 μl 0,1M Tris-HCl pufru, pH 9; 20 μl 1M roztoku laktátu a 40 μl 2,5mM NAD+. Také tyto mikrozkumavky temperujte na 37°C. Polovina těchto reakcí bude sloužit jako slepý pokus, proto do 4 zkumavek ihned přidejte 55 μl 2,4-dinitrofenylhydrazinu, v jehož přítomnosti enzymová reakce neprobíhá, a poté 20 μl neředěného, 2×, 5× a 10× ředěného enzymu. Ve zbývajících 4 mikrozkumavkách s reakční směsí iniciujte enzymovou reakci přidáním 20 μl neředěného, 2×, 5× a 10× ředěného enzymu v 30 sekundových intervalech a inkubujte přesně 15 minut při 37°C. Reakce přesně po 15 minutách zastavte 55 μl 2,4-dinitrofenylhydrazinu. Po 20 minutách při laboratorní teplotě do reakční směsi přidejte do všech mikrozkumavek 550 μl 56

5 Charakterizace enzymů Biochemické praktikum I, katedra biochemie, PřF UK v Praze, 2015/2016 0,4M NaOH a po 10 minutách pipetujte ze všech zkumavek 200 μl na mikrotitrační destičku a změřte absorbanci při 492 nm pomocí čtečky destiček (Sunrise, Tecan). Od absorbance vzorků odečtěte absorbanci příslušného slepého pokusu. Pro další měření je vhodné takové ředění enzymu, které po stanovení aktivity poskytuje absorbanci 0,25-0,4. Další stanovení provádějte výhradně s tímto enzymovým preparátem. Vzorky Slepé pokusy č. 1 2 3 4 5 6 7 8 0,1 M Tris-HCl pufr 20 μl 20 μl 20 μl 20 μl 20 μl 20 μl 20 μl 20 μl 1 M laktát 20 μl 20 μl 20 μl 20 μl 20 μl 20 μl 20 μl 20 μl + 2,5 mM NAD 40 μl 40 μl 40 μl 40 μl 40 μl 40 μl 40 μl 40 μl dinitrofenylhydrazin 55 μl 55 μl 55 μl 55 μl temperování při 37°C (asi 5 minut) enzym neřeď. 2x 5x 10x neřeď. 2x 5x 10x inkubace přesně 15 min 37°C dinitrofenylhydrazin 55 μl 55 μl 55 μl 55 μl asi 20 minut (laboratorní teplota) 0,4 M NaOH 550 μl 550 μl 550 μl 550 μl 550 μl 550 μl 550 μl 550 μl po 10 min pipetovat po 200 μl v triplikátech na destičku, A(492 nm) Kalibrace množství pyruvátu v reakční směsi: Pracujte v duplikátech: Do dvakrát šesti zkumavek pipetujte nejprve 0,3 mM roztok pyruvátu a destilovanou vodu podle následujícího schématu: Zkumavka 1 μl pyruvátu 0 μl vody 100

2 20 80

3 40 60

4 60 40

5 80 20

6 100 0

Do každé zkumavky pak přidejte 0,25 ml roztoku dinitrofenylhydrazinu, promíchejte a nechte stát 20 minut. Pak přidejte 550 μl roztoku 0,4M NaOH a po 10 minutách pipetujte 200 μl na mikrotitrační destičku a pomocí čtečky destiček změřte absorbance při 492 nm. První dvojice slouží jako slepý pokus, o průměrnou absorbanci slepého pokusu se redukují průměrné absorbance vzorků. Ze získaných hodnot sestavte kalibrační graf závislosti výsledné absorbance barevného komplexu na látkovém množství pyruvátu. Případné velké rozdíly absorbancí v duplikátu konzultujte s vedením praktik. Příprava zásobních roztoků různých koncentrací NAD+: Z 2,5mM zásobního roztoku NAD+, který máte k dispozici, připravte 60 μl 0,25mM; 0,75mM; 1,25mM a 1,75mM zásobního roztoku do 4 mikrozkumavek. Stanovení Michaelisovy konstanty pro nikotinamidadenindinukleotid (NAD+): Opět pracujte v duplikátech. V mikrozkumavce si připravte premix obsahující čtrnáctinásobek 20 μl 1M laktátu (280 μl) a čtrnáctinásobek 20 μl 0,1M Tris-HCl pufru pH 9 (280 μl ). Premix pipetujte po 40 μl do dvakrát šesti mikrozkumavek. Dále přidejte příslušné zásobní roztoky NAD+ podle následujícího schématu:

57

5 Charakterizace enzymů Biochemické praktikum I, katedra biochemie, PřF UK v Praze, 2015/2016 č. Zkumavky 1 2 3 4 5 6 slepý pokus

premix (μl) 40 40 40 40 40 40

NAD+ 40 μl 0,25 mM 40 μl 0,75 mM 40 μl 1,25 mM 40 μl 1,75 mM 40 μl 2,5 mM 40 μl 2,5 mM

Mikrozkumavky umístěte do termostatu se suchou lázní na 37°C a nechte 5 minut temperovat. Do zkumavek 1 až 5 pak v třicetisekundových intervalech pipetujte 20 μl roztoku enzymu a mikrozkumavky inkubujte při 37°C přesně 15 minut. Zkumavka č. 6 slouží jako slepý pokus, kde reakce neproběhne, proto můžete ihned pipetovat 55 μl zastavovacího činidla 2,4-dinitrofenylhydrazinu. Po 15 minutách přesně opět v třicetisekundových intervalech zastavte enzymovou reakci pomocí 55 μl roztoku 2,4-dinitrofenylhydrazinu. Nakonec přidejte ještě 20 μl roztoku enzymu do zkumavky č. 6. Zkumavky nyní nechte stát při laboratorní teplotě 20 minut a pak do každé přidejte 550 μl roztoku 0,4M NaOH. Po dalších 10 minutách stání pipetujte reakční směs po 200 μl na mikrotitrační destičku a změřte absorbanci při 492 nm pomocí čtečky destiček. Šestá zkumavka, kde enzymová reakce neproběhla, slouží jako slepý pokus, o průměrnou absorbanci slepého pokusu se redukují průměrné absorbance vzorků 1-5. Případné velké rozdíly absorbancí v duplikátu konzultujte s vedením praktik. Příprava zásobních roztoků různých koncentrací laktátu: Z 1M zásobního roztoku laktátu, který máte k dispozici, připravte 100 μl 0,1M; 0,2M; 0,4M a 0,5M zásobní roztok do 4 mikrozkumavek. Stanovení Michaelisovy konstanty pro laktát: Opět pracujte v duplikátech. V mikrozkumavce si připravte premix obsahující čtrnáctinásobek 40 μl 2,5mM NAD+(560 μl) a čtrnáctinásobek 20 μl 0,1M Tris-HCl pufru pH 9 (280 μl). Premix pipetujte po 60 μl do dvakrát šesti mikrozkumavek. Dále přidejte příslušné zásobní roztoky laktátu podle následujícího schématu: č. Zkumavky 1 2 3 4 5 6 slepý pokus

premix (μl) 60 60 60 60 60 60

laktát 20 μl 0,1 M 20 μl 0,2 mM 20 μl 0,4 mM 20 μl 0,5 mM 20 μl 1 mM 20 μl 1 mM

Mikrozkumavky umístěte do termostatu se suchou lázní na 37°C a nechte 5 minut temperovat. Do zkumavek 1 až 5 pak v třicetisekundových intervalech pipetujte 20 μl roztoku enzymu a mikrozkumavky inkubujte při 37 °C přesně 15 minut. Zkumavka č. 6 slouží jako slepý pokus, kde reakce neproběhne, proto můžete ihned pipetovat 55 μl zastavovacího činidla 2,4-dinitrofenylhydrazinu. Po 15 minutách přesně opět v třicetisekundových intervalech zastavte enzymovou reakci pomocí 55 μl roztoku 2,4-dinitrofenylhydrazinu. Nakonec přidejte ještě 20 μl roztoku enzymu do zkumavky č. 6. Zkumavky nyní nechte stát při laboratorní teplotě 20 minut a pak do každé přidejte 550 μl roztoku 0,4 M NaOH. Po dalších 10 minutách stání pipetujte reakční směs po 200 μl na mikrotitrační destičku a změřte absorbanci při 492 nm pomocí čtečky absorbancí. Šestá zkumavka, kde enzymová reakce neproběhla, slouží jako slepý pokus, o průměrnou absorbanci slepého pokusu se redukují průměrné absorbance vzorků 1-5. Případné velké rozdíly absorbancí v duplikátu konzultujte s vedením praktik.

58

5 Charakterizace enzymů Biochemické praktikum I, katedra biochemie, PřF UK v Praze, 2015/2016 Zpracování výsledků 1. Sestrojte kalibrační přímku závislosti průměrné absorbance při 492 nm na látkovém množství standardních roztoků pyruvátu vyjádřeném v µmol. 2. Vypočítejte výsledné koncentrace laktátu a NAD+ ve 100 μl reakční směsi. Zaznamenejte do tabulky rychlost reakce katalyzované LDH při příslušných výsledných koncentracích laktátu a NAD+ v podobě průměrné absorbance při 492 nm a přepočítejte na µmol·min-1·ml-1 (neboli U.ml-1). K přepočtu využijte rovnici lineární regrese kalibrační přímky, ze které zjistíte kolik µmol pyruvátu odpovídá příslušné absorbanci. Rychlost reakce (ν) vztažená na 1 ml odpovídá: 𝜇𝑚𝑜𝑙 pyruvátu 𝑣= ∙ 10 ∙ ř𝑒𝑑ě𝑛í [μmol ∙ min−1 ∙ ml−1 ] 𝑡 t je čas, po který reagoval enzym se substrátem, 50× se násobí vzhledem k tomu, že v reakci je pouze 20 l. 3. Sestrojte grafy závislosti rychlosti reakce katalyzované LDH na koncentraci laktátu a NAD+. 4. Určete Michaelisovu konstantu Km a maximální rychlost reakce Vlim LDH pro laktát a NAD+ z dvojitého reciprokého vynesení podle Lineweavera a Burka nebo pomocí nelineární regrese (např. programem EXCEL). Postup vyhodnocení Km nelineární regresí: V Excelu si připravte 2 buňky pro Km a Vmax, do kterých zadáte odhad (v našem případě buňka B1 a B2). Potom do 1. sloupce (A) vyplňte všechny hodnoty koncentrace substrátu, které jste použili, do 2. sloupce (B) hodnoty příslušné rychlosti reakce, kterou jste pro danou koncentraci substrátu naměřili (případně vypočítali). Do 3. sloupce (C) vložte vzorec pro výpočet rychlosti reakce = Vmax.[S]/(Km+[S]) neboli =$B$2*A4/($B$1+A4) a kopírujte pro všechny hodnoty koncentrace substrátu. Do 4. sloupce (D) vložte vzorec pro výpočet chyby mezi naměřenou a vypočtenou hodnotou = (νteor- ν)^2 neboli (C4-B4)^2. Sečtěte všechny chyby v buňce pod tabulkou (např. buňka D10). Nyní v záložce DATA využijte doplněk řešitel a jako účelovou funkci (ve starších verzích cílovou buňku) zadejte D10 (aby součet všech chyb) byl = 0 měněním buněk B1 a B2 (označíte obě buňky najednou v okně proměnné modelu). Pak už dáte pouze řešit a výsledek by se měl objevit namísto původních odhadů. Vypočtené hodnoty Km a Vmax pak lze využít i k proložení naměřených hodnot. Do jiného sloupce např. E zadáte koncentraci substrátu, tentokrát ale podrobně např. krok 0,01, v sloupci F opět spočítáte rychlost reakce: =$B$2*E4/($B$1+E4) pro všechny zadané hodnoty. Do grafu závislosti rychlosti reakce na koncentraci substrátu (osa x: A, osa y B) pak přidáte další řadu (zdrojová data osa x: E, osa y F, u které nedáte zobrazit body, ale pouze čáru-s dostatečným počtem hodnot bude hladká a bude mít tvar podle Michaelise-Mentenové. 1 2 3

A Km Vmax [S] (mM)

B

ν naměřená

C mM µmol·min-1·ml-1 ν vypočtená

59

D

E

F

chyba

[S] (mM)

ν vypočtená

5 Charakterizace enzymů Biochemické praktikum I, katedra biochemie, PřF UK v Praze, 2015/2016

5.4.

Stanovení Michaelisovy konstanty katalasy

Katalasa, systematicky H2O2 : H2O2-oxidoreduktasa (E.C. 1.11.1.6), je všeobecně rozšířený enzym, který rozkládá peroxid vodíku na vodu a molekulární kyslík: 2H2 O2 → 2H2 O + O2 Je to hemoprotein, obsahující čtyři molekuly hemu na molekulu bílkoviny. Enzym v krystalickém stavu se snadno připraví z jater. Enzym sám je rozkládán nadbytkem substrátu. Proto se stanovení aktivity provádí při 0 °C, aby bylo zabráněno rozkladu. Molekulová aktivita katalytického centra tohoto enzymu (číslo přeměny) je jedna z nejvyšších vůbec, udává se hodnota 1,25·106 min-1. Aktivitu katalasy můžeme měřit na základě množství vzniklého kyslíku (např. manometricky) nebo na základě úbytku H2O2 v reakční směsi (např. titrací manganistanem). Při manganometrickém stanovení se úbytek H2O2 rozloženého katalasou stanoví z rozdílu mezi jeho počáteční koncentrací v reakční směsi a koncentrací po zastavení enzymové reakce přídavkem zředěné H2SO4. Kyselina sírová, přidávaná k ukončení reakce, vytváří též vhodné prostředí pro manganometrickou titraci, která probíhá podle rovnice: 5H2 O2 + 2KMnO4 + 3H2 SO4 → 2MnSO4 + K 2 SO4 + 5O2 + 8H2 O Při stanovení Michaelisovy konstanty (Km) se stanoví rychlost reakce při různých koncentracích peroxidu vodíku. Další možností stanovení aktivity katalasy je spektrofotometrické kinetické stanovení, při kterém se sleduje pokles absorbance při 240 nm způsobený úbytkem H2O2. Cíl Stanovit Michaelisovu konstantu Km katalasy pro peroxid vodíku. Chemikálie a vybavení 0,2 M Na2HPO4 0,2 M NaH2PO4 0,1 M fosfátový pufr (pH 7,1), připravte sami ze zásobních roztoků: 33 ml 0,2M NaH2PO4 a 67 ml 0,2 M Na2HPO4), upravte na 0,1 M koncentraci, překontrolujte pH 1 mM KMnO4 0,2 M H2O2 (2 ml konc. H2O2 doplňte vodou na 100 ml – musí být denně čerstvý) 5% H2SO4 roztok katalasy o vhodné koncentraci: Pro titrační stanovení je doporučené výsledné ředění katalasy 30000× (100 l dobře rozmíchané suspenze enzymu/30 ml destilované vody: ředění 300×, poté tento roztok řeďte ještě 100×). Pro spektrofotometrické stanovení je doporučené ředění 3000×. Nutno však vždy vyzkoušet na jedné reakci a případně ředění změnit Byreta, titrační nádobky Postup Příprava roztoku H2O2: Připravte 0,2 M H2O2 a jeho koncentraci překontrolujte titrací 1 mM KMnO4 (na 0,3 ml 0,2 M peroxidu vodíku je zapotřebí 24 ml KMnO4). (Koncentrované roztoky H2O2 mívají často nižší koncentraci než je deklarovaná.) I kontrolní titrace je třeba provádět v kyselém prostředí (10 ml 5% H2SO4). Je-li spotřeba nižší, připravte nový roztok 0,2 M H2O2. Pak připravte ředěním základního roztoku H2O2 nižší koncentrace H2O2: 0,1 M; 0,05 M; 0,033 M; 0,02 M.

60

5 Charakterizace enzymů Biochemické praktikum I, katedra biochemie, PřF UK v Praze, 2015/2016 Stanovení Michaelisovy konstanty katalasy pro H2O2 titrační metodou: Postupně stanovte rychlost reakce katalyzované katalasou při různých koncentracích H2O2 takto: Do pěti titračních baněk pipetujte 1,5 ml 0,1 M fosfátového pufru (pH 7,1) a pak 0,3 ml peroxidu vodíku o různých koncentracích (0,2; 0,1; 0,05; 0,033 a 0,02 M H2O2). Vzhledem k tomu, že celkový objem reakční směsi je 3,0 ml a bylo pipetováno vždy 0,3 ml roztoku peroxidu vodíku, jsou koncentrace H2O2 v reakční směsi vždy desetkrát nižší než původní roztok peroxidu vodíku. K pufru a peroxidu vodíku v titračních baňkách pipetujte ještě 0,8 ml vody. Pro zjednodušení postupu lze stanovit Km při laboratorní teplotě. Postupně v půlminutových intervalech potom přidejte do jednotlivých baněk 0,4 ml roztoku katalasy. Obsah baňky vždy protřepte a ponechte reagovat přesně 5 minut. Po této době reakci zastavte přídavkem 10 ml 5% H2SO4. Kyselina sírová inaktivuje katalasu a zároveň vytvoří i vhodné prostředí pro manganometrickou titraci. Stanovení ještě jednou opakujte. V jednotlivých titračních baňkách potom stanovte množství zbylého H2O2 titrací 1 mM KMnO4 do růžového zbarvení (spotřeba musí být vždy vyšší než poloviční spotřeba slepého pokusu). Zároveň je nutno provést slepý pokus ke stanovení počáteční koncentrace peroxidu vodíku a to pro všechny koncentrace. Do 10 ml 5% H2SO4 v titračních baňkách pipetujte postupně 0,4 ml roztoku enzymu (enzym se takto ihned inaktivuje), pak 0,3 ml H2O2 o různých koncentracích, 1,5 ml 0,1 M fosfátového pufru (pH 7,1) a 0,8 ml destilované vody. Množství H2O2 stanovte titrací 1 mM KMnO4 do růžového zbarvení. Stanovení Michaelisovy konstanty katalasy pro H2O2 spektrofotometrickou metodou: Do pěti zkumavek pipetujte následující roztoky: č. zkumavky 1 2 3 4 5

Fosfátový pufr pH 7,1 [ml] 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5

H2O2 300 μl 0,2 M H2O2 300 μl 0,1 M H2O2 300 μl 0,05 M H2O2 300 μl 0,033 M H2O2 300 μl 0,022 M H2O2

destilovaná voda [ml] 0,9 0,9 0,9 0,9 0,9

Poté postupně v každé zkumavce enzymovou reakci iniciujte přidáním 300 μl vhodně zředěné katalasy (doporučené ředění 200-400×) a okamžitě spektrofotometricky sledujte úbytek absorbance při 240 nm po dobu 1 minuty oproti počátečnímu stavu v kyvetě (kinetická metoda; není potřeba slepý pokus). Kyveta musí být vhodná pro UV-oblast, nelze použít obyčejné spektrofotometrické kyvety. Vhodné ředění enzymu odpovídá lineárnímu úbytku absorbance. Měření opakujte. Poznámka Pokud je spotřeba při titraci extrémně nízká (tj. zbarví-li roztok do růžova již první kapka KMnO4), přidáme do titrační baňky zrnko rozpustné manganaté soli, která reakci katalyzuje. Vyhodnocení výsledků titrace 1. Sestavte do tabulky č. 1 spotřeby titračního činidla v čase t0 a t5 pro obě sady reakcí. 2. V tabulce č. 2 uveďte rozdíl spotřeby titračního činidla pro obě sady reakcí, která je úměrná počáteční rychlosti reakce katalasy, dále průměrnou hodnotu spotřeby a příslušnou koncentraci substrátu H2O2. 3. Sestrojte graf závislosti rychlosti reakce (rozdíl spotřeby titračního činidla t0-t5, případně µmol H2O2·min-1·ml-1 neboli U·ml-1) na koncentraci substrátu. 4. Určete Michaelisovu konstantu Km katalasy pro H2O2 z dvojitého reciprokého vynesení podle Lineweavera a Burka nebo pomocí nelineární regrese (např. programem EXCEL).

61

5 Charakterizace enzymů Biochemické praktikum I, katedra biochemie, PřF UK v Praze, 2015/2016 Postup vyhodnocení Km nelineární regresí: V Excelu si připravte 2 buňky pro Km a Vmax, do kterých zadáte odhad (v našem případě buňka B1 a B2). Potom do 1. sloupce (A) vyplňte všechny hodnoty koncentrace substrátu, které jste použili, do 2. sloupce (B) hodnoty příslušné rychlosti reakce, kterou jste pro danou koncentraci substrátu naměřili (případně vypočítali). Do 3. sloupce (C) vložte vzorec pro výpočet rychlosti reakce = Vmax.[S]/(Km+[S]) neboli =$B$2*A4/($B$1+A4) a kopírujte pro všechny hodnoty koncentrace substrátu. Do 4. sloupce (D) vložte vzorec pro výpočet chyby mezi naměřenou a vypočtenou hodnotou = (νteor- ν)^2 neboli (C4-B4)^2. Sečtěte všechny chyby v buňce pod tabulkou (např. buňka D10). Nyní v záložce DATA využijte doplněk řešitel a jako účelovou funkci (ve starších verzích cílovou buňku) zadejte D10 (aby součet všech chyb) byl = 0 měněním buněk B1 a B2 (označíte obě buňky najednou v okně proměnné modelu). Pak už dáte pouze řešit a výsledek by se měl objevit namísto původních odhadů. Vypočtené hodnoty Km a Vmax pak lze využít i k proložení naměřených hodnot. Do jiného sloupce např. E zadáte koncentraci substrátu, tentokrát ale podrobně např. krok 0,01, v sloupci F opět spočítáte rychlost reakce: =$B$2*E4/($B$1+E4) pro všechny zadané hodnoty. Do grafu závislosti rychlosti reakce na koncentraci substrátu (osa x: A, osa y B) pak přidáte další řadu (zdrojová data osa x: E, osa y F, u které nedáte zobrazit body, ale pouze čáru-s dostatečným počtem hodnot bude hladká a bude mít tvar podle Michaelise-Mentenové. 1 2 3

A Km Vmax [S] (mM)

B

ν naměřená

C mM µmol·min-1·ml-1 ν vypočtená

D

E

F

chyba

[S] (mM)

ν vypočtená

Vyhodnocení výsledků kinetické spektrofotometrické metody 1. Do tabulky č. 2 sestavte výsledné koncentrace H2O2 a příslušné změny absorbance za minutu. Změnu absorbance za minutu přepočítejte na mol·min-1·ml-1 neboli U·ml-1, jestliže víte, že molární absorpční koeficient H2O2 pro spektrofotometrické stanovení při 240 nm je ε = 39,4 mol−1 ∙ l ∙ cm−1 . Rychlost reakce (v) (vztaženou na 1 ml enzymového preparátu) vypočítáme podle vzorce 𝑣 = 1000 ∙

∆𝐴240 ∙ 𝑉𝑡 [μmol ∙ min−1 ∙ ml−1 ] 𝜀 ∙ 𝑙 ∙ 𝑉𝑒 ∙ 𝑡

kde Vt je celkový (total) objem reakční směsi v kyvetě (ml), Ve objem enzymového preparátu v kyvetě (ml), t čas (min.), A240 změna absorbance, ke které došlo za čas t, a  molární absorpční koeficient H2O2 – 39,4 mol-1·l·cm-1. 2. Sestrojte graf závislosti rychlosti reakce na koncentraci substrátu. 3. Určete Michaelisovu konstantu Km a maximální rychlost Vmax katalasy pro H2O2 z dvojitého reciprokého vynesení podle Lineweavera a Burka nebo pomocí nelineární regrese (např. programem EXCEL s využitím doplňku řešitel).

62

5 Charakterizace enzymů Biochemické praktikum I, katedra biochemie, PřF UK v Praze, 2015/2016

5.5.

Časový průběh štěpení želatiny trypsinem

Působením trypsinu (E.C. 3.4.21.4) se hydrolyticky štěpí některé peptidové vazby v bílkovinách. Tím dochází k uvolnění karboxylových skupin, které však nelze titrovat přímo odměrným roztokem alkalického hydroxidu, protože hydrolýzou peptidové vazby se současně uvolňuje bazická aminoskupina. Navázáním formaldehydu na aminovou skupinu se vytvoří Schiffova báze, čímž dojde ke ztrátě protonizované části molekuly a lze tedy následně titrovat karboxylové skupiny na vhodný indikátor. Tento postup nazýváme formolová titrace. Štěpení želatiny trypsinem probíhá v alkalickém prostředí při 37 °C a zastavuje se přídavkem formaldehydu, který inaktivuje enzym. Stanovením karboxylových skupin, uvolněných za různou dobu působením enzymu, lze sledovat časový průběh reakce.

Cíl Zjistit časový průběh štěpení želatiny trypsinem. Chemikálie a vybavení 5% roztok želatiny: před použitím rozpusťte na horké vodní lázni 2% roztok trypsinu (připravte 7 ml, nutno vždy čerstvý) 0,1 M hydroxid sodný Neutrální 40% roztok formaldehydu: již k dispozici (k 50 ml 40% formaldehydu byl přidán 1 ml 0,5% alkoholického roztoku fenolftaleinu a pak po kapkách 0,1 M hydroxid sodný až do slabě růžového zabarvení) 0,1% ethanolický roztok fenolftaleinu termostat, byreta, titrační baňky Postup Do 11-ti Erlenmayerových baněk o obsahu 100 ml pipetujte po 25 ml 5% roztok želatiny, přidejte 1,5 ml roztoku fenolftaleinu a zneutralizujte přídavkem 0,1 M hydroxidu sodného do stejného slabě růžového zbarvení ve všech baňkách. Potom baňky vložte do termostatu na 37 °C zároveň s nádobkou obsahující roztok trypsinu. Po vytemperování na stejnou teplotu (asi po 10 min.), vyjměte první baňku, přidejte 5 ml roztoku formaldehydu a stejným způsobem 0,5 ml roztoku trypsinu. Titrujte 0,1 M hydroxidem sodným do slabě růžového zbarvení. Získaná hodnota je úměrná obsahu volných karboxylových skupin v čase t = 0. Do druhé baňky rychle pipetujte 0,5 ml roztoku trypsinu, promíchejte, vložte do termostatu a přesně po 1 min. do směsi rychle pipetujte 5 ml roztoku formaldehydu. Promíchejte a titrujte 0,1 M hydroxidem sodným do růžového zbarvení. Stanoví se obsah karboxylových skupin v čase t = 1 min. Obdobným způsobem proveďte stanovení pro dobu inkubace 2, 3, 5, 10, 15, 20, 30, 45 a 60 min.

63

5 Charakterizace enzymů Biochemické praktikum I, katedra biochemie, PřF UK v Praze, 2015/2016 Vyhodnocení výsledků 1. Rozdíly mezi spotřebami titračního činidla pro čas t = 0 a jednotlivými stanoveními se sestavte do tabulky s příslušným časem. 2. Sestrojte graf závislosti množství vytvořeného produktu na čase. Získanými body proložte křivku. Z ní odečtěte počáteční rychlost reakce jako směrnici v čase t = 0. Kontrolní otázky 1. Co to je želatina? 2. Napište rovnici reakce glycinu s formaldehydem. 3. Proč se před započetím enzymové reakce přidává do roztoku fenolftalein a titruje se hydroxidem sodným do růžového zabarvení?

64

5 Charakterizace enzymů Biochemické praktikum I, katedra biochemie, PřF UK v Praze, 2015/2016

5.6.

Štěpení kaseinu trypsinem – stanovení Michaelisovy konstanty

Působením trypsinu (E.C. 3.4.21.4) se hydrolyticky štěpí některé peptidové vazby v bílkovinách. Tím dochází k uvolnění karboxylových skupin, které však nelze titrovat přímo odměrným roztokem alkalického hydroxidu, protože hydrolýzou peptidové vazby se současně uvolňuje bazická aminoskupina. Navázáním formaldehydu na aminovou skupinu se vytvoří Schiffova báze, čímž dojde ke ztrátě protonizované části molekuly a lze tedy následně titrovat karboxylové skupiny na vhodný indikátor. Štěpení kaseinu trypsinem probíhá v alkalickém prostředí při 37 °C a zastavuje se přídavkem formaldehydu, který inaktivuje enzym.

Cíl Určete Michaelisovu konstantu Km trypsinu pro kasein. Chemikálie a vybavení 5 % roztok kaseinu: již k dispozici (5 g kaseinu bylo rozpuštěno asi v 90 ml vody obsahujících 2 ml 1 M hydroxidu sodného. Roztok byl zahříván na vodní lázni do úplného rozpuštění, byl zfiltrován přes gázu, pH upraveno 1 M kyselinou chlorovodíkovou na hodnotu 8,5 a doplněn do 100 ml vodou. Tento roztok je zásobní a uchovává se v při teplotě –24 °C). 2% roztok trypsinu (připravte 6 ml ) 0,1 M NaOH neutrální 40% roztok formaldehydu: již k dispozici (k 50 ml 40% formaldehydu byl přidán 1 ml 0,5% alkoholického roztoku fenolftaleinu a pak po kapkách 0,1 M hydroxid sodný až do slabě růžového zabarvení). 0,1% ethanolický roztok fenolftaleinu termostat, byreta, titrační baňky Postup Do pěti Erlenmayerových baněk (100 ml) pipetujte roztoky podle následující tabulky: roztok kaseinu (ml) voda (ml) výsledná koncentrace kaseinu (%)

2,5 22,5 0,5

5 20 1

7,5 17,5 1,5

10 15 2

15 10 3

Do baněk dále přidejte 1,5 ml roztoku fenolftaleinu a obsah v baňkách zneutralizujte přídavkem 0,1 M hydroxidu sodného do stejného slabě růžového zabarvení. Potom baňky vložte do termostatu na 37 °C zároveň s nádobkou obsahující roztok trypsinu. Asi po 10 min. do každé baňky rychle přidejte 5 ml roztoku formaldehydu a stejným způsobem 0,5 ml roztoku trypsinu. Titrujte hydroxidem sodným do slabě růžového zabarvení. Získaná hodnota je úměrná obsahu volných karboxylových skupin v čase t = 0. Stejným způsobem nařeďte roztok kaseinu v druhé sadě baněk. Vložte do termostatu a po dobu 10 minut v 1 minutových intervalech přidejte do každé baňky 0,5 ml roztoku trypsinu. Po 20 minutách inkubace do každé baňky (ve stejném pořadí po 1 min. intervalech) přidejte 5 ml

65

5 Charakterizace enzymů Biochemické praktikum I, katedra biochemie, PřF UK v Praze, 2015/2016 roztoku formaldehydu. Obsah volných karboxylových skupin stanovte obdobným způsobem jako pro čas t = 0. Zpracování výsledků 1. Sestavte tabulku spotřeby titračního činidla v čase t = 0, t = 20 a rozdíl spotřeby pro příslušné koncentrace substrátu kaseinu vyjádřené v mM (relativní molekulová hmotnost kaseinu je 23 600). 2. Sestrojte graf závislosti rychlosti reakce (úměrné spotřebě titračního činidla) na koncentraci substrátu. Případně spotřebu titračního činidla můžete přepočítat na mol·min-1·ml-1 neboli U·ml-1 a v grafu tak pro rychlost reakce použít obvyklou jednotku. 3. Určete Michaelisovu konstantu Km trypsinu pro kasein z dvojitého reciprokého vynesení podle Lineweavera a Burka nebo pomocí nelineární regrese (např. programem EXCEL). Postup vyhodnocení Km nelineární regresí: V Excelu si připravte 2 buňky pro Km a Vmax, do kterých zadáte odhad (v našem případě buňka B1 a B2). Potom do 1. sloupce (A) vyplňte všechny hodnoty koncentrace substrátu, které jste použili, do 2. sloupce (B) hodnoty příslušné rychlosti reakce, kterou jste pro danou koncentraci substrátu naměřili (případně vypočítali). Do 3. sloupce (C) vložte vzorec pro výpočet rychlosti reakce = Vmax.[S]/(Km+[S]) neboli =$B$2*A4/($B$1+A4) a kopírujte pro všechny hodnoty koncentrace substrátu. Do 4. sloupce (D) vložte vzorec pro výpočet chyby mezi naměřenou a vypočtenou hodnotou = (νteor- ν)^2 neboli (C4-B4)^2. Sečtěte všechny chyby v buňce pod tabulkou (např. buňka D10). Nyní v záložce DATA využijte doplněk řešitel a jako účelovou funkci (ve starších verzích cílovou buňku) zadejte D10 (aby součet všech chyb) byl = 0 měněním buněk B1 a B2 (označíte obě buňky najednou v okně proměnné modelu). Pak už dáte pouze řešit a výsledek by se měl objevit namísto původních odhadů. Vypočtené hodnoty Km a Vmax pak lze využít i k proložení naměřených hodnot. Do jiného sloupce např. E zadáte koncentraci substrátu, tentokrát ale podrobně např. krok 0,01, v sloupci F opět spočítáte rychlost reakce: =$B$2*E4/($B$1+E4) pro všechny zadané hodnoty. Do grafu závislosti rychlosti reakce na koncentraci substrátu (osa x: A, osa y B) pak přidáte další řadu (zdrojová data osa x: E, osa y F, u které nedáte zobrazit body, ale pouze čáru-s dostatečným počtem hodnot bude hladká a bude mít tvar podle Michaelise-Mentenové. 1 2 3

A Km Vmax [S] (mM)

B

ν naměřená

C mM µmol·min-1·ml-1 ν vypočtená

66

D

E

F

chyba

[S] (mM)

ν vypočtená

5 Charakterizace enzymů Biochemické praktikum I, katedra biochemie, PřF UK v Praze, 2015/2016

5.7.

Inhibice trypsinu ovomukoidem

Ovomukoid je glykoprotein vaječného bílku, schopný inhibovat proteolytickou aktivitu trypsinu. V této úloze budeme sledovat vliv jeho koncentrace na rychlost enzymové reakce katalyzované trypsinem. Působením trypsinu (E.C. 3.4.21.4) se hydrolyticky štěpí některé peptidové vazby v bílkovinách. Tím dochází k uvolnění karboxylových skupin, které však nelze titrovat přímo odměrným roztokem alkalického hydroxidu, protože hydrolýzou peptidové vazby se současně uvolňuje bazická aminoskupina. Navázáním formaldehydu na aminovou skupinu se vytvoří Schiffova báze, čímž dojde ke ztrátě protonizované části molekuly a lze tedy následně titrovat karboxylové skupiny na vhodný indikátor. Tento postup nazýváme formolová titrace.

Cíl Zjistit, zda je ovlivněna proteolytická aktivita trypsinu v přítomnosti ovomukoidu. Chemikálie 2% roztok ovomukoidu: Připravte vždy čerstvý 2% roztok trypsinu: Připravte vždy čerstvých 6 ml 5% roztok kaseinu: již k dispozici (5 g kaseinu bylo rozpuštěno asi v 90 ml vody obsahujících 2 ml 1 M hydroxidu sodného. Roztok byl zahříván na vodní lázni do úplného rozpuštění, byl zfiltrován přes gázu, pH upraveno 1 M kyselinou chlorovodíkovou na hodnotu 8,5 a doplněn do 100 ml vodou. Tento roztok je zásobní a uchovává se v při teplotě -24 °C). 0,1 M NaOH 0,1% roztok fenolftaleinu v ethanolu Postup Do pěti titračních baněk pipetujte 25 ml 5% kaseinu. Potom přidejte 2% roztok ovomukoidu v množství 0; 0,125; 0,250; 0,5 a 1 ml a doplňte vodou na stejný objem. Do baněk dále přidejte 1,5 ml roztoku fenolftaleinu a zneutralizujte do stejného slabě růžového zbarvení roztokem NaOH. Vložte do termostatu a inkubujte 10 minut při 37 °C. Do každé baňky přidejte 5 ml roztoku neutrálního formaldehydu a 0,5 ml trypsinu a titrujte 0,1 M NaOH do slabě růžového zbarvení. Získaná hodnota je úměrná obsahu volných karboxylových skupin v čase t = 0. Stejným způsobem si připravte druhou sadu baněk. Po preinkubaci v termostatu přidávejte 0,5 ml roztoku trypsinu v jednominutových intervalech. Po 20 minutách inkubace zastavte enzymové štěpení přidáním 5 ml roztoku neutrálního formaldehydu a titrujte 0,1 M NaOH. Zpracování výsledků 1. Sestavte tabulku spotřeby titračního činidla v čase t = 0 a t = 20 minut, rozdíl spotřeby a příslušnou koncentraci inhibitoru. 2. Sestrojte graf závislosti rychlosti reakce katalyzované trypsinem na koncentraci inhibitoru. 3. Určete konstantu IC50 odpovídající takové koncentraci inhibitoru, která sníží aktivitu trypsinu na 50% ve srovnání s neinhibovanou reakcí (při dané koncentraci substrátu). 67

5 Charakterizace enzymů Biochemické praktikum I, katedra biochemie, PřF UK v Praze, 2015/2016

5.8.

Charakterizace trypsinu s využitím azokaseinu.

Trypsin je hydrolytický enzym, který štěpí proteiny, tedy peptidovou vazbu, za bazickými aminokyselinami argininem a lyzinem. Pro stanovení aktivity lze využít barevného substrátu – azokaseinu. Po reakci je nutno odstranit protein sražením kyselinou trichloroctovou a rozsah štěpení lze kvantifikovat měřením absorbance nesražených barevných peptidů. Cíl Určete pH optimum, závislost rychlosti reakce na čase a Michaelisovu konstantu trypsinu Chemikálie a vybavení 0,2% roztok trypsinu (1 ml, dále zředěný 100×) 1,25% roztok azokaseinu 2M NaOH Pufr Brittonův-Robinsonův pH 4-11 5% kyselina trichloroctová Mikrozkumavky Mikrotitrační destička Termostat Postup Stanovení pH optima trypsinu: Připravte si dvě sady mikrozkumavek po deseti. Jedna sada bude sloužit jako slepý pokus, ve druhé bude probíhat enzymová reakce. Do všech mikrozkumavek pipetujte 50 µl azokaseinu, 25 µl pufru o příslušném pH a 15 µl destilované vody. Dejte všechny zkumavky vytemperovat na 37°C a do první sady zkumavek, kde neproběhne enzymová reakce, přidejte 250 µl kyseliny trichloroctové k zastavení reakce a 10 µl enzymu. Enzymovou reakci budete startovat přidáním 10 µl naředěného enzymu, nezapomeňte reakční směs zamíchat. Reakce bude probíhat v každé zkumavce 20 minut přesně, proto musíte reakci zahajovat v 30 sekundových intervalech a v těchto intervalech také reakci ukončit 250 µl kyseliny trichloroctové, která zároveň způsobí vysrážení neštěpených molekul azokaseinu, zatímco odštěpené peptidové fragmenty zůstanou rozpuštěny v roztoku. Pro odstranění vysráženého proteinu je třeba všechny zkumavky cetrifugovat 5 minut při 10000 otáčkách za minutu na stolní centrifuze. Supernatant opatrně pipetujte do jamek mikrotitrační destičky po 100 µl. Do každé jamky přidejte 100 µl 2M NaOH. Destičku vložte do čtečky a zaznamenejte absorbanci při 450 nm. Míra rychlosti reakce je úměrná rozdílu absorbance měřeného vzorku a slepého pokusu. Sledování závislosti množství produktů reakce katalyzované trypsinem na čase: Pracujte v duplikátech. Připravte si sadu dvakrát deseti mikrozkumavek. Do všech zkumavek pipetujte 50 µl azokaseinu, 25 µl pufru pH 8 a 15 µl destilované vody. Zkumavky vložte do termostatu a nechte temperovat na 37°C. Enzymovou reakci budete zahajovat přidáním 10 µl naředěného enzymu tak, aby vždy dvojice reakcí probíhala 1, 2, 5, 10, 15, 20, 30,40 a 60 minut přesně. Rekci zastavíte přidáním 250 µl kyseliny trichloroctové, která zároveň způsobí vysrážení neštěpených molekul azokaseinu, zatímco odštěpené peptidové fragmenty zůstanou rozpuštěny v roztoku. Pro odstranění vysráženého proteinu je třeba všechny zkumavky cetrifugovat 5 minut při 10000 otáčkách za minutu na stolní centrifuze. Nezapomeňte na slepý pokus, tedy reakce probíhající 0 minut (přidáte nejprve kyselinu trichloroctovou a pak roztok enzymu). Supernatant opatrně pipetujte do jamek mikrotitrační destičky. Do každé jamky přidejte 100 µl 2M NaOH. Destičku vložte do čtečky a zaznamenejte absorbanci při 450 nm. Množství 68

5 Charakterizace enzymů Biochemické praktikum I, katedra biochemie, PřF UK v Praze, 2015/2016 produktu vytvořeného za určitý čas je úměrné rozdílu absorbance měřeného vzorku a slepého pokusu. Stanovení Michelisovy konstanty trypsinu pro azokasein: Připravte si dvě sady mikrozkumavek po 6 kusech. Pipetujte 2, 4, 6, 8, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50 µl azokaseinu a doplňte destilovanou vodou na objem 65 µl. Do každé mikrozkumavky pipetujte 25 µl Brittova-Robinsonova pufru pH 8,0. Do první sady zkumavek, která bude sloužit jako slepý pokus, pipetujte 250 µl kyseliny trichloroctové a poté 10 µl enzymu. Zkumavky vložte do termostatu a nechte vytemperovat na 37°C. Enzymovou reakci budete startovat přidáním 10 µl naředěného enzymu v 30 sekundových intervalech, tak aby reakce probíhala 20 minut přesně v každé zkumavce. Enzymovou reakci zastavte přidáním 250 µl kyseliny trichloroctové, která zároveň způsobí vysrážení neštěpených molekul azokaseinu, zatímco odštěpené peptidové fragmenty zůstanou rozpuštěny v roztoku. Pro odstranění vysráženého proteinu je třeba všechny zkumavky cetrifugovat 5 minut při 10000 otáčkách za minutu na stolní centrifuze. Supernatant opatrně pipetujte do jamek mikrotitrační destičky. Do každé jamky přidejte 100 µl 2M NaOH. Destičku vložte do čtečky a zaznamenejte absorbanci při 450 nm. Míra rychlosti reakce je úměrná rozdílu absorbance měřeného vzorku a slepého pokusu. Zpracování výsledků: 1. Sestrojte graf závislosti rychlosti reakce katalyzované trypsinem na pH 2. Sestrojte graf časové závislosti množství produktu vytvořeného reakcí katalyzovanou trypsinem 3. Sestrojte graf závislosti rychlosti reakce katalyzované trypsinem na koncentraci azokaseinu. Určete Michaelisovu konstantu Km trypsinu pro kasein z dvojitého reciprokého vynesení podle Lineweavera a Burka nebo pomocí nelineární regrese (např. programem EXCEL). Postup vyhodnocení Km nelineární regresí: V Excelu si připravte 2 buňky pro Km a Vmax, do kterých zadáte odhad (v našem případě buňka B1 a B2). Potom do 1. sloupce (A) vyplňte všechny hodnoty koncentrace substrátu, které jste použili, do 2. sloupce (B) hodnoty příslušné rychlosti reakce, kterou jste pro danou koncentraci substrátu naměřili (případně vypočítali). Do 3. sloupce (C) vložte vzorec pro výpočet rychlosti reakce = Vmax.[S]/(Km+[S]) neboli =$B$2*A4/($B$1+A4) a kopírujte pro všechny hodnoty koncentrace substrátu. Do 4. sloupce (D) vložte vzorec pro výpočet chyby mezi naměřenou a vypočtenou hodnotou = (νteor- ν)^2 neboli (C4-B4)^2. Sečtěte všechny chyby v buňce pod tabulkou (např. buňka D10). Nyní v záložce DATA využijte doplněk řešitel a jako účelovou funkci (ve starších verzích cílovou buňku) zadejte D10 (aby součet všech chyb) byl = 0 měněním buněk B1 a B2 (označíte obě buňky najednou v okně proměnné modelu). Pak už dáte pouze řešit a výsledek by se měl objevit namísto původních odhadů. Vypočtené hodnoty Km a Vmax pak lze využít i k proložení naměřených hodnot. Do jiného sloupce např. E zadáte koncentraci substrátu, tentokrát ale podrobně např. krok 0,01, v sloupci F opět spočítáte rychlost reakce: =$B$2*E4/($B$1+E4) pro všechny zadané hodnoty. Do grafu závislosti rychlosti reakce na koncentraci substrátu (osa x: A, osa y B) pak přidáte další řadu (zdrojová data osa x: E, osa y F, u které nedáte zobrazit body, ale pouze čáru-s dostatečným počtem hodnot bude hladká a bude mít tvar podle Michaelise-Mentenové. 1 2 3

A Km Vmax [S] (mM)

B

ν naměřená

C mM µmol·min-1·ml-1 ν vypočtená

69

D

E

F

chyba

[S] (mM)

ν vypočtená

5 Charakterizace enzymů Biochemické praktikum I, katedra biochemie, PřF UK v Praze, 2015/2016

5.9.

Štěpení škrobu -amylasou – časový průběh enzymové reakce

Enzym α-amylasa (1,4-α-D-glukan-glukanohydrolasa, E.C.3.2.1.1) katalyzuje hydrolýzu 1,4-α-D-glukosidové vazby škrobu a obdobných polysacharidů za vzniku redukujících sacharidů. Konečným produktem je maltosa, meziprodukty jsou různé dextriny. Vznikající redukující cukry redukují alkalický roztok 3,5-dinitrosalicylátu na 3-amino-5nitrosalicylát. Reakci lze sledovat měřením absorbance při vlnové délce 540 nm.

Cíl Zjistit časovou závislost štěpení škrobu α-amylasou. Chemikálie a vybavení 10 mM roztok maltosy: již připraven (342,3 mg maltosy ve 100 ml H2O). dinitrosalicylátové reagens: již k dispozici (1 g kyseliny 3,5-dinitrosalicylové rozpuštěný ve 20 ml 2 M NaOH a 50 ml roztoku vinanu sodnodraselného [300 g vinanu sodnodraselného v 500 ml vody]. Po zahřátí a rozpuštění doplněno na 100 ml destilovanou vodou). Na dně se může vyskytovat sraženina, není na závadu. 2 M NaOH 0,5% roztok škrobu – amylosy v 0,1 M fosfátovém pufru (pH 6,7): již k dispozici 0,5% roztok škrobu – amylopektinu v 0,1 M fosfátovém pufru (pH 6,7): již k dispozici 0,2 M Na2HPO4 0,2 M NaH2PO4 0,1 M fosfátový pufr (pH 6,7), připravte sami ze zásobních roztoků: 56,5 ml 0,2M NaH2PO4 a 43,5 ml 0,2 M Na2HPO4, upravte na 0,1 M koncentraci 1% NaCl roztok amylasy (1 mg amylasy/10 ml destilované H2O a řeďte ještě 50×) termostat, spektrofotometr Postup Kalibrace: Do 6 zkumavek pipetujte 0; 0,1; 0,2; 0,3; 0,4 a 0,5 ml roztoku maltosy a doplňte do 4 ml destilovanou vodou. Dále do každé zkumavky přidejte po 0,5 ml roztoku NaOH a po 0,5 ml dinitrosalicylátového reagens. Všechny zkumavky zahřívejte 5 minut ve vroucí vodní lázni s destilovanou vodou, ochlaďte a odečtěte absorbanci vzorků proti slepému vzorku, který neobsahoval žádný sacharid, při vlnové délce 540 nm. Důležité: Před měřením na spektrofotometru musí být všechny zkumavky ochlazeny na stejnou teplotu, protože absorbance vzorku je citlivá na změny teploty. Ze získaných hodnot sestrojte kalibrační křivku (závislost absorbance na množství maltosy). Měření aktivity: Substrát připravte smísením 50 ml roztoku škrobu, 30 ml fosfátového pufru pH 6,7 a 10 ml roztoku NaCl. Všechny závislosti měřte jak pro amylosu, tak pro amylopektin. Do zkumavek pipetujte 3,5 ml substrátu. Zkumavky se substrátem vložte na 10 minut do termostatované lázně s destilovanou vodou vyhřáté na 37 °C. Mezitím připravte vhodně zředěný roztok α-amylasy (50× - obvykle vykazuje amylasa v této koncentraci dostatečně 70

5 Charakterizace enzymů Biochemické praktikum I, katedra biochemie, PřF UK v Praze, 2015/2016 vysokou aktivitu. Není-li tomu tak, je nutno pokus opakovat znovu s vyšší koncentrací enzymu). K vytemperovaným vzorkům přidejte po 0,5 ml roztoku α-amylasy a inkubujte přesně l, 3, 5, 10 a 20 minut při 37 °C. Reakci ukončete přidáním 0,5 ml roztoku NaOH. Současně připravte dvojici zkumavek, kam pipetujete roztoky v tomto pořadí: 3,5 ml substrátu, 0,5 ml roztoku NaOH a 0,5 ml roztoku α-amylasy. Pořadí je nutno dodržet! Získaná hodnota bude odpovídat obsahu redukčních ekvivalentů v čase t = 0 a zároveň slouží jako slepý vzorek při spektrofotometrii. Nakonec přidejte ke všem vzorkům 0,5 ml dinitrosalicylátového reagens. Všechny zkumavky důkladně promíchejte na vortexu a pak zahřívejte 5 minut na vroucí vodní lázni. Po ochlazení měřte absorbanci při vlnové délce 540 nm. Vyhodnocení výsledků 1. Sestrojte kalibrační graf závislosti absorbance měřené při 540 nm na množství maltosy, tedy „redukčních ekvivalentů“, které se uvolnily při hydrolýze škrobu. 2. Sestavte tabulku hodnot absorbance, redukčních ekvivalentů a příslušný čas reakce pro substráty amylosu a amylopektin. 3. Sestrojte grafy závislosti redukčních ekvivalentů na čase a odečtěte počáteční rychlost reakce.

71

5 Charakterizace enzymů Biochemické praktikum I, katedra biochemie, PřF UK v Praze, 2015/2016

5.10.

Závislost rychlosti štěpení škrobu -amylasou na pH

Enzym α-amylasa (1,4-α-D-glukan-glukanohydrolasa, E.C.3.2.1.1) katalyzuje hydrolýzu 1,4- α -D-glukosidové vazby škrobu a obdobných polysacharidů za vzniku maltosy. V této úloze je pro sledování aktivity α-amylasy použit nerozpustný modrý škrobový substrát, jehož hydrolýzou vzniká modré ve vodě rozpustné barvivo. Množství uvolněného barviva, které je úměrné aktivitě enzymu, se indikuje měřením absorbance při 590 nm. Aktivita enzymu silně závisí na koncentraci vodíkových iontů. Provedením reakce v pufrech o různém pH lze zjistit optimální hodnou pH pro enzymovou reakci (pH optimum).

Cíl Zjistit pH optimum α-amylasy. Chemikálie Nerozpustný škrobový substrát (0,1 g rozpusťte v 7,5 ml destilované vody, před použitím suspenzi rozmíchejte, připravený substrát využijete i k podúloze aktivace, inhibice α-amylasy) (souprava na stanovení -amylasy AMS 50, Lachema Brno). srážecí roztok: již k dispozici – používá se komerčně dodaný v soupravě pro stanovení α-amylasy (0,02 M kyselina sulfosalicylová v 1,85 M MgSO4 s 1,3 mM chelatonem 3) (set). Roztok α-amylasy ve vodě (1 mg v 10 ml destilované vody). 0,2 M Na2HPO4 0,1 M kyselina citronová McIlvainovy pufry o pH 4,0-8,3 připravte podle následující tabulky zkumavka č. 0,1 M kys. 0,2 M Na2HPO4 ml pH citronová ml 1 5,20 2,80 4,0 2 4,00 4,00 4,8 3 3,50 4,50 5,4 4 3,20 4,80 5,8 5 2,20 5,80 6,6 6 1,40 6,60 7,0 7 0,50 7,50 7,6 8 0,20 7,80 8,0 9 0,00 8,00 8,3 Postup: Do 10 silnostěnných centrifugačních zkumavek pipetujte 0,3 ml škrobového substrátu a 0,5 ml pufru (do 10. zkumavky 0,5 ml destilované vody, slouží jako slepý pokus). V termostatované lázni zkumavky inkubujte 5 min při 37 °C. Dále do každé zkumavky, kromě desáté, pipetujte 0,2 ml roztoku enzymu (do desáté zkumavky 0,2 ml vody) a inkubujte přesně

72

5 Charakterizace enzymů Biochemické praktikum I, katedra biochemie, PřF UK v Praze, 2015/2016 15 min. při 37 °C. Do všech zkumavek přidejte 1 ml srážecího roztoku, promíchejte a po 15 min. odstřeďte 5 min. při 3000 g. Změřte absorbance čirého supernatantu při 590 nm proti kontrolnímu vzorku, tj. roztoku v desáté zkumavce. Převeďte hodnoty absorbance na aktivitu vztaženou na mililitr enzymového preparátu podle přiložené tabulky. Výsledky převeďte na miligram enzymového preparátu. Vyhodnocení výsledků 1. Sestrojte graf závislosti aktivity α-amylasy vztažené na miligram enzymového preparátu na pH pufru, ve kterém probíhala enzymová reakce. 2. Určete pH optimum reakce katalyzované α-amylasou. Absorbance Aktivita [U·ml-1] Absorbance Aktivita [U·ml-1] 0,046 0,04 0,402 0,40 0,068 0,06 0,449 0,45 0,089 0,08 0,495 0,50 0,110 0,10 0,541 0,55 0,120 0,11 0,587 0,60 0,130 0,12 0,679 0,70 0,150 0,14 0,769 0,80 0,170 0,16 0,859 0,90 0,190 0,18 0,948 1,00 0,210 0,20 1,037 1,10 0,229 0,22 1,125 1,20 0,259 0,25 1,212 1,30 0,288 0,28 1,473 1,60 0,307 0,30 1,645 1,80 0,354 0,35 1,816 2,00

73

5 Charakterizace enzymů Biochemické praktikum I, katedra biochemie, PřF UK v Praze, 2015/2016

5.11.

Aktivace a inhibice štěpení škrobu -amylasou

Aktivita α-amylasy (1,4--D-glukan-glukanohydrolasa, E.C. 3.2.1.1), která hydrolyzuje 1,4- α -D-glukosidové vazby škrobu a obdobných polysacharidů za vzniku dextrinů a posléze maltosy, je závislá na přítomnosti různých iontů. V této úloze je pro sledování aktivity α-amylasy použit nerozpustný modrý škrobový substrát, jehož hydrolýzou vzniká modré ve vodě rozpustné barvivo. Množství uvolněného barviva, které je úměrné aktivitě enzymu, se indikuje měřením absorbance při 590 nm.

Cíl Zjistit vliv některých solí na aktivitu α-amylasy. Chemikálie a vybavení nerozpustný škrobový substrát (již připravený při stanovení pH optima, před použitím suspenzi rozmíchejte) (souprava na stanovení -amylasy AMS 50, Lachema Brno). 0,1 M Tris-HCl pufr 7.0 0,2 M NaCl, 0,2 M KCl, 0,2 M KSCN, 0,2 M KBr, 0,2 M AgNO3, 0,2 M PbCl2, 0,2 M CaCl2 nasycený roztok HgCl2 roztok amylasy ve vodě (1 mg v 10 ml destilované vody) srážecí roztok: již k dispozici (komerčně dodávaný roztok v soupravě pro stanovení α-amylasy: 0,02 M kyselina sulfosalicylová v 1,85 M MgSO4 s 1,3 mM chelatonem 3) termostat, zkumavky, odstředivka spektrofotometr Postup Do silnostěnných centrifugačních zkumavek pipetujte 0,3 ml škrobového substrátu, 0,5 ml pufru a dále do jednotlivých zkumavek po 0,5 ml (v případě HgCl2 pouze kapka a 0,45 ml vody): Zkumavka 1 Roztok H2O

2 H2O

3 NaCl

4 KCl

5 6 KSCN KBr

7 8 9 HgCl2 AgNO3 PbCl2

10 CaCl2

Zkumavky se vloží do termostatované lázně na 37 °C zároveň s nádobkou obsahující roztok enzymu. Po 5 min. se do první zkumavky přidá 0,2 ml vody, do všech ostatních 0,2 ml roztoku enzymu v půlminutových intervalech a promísí se. Po 15 min. inkubace se reakce zastaví v půlminutových intervalech (ve stejném pořadí) přidáním 1 ml srážecího činidla, promísí se a po 15 min. se odstředí. Změří se absorbance čirého supernatantu při 590 nm proti roztoku ve zkumavce č. 1. Převeďte hodnoty absorbance na aktivitu vztaženou na mililitr enzymového preparátu podle přiložené tabulky. Výsledky převeďte na miligram enzymového preparátu.

74

5 Charakterizace enzymů Biochemické praktikum I, katedra biochemie, PřF UK v Praze, 2015/2016 Vyhodnocení výsledků 1. Sestavte do tabulky absorbanci modrého zabarvení vzniklého po reakci katalyzované αamylasou v přítomnosti různých solí a příslušné aktivity α-amylasy vztažené na miligram enzymového preparátu. 2. Experimentálně zjištěné hodnoty aktivity α-amylasy vyjádřete ve formě sloupcového diagramu. Absorbance Aktivita [U·ml-1] Absorbance Aktivita [U·ml-1] 0,046 0,04 0,402 0,40 0,068 0,06 0,449 0,45 0,089 0,08 0,495 0,50 0,110 0,10 0,541 0,55 0,120 0,11 0,587 0,60 0,130 0,12 0,679 0,70 0,150 0,14 0,769 0,80 0,170 0,16 0,859 0,90 0,190 0,18 0,948 1,00 0,210 0,20 1,037 1,10 0,229 0,22 1,125 1,20 0,259 0,25 1,212 1,30 0,288 0,28 1,473 1,60 0,307 0,30 1,645 1,80 0,354 0,35 1,816 2,00

75

5 Charakterizace enzymů Biochemické praktikum I, katedra biochemie, PřF UK v Praze, 2015/2016

5.12. Štěpení sacharosy -fruktosidasou (sacharasou) – závislost na množství enzymu Enzym -fruktosidasa (-D-fruktofuranosid-fruktohydrolasa E.C. 3.2.1.26) katalyzuje hydrolytické štěpení sacharosy - neredukujícího disacharidu - na ekvimolární směs glukosy a fruktosy, označovanou jako invertní cukr (podle změny znaménka rotace roztoku vznikem silně levotočivé fruktosy). Protože tyto monosacharidy, narozdíl od výchozího substrátu, mají redukční vlastnosti, lze užít ke sledování působení enzymu stanovení založeného na redukčních vlastnostech cukrů, vhodná je např. metoda Schoorlova. K přípravě enzymu se využívá nejčastěji pekařského nebo pivovarského droždí.

Cíl Zjistit, jak závisí množství vzniklého produktu na množství β-fruktosidasy Chemikálie 10% roztok sacharosy 0,2 M kyselina octová 0,2 M octan sodný 0,1 M acetátový pufr (pH 4,6): připravte sami ze zásobních roztoků: 25,5 ml 0,2 M kyseliny octové a 24,5 ml 0,2 M octanu sodného, upravte na 0,1 M koncentraci, překontrolujte pH. 1% hydroxid sodný činidla na stanovení redukujících cukrů podle Schoorla roztok enzymu: 10 g čerstvého droždí rozetřete v třecí misce s 10 až 15 g skelného prachu, přidejte po částech 5 ml vody a rozetřete 5 minut. Potom v několika dávkách přidejte ještě 35 ml vody, dobře promíchejte a nechte stát 30 minut při teplotě 25 až 30 °C. Pak suspenzi centrifugujte 20 minut při 4000 otáčkách/minutu, získáte jasný nebo mírně opalizující roztok. Postup Závislost rychlosti reakce na množství enzymu: Do pěti zkumavek pipetujte roztoky kromě enzymu podle následujícího schématu: Zkumavka Roztok sacharosy (ml) Pufr (ml ) Voda (ml) Roztok enzymu (ml)

A 5 3 2 0

B 5 3 1,5 0,5

C 5 3 1 1

D 5 3 0,5 1,5

E 5 3 0 2

Zkumavky nechte 5 minut vytemperovat v termostatu na 37 °C. V téže lázni vytemperujte i nádobu s enzymem. Potom do zkumavky B rychle pipetujte roztok enzymu, promíchejte a nechte inkubovat. Přesně po 15 minutách reakci zastavte přídavkem 2 ml roztoku NaOH. Inkubace s enzymem v temperovaných czkumavkách C až E se začíná v jednominutových intervalech po sobě a obdobně také po 15 minutách končí. Nakonec přidejte 2 ml NaOH do

76

5 Charakterizace enzymů Biochemické praktikum I, katedra biochemie, PřF UK v Praze, 2015/2016 zkumavky A, která slouží jako kontrola. Obsah zkumavek promíchejte a z každé odeberte 2 vzorky po 1 ml. V nich stanovte redukující cukry podle Schoorla. Stanovení redukujících cukrů podle Schoorla: Redukujícími cukry se redukuje dvojmocná měď Fehlingova činidla na oxid měďný. Okyselením kyselinou sírovou se z komplexu uvolní nadbytek soli měďnaté, která se redukuje jodidovými ionty na sůl měďnou. Reakcí měďných iontů s nadbytečným jodidem draselným vzniká ihned těžce rozpustný jodid měďný. Elementární jód, který se při reakci uvolnil, se titruje roztokem thiosíranu sodného. 2CuSO4 + 4KI → 2CuI + 2K 2 SO4 + I2 𝐼2 + 2𝑁𝑎2 𝑆2 𝑂3 → 2𝑁𝑎𝐼 + 𝑁𝑎2 𝑆4 𝑂6 Chemikálie Fehlingův roztok I: 6,93 g krystalického CuSO4·5 H5O se rozpustí ve 100 ml vody Fehlingův roztok II: 36,4 g vinanu sodno-draselného C4H4O6 NaK·4 H2O a 10 g hydroxidu sodného se rozpustí ve 100 ml vody Před použitím se smísí roztoky I a II v poměru 1:l Zředěná kyselina sírová, (1 objem koncentrované H2SO4 a 4 objemy destilované vody) Jodid draselný p.a. 0,05 M Na2S2O3 1% roztok škrobu v nasyceném roztoku NaCl Postup Do baňky na 250 ml pipetujte 10 ml Fehlingova roztoku I a 10 ml roztoku II, přidejte přesně odměřený vzorek obsahující sacharid a doplňte vodou na 50 ml. Baňku postavte na elektrický vařič, který je zapnut na takový stupeň žhavení, aby kapalina v baňce vřela během tří minut. Vaří se přesně dvě minuty a pak se baňka rychle ochladí tekoucí vodou na teplotu místnosti. K ochlazené kapalině přidejte roztok 3 g jodidu draselného v 10 ml destilované vody, okyselte 10 ml zředěné kyseliny sírové a ihned titrujte 0,05 M thiosíranem sodným do slabě hnědožlutého zabarvení. Pak přidejte několik kapek roztoku škrobu a pomalu dotitrujte, až zmizí fialové zbarvení a zbude nažloutle bílá barva jodidu měďného, která se několik minut nemění. Za stejných podmínek se provede i slepý pokus. Z rozdílu obou titrací, které se provedou dvakrát, odečtěte ze Schoorlovy tabulky množství sacharidu. Množství pro necelé mililitry se odvodí interpolací mezi dvěma sousedními hodnotami.

77

5 Charakterizace enzymů Biochemické praktikum I, katedra biochemie, PřF UK v Praze, 2015/2016 Schoorlova tabulka závislosti spotřeby na koncentraci některých cukrů: 0,05 M Na2S2O3 [ml]

Glukosa [mg]

Fruktosa [mg]

Galaktosa [mg]

Mannosa [mg]

Arabinosa [mg]

Xylosa [mg]

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27

3,2 6,3 9,4 12,6 15,9 19,2 22,4 25,6 28,9 32,3 35,7 39,0 42,4 45,8 49,3 52,8 56,3 59,8 63,3 66,9 70,7 74,5 78,5 82,6 86,6 90,7 94,8

3,2 6,4 9,7 13,0 16,4 20,0 23,7 27,4 31,1 34,9 38,7 42,4 46,2 50,0 53,7 57,5 61,2 65,0 68,7 72,4 76,2 80,1 84,0 87,8 91,7 -

3,3 7,0 10,4 14,0 17,5 21,1 24,7 28,3 32,0 35,7 39,4 43,1 46,8 50,5 54,3 58,1 61,9 65,7 69,6 73,4 77,2 81,2 85,1 89,0 93,0 -

3,1 6,3 9,5 12,8 16,1 19,4 22,8 26,2 29,6 33,0 36,5 40,0 43,5 47,0 50,6 54,2 57,9 62,6 65,3 69,2 73,1 70,0 81,0 85,0 89,0 -

3,0 6,0 9,2 12,3 15,5 18,6 21,9 25,2 28,6 32,0 35,4 38,8 42,2 45,6 49,0 52,4 55,8 59,3 62,9 66,5 70,2 74,0 77,9 81,8 85,7 -

3,1 6,3 9,5 12,8 16,1 19,4 22,8 26,2 29,6 33,0 36,5 40,0 43,5 47,0 50,6 54,2 57,9 62,6 65,3 69,2 73,1 77,0 81,0 85,0 89,0 -

Rhamnosa Sacharosa [mg] [mg]

3,2 6,5 9,9 13,3 16,8 20,2 23,7 27,2 30,8 34,4 38,0 41,6 45,2 48,8 52,4 56,0 59,8 63,5 67,3 71,0 74,8 78,6 82,4 86,2 90,0 -

3,1 6,2 9,3 12,4 15,6 18,8 22,0 25,2 28,4 31,7 35,0 38,3 41,6 44,9 48,2 51,6 55,1 58,7 62,3 65,9 69,6 73,3 77,1 80,9 84,7 -

Vyhodnocení výsledků 1. Množství titračního činidla převeďte na množství rozštěpené sacharosy podle Schoorlovy tabulky. 2. Do tabulky sestavte množství vzniklého produktu pro obě sady enzymových reakcí, jejich průměr a množství enzymu použitého v reakci. 3. Sestrojte graf závislosti množství produktu (rozštěpené sacharosy) na množství enzymu.

78

5 Charakterizace enzymů Biochemické praktikum I, katedra biochemie, PřF UK v Praze, 2015/2016

5.13.

Stanovení Michaelisovy konstanty -fruktosidasy

Enzym -fruktosidasa (-D-fruktofuranosid-fruktohydrolasa E.C. 3.2.1.26) katalyzuje hydrolytické štěpení sacharosy - neredukujícího disacharidu - na ekvimolární směs glukosy a fruktosy, označovanou jako invertní cukr (podle změny znaménka rotace roztoku vznikem silně levotočivé fruktosy). Protože tyto monosacharidy, narozdíl od výchozího substrátu, mají redukční vlastnosti, lze užít ke sledování působení enzymu stanovení založeného na redukčních vlastnostech cukrů, vhodná je např. metoda Schoorlova. K přípravě enzymu se využívá nejčastěji pekařského nebo pivovarského droždí.

Cíl Stanovit Michaelisovu konstantu Km -fruktosidasy pro sacharosu. Chemikálie 20% roztok sacharosy 0,2 M kyselina octová 0,2 M octan sodný 0,1 M acetátový pufr (pH 4,6): připravte sami ze zásobních roztoků: 25,5 ml 0,2M kyseliny octové a 24,5 ml 0,2 M octanu sodného, upravte na 0,1 M koncentraci, překontrolujte pH. 1% hydroxid sodný činidla na stanovení redukujících cukrů podle Schoorla roztok enzymu: 10 g čerstvého droždí rozetřete v třecí misce s 10 až 15 g skelného prachu, přidejte po částech 5 ml vody a rozetřete 5 minut. Potom v několika dávkách přidejte ještě 35 ml vody, dobře promíchejte a nechte stát 30 minut při teplotě 25 až 30 °C. Pak suspenzi centrifugujte 20 minut při 4000 otáčkách/minutu, získáte jasný nebo mírně opalizující roztok. Postup Do šesti zkumavek pipetujte roztoky s výjimkou roztoku enzymu podle následujícího schématu: Zkumavka Roztok sacharosy (ml) Voda (ml) Pufr (ml) Roztok enzymu (ml)

A 0 5 3 2

B 0,5 4,5 3 2

C 1 4 3 2

D 2 3 3 2

E 3 2 3 2

F 5 0 3 2

Zkumavky nechte vytemperovat v termostatované vodní lázni na 37 °C nejméně 5 minut. V téže lázni současně vytemperujte nádobu s enzymem. Potom se do zkumavky B rychle pipetujte roztok enzymu, promíchejte a nechte v termostatu přesně 15 minut. Pak reakci zastavte přídavkem 2 ml roztoku NaOH. Inkubace s enzymem v temperovaných zkumavkách C až F se začíná v jednominutových intervalech po sobě a analogicky se po 15 minutách končí. Nakonec se přidají 2 ml NaOH do zkumavky A, která slouží jako slepý pokus. Obsah zkumavek promíchejte a z každé odeberte dva vzorky po 1 ml. V nich stanovte redukující cukry podle Schoorla. V tabulce se použijí údaje pro sacharosu. 79

5 Charakterizace enzymů Biochemické praktikum I, katedra biochemie, PřF UK v Praze, 2015/2016 Stanovení redukujících cukrů podle Schoorla: Redukujícími cukry se redukuje dvojmocná měď Fehlingova činidla na oxid měďný. Okyselením kyselinou sírovou se z komplexu uvolní nadbytek soli měďnaté, která se redukuje jodidovými ionty na sůl měďnou. Reakcí měďných iontů s nadbytečným jodidem draselným vzniká ihned těžce rozpustný jodid měďný. Elementární jód, který se při reakci uvolnil, se titruje roztokem thiosíranu sodného. 2CuSO4 + 4KI → 2CuI + 2K 2 SO4 + I2 𝐼2 + 2𝑁𝑎2 𝑆2 𝑂3 → 2𝑁𝑎𝐼 + 𝑁𝑎2 𝑆4 𝑂6 Chemikálie Fehlingův roztok I: 6,93 g krystalického CuSO4·5 H5O se rozpustí ve 100 ml vody Fehlingův roztok II: 36,4 g vinanu sodno-draselného C4H4O6 NaK·4 H2O a 10 g hydroxidu sodného se rozpustí ve 100 ml vody Před použitím se smísí roztoky I a II v poměru 1:l Zředěná kyselina sírová, (1 objem koncentrované H2SO4 a 4 objemy destilované vody) Jodid draselný p.a. 0,05 M Na2S2O3 1% roztok škrobu v nasyceném roztoku NaCl Postup Do baňky na 250 ml pipetujte 10 ml Fehlingova roztoku I a 10 ml roztoku II, přidejte přesně odměřený vzorek obsahující sacharid a doplňte vodou na 50 ml. Baňku postavte na elektrický vařič, který je zapnut na takový stupeň žhavení, aby kapalina v baňce vřela během tří minut. Vaří se přesně dvě minuty a pak se baňka rychle ochladí tekoucí vodou na teplotu místnosti. K ochlazené kapalině přidejte roztok 3 g jodidu draselného v 10 ml destilované vody, okyselte 10 ml zředěné kyseliny sírové a ihned titrujte 0,05 M thiosíranem sodným do slabě hnědožlutého zabarvení. Pak přidejte několik kapek roztoku škrobu a pomalu dotitrujte, až zmizí fialové zbarvení a zbude nažloutle bílá barva jodidu měďného, která se několik minut nemění. Za stejných podmínek se provede i slepý pokus. Z rozdílu obou titrací, které se provedou dvakrát, odečtěte ze Schoorlovy tabulky množství sacharidu. Množství pro necelé mililitry se odvodí interpolací mezi dvěma sousedními hodnotami.

80

5 Charakterizace enzymů Biochemické praktikum I, katedra biochemie, PřF UK v Praze, 2015/2016 Schoorlova tabulka závislosti spotřeby na koncentraci některých cukrů: 0,05 M Na2S2O3 [ml]

Glukosa [mg]

Fruktosa [mg]

Galaktosa [mg]

Mannosa [mg]

Arabinosa [mg]

Xylosa [mg]

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27

3,2 6,3 9,4 12,6 15,9 19,2 22,4 25,6 28,9 32,3 35,7 39,0 42,4 45,8 49,3 52,8 56,3 59,8 63,3 66,9 70,7 74,5 78,5 82,6 86,6 90,7 94,8

3,2 6,4 9,7 13,0 16,4 20,0 23,7 27,4 31,1 34,9 38,7 42,4 46,2 50,0 53,7 57,5 61,2 65,0 68,7 72,4 76,2 80,1 84,0 87,8 91,7 -

3,3 7,0 10,4 14,0 17,5 21,1 24,7 28,3 32,0 35,7 39,4 43,1 46,8 50,5 54,3 58,1 61,9 65,7 69,6 73,4 77,2 81,2 85,1 89,0 93,0 -

3,1 6,3 9,5 12,8 16,1 19,4 22,8 26,2 29,6 33,0 36,5 40,0 43,5 47,0 50,6 54,2 57,9 62,6 65,3 69,2 73,1 70,0 81,0 85,0 89,0 -

3,0 6,0 9,2 12,3 15,5 18,6 21,9 25,2 28,6 32,0 35,4 38,8 42,2 45,6 49,0 52,4 55,8 59,3 62,9 66,5 70,2 74,0 77,9 81,8 85,7 -

3,1 6,3 9,5 12,8 16,1 19,4 22,8 26,2 29,6 33,0 36,5 40,0 43,5 47,0 50,6 54,2 57,9 62,6 65,3 69,2 73,1 77,0 81,0 85,0 89,0 -

Rhamnosa Sacharosa [mg] [mg]

3,2 6,5 9,9 13,3 16,8 20,2 23,7 27,2 30,8 34,4 38,0 41,6 45,2 48,8 52,4 56,0 59,8 63,5 67,3 71,0 74,8 78,6 82,4 86,2 90,0 -

3,1 6,2 9,3 12,4 15,6 18,8 22,0 25,2 28,4 31,7 35,0 38,3 41,6 44,9 48,2 51,6 55,1 58,7 62,3 65,9 69,6 73,3 77,1 80,9 84,7 -

Vyhodnocení výsledků 1. Množství titračního činidla převeďte na množství rozštěpené sacharosy podle Schoorlovy tabulky. 2. Do tabulky sestavte rychlost reakce (je úměrná množství rozštěpené sacharosy za 15 minut) pro obě sady enzymových reakcí, jejich průměr a příslušnou koncentraci substrátu. 3. Sestrojte graf závislosti rychlosti reakce katalyzované β-fruktosidasou na koncentraci substrátu. 4. Určete Michaelisovu konstantu Km β-fruktosidasy pro sacharosu z dvojitého reciprokého vynesení podle Lineweavera a Burka nebo pomocí nelineární regrese (např. programem EXCEL). Postup vyhodnocení Km nelineární regresí: V Excelu si připravte 2 buňky pro Km a Vmax, do kterých zadáte odhad (v našem případě buňka B1 a B2). Potom do 1. sloupce (A) vyplňte všechny hodnoty koncentrace substrátu, které jste použili, do 2. sloupce (B) hodnoty příslušné rychlosti reakce, kterou jste pro danou koncentraci substrátu naměřili (případně vypočítali). Do 3. sloupce (C) vložte vzorec pro výpočet rychlosti reakce = Vmax.[S]/(Km+[S]) neboli =$B$2*A4/($B$1+A4) a kopírujte pro všechny hodnoty koncentrace substrátu. Do 4. sloupce

81

5 Charakterizace enzymů Biochemické praktikum I, katedra biochemie, PřF UK v Praze, 2015/2016 (D) vložte vzorec pro výpočet chyby mezi naměřenou a vypočtenou hodnotou = (νteor- ν)^2 neboli (C4-B4)^2. Sečtěte všechny chyby v buňce pod tabulkou (např. buňka D10). Nyní v záložce DATA využijte doplněk řešitel a jako účelovou funkci (ve starších verzích cílovou buňku) zadejte D10 (aby součet všech chyb) byl = 0 měněním buněk B1 a B2 (označíte obě buňky najednou v okně proměnné modelu). Pak už dáte pouze řešit a výsledek by se měl objevit namísto původních odhadů. Vypočtené hodnoty Km a Vmax pak lze využít i k proložení naměřených hodnot. Do jiného sloupce např. E zadáte koncentraci substrátu, tentokrát ale podrobně např. krok 0,01, v sloupci F opět spočítáte rychlost reakce: =$B$2*E4/($B$1+E4) pro všechny zadané hodnoty. Do grafu závislosti rychlosti reakce na koncentraci substrátu (osa x: A, osa y B) pak přidáte další řadu (zdrojová data osa x: E, osa y F, u které nedáte zobrazit body, ale pouze čáru-s dostatečným počtem hodnot bude hladká a bude mít tvar podle Michaelise-Mentenové. 1 2 3

A Km Vmax [S] (mM)

B

ν naměřená

C mM µmol·min-1·ml-1 ν vypočtená

82

D

E

F

chyba

[S] (mM)

ν vypočtená

5 Charakterizace enzymů Biochemické praktikum I, katedra biochemie, PřF UK v Praze, 2015/2016

5.14.

Závislost aktivity -D-glukosidasy na čase

Sladké mandle obsahují vedle řady jiných glykosidas také -D-glukosidasu (-Dglukosid-glukohydrolasa, E.C. 3.2.1.21). Jednoduchým izolačním postupem z nich lze získat preparát nazvaný emulsin o značné -D-glukosidasové aktivitě. Enzym -D-glukosidasa hydrolyzuje specificky glykosidovou vazbu -D-glukosidu podle rovnice:

Reakci lze sledovat stanovováním přírůstku některého z produktů. Při inkubaci enzymu s fenyl--D-glukosidem vzniká fenol, který reaguje s 4-amino-antipyrinem v přítomnosti ferrikyanidu podle rovnice:

Vzniklá červeně zbarvená sloučenina může sloužit k citlivému spektrofotometrickému stanovení aglykonu. Barevná reakce se provádí v alkalickém prostředí (k neutralizaci vznikajících vodíkových iontů), které zároveň zastavuje enzymovou reakci. Cíl Zjistit aktivitu β-glukosidasy v emulsinu. Chemikálie a vybavení emulsin: 25 mg rozpusťte ve 2,5 ml destilované vody a centrifugujte podle pokynů asistenta. Emulsin je již připraven následujícím postupem: Jemně rozemleté mandle se opakovaně (3-4) extrahují nadbytkem toluenu, suspenze se zfiltruje a rozemleté mandle se usuší při laboratorní teplotě v digestoři. 10 g rozemletých odtučněných mandlí se rozmíchá s chladným roztokem 0,5 g krystalického síranu zinečnatého ve 45 ml vody a ponechá se při teplotě 0 °C 4 - 5 hodin. Chladný roztok se přefiltruje přes gázu a ta se vymačká. K filtrátu se opatrně přidá roztok 14 mg taninu v 5 ml vody. Sraženina, sestávající převážně z nečistot, se odstředí a vyhodí. Hlavní část enzymu se vysráží z filtrátu pomalým přidáním roztoku 0,15 g taninu v 5 ml vody. Sraženina se odstředí a zbaví taninu několikerým promytím acetonem a následujícím odstředěním. Vysuší se v exsikátoru nad koncentrovanou kyselinou sírovou. Rozetře se a suchý prášek se uchovává v lednici. glycinový pufr (pH 10,4): již k dispozici (z roztoku obsahujícího 4,51 g glycinu a 3,48 g NaCl v 500 ml bylo odebráno 54 ml a smícháno se 46 ml 0,1 M hydroxidu sodného, pH roztoku bylo upraveno na hodnotu 10,4) 1 % roztok 4-aminoantipyrinu ve vodě 3% roztok ferrikyanidu ve vodě 2,5 mM standardní roztok fenolu: již k dispozici (47 mg čistého fenolu bylo rozpušteno v 200 ml destilované vody) 0,01 M fenyl-β-D-glukosid: již k dispozici (290 mg glykosidu se rozpustí ve 100 ml destilované vody) 83

5 Charakterizace enzymů Biochemické praktikum I, katedra biochemie, PřF UK v Praze, 2015/2016 pufr podle McIlvainea (pH 5,0): 24,3 ml 0,1 M kyseliny citronové se smísí s 25,7 ml 0,2 M Na2HPO4 a doplní do 100 ml destilovanou vodou spektrofotometr. Postup Kalibrace: Do 5 zkumavek pipetujte 0,2; 0,4; 0,6; 0,8 a 1,0 ml roztoku fenolu a doplní se vodou do 1 ml. Zároveň proveďte slepý pokus s 1,0 ml vody. Do všech zkumavek přidejte 9,0 ml glycinového pufru, 1,0 ml roztoku 4-aminoantipyrinu a 3,0 ml roztoku ferrikyanidu. Promíchejte a po 10 minutách měřte absorbanci při 545 nm proti slepému pokusu. Ze získaných hodnot sestavte kalibrační křivku - závislost absorbance na množství fenolu. Měření aktivity: Do inkubační zkumavky pipetujte po 5,0 ml roztoku fenyl-β-D-glukosidu a 3,0 ml McIlvaineova pufru (pH 5,0). Zkumavku vložte do termostatované lázně (37 °C) a po vyrovnání teploty (asi 10 minut) rychle pipetujte 2,0 ml roztoku enzymu, promíchejte a ihned pipetujte 1,0 ml směsi do předem připravené zkumavky, obsahující 9,0 ml glycinového pufru (čas t = 0). Z inkubační zkumavky pak odebírejte přesně po 5, 10, 15, 20 a 30 minutách po 1,0 ml roztoku, pipetuje do zkumavek s 9,0 ml glycinového pufru a ihned promíchejte. Do všech zkumavek přidejte po 1,0 ml roztoku 4-aminoantipyrinu a 3,0 ml roztoku ferrikyanidu, promíchejte se a po 10 minutách měřte absorbance proti vzorku t = 0. Vyhodnocení výsledků 1. Sestavte kalibrační graf-závislost absorbance na látkovém množství fenolu vyjádřeném v µmol. 2. Sestrojte graf závislosti množství uvolněného fenolu v reakci katalyzované β-glykosidasou na čase. 3. Z grafu určete počáteční rychlost reakce jako směrnici tečny v čase t = 0. Aktivitu vzorku vyjádřete jako množství fenolu uvolněné 1 ml enzymového preparátu za 1 minutu. Kontrolní otázky: 1. β-D-glukosu a α-D-glukosu lze označit za isomery, stereoisomery, konformery, epimery, anomery nebo enantiomery? Vysvětlete. (I více označení může být správných.) 2. Navrhněte jiný způsob stanovení aktivity β-D-glukosidasy. 3. Jaké podmínky musí být splněny, aby získané hodnoty aktivity bylo možno vyjádřit v katalech.

84

5 Charakterizace enzymů Biochemické praktikum I, katedra biochemie, PřF UK v Praze, 2015/2016

5.15. Stanovení pH optima a Michaelisovy konstanty -Dglukosidasy Sladké mandle obsahují vedle řady jiných glykosidas také -D-glukosidasu (-Dglukosid-glukohydrolasa, E.C. 3.2.1.21). Jednoduchým izolačním postupem z nich lze získat preparát nazvaný emulsin o značné -D-glukosidasové aktivitě. Enzym -D-glukosidasa hydrolyzuje specificky glykosidovou vazbu -D-glukosidu podle rovnice:

Reakci lze sledovat stanovováním přírůstku některého z produktů. Při inkubaci enzymu se substrátem p-nitrofenyl--D-glukosidem vzniká p-nitrofenol, který má v alkalickém prostředí žlutou barvu a lze stanovit spektrofotometricky při vlnové délce 405 nm.

Cíl Stanovit pH optimum, Michaelisovu konstantu a maximální rychlost β-D-glukosidasy v emulsinu. Chemikálie a vybavení emulsin: 25 mg rozpusťte ve 2,5 ml destilované vody a přefiltrujte přes skládaný filtr. Emulsin je již připraven následujícím postupem: Jemně rozemleté mandle se opakovaně (3-4) extrahují nadbytkem toluenu, suspenze se zfiltruje a rozemleté mandle se usuší při laboratorní teplotě v digestoři. 10 g rozemletých odtučněných mandlí se rozmíchá s chladným roztokem 0,5 g krystalického síranu zinečnatého ve 45 ml vody a ponechá se při teplotě 0 °C 4 - 5 hodin. Chladný roztok se přefiltruje přes gázu a ta se vymačká. K filtrátu se opatrně přidá roztok 14 mg taninu v 5 ml vody. Sraženina, sestávající převážně z nečistot, se odstředí a vyhodí. Hlavní část enzymu se vysráží z filtrátu pomalým přidáním roztoku 0,15 g taninu v 5 ml vody. Sraženina se odstředí a zbaví taninu několikerým promytím acetonem a následujícím odstředěním. Vysuší se v exsikátoru nad koncentrovanou kyselinou sírovou. Rozetře se a suchý prášek se uchovává v lednici. 0,1 M borátový pufr pH 9 již k dispozici (38,1 g Na2B4O7.10 H2O bylo rozpuštěno v 1 l destilované vody, pH upraveno na 9 0,1 M kyselinou boritou (0,6183 g H3BO3 rozpuštěno ve 100 ml destilované vody). 5 mM roztok p-nitrofenyl-β-D-glukopyranosidu (15 mg se rozpustí v 10 ml destilované vody) 0,1 mM standardní roztok p-nitrofenolu: 13,5 mg p-nitrofenolu rozpusťte ve 100 ml borátového pufru pH 9). McIlvainovy pufry o pH 3,0-8,3 připravte podle následující tabulky: 85

5 Charakterizace enzymů Biochemické praktikum I, katedra biochemie, PřF UK v Praze, 2015/2016 zkumavka č. 0,1 M kys. citronová ml 0,2 M Na2HPO4 ml pH 1 6,40 1,60 3,0 2 5,20 2,80 4,0 3 4,00 4,00 4,8 4 3,50 4,50 5,4 5 3,20 4,80 5,8 6 2,20 5,80 6,6 7 1,40 6,60 7,0 8 0,50 7,50 7,6 9 0,20 7,80 8,0 10 0,00 8,00 8,3 4 mM, 3 mM, 2 mM, 1 mM a 0,5 mM roztok substrátu p-nitrofenyl-β-D-glukopyranosidu (připravte sami každého 1 ml ze zásobního 5 mM roztoku) spektrofotometr. Postup Kalibrace: Z 0,1 mM standardního roztoku p-nitrofenolu a borátového pufru pH 9 připravte kalibrační řadu: 1 ml 0,08 mM; 0,06 mM; 0,04 mM a 0,02 mM roztoku p-nitrofenolu. Promíchejte a měřte absorbanci všech pěti roztoků při 405 nm proti slepému pokusu (borátovému pufru pH 9). Ze získaných hodnot sestavte kalibrační křivku - závislost absorbance na látkovém množství fenolu. Stanovení pH optima: Do 10 mikrozkumavek pipetujte 50 l McIlvainova pufru o daném pH, 50 l 5 mM substrátu p-nitrofenyl-β-D-glukopyranosidu a reakci iniciujte 100 l roztoku enzymu obsaženého v emulsinu. Přesně po 10-ti minutách enzymovou reakci ukončete přidáním 800 l borátového pufru pH 9 a ihned měřte absorbanci při 405 nm proti slepým pokusům. Slepé pokusy připravíte pro každé pH zvlášť (dalších 10 mikrozkumavek) pipetováním 100 l roztoku enzymu přímo do 800 l borátového pufru pH 9 (vysokým pH se enzym inaktivuje) a přidáním 50 l McIlvainova pufru daného pH a 50 l 5 mM substrátu p-nitrofenyl-β-D-glukopyranosidu (slepý pokus má stejné složení jako vzorek, avšak enzymová reakce v něm neprobíhá). Promíchejte a měřte absorbanci při 405 nm. Stanovení Km: Do 5 mikrozkumavek pipetujte 50 l McIlvainova pufru o pH optimu (viz předešlý odstavec), 50 l roztoku substrátu p-nitrofenyl-β-D-glukopyranosidu (o koncentraci 5 mM, 4 mM, 3 mM, 2 mM, 1 mM a 0,5 mM) a reakci iniciujte 100 l roztoku enzymového preparátu emulsinu. Přesně po 10-ti minutách reakci ukončete přidáním 800 l borátového pufru pH 9 a ihned měřte absorbanci při 405 nm proti slepým pokusům. Ty připravíte obdobně jako v předchozím případě, 100 l enzymu se ihned inaktivuje 800 l borátového pufru pH 9 a teprve poté se přidá 50 l McIlvainova pufru o pH optimu a 50 l roztoku substrátu p-nitrofenyl-β-D-glukopyranosidu (o koncentraci 5 mM, 4 mM, 3 mM, 2 mM, 1 mM a 0,5 mM). Vyhodnocení výsledků 1. Sestavte kalibrační graf-závislost absorbance na látkovém množství p-nitrofenolu vyjádřeném v µmol. 2. Sestrojte graf závislosti aktivity β-glukosidasy (tj. látkového množství uvolněného p-nitrofenolu v reakci katalyzované β-glykosidasou za čas vztažené na ml enzymového preparátu) na pH pufru, ve kterém probíhala enzymová reakce. 3. Určete pH optimum reakce katalyzované β-glukosidasou.

86

5 Charakterizace enzymů Biochemické praktikum I, katedra biochemie, PřF UK v Praze, 2015/2016 4. Sestrojte grafy závislosti rychlosti reakce katalyzované β-glukosidasou v mol·min-1·ml-1 neboli U·ml-1 na koncentraci substrátu p-nitrofenyl-β-D-glukopyranosidu. 5. Určete Michaelisovu konstantu Km a maximální rychlost reakce Vmax β-glukosidasy pro p-nitrofenyl-β-D-glukopyranosid z dvojitého reciprokého vynesení podle Lineweavera a Burka nebo pomocí nelineární regrese (např. programem EXCEL).

87

6 Nukleové kyseliny Biochemické praktikum I, katedra biochemie, PřF UK v Praze, 2015/2016

6. NUKLEOVÉ KYSELINY Deoxyribonukleová kyselina (DNA) je nositelkou genetické informace. Primární strukturou DNA je lineární polymer, který se skládá z nukleotidů. Nukleotidy jsou složeny z cukru deoxyribosy, fosfátové skupiny a jedné ze čtyř dusíkatých bází – adenin (A), guanin (G), cytosin (C) nebo thymin (T). První dvě patří mezi puriny, zbylé mezi pyrimidiny. Dvě vlákna DNA se antiparalelně spojují a vytvářejí dvoušroubovici. Mezi protilehlými bázemi obou vláken se vytvářejí vodíkové můstky. Nejčastěji, při klasickém párování, mezi guaninem a cytosinem nebo mezi adeninem a thyminem (viz obrázek vpravo). Díky svému informačnímu obsahu je DNA velmi zkoumanou molekulou a byla vyvinuta řada technik její izolace, separace, vizualizace, sekvenování i amplifikace. Všechny tyto postupy jsou důležité pro lékaře, kriminalisty či evoluční biology – DNA je zásadním nástrojem pro diagnostiku nemocí, testy otcovství, vyšetřování zločinů, vytváření nových plodin či třeba hledání příbuzenských vztahů mezi organismy.

88

6 Nukleové kyseliny Biochemické praktikum I, katedra biochemie, PřF UK v Praze, 2015/2016

6.1. Identifikace fingerprinting

pachatele

vraždy

metodou

DNA

Analýza DNA na základě polymorfismu délky restrikčních fragmentů (Restriction Fragment Length Polymorphism – RFLP), objevené anglickým genetikem Alecem Jeffreysem roku 1985, je jednou z technik využívaných ve forenzních laboratořích. Při RFLP je DNA štěpena jednou nebo více restrikčními endonukleasami a vzniklá směs fragmentů je následně separována v agarosovém gelu. Výsledek separace je vizualizován pomocí obarvení DNA a nebo pomocí hybridizace se specifickými DNA sondami. Výsledek RFLP analýzy (detekovaný ve formě proužků odpovídajících DNA fragmentů) je pro určitou sekvenci DNA jedinečný na základě unikátní přítomnosti restrikčních míst přítomných v této sekvenci. Restrikční endonukleasy byly objeveny jako součást obranného mechanismu bakterií proti bakteriálním virům (bakteriofágům). Jsou to enzymy štěpící nukleové kyseliny uvnitř jejich molekuly. Pojmenovávají se zkratkou podle bakterie, ze které byly izolovány, následované číslem podle pořadí, ve kterém byly izolovány (např. enzym EcoRI byl první restriktasou tohoto typu izolovanou z Escherichia coli). Na DNA rozeznávají restrikční místo, neboli rozpoznávací sekvenci (specifické DNA několika – nejčastěji 6 – párů bazí), a buď štěpí přímo v tomto místě, nebo o několik páru bází mimo toto místo. Na obrázku jsou znázorněny rozpoznávané sekvence (místa v molekule DNA) dvou běžně používaných enzymů (EcoRI a PstI) a jednoho méně častého (BanI) a jakým způsobem jsou tyto sekvence štěpeny. EcoRI

PstI

BanI (Y = pyrimidinová; R = purinová báze)

Koncentrace a čistota DNA se stanovuje spektrofotometricky za využití faktu, že dvouvláknová DNA o koncentraci 50 mg/l vykazuje při 260 nm jednotkovou absorbanci a zároveň čistá dvouvláknová DNA by měla mít absorbanci při 280 nm asi 1,8-2× menší, než při 260 nm. Elektroforéza v agarosovém gelu umožňuje rozdělení fragmentů DNA podle velikosti. Fragmenty DNA jsou aplikovány do jamek agarosového gelu umístěném ve vodivém elektrodovém pufru. Pomocí stejnosměrného proudu se negativně nabité DNA fragmenty pohybují ke kladně nabité anodě. Rychlost pohybu DNA fragmentů agarosovým gelem v elektrickém poli je nepřímo úměrná jejich velikosti. Vzhledem k tomu, že DNA je bezbarvá, přidávají se ke vzorku ještě jiná barviva (nejčastěji bromfenolová modř a/nebo xylenkyanol), které DNA jako takovou neobarví, ale umožní snazší aplikaci vzorku i sledování průběhu elektroforézy. Barvy putují stejným směrem jako fragmenty DNA. Bromfenolová modř se pohybuje rychleji než xylenkyanol v 1,5% agarosovém gelu přibližně s DNA o velikosti 300 párů bazí (bp), zatímco xylenkyanol se v tomto gelu pohybuje současně s fragmenty o velikosti 4000 bp. DNA v gelu je možno detekovat několika metodami, nejčastější je použití fluorescenčního barviva (ethidium bromid, skupina SYBR barviv) které se interkaluje do dvoušroubovice. Toto barvivo je možné přidat buď přímo do gelu (ještě před nalitím do aparatury a ztuhnutím gelu), nebo následně po ukončení elektroforézy gel ponořit do lázně barvivo obsahující. Barvení tímto způsobem je velice citlivé, nicméně je třeba pracovat velmi obezřetně, neboť je použita látka specificky interagující s DNA. Méně citlivou metodou detekce DNA v gelu je použití methylenové modři (i pod různými komerčními označeními, např. Fast Blast DNA Stain), jejímiž největšími výhodami jsou menší toxicita a možnost zviditelnění DNA bez použití speciálních prosvěcovačů. Barvení methylenovou modří se provádí po skončení elektroforézy ponořením gelu do 0,002-0,02% roztoku na několik hodin. Případné výrazné pozadí je možné částečně eliminovat omýváním obarveného gelu ve vlažné vodě. Po

89

6 Nukleové kyseliny Biochemické praktikum I, katedra biochemie, PřF UK v Praze, 2015/2016 barvení mohou být vzorky porovnány jak mezi sebou, tak se standardem obsahujícím fragmenty DNA o známé velikosti. Cíl 1. Stanovit koncentraci DNA ve vzorcích. 2. Určit pachatele vraždy metodou RFLP pomocí vzorků DNA od 5 podezřelých a DNA odebrané z místa činu. 3. Vypočítat délku (v párech bazí) vzniklých fragmentů v analyzovaných vzorcích. Chemikálie DNA odebraná z místa činu DNA podezřelého č. 1; č. 2; č. 3; č. 4 a č. 5 (Pozn. Rozpuštěny v čisté vodě.) Koncentrát reakčního pufru (10× koncentrovaný – NEB CutSmart Buffer) (Pozn.: 1× koncentrovaný pufr obsahuje 50 mM octan sodný, 20 mM Tris-acetát pH 7.9 při 25°C, 10 mM octan hořečnatý a 100 μg/ml BSA) Restrikční endonukleasa BanI (20000 jednotek/μl; New England Biolabs) Standard DNA (100 bp DNA ladder; New England Biolabs) Barva pro aplikaci DNA do gelu Barva detekující DNA v gelu (SYBR Safe (Thermo Fisher), Fast Blast DNA stain (Bio-Rad) – methylenová modř) agarosa Elektroforetický TAE (Tris-acetát, EDTA, pH 8.5) pufr 50× koncentrovaný – připravte 300 ml 1× TAE ředěním s destilovanou vodou Pomůcky Horizontální elektroforetická souprava: nalévací souprava, vodováha, nalévací vana, hřeben Stojánek na mikrozkumavky Zdroj napětí Vařič (mikrovlnná trouba) Suchý blok na 37°C Nádoba s ledovou tříští Transiluminátor s modrým světlem (470nm) Fotoaparát Postup Restrikční štěpení vzorků DNA: Zkumavku s restrikčním enzymem označenou ENZ umístěte na led. Dále označte popisovačem 7 mikrozkumavek. Vše umístěte do stojánku na ledu.

90

6 Nukleové kyseliny Biochemické praktikum I, katedra biochemie, PřF UK v Praze, 2015/2016 Mikrozkumavka č. 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7.

P1 (podezřelý 1) P2 (podezřelý 2) P3 (podezřelý 3) P4 (podezřelý 4) P5 (podezřelý 5) MČ (místo činu 1 μg) MČ2 (místo činu 5 μg)

Stanovte koncentrace DNA ve vzorcích podezřelých a vzorku z místa činu měřením absorbancí na přístroji DeNovix. Do zkumavek pipetujte 1 μg příslušného vzorku DNA (vždy použijte novou špičku) a doplňte do 9 μl vodou (s výjimkou zkumavky 7, kam pipetujte 5 μg DNA). Ujistěte se, že vzorek je na dně mikrozkumavky. Přidejte 1 μl koncentrátu reakčního pufru, čímž získáte DNA v pufru vhodném pro restrikční štěpení. Do mikrozkumavek přidejte 0,2-0,5 μl restrikční endonukleasy BanI (ENZ) tak, aby se dostal na dno zkumavky (pipetujeme buď do roztoku, nebo na stěnu zkumavky těsně nad hladinu; v malém množství kapaliny na dně můžete pozorovat enzymový preparát klesající ke dnu díky glycerolu obsaženému v roztoku). Pro každou zkumavku použijte novou špičku! Důkladně mikrozkumavky uzavřete a promíchejte jemným proklepáváním prsty na mikrozkumavku. Poté sklepnutím zajistěte, aby veškerá kapalina byla na dně zkumavky. Inkubujte zkumavky 1 hodinu při 37°C. Elektroforetická separace DNA fragmentů: Z 50× koncentrovaného TAE pufru si připravte 300 ml 1× koncentrovaného ředěním s destilovanou vodou. Do Erlenmayerovy baňky připravte 1,25% agarosu ve 40 ml TAE pufru. Zahřívejte na vařiči na vodní lázni naplněné destilovanou vodou, dokud se agarosa zcela nerozpustí. Poté ochlaďte a po přidání 4 μl SYBR Safe a promíchání nalévejte do nalévací vaničky těsně upevněné v nalévací aparatuře. Bezprostředně po nalití roztoku umístěte hřeben do patřičných výřezů. Nalévací aparatura musí být předem vyrovnána pomocí stavěcích šroubů (zkontrolujte vodováhou). Po ztuhnutí vyjměte vaničku s agarosovým gelem z nalévací aparatury a umístěte ji do elektroforetické soupravy. Zajistěte, aby jamky agarosového gelu byly umístěny u černé (-) elektrody. Naplňte elektroforetickou soupravu připraveným TAE pufrem (přibližně 260 ml) tak, aby gel byl ponořen pod hladinou pufru.

91

6 Nukleové kyseliny Biochemické praktikum I, katedra biochemie, PřF UK v Praze, 2015/2016 Po uplynutí 60 minut štěpení vyjměte vzorky z 37°C. Přesvědčte se, že obsah zkumavek je na dně, případně s nimi poklepejte o stůl, nebo je mírně odstřeďte. Do každé zkumavky přidejte vždy novou špičkou 2 μl nanášecí barvy (LD, „loading dye“). Pipetu přenastavte na 12 μl, vzorek promíchejte opětovným nasátím a vypuzením a aplikujte do jamky agarosového gelu v aparatuře. Takto postupujte se všemi vzorky DNA. Dráha 1: DNA standard, 4 μl Dráha 2: P1, 12 μl Dráha 3: P2, 12 μl Dráha 4: P3, 12 μl Dráha 5. P4, 12 μl Dráha 6: P5, 12 μl Dráha 7: MČ, 12 μl Dráha 8: MČ2, 12 μl Pod dohledem asistenta zavřete víko elektroforézy (je možný pouze jeden způsob, aby se spojily kontakty, červený s červeným, černý s černým). Zapojte elektrody do zdroje napětí, opět červený do červeného, černý do černého). Nastavte napětí na 100 V a nechte vzorky separovat dokud bromfenolová modř nedoputuje přibližně 2 cm od konce gelu (30-60 minut). Vizualizace DNA fragmentů: Po separaci odpojte elektroforézu od zdroje napětí (opět pod dohledem asistenta), otevřete víko, vyjměte vaničku, umístěte ji na transiluminátor a pořiďte fotodokumentaci – doporučujeme si k úloze přinést fotoaparát, nebo alespoň mobilní telefon s fotoaparátem. Máte-li uspokojivou dokumentaci, vložte gel do Petriho misky s přiměřeným množstvím barvy Fast Blast DNA stain, tak aby byl gel ponořen. Gely nechte barvit přes noc. Přeneste gel do teplé (40-55°C) vody a promyjte jej. Změřte vzdálenost, kterou urazily jednotlivé fragmenty DNA od startu (konce jamky separačního gelu). Zpracování výsledků 1. Porovnejte účinnost barvení oběma metodami, povšimněte si rozdílů ve vzorcích z místa činu s rodílnou nanáškou. Dále pracujte pouze s fotografií z barvení pomocí SYBR Safe. 2. Vyhodnoťte, zda jsou některé proužky DNA fragmentů identické s fragmenty DNA odebrané z místa činu. Sestrojte graf závislosti log délky DNA fragmentů standardu na vzdálenosti od startu elektroforézy. Z grafu odečtěte délky fragmentů (v párech bazí) jednotlivých podezřelých. 3. Délky fragmentů lze spolu s množstvím DNA vyhodnotit také pomocí specializovaného softwaru (např. Gel Analyzer – http://www.gelanalyzer.com/).

92

7 Bezpečnostní předpisy pro chemické laboratoře Biochemické praktikum I, katedra biochemie, PřF UK v Praze, 2015/2016

7. BEZPEČNOSTNÍ LABORATOŘE

PŘEDPISY

PRO

CHEMICKÉ

Tyto předpisy jsou výtahem z ČSN 01 8003, pořízeným podle konkrétních podmínek pracovišť. Většina jejich ustanovení je doslovnou citací této normy. Další doporučující předpisy, přicházející v úvahu pro chemické laboratoře, zahrnují zejména: ČSN 65 0201 - Hořlavé kapaliny ON 73 5195 - Výstavba a úprava chemických laboratoří ČSN 07 8305 - Ocelové láhve se stlačenými a zkapalněnými plyny ČSN 34 1720 - Rentgenová záření a pracoviště ČSN 34 1730 - Radioaktivní látky ČSN 34 1730 - Elektrická zařízení ČSN 34 3500 - První pomoc při úrazech elektřinou ČSN 38 6601 - Plynové spotřebiče Vyhláška č. 50/1979 Sb. - odborná způsobilost v elektrotechnice Naříz. vlády č. 192/88 Sb. - jedy a látky zdraví škodlivé Vyhláška č. 110/1975 - registrace a evid. prac. úrazů Směrnice MŠ č. 26 956/86 - poskytování osobních ochranných prostředků Příslušné předpisy jsou k disposici u bezpečnostního technika fakulty a u odborných referentů bezpečnosti práce jednotlivých oborů. Všichni zaměstnanci, kteří mají přístup do chemických laboratoří, musí být PROKAZATELNĚ seznámeni s předpisy, přicházející v úvahu podle pracovního zařazení, jsou povinni tyto předpisy dodržovat a počínat si v souladu se svojí odbornou kvalifikací i v těch situacích, které nejsou doslovně dány předpisem. Dále jsou povinni účastnit se pravidelných školení bezpečnosti práce. Kontrolu těchto opatření provádějí vedoucí kateder a samostatných pracovišť nebo jimi pověření zaměstnanci. 1. Bezpečnost práce v chemické laboratoři vyžaduje dodržování bezpečnostních opatření, odpovídající povaze prostředí a látek, s nimiž se pracuje. 2. Laboratoře musí být vybaveny dostatečným počtem hasicích přístrojů, které musí být umístěny na viditelném a přístupném místě a pravidelně kontrolovány odbornými pracovníky. 3. Laboratoře musí být vybaveny dostatečným množstvím vhodných pracovních ochranných pomůcek (štíty, brýle, rukavice, zástěry apod.), které musí být udržovány ve funkčním stavu. Zaměstnanci musí být s užíváním ochranných pomůcek PROKAZATELNĚ seznámeni. Vedoucí laboratoře určí zaměstnance, který odpovídá za stav pomůcek. 4. Laboratoře musí být vybaveny prostředky pro poskytování první pomoci podle charakteru provozu (lékárničky). 5. Chemikálie musí být ukládány v uzavřených nádobách (obalech) z vhodného materiálu a označeny přesným názvem nebo vzorcem. Uskladnění a manipulace s jedy musí být prováděna v souladu s nařízením vlády č. 192/88 Sb. 6. Nádoby s kapalinami se musí chránit před přímými slunečními paprsky a ohřevem. 7. Alkalické kovy musí být ukládány pod ochrannou vrstvou interního rozpouštědla, bílý fosfor pod ochrannou vrstvou vody. Úbytek kapalin se musí doplňovat. 8. Rtuť se musí přechovávat pouze v nerozbitných nádobách. Množství nad 3 kg pouze v ocelových láhvích se šroubovým uzávěrem. 9. Látky, jejichž smícháním může být způsobena nebezpečná reakce, se musí ukládat odděleně. 10. V laboratořích musí být udržována čistota a pořádek. Únikové cesty musí být udržovány trvale volné. Nepotřebné předměty musí být průběžně odstraňovány.

93

7 Bezpečnostní předpisy pro chemické laboratoře Biochemické praktikum I, katedra biochemie, PřF UK v Praze, 2015/2016 11. Zaměstnanci musí být seznámeni se zacházením s hasicími přístroji, s požárními poplachovými směrnicemi a s tím, jak se chovat při úniku jedovatých plynů. 12. Laboratorní nádobí se nesmí používat k jídlu, pití a přechovávání potravin. Poživatiny nesmí být přechovávány v chladničkách, určených pro laboratorní použití. 13. Vyžaduje-li to charakter práce, musí se při práci používat vhodné ochranné pomůcky. 14. Každý zaměstnanec, který po skončení práce opouští laboratoř, se musí přesvědčit, zda je pracoviště v bezpečném a požárně nezávadném stavu. 15. Do odpadního potrubí je zakázáno vylévat rozpouštědla, která se nemísí s vodou, dále jedy, látky výbušné, louhy, koncentrované silné kyseliny, amoniak perhydrol a takové látky a jejich roztoky, které stykem s vodou, kyselinami nebo louhy uvolňují jedovaté nebo dráždivé plyny. Rovněž je zakázáno vylévat do odpadního potrubí biologický odpad. 16. Do odpadního potrubí se smějí vylévat v omezeném množství jednorázově nejvýše 0.5 l po zředění vodou alespoň 1:10 rozpouštědla s vodou dokonale mísitelná a kyseliny a louhy zředěné vodou nejméně 1:30. 17. Zbytky sodíku se likvidují rozpouštěním etanolu a vylitím roztoku do odpadního potrubí po patřičném zředění vodou. 18. Nádobí, které je znečištěno látkami zdraví nebezpečnými, musí být očištěno před předáním k umytí. Je zakázáno dávat k mytí poškozené nádobí. 19. Obsah olejové lázně se musí při zahřívání chránit před stykem s vodou a jinými kapalinami. 20. Střepy a jiné odpadky s ostrými hranami musí být odkládány do zvláštní odpadní nádoby. 21. Při práci s vakuem nebo přetlakem ve skle se musí používat jen vhodné nepoškozené nádobí, jehož odolnost vůči vakuu nebo přetlaku musí být předem přezkoušena. Aparatura musí být zakryta štítem nebo drátěnou sítí. 22. Při práci s látkami škodlivými zdraví je třeba dbát, aby nedocházelo k jejich styku s pokožkou, dýchacími orgány atd. 23. Veškerá manipulace s látkami dýmavými, zapáchajícími, dráždivými, jedovatými je dovolena provádět jen v digestoři s dostatečným odtahem. 24. Látky, jejichž rozpouštěním se uvolňuje teplo, se musí rozpouštět po částech za míchání a chlazení. 25. Při destilaci nízko vroucí hořlaviny se musí kontrolovat přívod vody do chladiče a odstranit z okolí všechny jiné hořlaviny do bezpečné vzdálenosti. 26. Při rozlití hořlaviny je nutno okamžitě zhasnout otevřený oheň, vypnout elektrický proud (v laboratoři), opustit místnost a postarat se o důkladné vyvětrání. Kapalina se asanuje vhodným porézním materiálem. Nepolární rozpouštědla rozlita na plastické hmotě se nesmějí roztírat (nebezpečí statické elektřiny). 27. Je zakázáno vytápět laboratoře přímým plamenem. 28. Hořlaviny je možno přechovávat v laboratoři pouze v množství, určeném pro bezprostřední použití. 29. Není dovoleno nechávat hořet kahany bez dozoru. 30. Při zjištění závady na plynové instalaci nebo spotřebiči je nutno příslušný úsek uzavřít a zajistit opravu. 31. Ocelové láhve se stlačenými plyny je nutno zajistit proti pádu třmeny, řetízky nebo uchycení ve stojanu. Vzdálenost ocelové láhve od otevřeného ohně musí být nejméně 3 m. 32. Místnosti, v nichž jsou ocelové láhve s plyny, musí být na dveřích označeny tabulkou s označením druhu plynu. 33. Plyny se smějí vypouštět z lahví pouze přes redukční ventil, určený pro daný plyn.

94

7 Bezpečnostní předpisy pro chemické laboratoře Biochemické praktikum I, katedra biochemie, PřF UK v Praze, 2015/2016 34. V laboratoři smějí být uloženy v blízkosti pracoviště nejvýše 2 láhve stejného druhu plynu. Láhve nesmějí být skladovány na volně přístupných místech (chodbách atd.). 35. V případě požáru je nutno z pracoviště nejprve odstranit ocelové láhve. 36. Uvnitř budovy smějí být ocelové láhve transportovány jedině na vozíku s našroubovaným kloboučkem. 37. Osoby bez elektrotechnické kvalifikace mohou: a) samostatně obsluhovat jednoduchá elektrická zařízení provedená tak, že při jejich obsluze nemohou přijít do styku s částmi pod napětím vyšším než 50 V. b) pracovat v blízkosti části pod napětím jen při dodržování bezpečných vzdáleností. 38. Opravovat, udržovat a rozšiřovat instalace elektrické energie a elektrického spotřebiče je dovoleno pouze osobám s příslušnou kvalifikací. 39. Tam, kde je pro objekt, budovu nebo její část vyhlášen zákaz kouření, musí být tento zákaz dodržován. Určené prostory, kde je dovoleno kouřit, musí být zřízeny v bezpečném prostředí, nesmějí být komunikačně spojeny s prostorami, kde se předpokládá nebezpeční výbuchu nebo požáru, a musí být zřetelně označeny. 40. V odůvodněných případech může vedoucí pracoviště po předchozím projednání s bezpečnostním technikem připojit k těmto předpisům doplňky, platné pro práce specielního charakteru. Sestavil: útvar BOZP a PO PřF UK Duben 1996

95