Molekulární aspekty kalcio-fosfátového metabolizmu u ledvinových komplikací diabetu mellitu
Diplomová práce se zabývá polymorfizmy v genu pro Calcium-sensing receptor (CASR) v souborech pacientů s diabetem a renálním postižením. Autorka vyslovuje hypotézu, že pravděpodobně CASR by mohl hrát patofyziologickou roli u pacientů s diabetem a nefropatií, neboť v těchto situacích dochází ke změnám vnitřního prostředí, které postihují také kalciofosfátový metabolizmus. Současně samotný CASR může pravděpodobně hrát roli v proliferaci extracelulární matrix u diabetické nefropatie. V rámci CASR genu byly stanoveny dva SNP, jeden méně často vyšetřovaný polymorfizmus v intronu 4, a dále druhý, frekventně vyšetřovaný polymorfizmus v exonu 7. Nekódující polymorfizmus v intronu 4 byl stanoven restrikční analýzou PCR produktu, zatímco polymorfizmus v exonu 7 měnící kodon 990 byl stanoven pomocí specifických TaqMan sond v „real-time PCR“. Současně byla vyšetřena mRNA-CASR v periferních leukocytech u vybrané skupiny diabetiků 1. a 2. typu, stejně jako u kontrol. Genetické vyšetření bylo provedeno v několika souborech – u pacientů s diabetem 1. a 2. typu bez probíhající nefropatie, u diabetiků s již rozvinutou nefropatií, u diabetiků s nefropatií nediabetického původu, u pacientů-nediabetiků s nefropatií a konečně u zdravých kontrol. Každý soubor zahrnoval současně muže i ženy. Stanovené genotypy (intron 4 – TT, TC, CC a exon 7 – AA, AG, GG) byly porovnány mezi jednotlivými skupinami pacientů. Genotyp GG byl zjištěn pouze u zdravých kontrol a nediabetiků s renálním selháním, proto jej autorka označuje jako „ochranný“ faktor vůči diabetu. Současně genotyp TC převažoval ve statisticky významné frekvenci u zdravých kontrol ve srovnání s ostatními skupinami, proto byl také označen jako „ochranný faktor“ vůči rozvoji diabetu a následným renálním komplikacím. V expresi CASR genu v periferních leukocytech nebyl zjištěn statisticky významný rozdíl mezi skupinou diabetiků a zdravými kontrolami. Diplomová práce hledá vztahy mezi systémy, které spolu zdánlivě úzce nesouvisí. V rámci tak komplexního metabolického onemocnění jako je diabetes mellitus jistě dochází také k postižení kalcio-fosfátového metabolizmu. Tím více pokud je pokročilý diabetes ještě komplikován chronickým renálním selháním. CASR je vedle svých typických cílových tkání exprimován také na beta buňkách v Langerhansových ostrůvcích pankreatu, a tak se nabízí hledání vztahu mezi tímto receptorem, jeho genetickými variabilitami a inzulínovou sekrecí i v jiných fyziologických situacích než je diabetická nefropatie. Možnou roli CASR u různých patogenetických jednotek dobře popisuje recentní review od Ward et al., Clinical Biochemistry, 2012. V diskusi autorka zmiňuje několik posledních publikací o CASR genu a jeho vztahu k např. kolorektálnímu karcinomu nebo primární hyperparatyreóze. Současně se ale příliš nedaří v diskusi do jednoho celku propojit právě vztah mezi CASR jako kandidátním genem pro kostní metabolizmus a diabetickou nefropatií. Na druhou stranu autorka vícekrát zmiňuje možnou roli CASR v proliferaci extracelulární matrix u diabetické nefropatie. Toto zajímavé tvrzení ale není podloženo citací. Hlavní připomínky: V rámci kapitoly Metody je velmi pěkně popsán postup stanovení obou SNP (sekvence primerů, podmínky PCR atd.). Z popisu není ale zřejmé, zda byl způsob stanovení obou SNP převzat od jiných autorů nebo zda byl originálně navržen. Ve výsledkové části by bylo vhodné u obou SNP doplnit frekvenci alel ve studovaných souborech (např. A= 0,9 a G = 0,1 pro G990R). Četnost (%) zjištěných genotypů by bylo
vhodné porovnat s jinými pracemi na srovnatelné kavkazské populaci. Tabulky s rozložením genotypů ve srovnatelných studiích doplňuje vyjádření Hardy-Weinbergovy rovnováhy potvrzující shodu mezi získanou a očekávanou frekvencí genotypů v dané populaci. Autorka zdůrazňuje, že genotyp TC představuje ochranný faktor vůči diabetu a jeho renálním komplikacím proto, že právě u zdravých kontrol (TC 65,6%) je výskyt této kombinace alel vyšší než v jiných skupinách. Z hlediska rozložení genotypů je zvláštní, že u zdravých kontrol převažuje heterozygotní genotyp, ale současně zcela chybí zastoupení CC jedinců. Pokud se v této skupině vyskytuje alela C natolik často, že heterozygotní genotyp tvoří 65% z celku, je velmi zvláštní, že současně v tomto souboru nebyl zjištěn žádný jedinec homozygotní pro CC při velikosti souboru 102 osob. Stávající rozložení genotypů u zdravých kontrol (tabulka 8) není proto velmi pravděpodobně v Hardy-Weinbergově rovnováze. Otázkou je proč? I z tohoto důvodu by bylo zajímavé porovnat zjištěné genotypy s jinými autory, kteří vyšetřovali stejný polymorfizmus v intronu 4 v CASR genu. Je současně nutné také vyloučit chybné stanovení SNP (miss-genotyping). S tímto problémem a následným odklonem od HW rovnováhy u jednoho z vyšetřovaných SNP má autorka tohoto posudku osobní zkušenost. Vedlejší připomínky: Abstrakt – výsledky: Genotyp GG se jevil jako ochranný faktor vůči rozvoji diabetu, protože byl nalezen pouze ve skupině zdravých kontrol a diabetiků 2.typu. – správně nediabetiků s chronickým renálním selháním – viz Výsledky str. 52, Tabulka č. 5. Ve výsledkové části abstraktu chybí zmínka o výsledku stanovení mRNA pro CASR v periferních leukocytech ve vybrané skupině diabetiků a kontrol – i když jde o „negativní“ zjištění, viz např. Závěr, str. 60. Abstrakt – anglicky : Správný anglický název je Calcium-sensing receptor (CASR) – ne Calcium-sensitive r. Řada drobných překlepů, uvádím jeden příklad : no statistically significance difference - správně significant difference
Chyby v seznamu zkratek: ADHH – není získaná hypokalciurická hyperkalcémie, ale autozomálně dominantní hypokalcémie s hyperkalciurií, jak autorka správně uvádí na str. 32 BMD – není stupeň kostní denzity, ale denzita kostního minerálu FBHH – je familiární benigní hypokalciurická hyperkalcémie MODY – různé možnosti překladu anglické zkratky, např. glukokinázový diabetes a diabetes transkripčních faktorů NIDDM - inzulin non-dependentní PTHrP - častěji se ponechává anglický název „ PTH related peptid“ , jde o peptid částečně strukturálně příbuzný k PTH, zejména vazebným místem pro PTH-receptor. PTHrp ale nereguluje v organizmu PTH, jak by mohlo z překladu vyplývat, naopak v řadě situací má zcela opačně účinky.
RT-PCR kvantitativní polymerázová řetězová reakce - ? pravd. reverzní polymerázová řetězová reakce TATA box sedminukleotidová sekvence DNA nacházející se…..zde asi něco chybí….. Kapitola Úvod V této kapitole je řada drobných překlepů, které vzhledem k délce kapitoly neuvádím všechny, pouze několik příkladů: Str. 15 - Vzájemný vztah mezi hodnotou systémového a funkcí ledvin je znám dlouhou dobu…chybí slovo „tlaku“. Str. 21 Zástupce nejčastěji se vyskytujících diabetických nefropatií je membranózní glomerulopatie….jde o odstavec nediabetické nefropatie Str. 25 – zevně sekretonických žláz….pravd. sekretorických žláz Hladina kalcia v krevním séru se u člověka pohybuje v rozmezí 23,24 až 2,60 mmol/l…..posun desetinné čárky - pravděpodobně správně 2,324 až 2,60 mmol/l…..prosím ověřit referenční meze z citovaného zdroje Stárka et al. 1997. Str. 27 Receptor pro kalcitriol se mimo tři základní systémy (ledviny, kost a kůže) ……i když se VDR vyskytuje skoro všude, mezi tři základní systémy patří ledviny, kost a střevo…prosím ověřit a opravit z citačního zdroje Str. 29 – chybně jméno v citaci: D´ouza-Li et al. 2006…viz citace č. 23 Str. 31 terciální hyperparathyreóza - terciární V ledvinové kůře je CaRS – správně CaSR Str. 32 Chorobu charakterizuje únava, slabost a cefalea, vzácně se vyskytuje hyperkalcémie, urolitiáza, renální insuficience a hypertenze (Pollack et al. 1994)………….citace Pollack 1994 chybí v závěrečném seznamu. Samotná definice FBHH na str. 32 je velmi zvláštní – jak už vyplývá z názvu, jde o benigní familiární hyperkalcémii. Zvýšená hladina vápníku je často u zcela bezpříznakových jedinců zjišťována náhodně. Uvedené obtíže jako únava, slabost, cefalea, renální insuficience možná byly někdy epizodicky popsány, ale rozhodně nepatří k typickému obrazu FBHH – prosím raději ověřit nebo použít jinou citaci, např. Ward B, Clinical Biochemistry 45, 943-953, 2012. Str. 33 Obermannová, Šumník 2009 – citace chybí v závěrečném přehledu
Některé studie ukazují na malou, ale významnou spojitost mezi A986A a R990G v PHPT fenotypu Zatímco 986S varianta je častější u pacientů s PHPT, renální lithiázu způsobuje 990G………..vhodné přeformulovat, věty oddělit a zejména uvádět přesně celé názvy SNP – A986S a R990G….. Str. 34 VDR BSmI polymorfizmem …..BsmI polymorfizmus Diskuse Str. 57 - Dále jsme analyzovali genovou expresi tohoto genu u 106 pacientů s T2D a porovnávali jsme ji s genovou expresí u 96 zdravých jedinců……terminologicky nepřesně – stanovení genotypů není analýza genové exprese……expresní studie byla dělána v periferních leukocytech u skupiny 19 jedinců…. Heterozygotní genotyp TC polymorfizmu v intronu 4 a homozygotní genotyp CC polymorfizmu v kodonu 990 se jevily jako ochranné genetické faktory v etiopatogenezi diabetu mellitus…….ochranný homozygotní genotyp v polymorfizmu v kodonu 990 je GG a nikoliv CC Identifikovaly 3 polymorfizmy (A986S, G90R, Q1011E), která se nachází v sedmém exonu a 1 polymorfizmus v intronu 5 v CaSR genu. Výskyt polymorfizmu R990G byl 2x vyšší než v kontrolní skupině. Mimoto byl ověřen 4x vyšší výskyt Q1011E ve srovnání s kontrolní skupinou (Romeo 2012)……..autor je Romero P viz citace 121……správně názvy 3 SNP: A986S, G990R, Q1011E u pacientů s primární hyperparathyroidosou…. s primární hyperparatyreózou… (Miedlich 2001). …u citací jednotně jméno et al., rok…. VDR a CaSR i přes účinky na LH a SHBG a inzulinovou rezistenci se podílí na patogenezi syndromu polycystickýc ovarií (Ranizad 2011)…… VDR a CaSR se přes účinky na LH, SHBG a inzulinovou rezistenci podílí na patogenezi syndromu polycystických ovárií (Ranizad et al. 2011). Str. 58 - z polymorfizmů nebyly zaznamenány interakce s koncentrací vápníku nebo trávení vápníku (Jenab et al. 2009). …. z polymorfizmů nebyly zaznamenány interakce se sérovou hladinou 25OH vitaminu D nebo dietním příjmem vápníku (správně dle zdroje) Primární hyperparathyroidesa (pPTH) souvisí s hyperkalcemií. pPTH představuje rizikový faktor vývoje pankreatitidy…….. Primární hyperparatyreóza způsobuje hyperkalcémii, která představuje rizikový faktor pro vývoj pankreatitidy (opravuji). Jedná se o R465Q mutaci CaSR polymorfizmu. Nachází se na 5 exonu záměnou argininu za glutamin v kodonu 465. Vyznačuje nepřímou odpovědí na stimulaci vápenatých iontů, což vede k FBHH (Leech et al. 2006)……………… Jedná se o R465Q mutaci v CaSR genu. Nachází se v 5 exonu a vzniká záměnou argininu za glutamin v kodonu 465. Funkční mutační analýza potvrdila inaktivační charakter mutace díky výraznému posunu stimulační křivky vpravo pro EC50 (Leech et al. 2006)…opravuji dle autorů z Pubmed
Závěr Str. 60 - polymorfizmu v intronu 4 a homozygotní genotyp CC polymorfizmu v kodonu 990 se jevily……stejná chyba se opakuje - ochranný je homozygotní genotyp GG, nikoliv CC Dále jsme analyzovali genovou expresi genu CaSR na úrovni mRNA v leukocytech periferní krve. Genová exprese byla prokázána pouze u zdravých kontrol, ale nebyla nalezena u diabetiků 1.a 2. typu……….nedává smysl !!!!! pojem genová exprese používat střídmě, pouze tam, kde jde opravdu o expresní studii, viz následující bod, kde uvedeno správně : byla prokázána exprese genu CaSR v leukocytech periferní krve u diabetických pacientů 1.. u pacientů s diabetem 2.typu i u zdravých kontrol. Pro malou skupinu vyšetřených pacientů nemohou být naměřené výsledky směrodatné. Seznam literatury - překlepy: 37. Hamilton DC, Grove VK, Smith CA, Cote DE. …….poslední autor je David Cole 71. Leech C, Lohse P, Stanojevic V, Lechner A, Goke B, Spitzweg C. Identification of a novel inactivating R465Q station of the kalcium-sensing receptor, Biochem Biophys Res, Comun, 2006 Apr 14, 342(3):996-1002 ……………………….mutation of the calcium-sensing… 126. Ryhlík I, FliseD, Rith E. 1999 Non-diabetic renal disease in type 2 diabetes. In: Rith ….hlavní autor je Ivan Rychlík…. ______________________________________________________________________________
Vzhledem k rozsahu výše uvedených odborných a formálních nedostatků je obtížné předloženou diplomovou práci s názvem „Molekulární aspekty kalcio-fosfátového metabolizmu u ledvinových komplikací diabetu mellitu“ doporučit k obhajobě.
V Praze 5. 9. 2012
MUDr. Kateřina Zajíčková, PhD.
