Mimojaderná transgenoze: metodologie a aplikace

Mimojaderná transgenoze: metodologie a aplikace

Doc. RNDr. Jindřich Bříza, CSc. BC AV ČR, v.v.i., ÚMBR a PřF JU, Branišovská 31 370 05 České Budějovice http://www.hybridmedicalanimation.com/pages/chloroplast.html

• Úvod - první stabilní transformace jádra rostlinné buňky chimérním selekčním genem z bakterií pomocí A. tumefaciens v r. 1983 (geny nptI a nptII; Fraley et al., PNAS, 80: 48034807), důkaz Ti plasmidu jako vektoru pro vnášení cizorodé DNA do rostlin v r. 1980 (Hernalsteens et al., Nature, 287: 654-656, 1980) - první transformace chloroplastů v r. 1988 (Chlamydomonas reinhardtii, Boynton et al., Science, 240: 1534-1538, 1988), u vyšších rostlin v r. 1990 transientní exprese (v chloroplastech tabáku, Daniell et al., PNAS, 87: 88-92, 1990) i stabilní transformace ptDNA tabáku (Svab et al., PNAS, 87: 8526-8530, 1990) - první transformace mitochondriální DNA u S. cerevisiae v r. 1988 (Johnston et al., Science, 240: 1538-1541, 1988) a je to dosud jediný organismus, jehož mtDNA je takto rutinně geneticky manipulována (i když C. reinhardtii statečně náskok dohání; Remacle et al., PNAS, 103: 47714176, 2006)

•Transformace rostlinné buňky Dosažení stabilní transformace rostlin je podmíněno úspěšnou realizací tří kroků: 1) vnesení klonované DNA do vhodného cílového pletiva 2) selekce buněk, které tuto DNA přijaly a integrovaly do svého genomu 3) regenerace rostlin schopných dalšího množení nebo pohlavního rozmnožování

•Transformace mitochondrií - nově vyvinutá metoda biologické balistiky (biolistiky) otevřela cestu mj. k transgenozi mitochondrií a plastidů - první prokazatelně úspěšná a reprodukovatelná transformace mitochondrií byla uskutečněna u S. cerevisiae: respiračně deficientní kmen (kvůli deleci mitochondriálního genu kódujícího největší podjednotku cytochromoxidázy) byl „opraven“ díky biolistickému vnesení DNA se standardním verzí tohoto genu - analýza ukázala, že k obnovení funkce genu došlo díky homologní rekombinaci do mitochondriálního genomu

•Transformace mitochondrií - první mitochondriální transformace rostlinné buňky (řasy C. reinhardtii) bylo dosaženo v r. 1996 (Boynton a Gillham, Meth. Enzymol., 264: 279-296, 1996), avšak byla to spíše výjimečná záležitost - mitochondriální genom C. reinhardtii je lineární, 15,8 kb dlouhý s telomerami tvořenými invertovanými repeticemi 500 bp s 40 bp jednořetězcovým přesahem - genom kóduje pouhých 8 proteinů

•Transformace mitochondrií - skutečně „rutinně“ se daří tento objekt mitochondriálně transformovat až od r. 2006 (Remacle et al., PNAS, 103: 4771-4776, 2006) - šlo o transformaci buněk mutovaných v genech cob, coxI nebo nd1 plasmidy nebo PCR generovanými fragmenty obsahujícími standardní formy mutovaných genů - oproti předcházejícím pracím byly opraveny jak deleční tak posunové mutace a transformační účinnost dosáhla 100-250 transformantů na µg DNA (cca 50 x více)

•Transformace plastidů  Typy plastidů: (1) chloroplasty (obsahují chlorofyl) (2) chromoplasty (obsahují žluté, oranžové nebo červené karotenoidy) (3) amyloplasty (obsahují škrob) (4) elaioplasty (obsahují oleje) (5) etioplasty (částečně vyvinuté chloroplasty tvořící se při klíčení semen ve tmě) (6) proplastidy (plastidové prekurzory) (7) gerontoplasty (chloroplasty během senescence)

•Transformace plastidů  Stabilní transformace – integrací vnášené DNA do ptDNA homologní rekombinací nebo pomocí fágové integrázy  Transientní vnesení cizorodé DNA

•Transformace plastidů  Plastidový transformační vektor – plazmid s 2 plastidovými sekvencemi (1-2 kbp), mezi nimi vnášené geny; neobsahuje replikační počátek, takže je záhy ztracen  Aktivní systém homologní rekombinace plastidový genom je ve stavu neustálých interi intramolekulárních výměn - (Maliga, Curr. Opin. Plant Biol., 5: 164-172, 2002).

•Transformace plastidů

•Transformace plastidů  Integráza fága φC31 – integrace cizí DNA do ptDNA činností místně specifické integrázy (INT) z fága φC31 (Lutz et al., Plant J. 37: 906-913, 2004); předpokládá se její užití u druhů, kde standardní transformace na základě homologní rekombinace nepřináší výsledky

•Transformace plastidů  Člunkové vektory – plazmidy s replikačním počátkem ColE1 z E. coli a plastidovým replikačním počátkem ori (Staub & Maliga, Mol. Gen. Genet. 249: 37-42, 1995); nemají praktické využití, neboť po odstranění selekčního tlaku jsou rychle ztráceny.  Exprese transientně vnesené DNA – byla studována exprese GUS (Sporlein et al., TAG 82: 717-722, 1991) nebo GFP (Hibberd et al., Plant J. 16: 627-632, 1998)

•Transformace plastidů Výhody transformace plastidového genomu:  Plastidy vykazují (až na výjimky) uniparentální přenos, tzn. nejsou přenášeny do další generace pylem. Díky tomu nemohou být transformované plastidy přeneseny do nekulturních příbuzných druhů a vytvořit tak tzv. superplevele, nebo způsobit genetické “znečištění” jiných plodin.  Řešení problému plodin nesoucích v jaderném genomu transgen pro δ-endotoxin z Bacillus thuringiensis (suboptimální exprese - vytvoření rezistentních hmyzích škůdců). Kole et al. (PNAS, 96: 1840-1845, 1999) dokázali plastidovou hyperexpresí nového genu pro δ-endotoxin zničit stoprocentně nejen citlivé škůdce, ale i škůdce, kteří již vykazovali u jaderně transformovaných rostlin vůči tomuto toxinu rezistenci. Přítomnost Bt genu v plastidovém genu brání toxickému účinku pylu z transgenních rostlin na jiné hmyzí druhy (známý případ motýla monarcha stěhovavý), neboť pyl díky absenci chloroplastové DNA žádný toxin neobsahuje - De Cosa et al., Nat. Biotechnol., 19: 71-74, 2000: toxin v pylu nepřítomen, v listech těchto rostlin tvořil až 47 % (!) všech rozpustných bílkovin.

•Transformace plastidů Výhody transformace plastidového genomu:  Chloroplastové transformační vektory obsahují dvě plastidové sekvence, které obklopují z obou stran vnášený transgen. Díky nim dochází homologní rekombinací k inzerci transgenu do daného předem zvoleného místa plastidového genomu. To vede k eliminaci pozičního efektu a je dosaženo uniformity exprese transgenu u všech získaných transgenních rostlin.  Fenomén umlčování genů (gene silencing), který se často vyskytuje u jaderně transformovaných rostlin, dosud nebyl u rostlin s transformovanými plastidy pozorován.  Byla prokázána exprese transgenů na vysoké úrovni jak u chloroplastů tak u chromoplastů (plody rajčete), což umožňuje využívat k produkci požadovaných látek nezelených částí rostlin.  Při selekci ani tady není třeba využívat jako selekční znak rezistenci k antibiotikům (viz dále).

•Transformace plastidů Výhody transformace plastidového genomu:  Bylo zjištěno, že v chloroplastech mohou přímo vznikat biologicky aktivní proteiny, které vyžadují vytváření bisulfidických můstků (lidský somatotropin, Staub et al., Nat. Biotechnol., 18: 333-338, 2000). To otvírá možnost produkovat v chloroplastech rekombinantní terapeutické proteiny v nativní formě.  Některé proteiny kódované transgeny v jaderném genomu a hromadící se v cytosolu, jsou pro buňku toxické. Jsou-li však stejné geny vneseny do genomu plastidu, kde se následně rovněž hromadí vznikající proteiny, bývají často netoxické a mohou se hromadit do velmi vysoké koncentrace.  Umožňují suborganelové cílení genových produktů do plastoglobulí – lipidy obsahujících struktur připojených k thylakoidním membránám a účastnících se hlavně metabolismu tokoferolů, vývoje thylakoidů a procesů reagujících na stres.

•Transformace plastidů Výhody transformace plastidového genomu:

•Transformace plastidů Metody transformace chloroplastů:  Základní metodou transformace se stala biolistická metoda.  Postupně byly vytvářeny vektory pro transformaci chloroplastů dvouděložných rostlin (Daniell et al., PNAS, 87: 88-92, 1990, tabák) i jednoděložných rostlin (Daniell et al., Plant Cell Rep., 9: 615-619, 1991, transientní exprese v chloroplastech listů a kalusů pšenice).  Další možné metody transformace: - transformace chloroplastů v izolovaných protoplastech pomocí PEGu (Biotechnology, 11: 95-97, 1993; Plant J., 3: 729-738, 1993) - tato metoda má však nižší účinnost než biolistická metoda - přímá mikroinjekce DNA do chloroplastu buněk listového mesofylu tabáku (Knoblauch et al., Nat. Biotechnol., 17: 906-909, 1999) - historická: pomocí baktérií A. tumefaciens (De Block et al., EMBO J., 4: 1367-1372, 1985; Venkateswarlu et al., Biotechnology, 9: 1103-1105, 1991) - tyto výsledky se však již nepodařilo nikdy zopakovat

•Transformace plastidů Metody transformace chloroplastů:  Selekce a) C. reinhardtii : k transformaci využívány nefotosyntetizující

kmeny nesoucí mutaci v jednom z chloroplastových genů podílejících se na fotosyntéze. Vnášeny byly funkční kopie stejných genů, což vedlo u transformantů k obnovení fotosyntézy a umožnilo tak jejich selekci (Boynton et al., Science, 240: 1534-1538, 1988). b) Použití bodových mutací v genech pro ribosomální RNA nebo ribosomální proteiny plastidů, které zajišťovaly resistenci k antibiotikům spektinomycinu, streptomycinu a erytromycinu (Newman et al., Genetics, 126: 875-888, 1990). Tuto selekci se podařilo realizovat i u vyšších rostlin (Svab et al., PNAS, 87: 8526-8530, 1990), nicméně úspěšnost transformace byla velmi nízká.

•Transformace plastidů Metody transformace chloroplastů:

 Selekce

c) Frekvenci transformace se podařilo významně zvýšit až použitím genu aadA kódujícího enzym adenosyl-3‘-adenyl transferasu. Tento enzym z E. coli inaktivuje některá antibiotika jako spektinomycin nebo streptomycin (Svab et al., PNAS, 90: 913-917, 1993). aadA je v současnosti při transformaci plastidů nejdůležitějším selekčním genem. d) Gen nptII byl využit při úspěšné selekci plastidových transformantů tabáku (Carrer et al., MGG, 241: 49-56, 1993), gen aphA-6 z Acinetobacter baumannii (Bateman & Purton, Mol. Gen. Genet., 263: 404-410, 2000) při transformaci C. reinhardtii.


 Selekce

e) Využití tolerance k herbicidům, jejichž mechanismem

působení je inhibice plastidově specifických metabolických drah (u C. reinhardtii vnesen do plastidového genomu mutantní gen zajišťující toleranci k atrazinu - Boyton a Gillham, Methods Enzymol., 217: 510-536, 1993). U vyšších rostlin se nepodařilo zopakovat, a to ani za použití jiných herbicidů: Lutz et al. (Plant Physiol., 125:15851590, 2001) sice získali plastidové transformanty tabáku exprimujíci gen bar, kódující fosfinotricinacetyl transferasu (PAT) zajišťující rezistenci vůči herbicidům s účinnou látkou fosfinotricinem, ale pouze po selekci na spektinomycinu, která byla možná díky přítomnosti genu aadA v konstruktu. Přímá selekce transformantů na médiu s fosfinotricinem se nezdařila, přestože úroveň exprese PAT byla vysoká a dosáhla až 7 % celkových rozpustných proteinů.


 Selekce f) Daniell et al. (Curr. Genet., 39: 109-116, 2001) použili

jako selekční marker gen ze špenátu kódující betainaldehyd dehydrogenasu (BADH). Tento enzym je přítomný jen v chloroplastech několika druhů adaptovaných k zasoleným a suchým půdám. Selekce je založena na konverzi toxického betainaldehydu (BA) tímto enzymem na netoxický betainglycin. Transformační účinnost při této selekci byl asi 25x vyšší než při použití selekčního systému tvořeného genem aadA a spektinomycinem a navíc byl celý proces transformace daleko rychlejší. Nicméně dosud v jiných laboratořích nepotvrzeno!


 Selekce g) Barone et al. (J. Exptl. Bot. 60: 3195-3202, 2009) použili k selekci systém založený na genu pro alfa-podjednotku antranilátsyntasy necitlivé ke zpětné vazbě (tj. k tryptofanu) a na 4-methylindolu nebo 7-methyl-DLtryptophanu jako selekčních látkách


 Selekce h) Kombinace vizuálního a selektovatelného markeru (Klaus et al. , Plant J. 35: 811-822, 2003) – k rychlé identifikaci transplastomických segmentů na regenerované rostlině použili pigment deficientní tabák, kde knokautovaný gen byl nahrazen genem aadA; transformační vektor pak obsahuje standardní „pigmentový“ gen spolu s dalším selektovatelným genem.



 Selekce ch) Negativní selekce (Serino et al., Plant J., 12: 697-701,

1997): využita pro prokázání funkčnosti systému CRE/lox v plastidech (Corneille et al., Plant J., 72: 171-178, 2001). Selekční systém je založen na bakteriálním genu codA kódujícím cytosindeaminasu. Letalita plastidových transformantů exprimujících tento gen je způsobena příjmem do média přidaného 5-fluorocytosinu, který je cytosindeaminasou snadno konvertován na toxický inhibitor biosyntézy pyrimidinů 5-fluorouracil.

•Transformace plastidů Metody transformace chloroplastů:  Regulační sekvence při transformaci plastidů a) Nejpoužívanější promotory v expresních kazetách: promotory plastidových genů pro 16S rRNA (rrn), tRNA pro valin (trnV), velkou podjednotku Rubisco (rbcL), ribosomální protein 16S (rps16) a protein D1 reakčního centra fotosystému II (psbA) (Heifetz, Biochimie, 82: 655-666, 2000). Na všechny promotory nasedá heteromerická RNA polymerasa kódovaná plastidovým genomem (PEP).

•Transformace plastidů Metody transformace chloroplastů:  Regulační sekvence při transformaci plastidů b) Regulační oblast 5‘: 5‘-UTR nebo 5‘-TCR (translation control region), což je 5‘-UTR plus kódující sekvence pro několik aminokyselin z N-konce plastidového genu, která je translačně fúzovaná s kódující sekvencí vnášeného genu. 5‘-TCR vede ke zhruba zdvojnásobení exprese transgenu, a to díky optimalizaci zahájení translace na plastidových ribosomech.

•Transformace plastidů Metody transformace chloroplastů:  Regulační sekvence při transformaci plastidů Např. Kuroda a Maliga (Plant Physiol., 125: 430-436, 2001) translačně fúzovali kódující oblast pro nptII s kódující sekvencí pro 14 prvních AK N-konce genu rbcL. NPTII tvořila 10,8 % všech rozpustných bílkovin, zatímco bez této 14 AK sekvence pouze 4,7 %. Zavedením tiché mutace do této sekvence bylo vyloučeno, že to nebyl pouze důsledek zvýšené stability fúzního proteinu. Aminokyselinové složení fúzního proteinu zůstalo stejné, ale koncentrace NPTII byla 35x nižší (0,31 %), což mohlo být způsobeno jedině dramatickým poklesem účinnosti translace v důsledku zavedené mutace. Také Ye et al. (Plant J., 25: 261-270, 2001) popsali pozitivní efekt 5‘-TCR sekvence na expresi plastidového transgenu, když gen pro 5-enolpyruvylšikimát-3-fosfát syntasu (EPSPS) fúzovali se sekvencí pro prvních 14 AK genu pro GFP, jenž je v plastidech velmi účinně translatován. Zvýšení exprese fúzního genu bylo dokonce třicetinásobné.

•Transformace plastidů Metody transformace chloroplastů:  Regulační sekvence při transformaci plastidů c) Regulační oblast 3‘: expresní kazeta zakončena regulační sekvencí 3‘-UTR, která má význam především pro stabilitu mRNA. Nejběžněji se používají sekvence odvozené z genů psbA, rbcL a rps16.


•Transformace plastidů Metody transformace chloroplastů:C

A B



Příklady úrovně akumulace rekombinantních proteinů v chloroplastech u plastidových transformantů při použití Prrn promotoru a různých 5‘ a 3‘ UTRs (Maliga, Curr. Opin. Plant Biol., 5: 164-172, 2002).

•Transformace plastidů Metody transformace chloroplastů:  Transaktivace plastidových genů Někdy je žádoucí (když konstitutivní exprese transgenů vede k redukci růstu, ke zvýšení náchylnosti k chorobám či dokonce k výraznému snížení až zastavení regenerace nebo k znemožnění selekce), aby exprese transgenů byla omezena jen na určité období vývoje rostliny. Pro tyto účely je ideálním řešením použít k regulaci exprese transgenů exogenně aplikované chemické aktivátory (Ward et al., Plant Mol. Biol., 22: 361-366, 1993; Gatz, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 48: 89-108, 1997). Pro řízení exprese plastidových transgenů je možné využít do plastidů směrovaných transaktivačních proteinů kódovaných jaderným genomem a ovládaných chemicky indukovaným promotorem. Tento systém je ilustrován na obr. 3 (Heifetz, Biochimie, 82: 655-666, 2000), kde inducibilním promotorem je promotor tabákového genu PR-1a (pathogenesis-related protein). Tento promotor je indukován pomocí aktivátorů typu BTH (benzothiadiazolové deriváty), což jsou látky indukující u rostlin tzv. získanou resistenci (systemic acquired resistance).

•Transformace plastidů Metody transformace chloroplastů: Transaktivace plastidových transgenů 1

•Transformace plastidů Metody transformace chloroplastů: Transaktivace plastidových transgenů 2 • Surzycki et al. (PNAS 104: 17548-53, 2007) vyvinuli transaktivační (inducibilní) systém u C. reinhardtii za využití k mědi citlivého promotoru genu pro cytochrom c6 a jaderně kódovaného chloroplastového proteinu Nac2, který specificky zajišťuje stabilizaci chloroplastové psbD mRNA (kóduje protein D2 PSII), neboť funguje na její 5ÙTR. • Vybavíme-li plastidový transgen 5ÙTR z genu psbD, můžeme řídit jeho expresi pomocí měďnatých iontů (protože by se netvořil ani D2 protein a tedy ani PSII, je třeba pro tento případ vložit do plastidového transformačního vektoru i gen psbD vybavený jiným promotorem a 5ÙTR, např. z genu petA). • Musí se však použít Nac2 deficientní kmen.

•Transformace plastidů Metody transformace chloroplastů:  Eliminace selektovatelných transgenů Děje se ze tří důvodů: (i) nepřijatelnost jakýchkoliv komerčně šířených GMP se selektovatelným genem pro veřejnost (ii) nedostatek (v podstatě jen 2) spolehlivých selektovatelných genů pro transgenozi ptDNA (iii) metabolické zatížení rostliny s tímto genem v případě jeho velmi vysoké exprese a) Delece na základě homologní rekombinace mezi přímými repeticemi ohraničujícími markerový gen (Iamtham & Day, Nat. Biotechnol. 18: 1172-1176, 2000)


•Transformace plastidů Metody transformace chloroplastů:  Eliminace selektovatelných transgenů b) Transientní kointegrace markerového genu (za využití pigmentově deficientního plastidového mutanta, Klaus et al., Nat. Biotechnol. 22: 225-229, 2004)

•Transformace plastidů Metody transformace chloroplastů:  Eliminace selektovatelných transgenů c) Excise markerového genu místně specifickým rekombinačním systémem Cre/loxP (Corneille et al., Plant J. 72: 171-178, 2001) z fága P1 nebo Int/attBattP (Kittiwongwattana et al., Plant Mol. Biol., 64: 137-143, 2007) z fága φC31

•Transformace plastidů Metody transformace chloroplastů:  Eliminace selektovatelných transgenů

•Transformace plastidů Metody transformace chloroplastů:  Eliminace selektovatelných transgenů d) Kotransformace a následná segregace 2 různých plastidových transformačních vektorů (jeden s markerovým genem, druhý s jiným transgenem, Ye et al., Plant Physiol., 133: 402-410, 2003).

•Transformace plastidů Příklady transformace chloroplastů:  Transplastomické rostliny tabáku bez užití selekce pomocí antibiotik (Daniell et al., Curr. Genet., 39: 109-116, 2001). Univerzální chloroplastový vektor obsahuje takové sekvence chloroplastové DNA, které jsou vysoce konzervativní a mohou být proto užity pro transformaci chloroplastů velké řady vyšších rostlin.

•Transformace plastidů Příklady transformace chloroplastů:  Oba geny vytvořily operon ovládaný promotorem Prrn a regulovaný 3‘UTR plastidového genu psbA. Promotor obsahoval také RBS (ribosome binding site) sekvenci z leaderu plastidového genu rbcL, tj. sekvenci zajišťující optimální vazbu chloroplastových ribosomů.  Celý proces transformace trval při použití BA 2-3 měsíce, při použití spektinomycinu 3-6 měsíců.  Regenerované prýty se objevily při použití BA za 12 dní u 80 % listových disků, (až 23 na disk), zatímco při druhém způsobu selekce se prýty objevily u 15 % disků za 45 dní, (1-2 na disk). Transformační účinnost byla při použití BA 25x vyšší než při použití spektinomycinu.  Southernova hybridizace potvrdila stabilní integraci transgenů do genomu plastidů i skutečnost, že v buňkách se vyskytovaly jen transformované plastidy.  Rostliny byly fenotypově normální a fertilní.

•Transformace plastidů Příklady transformace chloroplastů:  tabák (jasně nejsnadněji transformovatelný)  rajče (Ruf et al., Nat. Biotechnol., 19: 870-875, 2001), brambor (Sidorov et al., Plant J., 19: 209-216, 1999), Arabidopsis (Sikdar et al., Plant Cell Rep., 18: 20-24, 1998), Lesquerella fendleri (Skarjinskaia et al., Transgenic Res., 12: 115-122, 2003) s daleko menší účinností  lepší transformační účinnost dosažena u sóji (Dufourmantel et al., Plant Mol. Biol., 55: 479-489, 2004), mrkve (Kumar et al., Plant Physiol., 136: 2843-2854, 2004) a bavlníku (Kumar et al., Plant Mol. Biol., 56: 203-216, 2004)  důležitý produkční a modelový druh mechu Physcomitrella patens (čepenka odstálá) - Sugiura a Sugita, Plant J., 40: 314-321, 2004

•Transformace plastidů Příklady transformace chloroplastů:  Recentně úspěšně transformovány locika zahradní (Lelivelt et al., Plant Mol. Biol., 58: 763-774, 2005; Kanamoto et al., Transgenic Res., 15: 205-217, 2006), květák (Nugent et al., Plant Sci., 170: 135-142, 2006), topol (Okumura et al., Transgenic Res., 15: 637-646, 2006), zelí (Liu et al., Plant Cell Rep., 26: 1733-1744, 2007), cukrová řepa (De Marchis et al., Transgenic Res., 18:17-30, 2009), N. benthamiana (Davarpanah et al., J. Plant Biol., 52: 244-250, 2009), lilek (Singh et al., Transgenic Res., 19: 113-119, 2010), N. sylvestris (Maliga and Svab, 2010) nebo řepka (Cheng et al., Plant Cell Rep., 29: 371381, 2010.  Metoda transformace plastidové (chloroplastové) DNA se pomalu stává běžným postupem používaným pro vnášení cizorodých genů do genomu rostlin. Díky četným výhodám je jí věnována velká pozornost, takže se stává stále účinnější a spolehlivější.

•Transformace plastidů Příklady transformace chloroplastů:

•Transformace plastidů Příklady transformace chloroplastů: Nejnovější příklady: (i) Guan et al. (J. Exptl. Botany, 59: 3475-3484, 2008) pomocí chitinázy BjCHI1 z Brassica juncea ukázali u transplastomického tabáku na potenciál jejího využití proti řadě houbových i bakteriálních patogenů. (ii) Craig et al. (Transgenic Res., 17: 769-782, 2008) použili δ-9desaturázu ke změně lipidového metabolismu transplastomických rostlin (zvýšení podílu nenasycených MK) jak ve vegetativních tak generativních tkáních s vedlejším účinkem zvýšení odolnosti vůči chladu. (iii) Hasunuma et al. (J. Biosci. Bioeng., 105: 518-526, 2008) získali transplastomický tabák s nadprodukcí 1-deoxy-Dxylulosareductoisomerázy (DXR) katalyzující první krok dráhy vedoucí v plastidech k tvorbě isoprenoidů. Transformované rostliny měly zvýšený obsah různých isoprenoidů jako chlorofylu a, karotenu, luteinu atd.

•Transformace plastidů Příklady transformace chloroplastů: Nejnovější příklady: (iv) Morgenfeld et al. (Mol. Biotechnol., 43: 243-249, 2009) produkovali onkogenní protein E7 z HPV16 (samotný či ve fúzi s CP viru X bramboru) v plastidech tabáku

•Transformace plastidů Příklady transformace chloroplastů: Nejnovější příklady: (v) Daniell et al. (BMC Biotechnol., 9: 33, 2009) produkovali IGF-1 protein v plastidech tabáku. Expresní úroveň dosáhla 9,5 % TSP pro nativní gen a 11,3 % pro gen syntetický.

•Transformace plastidů Příklady transformace chloroplastů: Nejnovější příklady: (vi) Zhang et al. (Plant Sci., 180: 480, 2011) ukázali, že hybridní RUBISCO složené z rajčatové velké podjednotky a tabákové malé podjednotky je u tabáku funkční (ryze základní výzkum). (vii) Lee et al. (Plant Biotechnol. J., 9: 100, 2011) popsali úspěšnou produkci retrocyklinu-101 a protegrinu-1 (dvou důležitých antimikrobiálních peptidů užívaných k léčbě některých bakteriálních i virových infekcí) v chloroplastech tabáku (aplikovaný výzkum).

•Transformace plastidů Stručná historie transformace chloroplastů:

•Transformace plastidů Příklady transformace chloroplastů:  Význam pro studium biogeneze plastidů a jejich funkce (počátky replikace, RNA editing, promotory, translační elementy, fotosyntéza…)  Vyřazování genů fotosyntézy nebo jejich náhrada modifikovanými (např. ycf6, ndh geny, clpP, …)  Rubisco: celá řada prací, ale doposud se nepodařilo vytvořit lepší variantu enzymu; nicméně výsledky přispěly k prohloubení znalostí jeho funkce a regulace

• Transformace genem E7/GUS  v rámci grantu zabývajícího se produkcí proteinů lidského papilomaviru (HPV16) v rostlinách jsme přistoupili mj. k transformaci ptDNA tabáku  naše předchozí práce ukázaly (Šmahel et al., 2006, Bříza et al., 2007), že samotný onkoprotein E7 je v buňkách vysoce nestabilní  jeho stabilizace jsme dosáhli fúzováním s glukuronidázou (Vlasák et al., 2006)  pro transgenozi ptDNA jsme se však nejdříve rozhodli vyzkoušet fúzi onkogenu E7 s genem aadA (Ryba 2006), který kóduje enzym adenosyl-3‘-adenyl transferázu a slouží tedy při plastidové transformaci jako gen selekční (rezistence ke spektinomycinu)

• Transformace genem E7/GUS  celkem bylo získáno z 20 střel 8 rostlin, které regenerovaly na selekčním médiu RMOP s 500 mg/l spektinomycinu (Svab et al., 1990)  po provedené analýze pomocí PCR se ukázalo, že 7 z nich je transplastomických (zbývající rostlina byla zřejmě spontánní specifický mutant v genu pro 16S rRNA)  RT-PCR prokázala přítomnost specifické mRNA odpovídající svojí velikostí fúznímu genu ve všech 7 rostlinách  westernová hybridizace za použití monoklonální protilátky HPV16-E7 však opakovaně neprokázala přítomnost fúzního proteinu  zdá se tedy, že protein E7 je v chloroplastech i ve fuzi se selekčním proteinem aadA velmi nestálý

• Transformace genem E7/GUS  když se ukázala nestabilita proteinu E7/aadA, použili jsme k transformaci ptDNA fúzní gen E7/GUS, jehož produkt byl po jaderné transformaci rajčete a bramboru stabilní (Bříza et al., 2007)  transformační vektor obsahoval mezi sekvencemi plastidové DNA z oblasti sousedících genů rpoB a trnC v oblasti LSC (integrační místo č. 3) fúzní gen E7/GUS s promotorem z genu pro 16S rRNA a s terminační sekvencí z genu rbcL z Chlamydomonas reinhardtii a gen aadA se stejnými regulačními sekvencemi

• Transformace genem E7/GUS


PCR: primery P1+P2

PCR: primery P3+P4


SB: sonda rpoB

SB: sonda GUS


RT-PCR: E7/GUS

RT-PCR: aadA


WB: antiGUS

• Transformace genem E7/GUS  výsledkem je získání 6 homoplasmických rostlin nesoucích pouze gen E7/GUS, jedné rostliny pouze s genem aadA a jedné rostliny nesoucí v její ptDNA buď oba geny v původní konfiguraci nebo pouze fúzní gen E7/GUS  fúzní protein E7/GUS však, zdá se, ani v tomto případě nevzniká, detekován byl pouze protein GUS

Mimojaderná transgenoze: metodologie a aplikace

Recommend Documents