MIKROORGANIZMUSOK AZONOSÍTÁSA II

MIKROORGANIZMUSOK AZONOSÍTÁSA II. 1.1.1. A baktériumok nitrogén-anyagcseréjének vizsgálata A nitrogén körforgása a bioszféra szempontjából kulcsfontosságú jelenség. Érdemes egy kicsit bıvebben is megismerkedni vele a 28. ábra segítségével.

N2 fixáció NH3/NH4+

(beépítés szerves anyagba)

denitrifikáció nitrifikáció 1. szakasza disszimilatív nitrát redukció

asszimiláció

élılény fehérjéje

ammonifikáció

NO2-

NH4+

(nitrit)

nitrifikáció 2. szakasza NO3

-

asszimilatív nitrát redukció

(nitrát)

1. ábra: A nitrogén körforgása a természetben. Az élı szervezeten belül közvetlenül az ammónia (ammóniumion) épül be a bioszintetikus folyamatokon keresztül. Az ammóniához a levegı nitrogénjének fixálásával vagy a felvett nitrát redukciójával jut a szervezet. Biológiai nitrogén kötés (fixáció) A nitrogén-fixáció során a nitrogén hidrogénnel, oxigénnel vagy szénnel kapcsolódik, így ammóniává, különbözı nitrogén-oxidokká, vagy szerves nitrogénvegyületekké alakul. A magasabbrendő növények a levegı elemi nitrogénjét megkötni, azaz redukált formába átvinni nem tudják. A nitrogén kétféle módon alakulhat át a növények számára felvehetı formába. A legkevesebb nitrogén fotokémiai úton, például villámlás során kötıdik meg, különbözı nitrogén-oxidok formájában (<3*1012 g N/év). Ennél jóval nagyobb mennyiségő az a nitrogén, amely biológiai úton fixálódik. A nitrogénkötésre képes baktériumok a nitrogenáz enzim és a 1

szerves vegyületek lebontásából származó energia segítségével képesek a légkör nitrogénjét ammóniává (NH ) alakítani: +

-

3

N + 8H + 8e + 16ATP → 2NH + H + 16ADP + 16P 2

3

2

i

A biológiailag fixált nitrogén becsült mennyisége szárazföldi társulásokban 140*1012 g N/év. A nitrogénkötésre képes fajok életmódjuk szerint két csoportra különíthetıek el. Az elsı csoportba a szabadon élı baktériumok tartoznak, mint például az Azotobacter, a Clostridium, vagy az Anabaena. A szabadon élı N-fixáló baktériumok általában olyan helyeken fordulnak elı, ahol a környezetükben nagymennyiségő szerves anyag áll a rendelkezésükre, amelyet képesek közvetlenül hasznosítani. A másik csoportot azok a szimbionta baktériumok alkotják, amelyek a magasabb rendő növények gyökereivel élnek együtt. Ezek közül a legismertebbek a hüvelyesek (Leguminosae) gyökérgümıiben élı Nfixáló baktériumok, például a Rhizobium. Más családokba tartozó fajoknál is találkozhatunk szimbionta nitrogénfixáló szervezetekkel. Ilyenek például az éger (Alnus sp., Betulacecae), a keskenylevelő ezüstfa (Elaeagnus angustifolia, Elaeagnaceae) és a Myrica faya (Myricaceae) gyökérgümıivel szimbiózisban élı baktérium, a Frankia. Nitrifikáció Azokat a baktériumokat, melyek úgy jutnak energiához, hogy az ammóniát nitritté, vagy nitritet nitráttá oxidálják, nitrifikáló baktériumoknak nevezzük. A nitrifikáció során az oxidációva1 nyert energiát a szervezetek arra használják, hogy egyszerő szerves vegyületeket hozzanak létre (kemoszintézis). Ez a talaj élete szempontjából igen jelentıs, mivel ezáltal jönnek létre a növények számára könnyen felvehetı vegyületek. A nitrifikálás elsı fázisában az ammóniából nitrit képzıdik. 2NH3 + 3O2 = 2HNO2 +.2H2O + 662,02 kJ Ebben a folyamatban a nitrit képzıkhöz tartozó nemzetségek (Nitrosomonas, Nitrosococcus, Nitrosocystis) fajai vesznek részt. A második fázisban a salétromossav salétromsavvá (HNO3) oxidálódik. 2HNO2 + O2 = 2HNO3-+ 201,12 kJ Ezt a folyamatot a Nitrobacter és a Nitrocystis genuszokba tartozó fajok végzik. Nitrátredukció A nitrátredukció a nitrifikáció fordítottja. A nitrifikáció során keletkezett nitrátot egyrészt felvehetik a növények, úgyhogy a nitrát teljes értékő 2

nitrogénforrás a fehérjeszintézishez, másrészt a mikróbák felvétele (immobilizáció) révén ismét visszaalakulhat ammóniává, amelyet aztán a mikróbák a saját anyagcseréjükben hasznosítanak (asszimilatív nitrát redukció). Denitrifikáció Denitrifikációnak nevezzük a nitrátnak, nitriten és ammónián keresztül molekuláris nitrogénné való redukálását. Ezt a folyamatot az obligát anaerob denitrifikáló baktériumok idézik elı, melyek a nitrátokat Hakceptorként használják. A leggyakrabban denitrifikálók a Pseudomonas és a Thiobacillus nemzetségbe tartoznak (Pseudomonas aeruginosa, Thiobacillus denitrificans). Ezt a folyamatot disszimilatív nitrát redukciónak is nevezik, mivel a nitrát redukálódik, de nem épül be a mikróbák szervezetébe, vagyis nem immobilizálódik. A rosszul szellızött, anaerob körülményeket biztosító talajban rendkívül károsak. Hatásukra a talaj nitrát és nitrit tartalma átalakul, a molekuláris N2 pedig a növények számára már felvehetetlen. Helyes talajmőveléssel, a talaj porhanyításával, levegıssé-tételével szaporodásuk meggátolható. Ammonifikáció A fehérje lebontás hidrolitikus folyamat, melynek során a fehérje aminoés diaminosavakra bomlik. A dezaminálás végül is ammóniát szabadít fel. Az ammónián kívül - a fehérjék rothadása (anaerob lebontás) során indol, szkatol hullamérgeknek is nevezett biogén aminok (putreszcin, kadaverin, hisztamin, triptamin) és H2S is keletkezik. A fehérjék bontásában az anaerob baktériumokon kívül aerob baktériumok, bacillusok és gombák is részt vesznek. A proteolitikus enzimmel rendelkezı szervezetek a zselatint elfolyósítják. Vizsgálatunk során szénhidrátmentes táptalajt kell használni, mert szénhidrát jelenlétében a fehérjebontó (rothasztó) baktériumokat elnyomják a savképzı baktériumok. A mikroorganizmusok a nitrogéntartalmú szerves vegyületeket bioszintézis-szubsztrátumnak és hidrogén donornak is felhasználhatják. A nagy molekulasúlyú proteinek közül egyeseket csupán speciális csoportok képesek bontani. A kollagént egyes Clostridiumok, az elasztint a Pseudomonas és Vibrio fajok, a keratint, pedig fıleg sugárgombák támadják meg. A proteinek részleges hidrolizátumait, a peptonokat és peptideket, szinte valamennyi mikroorganizmus képes hasznosítani. A fehérjék lebontását elsısorban extracelluláris enzimek (proteázok) végzik 3

és a létrejövı amminosavak alkotják a kiinduló pontot az egyes biológiai folyamatokhoz. A proteázok az amilázok után a legfontosabb ipari enzimek, széleskörően hasznosítják ıket a mosószeriparban, sajtgyártásban, bır-, sütı- és gyógyszeriparban. Az ipar proteáz szükségletét ma már mikrobiális eredető enzimek fedezik, termeltetésükre egyaránt használnak gomba- és baktérium törzseket is. 1.1.1.1 A nitrát redukció vizsgálata Egyes mikroorganizmusok a nitrátokat nitritekké redukálják. A vizsgálatot a tiszta tenyészet nitrát tartalmú levestáptalajba történı átoltásával kell kezdeni. A beoltott csöveket 30 °C-on 24-48 órán át kell inkubálni. Az inkubálási idı lejárta után a táptalajhoz néhány csepp nitrátreagenst adva nitritek jelenléte esetén piros színreakciót tapasztalunk. Amennyiben a piros szín nem alakul ki, akkor vagy nem történt meg a nitrátok redukciója, vagy a keletkezett nitriteket a baktérium tovább redukálta. Ennek ellenırzése késhegynyi cinkpor hozzáadásával ellenırizhetı, mert ha a rendszerben nitrát van, akkor a cink hatására ez nitritté redukákódik, aminek következtében kialakul a piros szín. A fentiek alapján a próba elbírálását az alábbi táblázat tartalmazza: Nitrát reagens Piros

Cink -

Nincs színváltozás

Nincs színváltozás

Nincs színváltozás

Piros

Eredmény Pozitív (nitrit) Pozitív (nitrit továbbredukálása) disszimilatív nitrát redukció Negatív (nitrát)

1.1.1.2 Ureáz-próba Az ureáz próba során a baktériumok karbamid-bontó enzimének jelenlétét próbáljuk kimutatni. A próba lényege, hogy amennyiben a vizsgált baktérium termel ureáz enzimet akkor karbamid-tartalmú levesbe oltva a karbamidból lúgos kémhatást eredményezı ammónia keletkezik, a lúgos kémhatás pedig pH-indikátor hozzáadásával kimutatható.

Az ureázbaktériumok dezaminálást végzı ureáz enzime hatására bekövetkezı reakció:

4

H 2 NO C = O + 2 H 2O → ( NH 4 ) 2 − CO3 H 2 NN

( NH 4 ) 2 − CO3 → CO2 + H 2O + 2 NH 3 lúgos

1.1.1.3 Indol próba Az indol-próba során az egyes baktériumok által (pl. Escherichia coli) triptofánból termelt indolt mutatjuk ki. A próba lényege, hogy a vizsgált baktérium tiszta tenyeszetébıl triptofán-tartalmú levesbe oltva 37 °C-on 24-48 órán át tartó inkubálást követıen a tenyészethez Kovács-féle indol reagenst adva pozitív esetben a levestáptalaj felszínén piros győrő alakul ki.

E .coli

Kovács − reagens

triptofán   → indol     → rozindol (meggypiros)

1.1.2. Egyes extracelluláris enzimek kimutatása Az extracelluláris enzimek (exoenzimek) általában a baktériumok sejthártyájában szintetizálódnak nagy mennyiségben, innen választódnak ki a környezetbe, ahol a nagy molekulájú anyagokat építıköveikre bontják, alkalmassá téve arra, hogy a baktériumok citoplazmáján át bejutva a tápanyagforrásul szolgáljanak. Ezek az enzimek nem a baktériumok szoros értelemben vett anyagcseréjében játszanak szerepet, hanem a környezethez való viszonyukat szabják meg. Az extracelluláris enzimek igen széles skálájából csak a leglényegesebbeket emeljük ki.

1.1.2.1 A lipáz- és lecitináz-aktivitás vizsgálata A lipáz és lecitináz enzimeket kódoló génszakaszok a baktériumokban általában kapcsoltan öröklıdnek, így az esetek nagy részében együtt termelıdnek. A lipáz enzim a triglicerideket, a lecitináz pedig a lecitint bontja. Mindkét enzim aktivitásának vizsgálata tojássárga-emulziót tartalmazó táptalajon történik. Ennek egyik legjellegzetesebb példája a 5

Baird-Parker agar, amely az un. politróp táptalajok közé tartozik, mivel a Staphylococcusok-nak több biokémiai tulajdonságát is vizsgálható rajta: így a telluritredukáló-képesség, valamint a lipáz és lecitináz-aktivitás. A lipáz-aktivitás következtében emulzióban található zsírsavcseppek glicerinre és zsírsavakra hidrolizálódnak és a kiváló zsírsavcseppek gyöngyház-fényővé teszik az egyébként matt fekete, vagy szürke telepek felszínét. A lecitináz-aktivitás következtében az opálos, átlátszatlan táptalaj a telepek körül udvar formájában feltisztul. Ez utóbbi jelenséget nevezzük Nagler-reakciónak. Staphylococcus-ok esetében a próba jelentısége, hogy a lipáz és lecitináz enzimek termelése gyanút kelt a koaguláz enzim termelésére, ami viszont a Staphylococcus-ok patogenitására utal.

1.1.2.2 A koaguláz enzim kimutatása A koaguláz-enzim a vérsavó fehérjéit megalvasztja. A próba jelentısége a patogén Staphylococcusok kiszőrésében rejlik. A Staphylococcus-okat koaguláz-termelésük alapjan három csoportba soroljuk. A S. aureus csoport extracelluláris, szabad koagulázt termel, a S. intermedius csoport sejthez kötött koagulázt, míg a S. epidermidis csoport nem termel koagulázt. A S. aureus fakultatív patogén gennyes folyamatokból lehet izolálni, ezen kívül hıstabil polipeptid enterotoxint termel, tehát az ételmérgezı mikroorganizmusok közé tartozik. A S. intermedius törzsek zömmel húsevıkben okoznak gennyesedéssel járó folyamatokat. A S. epidermidis csoportba tartozó baktériumok szaprofiták, kivéve a csoportba tartozó S. hyicus, amely a sertések exsudatív bırgyulladását okozza, de humán egészségügyi jelentısége nincs. Kiderült, hogy S. hyicus törzsek egy része képes koagulázt termelni, az ilyen törzseket hemolízis vizsgálat segítségével lehet elkülöníteni, hiszen a patogén S. aureus törzsek véres agaron erıs hemolízist okoznak, míg a S. hyicus fajok nem hemolizálnak. A próba során a Baird-Parker lemezen izolált gyanús telepekbıl n , de legalább öt telepet egyenként nem szelektív levesbe oltunk, majd 37 °C hımérsékleten 24 órán át inkubáljuk. Tenyészetenként egy-egy Wassermann-csıbe 0,3 ml nyúlsavót pipettázunk, majd 0,1 ml mennyiséget mérünk hozzá a vizsgálandó mintából. A próbát 4 órás inkubációs idı után bíráljuk el. Pozitívnak tekintendı a próba, ha a tenyészet a nyúlsavót megalvasztotta.

6

A próba elbírálását mindenképpen idıben kell elvégezni, mert a Staphylococcusok egy része fibrinolizin enzimet is termel, ami elfolyósítja a koagulátumot. Az utóbbi idık vizsgálatainak eredménye a módosított Baird-Parker agar, amibe tojássárga-emulzió helyett nyúlsavót kell keverni koaguláz pozitív Staphylococcus telepek közül az egyébként tiszta, áttetszı táptalajban opálos udvar keletkezik.

1.1.2.3 Hemolizinek vizsgálata A hemolizinek a hemoglobin bontásáért felelıs enzimek. Általában virulencia-faktorok. Vizsgálatuk véres- vagy csokoládéagaron történik. A véresagar készítésének lényege, hogy a sterilezett, kb. 45 °C-ra hőtött alaptáptalajba 7% defibrinált (fizikai úton alvadásában gátolt) birkavért keverünk. A csokoládéagar ettıl abban különbözik, hogy ebbe még a hıkezelés elıtt keverjük a vért, és a hıkezelt vér adja a táptalaj sötétbarna színét. A hemolízisnek (hemiglobin kiszabadulása a vörösvérsejtekbıl) két formáját különböztetjük meg: az α- és a β-hemolízist. A β-hemolízisre jellemzı, hogy a hemolizáló telepek körül a táptalaj teljesen, éles határral feltisztul, mert a vörösvérsejtek és a hemoglobin lebomlik. Ezzel szemben az α-hemolízises zóna nem éles határú és zöldes árnyalatú. Ez azzal magyarázható, hogy a vörösvérsejtek ez esetben nem esnek szét, a zöldes színt pedig a hemoglobin egyik bomlásterméke adja.

1.2.

SZEROLÓGIAI PRÓBÁK

A szerológiai próbák körébe tartoznak az agglutinációs és precipitációs próbák, a komplementkötési próbák, és a különbözı jelzéses módszerek. Ezek közül a mindennapi bakteriológiai rutindiagnosztikában az agglutinációs és precipitációs próbákat használják. A komplementkötési próbákról és a jelzéses módszerekrıl a vírusdiagnosztika tárgykörében lesz szó. A szerológiai próbák alkalmazhatók mind ismeretlen antigén azonosítására ismert savó segítségével, mind pedig vérsavó ellenanyagtartalmának azonosítására ismert antigén segítségével. Ezen próbák elvégzésekor az antigének és ellenanyagok koncentrációja szempontjából nagyon körültekintıen kell eljárni, mivel nagymértékő antigén- vagy ellenanyag-felesleg esetén a Marrack-féle rácselmélet értelmében fals negatív eredményt kapunk. 7

1.2.1. Agglutinációs próbák Agglutináció alatt a korpuszkuláris (sejtes) antigének ellenanyagokkal történı kapcsolódásakor létrejövı összecsapódást értjük. E tekintetben az antigént agglutinogénnek, az ellenanyagot pedig agglutininnek nevezzük. Az agglutinációs próbák között - végrehajtásuk szerint megkülönböztetünk tárgylemez-agglutinációt és csıagglutinációt. Az agglutinációs próbáknak egy speciális formája az un. indirekt agglutináció, amikor a szolubilis antigéneket vagy az ellenanyagokat sejtfelülethez (pl. vörösvérsejt) vagy korpuszkuláris anyagokhoz (pl. latex, bentonit) adszorbeáljuk, ezáltal szabad szemmel is jól látható agglutináció jön létre.

1.2.1.1 Salmonellák azonosítása tárgylemez-agglutinációval (Bemutató) A baktériumok identifikálása során a leggyakrabban használt immunológiai próba a tárgylemez-agglutináció, amelynek során ismert típussavóban (az adott antigén ellen termeltetett savó) szuszpendáljuk a vizsgálandó - tiszta tenyészetbıl származó baktériumtelepet. Pozitív reakció esetén a tárgylemezen néhány perc alatt kialakul az összecsapódás.

1. GYAKORLAT A szalmonellák azonosításának döntı lépése a szerológiai vizsgálat. A szalmonellák O-, H- és F-antigénekkel rendelkeznek, illetve egyes szerotípusok hılabilis K-antigént is tartalmaznak, amelyeket Viantigénnek is neveznek, mivel kapcsolatban állnak ezen szerotípusok virulenciájával. Ezek az antigének elfedik az O-antigéneket, vagyis megakadályozzák azok agglutinációját homológ O-immunsavóban.

8

Ostor (H antigén)

Tok (K vagy Vi antigén) Lipopoliszacharid (O antigén)

Külsı membrán Periplazmatikus tér Lipoprotein Peptidoglikán Belsı membrán H antigén Fimbria (F antigén)

2. ábra: A szalmonella antigénjei A vizsgálat elsı lépése az önagglutináció kizárása. Ennek során a vizsgálandó törzset egy csepp fiziológiás konyhasóoldatban szuszpendáljuk, majd 1 perc elteltével agglutinációra megvizsgáljuk. Az önagglutinációt mutató törzsek szerológiai próbák elvégzésére nem alkalmasak. Ezután következik az O-agglutináció vizsgálata. A vizsgálathoz a törzset O-polivalens savóban szuszpendáljuk. Ha az eredmény negatív, el kell végezni a Vi-agglutináció vizsgálatát is monovalens anti-Vi savóval. Amennyiben a Vi-agglutináció eredménye is negatív, a szerológiai vizsgálatot negatívnak tekintjük. Ha a Viagglutináció pozitív, akkor 60 °C-on történı 60 perces hıkezelést követıen az O- és Vi-agglutinációt meg kell ismételni. Salmonellának tekintjük a vizsgált törzset abban az esetben, ha a hıkezelést követıen a Vi- agglutináció negatívvá, az O-agglutináció pedig pozitívvá válik. A jelenség magyarázata, hogy a hıkezelés során a hılabilis Vi-antigén inaktiválódik, és így az eddig elfedett O-antigén szabaddá válik. A folyamat vázlatát az alábbi ábra mutatja: önagglutináció ↓ -

→

+

→

9

kizárás a vizsgálatból

↓ O-agglutináció → ↓ ↓ Vi-agglutináció → ↓ + ↓ hıkezelés 60 °C, 60 perc ↓ O-agglutináció és Vi-agglutináció

+

→

Salmonella

-

→

nem Salmonella

+ -

-

↓ Salmonella

↓ nem Salmonella

Szükséges anyagok és eszközök: tárgylemez, oltókacs, fiziológiás konyhasó-oldat, homológ polivalens Oimmunsavó Mikroorganizmus: Salmonella typhimurium ferdeagaros tenyészete A gyakorlat kivitelezése: Alkohollal megtisztított tárgylemez felületére egy csepp homológ polivalens O-immunsavót cseppentünk, majd a ferde agarról lelángolt kaccsal levett telepet egyenletesen szuszpendáljuk benne. Pozitív esetben az agglutináció néhány perc alatt kialakul (a S. typhimurium nem rendelkezik Vi-antigénnel). Az elbírálást könnyíti, ha azt sötét alapon, nagyító segítségével végezzük. 1.2.2. Csıagglutináció A csıagglutinációt általában vérsavó ellenanyag-koncentrációjának meghatározásához használják. Ehhez a vérsavó kettes alapú hígításaihoz ismert sőrőségő baktérium-szuszpenziót adunk. Ha az agglutinációban a sejtfal-antigén vesz részt, az agglutinátum a kémcsı alján felkúszó szélő tapadós üledéket képez, H-antigén agglutinációja esetén pedig az üledék laza, vattaszerő és könnyen felrázható. A csıagglutináció egyik speciális formája az ABR-teszt. Ezzel a vizsgálattal a tejjel ürülı Brucellák ellen 10

termelt ellenanyagot lehet kimutatni. A vizsgálandó tejhez TTC-vel (trifenil-tetrazónium-klorid) megfestett Brucella szuszpenziót kell adni. Pozitív esetben kialakul az antigén-ellenanyag komplex, ami a tej felfölözıdésével a felszínre kerül, így a tej felületén piros győrő látható.

1.2.3. Staphytect és Staphylase Test A Staphytect és a Staphylase Test a koaguláz-pozitív Staphylococcusok kimutatására szolgáló indirekt agglutinációs tesztek. A Staphytect latexagglutinációs teszt, melynek lényege, hogy az anti-koaguláz ellenanyagot korpuszkuláris latex-hordozóanyaghoz kötötték. Így egy rendszerben, agglutinációval mutatható ki a Staphylococcus aureus extracellularis oldott koaguláz-enzime, és a St. epidermidis sejthez kötött koaguláza. A Staphylase Test ettıl annyiban különbözik, hogy az ellenagyagok hordozója vörösvérsejt.

1.2.4. PRECIPITÁCIÓS PRÓBÁK Precipitációról beszélünk abban az esetben, ha az oldott ellenanyag oldott antigénnel képez immunkomplexet, amely az oldatból csapadék formájában kiválik. Akár az agglutinációs próbák esetében, itt is fontos az antigén és ellenanyag mennyiségének ekvivalenciája. A precipitációs próbáknak is több változata ismert, de a legelterjedtebben a csıprecipitációs próbákat és az agargélprecipitációt használják.

1.2.4.1 Csıprecipitációs próbák A csıprecipitációs próbák lényege, hogy az antigén- és az ellenanyagoldatot egy kémcsıben reagáltatjuk. Végezhetjük a próbát oly módon, hogy az oldatokat összekeverjük - ez esetben az eredmény egyenletes zavarosodás, majd pelyhes ülepedés lesz -, vagy eljárhatunk úgy is, hogy az ellenanyag-oldatra rétegezzük az antigén-oldatot - ekkor győrő alakú precipitációs győrő keletkezik. Ez utóbbi esetben a győrő határa nem éles, alatta egy fokozatosan erısödı csapadékképzıdéső prezóna, fölötte pedig egy fokozatosan gyengülı csapadékképzıdéső posztzóna látható. Ez a jelenség a Marrack-féle rácselmélettel magyarázható. 11

A bakteriológiai gyakorlatban a legjelentısebb precipitációs próba a Bacillus anthracis (lépfene-baktérium) azonosítását szolgáló Ascoli-féle thermoprecipitációs próba. A próba során a B. anthracis hıstabil sejtfalhapténjét mutatjuk ki. A próba során elıször a vizsgálandó szervbıl fızéssel vizes kivonatot készítünk, majd ezt azbesztvattán átszőrve az oldatot a sejtektıl mentesítjük. Ezt az oldatot rétegezzük a B. anthracis sejtfalhapténje ellen termelt hiperimmun savóra. Pozitív esetben a precipitációs győrő néhány perc alatt kialakul. A vizsgálat elınye, hogy rothadó, esetleg már elföldelt tetembıl is elvégezhetı.

1.2.4.2 Agargél-precipitációs próba (AGP) Az AGP próbák esetében az antigén-ellenanyag kapcsolat agargélközegben jön létre az anyagok diffúziója révén. Mivel a diffúzió idıigényes, ezek a próbák általában csak 24 óra után bírálhatók el. Az AGP-nak négy formáját különböztetjük meg: a lineáris géldiffúziót, a lineáris, kettıs géldiffúziót, a kétdimenziós kettıs géldiffúziót és a radiális géldiffúziót. A lineáris géldiffúzió (Oudin-módszer) során a 2 % agarral elkevert ellenagyag; oldatot kémcsıbe mérjük, majd dermedés után erre rétegezzük az antigén-oldatot. Az antigén a gélközegbe diffundál, és itt alakul ki a precipitációs zóna. A lineáris kettıs géldiffúzió az Oudin-módszertıl annyiban különbözik, hogy az antigén-oldatba is agart keverünk, és így rétegezzük az ellenanyag-tartalmú gélre. Az antigén- és ellenanyag-oldat mennységi viszonyai döntik el, hogy melyik rétegben alakul ki a precipitációs zóna. A kétdimenziós kettıs géldiffúzió (Ouchterlony-módszer) esetében Petricsészébe agart öntünk, ebbe kis tartályokat vágunk, és ezekbe mérjük külön-külön az antigén- és ellenanyag-oldatokat. Az antigén és az ellenanyag radiálisan az agarba diffundál, és találkozásuknál alakul ki a precipitációs zóna. A precipitációs zóna tartályoktól való távolsága jellemzi az antigén és az ellenanyag mennyiségi viszonyait. A radiális immundiffúzió (Mancini-próba) abban különbözik az Ouchterlonymódszertıl, hogy az ellenanyag-oldatot az agarba elegyítettük, így csak az antigén-oldatot mérjük az agarlemezbe fúrt lyukakba. A radiális immundiffúzió eredményeként a lyuk körül győrő alakú precipitáció alakul ki. A győrő átmérıje arányos az antigén koncentrációjával.

12

(A mikroorganizmusok anyagcserefolyamataiban szerepet játszó extra- és intracelluláris enzimek, a biokémiai reakciók köztes illetve végtermékei jellemzıek az adott mikroorganizmusra, ezért vizsgálatuk diagnosztikai szempontból igen fontos. Emellett a különbözı anyagcsere- és légzéstípusra utaló vizsgálatok során hasznos felvilágosítást kaphatunk az adott mikroba mezıgazdasági és élelmiszeripari hasznosíthatóságáról is. A biokémiai vizsgálatokat hagyományosan speciális táptalajok és reagensek segítségével végzik. Az utóbbi években egyre elterjedtebbek a több tulajdonság egyidejő vizsgálatát lehetıvé tevı tesztkészletek, amelyek különálló rekeszeiben igen kis mennyiségő, különbözı biokémiai vizsgálatok elvégzését célzó speciális táptalajokat öntenek (Enterotube II:, API). Az eredmények leolvasása történhet szabad szemmel, vagy olyan - számítógépes egységgel összekötött spektrofotométer segítségével, amely alkalmasak ezen biokémiai tesztkészletek automatizált, a szubjektivitást kizáró elemzésére. Ezzel a kérdéssel részletesebben az automatizált vizsgálati módszerek között lesz szó.)

1.3.

Ismeretlen baktérium törzsek meghatározása 16S rDNS szekvencia alapján (DNS, PCR, ARDRA)

Ismeretlen baktérium törzsek fajmeghatározásának egyik legkevésbé ellentmondásos módszere a 16S rRNS gén szekvencia-analízise. Ennek lépései: DNS izolálás, a 16S rRNS gén felszaporítása univerzális primerek segítségével (PCR), az amplikon szekvenálása, a szekvencia összehasonlítása adatbázissal. Ha azonban egy nagyobb törzsgyőjteményt kell feldolgozni, ahol a fajok ismétlıdhetnek, akkor idı- és anyagtakarékossági szempontból célszerő a törzseket elıbb csoportosítani. Ez esetben az egyes törzsekbıl amplifikált 16S rDNS-t gyakran hasító restrikciós enzimekkel emésztjük. Távolrokon fajoknál a régión belül található restrikciós hasítási helyek száma és elhelyezkedése jelentıs mértékben különbözhet. Az enzimatikus emésztések gélelektroforézis utáni mintázata az eltérı méret és fragmentszám miatt különbözı lesz. Az így kapott mintázat alapján törzscsoportokat hozunk létre. Ez a módszer az ARDRA (Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis). Ezek után a csoportoknak csak egy-egy tagját kell szekvencia-analízisnek alávetni.

1.3.1. DNS izolálás és tisztítás tiszta tenyészetbıl 13

1. A membránszőréses eljárás A membránszőréses eljárás elıírt mennyiségő szőrhetı vizsgálati mintában lévı mikroorganizmusok mechanikus dúsítására szolgáló eljárás, mellyel minimális csíratartalom esetén is pontos csíraszámmeghatározást végezhetünk. A membránszőrés elve, hogy a meghatározott mennyiségő folyadékot egy jól definiált pórusátmérıjő membránszőrın átszívatjuk, miközben a folyadékban található csírák a szőrı felületén visszamaradnak. A szőrılapot ezután táptalaj felszínére fektetjük. A táptalaj tápanyagai a szőrılapba diffundálnak, lehetıvé téve a különálló mikroorganizmussejtek növekedését, azaz a telepképzést, melyek megfelelı inkubációs idı után megszámlálhatók. Eredményként a telepképzı egységek számát adjuk meg az átszívatott mintamennyiségre vonatkoztatva.

2. A szőrıberendezés A csíraszám-meghatározásra szolgáló készülék egy tölcsérszerő feltétbıl áll, amelynek anyaga lehet rozsdamentes acél, mőanyag vagy üveg, őrtartalma 100-250-500 ml, befertızıdés ellen fedéllel zárható. A feltét csavarkötéssel vagy rugós csipesszel rögzíthetı a szőrıtartó ülékrészhez, mely légmentesen záró gumitömítéssel kapcsolódik a szívópalackhoz. A szőrés során a membránszőrı átszakadásának megakadályozására az ülékben egy acél szita vagy durva pórusú kerámia vagy fém betét található, amelyre a szőrılap fekszik. A szívópalack egyrészt a vákuumot közvetíti a szőrı felé, másreszt az átszívatott folyadékot összegyőjti. A szívópalackhoz vákuumszivattyút, vagy vízlégszivattyút csatlakoztatva mőködtetjük a készüléket a gyorsabb átszívatás érdekében. Használat elıtt a tölcsért és a membránszőrıvel érintkezı alátétet autoklávban sterilezni kell. Ha ez nem lehetséges (pl. sorozatvizsgálat), akkor a gyakorlat számára általában elégséges életképes csíra eliminálást nyújt a két rész 20 másodperces intenzív lelángolása. Ebben az esetben a 14

szőrı-alátéten is át kell szívatni a lángot. Csak a készülék megfelelı lehőlése után helyezzük a steril membránszőrıt egy steril csipesszel úgy a szőrıalátétre, hogy a hálózat (amennyiben van) a szőrın felül legyen. 3. A membránszőrı A csíraszám-meghatározáshoz használatos membránszőrık cellulóznitrátból, cellulóz-acetátból, kevert cellulóz-észterbıl vagy hasonló anyagokból állnak, azokat jól definiált, behatárolt pórusnagysággal gyártják. A pórusméretet a felhasználási cél, azaz a visszatartandó mikroorganizmusok nagysága szerint választjuk meg: Mikroorganizmus Pórusátmérı Élesztıgombák 0,65 µm Penészgombák 0,65 µm Baktériumok (általában) 0,45 µm pl. Mikrokokkuszok, 0,20 µm baktériumspórák A membránszőrık kizárólag épen és sterilen használhatók, ezért célszerő gyárilag csomagoltan és sterilezetten beszerezni. Anyagtól függıen autoklávban sterilezhetık, bár ezek pórusjellemzıi már nem garantálhatók megbízhatóan. A csíraszámlálás megkönnyítésére a membránszőrıkön négyzetrácsos hálózat található. Leggyakrabban a 47 mm átmérıjő membránszőrı-lapokat használjuk.

4. Összes élı mikrobaszám meghatározása membránszőréssel 4.1. Vizsgálati minta Membránszőréssel csak olyan folyadékfázisban lévı minta csíraszáma határozható meg, melynek várható csíraszáma alacsony (általában <100/ml), és a telepszámlálást zavaró részecskéket nem tartalmaz. Nagyobb várható csíraszám esetén a mintából decimális hígítási sort kell készíteni. 4.2. A membránszőrés végrehajtása Az összeállított steril szőrıkészülék tölcsérébe aszeptikus körülmények mellett elıírás szerinti mennyiségő mintát vagy annak valamely hígítását öntünk. A vákuumszivattyút bekapcsolva a vizsgálandó folyadékot átszívatjuk a membránszőrı-lapon. Mielıtt a minta teljes mennyisége lefolyna, kb. 10-30 ml steril fiziológiás konyhasóoldatot hozzáöntve 15

leöblítjük a tölcsér falát, hogy az esetlegesen oda tapadt mikrobákat is rámossuk a szőrıre. A szívatást addig folytatjuk, míg a membránszőrı-lap csepegéstıl mentessé nem válik. Ezután a szivattyút kikapcsoljuk és nyomáskiegyenlítıdésig várunk, majd a tölcsért eltávolítjuk az ülékrıl, óvatosan csipesszel leemeljük a membránszőrı-lapot, s egy mozdulattal az elıre elkészített táptalaj felületére légbuborékmentesen ráfektetjük a rácsozott felszínnel felfelé.

4.3. Táptalaj Az összes élı mikrobaszám meghatározásához Plate-Count Agart használunk, melynek agar-agar tartalma legfeljebb 1% ehet, a tápanyagok diffúziójának elısegítése érdekében. A kb. 45 °C-ra lehőtött táptalajt Petri-csészébe kell kiönteni, a vízszintes helyzetben szilárdulni hagyni. Az így elıkészített agarlemezekre helyezzük majd a szőrılapokat. (Elektív, szelektív vagy differenciáló táptalajokat alkalmazva speciális mikrobacsoportok is meghatározhatók ezzel az eljárással.)

4.4. Inkubálás Fedıvel lefelé fordítva egy lemezt 44 ± 4 órán át 20°C-on – a szaprofita flóra – valamint 24 ± 4 órán át 37°C-on – a szennyezı flóra kimutatása céljából – kell inkubálni. 4.5. Telepszámlálás Az inkubációs idı elteltével a membránszőrı-lapon lupe segítségével megszámláljuk valamennyi telepet, s az összes telepszámot az átszőrt minta mennyiségére, vagy a hígításokkal kalkulált mennyiségre vonatkoztatva adjuk meg. A kiértékelésbe azon lemezeket vonjuk be, amelyekben ezen szám 10 és 100 között van. A térfogatra vonatkozó szaporodóképes csírák számát ezen képlet szerint számítjuk:

G=

N ,ahol V×f

G: térfogatra vonatkoztatott szaporodóképes csírák száma a vízminta ml-ében N: a telepképzı-egységek száma (TKE) vizsgálati egységenként I!g V: a vizsgált vízminta térfogata ml-ben f: a hígítási faktor, pl. f = 1 / 100 Az eredmények megadásánál a telepképzı-egységek (TKE) számát a vízminta 1 ml-ére vonatkoztatjuk. 16

***A membránszőrı készülék felépítése. Követelmények: Bakteriológiai határértékek Paraméterek Coliformszám 100 ml-ben Telepszám 37°C-on 1 ml-ben Telepszám 20°C-on 1 ml-ben

A B C Megengedhetı mennyiségek 0 2 0 20 100 500 100 500 500

Paraméterek Pseudomonas aeruginosa 100 mlben Fekális Streptococcus 100 ml-ben E. coli vagy fekális coliform 100 ml-ben Szulfitredukáló anaerob spórás baktérium (Clostridium) 50 ml-ben Enterális vagy egyéb kórokozó mikroorganizmus* 5000 ml-ben

Megengedhetı 0 0 0

mennyiség

0 0 0

Enterális baktériumokat oldó bakteriofág 100 ml-ben *-pl. Campylobacter, Salmonella, Shigella, 0Staphylococcus aureus, kórokozó omba, rotozoon, féreg ete, humán atogén vírus...

Vizsgálati módszerek Kvalitatív Kvantitatív Dúsításos Membránszőréses Szélesztéses MPN

Lemezöntéses

17

l. Telepszám-meghatározás: mintánként és higításonként 4 lemez 1-1 ml mintával Tápagar (összcsíra-agar) 2 lemez 37°C 48 óra - szennyezı flóra 2 lemez 20°C 96 óra - szaprofita flóra (fehérjebontók!) /5-7°C 7-10 nap
pszichrotróf pl. Ps. fluor./ leolvasás 2,5-6x lupéval

18

Ivóvíz minısítése mikrobiológiai vizsgálat alapján (MSZ 450-3:1991; MSZ 448/44-1990; MSZ ISO 8199:1992) Vízben található baktériumok: 1. Természetes flóra: Spirillum, Vibrio, Pseudomonas, Achromobacter, Chromobakterium. . 2. Talajbaktériumok: Bacillus, Streptomyces, Aerobacter... 3. Szennyezı flóra: E. coli, Enterococcus faecalis, Clostridium welchü... (normál bélflóra) Higiéniai és technológiai szempontú mikrobiológiai vizsgálatok Tárgya: -a víznyerés módjától és helyétıl függetlenül- minden ivásra; háztartási célra, vagy emberi fogyasztásra kerülı termék elıállításához, kezeléséhez használható vagy, ilyen termékkel közvetlen kontaktusba kerülı vízféleség. Terjedelme: 1. Ellenırzı bakteriológiai vizsgálat - ivóvíz hatósági vizsgálata esetén. -->Coliform baktériumok száma és fekális eredete, valamint Pseudomonas aeruginosa jelenléte, -->Telepszám 37°C-on , -->Telepszám 20°C-on. 2. Részletes bakteriológiai vizsgálat - közfogyasztás céljára szolgáló ivóvíz elsı vizsgálata. -->Coliform baktériumok száma és fekális eredete, -->Fekális coliformok jelenléte esetén E. coli I., -->Telepszám 37°C-on , -->Telepszám 20°C-on, Fekális streptococcusok száma -->Pseudomonas aeruginosa száma, -->Szulfitredukáló anaerob spórás baktériumok (Clostridium) száma, -->Feltételezett kórokozó célzott vizsgálata , -->Leggyakoribb enterális kórokozók jelenlétének vizsgálata (Salmonella, Shigella, enteropatogén Escherichia coli, Campylobacter)

19