1
A mikroorganizmusok leküzdése Természetes és mesterséges környezetünkben nagyszámú, igen változatos mikroorganizmus populációval élünk együtt, ami egyfelől gazdagítja világunkat, másfelől viszont komoly gondokat okoz. Azok az eljárások, melyek a mikroszkopikus élőlények ellenőrzését, illetve leküzdését teszik lehetővé, szerves részét képezik a modern emberiség életének. Nélkülük félelmetes méretű problémák keletkeznének az élelmiszerek előállításánál, tárolásánál és szállításánál, a gyógyszergyártás lehetetlenné válna, nem is beszélve arról a rengeteg betegségről, mely elárasztana nemcsak minket, de a haszonállatokat és növényeket is. Az élelmiszeriparban, a gyógyszergyártásban, az egészségügyi intézményekben és a kutatólaborokban a munkafolyamatok során a fertőzés megelőzésére nagy gondot kell fordítani. Minden ember hordoz haján, bőrén, szájában mikrobákat, amelyek a mozgás, a köhögés, a tüsszentés, valamint a közvetlen érintkezés következtében szóródhatnak, ezért a felsorolt munkahelyek közül sokban kötelező a steril védőruházat viselése, amely megakadályozza az ember által hordozott mikroorganizmusok környezetbe jutását. Jól ismerjük a műtétekhez használt orvosi védőruházatot (steril sapka, ing, nadrág, cipő, kesztyű és maszk). Nemcsak arra kell azonban ügyelni, hogy a betegeket megvédjük a további fertőzésektől, hanem arra is, hogy az egészségügyi dolgozók és a fertőző ágensekkel foglalkozó kutatók elkerüljék a betegségeket. A védőruha ebben az esetben is jó szolgálatot tesz, és szigorú rendszabályok írják elő a kötelező tisztálkodást. Laboratóriumokban a mikroorganizmusok tenyésztéséhez és vizsgálatához használt anyagokat, táptalajokat, edényeket és eszközöket, néhány kivételtől eltekintve sterilizálni kell. Az eszközöket az utólagos fertőzés kiküszöbölése érdekében igen gyakran műveletenként is sterilizálják. Sterilizálásra van szükség minden olyan esetben, amikor az anyagokon, eszközökön, edényeken jelenlevő mikroorganizmusok zavarnák a vizsgálatot. Ez érvényes a táptalajokra is, melyeket sterilizálás nélkül még hűtőben sem lehet hosszabb ideig tárolni, mert rajtuk a baktériumok elszaporodnak. Nem szükséges pl. a táptalaj fertőtlenítése, ha csupán a mikroorganizmusok egyes táptalajkomponensekre gyakorolt hatásának vizsgálata a cél. Ha pl. keményítőbontás a vizsgált folyamat, akkor a táptalajban eredetileg is meglévő mikroorganizmusok jelenléte nem zavaró, a beoltáskor a táptalajra kerülő mikroorganizmusok (pl. egyszerű talajszuszpenzióval) szerepe vizsgálható. Tesztként a sterilizálatlan, be nem oltott táptalaj használható fel. A laboratóriumokban speciális munkahelyeket is kialakítanak annak érdekében, hogy a levegőben levő mikrobák ne kerülhessenek a kísérleti anyagba, s belélegzésüktől megóvják a velük dolgozót. Ezek a berendezések lényegében olyan kabinok, amelyekbe a levegő szűrés vagy hőkezelés után, sterilizálva jut be. Az ún. laminárboxok lehetnek nyitottak, de zártak is, ahol a kísérletező teljesen szeparált a munkaanyagtól (ld. később).
2
Sok esetben szükség lehet a mikroszervezetek elölésére. E célra nagyon sok fizikai és kémiai eljárás kínálkozik. Mindenek előtt azonban tisztáznunk kell, hogy mikor tekinthető egy mikroorganizmus halottnak. A problémát az jelenti, hogy a sejtek sok esetben pusztulásuk után is megőrzik fizikai integritásukat és nem vizsgálhatók egyedileg, így nehéz eldönteni egy adott mikrobáról, hogy élő-e, vagy már elpusztult. Definíciószerűen abban az esetben tekinthető egy mikroorganizmus élettelennek, ha már optimális növekedési feltételek mellett sem képes reprodukcióra. A gyakorlatban mindig populációk, nem pedig az egyes sejtek pusztulását tanulmányozzuk. Ha egy letális hatásnak kitett tenyészet friss táptalajra oltva nem növekedik, kolóniát nem képez, akkor az a fenti definíció értelmében halott. A különböző fizikai behatásokra, kémiai vegyületekre igen eltérően reagálnak az élőlények, ráadásul a kezelés hatása is sok tényezőtől függ (pl. a hatóanyag-koncentrációtól, a populáció sűrűségétől, a környezeti feltételektől, a mikroba kondíciójától, stb.).
A sterilizálást sokféle módon lehet elvégezni, mindig a kívánalmaknak megfelelően, az alkalmazott anyagok és eszközök anyagai minőségének és a sterilizálási eljárásnak rájuk gyakorolt mellékhatása figyelembe vételével megválasztva azt. Sterilizálási fogalmak: -
sterilizálás: Az esetek nagy részében a teljes csíramentesség elérése a cél, vagyis valamennyi mikroorganizmusnak és spórának a megsemmisítése a használt anyagok, eszközök felületén. Tiszta tenyészetek készítésénél elengedhetetlen ezeken túlmenően a táptalajokban jelen levő mikroorganizmusok és spóráik elpusztítása vagy eltávolítása is, ami az előbbiek figyelembe vételével nem is mindig könnyű feladat. A sejtek pusztulása exponenciális függvényt követ, ami azt jelenti, hogy a sejtek zöme rövid időn belül elpusztul a kezelés hatására, míg az ellenállóbbak hosszú időn át életben maradhatnak. Mivel még az azonos mikroorganizmusokból álló populációk is heterogének, számolnunk kell a jelenlevő sejtek eltérő mértékű rezisztenciájával és figyelembe kell vennünk azt a tényt is, hogy a kevesebb egyedből álló populációk esetében rövidebb időn belül elérhető a sterilitás. Az elmondottak értelmében úgy kell megválasztani a hatóidőt, hogy a sterilizálandó anyag teljes mennyiségét figyelembe véve ne maradjon élő sejt az eljárás befejezése után. -
fertőtlenítés: olyan fizikai vagy kémiai eljárás, amely célja valamennyi kórokozó mikroorganizmusnak elpusztítása a használt anyagok, eszközök felületén, mely nem hat azonban a bakteriális endospórákra, amelyek az élet legellenállóbb formái.. (Gyakran a fertőtlenítési eljárással sterilitást érnek el.)
3
-
higiénizálás: a használt anyagok, eszközök felületének olyan mértékű megtisztítása, amely nem csupán a mikroorganizmusok és spórák többségének eltávolítását jelenti – amivel nagymértékben csökkenteni lehet a fertőzési lehetőséget –, hanem egyben azon szerves szennyezőanyagok eltávolítását is, amelyekben a jelenlévő mikroorganizmusok elszaporodhatnak. A higiénizálás is elérhet néha fertőtlenítést vagy sterilizálást.
Példa a megértéshez:
KÉZMOSÁSNÁL
sterilizálás
fertőtlenítés
higiénizálás (sanitization)
klór tartalmú szerekkel
híg fenollal (karbolsavval)
szappannal
kórokozókat kórokozókat elpusztítja
és
nem csupán a kórokozókat és a nemcsak a kórokozók és egyaránt nem kórokozók egy részét nem kórokozók egy részét pusztítja el pusztítja el, hanem az elszaporodásukat elősegítő szerves anyagokat is eltávolítja a kézről
Sok problémát jelentenek a kórokozó mikroszervezetek, hiszen gyakran kell elpusztításukról gondoskodni élő szervezetben vagy szöveten (pl. bőrön) úgy, hogy a kezelt élőlény, ill. szövet ne károsodjon. Fontos megjegyezni, hogy fenti módszereket elsősorban tárgyak fertőtlenítésére használják, mivel az alkalmazott koncentrációban általában túl toxikusak élő anyagok kezeléséhez. A kemoterápiás szerek olyan antimikrobiális vegyületek, melyek vagy szelektív toxicitásuknak, vagy az alkalmazott koncentrációnak köszönhetően nem, vagy csak kismértékben mérgezőek arra a szervezetre, melyet kezelnek velük. A természetben fellelhető és mesterségesen előállított kemoterápiás hatású vegyületek mellett a mikrobák maguk is képesek lehetnek antimikrobiális anyagok kiválasztására. Ezek az antibiotikumok, melyek igen kis koncentrációban ható vegyületek, ugyanis specificitásuk révén csak bizonyos metabolitikus folyamatokat képesek gátolni. További módszer:
tartósítás: a különböző anyagokban, élelmiszerekben lévő baktériumok élettevékenységének gátlása, ill. szaporodásuk gátlása. A zavartalan élettevékenységet folytató, szaporodó baktériumok anyagcseréjekor ugyanis mérgező anyagokat termelhetnek, tönkretehetik ezen anyagokat, élelmiszereket, sőt a bennük lévő mikroorganizmusok lehetnek önmaguk is patogének, melyek elszaporodva fertőzési veszélyt jelentenek. Tartósításként elvégezhetnek
4
sterilizálást is (pl. konzervek), de legtöbbször csak baktériumgátló eljárást jelent. Ilyen eljárás baktériumgátló anyagok adagolása, az élettevékenységek és a szaporodást gátló körülmények teremtése (cserzés, mélyhűtés, alacsony pH vagy magas ozmózisnyomás létrehozása). A hatás megszűnése után a sejtek újra osztódhatnak, a folyamat visszafordítható. Általánosságban azokat a szereket, ill. eljárásokat, melyeknek ilyen reverzibilis szaporodásgátlás a következményük, mikrosztatikus hatásúaknak nevezzük. A bakteriosztatikumok a baktériumok, míg a fungisztatikumok a gombák növekedését állítják le. Vannak olyan kémiai anyagok is, melyek irreverzibilis változásokat idéznek elő az élő sejtben, és ezek a növekedés, valamint a szaporodás végleges megszűnéséhez vezetnek. Ilyenek a baktericidek, amik a baktériumok, a fungicidek, amik a gombák, a sporocidek, amik a bakteriális endospórák, virucidek, amik a vírusok és a biocidek, amik az összes élőlény, de főképpen a mikroorganizmusok pusztulását okozzák. Előfordul, hogy ugyanazon hatóanyag különböző koncentrációi egy adott szervezetre lehetnek baktericid, ill. bakteriosztatikus hatásúak is. A sterilizálási eljárások A következőkben tekintsük át, miképpen befolyásolják az eltérő fizikai és kémiai kezelések a mikroorganizmusok életképességét! Még egy olyan kicsi lény is, mint az egyetlen sejtből álló mikroba nagy támadási felületet biztosít a különböző behatásokkal szemben, melyek megzavarhatják a sejtfal felépítését, a sejtmembrán funkcióit, a DNS és RNS szintézisét, valamint az enzimek működését. A fizikai ágenseken alapuló módszereket, mint a hőkezelést, besugárzást, szűrést elterjedten alkalmazzák ott, ahol a sterilitás követelmény. A hővel szemben rezisztens anyagokat tartalmazó készítmények sterilizálásának legegyszerűbb módja a hőkezelés. A magas hőmérséklet hatására károsodik a sejtmembrán, denaturálódnak a fehérjék és nukleinsavak. A hőmérséklet emelésével a membrán fluiditása nő, szelektív permeabilitása megszűnik és a membránhoz kapcsolt enzimek működésképtelenekké válnak, melynek következtében a sejtlégzés is leáll, így ATP sem keletkezik. A fehérjékben és nukleinsavakban a H-híd kötések felszakadnak, így másod-, harmadlagos szerkezetük fellazul, következésképpen funkcióikat többé már nem képesek ellátni. A különböző mikroorganizmusok eltérő mértékben érzékenyek a hőkezeléssel szemben. Általánosságban elmondható, hogy a baktériumok és gombák vegetatív sejtjei a legérzékenyebbek, de itt is nagy különbségekkel találkozhatunk: a Neisseria gonorrhoeae elöléséhez 50 °C-on 3 perc elegendő, míg a Staphylococcus aureus 60 °C-on akár egy órát is kibír. Érdemes megjegyezni, hogy bár a bakteriális endospórák hőrezisztenciája nagy, a spóraképző baktériumok vegetatív sejtjei hasonlóképpen viselik a hőkezelést, mint az egyéb
5
baktériumok. Meglepő módon a vírusok meglehetősen érzéketlenek a magas hővel szemben, de a különböző törzsek eltérő toleranciájával itt is számolnunk kell (adenovírusok 55°C -2-5 perc, hepatitis vírus 60°C -600 perc). Azt a legalacsonyabb hőmérsékletet, mely ahhoz szükséges, hogy egy adott mikroorganizmus-tenyészetben az összes sejt 10 percen belül elpusztuljon, "hőhalálpont"-nak (thermal death point) nevezzük. A gyakorlatban fontosabb lehet annak ismerete, hogy egy adott hőmérsékleten mennyi idő elegendő ugyanezen tenyészet esetében a sterilitás eléréséhez. Annak az időtartamnak, amely ahhoz szükséges, hogy az adott hőmérsékleten az összes élő sejtet elpusztítsuk, "hőhalálidő" (thermal death time) a neve. Ez több tényező függvénye, úgy mint a hőmérséklet, a páratartalom, a tápközeg összetétele és pH-ja, valamint magának a mikrobának a tulajdonságai. A mindennapi munka során gyakran előfordul, hogy kevert tenyészettel szennyezett anyagot kell sterilizálnunk és rendszerint nem áll módunkban az optimális paraméterek kimérése. Erre nincs is szükség, hiszen ha egy kezelés elöli a bakteriális endospórákat, melyek az összes többi élőlény közül a legellenállóbbak hővel szemben, akkor elpusztítja az élet többi formáját is; így a hőkezelési eljárások standardizálhatók. A különböző laboratóriumi eszközök (pl. oltókacs, szike), valamint a fertőzött hulladékok sterilizálására alkalmas égetési módszerek a többi hőkezelési eljárás közül a legdrasztikusabbak (a Bunsen égő lángjában a legmelegebb pont 1870 °C), ugyanis az égetés során a sejtek szerves anyaga CO2-re és vízre esik szét. Jóval kíméletesebb a száraz-hővel történő sterilizálás, amit hősterilizálókban végeznek. Itt 160-180 °C-on kettő-négy óra elegendő a fenti kritériumok teljesítéséhez. A módszer hátránya, hogy folyadékok és hőérzékeny anyagok esetében nem alkalmazható. A száraz hőnél hatásosabb a nedves hő, mivel a vízgőz jó, a levegő pedig rossz hővezető. Táptalajokat csak nedves hővel lehet sterilizálni. Ezen kívül a nedves hő alkalmazása indokolt olyan esetben, amikor a rövid sterilizálási idő elengedhetetlen, mert a sterilizálandó eszközök magasabb hőmérsékleten károsodnak. Ilyenek lehetnek például gumiból készült tárgyak, csövek, egyéb hőre érzékeny anyagok és az azokból készült eszközök, hőre érzékeny vegyületek. Gyakran a sterilizáláshoz szükséges hőmérséklet eléréséhez túlnyomást alkalmaznak. Igen széles körben elterjedt ez hétköznapjainkban is, gondoljunk csak az otthoni kuktákra, amelyekben nyomás alatt, gőzben főzzük ételeinket. Ilyen nagyméretű kuktáknak foghatók fel a laboratóriumi autoklávok, melyekben a csírátlanítást telített vízgőzzel túlnyomáson végezzük; megközelítőleg 1.0 atmoszféra túlnyomáson, 121 °C-on 15-20 perc a szükséges sterilizálási idő. Az autokláv lényegében egy hermetikusan záró, nagy belső nyomást kiálló tartály, melybe behelyezve a sterilizálandó tárgyakat abban gőzt fejlesztenek. Az autokláv zárt terében a nyomás a hevítés során növekszik, növelve ezzel a keletkező gőz hőmérsékletét.
Gondoljunk csak arra az egyszerű fizikai összefüggésre, ami alapján a hegymászók jóval 100°C alatti hőmérsékleten fel tudják már forralni teájukat, levesüket. Ezen összefüggés fordítottan is igaz, ezt alkalmazzuk az autoklávokban. S mivel a telített
6
gőz ideális gázként viselkedik, levegő jelenlétében ugyanolyan nyomás mellett a hőmérséklet alacsonyabb, mint a tisztán gőzt tartalmazó autoklávban. Ezért nem lehet a nyomás értékéből teljes biztonsággal az autokláv belső terében uralkodó hőmérsékletre következtetni, azt a hőmérséklet mérésével kell ellenőrizni. Itt is fontos, hogy a kiáramló gőz hőmérsékletét kell mérni!!! Néhány esetben a sterilizálandó anyag hőérzékenysége miatt nem alkalmazható az autoklávozás. Ilyenkor, ha más mód nem kínálkozik, megoldás lehet a tyndallizáció, vagy a membránszűrés. A tyndallizációt ún. Koch-fazékban végzik, 3 x 30´ áramló gőzben, három egymást követő napon történik a sterilizálás. Az élelmiszeriparban külön gondot kell fordítani az élvezeti érték megőrzésére, ugyanis az ízanyagok, illetve az élelmiszerek konzisztenciája a magas hő hatására megváltozhat. ezért célszerű a lehető legalacsonyabb hőmérsékletet alkalmazni. A konzervek, a tej, a sör és egyéb italok hőkezelése nem jelent sterilizálást, csak erőteljes csíraszám csökkentést, mivel a bakteriális endospórák és más, hőre kevésbé érzékeny szervezetek életben maradnak. A tej pasztőrizációját 62-66 °C-on 30 mp-ig, míg egy az ultrapasztőrözéskor eljárástól, alapanyagtól függően 72-78°C-on ill. 140°C-on 15 mp-ig végzik (pl. tejszínt 94-98 °C-on), hogy a vajsav és a fehérjék ne csapódjanak ki. Itt a lényeg nem a hőmérséklet nagyságán van, hanem azon, hogy hirtelen felmelegítéssel érjük el a kívánt hatást, s a lehűlésnek is pillanatszerűnek kell lennie. Ehhez a tejet vékony belső átmérőjű, kapilláris csövekben melegítik fel. Nemcsak a magas hőmérsékleten történő konzerválást, hanem az élelmiszerek fagyasztását is széles körben alkalmazzák. A mikróbák 4°C-os hőmérsékleten sokáig eltarthatók élő állapotban. Fagyasztásról beszélünk a háztartásban, ha –18°C-on ½-2 évig tároljuk élelmiszereinket. Laboratóriumokban -96°C-on kb. 5-10 évig, folyékony nitrogénben akár 3050 évig is fenntarthatók a mikroorganizmusok. Sikerrel „élesztettek újjá” kutatók többszázezer éves kitartóképleteket sarki jégpáncélból. Az igen alacsony hőmérsékletnek is csupán bakteriosztatikus hatása van, azonban a sorozatos kiengedés és visszafagyasztás károsító hatású lehet. A gyors lefagyasztás sokkal kevésbé veszélyes a mikroszervezetekre, mint a lassú, melynek során nagy és éles jégkristályok képződnek, amik a sejt szétesését idézik elő. A fagyasztáskor egy mozaikos szerkezet jön létre, melyben a kristályos és a folyékony részek egymásba alakulnak, így bizonyos enzimreakciók továbbra is lejátszódhatnak. Az ún. krioprotektáns szerek (pl. glicerin, inositol, dimetil-szulfonil) gátolják a tűkristályok létrejöttét, megnövelve ezzel az eltarthatóság idejét. Csírátlanításra elterjedten használt energiafajták a különböző sugárzások is, melyeknek előnyük, hogy hőérzékeny anyagok esetében is alkalmazhatók. A sugárzás atomi
7
tevékenységek révén létrejött energia emittálódása, ami nagy sebességgel terjed. Két csoportjukat különböztetjük meg: az elektromágneses sugárzásokat, melyek kizárólag hullámtermészetűek (ezek közül a γ-, a röntgen- és az ultraibolya-sugárzás alkalmas sterilizálásra) és a részecskesugárzásokat (korpuszkuláris és hullámtermészetűek egyszerre), melyek közül a nagyenergiájú elektronok alkotta β-, más néven katódsugárzás bír antimikrobiális aktivitással. Ha egy sejtet valamilyen sugárzással bombázunk, akkor annak molekulái abszorbeálják az energia egy részét, ami az alábbi következményekkel járhat. 1) A molekulák elektronegyensúlyát megzavarva ionképződést indukálhat (ionizáló sugárzás); ezen hatásra legérzékenyebb a DNS, de más sejtalkotók is károsodhatnak, valamint toxikus anyagok is keletkezhetnek, melyek következtében a sejt elpusztul (a szaporodásgátló hatás maximuma 265 nm-rel érhető el, mert ennél a hullámhossznál van a nukleinsavak abszorpciós maximuma. Már a közvetlen napfénynek is van ilyen hatása). Hatásukat tekintve a γ-, a röntgen- és a β-sugárzások sorolandók ide (60Co,
137
Cs, olcsó atomerőművi hulladékokban),
amelyeket elsősorban egészségügyi felszerelések (pl. műtőskesztyűk, műanyag segédeszközök, vakcinák) strerilizálására használnak. 2) A nem ionizáló sugárzások (UV) a molekulákat magasabb energiaszintre emelik, melynek következtében azok közt abnormális kötések létesülnek. A DNS esetében ez leggyakrabban timidin dimerek képződését jelenti, ami a dimerek helytelen leolvasása miatt mutációkhoz vezet. Az UV-sugárzást elsősorban fertőtlenítésre használják (pl. kórházakban a műtők levegőjének fertőtlenítéséhez). Alkalmazását manapság megkérdőjelezik ózonhatása miatt. A levegő és a hőérzékeny folyadékok sterilizálása a fentebb ismertetett eljárásokkal (hőkezelés, besugárzás) nem minden esetben problémamentes, így olyan módszert kellett keresni, amely a mikroszervezetek közegből történő eltávolítását és nem elölését célozza. E célra igen alkalmasnak bizonyult a szűrés, amelyet olyan esetekben alkalmazzák, amikor pl. a sterilezendő közeg termolabilis anyagokat is tartalmaz, amelyek a hőkezelés hatására károsodhatnának. Ilyenek többek között az antibiotikumok, vitaminok, fehérjéket és illó anyagokat tartalmazó szubsztrátumok, stb. A szűrőknek két fő típusát különíthetjük el: - szitahatású membránszűrők (cellulóz-észter, poliészter, teflon). Ezeket oldószerellenállóságuk szerint kell kiválasztani. A legmodernebb mikrobiológiai filterek igen vékony membránok, melyek pórusméretét pontosan beállítják és ellenőrzik. A különböző szűrők pórusának átmérője 8µm-től 0,02µm-ig változik. A baktériumok eltávolítására a 0,2 µm átmérőjű filterek a legalkalmasabbak, ám ezek a vírusokat áteresztik; utóbbiak kiszűrésére még finomabb pórusméretű (0,02 -0,05 µm) szűrőket alkalmaznak. -
adszorpciós hatású szűrők: - azbeszt (nem minden kristályosodási formája rákkeltő) - üveg (Fritt-lemez) - réz-frittek (porkohászatból, zsugorítással)
8
- műanyagok - Glasfaser (GF) (esetleg üveggyapotból) A baktériumszűrők túlnyomó többségének a működési elve a pórusok mikroadszorpcióján alapul. Ugyanis a mikroorganizmusok sejtjei vizes szuszpenzióban általában negatív töltésűek, a szűrők viszont pozitív töltésű anyagokból készülnek. A membránszűrők biológiailag semlegesek, nem akadályozzák a szűrőn fennmaradt mikroorganizmusok élettevékenységét, nem gátolják az enzimműködést, így könnyen tenyészthetők is. Ezen kívül festhetők, fénymikroszkóp alatt megvizsgálhatók. Terepi vizsgálatokhoz is alkalmazhatóak a membránszűrő-gyártó cégek által készített, kereskedelmi forgalomban kapható tenyészlapok. Ezek nagy mennyiségű táptalaj megtakarítását is lehetővé teszik, a helymegtakarítás mellett. Ezek rendszerint már sterilen szállított higroszkópikus lapok, amelyeket folyékony táptalajjal át lehet itatni, és a szűrőlapok így elhelyezhetők zárt Petri-csészében. A táptalajjal átitatott szűrőlap sterilen meg is szárítható és így hosszú ideig tárolható. Ilyen formában terepre könnyen szállítható, ott néhány csepp steril desztillált vízzel való megnedvesítés után rögtön használható. A kémiai szerek alkalmazásán alapuló eljárásoknak nem annyira a sterilizálás a céljuk, mint inkább a fertőtlenítés, illetve a kemoterápiás kezelés. A mikroszervezetek leküzdésére használható vegyületeknek egy része toxikusan hat valamennyi élő sejtre (nem szelektív anyagok), míg mások csak bizonyos típusú sejteket támadnak meg. Szelektíven hat az antibiotikumok jelentős hányada, és a gyógyszer-kutatásoknak köszönhetően egyre több mesterségesen előállított drogot ismerünk. A nem szelektív fertőtlenítő- és antiszeptikus szerek gátolják a mikrobák növekedését, illetve elpusztítják azokat. Míg az előbbieket elsősorban tárgyak, addig az utóbbiakat élő szövetek (pl. bőr) kezelésére használják. Napjainkban kb. 10 000 különböző antimikrobiális hatású anyagot állítanak elő világszerte és ezek közül megközelítőleg ezret használnak rutinszerűen. A teljesség igénye nélkül ismerkedjünk meg a főbb csoportokkal: Az alkoholoknál (R-OH) elkülönítünk alifás és aromás csoportokat. Az alifások közül az etilalkoholt és az izopropil alkoholt (utóbbi nem jövedéki termék, ezért nem külön adóköteles) kiterjedten használják; 50-70%-os vizes oldatuk kitűnő antiszeptikus tulajdonságokkal rendelkezik. Hatásmechanizmusuk függ az alkalmazott koncentrációtól. Az 50-95 %-os alkohololdatok oldják a sejtmembrán-lipideket, ezáltal megváltoztatják a sejt felületi feszültségét, így veszélybe kerül a sejt integritása -a sejt szétesik. A megváltozott áteresztőképességű membránon át sejtbe jutó alkohol denaturálja a fehérjéket. Az abszolút alkohol (100%-os) dehidratálja a sejtet, és így gátolja annak növekedését, viszont nem koagulálja a fehérjéket. Az alkoholok 70 %-os oldatuk formájában a leghatékonyabbak. Megölik a baktériumok és gombák vegetatív sejtjeit, de a spórákat kevésbé károsítják; a vírusok közül is sok kibírja ezt a kezelést. Nem javasolt a metanol és a benzin használata, mérgező ill. rákkeltő hatásuk miatt.
9
Aromás alkoholok közül a fenolszármazékok 1-3%-os vizes oldata (karbol) jó hagyományos szerek, de szintén rákkeltő, ezért tiltott. (Mégis pl. a Merulius lacrimans, könnyező házigomba spórái ellen szinte csak ez jó!!!). Sokáig használták keléses sérülések kezelésére is, így Flemming a penicillin előtt ezt használta orvosként. Nagy koncentrációban roncsolják a sejtfalat és a sejtmembránt, kicsapják a fehérjéket, míg alacsonyabb koncentrációban inaktiválják a sejt létfontosságú enzimrendszereit. Elpusztítják a baktériumokat, gombákat és a legtöbb vírust is, de a spórákkal szemben kevésbé hatásosak. A halogének (F , CI, 1, Br) és vegyületeik nagyon hatásos fertőtlenítő- és antiszeptikus szerek; elsősorban nem ionos formáiknak van antimikrobiális aktivitásuk. Minthogy a fluor és a bróm veszélyesebbek, mint a klór és a jód, s mert a mikroszervezetekre ugyanolyan mértékben toxikusak, mint a másik két elem, így rutinszerűen az utóbbiakat használják. Klórral már közel kétszáz éve fertőtlenítenek. Nemcsak gázalakban, hanem hipokloritok és klóraminok (NH2CI) formájában is alkalmazhatók a mikrobák leküzdésére. Hipoklórossav keletkezése mellett reakcióba lépnek a vízzel, majd a sav egy része újabb vízmolekulával reagálva hidrogénperoxiddá alakul. Mind a hipoklórossav, mind a hidrogénperoxid erős oxidálószer, mivel bomlásukkor naszcensz oxigén szabadul fel, ami képes az előforduló szabad szulfhidril-csoportokat oxidálni és a S-S kötések kialakulását megakadályozni. Ez enzimdenaturációhoz vezet, melynek következtében a sejtek metabolitikus aktivitása megszűnik. Cl2 + H20 → HCl + HClO ↔ HCl + 0• HClO + H20 → HCl + H202 ↔ H20 + 0• Egyaránt hatásosan alkalmazhatók a baktériumok és endospóráik, valamint a gombák és vírusok elpusztítására. Otthon is használjuk a HYPO-t, mely 8% NaClO és I % NaOH keveréke. A jód nem sokkal felfedezése után (1812) a gyógyászatban széles körben elterjedt fertőtlenítő- és antiszeptikus szerré vált. Kétféle készítménye ismert: a jód-tinktúra (jód 70 %os alkoholban oldva) és a különböző természetes detergensekkel képzett komplexeinek vizes oldatai. Felszívódása gyors. A klórhoz hasonlóan a szulfhidril- és a hidroxil-csoportokkal, valamint a diszulfid hidakkal reagálva szétroncsolja a fehérjéket. Baktericid, fungicid és virucid hatása mellett sporocid hatása is van. (Csak zárójelben jegyezzük meg, hogy más antimikrobiális oxidálószereket is ismerünk. Ilyen például a káliumpermanganát, vagy éppen a fent említett hidrogénperoxid is.) Az aldehidek funkciós csoportja (-CHO) erősen redukáló tulajdonságú. Közülük a formaldehidet és a glutársavat használják leggyakrabban mikrobiális kontroll céljára. A formaldehid gáz 1-3%-os vizes oldata a formalin. Az alkilezőszerek a szerves vegyületekben levő labilis hidrogéneket alkilcsoportokra cserélik ki. Fő támadási pontjaik a fehérjék és nukleinsavak amino- ( -NH2), szulfhidril- ( -SH) és karboxil- ( -COOH) csoportjai. Széles hatásspektrummal bíró antimikrobiális vegyületek.
10
A nehézfémek, mint a réz, ezüst, arany, higany, arzén, cink és ólom, különféle vegyületei jó hatásfokkal alkalmazható fertőtlenítők, de túl mérgezőek ahhoz, hogy élő szövetek kezelésére használják őket. Szerves vagy szervetlen sóik formájában kerülnek forgalomba; itt elsősorban a réz-, ezüst- és higanytartalmú készítményekre kell gondolnunk. A sejtekbe jutva a szerves vegyületek funkciós csoportjaival komplexet képeznek: főként a fehérjéket károsítják. Baktericid, fungicid és virucid hatásúak. A gyakorlatban nagy jelentőségük van a sterilizáló hatású gázoknak, hiszen ezek a hőkezelés alternatíváját jelentik. Már az ókori görögök is kihasználták a kéngőzök (a kén égésekor SO2 szabadul fel) csírátlanító hatását; otthonaikat és boroshordóikat fertőtlenítették ily módon. Sokféle antimikrobiális hatású gázt ismerünk, de a legelterjedtebbek az etilénoxid, a propilénoxid és a β-propiolakton. Az etilénoxid erős alkilezőszer; a fehérjék funkciós csoportjaival, valamint a nukleinsavakban lévő guaninnal reagál, gátolva az enzimek működését, képződését és a DNS replikációját. A propilénoxid az etilénoxidhoz hasonló hatásmechanizmus szerint roncsolja a sejteket, de kevésbé toxikus. A β-propiolakton szobahőmérsékleten folyadék és csak 155 °C-on válik gázhalmazállapotúvá. A DNS-t alkilezi. Igen mérgező, ezért felhasználása nagyon korlátozott. A detergensek, vagy felületaktív anyagok olyan szerves molekulák, melyeket egy hosszú hidrofób szénlánc és egy hidrofil "fej" alkot. A szénlánc töltése alapján beszélünk nem ionos, valamint anion- és kationaktív detergensekről. A nem ionos felületaktív anyagoknak nincs számottevő biocid hatásuk és az anionos detergensek is csak korlátozott mértékben használhatók gyenge hatékonyságuk miatt. Ebbe a csoportba tartoznak a szappanok, amelyek hosszú szénláncú karbonsavak (zsírsavak) nátrium- vagy káliumsói. A három csoport vegyületei közül a kationaktív detergensek a legjobb fertőtlenítőszerek. Közéjük tartoznak a kvaterner ammóniumsók (az ammónium ion hidrogénjeit nagy szénatomszámú alkilcsoportok helyettesítik: [NR4]+Cl-). A felületaktív anyagok hosszú szénláncukkal a sejtmembrán lipidrétegébe süllyednek, míg poláros, vízoldékony fejük a felszínen marad, melynek hatására a sejt felületi feszültsége csökken. Ez többek között a sejtmembrán szelektív permeabilitásának elvesztését eredményezi, és ennek következtében a sejttartalom akadály nélkül kiáramolhat a sejtből. A kvaterner ammóniumsók ezen kívül képesek a fehérjéket is denaturálni. Jó nedvesítő tulajdonságuk miatt főképpen tisztításra, műtétek előtti bemosakodásra használhatók. Hatásspektrumuk szűk; inkább csak bakteriosztatikus hatásuk van, de bizonyos baktériumokat el is pusztítanak. Az eddig ismertetett módszerekeket ill. azoktól eltérő módokat is alkalmazhatunk a laboratóriumi eszközök, edények sterilizálása: A fémeszközöket, (oltókacs, csipesz, szike, stb.) lánggal sterilizálhatjuk legkönnyebben. Ez a módszer azonban gyorsítja a korróziót. Helyette alkalmazható hőlég-sterilizátor is, ekkor arra kell ügyelni, hogy az eszközök az abból való kivétel után is sterilek maradjanak. Ehhez bezárhatjuk őket hőálló üvegedényekbe (pl. Petri-csészébe), vagy fémdobozba, azokkal együtt
11
sterilizálva őket. Gyakori és egyszerű megoldás, hogy az eszközöket egyenként alumínium fóliába csomagolva sterilizálják, ekkor ügyelni kell arra, hogy a gőz érhesse a teljes felületet. Az oltókacsot csak lánggal sterilizálhatjuk! Egyes mikrobiológiai munkák elvégzésénél ki kell küszöbölni a környezetbő ől történő ő őzések lehető őségét. Az ilyen munkákat oltófülkében vagy steril szobában végzik. Az fertő oltófülke üvegbő ől készült fülke, melynek belsejét sterilizálni lehet. Az oltófülke anyagai rozsdamentes acélváz és üveg homlokfal. Légterének sterilizálása UVlámpával történik a műveletekhez szükséges anyagok és eszközök behelyezése után. A munkatérben légmentesen záró, benyúló gumikesztyűvel lehet dolgozni. A légterén át enyhe túlnyomással, a bejövő nyílásnál megfelelő szűréssel levegő áramoltatható át, ill. ha a kűlső légteret óvni szükséges az esetleges fertőzésektől (pl. patogén kórokozókkal való munkánál), akkor enyhe vákuummal érhető el a megfelelő hatás. Az oltófülkékben és a steril szobákban UV-lámpával érik el a felületek és a levegő csírátlanítását. Az oltófülkék hátrányait küszöbölik ki a lamináris boxok. Ezek elülső része, a munkafelület kifelé teljesen nyitott, rajta keresztül igen gyenge túlnyomású, steril levegő áramlik keresztül folyamatosan. Az ezen légáramban örvénymentesen (laminárisan) áramló gázrészecskék különleges szűrőkön haladnak át a készülékben, amelyek közel 100%-os biztonsággal kiszűrik a baktériumokat. A szelektíven ható, kemoterápiás célokra használt készítményekkel szemben általános követelmény , hogy in vivo alkalmazásuk során mikrobicid hatásuk legyen, a gazdaszervezetet ne károsítsák, de annak szövet- és testnedvei azért ne tudják közömbösíteni. Már korábban említettük, hogy ilyen anyagok a természetben is találhatók (pl. az antibiotikumok), de mesterségesen is előállíthatók. Hatásmechanizmusuk tekintetében ezek igen eltérőek lehetnek. Ismerünk olyanokat, amelyek a fehérje-, nukleinsav-, ill. sejtfalszintézist gátolják, mások a sejtmembrán működésére hatnak, megint mások pedig létfontosságú metabolitok analógjaiként a sejt anyagcseréjét károsítják. Mivel jegyzetünkben később külön foglalkozunk az antibiotikumokkal, most csak -az áttekintés kedvéért -a következőket jegyezzük meg. A fehérjeszintézis szelektív gátlása azon a különbségen alapszik, amely egy prokarióta és egy eukarióta sejt fehérjeszintetizáló rendszerében megtalálható. A kloramfenikol, a tetraciklinek, a sztreptomicin, a kanamicin, a neomicin és az eritromicinek specifikusan kötődnek a baktériumok 70 S riboszómáihoz, míg az eukarióták 80 S riboszómáival ilyen kapcsolatot nem képesek kialakítani. A nukleinsav-szintézis tekintetében már nincsenek ilyen kiugró különbségek, így azon szereknek is jóval kevesebb a száma, melyek a prokariótákban a DNS replikációját, ill. az RNS-ek transzkripcióját specifikusan gátolják. Az aktinomicinek a DNS-szintézist zavarják, de nem elég szelektívek ahhoz (állati sejtekre is hatnak), hogy a terápiás gyakorlatban valóban használhatók legyenek. A Streptomycesek által termelt rifampicin kémiai átalakításával hozták létre a rifampint, ami a
12
baktériumok DNS dependens RNS-polimerázát gátolja, így szelektivitása révén már a gyógyászatban is alkalmazható. A baktériumoknak jellegzetes sejtfalszerkezetük van, így a sejtfalszintézist specifikusan zavaró anyagak jó kemoterápiás szereknek számítanak. A penicillin volt az első ismert antibiotikum, melyet Fleming 1929-ben fedezett fel baktérium-tenyészeteinek penészfertőzése során, ahol gátlási zónák alakultak ki a Penicillium notatum által termelt antibiotikum hatására. Ma már jó néhány , az eredetinél jobban termelő Penicillium fajt ismerünk. A penicillinek és a Cephalosporium fajok által termelt cefalosporinok a bakteriális sejtfalszintézisben résztvevő transzpeptidáz nevű enzimet gátolják, ezért a sejtfalban a peptidhidak nem alakulnak ki és a belső nyomás miatt a sejt szétesik. Bizonyos tulajdonságait, ill. összetételét tekintve a baktériumok és gombák sejtmembránja egyedülálló az élővilágban. Vannak olyan vegyületek, melyek specifikusan kötődve hozzájuk működésüket megzavarják. Példaként említhető, hogy a Gram-negatív baktériumok membránja foszfatidil-etanolinban gazdag, míg a gombákéban szerin található. Kizárólag ezen vegyületekkel reakcióba lépő anyagok, ha egyéb tulajdonságaik is megfelelőek, kemoterápiás szerként használhatók. A metabolitanalógok általában nem elég szelektívek, hiszen sok esetben olyan alapvető anyagcsereutakat (pl. sejtlégzést) zavarnak, melyek a prokariótákban és eukariótákban hasonló módon játszódnak le. Vannak azonban olyan metabolitikus folyamatok is, melyek csak bizonyos élőlényekre jellemzőek, így ezek szelektív gátlásával az adott szervezet elpusztítható. Ilyen anyagcsereút a purinok szintéziséhez nélkülözhetelen fólsav előállítása egyes mikroszervezetekben. A szintézisút egyik köztes terméke a paramino-benzoesav (PABA), melynek mesterségesen előállított strukturális analógjai a szulfonamidok (teljes kémiai nevük: paraamino-benzszulfonamidok). A két vegyület között kompetíció jön létre az enzimkötő helyekért, ahonnan a szulfonamid kiszorítja a PABA-t és így működésképtelen termékek jönnek létre -a sejt elpusztul. Minthogy az állati sejtek nem szintetizálnak fólsavat, a szulfonamidok jó hatékonysággal, kellő szelektivitással alkalmazhatók a rájuk érzékeny mikrobák okozta betegségek gyógyítására. A bakteriális eredetű fertőzések kezelésére sokféle antibiotikum közül választhatunk, hiszen mint már említettük -a prokarióták és eukarióták között meglevő strukturális és funkcionális különbségek révén számtalan szelektíven ható anyagot ismerünk. Más a helyzet a patogén gombák és parazita állatok vonatkozásában. Lévén ezek eukarióta szervezetek sejtfelépítésük és működésük az emberi, állati és növényi sejtekéhez nagyon hasonló, így azok a szerek, melyek rájuk nézve toxikusak, a többi eukarióta élőlényt is károsítják. Gombás fertőzések kezelésére használják az amfotericin B-t és a nisztatint, melyeket Streptomyces fajokból izoláltak és kémiai szerkezetük hasonló bizonyos membránlipidek szerkezetéhez, így képesek a plazmalemmába beépülni; ide sorolhatjuk a Penicilliumok által termelt griseofulvint is. Ismert protozoonok által okozott betegség a malária, melynek kezelésére évszázadokon át használták a kinint, amit a kínafa kérgéből nyertek. Ezt a természetes antimikrobiális szert napjainkra kiszorították a szintetikus kinolinok.
13
A vírusbetegségek kemoterápiás kezelése e kórokozók különleges élősködő volta miatt nehéz. A legtöbb antivirális szer leállítja a vírus szaporodását vagy úgy , hogy megakadályozza a vírus sejtbe jutását, vagy úgy, hogy blokkolja a vírusgenom átíródását és a transzlációt, vagy úgy, hogy az érési folyamatot zavarja meg. Habár ezen vírusellenes szerek az egészséges sejteket megóvják a fertőzéstől, a legtöbb esetben az extracelluláris és látens formában jelenlévő vírusokat nem károsítják. A kemoterápiás szereket szinte nap, mint nap használjuk betegségeink kezelésére, azonban a valódi célnak a betegségek megelőzését kell tekintenünk. Az immunológia és egy új tudományág, a biotechnológia rohamos fejlődése olyan eszközöket adott a kezünkbe, melyek segítségével eredményesen vehetjük fel a harcot a kórokozókkal szemben. A történeti áttekintés során megismerkedtünk az aktív és passzív immunizálással. Az aktív immunizálás célja a tartós védettség kialakítása olyan kórokozókkal szemben, melyekkel feltehetően a későbbi életünk során találkozni fogunk, míg a passzív immunizálás esetében általában a bekövetkezett fertőzést követően juttatják a szervezetbe az ellenanyagot, és ez nem ad életre szóló védettséget (pl. a kígyómérgek elleni antiszérumok is ilyenek). Az immunvédelemben résztvevő fehérvérsejtek ún. immunoglobulinokat termelnek, amelyek a fertőző ágenshez kapcsolódva semlegesítik azokat. Az immunoglobulinok képződésében szerepet játszó gének megismerését követően megkezdődtek a kísérletek egy-egy meghatározott tulajdonsággal bíró, specifikus ellenanyag színtéziséért felelős gén vagy gének átvitelére. A kezdeti próbálkozásokat baktériumokkal végezték és történtek sikeres beépítések, de a végső cél az lenne, hogy ilyen géneket háziállatokba beültetve hatékonyabb betegség-ellenállóságot alakítsanak ki. Nemcsak az állatok, de a termesztett növények esetében is szükség van nagyobb ellenálló képességű fajták nemesítésére. A hagyományos nemesítési eljárásokon kívül irányított nemesítésre is mód van a géntechnológia módszereinek felhasználásával. Betegségellenállóságot hordozó fajtákból már nemcsak keresztezés útján vihető át e tulajdonság, hanem az ellenállóságért felelős gén átültetésével is.
