A modern tömegspektrometria szerepe a mikroorganizmusok azonosításában

A modern tömegspektrometria szerepe a mikroorganizmusok azonosításában A kémiai Nobel díj és a Staphylococcus aureus

Lovász Csaba, Dr Szigeti Tamás Műszeres mikrobiológiai vizsgálatok – MALDI-TOF WESSLING DátumHungary Kft.

Bevezetés A 2002-ben a Kémiai Nobel díjat megosztva három kutató kapta:

Kurt Wüthrich NMR kutatások– a Biológiai makromolekulák térszerkezetének meghatározása

John B. Fenn ESI – Electrospray kidolgozása „A molekulák elefántjainak reptetése”

Koichi Tanaka MALDI kidolgozása – a Makromolekulák Lézer Deszorpciós Ionizációja Lovász Csaba, Dr Szigeti Tamás

Hungalimentária - 2015.04.22-23.

Tömegspektrometria Tömegspektrometria – szerkezet kutatási módszer – Elsődleges információk – a molekula mérete, a molekulatömeg – pontos tömegmérés – elemi összetétel – A vizsgálatokhoz a molekulákat gázfázisban ionizálni kell – makromolekulák esetén nem egyszerű feladat - fragmentáció

Tömegspektrometrométer (MS) – Ionforrás – gázfázisú ionok (EI, CI, ESI, MALDI ...) – Tömeg-analizátor – ionok elválasztása tömeg/töltés (Mágneses, Iontrap/Orbitrap, Quadrupole, TOF) – Detektor – a szeparált ionok detektálása (Electron multiplier, Photo multiplier, Microchanel plate ) Lovász Csaba, Dr Szigeti Tamás


MALDI-TOF tömegspektrometria A MALDI-TOF Tömegspektrometria K.Tanaka – SLD (Soft Laser Desorption) 1988 - Nagy energiájú lézer impulzusok – mátrix (glicerin, fémpor) – protonált kvázi molekulaionok [M+H]+

F. Hillenkamp – M.Karas – MALDI (Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization) 1988 - Nagy energiájú lézer impulzusok – mátrix (kis szerves molekulák) – protonált kvázi molekulaionok [M+H]+ - Fehérjék, proteinek, peptidek tömegspektrometriás vizsgálata

TOF – Time of Flight (A.E.Cameron, D.F. Eggers – An Ion Velocitron, 1948) - A felgyorsított ionok repülési idejét mérjük nano szekundum pontossággal – repülési idő vs. tömegszám

Lovász Csaba, Dr Szigeti Tamás


MALDI-TOF tömegspektrometria A „mátrix” szerepe a MALDI folyamatban A vizsgálandó molekulákat egy fényelnyelő „mátrixba” ágyazzuk be



MALDI-TOF tömegspektrometria A „mátrix” szerepe a MALDI folyamatban Lézer impulzusokkal gerjesztjük a mátrix molekulákat



MALDI-TOF tömegspektrometria A „mátrix” szerepe a MALDI folyamatban A mátrix molekulákkal együtt a vizsgálandó molekulák is gázfázisba jutnak, ionizálódnak

A „mátrix” energia-átvivőként, transzmitterként működik: az UV lézer energiáját közvetíti a vizsgálandó molekuláknak (deszorpció - protonátadás).

Mi Lovász Csaba, Dr Szigeti Tamás

Lézer energia Márix

[ Mi + H ]

+ Hungalimentária - 2015.04.22-23.

MALDI-TOF tömegspektrometria Lézer: UV lézer, 60 Hz, max. 337,1 nm Mátrix: a-Ciano-4-hidroxi-fahéjsav – HCCA – Abszorbancia maximum:332 nm Mátrix oldat:

1 mg/100 ml ACN / 5% TFA (1/1)



MALDI-TOF tömegspektrometria MALDI-TOF Tömegspektrométer



MALDI-TOF tömegspektrometria Bruker mikroFlex LT MALDI-TOF tömegspektrométer

Detektor – mikrochanel plate

UV Lézer MNL 100 Repülési cső

MALDI - Ionforrás


Optikai kábel


MALDI-TOF tömegspektrometria

MALDI-TOF tömegszám kalibráció – repülési idő vs. tömegszám Escherichia coli DH5 baktérium referencia tömegspektruma (2000 – 20.000 amu)



Mikroorganizmusok – tények, érdekességek • a mikroorganizmusok – azaz a baktériumok és a penész gombák általában szabad szemmel nem láthatóak 0,2 mm – 20 mm; • a Földön mindenhol előfordulnak – ubikviter élőlények (már találtak baktériumokat a nukleáris reaktorok hűtővízkörében is); • az emberi test sejtjeinek az aránya a bennünk/rajtunk élő mikroorganizmusokhoz képest 1:10 – 1:100; • kevesebb 0,5 %-uk ismert; • többségük teljesen ártalmatlan; • élelmiszeripar, biotechnológia

Yellowstone Nemzeti Park Grand Prismatic Spring Lovász Csaba, Dr Szigeti Tamás


Mikroorganizmusok – tények, érdekességek Yellowstone Nemzeti Park - Grand Prismatic Spring



Mikroorganizmusok osztályozása

Baktériumok – nincs sejtmagjuk (prokarióták) – méretűk 0,2 – 20 mm – gyors reprodukció (akár 20 percenként) – túlélőképesség tápanyagszegény környezetben – osztályozásuk Gram festés alapján (+ / -)

Escherichia coli Streptococcus

Vitamin előállítás A bélflóra része

Száj flóra - fogszuvasodás Lovász Csaba, Dr Szigeti Tamás


Mikroorganizmusok osztályozása

Gombák - fonalas gombák, élesztők – van sejtmagjuk (eukarióták) – méretűk 6 – 10 mm – a sejtmag tartalmazza a genetikai anyagot – egysejtű és többsejtű organizmusok – a biotechnológiában fontosak – erős sejtfal Penicillium Antibiotikum gyártás Sajt készítés

Saccharomyces cerevisiae Alkohol előállítás Kenyérsütés

Aspergillus Toxin termelés Lovász Csaba, Dr Szigeti Tamás


Mikroorganizmusok – azonosítása Miért szükséges azonosítanunk őket: Klinikai diagnosztika – humán gyógyászat; Élelmiszergyártás – higiéniai vizsgálatok, minőségi élelmiszerek előállítása; Állatgyógyászat – állategészségügy, takarmány előállítás; Tudományos kutatás – biotechnológia.

Az azonosítás módszerei: Biokémiai módszerek – a mikroorganizmusok metabolizmusa alapján enzim reakciók segítségével

Molekuláris biológiai módszerek – a mikroorganizmusok genetikai anyaga alapján, DNA, rDNA szekvenálás

MALDI Biotyper – a mikroorganizmusokban található genetikailag determinált fehérjék (elsősorban a riboszómális), illetve fehérje összetételük alapján Lovász Csaba, Dr Szigeti Tamás


MALDI Biotyper – az identifikálás alapja MALDI Biotyper – elsősorban a riboszómális fehérjék – tömegspektrum (fehérje profil)

A rendszervezérlő szoftver (flexControl) készíti a nyers tömegspektrumot Mért spektrum

Referencia spektrum

Minden mikroorganizmusnak van egy rá jellemző fehérje profilja, tömegspektruma (ujj lenyomat) Lovász Csaba, Dr Szigeti Tamás


MALDI Biotyper – az identifikálás folyamata Egyedi telepek kiválasztása

MALDI target előkészítése (direkt, extrakció)

MALDI-TOF tömegspektrum készítése

Adatfeldolgozás azonosítás


A tenyésztési körülmények – táptalaj, növekedési állapot, hőmérséklet – csak kis mértékben befolyásolják a spektrum minőségét és az azonosítás eredményét. Hungalimentária - 2015.04.22-23.

MALDI Biotyper – az identifikálás folyamata Direkt minta felvitel: -steril mintavételi eszköz, oltókacs -néhány tized milligramm biológiai anyag -közvetlenül a mintatartó-lemezre -mátrix oldat felcseppentése -szárítás

Etanolos extrakció: -steril oltókacs -néhány milligramm biológiai anyag -300 ml vízben szuszpendáltatva -900 ml etanol (vortex, centrifuga) -felülúszó leöntése, szárítás -10-20 ml 70%-os hangyasav -10-20 ml acetonitril (vortex, centrifuga) -a felülúszóból 1 ml a mintatartó-lemezre -mátrix oldat felcseppentése -szárítás Lovász Csaba, Dr Szigeti Tamás


MALDI Biotyper – az identifikálás folyamata Az előkészített mintatartó lemez (8 sor – 12 oszlop – 96 pozíció)

A mintatartó lemez behelyezése a MALDI-TOF készülékbe Lovász Csaba, Dr Szigeti Tamás


MALDI Biotyper – az identifikálás eredménye MALDI Biotyper Real Time Classification szoftver - eredmények



MALDI Biotyper – az identifikálás eredménye MALDI Biotyper Real Time Classification szoftver - eredmények

Nem megfelelő tömegspektrum

2,00 > „Score érték” > 1,70 azonosított faj (genus)


Megfelelő tömegspektrum

„Score érték” < 1,70 az azonosítás megbízhatósága nem megfelelő

„Score érték” > 2,00 azonosított mikroorganizmus


MALDI-TOF – mikrobiológiai vizsgálatok A laboratóriumban több mint 40 olyan akkreditált vizsgálatot végzünk, amelyben tenyésztéses módszereket alkalmazunk. Ezeknél a vizsgálatoknál képződik a „minta”, a különböző táptalajokon kinőtt tenyészetek: • Mikrobaszám: MSZ EN ISO 4833-1:2014 • Salmonella spp: MSZ EN ISO 6579:2006 • Staphylococcus aureus: MSZ EN ISO 6888-1:2008

• Bacillus cereus: MSZ EN ISO 7932:2005 • Clostridium perfingens: MSZ EN ISO 7937:2005 • Campylobacter spp.: MSZ EN ISO 10272-1:2006 • Listeria moncytogenes: MSZ EN ISO 11290-1:1998 • E.coli: MSZ ISO 16649-2:2005 • Enterobacteriace : MSZ ISO 21528-2:2007 • Enterococcus faecalis: DIN 10106:1991 • ….

Jelenleg ezeknél a módszereknél a megerősítő vizsgálatokkal párhuzamosan végezzük a MALDI Biotyper-rel az azonosításokat. Lovász Csaba, Dr Szigeti Tamás


MALDI-TOF – mikrobiológiai vizsgálatok Szalmonellafajok jelenlét kimutatására, meghatározására: az MSZ EN ISO 6579:2006 szabványos módszert - Élelmiszerek és takarmányok mikrobiológiája. Horizontális módszer a szalmonellafajok kimutatására (ISO 6579:2002))

és PCR alapú szalmonella kimutatási módszereket alkalmazzuk - BAX System PCR Assay for Salmonella (AFNOR Validation No.: QUA 18/03-11/02) - MicroSEQ Salmonella spp. Method (AFNOR Validation No.: ABI 29/02-09/10)



Élelmiszer/takarmány minta 25 g vagy 25 ml

1. nap

Elődúsítás, BPW, 37oC, 18 ±2 óra


1. nap


2. nap

Szelektív dúsítás, (RVS, MKTTn) 41,5°C - 37oC, 24±3 óra


1. nap


2. nap


3. nap

Tenyésztés szelektív, kromogén táptalajokon (XLD, Diasalm) 37oC, 24±3 óra

Negatív eredmény Riport (72 óra)

MALDI-TOF – mikrobiológiai vizsgálatok A Salmonella spp. pozitív megerősítő vizsgálat tenyészetei szelektív táptalajokon XLD

SHq

Tipikus morfológiájú telepek

Tipikus morfológiájú telepek


Diassalm

Hungalimentália - 2015.04.22-23.


1. nap


2. nap


3. nap


4. nap

Gyanús telepek átoltása TGE, 37oC, 24±3 óra



1. nap


2. nap


3. nap


4. nap

Gyanús telepek átoltása

5. nap

Biokémiai reakciók, szerológiai vizsgálatok

TGE, 37oC, 24±3 óra

37oC, 24±3 óra

Pozitív megerősített eredmény Riport (120 óra)



1. nap

BPW,

2. nap

37oC,

18 ±2 óra

Szelektív dúsítás, (RVS, MKTTn) 41,5°C 24±3 óra

3. nap

PCR alapú módszerek

Elődúsítás,

3 – 9 óra


Pozitív PCR eredmény

37oC,


4. nap


5. nap



37oC, 24±3 óra




1. nap

BPW,

2. nap

37oC,

18 ±2 óra


3. nap


Elődúsítás,

3 – 9 óra



37oC,



4. nap


5. nap



37oC, 24±3 óra


MALDI Biotyper MALDI-TOF (30 perc)

Pozitív/negatív megerősített eredmény Riport (72 óra)


1. nap

BPW,

2. nap

37oC,

18 ±2 óra


3. nap


Elődúsítás,

3 – 9 óra



37oC,

Tenyésztés szelektív, kromogén táptalajokon (XLD, Diasalm, SHq) 37oC, 24±3 óra

4. nap


5. nap



37oC, 24±3 óra


MagneBeads

MALDI Biotyper MALDI-TOF (30 perc)


Pozitív/negatív megerősített eredmény Riport (72 óra)

MALDI-TOF – mikrobiológiai vizsgálatok Salmonella spp. kimutatása MALDI Biotyper módszerrel, validálási eredmények - Referencia módszer MSZ EN ISO 6579:2006 - >200 szelektív táptalajról készült tenyészetek vizsgálata - ebből >150 Salmonella spp. pozitív

- Relatív pontosság (AC) = 100% - Relatív specifikusság (SP) = 100% - Relatív érzékenység (SE) = 100% - Fals pozitív arány (FA) = 0%

- Fals negatív arány (FN) = 0% - Eredmény táptalaj-független (SHq, XLD, TGE)

- Eredmény 30 perc alatt kész!!! Lovász Csaba, Dr Szigeti Tamás


MALDI-TOF – mikrobiológiai vizsgálatok MALDI Biotyper - MALDI-TOF azonosítás • Minimális minta-előkészítési igény; • Gyors és pontos analízis, nagy mintaszám (96 minta/40 perc); • Alacsony költségek; • Atípusos telepek, kísérő bióta analízis („sreen” módszer);

• Robusztus módszer – táptalaj független; • Spektrum analízis – szerotipizálás – antibiotikum rezisztencia előrejelzése; • Jelenleg 5627 species, 388 genus tartalmaz a könyvtár (fejlesztés); • 2014-ben >4000 telep azonosítás, 2015 I. negyedévben >2000 telep azonosítása. Lovász Csaba, Dr Szigeti Tamás


Köszönet nyilvánítás! -

Wessling Hungary Kft. Mikrobiológiai Laboratórium dolgozóinak;

-

Mikrobiológia értékelő részleg dolgozóinak: Borókay Zsuzsanna klasszikus mikrobiológiai részlegvezető; Pocklán Edit műszeres mikrobiológiai részleg vezető; Tóth Ildikó mikrobiológus mérnök.



Köszönöm a figyelmet! www.wessling.hu WESSLING Hungary Kft. 1047 Budapest, Fóti út 56. Tel: 06 1 872 3600 Fax: 06-1-435-0100 E-mail: [email protected]

Lovász Csaba – MALDI-TOF [email protected]

A modern tömegspektrometria szerepe a mikroorganizmusok azonosításában

Recommend Documents