A mikroorganizmusok szerepe a borászatban
Alkoholos erjedés
Almasavbontás
Borkezelések
Borbetegségek kialakulása
Az alkoholos erjedés legfontosabb hatásai
Must
Bor
.
Etanol (11%), Cukor<2g/l
cukor Anaerobiózis
élesztők
pH: 3,0 - 3,8
Almasav Borkősav
Almasav = Borkősav
Aminosav, NH4, vitaminok
A.sav, NH4, viitam. + Aromaanyagok
Az almasavbontás hatásai
Etanol (11%), Cukor<2g/l
Etanol (11%),
pH: 3,0 - 3,8 Almasav Borkősav A.sav, NH4, viitaminok + Aromaanyagok
Tejsavbaktérium
pH: 0,1 - 0,2 Borkősav = Almasav Tejsav A.sav, NH4, viitamin + Aromaanyagok
Az érlelés alatti változások
Etanol (11%), Cukor<2g/l pH: 3,0 – 4,0 Almasav, tejsav Borkősav A.sav, NH4, viitam. + + Aromaanyagok
További mikrobiológiai átalakulások Élesztők, tejsavbakt., ecetsavbakt.
Szorbinsav Szűrések Hőkezelések
Élesztőgomba (Saccharomyces cerevisiae)
A borokban jelen lévő tejsavbaktériumok Oenococcus oeni
Lactobacillus sp.
Az élesztők tápanyagszükséglete TÁPANYAG
FUNKCIÓ
HIÁNY A MUSTBAN ELŐFORDUL-E?
• Szénforrás (glükóz)
• N (NH4, aminosavak) • Lipidek telített zsírsavak telítetlen zsírsavak szterolvegyületek
energia, sejtfal, tartalék tápanyag
nem
Fehérje-szintézis
igen nem
Membránok felépítése
• Vitaminok tiamin biotin nikotinsav pantoténsav mio-inozitol
igen igen
Enzim alapanyagok lipid-anyagcsere
nem
Az élesztősejtszám zárt rendszerben
Állandósuló fázis Log élősejtszám
Sejtpusztulás fázisa Exponenciális fázis
Lag fázis
Idő
Az erjedést gátló tényezők • alkohol •SO2 • Növényvédőszer maradványok •Túl magas cukorkoncentráció • Alacsony (magas) hőmérséklet •Szorbinsav •Rövid szénláncú zsírsavak
A kénessav állapota a pH függvényében
A kénessav hatása az élesztősejtben
Tiamin-lebontás Fehérje,DNS szintézist módosítja
A szorbinsav (kálium-szorbát)
Szorbinsav (2,4 headiénsav) Legális dózis: 200 mg/l
268 mg/l káliumszorbát
A tejsavbaktériumok lebonthatják
2-eoxi-hexa-3,5 dién
Muskátliíz
A hőkezelés hatása az élesztő sejtszámra
Kezelés időtartama
D: tizedelési idő Nt: maradék sejtszám N0: kezdeti sejtszám
Élesztők, baktériumok: D érték 65 oC-on 1 perc alatt Pasztőrözés: 80-90 oC-on 10-20 másodpercig
A hőmérséklet hatása a tizedelési időre
A rövid szénláncú zsírsavak hatása az élesztőre
sejtfal plazmammembrán
Periplazmatikus tér mitokondrium
Sejtmag a kromoszómákkal plazmid Mitkokondriális DNS
Riboszómák
Endoplazmatikus retikulum
Az élesztők szaporodása
• •
Az ivaros szaporodás ritka az erjedés alatt
Ivartalan szaporodás: sarjadzás (egy vagy két sarjadzási pólus sejtenként •
Hasadással (bizonyos fajok)
A szőlőn található mikroorganizmusok
Oxidatív élesztők (Rhodotula) Penészgombák Ecetsavbaktériumok Tejsavbaktériumok
Vadélesztők (Kloeckera, Candida) Saccharomyces cerevisiae
A különböző fajok az erjedés során
Szőlő
must, erjedés eleje erjedés > 4% alk
Borok érlelése, tárolása
Sejtszám (db/cm3)
Az élesztőfajok változása az erjesztés során
Saccharomyces
Nem Saccharomyces
Erjedés napjai
Élesztőfajok FAJÉLESZTŐK Saccharomyces cerevisiae (általános fajélesztő)
• •
•
Saccharomyces bayanus (magas cukortartalmú mustokhoz) VADÉLESZTŐK Schizosaccharomyces (borhibák + almasav •
alkohol átalakítás)
Zigosaccharomyces (borhibák-kénessav és alkoholtűrő) • •
Brettanomyces (borhiba: etil-fenol képzés) Candida, Pichia, Hansenula fajok: virágélesztők
A vadélesztők alkohol- és kénessavtűrése rosszabb!
A spontán erjesztés vagy beoltás? • -
Előny Technikailag egyszerű Időnként „komplexebb” borok Sok élesztőtörzs jelenléte? Kis pincészeteknél az erjedés megakadása kisebb problémát jelent
Hátrány - Erjedési hibák gyakoribbak - Egy ismeretlen tulajdonságú -élesztő szaporodik el -erjedés megakadása
A szénhidrát anyagcsere az erjedés során
1 glükóz + 2 ADP
2 etanol + 2 CO2 + 2 ATP + 24 kcal
glükóz
piruvát
Termin. ox.
Erjedés
Etanol, CO2
Az élesztők glükóz és fruktózfogyasztása
fruktóz
glükóz
Erjedési melléktermékek képződése 1. Glicerin (4-15 g/l)
G-6-P
glükóz
A magas kénessavszint növeli a glicerin mennyiségét!!!
F-6-P F-1,6P Dihiroxi-Ac-
Glic.ald
Glicerin-3-p
glicerin
Glic. Sav Glic. Sav Glic. sav
ecetsav etanol
P-enol-piruvát Acetaldehid
Piruvát
Erjedési melléktermékek képződése 2. Ecetsav (0,3-0,8g/l) • 0,8 g/l felett kellemetlen • Az élesztőtörzstől függ a mennyisége • A jelenléte fontos a lipid-anyagcserében •Túltisztított mustokban a mennyisége növekszik • A nagyobb cukortartalmú mustok esetén növekszik a mennyisége 3. Borostyánkősav (200-300 mg/l) 4. Tejsav <100 mg/l 5. Glikogén (poliszacharid) 6. trehalóz/diszacharid
Alkoholkihozatal az erjedés során
1 glükóz
2 etanol + 2 CO2
A glükóz kb. 93 %-ból képződik etanol 1-6 g/l (átlagosan 3 g/l) a biomasszára 4-9 g/l (átlagosan 7 g/l) a glicerinképzésre 2 g/l pedig a különböző melléktermékekre fordítódik
Tényleges alkoholkihozatal: 16,8 g cukor
1 v/v% alkohol
Teljes erjedésben való cukor-adagolással a cukorkihozatal javul
A N anyagcsere •
•
•
•
Az élesztők nem tudják felhasználni a fehérjék és peptidek N tartalmát Kizárólag az aminosavak és a szabad NH4 ionok számítanak N forrásnak Az aminosavak közül a prolin nem vesz részt az élesztő metabolizmusában A N hiány a leggyakoribb oka az erjedés megakadásának
A must N-összetétele N-forrás Ásványi N
%-os arány 3-10 %
Aminosavak 25-30 % Peptidek
25-30%
Fehérjék
3-10%
Nukleinsav, vitamin, egyéb
Mikromennyiségb en
Nassz. (mg/l)
A mustok asszimilálható N-tartalma
Az erjedési idő és az asszimilálható N összefüggése
N- hiány esetén adagolható tápanyagok
• diammónium-foszfát (NH4)2HPO4 • diammónium-szulfát (NH4)2SO4 • 300 mg/l mennyiségben használható fel (63 mg/l tiszta N hatóanyag) • A legjobb az erjedés elején adagolni (50 % cukor-fogyás után hatástalan!!!) • Túl nagy mértékű adagolásával az erjedési hőmérséklet és a karbamid-képzés nő
Észterképződés és lipid-anyagcsere
Erjeszthető cukrok
piruvát acetaldehid
etanol
Acetoin diacetil α-hidroxisavak
acetolakát
Acetil-KoA
Lipidek, zsírsavak
Szulfátok szulfitek
α-ketosavak
aminosavak
Aldehidek Többértékű alkoholok
Észterek
Szterol-vegyületek
Ergoszterol (az élesztő képzi)
Szitoszterol ( mustban található)
Az erjedési hőmérséklet hatása •
10-35 oC között lehetséges
• •
Fehérborerjesztés: max 20 oC-on Vörösborerjesztés: 25-30 oC-on
•
A nagyobb hőmérsékleten gyorsabb az erjedés
•
Irányított erjesztés: legjobb a CO2 fogyás alapján irányítani
Az erjedési hőmérséklet hatása
A musttisztítás hatása az erjedésre Minél tisztább mustot erjesztünk, annál tovább tart az erjedés: •
A must lipidtartalma csökken
•
A sejtek alkoholtűrése romlik
•
A rövid szénláncú zsírsavak mennyisége nő
•
A védőkolloidok mennyisége csökken: az élesztősejtek érzékenyebbek a toxikus anyagokra
•
Az illósavak mennyisége nő
•
A kéntartalmú vegyületek mennyisége csökken
•
A vegetális ízeket adó C6 aromaanyagok mennyisége csökken
A fehérborkészítés lépései
Pektinbontó enzim
préselés
must Zavaros must
Erjedés vége Fejtés szűrés
ülepítés 18 óra-20 oC
borkezelések
Alkoholos erjesztés 16-20 oC
Az üledék kémiai összetétele
Az összetevő mennyisége • Összes cukor • Nitrogén • Hamutartalom • Pektintartalom • Lipidtartalom
Zavaros must
ülepítés 18 óra -12 oC
Az üledék gazdag: • oleinsavban (C18) • linolénsavban (C18) • palmitinsavban (C16)
Az erjedés időtartama (nap)
A musttisztítás hatása az erjedés időtartamára
Zavarosság (NTU)
Az oxigén szerepe
•
Az erjedő mustok levegőztetésével az erjedés gyorsítható
•
A levegőztetést 20-50%-os cukorfogyás esetén kell elvégezni
•
A hozzáadott N hatása is kedvezőbb O2 kezelés hatására
•
5-10 mg/l O2 eloszlatására van szükség
További tápanyag-utánpótlás • Tiamin: mindig a musthoz kell adagolni, különösen botrítiszes termés esetén • Élesztősejtfal: A rövid szénláncú zsírsavak sejtbe való behatolását akadályozza meg
Gyorsabb erjedés
Az erjedés megakadása • N, vagy lipidek hiánya • tiamin hiány •PO4 hiány •Magas hőmérséklet •Killer élesztők elszaporodása Teendők az erjedés leállása esetén: • kénezés (5g/hl) – (lizozim) • Fejtés (savnövelés) •Lehűtés •N és élesztősejtfal adagolás •Újrabeoltás más élesztővel
A cukortartalom hatása az erjedés megakadására
Elhúzódó erjedés
Problémamentes erjedés
A tápanyagutánpótlás hatása az erjedési folyamatra
Cukor g/l
Kombinált tápanyag
Kontroll
Erjedő mustminták (tápanyaggal vagy anélkül)
Szelektált fajélesztő-törzsek • Szárított formában kerülnek forgalomba • 10 g /hl beoltáskor elégséges (2 x 10 6 sejt/ml) •Speciális tulajdonságokkal bírnak • 150 különböző törzs van jelenleg forgalomban
Borhibákat okozó élesztőfajok
Brettanomyces: • Jó alkohol, közepes kéndioxid tűrés, • sok illósavat és illó fenolt termel • egéríz kialakulása • a cellobiózt is erjeszti Zygosaccharomyces: • Jól tűri a kénessavat, a szorbinsavat és az alkoholt • • • •
Candida, Pichia: Virágélesztők Aerob folyamatok Az alkoholt oxidálják acetaldehiddé, majd ecetsavvá
A tejsavbaktériumok jellemzése • Gram + baktériumok • aerotoleráns anaerób élőlények • tejsavat képeznek a glükózból • Kokkusz, vagy pálcika alakúak • Sejtek aggregációja lánc formában • Savtűrők, növekedésük optimuma az 5-6 közti pH • Aktív mozgásra képtelenek •Tejiparban és borászatban használatosak
A tejsavbaktériumok jellemzése • • • • •
• • • •
0,4-1µm mérettartomány Oenococcus, Pediococcus és Lactobacillus nemzetségek Tápanyagforrás: Hexózok, pentózok (arabinóz, ramnóz, xilóz) Poliszacharidokat is felhasznál (glükanáz aktivitás) Nitrogénforrás: legfontosabb nitogénforrásaik az aminosavak, közülük is az arginin, mely az energiatermelő folyamatokban használódik fel A kisebb méretű peptideket is fel tudják használni Az O. oeni proteáz aktivitását bizonyították Az erjedés után kialakuló N ellátottság általában elegendő számukra Vitaminforrásként tiamint, biotint, nikotinsavat és pantoténsavat használnak fel
Lactobacillus sp.
Pediococcus sp.
A glükóz homofermentatív erjesztése
glükóz
glükóz fruktóz fruktóz
dihidroxiaceton
glicerinaldehid Glicerinsav 1,3 P Glicerinsav 3 P Glicerinsav 2 P Foszfoenol-piruvát
BB B
1 glükóz
piruvát
2 tejsav + 2 ATP
A glükóz heterofermentatív erjesztése glükóz glükóz-6-P glükonát -6-P xilulóz-5-P Acetil-P Acetaldehid Etanol 1 glükóz
glicerinaldehid-3-P piruvát tejsav 1 tejsav + 1 etanol + 1 CO2 + 1 ATP
A glükóz heterofermentatív erjesztése külső elektron akceptor (fruktóz) jelenlétében
1 glükóz
1 tejsav + 1 ecetsav + 1 CO2 + 2 ATP
A különböző baktériumfajok anyagcseréje • Lactobacillus lactis: homofermentatív •További Lactobacillus fajok: homo- vagy heterofermentatívok • Leuconostoc: heterofermentatív • Oenococcus: heterofermentatív
A tejsavbaktériumok pentóz-erjesztése
Pentózok
Xilulóz -5 -P
Acetil-P
Glicerinaldehid-3-P
Acetát
Piruvát Tejsav
1 pentóz
1 tejsav + 1 ecetsav + 2 ATP
A citomsav lebontása
ecetsav citromsav
oxálecetsav piruvát
Tejsav
Acetaldehid Acetil-CoA acetolaktát
acetoin
2,3- butándiol
diacetil
Ecetsav
Az almasav átalakítása tejsavvá
Malolaktikus enzim Mn + NAD Almasav
Tejsav
szén-dioxid
A biogén aminok képződése
Hisztidin
Hisztamin
Az almasavbontás fiziko-kémiai feltételei • 2,9 pH alatt a baktérium nem életképes • 3,3 pH alatt kizárólag az O. oeni fejlődik • Alacsony pH esetén az anyagcserében a cukorfelvétel kisebb szerepet kap • Az élettevékenységük 13 v/v % alkoholtartalom felett csökken • 20 mg/l szabad -100 mg/l összes kénessavtartalom felett a baktériumok működését gátolja • Hőmérsékleti optimum: 18-25oC (magasabb hőmérsékleten az alkohol mérgező hatása növekszik) • A fenolsavak, elagitanninok gátló hatásúak • Az antocianinok és a galluszsav jelenléte fokozza az életképességüket • Bakteriofág vírusok támadhatják meg a tejsavbaktériumokat • A nagyobb SO2 termelésű élesztők zavarják a tejsavbaktériumok tevékenységét
Az almasavbontás hatásai
•Titrálható sav • Illósav • pH • almasav • tejsav
Almasavbontás előtt
Almasavbontás után
11,5 0,21 3,02 6,6 0,1
7,6 0,52 3,17 0,05 4,3
Az almasavbontás során lezajló változások sejtszám
almasav
tejsav Cukor (hexóz)
Felszaporodás Megfigyelhető almasavbomlás
Az almasavbontás folyamata
Hexózok
Etanol Tejsav Ecetsav
Almasav
Citromsav
Az almasavbontás folyamata sejtszám
tejsav almasav illósav
cukor
citromsav
Felszaporodás Megfigyelhető almasavbomlás
Az almasavbontás folyamata
Hexózok (fruktóz)
Etanol Tejsav Ecetsav
Almasav
Diacetil Citromsav
Acetoin, 2,3-Butándiol
Az almasavbontás folyamata
sejtszám
almasav diacetil Cukrok (hexózok)
citromsav
Felszaporodás Megfigyelhető almasavbomlás
A seprőntartás hatása a különbző aromaanyagok képződésére
Diacetil
diacetil
Acetoin, butándiol Acetoin
élesztők
2,3 butándiol
Alacsonyabb pH esetén nagyobb mennyiségben képződnek
A pH hatása a baktérium glükóz és almasav felhasználására
almasav
Cukorfogyás (µM/perc mg sejt)
Almasavfogyás (µM/perc mg sejt)
glükóz
A spontán almasavbomlás
pH Etanol Tápanyagok Hőmérséklet SO2
Véletlenszerű beindulás A tartályok mozgatása általában nem megoldható Borbetegségek kialakulásának kockázata
Kettős beoltás (ko-inokuláció)
Élősejt/ml
S. cerevisiae
10 nap
O. oeni
20 nap
Idő
Az almasavbontás irányítása • Lehetőleg az erjesdés után kell beindítani • SO2 szint alacsonyan tartása (20/100 alatt) • alacsony jhőmérséklet elkerülése (>20 oC) • Szükség esetén savtompítás (3,1 pH alatt, 3, 25 pH-ig) • Almasavbomlásban lévő borral is beolthatjuk a borokat (min. 10 %) • Szelektált, szárított készítmények (hőstreszzel kezelt) • A must beoltása esetén ritkán előfordul az erjedés leállása • USA: Lactobacillus fajokkal történő beoltás must állapotban
Az almasavbontás megakadályozása
•
SO2
•
Fejtés (csökken a tejsavbaktérium populáció)
•
Szűrés
•
Lizozim (200-500 mg/l)
•
Hűtés
Tejsavbaktérium- starterkultúrák alkalmazása • Oenococcus oeni szelektált törzsek •Szárított (liofilizált) formában kerülnek forgalomba •A bor pH-ján és alkoholtartalmán életképesek és szaporodnak • Közvetlen beoltásra felhasználhatók • Már forgalmaznak alacsonyabb hőmérsékleten is szaporodó törzseket is
Az almasavbontás végrehajtása • Vörösborok: kötelező (?) •Rozéborok: a bortípustól és a savösszetételtől függ •Fehérborok: általában nem szükséges Egyes fajtáknál gyakran alkalmazzák (Chardonnay- fehérbor/pezsgő) • A Schizosaccahromyces élesztővel történő almasavbontás is előfordul (almasav/etanol)
A tejsavbaktériumok okozta borbetegségek • tejsavas illósodás (maradék cukor!) • mannitos erjedés • a borkősav lebontása (ritka) • a borok nyúlósodása (sejtfal eredetű poliszacharidok- Pediococcus ) •Borok keseredése (glicerin átalakulása akroleinné) •Egéríz (a lizin lebomlásával ) •Vinil-fenolok kialakulása
A glicerin lebontása
glicerin
glicerinaldehid
1,3- propándiol
akrolein
Ecetsavbaktériumok • Gram – baktériumok • obligát aerob szervezetek • egyes fajok aktív mozgásra is képesek • nem érzékenyek a lizozimra •2 nemzetség: Acetobacter / Gluconobakter •Acetobacter: az etanol teljes oxidációja: CO2 + víz •Gluconobacter: az etanol részleges oxidációja: ecetsav • A Botrytis cinerea, az erjedés alatti oxidáció és a kisfahordó használata növeli az ecetsav mennyiségét
Az ecetsavbaktériumok tevékenysége
Etanol
Ecetsav
etil-acetát (200 mg/l felett érzékelhető)
Az ecetsavbaktériumok tulajdonságai
• O2- re van szükségük (inert gázok alkalmazása) • magas alkohol: gátlóhatás • pH: 3,0 alatt nem életképesek • Hőmérséklet: opt.: 25-30 oC • SO2: közepesen érzékenyek: 30 mg/l felett lassul az anyagcseréjük
