1.
MIKROORGANIZMUSOK MINİSÉGI MEGHATÁROZÁSA (AZONOSÍTÁS)
fejezetben a mikroorganizmusok mennyiségének Az elızı meghatározásának alapvetı módszereit mutattuk be. Ez a fejezet az egyes mikrobák identifikálásához (azonosításához) használt legfontosabb módszereket tárgyalja. A mikroorganizmusok azonosításához különféle határozók állnak rendelkezésre. A baktériumok rendszertani besorolásához világszerte a Bergey's Manual of Systematic Bacteriology címő baktériumhatározó 5 kötete a legelfogadottabb, mely kötetek második kiadása tartalmazza a jelenleg érvényben levı nomenklatúrát, és egyben a legújabb azonosítási módszereket is. A mikroorganizmusok azonosításához számtalan vizsgálat használatos. A mikrobák identifikálása során alkalmazunk morfológiai, szaporodási minimum és optimum, az anyagcsere vizsgálatát célzó biokémiai, az antigénszerkezetet elemzı szerológiai, sıt újabban genetikai teszteket is. A mikroorganizmusok azonosítására részben célirányos felhasználásuk, részben az ellenük való védekezés szempontjából van szükség. 1.1.
MORFOLÓGIAI VIZSGÁLATOK
A mikrobák morfológiai vizsgálatai között megkülönböztetünk mikromorfológiai és makromorfológiai vizsgálatokat. A mikromorfológiai vizsgálatok a sejt - vírusok esetében a virion - alaki tulajdonságainak megismerését célozzák. A baktériumok és gombák sejtjeinek mikromorfológiai vizsgálata fénymikroszkóppal - natív vagy festett preparátumok formájában - történik, mint ahogy arról már az 6. fejezetben szó volt. Az akariota mikroorganizmusok vizsgálata, valamint a pro- és eukariota sejtek ultrastruktúrális vizsgálatának eszköze az elektronmikroszkóp. A makromorfológiai vizsgálatok a mikrobák folyékony és szilárd táptalajokban létrehozott tenyészeteinek alaktani tulajdonságait célozzák. A szilárd táptalaj felületén vagy belsejében rendszerint egyetlen sejtbıl vagy telepképzı egységbıl fejlıdı sejttömeg a telep (kolónia), amelyben a sejtek száma több milliárd is lehet. A mikroorganizmusok telepeinek jól meghatározható, az adott mikroorganizmusra jellemzı morfológiai megjelenése van. A különbözı baktériumok és gombák szilárd táptalajon képzıdött telepeinek alakja, mérte, színe, szaga, szegélye különbözı. A 1
telep fontos jellemzıje a pigmenttermelés formája is (extra-, vagy intracelluláris, vízben oldódó színanyag). Folyékony táptalajokban is más-más az egyes mikrobák megjelenési formája (üledékképzıdés, felszíni hártyaképzés, diffúz zavarosodás stb.).
A) 1.
2.
3.
B) 1.
2.
a
b
c
a
b
c
1. ábra: A mikroorganizmusok néhány jellegzetes telepformája A) A baktériumok és gombák telepformái szilárd táptalajon: l. Telepek alakja felülnézetben 2. Telepek alakja oldalnézetben 3. Telepek szegélyei felülnézetben B) A baktériumtenyészetek néhány jellegzetes megjelenési formája folyékony táptalajokban: 1. Szaporodás a táptalaj belsejében; a. diffúz zavarosodás b. üledékképzıdés c. pelyhesedés 2. Szaporodás a táptalaj felszínén; a. hártyásodás b. pellikula-képzıdés (bırkésedés) c. győrős telepképzıdés
2
A telepek jellege tekintetében megkülönböztetjük az R (rough)-, az S (smooth)- és az M (mucoid)-telepeket. Az R-telepek felszíne matt, rögös vagy érdes. Az S-telepek sima felületőek, fénylık, vajszerőek. Az Mtelepekre a nyálkás felszín jellemzı. Elıfordul, hogy a tenyészet elöregedése vagy a sorozatos passzálások hatására a telepmorfológia megváltozik. A burkos Gram-pozitív baktériumok, amelyek S telepeket képeznek, mutáció révén elveszíthetik buroktermelı képességüket (és ezzel együtt általában virulenciájukát is). A buroktermelı-képességüket elvesztett baktériumok R-telepeket képeznek. A mikroorganizmusok morfológiai tulajdonságainak ismerete nagymértékben leszőkíti azoknak a biokémiai teszteknek a mennyiségét, amelyet az adott mikroba azonosítása érdekében el kell végezni, de nem szabad elfelejteni, hogy ugyanazon mikroorganizmus más táptalajon tenyésztve eltérı tulajdonságokat mutathat. 1. GYAKORLAT Cél az egyes mikrobák által képzett telepek, tenyészetek tulajdonságainak tanulmányozása. Szükséges anyagok és eszközök: steril hígítóvíz kémcsıben, oltókacs, nagyító Mikroorganizmus: Asztalonként egy-egy lemez az alábbi mikroorganizmusok tenyészetével: Bacillus subtilus E. coli E. coli és Micrococcus mix Pseudomonas aeruginosa Serratia marcescens A gyakorlat menete: A gyakorlat során a külön álló telepeket tartalmazó lemezeket vizsgáljuk meg. Az értékelendı tulajdonságok közül az elsı hatot lezárt Petricsészén keresztül értékelje szabad szemmel, illetve nagyító segítségével. Ha a lemeztetın kondenzvíz található, akkor ezt steril mintatevı pálcával lehet eltávolítani. A konzisztencia megállapításához használjon oltókacsot. Az emulgeálhatóság meghatározása érdekében szuszpendáljon el egy telepet egy kémcsınyi hígítóvízben. Vegyen le egy telepet a kaccsal, 3
tegye bele a hígítóvízbe és kenje az inokulumot a kémcsı falára közvetlenül a folyadék szintjénél. Ez biztosítja, hogy az inokulum szuszpenzió egyenletesen oldott legyen, ne egy feloldatlan baktérium tömeg ússzon a hígítóvízben. ÉRTÉKELENDİ TULAJDONSÁGOK: 1. A TELEP ALAKJA ÉS MÉRETE (milliméterpapír segítségével lemérve) 2. A TELEP SZÉLE: nagyítóval nézve 3. PIGMENT KÉPZÉS: fehér, barnássárga, piros, bordó stb. Néhány színanyag vízoldékony. Ha levesz egy kacsnyi mennyiséget a lemez felületérıl egy kémcsınyi vízbe, akkor is látszik a szín? Lehet látni a színanyagokat táptalajban is a növekvı baktériumtelep körül? 4. A TELEPEK OPÁLOSSÁGA: átlátszó (tiszta), opálos, áttetszı (majdnem tiszta, olyan mintha tejüveg néznénk át), irizáló (szivárvány színeiben játszik) 5. A TELEPEK KIEMELKEDÉSE: a telepmagasság megállapítása a lemezek oldalra fordításával történik. 6. A TELEP FELÜLETE: sima, fénylı, egyenetlen, matt, ráncos 7. KONZISZTENCIA: Vajszerő, ragadós, nyúlós (ragad a kacshoz, nehéz leszedni róla) törékeny (száraz, szétesik darabokra, mukoid (nyálkás felülető) 8. EMULGEÁLHATÓSÁG: könnyő vagy nehéz emulgeálni? Egynemő szuszpenziót képez, szemcsés szuszpenziót vagy egyáltalán nem emulgeál? 9. SZAG: van vagy hiányzik? Ha van szaga, mihez hasonlít?
4
1.2.
A KÖRNYEZETI TÉNYEZİK HATÁSÁNAK VIZSGÁLATA A MIKROORGANIZMUSOK SZAPORODÁSÁRA
A szaporodást befolyásoló tényezık ismerete az ipari mikrobiológia egyik alapvetı követelménye. A külsı környezeti tényezık hatásának ismerete lehetıvé teszi, hogy a mikrobiológiai folyamatokat számunkra kedvezı irányba befolyásoljuk. A mikroorganizmusokra ható élı és élettelen környezeti tényezık között meg kell említeni a tápanyagokat, a hımérsékletet, a sugárzást, a pH-t és a redoxpotenciált, a vízaktivitást, a különbözı gátlóanyagokat és a mikroorganizmusok közti, valamint a mikroorganizmusok és magasabb rendő szervezetek közti kölcsönhatásokat. A mikroorganizmusok tápanyagigényének vizsgálata különbözı összetételő táptalajokon történhet, amirıl egy korábbi fejezetben már szó esett. Az ionizáló és nem ionizáló sugárzások mikrobákra gyakorolt hatásával a "Sterilezés" címő fejezetben foglalkoztunk. 1.2.1. Hımérséklet, mint környezeti tényezı A mikroorganizmusok élettevékenységüket (szaporodás, anyagcsere) csak egy bizonyos hımérséklet-tartományban képesek folytatni. Az életjelenségek mindegyike bonyolult, enzimekkel katalizált biokémiai folyamatok eredményeként jön létre. Ezen enzimek mőködéséhez szükséges hımérséklet-tartományt három kitüntetett hımérséklettel jellemezhetjük (20. ábra) Hımérséklet-minimum: az a hımérséklet, amely alatt a mikroorganizmus nem képes szaporodni. (Nem azonos az anyagcsere megszőnését eredményezı hımérséklettel!) Hımérséklet-optimum: az a hımérséklet, amelyen a részfolyamatok eredıjeként maximális sebességő a szaporodás. (Az egyes anyagcsere-folyamatok, a termékképzés, a toxintermelés stb. optimuma nem feltétlenül esik egybe a szaporodás hıoptimumával!) Hımérséklet-maximum: az a hımérséklet, amely felett a mikroorganizmus nem képes szaporodni. (Nem azonos az anyagcsere megszőnését eredményezı hımérséklettel!)
növekedési ráta
Az enzimek maximális hatékonysággal mőködnek Az enzimek mőködése folyamatosan gyorsul
minimum
optimum
maximum
hımérséklet
5
A membránok gél állapotba kerülnek, a transzport folyamatok és az anyagcsere leáll
A fehérjék kicsapódnak, a membránok felszakadnak, a sejt elpusztul
2. ábra: A hımérséklet hatása a szaporodási sebességre és sejtre gyakorolt hatás következményei (Madigan et al., Fig. 6.16) A szaporodás minimum, optimum és maximum hımérsékletparaméterei nem éles határral meghúzott értékek, hanem - különösen az optimum esetében - néhány °C-nyi hımérsékletintervallumként határozhatók meg. A mikrobák igen széles hımérsékleti tartományban képesek szaporodni. A klasszikus kategorizálás szerint hımérsékletigényük alapján három csoportba sorolhatók. E szerint megkülönböztetünk psychrophil (hidegkedvelı), mesophil és thermophil (melegkedvelı) mikroorgamzmusokat. A pszichrofil csoportra jellemzı, hogy szaporodásuk hımérsékletoptimuma 15 °C alatt van. Ezt a csoportot tovább tagolva beszélhetünk pszichrotoleráns (hidegtőrı) mikrobákról, amelyek szaporodása 5 °C alatti hımérsékleten leáll, valamint kriotoleráns mikrobákról, amelyek -18 °C hımérséklet-minimumig szaporodásképesek. E hımérséklet alatt gyakorlatilag nem kell a mikroorganizmusok szaporodásával számolni. A mezofil mikrobák szaporodásának hımérséklet-optimuma 25-41 °C közé esik. Ebbe a csoportba tartozik a legtöbb patogén, valamint élelmiszer-rontó, -fertızı és -mérgezı mikroorganizmus. A termofil mikroorganizmusokra jellemzı, hogy szaporodásuk 40 °C feletti hımérsékletén éri el a maximális sebességet, 65 °C fölött pedig gyakorlatilag már nem kell mikrobaszaporodással számolni. A csoporton belül elkülönítjük az un. termotoleráns (melegtőrı) mikrobákat, amelyek szaporodásának hımérséklet-maximuma 50 °C. A mikroorganizmusok hımérsékletigényének illetve –tőrésének vizsgálata tiszta tenyészetbıl elıállított vonáskultúrák különbözı hımérsékleten, 1 héten át zajló inkubálásával történik. Az inkubálási idı eltelte után a tenyészetek szaporodásának mértéke alapján állapítjuk meg az optimális szaporodási hımérsékletet. Mivel ez a vizsgálat igen hosszadalmas, a mindennapi rutin diagnosztikában nincs helye. 1.2.2. A környezet redoxpotenciálja A szaporodási közeg redoxpotenciálja is meghatározó abból a szempontból, hogy mely mikroorganizmusok képesek elszaporodni, illetve milyen anyagcsere-folyamatok zajlanak le. Redoxpotenciál alatt értjük a közeg a normál hidrogén (H2)-elektródra vonatkoztatott potenciálját, ha a közegben az oxidált és redukált alak homogén formában van jelen. Egy rendszer redoxpotenciálja a NERST-féle egyenlettel írható le: E = E0 +
RT [ox] * ln ZF [red ]
ahol E: a közeg redoxpotenciálja (mV) E0: a közeg normálpotenciálja, vagyis a hidrogén-elektródra vonatkoztatott potenciál abban az esetben, ha a rendszert alkotó oxidált és redukált formák aktivitása megegyezik (mV) 6
R: egyetemes gázállandó (8,31 Ws/K) T: abszolút hımérséklet (K) Z: az oxidált és redukált formák közötti elektronátmenetek száma F: Faraday-állandó (9,65 x 104 As) A mV-ban mért E érték redukáló, a pozitív érték oxidáló körülményeknek felelnek meg. A mikroorganizmusok természetes környezete minden esetben összetett, soktényezıs rendszer, ezért az egységes értelmezhetıség céljából az elektródpotenciál kialakítását minden esetben az alábbi folyamatra vonatkoztatjuk: 2H+ + 2e- ↔H2 E folyamat értelmezésében tehát a rendszerben mérhetı elektródpotenciál arányos a rendszerben lévı hidrogén-gáz parciális nyomásával. Ennek alapján a redoxrendszereket egy velük azonos elektródpotenciált eredményezı - azonos pH-értékő hidrogén-elektródban lévı hidrogén-gáz nyomásának negatív tizes alapú logaritmusa, az rH-érték használható: rH=-lgPH2 Az rH-skála 0-42-ig terjed; minél nagyobb az rH-érték, a közeg annál erısebb oxidáló hatással rendelkezik. A mikroorganizmusok oxigénigényét - rH-értékben megadva - az alábbi táblázat tartalmazza: Aerob mikroorganizmusok Mikroaerofil mikroorganizmusok Anaerob mikroorganizmusok
rH > 14 7,4 < rH < 14 rH < 7,4
A redukáló hatás vizsgálatát a biokémiai vizsgálatok között végezzük.
2. GYAKORLAT
A baktériumok oxigénigényének vizsgálata tioglikolátos agarban Szükséges anyagok és eszközök: 5 db kémcsıben 10-10 ml tioglikolátos agar, 4 db steril 1 cm3-es pipetta, oltókacs, gázláng, 45-50 °C-ra állított vízfürdı. Mikroorganizmusok: Lactobacillus plantarum 3 napos tenyészete komplex táplevesben, Clostridium sporogenes 3 napos tenyészete RCM-levesben, Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae és Bacillus subtilis 3 napos tenyészetei TGE-táplevesben. A gyakorlat menete: Olvasszuk föl és hőtsük vissza 45 °C.on a tioglikolátos agart tartalmazó kémcsöveket. Oltsuk be mindegyik kémcsövet egy mikrobaszuszpenzió 0,2 ml-ével., majd alaposan keverjük össze az inokulumot az agar táptalajjal. Írjuk a kémcsövekre a mikroba nevét! 7
Eredmények és értékelésük: Egy hét múlva vizsgáljuk meg a tenyészeteket. Ahol szaporodás történt a keletkezett gázok a tioglikolátos agart megrepesztik, szétnyomják (23. ábra). Állapítsuk meg, melyik mikroorganizmus aerob, fakultatív anaerob, aerotoleráns-anaerob (mikroaerofil), obligát anaerob.
3. ábra: Levegıigény szerint fejlıdı mikrobák tioglikolátos magas agarban. A= aerob, B= anaerob C=fakultatív anaerob, D=aerotoleráns-anaerob (mikroaerofil) 1.2.3. A pH hatása a mikroorganizmusok szaporodására A mikroorganizmusok pH-igénye illetve -tőrése - akárcsak a hımérsékletigénye - három paraméterrel - a minimális, az optimális és a maximális pH-értékkel -jellemezhetı. A mikroorganizmusok általában 3-11 pH-tartományban képesek szaporodni, de a többség pHoptimuma a semleges érték körül mozog. A legszélesebb pH-intervallumban (1,5-11) a penészgombák képesek szaporodni, de az élesztık pH-spektruma is igen széles (2,5-8,5). A baktériumok közül egyesek képesek savas kémhatású közegben is szaporodni, mint pl. a Staphylococcusok és a Lactobacillusok. Az emberi kolera kórokozója - a Vibrio cholerae ugyanakkor bázikus környezetben éri el szaporodási sebességének maximumát. A pH változásának hatása nem közvetlenül érvényesül a sejten belül, hiszen a belsı pH a külsı környezet pH-jának tág határok közötti változása esetén is viszonylag állandó. A hatás a transzport folyamatok sebességének, irányának, egyensúlyának megváltoztatásán keresztül érvényesül. A minimum- és a maximum pH-értékek alatti, illetve fölötti értékeken a szaporodás leáll, majd csírapusztulás következik be. Ennek alapján alkalmazzák a savanyítást élelmiszerek, takarmányok (silózás) tartósítására. 1.2.4. A vízaktivitás és az ozmotikus nyomás hatása a mikroorganizmusok szaporodására. A mikroorganizmusok számára a víz nemcsak a belsı környezet egyik legfontosabb összetevıje, hanem feltétlenül szükséges környezeti tényezı is. A belsı és a külsı víztér közti 8
egyensúly fenntartását a sejtmembrán aktív és passzív transzportfolyamatok révén biztosítja. Lényeges szempont, hogy a mikroorganizmusok csak a kémiailag szabad vizet tudják hasznosítani, a vegyületekben kötöttet nem. Mikrobiológiai szempontból a környezetben jelenlévı szabad vízmennyiségének, fizikai állapotának és a mikrobákra gyakorolt hatásának jellemzésére három fogalmat használunk: • vízaktivitás (av) • egyensúlyi relatív páratartalom (ERP) • ozmózisnyomás (Pa) A vízaktivitás a víz felvehetıségének, „hozzáférhetıségének” mértéke. A vízaktivitás értéke 0 és 1 közötti érték. Az oldott anyagot nem tartalmazó tiszta víz vízaktivitása 1. Az oldatok av értéke 1-nél kisebb. A vízaktivitás a közegben lévı vizes oldat gıztenziójának és a tiszta oldószer (víz) gıztenziójának a hányadosa adott hımérsékleten: P av = k Pv ahol, av: vízaktivitás adott hımérsékleten Pk: a közegben lévı vizes oldat gıztenziója Pv: a víz gıztenziója A mikroorganizmusok szaporodásához szükséges vízaktivitás-értékeket az 5. táblázat tartalmazza. 1. táblázat: A mikroorganizmusok szaporodásának minimális vízigénye Mikroorganizmusok av érték Szaporodás Romlást okozó 0,91 alatt nem szaporodnak baktériumok általában Gram-negatív pálcák 0,95 alatt nem szaporodnak Gram pozitív baktériumok 0,88 alatt nem szaporodnak Kiv. a St. aureus, mely 0,86 értékig szaporodik, de enterotoxint csak 0,92 értékig termel Élesztıgombák általában 0,80 alatt nem szaporodnak Penészgombák 0,7-0,65 alatt nem szaporodnak Enzimek aktivitása 0,85 alatt gátlódik a lipázé 0,30 alatt szőnik meg Semmilyen 0,57-0,50 alatt nem szaporodik mikroorganizmus Zárt rendszerek esetében elmondható, hogy a légtér és a mikroorganizmus természetes környezete (élelmiszer, talaj stb.) között a víztartalom tekintetében egyensúly áll be. Adott hımérsékleten a légtérnek azt a relatív páratartalmát, amely mellett a közeg víztartalma már nem változik, egyensúlyi relatív páratartalomnak (ERP) nevezzük. Az egyensúlyi relatív páratartalom és a vízaktivitás között az alábbi egyenlettel kifejezhetı összefüggés áll fenn: av×100=EPR Az ozmózisnyomás (): ha a mikroba sejtmembránjának két oldalán az oldatok töménysége különbözik, akkor a membránra ható nyomás is különbözı lehet. Nagysága függ az oldott
9
anyag koncentrációjától és kémiai minıségétıl. Az ozmózisnyomás és a vízaktivitás értékek egymással ellentétesen változnak. Ha két oldat azonos koncentrációjú, így azonos ozmózisnyomású, izotóniás. Ha nem azonos ozmózisnyomásúak, a töményebb hipertóniás, a hígabb hipotóniás. A 24. ábrán izotóniás, hipotóniás és hipertóniás oldatba tett sejtet ábrázoltunk.
4. ábra: Az a.: izotóniás, b.: hipotóniás és c.: hipertóniás oldatba tett sejt a.: változatlan marad, b.: megduzzad, c.: összetöpörödik. A mikroorganizmusok vízaktivitás igényük alapján a 6. táblázatban szereplı négy csoportba sorolhatók (Bíró, 1994). 2. táblázat: A mikroorganizmusok csoportosítása vízaktivitás igényük alapján Csoportok Hidrophil (vízkedvelı) Xerotolerans (szárazságtőrı) Xerofil (szárazságkedvelı) Ozmofil
av-érték 1-0,95 0,95-0,9 0,9-0,85 0,85-0,57
Élelmiszeripari szempontból a vízaktivitás csökkentésének igen nagy a jelentısége, mivel a nagy víztartalmú élelmiszerek kedveznek a mikrobák elszaporodásának. Az av, ERP és az ozmózisnyomás határértékeinek ismeretében módunkban áll ezen tényezıket a tartósítóipari termékeknél úgy szabályoznunk, hogy azokat a mikrobák számára szuboptimális szinten tartva meggátolják a termékek mikrobiális romlását A vízaktivitás csökkenthetı szárítással, bepárlással vagy a vizet kémiailag megkötı, ozmotikusan aktív anyagok, mint pl. sók, cukrok, vagy zsírok közegbe juttatásával. A mikroorganizmusok vízaktivitás-igénye igen jól jellemezhetı cukortőrésükkel is. Másként kell megítélnünk az oldott sók hatását. Ismeretes, hogy a tenyésztéshez készített tápközegekbe különbözı sókat szoktunk mérni. A mikroorganizmusok szaporodásához tehát szükségesek. Amíg a cukroknál a kisebb molekulasúlyúak a gátlóbbak, a sók a növekedı vegyértékkel és molekulasúllyal toxikusabbak. Általában a mikroorganizmusok zöme a sótartalmat lényegesen kisebb koncentrációban viseli el, mint az oldott szerves vegyületeket. A patogén mikroorganizmusok többsége 1-2% nátrium-klorid koncentráció mellett szaporodik optimálisan. Azokat a mikroorganizmusokat, amelyek még 7,5% sókoncentráció
10
mellett is képesek szaporodni, halotolerans mikróbáknak nevezzük. Ebbe a csoportba tartozik pl. a Staphylococcus aureus és a Bacillus cereus. A 15% sótartalom felett is szaporodni képes mikroorganizmusokat halofileknek nevezzük. Ezek közül élelmiszerhigiéniai tekintetben kiemelkedı jelentıségő a Vibrio parahaemoliticus, amely fıként nyers, sózott tengeri állatok fogyasztása révén okoz ételmérgezést. Amellett, hogy az ozmotikusan aktív anyagok a vízaktivitás csökkentésén keresztül gátolják a mikroorganizmusok szaporodását, meg kell említeni, hogy némelyeknek specifikus gátló hatása is van. Így pl. a húsok pácolásához alkalmazott nitrát-sók - egyéb hatásaik mellett specifikusan gátolják a Cl. botulinum spórák kicsírázását. 3. GYAKORLAT (Bemutató)
Szükséges anyagok és eszközök: 2,5; 5; 7,5; 10 és 15% NaCl-tartalmú, valamint sómentes TGY- (triptóz-glükóz élesztıkivonat) - levestáptalaj, oltókacs Mikroorganizmusok: Staphylococcus aureus és Escherichia coli ferdeagaros tenyészete A gyakorlat végrehajtása: A Staphylococcus aureus és Escherichia coli törzsekkel beoltunk egy-egy sorozat, különbözı sókoncentrációjú levestáptalajt. 24 órán át tartó 37 °C-os inkubálást követıen a zavarosodás alapján elbíráljuk, hogy a csövekben történt-e baktériumszaporodás. Értékelés: 1.2.5. Gátlóanyagok hatása a mikroorganizmusok szaporodására Gátlóanyagoknak nevezzük mindazon vegyületeket, amelyek a mikroorganizmusok szaporodását gátolják. Hatás szempontjából ezen belül megkülönböztetünk sztatikus és cid hatású anyagokat. A sztatikus hatás csak a mikroorganizmusok szaporodásának gátlását jelenti, cid hatás alatt a mikrobák elpusztítását értjük. Gyakran egy anyagra nem lehet egyértelmően azt mondani, hogy sztatikus, vagy cid hatású, mivel ezt az anyagi minıségen kívül befolyásolja a koncentráció, a hımérséklet, a pH és a behatás ideje is. A baktericid, fungicid, sporocid, illetve viricid hatású vegyület elpusztítja a baktériumokat, gombákat, spórákat illetve vírusokat. Az az anyag, amely valamennyi mikroorganizmust, a gombák szaporítóképleteit és a bakteriális endospórákat egyaránt el tudja pusztítani, germicid hatású. Vannak fertıtlenítıszerek, amelyek kisebb koncentrációban csupán bakterio-, vagy fungisztatikus hatást fejtenek ki, magasabb koncentrációban viszont hatásuk cid jellegő. A gátlóanyagok lehetnek szervetlen (abiogén) vagy szerves (biogén) vegyületek. Biogén eredető szerves anyagok a fitoncidok, amelyeket magasabb rendő növények termelnek (pl. vöröshagyma, fokhagyma, kapor stb.), az állati eredető epesavas sók, vagy a természetes antibiotikumok. A gátlóanyagokat felhasználás szempontjából is csoportosíthatjuk, bár ez a csoportosítás - az alkalmazás szerteágazósága miatt - nem túl gyakorlatias. Gátlóanyagokat használunk pl. tartósítószerként, fertıtlenítıszerként, vagy gyógyászati célból, valamint a mikroorganizmusok szelektív tenyésztésekor.
11
A tartósítószerek hatékonysága több tényezıtıl függ, ilyenek: koncentráció, hımérséklet, hidrogénion koncentráció, tápanyag összetétel, mikroba faja, száma stb. Hatás szempontjából külön nagy jelentıségő a közeg pH-ja, amely az alkalmazott tartósítószer disszociációs viszonyait befolyásolja. A szerves savak, mint tartósítószerek (hangyasav, benzoesav, szorbinsav), valamint a kénessav a hatásukat disszociálatlan sav formájában fejtik ki. Kis pH tartományokban a disszociáció foka kisebb, tehát a tartósítószer hatékonysága nagyobb. 3. táblázat: Néhány tartósítószer disszociációja a közeg pH-jának függvényében (25 °C) Tartósítószer
3,0
Hangyasav Benzoesav Szorbinsav
85,0 94,0 98,0
pH 4,0 5,0 Disszociálatlan sav (%) 36,0 5,0 61,0 13,0 86,0 37,0
7,0 0,06 0,15 0,60
1.2.5.1 A gátlóanyag-érzékenységi vizsgálatok kivitelezési módszerei A gátlóanyag-érzékenység vizsgálatok hígításos és diffúziós módszerekkel történhetnek. A sorozathígításos módszer esetében a vizsgálatot folyékony tápközegben végezzük. A vizsgálandó vegyületbıl a megfelelı összetételő táptalajban feloldva kívánt koncentrációjú törzsoldatot készítünk. Ezután a törzsoldatból felezı hígítási sort készítünk, ez azt jelenti, hogy a sorozat minden tagja az elızı tagnak fele mennyiségő gátlóanyagot tartalmaz. Ezt a következıképpen érhetjük el: a törzsoldatból kiveszünk 5 ml-t és a következı, 5 ml táptalajt tartalmazó kémcsıbe mérjük, alaposan összekeverjük, és 5 ml-t átviszünk a következı, 5 ml-t táptalajt tartalmazó kémcsıbe, ezt addig ismételjük, amíg a kívánt hígítási fokot el nem érjük. Fontos, hogy az utolsó kémcsıbıl az összekeverés után kivegyünk 5 ml folyadékot, amit egy győjtı edénybe engedünk, „eldobunk”. Ezzel elérjük, hogy minden kémcsıben 5 ml, egyre csökkenı koncentrációjú gátlóanyag oldat van (pl. 256, 128, 64, 32, 16, 8, 4, 2, 1 mg/l). Ügyeljünk arra, hogy a hígítás minden lépését mindig új pipettával végezzük. Ezután minden kémcsıbe azonos mennyiséget (pl. 0,1 ml) mérünk a vizsgálni kívánt mikroorganizmus ismert sejtkoncentrációjú tenyészetébıl. (A tenyészet összes baktériumszámát számlálókamrával meghatározzuk, és a sejtkoncentrációt úgy állítjuk be, hogy a tesztcsövekben - baktériumok esetében - 1x105 kiindulási sejtszámot kapjunk, figyelembe véve a leoltáskori hígulást. Ez a példánk esetében, ahol 5 ml táptalajhoz 0,1 ml baktérium szuszpenziót adunk 5x106 sejt/ml). A kémcsöveket megfelelı hımérsékleten 24-48 óráig inkubáljuk. Mindig alkalmazzunk gátlóanyagot nem tartalmazó kontroll csöveket is, a mikrobák szaporodásának ellenırzésére. Az inkubálás után megvizsgáljuk a csöveket, ha a tápközeg zavarosságát észleljük, az azt jelenti, hogy abban a kémcsıben a mikrobák szaporodásra voltak képesek, a vizsgált szer abban a koncentrációban nem volt képes gátolni növekedésüket. Az a legnagyobb hígítási fokú (legkisebb gátlóanyag-koncentrációjú) csı, amelyben még tiszta, átlátszó tápfolyadékot találunk adja meg a vizsgált vegyületnek azt a legkisebb koncentrációját, amely gátolja a teszt mikroorganizmus szaporodását, ezt az értéket MIC értéknek (minimális gátló koncentráció) nevezzük. Ha átoltást végzünk gátlóanyag mentes tápközegbe a szaporodást nem mutató kémcsövekbıl, akkor meghatározhatjuk a azt a koncentrációt, amely a baktériumokat el is öli. (minimális baktericid koncentráció, MBC) (x. ábra).
12
Szaporodás
Nincs szaporodás
Átoltás gátlóanyagmentes tápközegbe a sorozathígítás MIC koncentrációja feletti csövekbıl
5. ábra: MIC és MBC értékek meghatározása a gátlóanyag-érzékenységi vizsgálatok segítségével A folyékony táptalaj tehát csak olyan vegyületek vizsgálatára alkalmas, melyek abban feloldhatóak, nem változtatják meg a közeg átlátszóságát, a vízben rosszul oldódó vegyületeket agar hígításos módszerrel tanulmányozhatjuk. Az agar-diffúziós módszer onnan kapta a nevét, hogy a vizsgálandó vegyületek az agar lemezben diffundálni képesek és hatékonyságuktól függı mértékben váltják ki a teszt mikroorganizmusok szaporodás-gátlási zónáját. A gátlási zóna nagysága függ a vegyület diffúziós sebességétıl, koncentrációjától, a mikroba érzékenységétıl. Az eljárás lényege: az elıre elkészített táptalajba külsı hordozóanyag segítségével (pl. korong, tabletta), vagy a nélkül (lyuktesztnél egyszerően vizes oldatban) diffúzióval juttatjuk be a hatóanyagot. A két legelterjedtebb metodika: a korong- és a lyukmódszer. A korongmódszer esetében a tesztmikrobával beoltott agarlemez felületére helyezik az ismert koncentrációjú vegyülettel átitatott papírkorongokat. Majd meghatározott ideig (általában 2448 óráig) inkubálják. A gátlóanyag a táptalajba diffundál, és gátlási zónát hoz létre, amennyiben a mikroorganizmus érzékeny az adott szerre. A gátlási zóna átmérıjének mérésével következtethetünk a vizsgált anyag hatékonyságára. A lyukteszt módszer lényege, hogy a vizsgálandó mikroorganizmust tápagar lemezbe vagy annak felületére szélesztjük és dugófúrócsıvel, steril körülmények között (10 mm átmérıjő) lyukakat vágunk a lemezbe. A lyukakba a vizsgálandó anyag vizes oldatából készített hígítási sorából azonos mennyiségeket viszünk. ((0,2 ml). Ezt követıen a Petri-csészéket 10 °C-os hőtıszekrénybe tesszük és 10 órán át ott tartjuk. Ezután 28 °C-os termosztátba visszük és 1-2 napos inkubáció után megmérjük a lyukak körül kialakuló gátló vagy serkentı zónák átmérıjét, amibıl következtethetünk a gátlóanyag toxikusságára.
13
4. GYAKORLAT
A fitoncidok hatásának vizsgálata lyukteszttel (A fitoncidok olyan - gyakran illó, a baktériumokra kis koncentrációban is mérgezı vegyületek, melyeket magasabb rendő növények termelnek.) Szükséges anyagok és eszközök: Tesztagar pH 7,2, agarfúró, lándzsa, fokhagyma-szuszpenzió, cseppentı Mikroorganizmusok: Staphylococcus aureus és Escherichia coli tenyészetekbıl készített szuszpenzió A gyakorlat menete: A baktérium-szuszpenziókból néhány cseppet Petri-csészébe pipettázunk, majd a felolvasztott tesztagarral lemezeket öntünk. A lemezek megszilárdulása után a lelángolt agarfúróval a lemezekbe 2-2 lyukat fúrunk. A kiszúrt agarkorongokat lelángolt lándzsával távolítjuk el a lemezbıl. Az egyik lyukba steril hígítóvizet, a másikba pedig fokhagyma-szuszpenziót cseppentünk. 37 °C-on 48 órán át tartó inkubálás után megvizsgáljuk a baktériumnövekedést a lyukak körül. Értékelés: 5. GYAKORLAT A festékek bakteriosztatikus hatásának vizsgálata. Számos festékanyag; így pl. a trifenilmetán típusú festékek viszonylag nagy hígításban is gátolják a baktériumok szaporodását. Szükséges anyagok és eszközök: Tesztagar pH 7,2, agarfúró, lándzsa, 0,1 és 0,01 %-os kristályibolya-oldat, cseppentı Mikroorganizmusok: Staphylococcus aureus és Escherichia coli tenyészetekbıl készített szuszpenzió A gyakorlat menete: A baktérium-szuszpenziókból néhány cseppet Petri-csészébe pipettázunk, majd a felolvasztott tesztagarral lemezeket öntünk. A lemezek megszilárdulása után a lelángolt agarfúróval a lemezekbe 3-3 lyukat fúrunk. A kiszúrt agarkorongokat lelángolt lándzsával távolítjuk el a lemezbıl. Az egyik lyukba steril hígítóvizet, a másik kettıbe pedig a különbözı koncentrációjú kristályibolya-oldatokat cseppentjük. 37 °C-on 48 órán át tartó inkubálás után megvizsgáljuk a baktériumnövekedést a lyukak körül. Értékelés:
14
1.2.5.2 A fertıtlenítıszerek antifugális hatása A fertıtlenítıszerek olyan vegyületek, amelyek a mikroorganizmusokat a szervezeten kívül teszik ártalmatlanná. Annak alapján, hogy a kórokozót csupán fejlıdésében gátolják, vagy el is pusztítják, antiszeptikus, vagy dezinficiáló hatásról beszélünk. E két tulajdonság tekintetében a fertıtlenítıszerek között éles határt vonni azonban nem lehet, minthogy a fertıtlenítıszerek mikrobákra gyakorolt hatása több tényezı függvénye. A fertıtlenítıszerként használt kémiai vegyületek hatása a vegyülettıl és a mikroorganizmustól függıen változó. Az egyes mikroorganizmusok érzékenysége különbözı a használt fertıtlenítıszerrel szemben. A fertıtlenítıszerek egyetemes sejtmérgek, amelyek hatása az alkalmazott koncentrációtól is függ. A vegetatív sejtek viszonylag érzékenyebbek a szaporítósejteknél és a bakteriális endospóráknal. A fertıtlenítıszerek általános felosztása a mikroorganizmusokra gyakorolt hatásuk alapján történik: A bakterio- illetve fungisztatikus hatású fertıtlenítıszer nem öli meg a baktériumokat illetve gombákat, de gátolja azok szaporodását. A fertıtlenítıszer közömbösítése vagy a kritikus koncentrációértéknél kisebb koncentrációra hígulás után a mikroorganizmusok tovább növekednek és szaporodnak. A kémiai úton ható fertıtlenítık hatásmechanizmusa nem egységes, sok esetben nem is tisztázott. A fertıtlenítı hatás lényege a baktériumok, vírusok, gombák életfeltételeit jelentı hımérsékleti, pH-, ion- és ozmotikus viszonyoknak a mikrobákra nézve hátrányos megváltoztatása. A fertıtlenítı kemikáliák antimikróbás hatásukat a mikroorganizmus testének (membrán, sejtfal stb.) vagy enzimrendszerének károsítása útján érik el. A hatás esetenként többirányú is lehet. A hatékonyság szempontjából lényeges kérdés, hogy a létrehozott elváltozások reverzibilis vagy irreverzibilis jellegőek-e. A fertıtlenítıszerként használt anyagoktól elvárjuk, hogy csíraölı hatásuk széles spektrumú legyen, vízben vagy alkoholban oldhatók, kellıen stabilak, kellemes illatúak, vagy legalább szagtalanok legyenek. Az emberi és állati szervezetre ne vagy csak kevéssé legyenek toxikusak, szövetkárosítóak, allergizáló hatásúak, teratogén és mutagén tulajdonságokkal ne rendelkezzenek. Alkalmazásuk ne okozzon környezetszennyezést, a fém-, textil- és egyéb anyagokat ne károsítsák, szennyezı anyagok hatásukat lehetıleg ne csökkentsék, gazdaságosak legyenek. A fertıtlenítıszerek hatékonyságát befolyásoló fıbb tényezık a következık: • a fertıtlenítendı felület, eszköz vagy tárgy anyagi minısége • a fertıtlenítıszer koncentrációja • a behatási idı • a fertıtlenítıszer valamint a fertıtlenítendı anyag hımérséklete • a fertıtlenítıszer kémhatása • a fertıtlenítendı anyag szerves anyagokkal való szennyezettsége • a mikroorganizmusok csíraszáma és ellenállóképessége.
6. GYAKORLAT A fertıtlenítıszer antifugális hatásának vizsgálata lyukteszttel Szükséges anyagok és eszközök:
15
Malátaagar, agarfúró, lándzsa, Hypo, Neomagnol és Dürr fertıtlenítıszer 2 %-os oldata, cseppentı Mikroorganizmusok: Fusarium oxysporum konídium-szuszpenzója A gyakorlat menete: A konídium-szuszpenzióból néhány cseppet Petri-csészébe pipettázunk, majd a felolvasztott maláta-agarral lemezt öntünk. A lemezek megszilárdulása után a lelángolt agarfúróval a lemezekbe 4-4 lyukat fúrunk. A kiszúrt agarkorongokat lelángolt lándzsával távolítjuk el a lemezbıl. Az egyik lyukba steril hígítóvizet, a másik háromba pedig különbözı fertıtlenítıoldatokat cseppentünk. Szobahımérsékleten történı 72 órán át tartó inkubálás után megvizsgáljuk a gombanövekedést a lyukak körül. Értékelés: 7. GYAKORLAT Fertıtlenítıszerek mikrobiológiai hatásosságának meghatározása Szükséges eszközök: Fertıtlenítıszer: 1% és 2%-os Na-hipoklorit-oldat Kontroll oldat: 0,9%-os NaCl-oldat Táptalaj: TSB levesek, TSA lemezek pipetta, vortex, oltókacs, vízfürdı Mikroorganizmusok: Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus subtilis A tesztbaktériumok tenyészeteibıl 10 cm3 TSB-t tartalmazó csövekbe oltunk, majd a tápleveseket 37 °C hımérséklető termosztátba 18-24 óráig inkubáljuk. A gyakorlat menete: A fertıtlenítıszer-koncentrátumból a laboratóriumban elkészített oldat, illetve a kontroll oldat 9-9 cm3-nyi mennyiségeit steril kémcsövekbe mérjük, majd a kémcsöveket 20 0C hımérséklető vízfürdıbe helyezzük. Ezt követıen a már elızetesen elıállított 18-24 órás tesztbaktériumok szuszpenzióiból steril pipettával 0,1 - 0,1 cm3-t mérünk egy-egy kémcsıbe. Az így elkészített fertıtlenítıszer-baktériumszuszpenzió keverékét összekeverjük. A baktériumszuszpenzió hozzáadása pillanatában stopperórát indítunk, majd az elıre meghatározott idı elteltével (1, 5, 15, 30, 45 és 60 perc) steril kaccsal a fertıtlenítıszerbaktériumszuszpenzió elegyébıl kioltásokat végzünk TSA táptalajra. Értékelés: CsıVizsgált Inokulált mikroba 1’ 5’ 1 3 4 60 szám anyag 5’ 0’ 5’ ’ 1. 1%-os hypo Staphylococcus aureus 2. 1%-os hypo Ps. aeruginosa 3. 1%-os hypo Bacillus subtilis Staphylococcus 4. 2%-os hypo aureus 16
5. 6. 7. 8. 9.
2%-os hypo 2%-os hypo 0,9%-os NaCl 0,9%-os NaCl 0,9%-os NaCl
Ps. aeruginosa Bacillus subtilis Staphylococcus aureus Ps. aeruginosa Bacillus subtilis
Jelmagyarázat: + mikroorganizmusok növekedése észlelhetı; - mikroorganizmusok növekedése nem észlelhetı 1.2.5.3 A mikroorganizmusok antibiotikum-érzékenységének kimutatása Egyes mikroszervezetek élettevékenységük során számos olyan anyagot termelnek (anyagcsere végtermék, vagy köztestermék), amelyek más mikroorganizmusra mint specifikus anyagcsere-inhibitorok hatnak. Ezek az antibiotikumok. Sztatikus vagy cid hatásuk révén az antibiotikumot termelı mikrobák, mintegy kiszelektálják a környezetében lévı az adott antibiotikumra érzékeny más mikrobafajokat, törzseket, azoknak antagonistáivá válnak. Az antibiotikumok többsége emberre, állatra is toxikusak, azonban ezek között a vegyületek között több olyan is van, melyet az ember a különbözı betegségek gyógyításában, a fertızések leküzdésében fel tud használni. Az antibiotikum- vegyületeket különféle toxikológiai és mutagenitási vizsgálatoknak vetik alá, melyeket többféle emlısállaton is elvégeznek, mielıtt az emberi kipróbálásra kerülnek. Majd többfázisú humán klinikai vizsgálatok után lehet belılük gyógyszer, amennyiben bebizonyosodik, hogy a mikrobák elleni hatékonyak az emberi szervezetben is, illetve az emberre nézve biztonságosan, súlyos mellékhatások nélkül alkalmazhatóak. Vannak olyan baktériumok, amelyek az eddig ismert antibiotikumokra (illetve azok egy részére) érzékenyek (szenzitívek), azaz hatásukra elpusztulnak. Vannak azonban olyanok is, amelyek ezekre az anyagokra kevésbé érzékenyek (rezisztensek). Az antibiotikumok rendszeres adagolása olyan szelekciós nyomást jelent, ami a rezisztencia elterjedésének mértékét növeli (Az indokolatlan antibiotikum-használat ezért kerülendı.) Az új antibiotikum-termelı fajok, törzsek tesztelése, a termelt metabolitok szőrıvizsgálata („screenelése”) folyamatosan zajlik, hogy egyre újabb hatóanyagokkal tudjuk leküzdeni a gyógyszerekkel szemben folyamatosan kialakuló antibiotikum-rezisztenciát. Az antibiotikum rezisztencia meglehetısen széles körő kialakulása sok esetben szükségessé teszi a baktériumok antibiotikum érzékenységének vizsgálatát, a hatékony vegyület kiválasztását. A megbetegedést okozó baktériumtörzs antibiotikum-érzékenységi vizsgálatának eredménye célzott antibiotikum-terápiát tesz lehetıvé mind az állategészségügy, mind a humán egészségügy területén. A kórokozó-orientált antibiotikumterápia mindig sokkal olcsóbb, mint az empirikus, így ezek a vizsgálatok hozzájárulnak a gyógykezelés költséghatékonyságának növeléséhez. Továbbá csökkenthetı az antibiotikum terhelés, amivel elkerülhetı az újabb rezisztens törzsek megjelenése. Bizonyos - antibiotikumokra fokozottan érzékeny - törzseket (pl. Geobacillus stearothermophilus subsp. calidolactis) felhasználjuk az antibiotikumok élelmiszerekbıl történı kimutatására. A mikroorganizmusok antibiotikum-érzékenységének gyors kimutatására a legelterjedtebben alkalmazott módszer az agardiffúziós korongteszt. Ennek lényege, hogy logaritmikus szaporodási fázisban lévı tiszta levestenyészetbıl lemezöntéssel szilárd tenyészetet készítünk, 17
majd a lemez felszínére különbözı antibiotikumokkal átitatott papírkorongokat helyezünk. A lemezeket megfelelı hıfokon adott ideig inkubáljuk. Ezalatt az antibiotikum radiálisan az agarba diffundál, és így a papírkorong körül - amennyiben az adott mikroorganizmus érzékeny az alkalmazott antibiotikumra - gátlási zóna alakul ki. Adott antibiotikumra vonatkoztatva a mikroba érzékenysége arányos a gátlási zóna átmérıjével. A humán és állategészségügyben rutinszerően, szabványok szerint alkalmazzák ezt a módszert antibiotikum-érzékenységi vizsgálatokra. A gátlási zóna átmérıjét a szabványban megadott értékhez hasonlítva megállapítható, hogy az adott mikroorganizmus melyik hatóanyaggal szemben érzékeny, ill. rezisztens. Elıre elkészített, ismert hatóanyag tartalmú korongok a diagnosztikai cégektıl beszerezhetık, a gyakorlaton mi is ilyen korongokkal dolgozunk. (Természetesen olyan vegyületek esetében, amelyeknél nem áll rendelkezésre a kereskedelemben beszerezhetı korong, mi is elkészíthetjük).
8. GYAKORLAT Szükséges anyagok és eszközök: Tesztagar pH 7,2, antibiotikummal átitatott "RESISTEST" korongok (szumetrolim, chloramphenicol, ofloxacin, tetracyclin), steril csipesz Mikroorganizmusok: Staphylococcus aureus és Escherichia coli tenyészetekbıl készített szuszpenzió A gyakorlat menete: A baktériumszuszpenziókból néhány cseppet Petri-csészébe pipettázunk, majd a felolvasztott tesztagarral lemezeket öntünk. A lemezek megszilárdulása után a lemezek felszínére steril csipesszel negyedenként a Petri-csésze aljára írt számok fölé elhelyezünk 1-1 RESISTEST korongot, majd a lemezeket egyenes állásban 48 órára 37 °C-os termosztátba helyezzük. Az inkubációs idı eltelte után lemérjük a kialakult gátlási zónák átmérıjét, és így adjuk meg, hogy az adott mikroorganizmus melyik antibiotikumra a legérzékenyebb. Értékelés: Vonalzóval mérjük meg a korongok körüli mikrobanövekedéstıl mentes gátlási zónák átmérıjét! Hasonlítsuk össze az egyes törzsek különbözı antibiotikummal szembeni érzékenységét a gátlási zóna mérete alapján! Hasonlítsuk össze a különbözı törzseknél kapott értékeket! 1.2.6. Mikroorganizmusok közti kölcsönhatások Környezetünkben a mikroorganizmusok különbözı fajokból álló, kevert közösségekben (asszociációkban) fordulnak elı. Az egyes csoportok között a kölcsönös kapcsolatok különbözı formái fordulnak elı aszerint, hogy az egyes partnerek számára káros (-), közömbös (∅) vagy elınyös-e (+) az együttélés (8. táblázat).
18
4. táblázat: A szimbiózisok típusai B faj ∅
A faj
+ Mutualizmus (egymás nélkül Kommenzalizmus + életképtelen) (segítı) Protokooperáció (nincs függés) Kommenzalizmus Neutralizmus ∅ (segítı) Parazitizmus Amenzalizmus Predáció Jelölés: +=kedvezı, ∅=közömbös, -=káros
Parazitizmus Predáció Amenzalizmus Antagonizmus -Kompetíció -Antibiózis
Az antagonizmus során a mikroorganizmusok egymás fejlıdését gátolják, ez lehet kölcsönös és egyirányú is. A gátló hatást elıidézheti táplálék-konkurencia (kompetíció), illetve bizonyos anyagcseretermékek (savak, toxinok, antibiotikumok) kiválasztása, amelyek akadályozzák a velük szemben érzékeny mikroorganizmusok növekedését, de esetleg el is pusztítják azokat. A tejsavas erjedésnél a Lactobacillusok savtermelése akadályozza a fıbb mikroorganizmusok növekedését. Az antibiózisnál a gátlóanyag az antibiotikum. Az antagonisztikus hatás Petricsészében is könnyen bemutatható: a táptalajon az antagonista mikroszervezet akadályozza a vele szemben érzékeny másik mikrobát, ezért körülötte gátló zóna (tarfolt) keletkezik. Parazitizmus jön létre, ha az egyik faj a másik rovására él. Baktérium és baktérium között igen ritka a parazitizmus. Ezzel szemben a bakteriofágok élısködése a baktériumokban általános jelenség. A predáció a protozoonokra jellemzı a természetben. Mutualizmusról beszélünk, ha az együttélés mindkét fél számára elınyös. Egyik mikroorganizmus elısegítheti a másik fejlıdését pl. tápanyag-produkció révén is. Például a Bvitaminokat igénylı Lactobacillus-ok csak olyan környezetben életképesek, ahol a szaporodó élesztık, penészek vagy bizonyos baktériumok B-vitamint szintetizálnak. A kommenzalizmusra jellemzı, hogy az egyik faj tevékenysége elısegíti a másik fejlıdését. Például mikrobiológiai laboratóriumban oly módon is tenyészthetünk anaerob mikroorganizmusokat, hogy vele közös légtérbe aerob baktérium tenyészetét helyezzük, amely elfogyasztja a légtérben lévı oxigént. 1.2.6.1 CAMP teszt A diagnosztikai célokat szolgáló CAMP-teszt azon az elven alapul, hogy egyes hemolizáló (vérsejteket oldó és/vagy vérfestéket bontó) baktériumok egymás hatását erısítik. 9. GYAKORLAT (Bemutató)
Szükséges anyagok és eszközök: véresagar, oltókacs
19
Mikroorganizmusok: Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, Listeria innocua Staph.aureus
T E S Z T
L. monocytogenes β-hemolízis
T Ö R Z S E K
L.innocula Nincs hemolízis
K O N T R O L L T Ö R Z S E K
6. ábra: CAMP teszt A gyakorlat végrehajtása: A véresagar-lemezre átlósan vonal alakban β-hemolizáló Staphylococcus aureus teszttörzset kell oltani a 26. ábra szerint. A vizsgálandó baktériumok levestenyészetébıl ennek jobb oldalára úgy kell átoltani, hogy az oltási vonal éppen a Staphylococcus oltási vonal mellett kezdıdjön. 37 °C-on 24 órán át történı inkubálás után CAMP-pozitívnak kell értékelni a tesztet, amennyiben a Staphylococcus ß-hemolízis zónájában egy teljes hemolízis zóna képzıdik. Értékelés:
1.3.
A BAKTÉRIUMOK ANYAGCSERÉJÉNEK VIZSGÁLATA
Már a 7.1 fejezetben említésre kerültek a baktériumok anyagcsere változatai, amely módozatok közül élelmiszerhigiéniai és humán- valamint állategészségügyi jelentısége elsısorban a kemoheterotróf baktériumoknak van. Mint minden azonosítási próbában a biokémiai vizsgálatok során is alapvetı feltétel, hogy a próbák kiindulási alapja tiszta tenyészet legyen. A mikroorganizmusok anyagcsere-folyamataiban szerepet játszó extra- és intracelluláris enzimek, a biokémiai reakciók köztes, illetve végtermékei jellemzıek az adott mikroorganizmusra, ezért vizsgálatuk diagnosztikai szempontból igen fontos. Emellett a különbözı anyagcsere- és légzéstípusra utaló vizsgálatok során hasznos felvilágosítást kaphatunk az adott mikroba mezıgazdasági és élelmiszeripari hasznosíthatóságáról is. A biokémiai vizsgálatokat hagyományosan speciális táptalajok és reagensek segítségével végzik. Az utóbbi években egyre elterjedtebbek a több tulajdonság egyidejő vizsgálatát lehetıvé tevı tesztkészletek, amelyek különálló rekeszeiben igen kis mennyiségő, különbözı biokémiai vizsgálatok elvégzését célzó speciális táptalajokat öntenek (Enterotube II; API). Az eredmények leolvasása történhet szabad szemmel vagy olyan - számítógépes egységgel összekötött - coloriméter, segítségével, amely alkalmasak ezen biokémiai tesztkészletek automatizált, a szubjektivitást kizáró elemzésére.
20
1.3.1. A baktériumok szénhidrátforgalmának vizsgálata A szénhidrátok - mint tápanyagok - igen jelentıs szerepet töltenek be a kemoheterotróf mikroorganizmusok anyagcseréjében: egyrészt, mint szénforrás másrészt, mint energiaforrás játszanak benne szerepet. A baktériumok anyagcsere-utjai jellemzıek az adott baktériumra, így a biokémiai reakciók alapján történı azonosítás jelentıs részét képezi. Szénhidrátanyagcseréjükön belül vizsgáljuk a hasznosított szénhidrátok körét, a lebontás módját, a katalizáló enzimek jelenlétét, különbözı metabolitok termelését. 1.3.1.1 A szénhidrátbontás vizsgálata A szénhidrátbontás vizsgálata arra terjed ki, hogy a vizsgált baktérium milyen szénhidrátokat képes lebontani. Ezt - igénytelen baktérium esetében - vizsgálhatjuk 1% tetszıleges szénhidrátot és indikátort tartalmazó peptonvízben. Igényes baktériumok esetében a táplevest ki kell egészíteni 10% savóval, triptonnal és élesztıkivonattal. A táptalajok készítésekor tekintettel kell lenni arra, hogy sem a szénhidrát-oldat, sem pedig a savó nem hıkezelhetı, ezért ezeket autoklávozás után kell a levesbe keverni. Táptalajok készítéséhez csak egészséges állat sterilen vett vérébıl steril körülmények között készített savó, és membránfilteren való szőréssel sterilezett cukoroldat használható. A leveseket a tiszta tenyészetrıl lelángolt oltókaccsal levett teleppel oltjuk be, majd 30 °C hımérsékleten, 24-48 órán át inkubáljuk a csöveket. Az elbírálás alapja, hogy a baktériumok nagy része a szénhidrátokból savat és esetenként gázt termel. A savtermelés kimutatását szolgálja a levesbe kevert pH-indikátor, a gáztermelés kimutatására pedig Durham-féle fermentációs csövet helyezhetünk a levesbe. Anaerob baktériumok esetében tekintettel kell lenni arra a tényre, hogy ezek a baktériumok erıs redukáló hatással rendelkeznek, ami szintén megváltoztathatja az indikátor színét. Ezért anaerob tenyészetek esetében a pH-változást célszerő pH-mérıvel ellenırizni. 1.3.1.2 Metilvörös próba A metilvörös próba annak eldöntését szolgálja, hogy a vizsgált baktérium erısen (kevert savas erjesztést végzı) vagy gyengén (butándiolos erjesztést végzı) savtermelı-e. A baktérium tiszta tenyészetével be kell oltani egy glükóztartalmú levestáptalajt, majd a megfelelı inkubáció után a táptalajhoz néhány csepp metilvörös indikátort adni. Pozitív esetben - 4,4 alatti pH-értéken - az indikátor piros színt mutat. A próbának gyakorlati jelentısége, hogy segítséget nyújt a kóliformok Enterobacter-fajoktól való elkülönítésében. 1.3.1.3 OF teszt (Hugh-Leifson teszt) A teszt a szénhidrátbontás módjának meghatározását szolgálja, segítségével megállapítható, hogy egy adott baktérium a szénhidrátokat oxidatív, vagy fermentatív úton bontja-e. A vizsgálathoz 1% szénhidrátot és indikátort (pl. brómtimolkék) tartalmazó félfolyékony magasagart használunk, amelyet a vizsgálandó baktérium színtenyészetével szúrásos technikával párhuzamos beállítása mellett oltunk be. Az egyik csövet aerob, a másik csövet anaerob körülmények között inkubáljuk. Megfelelı inkubációs idı eltelte után a csöveket az indikátor színváltozására tekintettel bíráljuk el. Az aerob baktériumok oxidatív, az anaereobok mind oxidatív, mind pedig fermentatív úton képesek a szénhidrátokat bontani. 21
A próba elbírálását az alábbi táblázat tartalmazza: Aerob tenyésztés + + -
Anaerob tenyésztés + + -
Elbírálás Oxidatív (obligát aerob) Fermentatív (obligát anaerob) Oxidatív és fermentatív (fakultatív anaerob) Nem bontja a glükózt
10. . GYAKORLAT Szükséges anyagok és eszközök: 4 csı OF-agar, oltóttő, paraffinolaj Mikroorganizmusok: Staphylococcus aureus és Micrococcus ssp. ferdeagaros tenyészete A gyakorlat menete: Mind a Staphylococcus aureus, mind a Micrococcus ssp. tenyészetbıl átoltást végzünk 2-2 OF-agart tartalmazó csıbe szúrásos technikával. Mindkét átoltás egyik csövét parffinolajjal fedjük. A csöveket 24 órán át 37 °C-on inkubáljuk, majd a brómtimolkék indikátor sárga színváltására nézve bíráljuk el. Értékelés: 1.3.1.4 α-amiláz detektálása keményítı tartalmú agarlemezeken A keményítı a természetben az egyik leggyakrabban elıforduló poliszacharid, ami számos szervezetben mint tartalék tápanyag lelhetı fel. A keményítıt két glükóz-polimer, az amilóz és az amilopektin építi fel, amelyek egyaránt gyorsan hidrolizálhatóak a mikrobák által termelt α-amiláz hatására. A bontás folyamata: keményítı
α-amiláz
α-amiláz
dextrin
maltóz
maltáz
glükóz
A keményítıt tartalmazó tápközegbe való oltás és tenyésztés után jód-próbával mutathatjuk ki a keményítı bontását. 11. GYAKORLAT Szükséges anyagok és eszközök: oltókacs, keményítıtartalmú lemeztáptalaj, KJ-os jódoldat (lugol) Mikroorganizmusok: Bacillus cereus és Escherichia coli ferdeagaros tenyészete
22
A gyakorlat menete: A vizsgált tesztmikróbák kacsnyi mennyiségével vonaloltást végzünk a keményítıagar felszínére, majd termosztátba helyezzük a lemezeket. Az inkubációs idı letelte után a kifejlıdött kolóniákat tartalmazó lemeztáptalaj felszínére lugol-oldatot cseppentünk. Értékelés: A kiértékelés a jód és a keményítı kék színreakcióján alapul. Pozitív színreakció esetén az αamilázt termelı baktérium kolóniája körül az elbomlott keményítınek köszönhetıen a táptalaj színtelen marad. 1.3.1.5 A redukáló hatás vizsgálata Erıs redukáló hatással azon baktériumok esetében kell számolni, amelyek az anyagok lebontását dehidrogénezéssel végzik, vagyis képesek fermentatív szénhidrátbontásra. Ezek közé kell sorolni az anaerob és fakultatív anaerob baktériumokat. A redukáló hatás vizsgálható metilénkék táptalajba keverésével, mert a metilénkék redukció hatására elszíntelenedik. Több differenciáló táptalaj alkalmas a baktériumok redukáló hatásának vizsgálatára. A fontosabbakat az alábbi táblázat tartalmazza: 5. táblázat: A baktériumok redukáló hatásának vizsgálata Vizsgált Táptalaj Reakció baktérium Szulfit2− 2− Mezofil ⇒S SO 3 redukciós szulfitredukáló 2+ leves + S 2 − ⇒ FeS Clostridium Fe (DRCM) Staphylococcus
Salmonella
Baird-Parker Tellurit redukciója tellurrá agar Fe2+ tartalmú táptalaj
Eredmény Fekete csapadék Grafitszürk e vagy fekete telepek
Kéntartalmú aminosavakból H2S telepek Fe2+ + H2S →FeS + 2 H+
1.3.1.6 Kataláz-próba Az aerob és fakultatív anaerob baktériumoknál - szemben a magasabb rendő állatokkal - a terminális oxidációban a citokróm-oxidáz egyetlen pár hidrogénatomot továbbít a hidrogénakceptor szerepét betöltı molekuláris oxigénhez. A reakció végtermékeként víz helyett hidrogén-peroxid keletkezik, amely oxidáló tulajdonságánál fogva sejtméreg, így a környezetben felhalmozódva a baktériumokra is toxikus. A hidrogén-peroxidot a baktériumok vas-porfirinvázas kataláz nevő enzime vízre és oxigénre bontja. kataláz enzim
2 H2O2
2 H2O + O2
23
Azon baktériumok, amelyek nem rendelkeznek kataláz enzimmel, általában az anaerobok közé tartoznak (esetleg aerotoleransak lehetnek). Kataláz enzimet termel minden obligát aerob baktérium, és a fakultatív anaerobok egy része is, így pl. a Staphylococcus aureus. A kataláz próba két változata terjedt el: a tárgylemez- és a kémcsı-próba Az elıbbit szilárd tenyészetek, az utóbbit pedig levestenyészetek esetében alkalmazzuk. A tárgylemezpróba elvégzése során a tenyészetbıl egy kacsnyi mennyiséget tárgylemezre viszünk, majd 3%-os hidrogén-peroxid-oldatot cseppentünk rá. Az oldatba nem szabad fémkaccsal nyúlni, mert az katalizálhatja a hidrogén-peroxid bontását, és fals pozitív eredményt kaphatunk. A kémcsıpróba során a levestenyészetbe kb. 1 ml hidrogén-peroxid-oldatot kell önteni. Mind a tárgylemez- mind pedig a kémcsıpróba esetében a pozitív reakciót gázképzıdés, (pezsgés) jelzi. Tárgylemez-próba esetén elıfordul, hogy a gyenge kataláz-aktivitással rendelkezı baktériumok esetében a próba csak lupe segítségével bírálható el. A vizsgálatokhoz nem célszerő töményebb oldatot használni, mert könnyen bomlik. A hidrogén-peroxid-oldatot sötétített üvegben kell tartani, mert fény hatására is bomlik. 12. GYAKORLAT Szükséges anyagok és eszközök: tárgylemez, oltókacs, 3%-os hidrogén-peroxid-oldat Mikroorganizmusok: Micrococcus spp., Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, Lactobacillus plantarum ferdeagaros tenyészete Értékelés: Jegyezzük fel, melyik tenyészetnél észlelünk gázfejlıdést
1.3.1.7 Oxidáz próba Oxidáz-próba alatt az oxidatív anyagcserét folytató baktériumok terminális oxidációjában szerepet játszó (az elektrontranszportlánc citokróm-c-jét visszaoxidáló) citokróm-oxidáz enzim kimutatását értjük. A kimutatás során a tiszta tenyészetbıl egy telepet 1%-os színtelen tetrafenilén-diamin-oldattal átitatott szőrıpapírcsíkra viszünk. Amennyiben a mikroba termel oxidáz-enzimet a szőrıpapíron sötétkék elszínezıdés látható. Az oxidáz-próbához - akárcsak a kataláz-teszthez - fém oltókacs nem használható. 1.3.1.8 Voges-Proskauer (acetil-metil-karbinol) próba A Voges-Proskauer próba a butándiolos erjedés köztitermékének, az acetil-metil-karbinolnak (acetoin) kimutatását szolgálja. A próba lényege, hogy az acetoin lúgos, közegben oxigén jelenlétében piros színő diacetillé oxidálódik. Az oxidációt α-naftol vagy kreatinin hozzáadásával elısegíthetjük.
24
A reakciósorozat vázlata:
glükóz
erjesztés
CH3
CH3
CH-OH
CH-OH
C=O
CH-OH
CH3
CH3
acetoin
redukció
butándiol
CH3 CH-OH C=O
CH3 40%-os KOH
C=O
α-naftol, vagy kreatinin
CH3 acetoin
diacetil
C=O CH3
A próba elvégzéséhez 1% glükózt tartalmazó levestáptalajra van szükség, amit beoltunk a vizsgálandó mikroba tiszta tenyészetével, majd 30 °C-on 24-48 órán át inkubáljuk. Az inkubációs idı eltelte után a levestenyészethez cseppentünk 1-1 csepp reagenst. Pozitív esetben 10-15 perc várakozási idı után a leves pirosan elszínezıdik. A próba a metilvörös próbához hasonlóan lehetıséget ad a kevert savas és a butándiolos erjesztést végzı mikroorganizmusok kimutatására.
13. GYAKORLAT
Szükséges anyagok és eszközök: 2 csı beoltott Voges-Proskauer leves, VP-reagens l (5 %-os etanolos (96 %) 1-naftol) és VPreagens 2 (40 %-os kálium-hidrixid-oldat), kreatin Mikroorganizmusok: Bacillus cereus és E. coli VP-levesbe oltva A gyakorlat menete: A beoltott és 30 °C-on 24 órán át inkubált VP-levestenyészetek 1 ml-éhez 0,2 ml VP-reagens 2-t és 0,6 ml VP-reagens 1-t, valamint néhány kreatin kristályt adunk. A csöveket 1 órán át szobahımérsékleten állni hagyjuk, majd elbíráljuk. Pozitív esetben piros színreakció tapasztalható. Negatív esetben 24 óra inkubálás után újra el kell bírálni a reakciót.
25
