TENYÉSZTÉSES MIKROBIOLÓGIAI VIZSGÁLATOK II.
1. Mikroorganizmusok számának meghatározása telepszámlálásos módszerrel A telepszámlálásos módszerek esetében a tenyésztést szilárd táptalajon végezzük, így szemben az MPN-módszerrel, ahol a csíraszámot indirekt úton, statisztikai módszerrel határoztuk meg - a kifejlıdött telepek közvetlenül megszámolhatók. A telepszámlálásos módszerek alkalmazhatóságának alapfeltétele, hogy • a táptalajokon kinıtt telepek egyetlen sejt szaporodásából származzanak, és • a telepek számolhatók legyenek, vagyis a cél olyan lemeztenyészetek elıállítása, amelyen az egyedülálló (soliter) telepek száma 10-300 közötti. Akárcsak az MPN-módszerrıl, a telepszámlálásos módszerekrıl is elmondható, hogy - a táptalajtól és a tenyésztési technikától függıen - alkalmas mind az összcsíraszám; mind pedig valamely tetszıleges mikrobacsoport számának meghatározására. Élısejtszám meghatározás lemezöntéses módszerrel A lemezöntéses módszert fıként kevéssé hıérzékeny, nem obligát aerob mikroorganizmusok tenyésztésére használjuk. Alkalmazható az összcsíraszám, valamint szelektív vagy elektív táptalajok és optimális tenyésztési viszonyok alkalmazásával szőkebb mikrobacsoportok élıcsíra-számának meghatározásához. A vizsgálat elsı lépése - mint miden élıcsíra-szám meghatározást célzó tenyésztéses módszer esetében - a megfelelıen elıkészített mintából decimális hígítási sor készítése. Ezt követıen a hígítási sor tagjaiból 2-2 - egyértelmő jelzéssel (mintaszám, leoltás dátuma, alkalmazott táptalaj rövidített neve, hígítás foka) ellátott - Petri-csészébe 1-1 cm3 szuszpenziót kell pipettázni steril pipettával a legmagasabb hígítástól kezdve a nagyobb sejtsőrőségő tagok felé haladva (19. ábra). Pipettázáskor nem vesszük le teljesen a csészék fedelét, csupán annyira emeljük fel, hogy a pipettával be tudjunk nyúlni (1) (20.ábra). A sterilezett, 45-50 °C hımérséklető, táptalajból kb. 15 cm3 mennyiséget öntünk a megemelt fedelő Petri-csészékbe (2), majd egyenletes rotáló mozgatással a - még folyékony - táptalajt alaposan elkeverjük a Petri-csészében lévı szuszpenzióval (3). Ügyelni kell arra, hogy mozgatás közben a tápközeg ne kerüljön a Petri-csésze falára és tetejére, valamint ne szennyezze a környezetet. Az inokulum szétosztása és a táptalaj öntése közötti idıtartam ne haladja meg a 15 percet. A tápközeg megszilárdulása (4) után a Petri-csészéket meg kell fordítani úgy, hogy a lemez kerüljön felülre (5). Ennek célja egyrészt a képzıdı kondenzvíz visszacsöpögésének, a gyors kiszáradásnak, valamint a telepek elvándorlásának megakadályozása. A lemezeket ezt követıen megfelelı hımérséklető termosztátba kell helyezni, és elıírt ideig tenyészteni.
1
1-1 cm3
1. ábra: A lemezöntéses módszer kivitelezésének rajzos vázlata I. O= Petri-csésze
2. ábra: A lemezöntéses módszer kivitelezésének rajzos vázlata II. Kerüljük a termosztátok túlterhelését. A csészeoszlopok között, az oszlopok és termosztát falai, valamint az oszlopok és a polc lapjai között legalább 29 mm hézagot kell hagyni. Egy oszlopban legfeljebb 6 csésze legyen. Az inkubálás lejárta után a lemezeket kivesszük a termosztátból, és a rajtuk kifejlıdött telepeket megszámláljuk. Csak azokat a lemezeket vonjuk be az értékelésbe, amelyeken a telepszám 10-300 (nagymérető telepek esetén 10-150) közötti. A csíraszámot az értékelésbe bevont lemezeken (két egymást követı hígítás) megszámlált telepszámok súlyozott átlagaként adjuk meg a hígítási fok figyelembe vételével az alábbi képlet alapján:
C=
∑c (n1 + 0,1 ⋅ n 2 ) * V * d
ahol
2
C = telepszám súlyozott középértéke ∑ c =a számításba bevont valamennyi lemezen számolt telepek összes száma (az elsı értékelhetı és az azt követı hígítási fokok) n1 =az elsı értékelhetı hígítási fokhoz tartozó lemezek száma n2 =a második értékelhetı hígítási fokhoz tartozó lemezek száma d =az elsı értékelt hígítási szint hígítási foka (pl. 10-2) V =a lemezekre vitt kultúra mennyisége (jelen esetben 1 cm3) A kapott értéket minden esetben normál alakba hozva adjuk meg eredményként. Ennél a vizsgálati módszernél célszerő az alkalmazott táptalajt úgy megválasztani, hogy az tiszta, áttetszı legyen, mert az opálos színő táptalajok zavarhatják a kolóniák felismerhetıségét. 1. GYAKORLAT
Pasztırözött tej összcsíraszámának meghatározása lemezöntéses módszerrel Összcsíraszám alatt értjük azoknak az élı mikroorganizmusoknak a számát, amelyek 30 °C hımérsékleten aerob körülmények között 48-72 óra alatt telepet képeznek (összes élı, aerob és fakultatív anaerob, mezofil és fakultatív pszichrotróf mikrobák száma). A vizsgálatot szilárd alaptáptalajon kell végezni, mint pl. a triptont, élesztıkivonatot és glükózt tartalmazó Plate-Count agar
Szükséges anyagok és eszközök: 90 cm3 steril hígítóvíz Erlenmeyer-lombikban, 10 cm3-es steril pipetta, 5 x 9 cm3 steril hígítóvíz kémcsıben, 1 cm3-es steril pipetta, 6 db steril Petri-csésze, olvasztott Plate-Count agar Mikroorganizmus: Pasztırözött tej természetes mikroflórája A gyakorlat menete: A pasztırözött tejminta 10 cm3-ét bemérjük 90 cm3 steril hígítóvízbe, majd az így elkészített és alaposan összekevert alaphígításból további decimális hígításokat készítünk 10-5 hígítási fokig. A hígítási sor utolsó három tagjából 1-1 cm3 t pipettázunk hígításonként 2; azonosítható jelöléssel ellátott steril Petri-csészébe, majd felolvasztott és 45 °C-ra visszahőtött Plate-Count agarral lemezt öntünk. Szilárdulás után a lemezeket 48-72 órára 30 °C-ra állított termosztátba helyezzük. Az inkubálási idı után a kifejlıdött telepeket megszámoljuk, és a fenti képlet alapján kiszámoljuk a tej 1 cm3-ére vonatkoztatott összcsíraszámot. Ha valamely képletrıl szabad szemmel nem tudjuk eldönteni, hogy telep-e, célszerő lupéval is megvizsgálni. Megjegyzés: a módszer alkalmas az aerob spóraszám meghatározására is, ha a mintát vagy a hígítási sor tagjait 80 °C-on 10 percen át kezelve a vegetatív alakokat elpusztítjuk. Eredmények:
3
2. ÉLİSEJTSZÁM MEGHATÁROZÁSA FELÜLETI SZÉLESZTÉSSEL A felületi szélesztés alkalmazható hıérzékeny, obligát aerob mikroorganizmusok tenyésztésére is. Ennél a módszernél alkalmazhatunk opálos színő (általában tojássárgaemulziót tartalmazó) táptalajokat, mivel a mikrobaszaporodás a táptalaj felszínén történik, így a telepek szabad szemmel is jól láthatók. A felületi szélesztéses módszer - akár az MPN, vagy a lemezöntéses eljárás - alkalmazható az összcsíraszám, valamint szelektív vagy elektív táptalajok és optimális tenyésztési viszonyok alkalmazásával szőkebb mikrobacsoportok élıcsíraszámának meghatározásához. A felületi szélesztéses eljárás során a már elıre leöntött és megszilárdított, szikkasztott felülető lemez felületére pipettázunk hígításonként 0,1 cm3 szuszpenziót (19. ábra). Ha nincs más elıírás a szárítást beoltás elıtt fedı nélkül, lefelé nézı agarfelülettel kell elvégezni egy 50 °C-os termosztátban 30 percig. A táptalaj szikkasztására azért van szükség, mert a nedves felülető lemezen nehéz a szélesztés, és a kifejlıdı telepek szétfutnak. Beoltás után a megfordított lemezeket megfelelı körülmények között meghatározott ideig inkubáljuk. Az inkubációs idı letelte után a kifejlıdött telepeket megszámláljuk. Az értékelésbe csak azokat a lemezeket vonjuk be, amelyeken a telepszám 10-300 (nagy telepek esetén 10-150) közötti. A csíraszám meghatározása súlyozott átlag számításával az elıbb már említett képlet alapján történik: C=
∑c (n1 + 0,1 ⋅ n 2 ) * V * d
ahol C = telepszám súlyozott középértéke ∑ c =a számításba bevont valamennyi lemezen számolt telepek összes száma (az elsı értékelhetı és az azt követı hígítási fokok) n1 =az elsı értékelhetı hígítási fokhoz tartozó lemezek száma n2 =a második értékelhetı hígítási fokhoz tartozó lemezek száma d =az elsı értékelt hígítási szint hígítási foka (pl. 10-2) V =a lemezekre vitt kultúra mennyisége (jelen esetben 0,1 cm3)
0,1-0,1 cm3
3. ábra: A felületi szélesztéses módszer kivitelezésének rajzos vázlata O= Petri-csésze
4
Látható, hogy a lemezöntéses módszernél a lemezekre vitt inokulum mennyisége 1 cm3, a felületi szélesztéses módszernél 0,1 cm3. Az eredményt minden esetben normál alakba hozva kell megadni CFU/ cm3 vagy CFU/g mértékegységgel. A fentiekbıl következik, hogy szilárd minták esetében, a vizsgálat érzékenysége legalább 102 mikroba/g, folyékony minták esetében pedig; 101 mikroba/ cm3. Elıfordulnak azonban olyan vizsgálati minták, amelyekben a keresendı mikroorganizmus ennél kisebb számban, fordul elı. Ezek kimutatását célozza az un. "három-lemez"-módszer. Ennek lényege, hogy a hígítási sor elsı tagjából - szilárd minták esetében ez az l-es hígítás (alapszuszpenzió), folyékony minták esetében pedig maga a minta (0-s hígítás) - összesen 1 cm3 mennyiséget három lemez felületén oszlatunk el, majd a megfelelı inkubálás eltelte után a telepeket mindhárom lemezen megszámláljuk, és a kapott értékeket összeadjuk. Ez a szám megmutatja, hogy - szilárd minták esetében - az alapszuszpenzió, illetve - folyékony minták esetében - a minta 1 cm3-ében hány mikroba található. 2. GYAKORLAT
Pasztırözött tej összes Staphylococcus-, és feltételezhetıen Staphylococcus aureus számának meghatározása felületi szélesztéses módszerrel A Staphylococcus nemzetség tagjai megtalálhatók az ember és az állatok bırén, felsı légutaiban, a húgy és nemi szervek nyálkahártyáin, illetve egyes fajaik a tejben és tejtermékekben is. Élelmiszerhigiéniai szempontból legjelentısebb képviselıjük a Staphylococcus aureus, amely hıtőrı enterotoxin-termelése révén az ételmérgezı mikroorganizmusok közé tartozik. A Staphylococcus-ok szelektív tenyésztésére a szulfamethazin-tojássárga-tellurit tartalmú szelektív és differenciáló agarlemezt alkalmazzuk. A szulfamethazin visszaszorítja a kísérı mikroflórát, a tellurit a Staphylococcusok-ra jellemzı tellurit-redukció kimutatását célozza, amelynek eredményeként a telepek fekete vagy grafitszürke színben tőnnek föl. A táptalajon vizsgálható a Staphylococcus aureus-ra jellemzı lipáz-lecitináz aktivitás. A lipáz pozitívak azok a telepek, amelyek felülete a keletkezı zsírsavak miatt gyöngyházfényő. A lecitináz aktivitást az un. Nagler-reakció mutatja. Ennek lényege, hogy a lecitin elbontása miatt a telepek körül - a tojássárga-tartalom miatt - egyébként opálos táptalaj feltisztul.
Szükséges anyagok és eszközök: 90 cm3 steril hígítóvíz Erlenmeyer-lombikban, 10 cm3-es steril pipetta, 9 cm3 steril hígítóvíz kémcsıben, 1 cm3-es steril pipetta, 4 db Baird-Parker agarlemez, steril Wassermann-csövek Mikroorganizmus: Pasztırözött tej természetes mikroflórája A gyakorlat menete: A pasztırözött tejminta 10 cm3-ét bemérjük 90 cm3 steril hígítóvízbe, majd az így elkészített és alaposan összekevert alaphígításból további decimális hígítást készítünk 10-2 hígítási fokig. A hígítási sor tagjaiból 0,1 – 0,1 cm3-t pipettázunk hígításonként 2, azonosítható jelöléssel ellátott steril Baird-Parker agarlemezre. A lemezeket 24-48 órára 37 °C-ra állított termosztátba helyezzük. Az inkubálási idı után a kifejlıdött fekete vagy grafit szürke telepeket, valamint ezek közül a gyöngyházfényő és Nagler-reakciót mutató telepeket megszámoljuk, és a fenti képlet alapján kiszámoljuk a tej 1 cm3-ére vonatkoztatott Staphylococcus-, valamint feltételezett Staphylococcus aureus-számot 5
Számolási példa telepszám súlyozott átlagának kiszámítására lemezöntéses módszer esetében Tegyük fel, a lemezeken kinıtt telepek leszámolása után az alábbi eredményeket kaptuk a nyers tej összcsíraszámának vizsgálatakor. Hígítási szint Hígítási fok 1. párhuzamos lemezein kinıtt telepek száma (c) 2. párhuzamos lemezein kinıtt telepek száma (c)
10-1 1
10-2 2
10-3 3
10-4 4
10-5 5
sok
sok
280
27
3
sok
sok
235
23
2
A kiértékelésbe csak a fekete négyzettel körülvett telepszámokat vonhatjuk be, mert ezek felelnek meg a 10
∑c
280 + 235 + 27 + 23 565 = = −3 (n1 + 0,1 ⋅ n 2 ) * V * d (2 + 0,1 * 2 ) * 1 * 10 2,2 * 10 −3 = 256,82 * 10 3 = 2,57 * 10 5 CFU 3 cm 5 2,57*10 a nyers tej mintánk összcsíraszáma. 1 1 = 1000 = 10 3 Figyelem: 10-3=0.001=1/1000, így −3 = 1 10 1000 C=
=
3. Membránszőréses módszer A membránszőréses módszert alacsony csíraszámú folyadék- és gázminták vizsgálatára alkalmazzuk. A minta meghatározott mennyiségét membránfilteren átszívatva annak pórusain a mikrobák visszamaradnak. A membránfiltert táptalajra helyezve a filteren átdiffundáló tápanyagok révén a telepek magán a filteren alakulnak ki. A membránszőréses módszer alkalmazásáról és technikai kivitelezésérıl részletesen a "Víz összes csíraszámának meghatározása membránszőréses módszerrel" címő gyakorlat keretében lesz szó.
6
