MENDELOVA ZEMĚDĚLSKÁ A LESNICKÁ UNIVERZITA V BRNĚ FAKULTA AGRONOMICKÁ
DISERTAČNÍ PRÁCE ve studijním oboru CHEMIE Mgr. Barbora Procházková
STANOVENÍ METABOLITŮ S VYUŽITÍM ELEKTROMIGRAČNÍCH METOD
Poděkování Na tomto místě bych chtěla poděkovat prof. RNDr.Vlastimilovi Kubáňovi, DrSc. za podporu při odevzdávání této práce, doc. Ing. Janu Pospíchalovi, DrSc. ze odborné vedení a rady během mého studia, Ing. Jiřímu Šalplachtovi, PhD. za pomoc při měření na MALDI TOF MS, Ing. Pavle Andrlové za pomoc s metodou 1-D SDS PAGE, Mgr. Nikole Kotlánové, PhD. za pomoc při měření na spektrofotometru NanoDrop a všem kamarádům a rodině za psychickou podporu.
Prohlášení Prohlašuji, že jsem disertační práci na téma „Stanovení metabolitů s využitím elektromigračních metod“ vypracovala samostatně s použitím literatury, kterou cituji. Souhlasím, aby práce byla uložena v knihovně MZLU v Brně a zpřístupněna ke studijním účelům.
V Brně 22. 8. 2008
Mgr. Barbora Procházková
2
OBSAH 1. ÚVOD.......................................................................................................4 2. TEORETICKÁ ČÁST............................................................................6 2.1. SINICE, ŘASY A JEJICH FYKOBILIPROTEINY....................................................................................................6 2.2. ELEKTROMIGRAČNÍ METODY....................................................................................................................17
3. CÍLE PRÁCE........................................................................................30 4. EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST................................................................31 4.1. CHEMIKÁLIE ........................................................................................................................................31 4.2. POUŽITÉ PŘÍSTROJE................................................................................................................................32 4.3. BIOLOGICKÝ MATERIÁL...........................................................................................................................33 4.4. METODY KULTIVACE, SKLIZNĚ A EXTRAKCE ...............................................................................................34 4.5. EXTRAKCE PBP...................................................................................................................................35 4.6. CAF-IEF...........................................................................................................................................35 4.7. GELOVÁ ELEKTROFORÉZA V POLYAKRYLAMIDOVÉM GELU (1-D SDS PAGE)................................................37 4.8. MALDI-TOF/TOF MS.....................................................................................................................38 4.9. UV-VIS SPEKTROFOTOMETRIE.................................................................................................................39
5. VÝSLEDKY A DISKUSE.....................................................................40 5.1. VÝBĚR ELEKTROLYTOVÉHO SYSTÉMU........................................................................................................40 5.2. DÁVKOVACÍ PROCES A PROCES FOKUSACE..................................................................................................42
6. ZÁVĚR...................................................................................................60 7. LITERATURA......................................................................................63 8. SEZNAM POUŽITÝCH ZKRATEK..................................................67 9. ABSTRAKT...........................................................................................68 10. SUMMARY..........................................................................................69 11. ŽIVOTOPIS.........................................................................................70 12. SEZNAM PUBLIKACÍ......................................................................71 13. POSTER...............................................................................................71 14. VEŘEJNÁ PREZENTACE................................................................71
3
1.Úvod V posledních letech se zájem jak široké veřejnosti, tak i vědecké obce stále více obrací k problematice sinic a řas. Jednak jako k možnému zdroji potravy a zdroji surovin pro přípravu potravinových doplňků, dále také jako k potenciálnímu zdroji surovin pro výrobu biopaliv a v neposlední řadě také jako k velkému aktuálnímu problému našich vod. Řasy jsou zdrojem potravy lidstva už od nejstarších dob např. v Japonské a Čínské kuchyni je mnohostranně používána mořská červená řasa rodu Porphyra, která se u nás prodává pod obchodním název řasa Nori. Další sinice používaná do polévek a omáček je Spirulina platensis, známá také jako Arthrospira fusiformis a zelená řasa rodu Chlorela. Sinice a řasy jsou bohaté na bílkoviny, esenciální aminokyseliny, vitamíny (A, B2, B12, C), vlákninu a minerály (vápník, hořčík, zinek, jód, sodík, železo). Jsou zásadotvorné a vyrovnávají tak překyselení organismu, což bývá příčinou mnoha nemocí. Obsahují nenasycené mastné kyseliny, které příznivě regulují hladinu cholesterolu v krvi. Sinice a řasy svými antioxidačními účinky chrání buňky před působením volných radikálů. Odnímají z těla těžké kovy jako je olovo, rtuť a kadmium. Používají se jako prevence nebo stav zlepšující prostředek při široké škále civilizačních chorob, např.: vysoký krevní tlak, arterioskleróza, alergie, revmatismus, rakovina, poruchy nervové i gynekologické. Na druhou stranu, vysoký nárůst řas a sinic v letních měsících v rybních, přehradách a mořích způsobuje jak lidem, tak živočichům nemalé problémy. Sinice vystoupají na hladinu v podobě zelené kaše nebo drobných až několik milimetrů velkých částeček a vznikne tzv. vodní květ. Sinice a některé řasy obsahují látky, které mohou u alergiků způsobit výskyt přecitlivělých reakcí, jako jsou kožní problémy, záněty a alergické reakce očí a spojivek. Vlivem produkce toxinů dochází k otravám. Mohou to být projevy od lehkých akutních otrav, projevujících se střevními a žaludečními potížemi, přes bolesti hlavy, až po vážnější jaterní problémy. Jsou známy případy úhynu zvířat, ryb a dokonce i úmrtí lidí, kteří pravidelně pili vodu ze zdroje s masovým výskytem sinic. Vzhledem k nutnosti důkladného poznání složení řas a sinic byla vypracována řada separačních metod pro izolaci jednotlivých složek organického vzorku. Některé tyto složky potom nachází využití v návazných výzkumných pracích, lékařství apod. Separování a koncentrování proteinů hraje významnou roli v biochemii, proto byla vypracována řada purifikačních metod a postupů. Při separaci proteinů je nejvíce používána metoda gelové elektroforézy, která je však poměrně časově náročná. Pro rychlou přípravu vzorků, např. pro hmotnostní spektrometrii se nabízí relativně nově vyvinutá metoda izoelektrické fokusace bez nosných amfolytů, které je tato práce věnována především.
4
Izoelektrická fokusace bez nosných amfolytů (CAF-IEF) je metoda, která spojuje prvky izotachoforézy (ITP) a izoelektrické fokusace. (IEF), která je akceptována jako standardní metoda pro charakterizaci a separaci amfolytů z jejich směsí. K její realizaci je nutné mít k dispozici nosné amfolyty, které vytváří gradient pH, ve kterém dochází k separaci amfolytů na základě jejich pI. Použití nosných amfolytů může při pozdější identifikaci činit problémy, např. absorbci ve stejné oblasti spektra jako amfolyty, nebo mohou tvořit s amfolytem konjugáty. Také pořizovací cena je poměrně vysoká. Všechny tyto faktory vedly k pokusu o vytvoření stabilního pH gradientu bez těchto nosných amfolytů. U izoelektrické fokusace bez nosných amfolytů je gradient pH, původně vytvořený nosnými amfolyty, nahrazen pH skokovým rozhraním tvořeným vhodným elektrolytovým systém. Zde dochází k fokusaci amfolytů na základě jejich pI. Její přednosti jsou v jednoduchém experimentálním uspořádání, ve finanční nenáročnosti a v poměrně krátké době potřebné pro analýzu. Již dřívější práce poukázaly na vhodnost použití této metody pro předkoncentraci a purifikaci směsí modelových proteinů pro hmotnostní spektrometrii [1]. Tato práce rozšiřuje využití uvedené metody pro purifikaci proteinů z biologických matric, konkrétně fykobiliproteinů ze sinic a červených řas.
5
2.Teoretická část 2.1. Sinice, řasy a jejich fykobiliproteiny 2.1.1.Sinice – Cyanobacteria (Cyanophyta) Sinice jsou prokaryontní gramnegativní autotrofní organismy s oxygenní fotosyntézou, které podle stavby stélky a přítomnosti specializovaných buněk (heterocystů) rozlišujeme na řády: Chroococcales, Oscillatoriales, Nostocales a Stigonematales. Název sinic, Cyanophyta, zdůrazňuje speciální asimilační modré barvivo (fykocyanin), které spolu s jinými asimilačními barvivy propůjčuje stélkám těchto sinic modrozelenou barvu. Od řas i vyšších rostlin se sinice odlišují tím, že asimilační barviva nejsou uložena v chromatoforech, nýbrž jsou difusně rozptýlena ve vnější plasmě, která přejímá funkci asimilačního orgánu. U sinic nejsou přítomny obrvené rozmnožovací buňky ani gamety nebo jiné pohlavní orgány [2]. Protoplast sinic je primitivně rozdělen na vnější chromatoplasmu, obsahující asimilační barviva, a vnitřní bezbarvou centroplasmu, zvanou také centrální těleso. Chromatoplasma obsahuje difusně rozptýlená asimilační barviva, jichž ubývá do středu buňky. Chromatoplasma přejímá jako celek fyziologickou funkci chromatoforu, není však od ostatní plasmy oddělena zřetelnou hranicí. Asimilační pigmenty sinic jsou rovnoměrně rozptýleny v chromatoplasmě, která u kulovitých sinic je pravidelná a stejnoměrná. U vláknitých forem je chromatoplasma výrazně tlustší při povrchu vlákna než u příčných stěn. Obsahuje převážně chlorofyl a (nejdůležitější fotosyntetické barvivo [3]). Chlorofyl b zcela chybí. Ze skupiny karotenoidů byly v mnoha sinicích nalezeny hlavně β-karoten a v malém množství flavacin. Z xanthofylů převládá myxoxanthin a myxoxanthofyl. Charakteristické modré barvivo sinic, C-fykocyanin (CPC), nechybí žádnému druhu. Toto bílkovinné barvivo je rozpustné ve vodě a nerozpustné v tucích. Podobně se chová červené barvivo sinic, fykoerythrin (PE), který se nepatrně liší od stejnojmenného barviva červených řas (Rhodophyta). Mnohým sinicím však fykoerythrin chybí. Obě barviva náleží do skupiny barviv tzv. fykobilinů (PBP) [2]. Buněčná blána (membrána) obklopující protoplast sinic je složena, zvláště u vláknitých typů, ze dvou vrstev: z vnitřní blány a z vnějšího obalu. Skoro všechny sinice jsou opatřeny slizovými pochvami, které jsou buď rozplývavé a bez struktury, nebo pevné a vrstvené. Plynné vakuoly se zpravidla vyskytují u planktonních sinic a snižují jejich specifickou hmotnost do té míry, že tyto sinice se vznášejí při hladině
6
v podobě vodního květu. Kromě planktonních sinic mají plynné vakuoly sinice žijící na hnijícím bahně nebo v jiném prostředí chudém na kyslík. Tvar buněk sinic je jednoduchý: kulovitý, elipsoidní, válcovitý, soudečkovitý, vejčitý, tyčinkovitý nebo půlměsíčitý. Buňky jsou nečleněné, bez výrůstků a bez nápadné specializace. Nové buňky vznikají nepohlavním dělením, některé rody tvoří spory. Buňky sinic zřídka žijí jednotlivě. Zpravidla tvoří slizovité kolonie nebo jsou seskupeny ve vlákna. Shluky kolonií buněčných sinic mohou nabýt takových rozměrů, že jsou viditelné pouhým okem – „vodní květ“ [4]. Některé vláknité formy mívají specializované buňky heterocyty, ve kterých probíhá fixace vzdušného dusíku a akinety, což jsou klidové buňky určené k přetrvání nepříznivých období [2]. 2.1.1.1. Výživa sinic
Sinice jsou autotrofní organismy, které asimilují CO2 pomocí asimilačních pigmentů a světelné energie. Dovedou však zpracovávat i organické látky, a žijí tedy mixotrofně. Proto některé druhy mohou vegetovat i za nepřítomnosti světla. U druhů rostoucích hluboko pod vodní hladinou můžeme pozorovat chromatickou adaptaci, tj. přizpůsobení barvy sinic ke změně spektrální charakteristiky světla; chromatická adaptace byla dokázána také experimentálně, ukázalo se, že kromě barvy světla je důležitá i jeho intenzita. Sinice vytvoří komplementární barvu k barvě dopadajícího světla, tj. při modré barvě v hloubce vody se v chromatoplasmě sinic zvýší množství fykoerythrinu [4]. 2.1.1.2. Výskyt sinic
Sinice jsou v přírodě obecně rozšířeny. Rostou i na místech, na nichž jsou životní podmínky pro ostatní rostliny nepřijatelné (skály, ledovce, horká vřídla atd.). Vynikají neobyčejnou odolností vůči nízkým teplotám. Rostou jako první organismy na nově vytvořené a neosídlené zemi, např. na vulkanických ostrovech. Mnoho sinic nacházíme v planktonu. Život sinic v planktonní zóně v četných případech umožňují plynné vakuoly, které činí buňky lehčími než voda, takže se sinice za klidného počasí shromažďují při hladině a tvoří „vodní květy“. Terestrické formy sinic žijí na vlhkých stanovištích, na zemi, na skalách, na střechách, na kůře stromů, v jeskyních apod. Sinice jsou také důležité z hlediska zemědělské výroby. Vnikají hluboko do ornice a dovedou tam žít i bez viditelného záření. Tyto sinice mají pro mikrobiální život jistě větší význam, než je dosud známo. Např. sinice z rýžových polí Indie dovedou asimilovat vzdušný dusík do té míry, že spolu s bakteriemi kryjí spotřebu dusíku pro pěstované plodiny.
7
Některé sinice jsou citlivými ukazateli jakosti vody, proto mají význam jako vůdčí indikátory v biologické analýze vod. Sinice dokáží srážet vápence a jejich činnost je někdy tak intenzivní, že vznikají mohutné sraženiny (sintry, tufy, travertiny). Vápenec se sráží obyčejně v pochvách nebo na pochvách vláknitých sinic z čeledi Oscillatoriaceae. Symbióza sinic s lišejníkovými houbami se vyskytuje u rosolovitých lišejníků [4].
2.1.2.Ruduchy – Červené řasy (Rhodophyta) Ruduchy jsou fotoautotrofní eukaryotní organismy s jednobuněčnou nebo mnohobuněčnou stélkou. Jedním z hlavních znaků je absence bičíků v životních cyklech všech známých ruduch. Podle stavby stélky a dalších znaků rozlišujeme tři třídy. První z nich, Cyanidiophyceae, obsahuje jednobuněčné ruduchy rostoucí v extrémních podmínkách. Třída Bangiophyceae obsahuje vývojově primitivní ruduchy. Třetí třída, Florideophyceae, zahrnuje většinu známých ruduch. Patří sem ruduchy se složitější stélkou, která může být jednoosá, nebo mnohoosá. Buňky ruduch jsou vždy pokryté buněčnou stěnou. Její základní strukturu tvoří submikroskopické mikrofibrily celulózy s pravidelným křížovým uspořádáním. Celulóza je v buněčné stěně obsažena jen několika procenty. Podstatnou složkou jsou vysoce amorfní hydrofilní polygalaktany. Důležitou součástí stélek a reprodukčních buněk je sliz. Ruduchy patří k několika skupinám řas, u nichž dochází ke kalcifikaci buněčné stěny, při které se ukládají kalciové nebo aragonitové krystaly. Při velké reprodukční potenci ruduch mají tyto řasy značnou horninotvornou kapacitu, která se uplatňovala a uplatňuje při vzniku fosilních a růstu recentních korálových útesů. Chloroplasty ruduch mají v rozsahu celého oddělení podobnou submikroskopickou stavbu. Jsou uloženy volně v cytoplasmě a nemají žádné spojení s jádrem nebo s cisternou endoplazmatického retikula. Jejich povrch pokrývá dvojice membrán. Tylakoidy jsou uloženy vzájemně rovnoběžně. Jejich vnější povrch pokrývají polokulovité nebo válečkovité fykobilizomy, které obsahují přídavná fotosyntetická barviva, fykobiliproteiny (PBP), podobně jako ve stejných strukturách tylakoidů sinic. Jedná se o modrý fykocyanin, allofykocyanin a červený fykoerythrin. Hlavní fotosyntetický pigment, chlorofyl a, je obsažen v tylakoidech. U některých ruduch byl zjištěn také chlorofyl d, ale jeho distribuce není přesně zmapována. Dalšími pigmenty obsaženými v chloroplastech jsou: α-karoten a β-karoten a xantofyly, zeaxantin a lutein. Výsledná barva ruduch závisí na poměrném zastoupení jednotlivých pigmentů v chloroplastech. Červená barva stélky je považovaná za typickou a vyjadřuje převahu fykoerythrinu [2], nicméně sladkovodní ruduchy obvykle červené nejsou [3]. 2.1.2.1. Výskyt ruduch
Ruduchy jsou velmi početná skupina převážně mořských řas (4000–6000 druhů) a jsou dominantními mořskými makrofyty. Rostou v litorální a sublitorální zóně,
8
ve větších hloubkách než jiné řasy. Jsou to producenti, ostatním organismům poskytují potravu i úkryt. Od rovníků k pólům však jejich význam klesá, jde hlavně o tropické druhy, ale lze je nalézt na celém světě, včetně Antarktidy. Sladkovodní ruduchy preferují prudce tekoucí vody, kde je menší kompetice ostatních řas. Nejhojnější sladkovodní ruducha je Potěrka žabí símě, která roste i v Česku, v rašelinných tůních a v potocích [5]. 2.1.2.2. Využití ruduch
Makrofytické ruduchy nachází tradiční i moderní využití v potravinářském a farmaceutickém průmyslu. Vyrábí se z nich agar a jsou důležitým potravním doplňkem. V tradičním lékařství se používaly při léčení různých chorob. Jsou účinné proti parazitickým červům, počítá se s nimi při léčbě epilepsie a přípravek z Ptilota plumosa specificky sráží krev skupiny B [2].
2.1.3.Tylakoidy Tylakoid je slovo pocházející z řečtiny a znamená „podobný pytli“. Tylakoidy jsou ploché váčky, buď přibližně kulaté, o průměru zpravidla méně než jeden mikrometr, nebo užší a protáhlé v jednom směru. Jsou tvořeny tylakoidními membránami, jejichž tloušťka se pohybuje okolo šesti nanometrů. Složkami tylakoidních membrán (obr. 1) jsou mj. dva typy chlorofylbílkovinných komplexů (PS 1 a PS 2). Molekuly chlorofylu v reakčních centrech obou komplexů mají schopnost přenášet elektrony (odebírané z molekul vody) přes tylakoidní membránu proti potenciálovému spádu. Oddělení elektrických nábojů v reakčních centrech je vlastní podstatou fotosyntetické přeměny energie. Pro každé reakční centrum sbírá (soustřeďuje) zářivou energii několik stovek molekul chlorofylů (chlorofyl a, chlorofyl b) a dalších barviv, karotenů a xantofylů, tvořících ve vazbě na bílkoviny světlosběrné komplexy fotosystémů [6].
9
Obr. 1.OEC – komplex uvolňující kyslík, PS – fotosystém (reakční centrum, dřeňový komplex), LHC – světlosběrný komplex (u LHC 2 vyznačena jeho periferní mobilní a vnitřní imobilní část), Cyt blf – komplex cytochromů, CF / CF – ATP syntáza (coupling factor), P680, P700 – pigment centra fotosystému (s udaným maximem absorpce), PQ - plastochinon, PC – plastocyanin, Fd – ferredoxin [6].
Na povrchu tylakoidního váčku se nacházejí tzv. fykobilizómy. Ty zachytí více než polovinu fotonů, které se dostanou do reakčního centra. Jsou to proteinové komplexy s charakteristickou vnější strukturou, které slouží jako světlosběrné přenašeče energie pro fotosystém II [7]. Mívají různý tvar (polokulovité nebo vějířovité útvary). Jsou různě veliké, obvykle o průměru asi 30 nm, molekulové hmotnosti 7 až 15 tisíc kDa a obsahují 300 až 800 bilinových molekul [8].
Obr. 2.Struktura fykobilizómu [9].
10
Jednotlivé vějířovité (nebo polokulovité) fykobilizómy sestávají ze dvou nebo tří válců, na které nasedají radiálně tyčky (obr. 2). Válce i tyčky jsou sestaveny ze strukturních jednotek tvaru terčíku o průměru 11 nm uprostřed s otvorem o světlosti 3 nm. Terčíky sestávají z trimerů (tloušťka 3 nm) a hexamerů (tloušťka 6 nm) základního dimeru, složeného z neidentických podjednotek α a β, jejichž molekulová hmotnost je okolo 20 kDa. Ta obsahují jednu nebo více kovalentně připojených otevřených tetrapyrolových jader, která jsou navázána přes jednu a někdy dvě thioétherové vazby. Jsou známy úplné primární struktury bílkovinných podjednotek α a β všech spektroskopických tříd fykobilinů. Je také známo, na kterých cysteinových zbytcích jsou vázány fykobilinové chromofory a jak nekovalentní vazba jejich druhého konce mění absorpční vlastnosti barviva. Dále je známo, jak se podjednotky α a β spojují v dimer (αβ) a jak tyto dimery vytváří trimery (αβ)3 nebo hexamery (αβ)6, základní stavební kameny fykobilizómů. Dimery (αβ) lze disociovat při velmi nízké iontové síle roztoku nebo působením chaotropních činidel, ale na disociaci heterodimeru je třeba použít činidel, která současně bílkoviny denaturují. Přenos excitace je směrován skrze tyčinky do jádra a zde z donorových bilinů s absorpčním maximem 660 nm na koncové akceptorové biliny o maximu 670 nm. V tyčinkách je přenos také směrován pořadím fykobilinových pigmentů ve sloupci terčíků od fykoerythrinu přes fykocyanin k allofykocyaninu, tedy z barviva s maximem absorpce při kratší vlnové délce na barvivo s maximem při delší vlnové délce. Pravidelnost struktury pro takto přesně uspořádanou funkci zajišťují spojovací bílkoviny, které jednotlivé terčíky k sobě poutají [8]. Fykobilizómy se skládají z fykobiliproteinů, což jsou rostlinná barviva vyskytující se u sinic a zástupců některých oddělení nižších rostlin – u skrytěnek, rozsivek, hnědých řas, ruduch a krásnooček [9, 10]. Mohou představovat až 60 % z rozpustných buněčných proteinů. Patří do rodiny světlosběrných makromolekul, jejichž funkcí je zachytávání energie v rozmezí vlnových délek 495–650 nm a přenášení energie na chlorofyl a dále do fotosyntetického reakčního centra. Značná citlivost tohoto typu světlosběrné antény umožňuje mj. fotosyntézu sinic při velmi nízké hladině osvětlení – hluboko pod hladinou vody, v půdě, uvnitř kamenů, v jeskyních atd. Podle spektrálních vlastností můžeme fykobiliproteiny rozdělit do tří hlavních skupin: fykoerythrin (PE, λmax = 560 nm), fykocyanin (PC, λmax = 620 nm) a allofykocyanin (APC, λmax = 650 nm) [8].
2.1.3.1. Fotosyntetická barviva
Ve fotosyntetickém ústrojí plní barviva tři úlohy: 1. Vlastní fotochemická přeměna energie v reakčních centrech. V oxygenní fotosyntéze je takto činný pouze chlorofyl a, u fotosyntetických bakterií jsou to nejčastěji také (bakterio)chlorofyly BChl a, ale u mnohých také BChl b. (Bakterio)chlorofyly, které po excitaci rozdělují náboje, tvoří obvykle dimerovou strukturu, tzv. zvláštní pár.
11
2. Zachycení fotonů a přenos energie soustavou molekul barviv do reakčního centra. To je úkol barviv zabudovaných v bílkovinných molekulách světlosběrných antén. V těchto pigmentproteinech jsou vedle (bakterio)chlorofylů a a b také další (bakterio)chlorofyly (c, d a e), fykobiliny a xanthofyly. Podle toho rozeznáváme antény převážně (bakterio)chlorofylové, převážně xanthofylové a výhradně fykobilinové. 3. Ochrana fotosyntetického ústrojí před (a) nežádoucí nebo (b) nadměrnou excitací. Chemicky patří všechna barviva fotosyntetických membrán do dvou skupin: tetrapyroly s uzavřeným kruhem (chlorofyly a bakteriochlorofyly) nebo s kruhem otevřeným (fykobiliny) [8]. 2.1.3.2. Otevřené tetrapyroly
Fykobiliproteiny (PBP) jsou chromoproteiny s kovalentně vázanými barvivy fykobiliny. Fykobiliny jsou lineární neboli otevřené tetrapyroly a představuji hydrofilní (ve vodě rozpustné) polypeptidy. U živočichů se také setkáváme s biliny; jsou produktem rozkladu hemu (žlučová barviva). Také u sinic a řas vznikají fykobiliny oxidačním otevřením porfyrinového kruhu. Uhlíkové můstky mezi pyrolovými jádry bilinů mohou mít obě vazby jednoduché nebo jednu dvojnou. Všechny tři můstky nasycené mají bilany, např. urobilinogen, který je pouze u živočichů. Jeden můstek s nenasycenou vazbou mají bileny, např. fykourobilin, dva nenasycené můstky mají bilidieny, např. fykoerythrobilin nebo fykobiliviolin, a všechny tři můstky mají dvojnou vazbu u bilitrienů, jejichž příkladem je fykocyanobilin. Fykobiliny se na bílkovinu váží na jejich thioétherovou vazbu mezi prvým uhlíkem vinylového substituentu na pyrolovém kruhu fykobilinu a cysteinovým zbytkem v molekule bílkoviny. Všechny fykobiliny jsou takto vázány přes vinyl na kruhu A. Některé fykoerythrobiliny a fykourobiliny mají ještě druhou takovou vazbu na kruhu D [8].
12
Obr. 3.Strukturní vzorce fykocyanobilinu (A) a fykoerythrobilinů (B, C) [8].
Čtyři druhy fykobiliproteinů, které se vyskytují v sinicích a ruduchách, se liší polohou absorpčních maxim ve spektru: allofykocyanin (APC) má maximum absorpce mezi 650 a 680 nm, fykocyanin (PC) mezi 620 a 635 nm, fykoerythrocyanin (PEC) absorbuje nejsilněji u 575 nm a fykoerythrin (PE) mezi 545 a 565 nm. Velká rozmanitost absorpčních vlastností fykobiliproteinů není tolik dána nepříliš výraznými rozdíly ve struktuře molekul samotných fykobilinů, jako především jejich vzájemným působením s bílkovinou, na níž jsou vázány. Ačkoli fykobiliny nazýváme lineární tetrapyroly, jejich molekula má tvar přeštípnutého prstence, jehož volné konce jsou od sebe oddáleny ve směru kolmém na rovinu kruhu. To je přirozené uspořádání čtyř pyrolových molekul. Ve fykobiliproteinech jsou však fykobilinové molekuly v různé míře nataženy, buď kovalentní vazbou na bílkovinu na obou koncích, nebo jiným silovým působením aminokyselinových zbytků v bílkovině. S natažením molekuly se výrazně mění její absorpční vlastnosti. Nejčastějšími chromofory fykobiliproteinů jsou modrý fykocyanobilin (λmax = 600–670 nm), červený fykoerythrobilin (λmax = 540–570 nm) a červený fykourobilin (λmax = 490–500 nm). Méně častý je purpurový fykobiliviolin a dosud blíže neurčený zelený fykobilin odvozený od biliverdinu (λmax = 660–690 nm). Všechny sinice a ruduchy obsahují allofykocyanin (αAPCβAPC )3 a fykocyanin (αPCβPC)6. Především u ruduch (ale také u některých sinic) k nim přistupuje fykoerytrocyanin (αPECβPEC)6 nebo některý z fykoerythrinů. To může být C-PE, jehož složení je (αPEβPE )6, nebo B-PE a R-PE se strukturou (αPEβPE )6τ. Písmena C, B u fykoerythrinů a R u skrytěnek (Cryptophyta) označují příslušnost ke skupině charakterizované tvarem absorpčního spektra (a ovšem také strukturou, na níž tvar spektra závisí). τ ve fykoerythrinech je třetí podjednotka s molekulovou hmotností okolo 30 kDa a s vysokým obsahem chromoforů [8].
13
2.1.4.Fykocyanin (PC) Fykocyanin je modrý protein, který slouží jako světlosběrná anténa pro světelnou energii přijímanou z okolního prostředí, která je sinicí nebo řasou dále převáděna do molekuly ATP. Je to bílkovinný komplex, který se skládá ze dvou bílkovinných podjednotek α a β, na podjednotce α je navázán jeden fykocyanobilin a na podjednotce β jsou navázány dva [11]. Bílkovinný komplex se nepatrně liší organismus od organismu [12]. Je dobře rozpustný ve vodě, nerozpustný v kyselých roztocích (pH 3) [13], jeho izoelektrický bod (pI) je okolo 4,7 a molekulová hmotnost jednotlivých podjednotek je v rozmezí 18 –20 kDa [14]. Také jsou známy krystalové struktury fykobilinového komplexu [14]. Fykocyanin se rozkládá vlivem světla a je nestabilní již při pokojové teplotě, kdy ztrácí modrou barvu [16]. Experimentálně se u fykocyaninu neprokázaly toxické účinky na zvířatech [17]. Naopak, fykocyanin má v nanomolárním množství antioxidační vlastnosti [18], indukuje apoptózu [19] a jeví se jako možné chemoterapeutikum [20]. Zvyšuje obranyschopnost organismu před infekcemi, má protizánětlivé účinky [18], je neuroprotektivní [21] a chrání před ledvinovým kameny [22].
2.1.5.Allofykocyanin (APC) Allofykocyanin je modrý fykobiliprotein, který je lokalizován v jádře fykobilizómu a je jeho hlavní součástí. Skládá se z podjednotek α a β, které jsou v poměru 1:1, a na každé podjednotce je jedna molekula chromoforu fykocyanobilinu. Fykobilizómy sinic a červených řas mají tři typy jader: bicylindrické, tricylindrické a pentacylindrické. U bicylindrického typu oba cylindry leží na povrchu tylakoidní membrány. Při pH pufru 6–7 disociuje fykobilizóm na jednotlivé biliproteiny, které mohou být dále purifikovány. Allofykocyanin je purifikován jako trimetr (obr. 4) . Jsou známy primární struktury podjednotek α a β u sinic i červených řas [23, 24]. Molekulová hmotnost podjednotek se pohybuje okolo 18 kDa. Trimer allofykocyaninu je disociován na monomer za určitých podmínek. Částečné disociace se dosáhne mírným okyselením a použitím chaotropních činidel 0,5–1,0 M NaSCN nebo NaClO4. Monomery se mohou asociovat zase zpět na polymery. Absorpční spektra trimeru a monomeru jsou rozdílná. Monomer má absorpční maximum při 615 nm a trimer při 650 nm se zřetelným sekundárním maximem při 620 nm [25, 26]. Allofykocyanin stejně jako fykocyanin indukuje apoptózu [27].
14
Obr. 4.Strukturní schéma APC [28]
2.1.6.Fykoerythrin (PE) Fykoerythrin je červený, ve vodě rozpustný fykobiliprotein, složený ze dvou podjednotek α a β a dále ještě z polypeptidu γ (τ), který je spojovacím proteinem. Jsou známy dva fykoerythriny: B-PE a R-PE, přičemž každý z nich obsahuje jiný počet fykoerythrobilinů. To se projevuje přítomností různých absorpčních maxim (R-PE 565 nm, B-PE 545 nm). Množství variant je dáno druhem organismu [29]. PE je rozpustný ve vodě a je známa jeho krystalová struktura [30]. Molekulová hmotnost podjednotky α je asi 18 a β 20 kDa. Izoelektrický bod (pI) jednotlivých podjednotek je 4,3 [31].
2.1.7.Využití fykobiliproteinů PBP se používají jako přírodní barvící látky v potravinářství (žvýkačky, zmrzlina) a v kosmetice (krémy) [32, 33]. Fluorescenčních vlastností se využívá v molekulární genetice ke značení nukleových kyselin [34] a také při sledování vývojových stadií fytoplanktonu a biomasy.
15
2.1.8.Metody extrakce, purifikace a identifikace fykobiliproteinů (PBP) Fykobiliproteiny (PBP) mohou být z organismu získávány různými destrukčními a extrakčními technikami, a to jak metodami fyzikálními (mechanickými), tak chemickými, příp. enzymatickými, např. extrakcí v ultrazvukové lázni, metodou french press, metodou postupného zmrazování a rozmrazování, pomocí dvoufázového vodního systému (ATPS), rozrušením pomocí kuliček nebo písku, mrazením dusíkem a následným pomletím na kryogenním mlýnku nebo enzymatickou hydrolýzou lysozymem [25, 35-42]. Purifikace PBP se obvykle provádí kombinací metod např. vysolováním (síranem amonným), dialýzou a poté obvykle následuje chromatografie (iontoměničová, gelová nebo adsorpční chromatografie). Další možnou separační technikou je centrifugace v gradientu sacharózy a kapilární elektroforéza. Také byla provedena separace PBP pomocí izoelektrické fokusace (IEF) na čipu a izoelektrické fokusace ve volném roztoku ve speciálně upraveném přístroji s izoelektrickou membránnou [25, 37, 43-53]. K charakterizaci a identifikaci PBP se používají techniky jako je kapilární elektroforéza s laserem indukovanou fluorescenční detekcí a kapilární elektroforéza v kombinaci s hmotnostní spektrometrií (CE-IT-MS, CE-ESI-MS, CE-TOF-MS). Dalšími technikami jsou reverzně fázová kapalinová chromatografie (HPLC, HPLCESI-MS) a planární gelová elektroforéza - SDS-PAGE [37, 38, 48, 50, 51, 54]. Čistota a množství proteinu mohou být přímo stanoveny pomocí absorpční spektrometrie, spektrofotometrie, polarizační fluorescencí, fluorescencí indukovanou laserem, nebo cirkulárním dichroismem [ 40, 41, 49, 50, 51, 55-57].
16
2.2. Elektromigrační metody 2.2.1.Základy elektromigračních metod Historie objevu elektroforézy se datuje rokem 1892, kdy byl poprvé popsán pohyb anorganických částic v koloidním roztoku pod vlivem elektrického pole a nedlouho poté byl tento jev popsán i u proteinů ve vodných roztocích. Ve 30. letech 20. století zkonstruoval švédský chemik Arne Tiselius [58] zařízení umožňující rozdělení proteinů krevního séra na základě jejich elektroforetických pohyblivostí. Za tento významný objev byl oceněn Nobelovou cenou v roce 1948 [59]. V polovině 60. let vznikla nová elektroforetická metoda – kapilární izotachoforéza (ITP), která se ukázala vhodnou pro analýzu směsí malých iontů, jak anorganických, tak i organických. Teoretické základy popisu této metody položil Kohlrausch [60] a první praktické pokusy separace látek pomocí ITP byly popsány Kendallem [61,62]. Bouřlivý rozvoj separačních elektromigračních technik nastal v 80. letech s použitím křemenných kapilár v separačním procesu [63, 64]. Účinnost separace v porovnání s velmi rozšířenou kapalinovou chromatografií byla do té doby nevídaná. V současnosti se používají především následující moderní kapilární elektroforetické techniky: zónová elektroforéza (CZE), izotachoforéza (ITP), izoelektrická fokusace (IEF), které mají velmi dobré separační vlastnosti, jako je selektivita, rozlišení a rychlost analýzy. Díky těmto skutečnostem patří elektromigrační metody mezi nejúčinnější separační metody vůbec [65, 66, 67, 68]. Dalšími kapilárními elektromigračními metodami jsou kapilární gelová elektroforéza, která využívá síťová pole polyakrylamidových a agarových gelů, dále bioafinitní elektroforéza v kapilárním uspořádání, elektrokinetická chromatografie a elektrochromatografie [69, 70, 71, 72].
2.2.2.Popis a princip elektromigračních metod Elektromigrační metody patří mezi separační metody, kde dochází k separaci nabitých látek – iontů, molekul, makromolekul i nižších organismů, na jednotlivé složky působením elektrického proudu, procházejícího roztokem elektrolytu. Jednotlivé separované složky vzorku jsou pak vhodným způsobem detekovány. Principem elektromigrační metody je využití rozdílné pohyblivosti nabitých částic ve stejnosměrném elektrickém poli k jejich separaci. Pohyblivost (nebo-li mobilita) nabitých částic závisí na velikosti náboje, velikosti a tvaru molekul, podmínkách separačního prostředí a intenzitě použitého elektrického pole [73]. Obecně se přístroj pro kapilární elektromigrační metodu skládá z elektrodových komůrek, elektrod, kapiláry, místa pro nástřik, zdroje vysokého napětí a detektoru (obr. 5).
17
Obr. 5.Schéma kapilárního separačního zařízení.
Rozlišujeme čtyři základní mody (varianty) elektroforézy: – elektroforéza s pohyblivým rozhraním (MBE) – zónová elektroforéza (CZE) – izotachoforéza (ITP) –
izoelektrická fokusace (IEF) 2.2.2.1. Elektroforéza s pohyblivým rozhraním – MBE
Elektroforéza s pohyblivým rozhraním je nejstarší technikou s diskontinuálním elektrolytovým systémem. Prakticky se pro separaci již nepoužívá, nicméně princip a způsob MBE migrace je ve své podstatě přechodně obsažen na začátku každé separace, ať už se jedná o ITP, CZE nebo IEF, proto je velmi důležité její pochopení. Experimentální uspořádání je analogické frontální metodě v chromatografii. V separačním prostoru je vytvořeno rozhraní mezi dvěma elektrolyty, z nichž jeden obsahuje vzorek a druhý se označuje jako tzv. vedoucí elektrolyt – LE (leading electrolyte). Vedoucí elektrolyt je vybrán tak, aby jeden jeho iont (vedoucí iont) měl stejné nábojové znaménko a větší pohyblivost než separované ionty, jeho druhý iont opačného znaménka, tzv. protiiont migrující proti směru pohybu separovaných látek, zajišťuje elektroneutralitu systému a má většinou i vhodné pufrační účinky.
18
Průchodem elektrického proudu systémem začne vlastní separační proces. Vedoucí iont se začne pohybovat směrem do kapiláry a za ním se začnou vytvářet zóny složek vzorku. Pro N-komponentní směs vzorku se vytvoří N migrujících rozhraní a N zón. Délka jednotlivých zón se v průběhu času zvětšuje. Každá složka vzorku vytvoří zónu, jejíž pořadí, složení a rychlost pohybu jsou dány pořadím pohyblivostí dané složky ve vzorku, složením vzorku a složením vedoucího elektrolytu. Počet látek v zónách se směrem od vedoucího elektrolytu ke vzorku zvětšuje. Pouze nejrychlejší zóna obsahuje samotnou nejrychlejší složku vzorku, každá další zóna obsahuje kromě své složky i všechny složky rychlejší, které touto zónou neustále procházejí do svých vlastních zón. Koncentrace zón se řídí Kohlrauschovou regulační funkcí – tzv. omega funkcí, jejíž hodnota je v průběhu separace konstantní, rozhraní mezi zónami jsou ostrá díky tzv. zaostřujícímu efektu. Metodu můžeme považovat za rovnovážnou, i když délka zón v průběhu separace narůstá, jejich složení zůstává konstantní [73].
Obr. 6. Schéma separace látek elektroforézou s pohyblivým rozhraním.
2.2.2.2. Zónová elektroforéza – CZE
Nejjednodušší elektroforetickou technikou je zónová elektroforéza. Její analogií v chromatografii je eluční metoda, která je nejběžněji používána [73]. CZE je vhodná pro separaci molekul s nábojem (iontů) lišících se svou molekulovou hmotností, tvarem a nábojem [74]. Vzorek migruje v prostředí základního elektrolytu – BGE, jehož složení zaručuje v celé kapiláře konstantní separační podmínky, tj. konstantní koncentraci látek, iontovou sílu, pH a homogenní elektrické pole. Zóny jednotlivých látek migrují konstantní (ale každá svou) rychlostí a postupně se od sebe vzdalují. Zónová rozhraní nejsou ostrá a v průběhu experimentu se rozmývají vlivem difuse [75].
19
Pro separaci je nutné, aby elektivní pohyblivosti, a tím i migrační rychlosti různých látek byly navzájem různé. Toho se docílí vhodnou volbou základního elektrolytu. Separace probíhá tak, že se do kapiláry naplněné základním elektrolytem vnese úzká zóna vzorku. Po vložení napětí mezi konce kapiláry začne protékat elektrický proud a jednotlivé látky vzorku začnou migrovat navzájem různými rychlostmi, a tím se separují. V kapiláře pak látky migrují směrem k detektoru, který je často umístěn přímo na kapiláře. Během jednoho experimentu lze dělit a detekovat oba dva druhy iontů (anionty, kationty) [76]. Kromě elektroforetického pohybu nabitých částic je celý objem roztoku uvnitř kapiláry uváděn do pohybu elektroosmotickým tokem. V kapilárách s nemodifikovaným vnitřním povrchem je tento tok orientován směrem ke katodě a jeho rychlost je relativně vysoká (většinou vyšší než rychlost elektroforetická) a anionty i kationty mohou být analyzovány současně během jednoho experimentu [77]. Koncentrace zón se opět řídí Kohlrauschovou regulační funkcí – tzv. omega funkcí, jejíž hodnota je v průběhu separace konstantní. Díky přítomnosti základního elektrolytu v zóně je výsledná koncentrace složky vzorku v zóně poměrně nízká [73].
Obr. 7.Schéma zónové elektroforetické separace látek.
2.2.2.3. Izotachoforéza – ITP
Izotachoforéza je moderní analytická separační technika. Patří mezi metody s nehomogenním elektrolytovým systémem, chromatografickým analogem této metody je vytěsňovací chromatografie [73]. V ITP je vzorek umístěn mezi dva pomocné elektrolyty – vedoucí elektrolyt (LE) a koncový (TE, tzv. terminating electrolyte) elektrolyt. Po ukončení separace každá zóna obsahuje pouze separovaný ion nebo jeho protiion, který je shodný ve všech zónách, všechny zóny migrují stejnou rychlostí, odtud název izotachoforézy (řecky isos = stejný, tachos = rychlost), stýkají se ostrými rozhraními a postupem času se nerozmývají díky
20
samozaostřujícímu efektu. V jedné analýze jsou separovány pouze složky migrující jedním směrem. Proto u ITP hovoříme o kationtové nebo aniontové separaci. Vedoucí elektrolyt má stejné vlastnosti a jsou na něj kladeny stejné požadavky jako na elektrolyt v MBE, koncový elektrolyt je vybrán tak, aby jeho tzv. koncový iont (stejného znaménka jako separované ionty) měl naopak menší pohyblivost než všechny separované složky vzorku. Průchodem elektrického proudu systémem začne vlastní separační proces. Vedoucí iont se začne pohybovat směrem do kolony a za ním se začnou vytvářet zóny složek vzorku. Pro N-komponentní směs vzorku se vytvoří N zón [75]. Koncentrace zón se rovněž řídí Kohlrauschovou regulační funkcí, jejíž hodnota je v průběhu separace konstantní. Metoda je rovnovážná, rozseparované zóny látek se po dosažení rovnováhy již nemění [73].
Obr. 8.Schéma izotachoforetické separace látek.
2.2.2.4. Izoelektrická fokusace – IEF
Izoelektrická fokusace je elektromigrační metoda s nehomogenním elektrolytovým systémem, metoda má obdobu v chromatografické technice nazvané chromatofokusace [73]. Metodou izoelektrické fokusace se separují tzv. amfolyty. Amfolyt je taková chemická sloučenina, která může existovat v kladné, záporné a neutrální formě v závislosti na pH prostředí, ve kterém se nachází. Amfolyty jsou např. aminokyseliny, peptidy a proteiny. Každý amfolyt má svůj izoelektrický bod, tzv. pI, které se rovná určitému pH, při kterém má amfolyt z makroskopického hlediska nulový náboj, a tudíž
21
se nepohybuje v elektrickém poli. Jestliže je pH prostředí vyšší než je pI amfolytu, převládá jeho záporná forma a v elektrickém poli migruje k anodě. V opačném případě převládá jeho kladná forma a amfolyt migruje ke katodě. Izoelektrická fokusace je založena na migraci amfolytu v pH gradientu. Vzorek je zakoncentrován v oblasti o určitém pH, které odpovídá jeho izoelektrickému bodu – pI. V praxi se gradient vytvoří tak, že se separační kapilára naplní roztokem směsi amfolytů s různými pI (tzv. nosné amfolyty). Průchodem proudu směsí vhodných nosných amfolytů umístěných mezi dvěma krajními elektrolyty anolytem – kyselinou (dávkujícím do kolony H+ ionty) a katolytem – zásadou (dávkujícím do kolony OHionty) se vytváří v separační koloně podélný gradient pH. Po aplikaci vzorku a zapnutí proudu začne směs amfolytů a vzorek migrovat v elektrickém poli. Migrující amfolyty postupně ztrácejí náboj v závislosti na jejich pI a vzniká pH gradient. Dělené látky v tomto prostředí migrují, dokud nedoputují do té části separačního prostředí, jehož pH je rovno jejich pI. Zde budou mít z makroskopického hlediska nulový náboj a migrace se zastaví [78]. Izoelektrická fokusace je jedinou metodou, jejíž separační princip nebyl odvozen z Kohlrauschovy práce. Zónová rozhraní jsou velmi ostrá a časově stabilní. Hodnota funkce omega se v průběhu separačního běhu mění, výsledná koncentrace složky vzorku ve fokusované zóně je ovlivněna přítomností pomocných amfolytů v zóně a rovnováhou mezi sílou difuse a fokusace, je tudíž závislá na vloženém napětí na kolonu [73]. Po dosažení ustáleného stavu je v kapiláře třeba fokusované zóny uvést do pohybu tak, aby prošly detektorem a byly detekovány. K přirozené migraci zón dochází při IEF v křemenných kapilárách s neupraveným vnitřním povrchem v důsledku přítomnosti elektroosmotického toku [79].
Obr. 9.Schéma izoelektrické fokusace látek.
22
2.2.3.Izoelektrická fokusace bez nosných amfolytů (CAF - IEF) Izoelektrická fokusace bez nosných amfolytů CAF-IEF (Carrier Ampholyte FreeIsoelectric Focusing) je separační metoda spojující výhody kapilární ITP a IEF. Stejně jako IEF zvyšuje koncentraci amfolytu, separuje látky podle jejich pI, odstraňuje přebytek neamfolytů, zóny po ukončení separace neopouští separační kapiláru a většinou je nutné mít dostatečný objem separovaného vzorku. S metodou ITP má společné tyto znaky: tvoří ostře ohraničené zóny o konstantním složení, koncentrace v celém objemu každé zóny je stejná a každá ze zón obsahuje mimo jedné složky vzorku jen pomocný (modifikační) elektrolyt. Používá se ve speciálních případech, zvláště pro mikropreparativní účely, kdy se mohou nosné amfolyty vypustit a nahradit dvěma elektrolyty s regulovatelnou hodnotou pH. Ty vytvoří v koloně ostré rozhraní pH, na kterém se amfolyty vzorku zakoncentrují dle jejich pI [80-83]. Metoda je založena na oboustranné regulaci pohybu neutralizačního reakčního rozhraní (dále jen rozhraní), které je tvořeno dvěma elektrolyty (pufry) s různými hodnotami pH [84]. Tyto dva elektrolyty tvoří ostré rozhraní, na kterém dochází k fokusaci amfolytu. Při různých hodnotách pH elektrolytů se rozhraní pohybuje různou rychlostí. Při určité dvojici hodnot pH, odpovídající rovnosti toků H+ a OH– iontů, se pohyb rozhraní zastaví. Regulací pH a rychlosti pohybu rozhraní můžeme dosáhnout stavů, kdy rozhraní stojí, nebo se pohybuje. Stacionární stav o nulové rychlosti je velmi výhodný, jak pro proces kontinuálního dávkování, tak pro fokusaci, předkoncentraci a přečištění vzorku. Nenulového stavu o známé rychlosti pohybu rozhraní se využívá k transportu fokusovaných zón k místu detekce a separace. Výhodou CAF-IEF je nepřítomnost nosných amfolytů, které jsou drahé a tvoří komplexy s analytem, což je nežádoucí pro další analýzu a identifikaci (MALDI-TOF MS) [85]. Experimentálně bylo prokázáno, že CAF-IEF se řídí Kohlraushovou omega funkcí, i když tato funkce není v průběhu fokusace konstantní. 2.2.3.1. Princip regulace pohybu neutralizačního rozhrani CAF-IEF
Základem metody CAF-IEF je regulace velikosti solvolytických toků v kapiláře, což zásadně ovlivňuje složení elektrolytu v kapiláře a rychlost pohybu rozhraní. Změny velikosti solvolytických iontů se dosahuje tak, že část solvolytických toků JS vtékajících do kapiláry z elektrodové komůrky je nahrazena tokem chemicky nereaktivního co-iontu JG (modifikujícím elektrolytem), který migruje stejným směrem – viz obr. 10.
23
Obr. 10.Schéma a výpočet toků v elektrodové komůrce[82].
Velikost solvolytických toků (rovnice r1) je pak přímo úměrná poměru koncentrací solvolytických iontů CS (mol/l) a co-iontů CG a jejich pohyblivostí (mobilit) uS, ug (m2/V.s), dále je také závislá na vodivosti elektrolytu κ (S/cm) a velikosti proudu I (A) – viz rovnice (1), kde k1 je konstanta závislosti [82].
(1) Pro tok libovolného iontu i platí rovnice (2), kde Ii (A) je proud procházející elektrodovou komůrkou, ti je převodové číslo iontu i v roztoku, F je Faradayova konstanta (9,6487 . 104) a zi je náboj iontu (C) [82].
(2) Jsou známy dva způsoby regulace pH elektrolytů, a to pomocí změny poměrů elektrických proudů – elektrická regulace [86], nebo použitím pufrů o konstantním složení, kde požadované změny pro migraci vzorku je dosaženo výměnou elektrolytů v komůrce, popř. přesunutím kapiláry z jedné komůrky obsahující základní elektrolyt do druhé komůrky obsahující elektrolyt modifikující [87]. V obou případech se regulace pohybu rozhraní děje tak, že velikost jednoho solvolytického toku je regulována a velikost druhého solvolytického toku zůstává konstantní. Pro elektrickou regulaci se používá speciální zařízení. Separační kapilára se umístí mezi dva elektrodové bloky. První (startovací) elektrodový blok je složen ze dvou elektrodových komůrek, které jsou navzájem spojeny přes vysokonapěťový zdroj, který dodává elektrický proud do jednotlivých komůrek v určitém poměru. Jedna komůrka obsahuje primární (základní) elektrolyt (BGE) např. 0,01M KCl a druhá obsahuje elektrolyt modifikující např. 0,01M HCl. Druhý elektrodový blok je složen pouze z jedné elektrodové komůrky, která obsahuje BGE. Tento způsob regulace umožňuje
24
ovlivnit složení elektrolytu během samotné analýzy, což je velmi výhodné pro vlastní separaci. Další výhodou je, že nedochází k postupnému vyčerpávání elektrolytů, a tím pádem může být doba fokusace vzorku teoreticky časově neomezena. Nevýhodou je složitější experimentální uspořádání a nutnost použití speciálně upraveného přístroje.
Obr. 11.Schéma a výpočet toků v elektrodové dvojkomůrce pro případ elektrické regulace [82].
Výhodou druhého způsobu regulace (výměnou elektrolytů) je jednoduché experimentální uspořádání a možnost použití komerčně dostupného přístroje, nicméně dochází k postupnému vyčerpávání elektrolytů během analýzy.
2.2.3.2. Neutralizační reakční rozhraní
Neutralizační reakční rozhraní hraje významnou roli v separaci a izolaci látek v pH gradientu a je požadována především jeho ostrost. Pro úspěšnou separaci amfolytů musí mít rozhraní následující vlastnosti: slabé a silné kyseliny a báze procházejí přes pH rozhraní, amfolyty s pI hodnotou v rozmezí pH elektrolytů jsou zachyceny na rozhraní a amfolyty s pI mimo rozmezí procházejí přes rozhraní. Neutralizační rozhraní musí mít stabilní polohu v kapiláře, rozpětí pH skoku musí být regulovatelné a musí být stabilní v čase. Neutralizační rozhraní je charakterizováno těmito vlastnostmi: rozsah pH, rychlost pohybu a časová stabilita.
25
Obr. 12.Schéma toků iontů v koloně tvořících neutralizační rozhraní, v základním elektrolytu KCl. Anoda je nalevo, katoda napravo [80].
2.2.3.3. Rychlost pohybu rozhraní a rovnovážný stav
Rychlost pohybu rozhraní je dána rozdílem velikosti vstupujících solvolytických toků (H+ a OH- iontů) z elektrodových komůrek do kapiláry a samotnou pohyblivostí solvolytických iontů. Znalost rychlosti pohybu rozhraní a možnosti ovlivnění tohoto pohybu je důležitá pro regulaci vlastní migrace a možnosti transportu látek separovaného analytu. Rychlost pohybu rozhraní je možno vyjádřit pomocí kombinace rovnic pro pohyblivé rozhraní každého iontu, např. iontu R. Podobné rovnice platí i pro solvolytické ionty [82].
(3) WR – rychlost pohybu rozhraní iontu R (m3/Q) A, Z – elektrolyty κ – vodivost elektrolytu (S/cm) c – molární koncentrace iontu R v elektrolytu (mol/l) – celková molární koncentrace (mol/l) Jestliže jsou si vstupující solvolytické toky navzájem rovny, je rozhraní v kapiláře ve stacionárním stavu (rovnovážném stavu) a pohyb rozhraní se zastaví.
26
Jh = Joh
V=0
(4)
Nejsou-li solvolytické toky rovny rozhraní se pohybuje ve směru převládajícího solvolytického toku rychlostí, která je úměrná velikosti rozdílů toků od rovnovážného stavu. V = fce (Jh-Joh)
(5)
2.2.3.4. Stabilita reakčního neutralizačního rozhraní
Stabilita neutralizačního rozhraní je dána úbytkem elektrolytu na rozhraní, což je charakteristické pro IEF metody. Pomocí teoretických výpočtů lze tento úbytek vypočítat podle následující rovnice (6) [80].
(6) ΔJC, ΔJK – úbytek toku elektrolytu (mol/s) K, C – ionty elektrolytu (kationt, aniont) JS – solvolytické toky (mol/s) U – pohyblivost iontů (m2/V.s) Úbytek toku elektrolytu, ΔJ, obou jeho iontů K a C je úměrný velikosti solvolytických toků JS a konstantě závislé na pohyblivosti U jednotlivých iontů elektrolytu. Úbytek elektrolytu způsobuje nepříznivé koncentrační změny v kapiláře, které vedou ke zvyšování odporu, teploty a následně k přerušení analýzy. Stabilitu rozhranní v čase je možné spočítat z rychlosti úbytku koncentrace elektrolytu a velikosti difuse. Koncentrační profil úbytku elektrolytu je dán vztahem (7) [80].
(7)
27
CO – původní koncentrace elektrolytu (mol/l) D – difuzní koeficient (m2/s) ΔJ – rozdíl velikosti solvolytických toků (mol/s) T – čas (s) x – šířka rozhraní (m) Po úpravě dostaneme vztah (8) pro výpočet času stability rozhraní v závislosti na původní koncentraci elektrolytu a rozdílu solvolytických toků [80].
(8) t – čas dosažení nulové rychlosti koncentrace elektrolytu (s)
2.2.3.5. Vlastnosti fokusované zóny amfolytu
Vlastnosti zón amfolytů jsou závislé na složení daného amfolytu a dále na vlastnostech elektrolytu tvořícího rozhraní. Je-li rozhraní stacionární, zóny amfolytů se zafokusují na rozhraní a nepohybují se. V opačném případě dochází k pohybu zón. pH zón na rozhraní je rovno pI jednotlivých amfolytů a koncentrace těchto zón je závislá na koncentraci základního elektrolytu (viz obr. 13). Délky zón jsou úměrné koncentraci dávkované látky a době dávkování [88].
28
Obr. 13.Závislost koncentrace fokusované zóny nízkomolekulárního pI markeru na koncentraci základního elektrolytu [88].
29
3.Cíle práce 1. Nalezení vhodného elektrolytového systému pro fokusaci a transport PBP. 2. Prekoncentrace, purifikace a mikropreparace PBP z biologické matrice. 3. Identifikace získaných PBP pomocí MALDI-TOF/TOF hmotnostního spektrometru. 4. Kvantifikace PBP.
30
4.Experimentální část 4.1. Chemikálie allofykocyanin - Sigma–Aldrich Chemical Co. (St. Louis, MO, USA) fykocyanin - Sigma–Aldrich Chemical Co. (St. Louis, MO, USA) fykoerythrin - Sigma–Aldrich Chemical Co. (St. Louis, MO, USA) sérový hovězí albumin - Sigma–Aldrich Chemical Co. (St. Louis, MO, USA) myoglobin z koňského srdce - Sigma–Aldrich Chemical Co. (St. Louis, MO, USA) modelové syntetické nízkomolekulární pI markry - doc. RNDr. Karel Šlais, DrSc. (Ústav analytické chemie, Akademie věd ČR, Brno, ČR) hydroxypropylmethylceluloza (HPMC) – Sigma–Aldrich Chemical Co. (St. Louis, MO, USA) trypsin - Roche Diagnostic (Mannheim, Germany) glycerol – Pliva-Lachema (Brno, ČR) glycin - Aldrich Chemical Co. (St. Louis, MO, USA) akrylamid - Heidelbarg (New York, USA) bisakrylamid (N,N´- methylenbisakryl amid) – Heidelbarg (New York, USA) bromfenolová modř – Penta (Praha, ČR) Coomassie brilliant blue G-250 - Sigma–Aldrich Chemical Co. (St. Louis, MO, USA) 2-merkaptoethanol - Sigma–Aldrich Chemical Co. (St. Louis, MO, USA) peroxodisíran amonný – Sigma–Aldrich Chemical Co. (St. Louis, MO, USA) SDS (dodecylsulfát sodný) – Heidelbarg (New York, USA) TEMED (N,N,N´,N´ - tetramethylethylen diamin) – Heidelbarg (New York, USA) standardy pro Mr – Sigma–Aldrich Chemical Co. (St. Louis, MO, USA) ostatní chemikálie čistoty p.a. – Pliva-Lachema (Brno, ČR)
31
4.2. Použité přístroje Laminární box: (Holten LaminAir A/S, Allerod, Dánsko) Autokláv: Tuttnauer 3870 EA (RPI, Replacement Parts Industries, Inc., Van Nuys, CA, USA) Laboratorní vibrační mlýn: VIBROM 2S (Jebavý, Třebechovice, ČR) Centrifuga: MPW – 350 R High Speed Brushless Centrifuge (MPW MED.INSTRUMENTS, Varšava, PL) Ultrazvuková lázeň: K5 (Kraintex, SR) Izotachoforetický analyzátor: CS Isotachophoretic analyser (Ústav radioekologie a využití jaderné techniky, Spišská Nová Ves, SK) Hmotnostní spektrofotometr: MALDI TOF/TOF - 4700 Proteomics Analyzer vybavený lineárním detektorem, (Applied Biosystems, Framinghem, MA, USA) Gelová elektroforéza: Mini-PROTEAN 3 Cell (Bio-Rad Laboratories, Herkules, CA, USA) Spektrofotometr: NanoDrop ND – 1000 (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE, USA) Spektrofotometr: HELIOS β (Spectronic Unican Co., Cambridge, GB) Pipetové špičky ZipTip C18: Millipore (Billerica, MA, USA)
32
4.3. Biologický materiál Kultury červené řasy Porphyridium cruentum byly získány ze sbírky autotrofních organismů Botanického ústavu Akademie věd ČR v Třeboni jako předkultivovaná inokula o objemu 0,5 l. Sinice Anabaena doliolum byla získána v lyofilizované formě od prof. Mgr. Bořivoje Klejduse, Ph.D. Použité organismy: ANABAENA DOLIOLUM Imperium: Prokarya Říše: Bacterie (Bacteria) Oddělení: Sinice/cyanobakterie (Cyanobacteria) Řád: Nostocales Rod: Anabaena
Obr. 14.Anabaena doliolum.
PORPHYRIDIUM CRUENTUM Imperium: Eukaria Říše: Rostliny (Plantae) Podříše: Biliphyta Oddělení: Ruduchy (Rhodophyta) Třída: Bangiophyceae Řád: Bangiales Rod: Porphyridium
Obr. 15.Porphyridium cruentum.
33
4.4. Metody kultivace, sklizně a extrakce 4.4.1.Složení a příprava kultivačního média pro Porphyridium cruentum Medium pro P. cruentum Bylo smícháno 1000 ml roztoku 1 s 0,5 ml roztoku 2 a 0,5 ml roztoku 3. Médium bylo autoklávováno. Roztok 1 (1000 ml)
Roztok 2 (250 ml)
KCl
4,00 g
Fe-EDTA
4,6 g
NaCl
3,13 g
Roztok 3 (1000 ml)
KNO3
1,24 g
H3BO3
3,09 mg
MgSO4
2,50 g
MnSO4.4H2O
1,20 mg
K2HPO4
0,66 g
CoSO4.7H2O
1,40 mg
Ca(NO3)2
0,17 g
CuSO4.5H2O
1,24 mg
KI
0,05 g
ZnSO4.7H2O
1,43 mg
KBr
0,05 g
(NH4)6Mo7O24.4H2O
1,84 mg
Tab.1.Složení kultivačního média pro Porphyridium cruentum (BRODY & EMERSON (1959): modif. PEKÁRKOVÁ (p.c.)) [89].
4.4.2.Kultivace a sklizeň Předkultivované buňky P. cruentum byly dále kultivovány v Erlenmayerových baňkách s širokým hrdlem v laboratoři za laboratorní teploty. Asi po měsíci byly kultury pasážovány do čerstvého média. Po dostatečné kultivaci byly buňky sklízeny. Čiré médium nad biomasou bylo slito a buněčný sediment se odstředil při 18 000 g. K úplnému odstranění kultivačního média z buněk byl pelet po centrifugaci rozsuspendován v destilované vodě a opět centrifugován. Tento postup se opakoval dvakrát. Obr. 16.Kultura Porphyridium cruentrum.
34
4.5. Extrakce PBP Byly použity dvě extrakční techniky pro extrakci PBP z buněk: a) extrakce biomasy v ultrazvukové lázni b) rozrušení biomasy pomocí kryogenního mletí ad a) Lyofilizovaná sinice A. doliolum byla rozsuspendována v destilované vodě. Suspenze byla na 30 min. vložena do ultrazvukové lázně, kde došlo k rozrušení buněčných membrán a vylití buněčného obsahu. Poté byla suspenze centrifugována při 24 000 g a modrý supernatant (extrakt) byl oddělen od peletu a použit pro separaci PBP. Zbylá biomasa byla rozsuspendována v destilované vodě a použita k další extrakci. Opět byla vložena do ultrazvukové lázně a poté z důvodů účinnější extrakce nechána přes noc v lednici. Pak byla centrifugována při 24 000 g a extrakt byl použit pro další analýzu. ad b) Pro čerstvou biomasu červené řasy P. cruentum nebyla extrakce v ultrazvukové lázni dostačující, proto byla použita technika kryogenního mletí. Odcentrifugovaná biomasa byla zmražena tekutým dusíkem v mlecí misce s mlecí koulí. Miska byla uzavřena, upevněna rychloupínací kovovou obručí a poté byl vzorek mlet po dobu cca 10 min. Vzorek byl z misky vypláchnut destilovanou vodou, vložen do lednice a extrahován přes noc. Druhý den byl vzorek centrifugován při 24 000 g a extrakt byl dále analyzován.
4.6. CAF-IEF 4.6.1.Měření rychlosti pohybu rozhraní a fokusace modelových amfolytů K měření rychlosti pohybu rozhraní různých elektrolytových systémů a k fokusaci modelových nízkomolekulárních pI markerů a myoglobinu byl použit přístroj CS Isotachophoretic Analyser (obr. 17). Přístroj má především analytické využití pro analýzu aniontů i kationtů ve vodných prostředích, avšak přípustná jsou i prostředí směsná (voda – alkohol). Přístroj je dvoukolonový s teflonovou kapilárou. Vzorek lze vnášet buď dávkovacím kohoutem nebo stříkačkou. Detekce je vodivostní s výstupem funkčním i derivačním. Pracovní proud je max. 500 µA. Zdroj je vybaven přepěťovou ochranou nastavitelnou v rozmezí 6-16 kV. Pro naše účely byla používána pouze první kolona.
35
Obr. 17.CS Izotachoforetic Analyser: Terminátorový blok (T), Dávkovací kohout (K), Septum (S), Teflonová separační kapilára (C1), Detekční cela pomocného detektoru (D1), Rozdělovací blok (R), Pomocná elektroda (P), Analytická kapilára (C2), Detekční cela (D2), Blok cílové elektrody (L) [75].
4.6.1.1. Mikropreparace fykobiliproteinů
K mikropreparace PBP byl použit upravený přístroj CS Isotachophoretic Analyser (obr. 18). Vzhledem k tomu, že původně je analyzátor určen pouze pro analýzu, musel být pro účely separace upraven. Teflonová kapilára byla rozstřižena a její jedna část byla nahrazena kapilárou většího průměru tak, aby bylo možné kapiláry navzájem spojit. Tím vzniklo místo, kde po ukončení separace byla zóna PBP z kapiláry vyjmuta pomocí injekční stříkačky.
36
Obr. 18.Schéma upraveného přístroje CS Izotachoforetic Analyser: Zdroj vysokého napětí (HV), Terminátorový blok (terminátorová komůrka) (T), Blok cílové elektrody (L), Dávkovací kohout (V), Teflonová separační kapilára (C), Místo spojených kapilár (S), pro odběr injekční stříkačkou.
4.7. Gelová elektroforéza v polyakrylamidovém gelu (1-D SDS PAGE) K dělení vzorku získaného metodou CAF-IEF byla použita diskontinuální gelová elektroforéza 1-D SDS-PAGE. Zásobní roztoky a pufry: akrylamid – bisakrylamid (30 : 0,8) 30 g akrylamidu a 0,8 g bisakrylamidu se rozpustilo ve 100 ml destilované vody, zfiltrovalo a uchovalo v tmavé láhvi při 4°C. Pufry: vzorkový
- 3,55 ml dest. vody, 1,25 ml 0,5 M Tris-HCl, pH 6,8, 2,5 ml glycerolu, 2,0 ml 10% SDS, 0,2 ml 0,5% bromfenolové modři
37
Před použitím bylo přidáno 50 μl 2-merkaptoethanolu do 950 μl vzorkového pufru. Vzorek se zředil v poměru 1:2 vzorkovým pufrem a zahřál na 95°C po dobu 4 min. koncentrační
- 1,5 M Tris-HCl (pH 6,8)
separační
- 0,5 M Tris-HCl (pH 8,8)
elektrodový pufr (10 x koncentrovaný), pH 8,3 - 30,3 g Tris – base, 144 g glycinu, 10g SDS Po rozpuštění byl vzorek doplněn na 1000 ml destilovanou vodou. Gely: separační
- 3,4 ml dest. vody, 4 ml akrylamidu (akrylamid-bisakrylamid 30: 0,8), 2,5 ml separačního pufru, 0,1 ml 10% SDS, 50 µl 10% persíranu amonného, 5 µl TEMED
koncentrační - 5,4 ml H2O, 2 ml 30% akryamidu, 2,5 ml koncentračního pufru, 0,1 ml 10% SDS, 50 µl 10% persíranu amonného, 5 µl TEMED Elektroforéza byla prováděna v 6% koncentračním polyakrylamidovém gelu a 12% separačním gelu za použití SDS - diskontinuálního systému podle Laemliho [90] při napětí 120 V po dobu 1,5 - 2 h. Gel byl obarven Coomassie brilliant blue a oskenován.
4.8. MALDI-TOF/TOF MS 4.8.1.Příprava vzorku pro hmotnostní spektrometrii po separaci na 1-D gelu Jednotlivé skvrny (proužky) PBP byly z gelu vyříznuty a podrobeny enzymatickému štěpení. Nejprve byly vyříznuté kousky gelu odbarveny roztokem acetonitril / voda (1:1, 2 x 15 min) a dále roztokem acetonitril / 0,1 M NH 4HCO3 (1:1, 20 min). Bílkoviny byly redukovány 10 mM dithiothreitolem a následně alkylovány 55 mM iodoacetamidem. K enzymatickému štěpení bílkovin byl použit trypsin (12,5 ng/μl trypsinu v 50 mM NH4HCO3). Enzymatické štěpení probíhalo při teplotě 37 °C po dobu 18 h. Výsledné peptidy byly z gelu extrahovány roztokem acetonitril / 25 mM NH4HCO3 (1:1, 30 min) a 5% kyselinou mravenčí (2 x 15 min), extrakty byly spojeny a vysušeny na vakuové odparce. Pro hmotnostněspektrometrickou analýzu byly vysušené vzorky peptidů rozpuštěny v 15 μl 0,1% kyseliny trifluoroctové a následně přečištěny pomocí ZipTip pipetových špiček C18 [91, 92].
38
4.8.2.Příprava vzorku pro hmotnostní spektrometrii po separaci metodou CAF-IEF Zafokusovaná zóna PBP byla podrobena enzymatickému štěpení trypsinem. Vzorek byl redukován a alkylován podobným způsobem jako v případě štěpení v gelu. Na štěpení se použil trypsin o koncentraci 25 ng/μl trypsinu v 50 mM NH4HCO3 a štěpení probíhalo při teplotě 37 °C po dobu 18 h. Vzorky byly přečištěny pomocí ZipTip pipetových špiček C18.
4.8.3.Hmotnostní analýza na MALDI-TOF/TOF MS a MS/MS Hmotnostní spektra byla měřena na hmotnostním spektrometru MALDI TOF/TOF. Kolizní plyn byl argon. Jako matrice byla použita kyselina α-kyano4-hydroxyskořicová (6 mg/ml v roztoku acetonitril / 0,1% kyselina trifluorooctová, 1:1). Vzorek byl smíchán s matricí přímo na destičce v poměru 1:1.
4.9. UV-Vis spektrofotometrie Pro stanovení čistoty PBP a stanovení jejich koncentrace jak v surovém extraktu, tak ve vzorku získaném metodou CAF-IEF byl použit spektrofotometrický přístroj NanoDrop ND – 1000. Přístroj je určen pro měření velmi malých objemů (1-5 μl), což byla hlavní podmínka pro výběr vhodného spektrofotometru.
39
5.Výsledky a diskuse 5.1. Výběr elektrolytového systému Výběr vhodného elektrolytového systému se řídí několika podmínkami, jako jsou: snadná regulovatelnost, rychlost provedení regulační změny, zajištění korektní migrace látek vzhledem k rychlosti pohybu rozhraní. Rychlost pohybu rozhraní je dána rozdílem velikostí vstupujících solvolytických toků do kapiláry a pohyblivostí solvolytických iontů. Znalost rychlosti pohybu rozhraní a možnost její regulace je důležitá pro ovlivnění migrace a transportu látek. Pro zajištění korektní migrace analytu (amfolytu) při transportu je důležité znát rychlost pohybu rozhraní v závislosti na složení elektrolytu. Rychlost pohybu rozhraní (jeho efektivní pohyblivost) nesmí přesáhnout hodnotu efektivní pohyblivosti amfolytu v pohybující se zóně. Migrační rychlost byla sledována pomocí pohybu rozhraní dvou elektrolytů o různém pH v separační kapiláře o průměru 0.5 mm. Protože nebyl k dispozici speciálně upravený přístroj umožňující elektrickou regulaci pohybu rozhraní, musel být pohyb rozhraní regulován výměnou elektrolytů v terminátorové komůrce. Terminátorový blok (T) byl naplněn koncovým elektrolytem - TE (terminátor) nebo elektrolytem dávkovacím - DE a pomocný blok (P) s blokem cílové elektrody (L) byl naplněn vedoucím elektrolytem – LE (leading) s přídavkem bromthymolové modři pro snadnou identifikaci rozhraní. Po nastavení vhodného proudu 200 µA a zapnutí přístroje byl měřen čas pohybu rozhraní. Předmětem měření bylo několik elektrolytových systémů - viz tabulka 2, obr. 19. pK jednotlivých kyselin a hydroxidu uvádí tabulka 3. Vedoucí elektrolyt vždy obsahoval 0. 1 mM bromthymolovou modř pro zviditelnění rozhraní. Koncentrace NH4+ solí v koncovém – dávkovacím elektrolytu se měnily v rozmezí od 0 M do 8,5 mM. Se stoupající koncentraci NH4+ soli v dávkovacím elektrolytu se migrace zpomalovala, až zcela ustala. Nulové migrace bylo následně využito pro proces kontinuálního dávkování vzorku amfolytu, pro jeho prekoncentraci a fokusaci.
40
Vedoucí elektrolyt (L)
Dávkovací elektrolyt (T)
0.01M NH4OH, 0.01M NH4COOH, pH 9,4
0,01M CH3COOH; x M NH4COOH
0.02M NH4OH, 0.01M NH4COOH, pH 9.7
0,01M CH3COOH; x M NH4COOH
0.01M NH4OH, 0.01M (NH4)3PO4, pH 9.6
0.01M H3PO4, x M (NH4)3PO4
0.01M NH4OH, 0.01M (NH4)2H4C4O6, pH 9.2
0,01M H6C4O6, x M (NH4)2H4C4O6
0.01M NH4OH, 0.01M (NH4)2H4C4O4, pH 8.9
0,01M H6C4O4, x M (NH4)2H4C4O4
0.01M NH4OH, 0.01M (NH4)2C2O4, pH 9.4
0,01M H2C2O4, x M (NH4)2C2O4
0,01M CH3COOH, 0,01M NH4COOH, pH 4.40.01M NH4OH, x M NH4COOH
Tab.2.Elektrolytové systémy, x – hodnoty koncentrací NH4+ solí v rozmezí od 0 M do 0.0085 M.
Sloučenina
pK1
pK2
pK3
Kyselina octová
4.75
Kyselina trihydrogenfosforečná
2.16
7.21
12.32
Kyselina jantarová
4.21
5.64
Kyselina vinná
2.98
4.34
Kyselina šťavelová
1.23
4.19
Hydroxid amonný
9.53
41
Tab.3.Tabulka 2: pK kyselin a hydroxidu.
Obr. 19. Graf závislosti rychlosti neutralizačního reakčního rozhraní v závislosti na koncentraci soli v 0.01M roztoku dávkovacího elektrolytu.
5.2. Dávkovací proces a proces fokusace Obecně se mikropreparace amfolytů skládá ze dvou kroků: 1. Krok - dávkování (fokusace amfolytů) 2. Krok - transport zón amfolytů. V první kroku dochází k tzv. procesu dávkování vzorku (amfolytu). Dávkovací elektrolyt, jehož součástí je i analyt, se vloží do terminátorové komůrky a proces
42
dávkování se zahájí zapnutím elektrického proudu. Po určité době se dávkovací proces přeruší a dávkovací elektrolyt se vymění za terminátorový elektrolyt. V případě speciálně upraveného přístroje s možností elektrické regulace rychlosti pohybu rozhraní bychom získali tzv. nekonečný (nevyčerpatelný) elektrolyt a proces dávkování by mohl být prakticky nekonečný, avšak tento přístroj nebyl k dispozici. V druhém mikropreparačnímu kroku jsou transportovány do místa detekce a odběru vzorku.
zafokusováné
zóny
analytu
Pro mikropreparaci analytu (PBP: C-PC, APC, B-PE) byl zvolen kationtový směr migrace. Vzorek byl dávkován z kyselého pH. Aniontový směr migrace je pro tento proces možný také, ale uplatňují se při něm nepříznivé vlivy absorbovaného CO2, které způsobují rozmývání zón. Pro další analýzu byl vybrán tento elektrolytový systém: LE - 0,01M NH4CH3COO, 0,01M NH4OH, pH 9,4 s přídavkem 0,1% HMPC pro zvýšení viskozity elektrolytu, DE – 0,01M CH3COOH, 0,003M NH4CH3COO, pH 4,2. TE - 0,01M CH3COOH, pH 3,8. Navržený systém měl vhodné rozmezí pH rozhraní pro fokusaci PBP (4,2 – 9,4) a pH dávkovacího elektrolytu bylo vhodné pro fokusaci PBP. Při nižším pH dávkovacího elektrolytu (cca 3) dochází ke srážení PBP.
5.2.1.Fokusace s nízkomolekularními pI markery a myoglobinem Jako modelové vzorky pro ověření správného výběru elektrolytového systému pro fokusaci PBP byly použity nízkomolekulární pI markery (4,7, 5,7, 7,4, 7,9) o koncentrací 1 - 5 mg/ml a myoglobin o koncentraci cca 20 mg/ml. Jako optimální byl zvolen proud 200 μA. Popis použitého elektrolytového systému uvádí předešlá kapitola. Na obrázku 20 vidíme tři zafokusované zóny. Dávkovací elektrolyt obsahoval 2 nízkomolekulární pI markery 5,7 a 7,9 a myoglobin pI 7,4. Navržena doba dávkování byla 60-80 min. Optimální doba fokusace byla 60 min. Při delší době dávkování docházelo k vyčerpání elektrolytů a k pohybu rozhraní již v dávkovacím kroku, což je nežádoucí (dochází k rozmývání zón a k nekorektní migraci zón). Na obrázku 20 lze vidět, že fokusované zóny mají ostrá rozhraní a jsou postupně seřazeny dle svých pI, což svědčí o korektnosti migrace a vhodném výběru elektrolytového systému.
43
Obr. 20.Zafokusované zóny nízkomolekulárních pI markerů
5.2.2.Mikropreparace fykobiliproteinů Pro mikropreparaci PBP bylo použito 3 ml extraktu. Optimální proud byl 200 μA. Doba dávkování byla 60 min. Doba preparace byla cca 30 min. Na analýzu byl použit stejný elekrolytový systém jako u modelových nízkomolekulárních pI markerů a myoglobinu. Stejné podmínky a elektrolytový systém byl použit pro mikropreparaci nejen C-fykocyaninu a allofykocyaninu (C-PC, APC) z A. doliolum, ale i B-fykoerythrinu (B-PE) z P. cruentum. Původně se plánovalo, že extrakt PBP bude fokusován spolu s nízkomolekulárními pI markery. Proto byl nejdříve vzorek mikropreparován na neupraveném izotachoforetickém přístroji společně s nízkomolekulárními pI markery. Výsledná fokusace je na obrázku 21. Zóny mají ostrá rozhraní a jsou postupně seřazeny dle svých pI, což potvrzuje korektnost migrace jednotlivých látek a vhodný výběr elektrolytového systému. Z hodnot pI jednotlivých nízkomolekulárních pI markerů lze odhadnout hodnotu pI fokusovaných PBP (C-PC a APC), pI je v rozmezí hodnot 4,7 – 7.4.
44
Obr. 21.Zafokusované zóny nízkomolekulárních pI markerů a fykobiliproteinů.
Avšak při použití upraveného izotachoretického přístroje s širší separační kapilárou (0,8 mm), za účelem možného odebrání vzorku injekční stříkačkou, fokusace neprobíhala optimálně. Zde nedocházelo ke korektní migraci zón. Zóny byly rozmyté a vzájemně se mísily. Z toho důvodu se od použití nízkomolekulárních pI markerů upustilo. V prvním mikropreparačním kroku byl z extraktu vytvořen dávkovací elektrolyt. Do extraktu byl přidán 1 M NH4CH3COO tak, aby jeho výsledná koncentrace v extraktu byla 0,01M. Následně bylo upraveno pH extraktu pomocí 1M CH3COOH na hodnotu 4,2 čímž vznikl dávkovací elektrolyt. Extrakt z P. cruentum bylo nutné upravovat velmi citlivě, neboť při nižším pH docházelo k vysrážení proteinu. Dávkovací elektrolyt se aplikoval do terminátorové komůrky a zahájil se proces dávkování. Ve druhém kroku byla zafokusovaná zóna PBP transportována. Dávkovací elektrolyt byl vyměněn za terminátorový elektrolyt (0.01M CH3COOH, pH 3,8) a PBP byly transportovány do místa spojených kapilár, kde byly sbírány pomocí injekční stříkačky. Množství odebraného vzorku bylo cca 5 μl. Odebírání vzorku vyžadovalo zručnost a zkušenost.
45
Zafokusovaná zóna C-PC a APC je na obrázku 22 a zóna B-fykoerythrinu na obrázku 23. Zóny jsou poměrně ostré a nerozmyté. Následné analýzy vzorků prokázaly, že mikropreparace PBP byla úspěšná. Odebrané vzorky byly dále analyzovány pomocí gelové elektroforézy SDS-PAGE, MALDI-TOF MS a UV-Vis spektrofotometrie.
Obr. 22.Zafokusovaná zóna C-fykokyaninu a allofykocyaninu.
Obr. 23.Zafokusovaná zóna B-fykoerythrinu.
46
5.2.3.Stabilita PBP při různé teplotě uchovávání Z důvodů možností uchovávání a zpracování extraktů byla sledována jejich stabilita v čase při laboratorní teplotě a teplotě 3 – 8 °C (teplota v lednici). Extrakty se měřily na spektrofotometru HELIOS β Spectronic Unican. Stabilita se měřila při λmax 650 nm (extrakt z A. doliolum) a λmax 545 nm (extrakt z P. cruentum). Naměřené závislosti jsou na obrázcích 24 a 25. Měření ukázala, že při laboratorní teplotě dochází k rychlému rozpadu proteinu. V případě uchovávání extraktů v lednici je maximální doba skladování dva dny. Zmrazený extrakt může být několikrát rozmražen a opět zmražen - viz obrázek 26. Nejlepší alternativou je získaný extrakt ihned zpracovat nebo zmrazit.
1 0,9 0,8 Absorbance
0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 0
1
2
3
4 Počet dnů
5
6
7
8
Teplota 3 - 8°C Lab. teplota
Obr. 24.Stabilita extraktu B-PE z P. cruentum v čase za laboratorní teploty a v lednici (3 – 8°C)
47
1,4 1,2
Absorbance
1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 0
1
2
3
4
5
6
7
Teplota 3 - 8°C
Počet dnů
Leboratorní teplota
Obr. 25.Stabilita extraktu PBP (C-PC a APC) A. doliolum v čase za laboratorní teploty a v lednici (3 – 8 °C).
1,4 1,2
Absorbance
1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 0
1
2
3
4
5
6
Počet dnů
Obr. 26.Stabilita PBP (C-PC a APC) z A. doliolum při zmrazování a rozmrazování extraktu.
48
7
5.2.4.Gelová elektroforéza (1-D SDS PAGE) Vzorek po CAF-IEF byl dále analyzován metodou 1-D SDS PAGE. Tato metoda je nejčastěji používána pro separaci a přípravu proteinů pro MALDI MS. Bylo zajímavé porovnat výsledky z MALDI-TOF/TOF MS získané z analýzy vzorku touto metodou a výsledky z metody CAF-IEF. Na gelu, viz obrázek 27, byly vzorky separovány v redukujícím prostředí. V dráze A, B se vzorkem analyzovaným metodou CAF-IEF je vidět, že v porovnání s dráhou surového extraktu (dráha C, D) došlo k výraznému zakoncentrování proteinů o molekulových hmotnostech 18 - 17 kDa. Nicméně tyto proteiny nebyly zcela přečištěny a také samotná separace na gelu nebyla kvantitativní. Jednotlivé proteiny C-PC a APC a jejich podjednotky α a β nebyly od sebe dostatečně oddělené, což se dalo vzhledem k velmi podobným molekulovým hmotnostem jednotlivých podjednotek předpokládat. Nedostatečnou separaci na gelu prokázala i pozdější analýza na MALDI TOF/TOF MS.
Obr. 27.1-D SDS PAGE pro PBP (C-PC a APC) ze sinice A. doliolum pro vzorky v redukujícím prostředí barvený Coomassie brilliant blue: dráha A, B - zafokusovaná zóna metodou CAF IEF, dráha C, D - surový extrakt.
49
5.2.5.Identifikace pomoci MALDI-TOF/TOF MS Pro jednoznačnou identifikaci proteinů byla použita MALDI hmotnostní spektrometrie. K tomuto účelu byly analyzovány jak vzorky po separaci pomocí 1-D SDS PAGE v případě A. doliolum, tak i vzorky po CAF-IEF u A. doliolum a P. cruentum. Nejprve byla u vzorku získaném po CAF-IEF naměřena spektra intaktních bílkovin, neboť analýza bílkovinných směsí založená na tomto principu je velmi rychlá. Pro MALDI analýzu intaktních bílkovin byly použity tři různé matrice: 2,6–dihydroxyacetofenon, kyselina sinapová a kyselina 2,5–dihydroxybenzoová. Jedinou vhodnou matricí se ukázala být kyselina sinapová. Nicméně naměřená spektra nebyla příliš kvalitní, a z tohoto důvodu nejsou v práci uvedena. K jednoznačné identifikaci bylo nutné použít proteomickou analýzu zahrnující enzymatické štěpení separovaných bílkovin, hmotnostní spektrometrii a bioinformatiku. Po enzymatickém štěpení byly výsledné peptidy dále analyzovány hmotnostním spektrometrem MALDI TOF/TOF, a to jak v MS, tak v MS/MS modu. Následně bylo provedeno vyhodnocení naměřených dat pomocí databázového vyhledávacího programu MASCOT. Vzorky byly z gelu vyříznuty a enzymaticky štěpeny trypsinem, podobně jako vzorky po CAF-IEF. Jako matrice pro MALDI analýzy byla použita kyselina α-kyano-4hydroxyskořicová. Vzorky byly před vlastní MALDI analýzou přečištěny pomocí ZipTip pipetových špiček C18 a spolu s matricí naneseny na MALDI destičku. Nejprve byla změřena MS spektra (tzv. peptide mass fingerprinting PMF). Dále byly jednotlivé peptidy analyzovány pomocí tandemové hmotnostní spektrometrie (MS/MS). Naměřená spektra a identifikované proteiny jsou uvedeny na obrázcích 28 – 35 a v tabulce 4. K vyhodnocení spekter byl použit program MASCOT s proteinovou databází Swiss-Prot. Na základě MS/MS spekter byla jednoznačně potvrzena identifikace PBP, a to jak ve vzorcích po CAF-IEF, tak ve vzorcích z gelu. Ve vzorcích přečištěných pomocí CAF-IEF byly identifikovány α a β podjednotky allofykocyaninu a C-fykocyaninu u sinice A. doliolum a α a β podjednotky B-fykoerythrinu u P. cruentum.
50
Organismus
Metoda separace
1D-SDS PAGE vrchní proužek
A. doliolum
1D-SDS PAGE spodní proužek
CAF-IEF (roztok)
P.cruentum
CAF-IEF (roztok)
Identifikované proteiny MS/MS)
(MS,
Molekulová hmotnost (Da)
C-fykocyanin α podjednotka
17 504
C-fykocyanin β podjednotka
18 546
Allofykocyanin α podjednotka
17 392
Allofykocyanin β podjednotka
17 351
Allofykocyanin β podjednotka
17 351
C-fykocyanin α podjednotka
17 504
C-fykocyanin β podjednotka
18 546
Allofykocyanin α podjednotka
17 392
Allofykocyanin β podjednotka
17 351
B-fykoerythrin α podjednotka
17 977
B-fykoerythrin β podjednotka
18 884
Tab.4.PBP proteiny nalezené v gelu i v roztoku.
Obr. 28.MALDI-TOF/TOF hmotnostní spektrum trypsinového digestu vrchního proužku 1- D SDS PAGE A. doliolum
51
Obr. 29.MALDI-TOF/TOF hmotnostní spektrum trypsinového digestu spodního proužku 1-D SDS PAGE A. doliolum
Obr. 30.MALDI-TOF/TOF hmotnostní spektrum trypsinového digestu vzorku PBP získaného metodou CAF-IEF z A. doliolum.
52
Obr. 31.MALDI-TOF/TOF hmotnostní spektrum trypsinového digestu vzorku B-PE získaného metodou CAF-IEF z P. cruentum.
Obr. 32.MS/MS analýza protonovaného peptidu LIDGATQAVYQKFPYTTQTPGPQFAADSR (m/z 3171 Da) měřená na MALDI-TOF/TOF hmotnostním spektru vrchního proužku 1-D SDS PAGE z A. doliolum .
53
Obr. 33.MS/MS analýza protonovaného peptidu AQDAITAVINSADVQGK (m/z 1700 Da) měřená na MALDI-TOF/TOF hmotnostním spektru spodního proužku 1-D SDS PAGE A. doliolum
Obr. 34.MS/MS analýza protonovaného peptidu VKTPITEAIAAADTQGR (m/z 1741 Da) měřená na MALDI-TOF/TOF hmotnostním spektru vzorku získaného metodou CAF-IEF z A. doliolum
54
Obr. 35.MS/MS analýza protonovaného peptidu FPSNSDLESIQGNIQR (m/z 1804 Da) měřená na MALDI-TOF/TOF hmotnostním spektru vzorku získaného metodou CAF-IEF z P. cruentum.
55
5.2.6.Kvantifikace PBP K určení čistoty, koncentrace, výtěžku jednotlivých PBP a ke stanovení celkové koncentrace bílkoviny u surového extraktu a vzorku přečištěného pomocí metody CAFIEF byl použit spektrofotometr NanoDrop ND – 1000. Přístroj je určen k měření velmi malých objemů 1-5 μl. K měření bylo použito 2 - 3 μl vzorku, rozsah vlnových délek byl 250 – 700 nm. Naměřená spektra PBP jsou na obrázcích 36 a 37. Pomocí hodnoty poměru absorbancí A620/A280 (C-PC), A650/A280 (APC) [93] a A545/A280 (B-PE) [94] byla stanovena čistota jednotlivých PBP. Výsledky jsou shrnuty v tabulkách 5 a 6. C-PC byl zkoncentrován asi desetkrát, APC devětkrát a B-PE sedmkrát. Naměřená absorpční maxima odpovídají absorpčním maximům jednotlivým proteinů (viz teoretická část). V případě C-PC je λmax 620 nm a u B-PE λmax 545 nm. V případě vzorku z A. doliolum se píky C-PC a APC překrývají. Koncentrace PBP a celkové koncentrace bílkovin byly stanoveny pomocí kalibračních křivek, viz obrázky 38 - 40. Výsledky shrnují tabulky 5 a 6. Jako standard pro stanovení celkové bílkoviny byl použit sérový hovězí albumin (ABS). Poměr vlnových délek surového extraktu C-PC byl 0,124 a v případě B-PE 0,388, což naznačuje, že samotná extrakce PBP nebyla příliš úspěšná. Nicméně optimalizace extrakce nebyla cílem této práce.
Obr. 36.Naměřená absorpční spektra C- fykocyaninu a allofykocyaninu.
56
Obr. 37.Naměřená absorpční spektra B- fykoerythrinu.
Vzorek
A620/A280 C-PC
A650/A280 APC
Surový
0.124
0.054
extrakt
± 0.006
± 0.002
1.29
0.479
± 0.144
± 0.052
Vzorek po CAFIEF
Koncentrace C-PC
Koncentrace APC
[mg*ml-1]
[mg*ml-1]
0.56 ± 0.06
0.32 ± 0.02
5.75 ± 0.52
1.23 ± 0.10
Celkový
Výtežek
Výtěžek
protein [mg*ml-1]
C-PC
APC
[%]
[%]
11.4
4.92
2.74
± 0.98
± 0.49
± 0.17
10.8
52.9
11.3
± 0.93
± 4.82
± 0.90
Tab.5.Kvantifikační tabulka C-fykocyaninu a allofykocyaninu.
57
Vzorek
A545/A280
Koncentrace
Celkový
Výtěžek
B-PE
B-PE
protein
B-PE
[mg*ml-1]
[mg*ml-1]
[%]
0.388 ± 0.01
0.48 ± 0.01
3.86 ± 0.33
12.4 ± 0.11
2.51 ± 0.13
1.85 ± 0.04
3.51 ± 0.30
52.7 ± 0.10
Surový extrakt Vzorek po CAF-IEF
Tab.6.Kvantifikační tabulka B-fykoerythrinu.
0,25
Absorbance
0,2
0,15
0,1
y = 0,0555x + 7E-17 R2 = 0,9993
0,05
0 0
0,5
1
1,5
2
2,5
Konce ntrace (m g/m l)
Obr. 38.Kalibrační přímka ABS.
58
3
3,5
4
4,5
1,2 1 y = 0,375x - 0,0113 R 2 = 0,9876
Absorbance
0,8 0,6
APC
y = 0,1593x - 0,0037
C-PC
R 2 = 0,9969
0,4 0,2 0 0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
-0,2 Koncentrace (mg/ml)
Obr. 39.Kalibrační přímky allofykocyaninu a C-fykocyaninu.
0,9 0,8 0,7
Absorbance
0,6 0,5 y = 0,2983x - 0,0604
0,4
R 2 = 0,9988
0,3 0,2 0,1 0 0
0,5
1
1,5
2
2,5
Koncentrace B-PE (mg/ml)
Obr. 40.Kalibrační přímka B-fykoerythrinu.
59
3
3,5
6.Závěr Tato práce se zabývá možností využití izoelektrické fokusace bez nosných amfolytů (CAF-IEF) pro přípravu vzorků proteinů pro MALDI-TOF hmotnostní spektrometrii. Pro úspěšné splnění daných cílů práce byl důležitý výběr vhodného analytu. Bylo nutné brát ohledy na možnosti separační metody CAF-IEF a vizuální detekce. Především bylo důležité nalézt takové proteiny, které by absorbovaly ve viditelné oblasti spektra a byly hydrofilní. Jako vhodné a perspektivní analyty pro demonstraci použitelnosti metody CAF-IEF byly zvoleny fykobiliproteiny (PBP). Jsou to látky ve vodě rozpustné a absorbující ve viditelné části spektra, což umožnilo jednoduchou detekci a mikropreparaci vzorku ze separační kapiláry. Dále jsou PBP přítomny v organismech, které se stávají středem zájmu zejména ekologů a dietologů. Proteiny samy o sobě nacházejí využití v potravinářském a kosmetickém průmyslu, a také v biochemii na při značení DNA. Konkrétně se jednalo o C - fykocyanin (C-PC) a allofykocyanin (APC) ze sinice Anabaeny doliolum a o B - fykoerythrin (B-PE) z červené řasy Porphyridium cruentum. Extrakce PBP byla prováděna dvěma různými metodami. Pro extrakci C-PC a APC ze sinice A. doliolum byla použita extrakce v ultrazvukové lázni. Tato metoda nebyla vhodná pro extrakci B-PE z řasy P. cruentum, což je s ohledem na rozdílnou buněčnou stavbu obou organismů pochopitelné. Sinice mají prokaryotickou buňku, zatímco řasy eukaryotickou. Pro extrakci B-PE bylo použito techniky kryogenního mletí. Vzorek byl zmražen tekutým dusíkem a poté pomlet laboratorním vibračním mlýnem. Jako extrakční činidlo se použila destilovaná voda z důvodů minimalizace přítomnosti dalších látek ve vzorku. Surový extrakt byl dále analyzován různými metodami. Sledováním stability proteinu v čase ukázalo, že nejvhodnější je vzorek zpracovat ihned po extrakci a nebo jej ihned zamrazit. Při uchování extraktu za laboratorní teploty dochází k poměrně rychlé degradaci proteinu (což je v souladu s publikovanými poznatky) a extrakt při uchovávání v lednici (3 – 8 °C) je nutno zpracovat do dvou dnů. Nejprve bylo třeba nalézt vhodný elektrolytový systém pro fokusaci a mikropreparaci PBP. Bylo nutné zvolit vhodné složení dávkovacího elektrolytu tak, aby došlo k zastavení reakčního neutralizačního rozhraní (dále jen rozhraní) a k fokusaci proteinu. Bylo měřeno několik elektrolytových systémů. Na základě měření rychlosti pohybu rozhraní bylo nalezeno složení jednotlivých dávkovacích elektrolytů. Pro analýzu byl vybrán kationtový směr migrace, neboť fokusace s aniontovým směrem migrace bývá problematická vzhledem k absorpci CO2, který znesnadňuje analýzu. Byl vybrán dávkovací elektrolyt s následujícím složení: 0,01M CH3COOH, 0,003 M NH4CH3COO, pH 4,2. Jiné dávkovací elektrolyty nebyly vhodné kvůli pH, které je nižší než pH dávkovacího octanového elektrolytu. Při nižších pH dochází ke srážení BPB. Mikropreparační proces CAF-IEF se obecně skládá ze dvou kroků. Prvním krokem je dávkování a proces fokusace vzorku, kdy rozhraní stojí a dochází na něm k fokusaci amfolytu. Po určité době je dávkovací elektrolyt vyměněn za koncový elektrolyt a proces dávkování se ukončí. V druhém kroku dochází k pohybu rozhraní a k transportu amfolytu do místa jeho odběru či detekce.
60
Vhodnost vybraného elektrolytového systému obsahujícího NH4OH, NH4CH3COO, CH3COOH byla nejdříve testována na modelových vzorcích nízkomolekulárních pI markerů (pI 4,6; 5,7; 7,4; 7,9) a na myoglobinu pI 7,4. Zafokusované zóny měly ostrá rozhraní a nedocházelo k jejich vzájemnému promícháváni. Zóny byly po separaci seřazeny dle svých pI, čímž se potvrdila vhodnost vybraného elektrolytového systému. Surový extrakt PBP byl upraven na dávkovací elektrolyt. Doba dávkování byla 60 min při proudu 200 µA. Poté byla zóna transportována 0,01 M CH3COOH. Doba separace byla cca 30 min. Odebraný vzorek byl použit pro další analýzy na MALDITOF/TOF MS, 1-D SDS PAGE a UV-Vis spektrofotometrii. Pro určení čistoty, koncentrace, výtěžku jednotlivých PBP a ke stanovení celkové koncentrace bílkoviny jak surového extraktu, tak i vzorku získaného metodou CAF-IEF, byla použita UV-Vis spektrofotometrie. Pomocí hodnoty poměrů absorbancí A620/A280 (C-PC), A650/A280 (APC) a A545/A280 (B-PE) byla stanovena čistota PBP. Koncentrace PBP a celkové koncentrace bílkoviny byly stanoveny z kalibračních křivek. Odebraný vzorek PBP z CAF-IEF z A. doliolum a surový extrakt PBP z téže sinice byly dále separovány metodou 1-D SDS PAGE. Na výsledném gelu lze zřetelně vidět míru zakoncentrování vzorku metodou CAF-IEF oproti surovému extraktu. Jednotlivé α a β podjednotky C-PC a APC nebyly od sebe dostatečně odděleny, což je vzhledem k velmi podobným molekulovým hmotnostem jednotlivých proteinů pochopitelné. Vzorky PBP byly dále analyzovány pomocí MALDI-TOF/TOF hmotnostní spektrometrie. Odebrané vzorky z CAF-IEF a vyřezané proužky PBP z polyakrylamidového gelu (1-D SDS PAGE) byly enzymaticky štěpeny trypsinem a analyzovány metodou MS a MS/MS. Naměřená spektra jednoznačně potvrdila přítomnost α a β podjednotky C-PC a APC ve vzorku z A. doliolum, a to jak ve vzorku po CAF-IEF, tak i ve vzorku z gelu, a dále α a β podjednotky B-PE ze vzorku získaného metodou CAF-IEF z P. cruentum. K vyhodnocení spekter PBP byl použit program MASCOT s proteinovou databází Swiss-Prot. Analýza separovaných proteinů prokázala, že metoda je vhodná pro prekoncentraci a mikropreparaci vzorku, protože má oproti běžným separačním postupům poměrně krátkou dobu analýzy (1,5 h). Oproti metodě 1-D SDS PAGE odpadá krok extrakce proteinu z gelu, čímž se doba přípravy vzorku pro MALDI-TOF MS ještě zkrátí. Metoda je finančně nenáročná, neboť nepoužívá drahé nosné amfolyty. Nepoužívá organická rozpouštědla, takže méně zatěžuje životní prostředí. Také nepoužívá zdraví škodlivé sloučeniny jako je akrylamid, který je neurotoxický. Přestože separace jednotlivých proteinů není kvantitativní, pro analýzu proteinů na MALDI-TOF MS je dosažená čistota proteinů dostačující. Míra zakoncentrování byla dobře zřetelná na separačním gelu a taktéž byla potvrzena spektrofotometricky. Nevýhodou navrženého postupu je omezená možnost detekce, kdy se požaduje, aby separovaný protein absorboval ve viditelném spektru. Poměrně nepraktické je také využití injekční stříkačky pro odběr vzorku, což vyžaduje určitou manuální zručnost. Při odběru může navíc docházet k menšímu promísení separovaných zón a tím ke znečištění vzorku.
61
Případné další navazující práce by se tedy mohly zaměřit na zdokonalení techniky detekce a odběru vzorku proteinů, např. širšího využití nízkomolekulárních pI markerů pro separaci proteinů nebo využití UV detekce, popř. fluorescenční detekce. Dále se nabízí možnost použití další navazující elektroforetické metody - kapilární elektroforézy. Z hlediska techniky odběru vzorku se nabízí možnost použití separačního kohoutu od firmy Villa LABECO, případně dalších doplňujících součástí umožňujících přesnější odběr vzorku.
62
7.Literatura [1] Pospíchal J., Chmelík J., Deml M., J. Microcolumn. Sep. 7 (1995) 213-219 [2] Kalina T., Váňa J., Sinice, řasy, houby, mechorosty a podobné organismy v současné biologii, Univerzita Karlova v Praze, Karolinum (2005) [3] Poulíčková A., Jurčák J., Malý obrazový atlas našich sinic a řas, Univerzita Palackého v Olomouci, Olomouc (2001) [4] Fott B., Sinice a řasy, Československé akademie věd (1956) [5]
[6] Kutík J., Vesmír 75, 33 (1996) [7] Samsonoff W. A., MacColl R., Arch. Microbiol. 176 (2001) 400-405 [8] Šetlík I., Seidlová J., Šantrůček J., Fyziologie rostlin 4 [9] [10] [11] MacColl R., J. Struct. Biol. 124 (1998) 311-334 [12] Ewards M. R., Hauer Ch., Stach R. F., Eisele L. E., MacColl R., Biochim. Bioph. Acta 1321 (1997) 157-164 [13] Albertsson P. A., Photosynth. Res. 76 (2003) 217-225 [14] Sun Y. W. J., Electrophoresis 21 (2000) 1746-1754 [15] Stee B., Troxler R. F., Teeter M., Biophys. J. 6 (1999) 2912-2921 [16] Jespersen L., Strømdahl L. D., Olsen K, Skibsted L. H., Eur. Food Res. Technol. 220 (2005) 261-266 [17] Akhilender Naidu K., Sarada R., Manoj G., Khan M. Y., Mahadeva Swamy M., Viswanatha S., Narasimha Murthy K., Ravishankar G., Srinivas L., Food Biotechnol. 13 (1999) 51-66. [18] Romay C., Armesto J., Remirez D., González R., Ledom N., García, Inflamm. Res. 47 (1998) 36-41 [19] Subhashini J., Mahipal S. V. K., Reddy M. M., Rachamallu A., Reddanna P., Biochem. Pharmacol. 63 (2004) 453-462 [20] Pardhasaradhi B. V., Ali A. M., Kumari A. L., Reddanna P., Khar A., J. Phycol. 44 (2008) 260-268 [21] Romay CH., González R., Ledón N., Remirez D., Rimbau V., Curr. Prot. Pept. Sci. 4 (2003) 207-216 [22] Farooq S. M., Asokan D., Sakthivel R., Kalaiselvi P., Varalakshmi P., J. Food Sci. 71 (2006) 486-491 [23] Sidler W., Gysi J., Isker E., Zuber H., Physiol. Chem. 362 (1981) 611-628
63
[24] Offner G. D., Troxler R. F., J. Biol. Chem. 258 (1983) 9931-9940 [25] MacColl R., Arch. Biochem. Biophys. 223 (1983) 24-32 [26] MacColl R.,. Csatorday K., Berns D. S., Traeger E., Arch. Biochem. Biophys. 208 (1981) 42-48 [27] Shih S. R.; Tsai K. N.; Li Y. S.; Chueh C. C.; Chan E. C., J. Med. Virol. 70 (1) (2003) 119-125. [28] Kathiresan S., Sarada R., Bhattacharya S., Ravishankar G.A., Biotechnol. Bioeng. 96 (2007) 456-463 [29]Ritter S., Hiller R. G., Wrench P. M., Wetle W., Diederichs K.,J. Struct. Biol. 126 (1999) 86-97 [30] Isailovic D., Li H-W., Yeung E.S., J. Chromatogr. A 1051 (2004) 119-130 [31] Cohen Z., Handbook of Microalga Mass Culture, CRC Press Inc. Boca Rayton (1988) [32] Ayyagari M., Pande R., Kamtekar S., Gao H., Marx K., Kumar J., Tripathy S., Akkara J., Kaplan D., Biotechnol. Bioeng. 45 (1995) 116 [33] Roman R. B., Alvarez-Pez J. M., Fernandez F. G. A., Grima E. M., J. Biochem. 93 (2002) 73-85 [34] ] Bermejo R., Fernández E., Alvarez-Pez J. M., Talavera E. M., J. Lumin. 99 (2002) 113-124 [35] Santiago-Santos Ma. C., Ponce- Noyola T., Olvera-Ramírez R., Ortega-López J., Cañizares-Villanueva R. O., Process Biochem. 39 (2004) 2047-2052 [36] Benavides J., Rito-Palomares M., J. Chromatogr. B 807 (2004) 33-38 [37] Simó C., Herrero M., Neusüβ CH., Pelzing M., Kenndler E., Barbas C., Ibáñez E., Cifuentes A., Electrophoresis 26 (2005) 2674-2683 [38] Herrero M., Simó C., Ibáñez E., Cifuentes A., Electrophoresis 26 (2005) 4215-4224 [39] Viskari P. J., Colyer CH. L., Anal. Biochem 319 (2003) 263-271 [40] Furuki T., Maeda S., Imajo S., Hiroi T., Amaya T., Hirokawa T., Ito K., Nozawa H., J. Appl. Phycol. 15 (2003) 319-324 [41] Sarada R., Pillai M. G., Ravishankar G. A., Process Biochem. 34 (1999) 795801 [42] Eisele L. E., Bakhru S. H., Liu X., MacColl R., Edwards R. M., Biochim. Biophys. Acta. 1456 (2000) 99-107 [43] Shang T. Q., Ginter J. M., Johnston M. V., Larsen B. S., McEwen CH. N., Electrophoresis 24 (2003) 2359-2368 [44] Mendiola J. A., Marín F. R., Hernández S. F., Arredondo B. O., Senorás F. J., Ibañez E., Reglero G., J. Sep. Sci. 28 (2005) 1031–1038b [45] Sanders J. C., Hung Z., Landers J. P., Lab. Chip 1 (2001) 167-172
64
[46] Tsai S. W., Loughran M., Hiratsuka A., Yano K., Karube I., Analyst. 128 (3) (2003) 237-244 [47] Aráoz R., Lebert M., Häder D. P., Braz. J. Med. Biol. Res. 32 (1999) 10631071 [48] Viskari P. J., Kinkade CH. S., Colyer CH. L., Electrophoresis 22 (2001) 2327-2335 [49] Minkova K. M., Tchernov A. A., Tchorbadjieva M. I., Fournadjieva S. T., Antova R. E., Busheva M. CH., J. Biotechnol. 102 (2003) 55-59 [50] Bermejo E., Talavera E. M., Alvarez-Pez J. M., Orte J. C., J. Chromatogr. A 778 (1997) 441-450 [51] Bermejo B., Felipe M. A., Talavera E. M., Alvarez-Pez J. M., Chromatographia 63 (2006) 59-66 [52] Zolla L., Bianchetti M., Rinalducci S., Eur. J. Biochem. 269 (2002) 15341542 [53] Huang Z., Yang F., Zheng W. J., Guo B. J. Chem. J. Chin. Univ. Chin. 27 (6) (2006) 1051 – 1054 [54] Zolla L., Bianchetti M., J. Chromatogr. A 912 (2001) 269-279 [55] Román R. B., Alvárez-Pez J. M., Fernández F. G. A., Grima E. M., J. Biotechnol. 93 (2002) 73-85 [56] McColl R., Eisele L. E., Marrone J., Biochim. Biophys. Acta 1412 (1999) 230-239 [57] Macoll R., Eisele L., E., Menikh A., Biopolymers (Biospectroscopy) 72 (2002) 352-365 [58] Tiselius A., Nova Acta Reg. Soc. Sci. Uppsaliensis, 7 (4) (1930) 1-107 [59] Gaš B., Vemír 80,370 (2001) [60] Kohlrausch F., Ann. Phys. Chem., N..F. 62 (1987) 209 [61] Kendall J., Crittenden E. C., Proc. Nat. Acad. Sci. U. S. 9: 75 (1923) [62] Longsworth L. G., Nat. Bur. Stand. Cirk. No. 524 (1953) 59 [63] Jorgenson J. W., Lukacs K. D., Anal. Chem. 53 (8) (1981) 1298-1302 [64] Jorgenson J. W., Lukacs K. D., Clin. Chem. 27 (9) (1981).1551-1553 [65] Everearts F. M., Beckers J. L., Verheggen, Th. P. E. M.: Isotachophoresis, Theory Instrumentation and Applications, Elsevier, Amsterdam (1976). [66] Mikkers, F. E .P., Everaerts, F. M., Verheggen, TH. P. E. M., J. Chromatogr. 169 (1976) 1-20 [67] Lukacs K. D., Jorgenson J. W., JHRC and Chrom. Commun. 8 (1985) 407411 [68] Swensson H., Acta Chem. Scand. 15 (1961) 325
65
[69] Hjertén S., J. Chromatogr. 1 (1983) 275 [70] Guttman A., Cooke, N., Anal. Chem. 63 (1991) 2038 [71] Terabe S., Trends Anal. Chem. 8 (1989) 129 [72] Jorgenson J., Lukacs K. D., J. Chromatogr. 218 (1981) 209 [73] Pospíchal J., Využití řízených dynamických změn elektrolytů v elektromigračních metodách, Brno (2003) [74] [75] Boček P., Analytická kapilární izotachoforéza, Praha (1987) [76] Dolník V, Úvod do kapilární elektroforézy, Brno (1994) [77] Kouda P., Moderní analytické metody, Ostrava (1996) [78] Boček P., Deml M.,Gebauer P., Dolník V., Anal. Isotachophor. (1988), 13-15 [79] Kašička V., Chem. listy 91 (1997) [80] Pospíchal J., Deml M., Boček P., J. Chromatogr. 638 (1993) 179-186 [81] Deml M., Pospíchal J., J. of Appl. Theor. Electrophoresis 4 (1994) 107-115 [82] Pospíchal J., Deml M., Gebauer P., Boček P., J. Chromatogr. 470 (1989) 4355 [83] Deml M., Pospíchal J., Chmelík J., J. Chromatogr. A 709 (1995) 39-49 [84] Pospíchal J., Glovinová E.; J. Chromatogr. A 918 (2001) 195-203 [85] Procházková B., Pospíchal J.; MendelNet Agro 2004 [86] Boček P., Deml M., Pospíchal J., Sudor J., J. Chromatogr. 470 (1989) 309312 [87] Sudor J., Pospíchal J., Deml M., Boček P., J. Chromatogr. 545 (1991) 331336 [88] Glovinová E., Využití elektromigračních metod v ekologii lesa, Brno (2005) [89] [90] Laemli U. K., Nature 227 (1970) 680 [91] Řehulka P., Šalplachta J., Chmelík J.: J. Mas. Spectrom. 38 (2003) 1267 [92] Šalplachta J., Řehulka P., Chmelík J.: J. Mass. Spectrom. 39 (2004) 1395 [93] Glazer A. N., Methods. Enzymol. 167 (1988) 291 [94] Bermejo R., Alvarez-Pez J. M., Acien-Fernandez F. G., Molina-Grima E., J. Biotechnol. 93 (2002) 73
66
8.Seznam použitých zkratek APC - allofykocyanin (allophycocyanin) ATP – adenosintrifosfát ATPS – extrakce pomocí dvoufázového vodního systému (aqueous two phase extraction) BGE – základní elektrolyt (background electrolyte) CAF-IEF - izoelektická fokusace bez nosných amfolytů (carrier ampholyte-free isoelectric focusing) CZE – kapilární zónová elektroforéza (cappilary zones electrophoresis) DE – dávkovací elektrolyt (dosing electrolyte) ESI - ionizace eletrospreyem (electrospray ionisation) HPLC - vysokotlaká účinná kapalinová chromatografie (high performance liquid chromatography) IEF – izoelektrická fokusace (isoelectric focusing) ITP – izotachoforéza (izotachophoresis) LE – vedoucí elektrolyt (leading electrolyte) MALDI – laserem indukovaná desorpce pomocí matrice (matrix assisted laser desorption ionization) MBE – elektroforéza s pohyblivým rozhraním (moving boundary electrophoresis) MS - hmotnostní spektrometr (mass spectrometer) PBP - fykobiliproteiny (phycobiliprotein) PC - fykocyanin (phycocyanin) PE - fykoerythrin (phycoerythrin) pI – izoelektrická bod (izoelectric point) PS – fytosystém (photosystem) SDS-PAGE - gelová elektroforéza s dodecylsulfátem sodným na polyakryamidu (sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis) TE – koncový elektrolyt (terminating electrolyte) TOF – doba letu, druh analyzátoru (time of flight)
67
9.Abstrakt Tato práce zkoumá možnost využití izoelektrické fokusace bez nosných amfolytů (CAF-IEF) jako vhodné metody pro přípravu vzorků proteinů pro MALDI-TOF hmotnostní spektrometrii. Cílem práce bylo v prvé řadě nalezení vhodného elektrolytového systému pro fokusaci a mikropreparaci fykolibiliproteinů (PBP) ze sinice Anabaena doliolum a z červené řasy Porphyridium cruentum a dále identifikace purifikovaných proteinů pomocí MALDI-TOF MS, včetně jejich kvantifikace pomocí UV-Vis spektrofotometrie. Jako vhodné a perspektivní analyty pro demonstraci použitelnosti této metody byly zvoleny fykobiliproteiny (PBP). Jsou to látky ve vodě rozpustné a absorbující ve viditelném záření, což umožnilo jednoduchou detekci a odběr vzorku z kapiláry. Jednalo se konkrétně o C-fykocyanin (C-PC) a allofykocyanin (APC) ze sinice Anabaeny doliolum a o B-fykoerythrin (B-PE) z červené řasy Porphyridium cruentum. Pro extrakci PBP z organismů byly použity dvě různé extrakční techniky. Pro extrakci PBP z A. doliolum byla použita ultrazvuková lázeň, zatímco pro extrakci B - PE z červené řasy byla použita technika kryogenního mletí. Jako extrakční činidlo byla použita destilovaná voda. Surový extrakt byl dále analyzován metodou CAF-IEF. Jako vhodný elektrolytový systém pro fokusace a mikropreparaci PBP byl vybrán elektrolytový systém obsahující NH4OH, NH4CH3COO, CH3COOH o přesně definovaném složení. Čistota proteinů a koncentrace jednotlivých PBP byla stanovena spektrofotometricky. Pomocí hodnoty poměrů absorbancí A620/A280 (C-PC), A650/A280 (APC) a A545/A280 (B-PE) byla stanovena čistota PBP. Koncentrace jednotlivých PBP byla stanovena pomocí kalibrační křivky. Po CAF-IEF byl purifikovaný vzorek z důvodů stanovení čistoty a míry zakoncentrování analytu analyzován také jednorozměrnou gelovou elektroforézou (1- D SDS PAGE). Tato analýza ukázala, že vzorek PBP byl pomocí CAF-IEF dostatečně zakoncentrován a přečištěn. Odebrané vzorky z CAF-IEF a vyřezané proužky PBP z gelu (1-D SDS PAGE) byly podrobeny enzymatickému štěpení trypsinem a výsledné peptidy byly analyzovány pomocí MALDI-TOF/TOF hmotnostního spektrometru v MS i MS/MS modu. Naměřená spektra jednoznačně potvrdila přítomnost C-PC a APC ve vzorku z A. doliolum a B-PE z P. cruentum. K vyhodnocení spekter PBP byl použit program MASCOT s proteinovou databází Swiss-Prot. Metoda CAF-IEF se ukázala být vhodnou alternativou pro přípravu proteinů pro MALDI-TOF MS. Její výhodou oproti 1-D SDS PAGE je zejména časová a finanční nenáročnost a poměrně jednoduchá příprava vzorku.
68
10.Summary This work is focused on testing the suitability of carrier amfolyte-free isoelectric focusing (CAF-IEF) for preparation of the protein samples for MALDI-TOF mass spectrometry. The aim of this work was finding the electrolytic system suitable for focusation and micropreparation of phycobiliproteins (PBP) from Anabaena doliolum (cyanobacteria) and Porphyridium cruentum (red alga), the identification of purified proteins using MALDI-TOF/TOF MS, including their quantification by UV-Vis spectrophotometry. Phycobiliproteins (PBP) are water-soluble and they absorb in UV-Vis, therefore they can be easily detected and separated directly from the capillary. In this study we analyzed C-phycocyanine (C-PC) and allophycocyanine (APC) from Anabaena doliolum and B-phycoerythrine (B-PE) from Porphyridium cruentum. Two different extract techniques were used for the extraction of PBP from the organisms. PBP were extracted from A. doliolum by ultrasonic extraction, whereas B-PE were isolated from the red alga using cryogenic mill. Distilled water was used as an extraction solvent in both cases. Crude extract was then analyzed by CAF-IEF method. An electrolytic system containing NH4OH, NH4CH3COO, CH3COOH in specific ratio proved to be suitable for focusation and micropreparation of PBP. Purity and concentration of individual PBP were determined by spectrophotometry. Purity of PBP was determined on the basis of the ratios of absorbances A620/A280 (C-PC), A650/A280 (APC) and A545/A280 (B-PE), and the concentration of individual PBP was determined using the calibration curve. The sample purified by CAF-IEF was consequently analyzed by one-dimensional gel electrophoresis (1-D SDS PAGE). The analysis confirmed that CAF-IEF was sufficient for purification and concentration of the sample. The samples taken from CAF-IEF and PBP bends from the gel (1-D SDS PAGE) were treated with trypsine (enzymatic cleavage) and the peptides formed were analyzed by MALDI-TOF/TOF mass spectrometer in both MS and MS/MS modes. The MS spectra unambiguously proved the presence of C-PC a APC in the sample from A. doliolum and B-PE in the sample from P. cruentum. Spectra of PBP were analyzed using the MASCOT programme with Swiss-Prot protein databáze. It has been proved that CAF-IEF can be successfully used for preparation of the protein samples for MALDI-TOF/TOF MS. Compared to 1-D SDS PAGE, it is less time-consuming, less expensive and the sample preparation is reasonably simple.
69
11.Životopis Osobní údaje : Jméno :
Barbora Procházková
Akademický titul : Mgr. Datum narození : 28.2.1978 Adresa :
Národní třída 40, 695 01 Hodonín
Telefon :
+420 518 355783, mobil 775026063
Email :
[email protected]
Stav :
svobodná
Vzdělání : 2002 – dosud
Ph.D., Agronomická fakulta Mendelovy zemědělské a lesnické univerzity v Brně, Ústav chemie a biochemie. Obor: Zemědělská chemie PhD téma: Stanovení metabolitů s využitím elektromigračních metod
1996 – 2002
Mgr., Přírodovědecká fakulta Masarykovy univerzity v Brně, Obor: Biochemie, Učitelství chemie pro střední školy. Téma diplomové práce: Purifikace a vlastnosti enzymu glyoxylát oxidásy z houby Fomitopsis Pinicola
1992 – 1996
SPŠ Hodonín. Obor: Technologie keramiky
Praxe : 2008 – dosud
vedoucí chemické laboratoře úseku ÚKJ, Bioveta a.s., Ivanovice na Hané
2003 – 2007
technický pracovník pro výzkum, výuka praktik a seminářů (anorganická, organická chemie), Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně
2003
učitelka chemie, Základní škola a mateřská škola v Brně
2002
učitelka chemie, Církevní střední zdravotnická škola v Brně
70
12.Seznam publikací 1. Procházková B., Glovinová E., Pospíchal J., Analysis of amino acids by combination of carrier ampholyte-free IEF with ITP, Electrophoresis 28 (2007) 2168-2173 2. Procházková B., Šalplachta J., The use of carrier ampholyte free isoelectric focusing (CAF-IEF) for proteomic analysis, Chromatographia 67 (2008) 555-561
13.Poster 1. Procházková B., Šalplachta J.: The use of carrier ampholyte-free isoelectric focusing (CAF-IEF) for proteomic analysis, Advances in Chromatography and Electrophoresis 2007 & CHIRANAL 2007, Olomouc, Univerzita Palackého
14.Veřejná prezentace 1. Procházková B., Pospíchal J.: Využití Isoelektrické fokusace bez nosných amfolytů (CAF – IEF) pro analýzu stresových proteinů, MendelNet Agro 2004, Brno, Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně
71
