MENDELOVA ZEMĚDĚLSKÁ A LESNICKÁ UNIVERZITA V BRNĚ Agronomická fakulta Ústav morfologie, fyziologie a genetiky zvířat
Metody analýzy genomu kvasinek Bakalářská práce
Brno 2006
Vedoucí bakalářské práce:
Vypracovala:
prof. Ing. Josef Dvořák, CSc.
Hana Kolínková
2
Souhrn V dnešní době jsou kvasinky široce využívány v řadě oblastí, jako je věda, technologie
a
medicína.
Některé
druhy
jsou
nezastupitelné
v potravinářském
a farmaceutickém průmyslu, jiné jsou využívány jako biologické modelové systémy pro studium obecných regulací metabolismu eukaryotických buněk, další působí jako faktory vyvolávající různá onemocnění. Rozvojem molekulárně-genetických metod došlo k velkému pokroku zejména v genetice. Detailní studium genomu kvasinek je důležité pro zjištění sekvence genů a celé genetické informace. S takto získanými znalostmi pak můžeme manipulovat v genomu organismů. Cílem bakalářské práce bylo prostudovat doporučenou literaturu a zpracovat ji formou literární rešerše, sestavit přehled metodik používaných v oblasti molekulární biologie kvasinek.
3
Summary Nowadays, yeasts are broadly exploited in a lot of regions, such as science, technology and medical science. Some sorts of yeasts are necessary in food and pharmaceutical industry, other are exploited as biological model systems for study common regulation metabolism eukaryotic cells, some of them are factors, that cause different illness. The development of molecular-genetic methods gets to big progress, especially in genetics. Detailed study of genome yeasts is important for inquest sequence of genes and whole genic information. We can manipulate then with those knowledges in genome of organisms. The aim of this bachelor work was read up recommended literature,work up her form literary background research and put together survey methodist used in the area of molecular biology yeasts.
4
Poděkování Ráda bych poděkovala panu prof. Ing. Josefu Dvořákovi, CSc. za možnost vypracovat bakalářskou práci na Ústavu morfologie, fyziologie a genetiky zvířat a zvláště děkuji Ing. Přívětivé za ochotu, cenné informace a rady, které mi poskytovala během zpracování bakalářské práce. Můj velký dík patří také mé rodině a všem blízkým za pochopení a podporu při studiu a při vypracování bakalářské práce.
5
Prohlášení Prohlašuji, že jsem bakalářskou práci na téma METODY ANALÝZY GENOMU KVASINEK vypracovala samostatně a použila jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém soupisu literatury. Souhlasím, aby práce byla uložena v knihovně Mendelovy zemědělské a lesnické univerzity v Brně a zpřístupněna ke studijním účelům.
V Brně, dne 5.5. 2006
6
OBSAH 1. ÚVOD............................................................................................................................................ 7 2. LITERÁRNÍ PŘEHLED............................................................................................................. 9 2.1 VZNIK EUKARYOTICKÝCH BUNĚK ............................................................................................. 9 2.2 CHARAKTERISTIKA KVASINKOVÉ BUŇKY ................................................................................. 9 2.3 SLOŽENÍ KVASINKY .................................................................................................................. 10 2.3.1 BUNĚČNÁ STĚNA .................................................................................................................... 10 2.3.2 CYTOPLAZMATICKÁ MEMBRÁNA (PLAZMALEMA) .............................................................. 10 2.3.3 CYTOPLAZMA ......................................................................................................................... 10 2.3.4 CYTOSKELET .......................................................................................................................... 11 2.3.5 ENDOPLAZMATICKÉ RETIKULUM (ER) ................................................................................ 11 2.3.6 VAKUOLA................................................................................................................................ 11 2.3.7 RIBOZOMY .............................................................................................................................. 12 2.3.8 GOLGIHO APARÁT .................................................................................................................. 12 2.3.9 REZERVNÍ LÁTKY ................................................................................................................... 12 2.3.10 MITOCHONDRIE ................................................................................................................... 12 2.3.11 JÁDRO A GENOM................................................................................................................... 13 2.4 MOLEKULÁRNĚ-GENETICKÉ METODY .................................................................................... 15 2.4.1 IZOLACE, NAMNOŽENÍ, SEPARACE A VIZUALIZACE NUKLEOVÝCH KYSELIN..................... 16 2.4.1.1 Izolace nukleových kyselin ................................................................................................ 16 2.4.1.1.1 Metodické principy využívané při izolaci nukleových kyselin................................... 17 2.4.1.1.2 Fenol-chloroformová extrakce nukleových kyselin ..................................................... 17 2.4.1.1.3 Měření koncentrace nukleových kyselin ....................................................................... 18 2.4.1.2 Polymerázová řetězová reakce.......................................................................................... 19 2.4.1.3 Elektroforéza ...................................................................................................................... 22 2.4.1.3.1 Agarózová elektroforéza................................................................................................. 22 2.4.1.3.2 Polyakrylamidová elektroforéza.................................................................................... 23 2.4.1.4 Vizualizace elektroforetických gelů.................................................................................. 24 2.4.2 VYUŽITÍ POLYMERÁZOVÉ ŘETĚZOVÉ REAKCE.................................................................... 25 2.4.2.1 Sekvenování ........................................................................................................................ 25 2.4.2.2 Detekce polymorfismů ....................................................................................................... 26 2.4.2.2.1 Hybridizace nukleových kyselin .................................................................................... 27 2.4.2.2.1.1 Hybridizace na pevných nosičích................................................................................ 28 2.4.2.2.1.2 Polymorfismus délky restrikčních fragmentů (RFLP) ............................................. 29 2.4.2.2.2 Modifikace polymerázové řetězové reakce ................................................................... 30 3. ZÁVĚR........................................................................................................................................ 34 4. SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY ...................................................................................... 35
7
1. ÚVOD Kvasinky zaujímají celosvětově první místo mezi průmyslovými mikroorganismy. Jsou široce využívány v řadě oblastí vědy, technologie i medicíny. Některé druhy jsou nezastupitelné v potravinářském a farmaceutickém průmyslu, jiné jsou využívány jako biologické modelové systémy pro studium obecných regulací metabolismu eukaryotických buněk, další působí jako faktory vyvolávající onemocnění. Biodiverzita kvasinek je stále významnější při studiu jejich vlastností, poněvadž umožňuje lépe charakterizovat metabolismus a požadavky na kultivační prostředí. Kultivační podmínky jsou důležité především u biotechnologicky využitelných kmenů. Dosud velmi málo prozkoumaná je i funkce a význam značné části kvasinkových genů. V historii lidské populace zaujímají kvasinky významné místo z ekonomického, sociálního i zdravotního hlediska. Jsou často popisovány jako nejstarší „domestikované organismy“, které jsou po tisíciletí využívány k výrobě alkoholických nápojů a kynutého pečiva. Výroba piva představuje pravděpodobně první světovou biotechnologii. V současné době jsou kvasinky využívány kromě tradičních výrob v řadě dalších aplikací. Kvasinky a kvasinkové mikroorganismy jsou v přírodě velmi rozšířeny. Protože mají většinou pouze glykolytické schopnosti, vyskytují se především na materiálech obsahujících cukry, tedy na ovoci, zvláště bobulovém a peckovém (hrozny, švestky apod.) a na cukerných potravinách. Dále jsou v květních nektarech, výronech stromů, v půdě, ve vzduchu, ve střevním traktu lidí, zvířat a některého hmyzu (např. včel). Šíří se různými přenašeči, hlavně hmyzem, větrem apod. Hlavní průmyslový význam kvasinek tkví v jejich použití pro výrobu alkoholických nápojů a pekařského a krmného droždí. Ethanol pro chemické účely se dnes většinou vyrábí synteticky, neboť je to levnější než zkvašování hodnotných surovin. Stoupající cena ropy však vedla k tomu, že se v některých státech (např. v Brazílii) vyrábí kvasný ethanol jako náhražka benzinu. Značné produkce ethanolu pro potravinářské a farmaceutické účely se dosahuje i při výrobě pekařského droždí. Tzv. přiboudlina, tj. vyšší alkoholy, které se získají při rafinaci kvasného lihu, se používá hlavně jako rozpouštědlo laků. Droždí se pro svůj vysoký obsah vitaminů skupiny B používá také pro výrobu léčebných výživných preparátů.
8
Z buněk kvasinek se izoluje pro komerční účely také řada chemikálií, používaných v biochemických laboratořích, např. enzymů, koenzymů, nukleotidů apod. Speciální kmeny Saccharomyces cerevisiae se používají pro výrobu ergosterolu, tj. provitaminu D, který ozářením ultrafialovým světlem poskytuje vitamin D. Ergosterol se izoluje z buněk kvasinek. Kvasinka Saccharomyces cerevisiae se uplatňuje jako pekařská, lihovarská, vinařská nebo spodní či svrchní pivovarská kvasinka. Kmeny, které se hodí k jednotlivým účelům, se ovšem velmi liší svými fyziologickými vlastnostmi. Tento druh slouží také jako modelový organismus pro biochemické a genetické práce, a je proto nejprostudovanější kvasinkou. Z tohoto důvodu je S. cerevisiae vzorem v bakalářské práci. Nukleové kyseliny v genomu kvasinek představují molekuly, které se stávají důležitým cílem laboratorní analýzy. Z tohoto důvodu klinické (servisní a výzkumné) laboratoře potřebují jednoduché a spolehlivé analytické metody. Analytické postupy v molekulární biologii obecně používají metody centrifugační, metody extrakce a purifikace (čištění) nukleových kyselin, elektroforetické, hybridizační a amplifikační metody. Tyto metody se v praxi vzájemně překrývají. Rozvojem molekulárně-genetických metod došlo k velkému pokroku v genetice. Detailní studium genomu kvasinek je důležité pro zjištění sekvence genů a celé genetické informace. S takto získanými znalostmi pak můžeme manipulovat v genomu organismů, čímž se zabývá genové inženýrství. Geneticky modifikované kvasinky jsou producenty farmakologických preparátů pro prevenci i léčbu onemocnění. V budoucnu lze předpokládat ještě větší využití kvasinek v dalších průmyslových oblastech, jako je obnova zdrojů energie, environmentální biotechnologie a využití technologie rekombinantní DNA v humánní medicíně. Cílem bakalářské práce bylo prostudovat doporučenou literaturu a zpracovat ji formou literární rešerše, sestavit přehled metodik používaných v oblasti molekulární biologie kvasinek.
9
2. LITERÁRNÍ PŘEHLED
2.1 Vznik eukaryotických buněk Existují tři typy buněčného života, a podle toho se veškerý život na planetě dá rozdělit do tří říší: Eubacteria, Archaebacteria a Eukaryota. První dvě říše zahrnují organismy bakteriální a patří souhrnně mezi prokaryotické buňky (3). Rozdíl mezi nimi a buňkami eukaryotickými spočívá v tom, že buňky prokaryotické jsou mnohem menší, mají jen jednu membránu (hlavní, cytoplazmatickou) a nemají žádné organely. Jádro neexistuje, DNA je jako jeden chromozom nechráněn v cytoplazmě. Tvar buňky je určen buněčnou stěnou. Eukaryotické
buňky
jsou
naproti
tomu
mnohem
větší,
vše
je
členěno
do membránových kompartmentů a tvar buňky je určen zejména cytoskeletem (12).
2.2 Charakteristika kvasinkové buňky Kvasinky jsou heterotrofní eukaryotní organismy, náležící mezi houby (Fungi). Český název dostaly pro schopnost většiny druhů zkvašovat monosacharidy a některé disacharidy, případně trisacharidy na ethanol a oxid uhličitý (Šilhánková, 2002). Kvasinky vykazují velkou tvarovou, velikostní či barevnou diverzitu. Dokonce mezi samotnými buňkami jednoho kmene lze nalézt morfologické a barevné heterogenity. To je převážně způsobeno změnami fyzikálních a chemických podmínek v prostředí (1). Tvar buňky kvasinek souvisí s převažujícím způsobem vegetativního rozmnožování, jež se děje buď pučením nebo dělením. Nejčastěji je tvar krátce elipsoidní, případně vejčitý až kulovitý. Některé rody tvoří dlouze protáhlé buňky, vyskytuje se však i tvar citronovitý (např. Kloeckera apiculata), trojúhelníkovitý (rod Trigonopsis) a válcovitý (rod Schizosaccharomyces). Tvar buněk i jejich velikost jsou do určité míry ovlivněny kultivačními podmínkami a stářím buněk (Šilhánková, 2002). Kvasinky mají průměr přibližně 5 µm a mnoho jejich důležitých znaků se dá pozorovat ve světelném mikroskopu (Burke et al., 2000).
10
2.3 Složení kvasinky 2.3.1 Buněčná stěna Buněčná stěna kvasinek má, podobně jako u bakterií, silnou a pevnou strukturu, která dává buňce tvar a chrání ji před mechanickými vlivy a před osmotickým šokem. Velkými póry
stěny
mohou
volně
procházet
všechny
sloučeniny
kromě
sloučenin
vysokomolekulárních, jako jsou polysacharidy a bílkoviny. Kidby a Davis (1970) navrhli model buněčné stěny pro rod Saccharomyces cerevisiae, který ještě rámcově platí. Podle tohoto modelu má buněčná stěna tři vrstvy: vnější, střední a vnitřní. Na povrchu stěny kvasinek jsou patrné jizvy po pučení, které se v elektronovém mikroskopu jeví jako mírně vyvýšené prstence. Na jednom pólu každé buňky můžeme spatřit zvláštní jizvu, která zůstala v místě dřívějšího spojení buňky (vlastně pupenu) s mateřskou buňkou. Tato jizva se nazývá jizva zrodu. Elipsoidní buňky rodu Saccharomyces nepučí nikdy v místě, kde už předtím pučely, takže počet jizev nám současně určuje i stáří buňky. Některé druhy kvasinek (hlavně příslušníci rodu Cryptococcus a někteří příslušníci rodů Lipomyces a Trichosoron) tvoří kolem svých buněk, tj. na povrchu stěn, ještě polysacharidové obaly ve formě pouzder.
2.3.2 Cytoplazmatická membrána (plazmalema) Cytoplazmatická membrána je poměrně tenká, tloušťky 7,5 až 8 nm, složená z lipidů a proteinů. Vytváří četné vychlípeniny vybíhající do cytoplazmy. Je volně propustná pouze pro malé molekuly bez náboje a proto tvoří osmotické rozhraní mezi buňkou a vnějším prostředím (Šilhánková, 2002).
2.3.3 Cytoplazma Uvnitř buňky je objemný prostor vyplněný kapalinou, nazývaný cytoplazma (cytozol) (13). Cytoplazma je kyselá (pH 5,25) koloidní tekutina, obsahující především ionty, nízkou nebo střední molekulovou hmotnost organických sloučenin a rozpustné makromolekuly (např. enzymy, proteiny, glykogen) (1). Uvnitř cytozolu se nachází cytoskelet s buněčnými organelami. Cytozol obsahuje rozpuštěné živiny, pomáhá ničit zplodiny metabolismu a posunuje materiál okolo buňky procesem nazývaným cytoplazmatický tok. Jádro mění svůj tvar podle pohybu cytoplazmy.
11
Cytoplazma také obsahuje mnoho solí, je vynikající vodič elektřiny a vytváří dokonalé prostředí pro mechanismus buňky (13). Cytoplazma mladých buněk kvasinek se ve světelném mikroskopu jeví jako průhledná homogenní hmota. U starších buněk se v ní objevují zrníčka a jemná nebo větší vakuolizace (Šilhánková, 2002).
2.3.4 Cytoskelet Cytoskelet tvoří jakousi opěrnou a pohybovou soustavu buňky – pomáhá udržovat tvar buňky a podílí se na pohybech organel i celé buňky (8). Cytoskelet je organizovaná síť tří základních vláken: mikrotubulů, mikrofilament a intermediálních filament. Rozprostírá se v cytoplazmě i v jádře a umožňuje vnitrobuněčný pohyb organel z jednoho místa na druhé (7).
2.3.5 Endoplazmatické retikulum (ER) Endoplazmatické retikulum slouží jako transportní síť pro molekuly zaměřené na určité modifikace a specifické cíle ve srovnání s molekulami plujícími volně v cytoplazmě. ER je membránová organela sestávající ze systému plochých váčků. Rozlišujeme: •
ER drsné (granulární) - má na povrchu ribozomy
•
ER hladké (agranulární) - na povrchu ribozomy nemá (13).
2.3.6 Vakuola Vakuola patří k nejnápadnějším složkám cytoplazmy kvasinek. Je to většinou kulovitý útvar obklopený jednoduchou membránou, která často vysílá úzké výběžky do cytoplazmy. U mladých nebo pučících buněk jsou většinou přítomny malé vakuoly, často ve větším počtu, kdežto zralé klidové buňky obsahují jednu velkou vakuolu. U starších buněk někdy vakuola vyplňuje téměř celý prostor buňky. Izolace vakuol po lyzi protoplastů ukázala, že uvnitř vakuol jsou uloženy hydrolytické enzymy, jako jsou proteinasy, ribonukleasa a esterasa, takže vakuoly mají zřejmě podobnou funkci jako lyzosomy u vyšších organismů. Jsou místem, v němž dochází k rozpadu těch struktur buňky, které se neustále v buňce rozkládají a obnovují a které mají krátký poločas rozpadu (některé enzymy apod.). Kromě toho obsahují vakuoly ještě
12
polyfosfáty a velkou zásobu draselných iontů, aminokyselin a purinů, takže jsou rezervoárem látek, jež se právě neúčastní metabolismu (Šilhánková, 2002).
2.3.7 Ribozomy Ribozomy jsou malé zrnkovité útvary skládající se z proteinů a ribozomální RNA (rRNA). Vyskytují se v cytoplazmě samostatně nebo v nakupeninách nazývaných polyribozomy nebo jsou přidruženy ke granulárnímu endoplazmatickému retikulu. Ribozomy jsou místem translace.
2.3.8 Golgiho aparát Jedná se o membránovou organelu složenou z plochých cisteren a různých váčků. Dokončuje se zde modifikace produktů syntetizovaných buňkou, které se potom pomocí transportních váčků dostávají na místo určení. Organela je strukturně i funkčně polarizována – na jednom pólu vstupují „suroviny“ dovnitř, z opačného pólu pak vychází již hotové produkty (8).
2.3.9 Rezervní látky Kromě strukturních útvarů se v cytoplazmě kvasinek nacházejí zřetelná zrníčka rezervních látek, především volutinu (tj. polymetafosfátu) a polysacharidu glykogenu. U některých rodů kvasinek (např. Rhodotorula) se jako rezervní látka vyskytuje tuk, který ve formě velké kapky může za vhodných kultivačních podmínek (vysoký poměr využitelného zdroje uhlíku k využitelnému dusíku) dosáhnout až 60 % sušiny buňky (Šilhánková, 2002).
2.3.10 Mitochondrie Mitochondrie jsou strukturální útvary velmi rozmanitého tvaru (kulovité, válcovité až vláknité nebo laločnaté). Mitochondrie téže buňky se obyčejně liší tvarem i velikostí. Jsou obklopeny dvěma membránami. Vnější membrána má bradavčitý povrch a vnitřní membrána tvoří hluboké vchlípeniny směrem dovnitř mitochondrie, které se nazývají kristy (Šilhánková, 2002). Mitochondrie patří mezi tzv. semiautonomní organely – část svých proteinů si díky své kruhové molekule DNA a vlastnímu proteosyntetickému aparátu mohou nasyntetizovat
13
samy. Nejen pro podobnost této kruhové molekuly s genetickou informací bakterií se uvažuje, že mitochondrie jsou z hlediska evoluce heterotrofní bakterie, které nejen přežily uprostřed cytoplazmy jiné buňky, ale dokázaly s ní navázat trvalé soužití (tzv. endosymbióza) (8).
2.3.11 Jádro a genom Jádro Jádro je laločnatá organela, která má v průměru asi 1,5 µm. Je od cytoplazmy odděleno dvojitou jadernou membránou s velkými póry a je umístěno přibližně ve středu buňky. Ve světelném mikroskopu je zřetelné pouze po speciálním barvení (Šilhánková, 2002). Buněčné jádro je základním stavebním prvkem buňky a je zároveň nepostradatelnou součástí každé plnohodnotné buňky. Představuje centrum, které řídí a kontroluje činnost buňky, jež je zakódována v chromozomech (5). Rozlišení chromozomů v jádře kvasinek je i pomocí elektronové mikroskopie tenkých řezů buněk velmi obtížné. Počet chromozomů byl proto odvozován z výsledků genetických studií. Mikroskopicky sestávají chromozomy ze dvou podélných a od sebe oddělených polovin, chromatid. Obě chromatidy jsou spojeny v místě nazývaném centroméra. Tato oblast je na chromozomu patrná nápadným zúžením (primární konstrikce) a slouží k úponu mikrotubulů dělícího vřeténka. Na některých chromozomech lze nalézt kromě primární konstrikce rovněž sekundární konstrikci, která je místem vzniku jadérka (organizátor nukleolu). Sekundární konstrikce přitom rozděluje jedno z ramének chromozomu na dva segmenty nestejné délky, z nichž kratší se nazývá satelit. V chromozomech je DNA asociována s jinými organickými molekulami, především malými bazickými proteiny (histony) a kyselými nehistonovými proteiny. Tento komplex DNA a proteinů se jmenuje chromatin (Zima et al., 2004). Základní organizační jednotkou chromatinu je nukleozom, který se skládá z histonového jádra (oktamer histonů H2A, H2B, H3 a H4) obtočeného DNA. Jednotlivá jádra jsou propojena pomocí histonů H1, které např. chrání DNA před enzymatickým štěpením. Velikost nukleozomu je 10 – 11 nm. Další spiralizací vzniká struktura solenoid (25 – 30 nm) a tzv. proteinové lešení (přibližně 60 nm). Vyšší úrovní spiralizace jsou chromatidy kompaktního metafázového chromozomu (Rosypal, 1999).
14
Struktura chromozomu se mění v závislosti na fyzikálním a chemickém stavu chromatinu, tj, zda je chromatin ve stavu kondenzovaném nebo dekondenzovaném. Kondenzovaným stavem se rozumí silně zhuštěný stav chromatinu (tzv. heterochromatin) na rozdíl od velmi slabě zhuštěného neboli chromatinu nekondenzovaného (tzv. euchromatin). V jádře některých kvasinek se vyskytuje také nízkomolekulární DNA, která má kruhovou strukturu a je obdobou plazmidů bakterií. Dále jádro obsahuje jadérko, které může být obsaženo i ve více exemplářích (8). Jadérko je kulaté struktury a je složeno z DNA, RNA a proteinů. DNA přítomná v jadérku kóduje ribozomální RNA. Proteiny syntetizované v cytoplazmě vstupují přes póry do jádra a sdružují se s nově vytvořenou rRNA v jadérku. Později se ribozomální jednotky stěhují do cytoplazmy. Jadérko mizí během buněčného dělení, ale znovu se objevuje ve finálním stupni mitózy. Jadérko produkuje ribozomy, které se stěhují z jádra na drsné endoplazmatické retikulum, a které je rozhodující v syntéze proteinů (10). Základní hmotu jádra tvoří amorfní substance vyplňující prostory mezi chromatinem a jadérkem. Je složena především z proteinů, metabolitů a iontů. Nazývá se jaderná (nukleární) matrix a v současné době je předmětem výzkumu (5).
Genom K přežití buněk je nutný genom, který musí v podmínkách současné biosféry obsahovat zhruba 400-500 genů kódujících základní provoz buňky. Takový organismus dnes může přežívat jen jako parazit - na úkor organismů s bohatším aparátem genů. Genů v genomu může být mnohem víc, než se původně předpokládalo. Ukázalo se to už v r. 1992, kdy byla poprvé publikována úplná sekvence DNA celého chromozomu kvasinky. Šlo o poměrně malý chromozom III kvasinky Saccharomyces cerevisiae (celý genom o délce 13 500 kb je rozčleněn do 16 chromozomů). O tom, jak náročný úkol to byl, nejlépe svědčí skutečnost, že se na něm podílelo 147 autorů z 35 laboratoří. Autoři na fragmentu dlouhém pouhých 315 kb nalezli 1820 úseků, které nesly charakteristiky genů kódujících proteiny. A ukázalo se, že jen 37 z nich bylo známých už předtím - a to navzdory několika desetiletím velmi intenzivních genetických studií na tomto organismu (3).
15
Struktura kvasinkového genomu Geny, z nichž sestává genom kvasinek, jsou rozděleny do tří buněčných organel: do jádra, mitochondrií a plazmidů. Většina genů je soustředěna v jádře na chromozomech. Každý chromozom obsahuje jednu dlouhou lineární molekulu dsDNA (chromozomová DNA nebo jaderná DNA), která působí ve funkci genoforu. Geny, které jsou na této DNA lokalizovány jsou nazývány jadernými. Kódují proteiny nebo jsou přepisovány do funkčních RNA, které rozhodujícím způsobem ovlivňují životní funkce kvasinky. Do mitochondrií se soustřeďuje jen malá část genů, které však také významně zasahují do životních funkcí, např. do terminálního oxidázového cyklu. Genoforem je v této organele většinou kružnicová dsDNA - mitochondriová (mtDNA). Některé kvasinky mají mitochondriový genofor tvořený lineární dsDNA. Plazmidová DNA zpravidla není pro buňku esenciální, protože neobsahuje genetickou informaci kódující nezbytné životní funkce. Zatím jen u malého počtu eukaryotických buněk byla zjištěna její přítomnost. Ve většině laboratorních kmenů kvasinky Saccharomyces cerevisiae lze však v jádře nalézt 2 µm plazmid, který představuje kovalentně uzavřenou kružnicovou dsDNA. Buňka potom obsahuje plazmidovou DNA asi v 60 kopiích v haploidním a ve 120 kopiích v diploidním stádiu. Tento 2 µm plazmid se stal základem pro konstrukci mnoha vektorů používaných v genových manipulacích u kvasinek (Rosypal, 1999).
2.4 Molekulárně-genetické metody Molekulární, resp. molekulárně-genetické metody jsou z historického hlediska nejmladší, současně však nejdynamičtěji se rozvíjející součástí metodologického aparátu současné biologie. Až do poloviny 60. let 20. století, kdy začaly být rutinně aplikovány metody tzv. „biochemické genetiky“ (tj. elektroforézy proteinů) na volně žijící populace živočichů, nebylo až na výjimky možno studovat uspořádání a dynamiku genetické proměnlivosti v populacích. Poslední dvě desetiletí pak byla svědkem několika technických a metodických pokroků, které znamenaly průlomové momenty. Automatizace některých technických postupů (syntéza požadovaných fragmentů DNA, zjišťování proteinových a nukleotidových sekvencí) umožnila aplikaci molekulárních metod v masovém měřítku, jiné inovace zase přinesly zjednodušení a zlevnění některých technik
16
a tím i jejich rozšíření mezi spíše terénně zaměřenými biology. Molekulární metody tak pronikly do ekologie, systematiky, populační biologie, etologie a dalších biologických oborů a staly se jejich nedílnou součástí.
Studium DNA má několik výhod: •
především můžeme studovat přímo genotyp, nikoli pouze jeho fenotypový projev
•
rozmanitost genomu nám poskytuje možnost volby takové sekvence, která je pro naše účely optimální
•
molekulární metody zpravidla umožňují jejich použití pro kterýkoli typ DNA
•
DNA lze připravit i z malého množství tkáně, je relativně stabilní a není nutno ji zmrazovat
•
molekulárními metodami můžeme studovat ohrožené druhy bez jakéhokoli kontaktu se studovanými objekty a dokonce i organismy dávno vyhynulé.
Výběr částí genomu, které jsou z hlediska našich potřeb optimální, závisí na několika kritériích, především na rychlosti evoluce a způsobu dědičnosti. Dalším kritériem je, zda potřebujeme znát pouze prostorovou distribuci jednotlivých alel nebo také jejich fylogenezi, neboť vhodnost některých metod pro fylogenetickou analýzu je omezená. Je nutno přihlížet k tomu, zda dědičnost studovaných markerů je dominantní nebo kodorninantní (Zima et al., 2004). V dalších kapitolách jsou popsány nejrozšířenější molekulární metody, které nalézají nebo mohou nalézt uplatnění v analýze genomu kvasinek. Jejich výběr není (a ani nemůže být) vyčerpávající, některé metody jsou popsány jen velmi stručně, jiné jsou zcela pominuty.
2.4.1 Izolace, namnožení, separace a vizualizace nukleových kyselin 2.4.1.1 Izolace nukleových kyselin Izolace genetického materiálu je prvním krokem většiny molekulárně genetických technik. Skládá se z rozbití tkáně a buněk, izolace a čištění nukleových kyselin a stanovení koncentrace a čistoty získané nukleové kyseliny. Izolace DNA spočívá v uvolnění DNA z vazby na jaderné proteiny a následném odstranění kontaminujících komponent. Klasickou metodou izolace DNA je fenol-
17
chloroformová deproteinace, v současnosti jsou často využívány modifikace enzymatické degradace s vysolením, případně jsou využívány komerční soupravy založené na principu izolace s využitím iontoměniče. Izolace RNA je obdobou izolace DNA, zahrnuje však kroky zabraňující velmi rychlé degradaci molekul specifickými enzymy (ribonukleasami). Patří sem např. fenolchloroformová deproteinace, deproteinace guanidiniovými solemi nebo izopyknická centrifugace (9).
Výchozím materiálem pro izolaci nukleových kyselin mohou být: –
Jednotlivé buňky kvasinek
–
Nukleové kyseliny v elektroforetických gelech
–
Produkty PCR reakcí
2.4.1.1.1 Metodické principy využívané při izolaci nukleových kyselin •
•
•
Rozrušení buněčných stěn působením –
Enzymů (lyzosym a celulázy)
–
Detergentů (dodecylsulfát sodný)
Enzymatické kroky pro odstranění kontaminant –
Proteináza K nebo proteináza E
–
RNáza nebo DNáza
Kroky využívající různou rozpustnost –
Fenolová extrakce
–
Adsorpce na pevný podklad
•
Centrifugace
•
Precipitace (srážení) (Šmarda et al., 2005)
2.4.1.1.2 Fenol-chloroformová extrakce nukleových kyselin Tradiční fenol-chloroformová metoda extrakce ponechává nukleové kyseliny rozpuštěné ve vodném prostředí (pufru) a odstraňuje ostatní složky lyzátu, především proteiny. K lyzátu je přidána směs fenolu, chloroformu a izoamylalkoholu. Chloroform je organické rozpouštědlo a nemísí se s vodným roztokem buněčného lyzátu, takže se směs rozdělí na dvě fáze – horní vodnou a dolní chloroformovou. Protřepáváním dochází
18
k mísení fází, při kterém fenol sráží proteiny přítomné ve vodném lyzátu. Izoamylalkohol zvyšuje rozpustnost fenolu v chloroformu a po skončení protřepávání přejde fenol do chloroformové fáze. Po protřepání je roztok odstředěn pro dokonalé oddělení fází. Na rozhraní mezi fázemi se obvykle objeví bílý prstenec sražených proteinů. Horní vodná fáze obsahuje nukleové kyseliny a je přenesena do nové čisté zkumavky. Pro dokonalé odstranění proteinů je nutno extrakci opakovat opětovným přidáním směsi fenolchloroform-izoamylakohol a protřepáváním tak dlouho, dokud se na rozhraní nepřestane po odstředění objevovat bílá proteinová sraženina. U izolace z rostlin, hub a některých bakterií je někdy nutné odstranit i polysacharidy extrakcí s cetyltrimetylamonium bromidem (CTAB). Nakonec je nutné extrahovat ještě jednou směsí jen chloroformu s izoamylakoholem (v poměru 24:1), aby byly odstraněny i stopy fenolu v roztoku, které by mohly interferovat například s enzymy při dalším opracování izolovaných nukleových kyselin. Z přečištěného vodného roztoku je možné nukleové kyseliny vysrážet přidáním koncentrovaného ethanolu. Po odstředění se na dně zkumavky objeví mléčně zkalený sediment (pelet). S nukleovými kyselinami se srážejí i soli, které zvyšují účinnost srážení nukleových kyselin a dávají peletu bílé zbarvení. Soli je pak potřeba odmýt 70 % ethanolem. Čisté nukleové kyseliny je možné po odsátí supernatantu rozpustit ve vodě nebo ve vhodném pufru. Protože více než 95 % objemu nukleových kyselin v buňce tvoří RNA, převažuje RNA i v tomto roztoku. Pokud potřebujeme pracovat s čistou DNA, musí být RNA odstraněna působením RNázy. Roztok musí být poté znovu přečištěn fenolchloroformovou extrakcí a DNA sražena ethanolem (4).
2.4.1.1.3 Měření koncentrace nukleových kyselin Je třeba mít na paměti pravidlo, že méně, někdy znamená více. Dokonce i nadměrné množství byť čistě izolované DNA může PCR reakci zablokovat stejně jako některé chemikálie. Je tedy vhodné stanovit alespoň orientační množství templátové DNA vstupující do reakce. V běžné praxi se k měření koncentrace nukleových kyselin používají dvě metody: Spektrofotometrická metoda –
Je to vhodná metoda pro měření vzorků, které jsou dostatečně čisté bez významného množství kontaminant
19
–
Nukleové kyseliny absorbují UV záření s maximem absorbance v oblasti vlnové délky okolo 260 nm
–
Z hodnot optické hustoty lze koncentraci a čistotu vzorku stanovit podle empirických vztahů. Stupeň čistoty nukleových kyselin se stanovuje z poměru absorbance při 260 a 280 nm. Při znečištění vzorku proteiny, jejichž absorpční maximum leží okolo 280 nm, bude vypočtený poměr výrazně nižší a stanovení koncentrace NK nebude přesné
•
Fluorescenční metoda –
Je vhodná u vzorků s nízkou koncentrací nukleových kyselin nebo znečištěných přítomností jiných látek
–
Využívá se fluorescence, k níž dochází po ozáření komplexu ethidium bromidu
navázaného
na
DNA
UV
světlem.
Vzniká
viditelné
červenooranžové světlo o vlnové délce 590 nm, jehož intenzitu lze srovnat s intenzitou standardu o známé koncentraci buď vizuálně nebo po pořízení fotografického záznamu. Stanovení se provádí na agarózových gelech s nízkou koncentrací ethidium bromidu, na které se testované vzorky buď nakapou nebo podrobí elektroforéze, která umožní částečnou purifikaci (očištění) nukleových kyselin (Šmarda et al., 2005).
2.4.1.2 Polymerázová řetězová reakce Polymerázová řetězová reakce (Polymerase Chain Reaction - PCR) je nejčastěji používanou molekulárně-biologickou amplifikační technikou v diagnostice. Cílová DNA bývá často ve vzorcích analyzovaných většinou pro účely genotypizace nebo detekce mikroorganismů přítomna v tak nízkých koncentracích, že ji není možno po izolaci přímo detekovat. Proto je nezbytné zvýšit analytickou sensitivitu její mnohonásobnou replikací (9). Polymerázová řetězová reakce, patentovaná v roce 1987 v USA, způsobila revoluci ve světě molekulární biologie. Důvodem je možnost vytvořit pomocí této poměrně jednoduché metody velké množství kopií určitého úseku DNA. Je to vlastně jakási replikace in vitro. Pomocí takto získaných kopií DNA lze detekovat předpoklady organismů pro určitou vlastnost, jejíž projev je samozřejmě i výsledkem spolupůsobení vnějších vlivů.
20
Autor metody, Kary B. Mullis, byl za svůj objev oceněn v roce 1993 Nobelovou cenou a PCR, včetně svých modifikací, se za několik málo let rozšířila do laboratoří celého světa (Štorchová, 1999). Přestože je princip PCR velmi jednoduchý, praxe má bohužel často k jednoduchosti daleko vzhledem k mnoha vzájemně spolupůsobícím faktorům ovlivňujícím konečný výsledek. I pro odborníky v oblasti molekulární biologie občas zůstává záhadou, proč určitý cyklus funguje a jiný ne nebo proč funguje jedna dvojice primerů (jednořetězcových oligonukleotidů), zatímco jiná ne. Proto je zpravidla nutno konkrétní hodnoty jednotlivých parametrů (koncentrace iontů, teplotní režim atd.) empiricky vyzkoušet (Zima et al., 2004).
Princip metody Polymerázová řetězová reakce je enzymová metoda umožňující mnohonásobné namnožení vybraného úseku DNA in vitro (11). Je založena na annealingu, neboli připojení, extenzi (prodlužování) primerů a geometrické amplifikaci (namnožení) molekul DNA za cyklického opakování tří kroků lišících se pouze teplotními podmínkami. Syntézu DNA řízenou templátem (matricovou DNA) katalyzuje termostabilní DNA polymeráza (Knoll a Vykoukalová, 2002). DNA polymeráza je izolovaná z termofilních bakterií, žijících v pramenech horkých až 100 ºC, která vykazuje dostatečnou enzymovou aktivitu po celou dobu syntézy. Nejpoužívanější termostabilní polymeráza je Taq, která pochází z eubakterie Thermus aquaticus (11). V současné době už však Taq DNA polymeráza není získávána izolací z bakterií, ale její produkce se stala předmětem genového inženýrství. Činnost enzymu je závislá na mnoha faktorech: kvalitě a koncentraci templátové DNA, primerech, přítomnosti stimulátorů (MgCl2, KCl) nebo inhibitorů její aktivity (ethanol, močovina) atd. PCR umožňuje současnou syntézu obou komplementárních vláken extenzí dvou primerů (jednořetězcových oligonukleotidů) připojených ke komplementárním řetězcům na protilehlých koncích templátu. Umístění obou primerů tak ohraničuje amplifikovaný úsek DNA (Knoll a Vykoukalová, 2002). Roztok pro PCR obsahuje DNA templát, směs všech čtyř nukleotidů dNTP (dATP, dGTP, dCTP, dTTP), dvojici primerů, Taq DNA polymerázu, komerčně dodávaný pufr, MgCl2 a kvalitní redestilovanou vodu (Zima et al., 2004).
21
Polymerázová řetězová reakce je cyklické opakování tří základních kroků: 1) oddělení vláken dvoušroubovice DNA teplotní denaturací (teplotou vyšší než 92 ºC) 2) annealing – připojení primerů ke komplementárním úsekům DNA (při teplotě 45 – 72 ºC) 3) elongace (prodloužení) připojených primerů termostabilní DNA polymerázou (72 ºC) Cyklickým opakováním kroků (20 - 50 krát) dochází k syntéze úseku ohraničeného primery. Protože produkty předcházejícího cyklu jsou templáty cyklu následného, stoupá násobně počet kopií syntetizovaného úseku v každém cyklu. Metoda poskytuje až 109 násobné pomnožení cílového úseku DNA během 2 - 3 hodin. Cyklické změny teplot reakční směsi lze řídit automatizovaně v termocykléru. Mikrozkumavky nebo destičky s reakční směsí jsou v termocykléru uloženy v kovovém bloku, jehož teplota je řízena podle programu, nastaveného uživatelem. Produkty polymerázové řetězové reakce jsou potom dále zpracovávány, separovány, vizualizovány, identifikovány a charakterizovány dalšími metodami (různé typy elektroforéz, hybridizační metody, sekvenování atd).
Nevýhody PCR •
Jednou komplikací je právě její účinnost a specifita. Stačí i třeba minimální kontaminace nějakou cizí DNA, například zanesení DNA do roztoku používaných primerů, a výsledky reakce ztrácejí jakoukoliv výpovědní hodnotu. V laboratořích specializovaných na diagnostiku s využitím PCR nebo v laboratořích kriminalistů znají řadu postupů, jak riziko kontaminace snížit. V mnoha případech jde totiž do slova a do písmene o život.
•
Další vadou PCR je nepřesnost používaných enzymů. Termostabilní polymerázy pracují v extrémních podmínkách a poměrně často (podstatně častěji než ostatní DNA polymerázy) zařazují do řetězce chybné nukleotidy. Pro přesné syntézy konkrétních úseků genů je proto třeba věnovat dostatečnou pozornost kontrole výsledku (6).
22
2.4.1.3 Elektroforéza Základní metodou identifikace, separace a purifikace nukleových kyselin nebo fragmentů DNA je elektroforéza v agarózovém nebo polyakrylamidovém gelu. Fragmenty nukleových kyselin jsou rozděleny v elektrickém poli od katody k anodě. Jako mobilní fáze se používá agarózový nebo polyakrylamidový gel (PAGE) (11). Zařízení se skládá z elektroforetické vany s anodou, katodou a pufrem, vlastního držáku gelu, ve kterém bude k separaci docházet, a externího zdroje stejnosměrného napětí. Gelový přípravek se nalije do vaničky (agarózová elektroforéza) nebo mezi skla (polyakrylamidová elektroforéza) a nechá se ztuhnout. Jamky (starty) pro umístění vzorků se tvoří pomocí tzv. hřebenů s definovanou šířkou, které se vsunou do gelu před zatuhnutím. Nukleové kyseliny migrují směrem k anodě (+ pólu). Rychlost pohybu studované NK závisí jednak na vlastnostech NK (molekulová hmotnost – velikost, elektrický náboj, prostorové uspořádání), na vlastnostech nosiče (gelu), prostředí (pufru) a na přivedeném napětí. Obecně platí, že molekuly větší velikosti a složitější prostorové struktury prochází gelem pomaleji, tj. zůstávají blíže místu nanesení vzorků (startu). Pro separaci molekul o určité velikosti je třeba volit správnou koncentraci gelu.
2.4.1.3.1 Agarózová elektroforéza Jako prostředí pro dělení slouží gel z agarózy (polysacharid izolovaný z mořských řas). Připravuje se rozvařením práškové agarózy v elektroforetickém pufru, tuhne za pokojové teploty. Gely se většinou sestavují jako horizontální (separace na vodorovné ploše). Koncentrace agarózy určuje velikost pórů a tím propustnost pro DNA určité velikosti. Homogenita a rozlišovací schopnost je nižší než u polyakrylamidového gelu, ale špičkové vysoce kvalitní agarózy se vlastnostem polyakrylamidu přibližují. Velmi snadná příprava gelů však tuto nevýhodu vyváží (Knoll a Vykoukalová, 2002). Typy agarázových gelů: •
Klasické (standardní) agarózy. Teplota tání se pohybuje mezi 85 a 95 °C a teplota tuhnutí gelu mezi 35 a 42 °C. Standardní agarózy (o koncentraci 0,7 – 4 %) umožňují purifikaci a separaci nativní, štěpené nebo amplifikované DNA a samozřejmě i RNA. (Separaci fragmentů delších než 40 kb nelze uskutečnit klasickou elektroforézou. Na dělení fragmentů 40 kb – 5 Mb se používá pulzní elektroforéza).
23
•
Agarózy s nízkou teplotou tání a zgelovatění jsou výsledkem hydroxyetylace agarózy. Tyto vlastnosti (teplota tání 40 – 65 °C, teplota zgelovatění 8 – 35 °C) umožňují jednoduchou purifikaci DNA a enzymatické pochody uvnitř gelu. Může sloužit jako rezervoár vyřezaných DNA fragmentů (po separaci) pro následnou amplifikaci.
•
Chemicky modifikované agarózy mají příznačně vyšší síťovací vlastnost, čímž se přibližují k rozlišovací schopnosti polyakrylamidového gelu, a tak umožňují analýzu fragmentů DNA lišících se o 4 bp při délkovém rozmezí 200 - 800 bp.
2.4.1.3.2 Polyakrylamidová elektroforéza Polyakrylamidový gel umožňuje separaci dvouvláknové i jednovláknové nukleové kyseliny. Oproti agaróze má tři výhody: 1. má vyšší rozlišovací schopnost 2. umožňuje akomodaci většího množství NK než agarózový gel 3. DNA získávána zpět z PAGE je extremně čistá (11).
U polyakrylamidové elektroforézy slouží jako prostředí pro dělení gel tvořený polyakrylamidem. Gel má vynikající homogenitu a rozlišovací schopnost. Gely se tvoří polymerací monomerů akrylamidu křížově sesíťovaného pomocí látky bis-akrylamid. Koncentrace akrylamidu určuje velikost pórů podobně jako u agarózy. Nevýhodou použití PAGE je vysoká toxicita akrylamidu.
Typy polyakrylamidových gelů: •
Denaturující gely – na gel se nanáší teplotně denaturovaná DNA (jednořetězcová) a dělení probíhá za přítomnosti denaturantu v gelu. To způsobí, že se molekuly separují jen na základě své velikosti, vyloučí se tak vliv prostorové struktury a složení bází. Využívá se především pro určení velikosti DNA, při testování mikrosatelitů a sekvencování. Většinou je ve vertikálním provedení.
•
Nedenaturující gely (nativní) – vzorek se separuje nedenaturovaný. Výhodou je možnost barvení ethidium bromidem. Mobilita DNA je ovlivněna prostorovou strukturou DNA a proto ji nelze použít pro přesné stanovení velikosti molekul.
24
•
Denaturující gradientové gely - používají se pro separaci stejně dlouhých fragmentů lišících se svou sekvencí. Využívá se při metodě denaturační gradientová gelová elektroforéza (DGGE) (Knoll a Vykoukalová, 2002).
2.4.1.4 Vizualizace elektroforetických gelů Po proběhnutí elektroforézy je třeba identifikovat polohy rozdělených molekul, které nejsou pouhým okem viditelné. K tomuto účelu musí být DNA nějakým způsobem označena nebo obarvena. Molekuly DNA lze snadno zviditelnit, např.: •
Přímým barvením vhodným barvivem
Nejjednodušší a nejlevnější
Barvivo se váže na DNA
Zbarvení je proporcionální koncentraci DNA a tím i velikosti fragmentů
Mezi tyto systémy patří např. značení ethidium bromidem. Ethidium bromid je vmezeřující barvivo, které se skutečně vmezeří do záhybů dvoušroubovice DNA a zůstane v nich poměrně pevně zaklíněno. Po tomto kroku následuje zviditelnění fragmentů DNA v ultrafialovém světle na transluminátoru. •
Koncovým značením 32P označených dNTP připojených na konce fragmentů DNA
Lze aplikovat jen na vysoce přečištěné sekvence
Každý fragment má stejný počet konců, intenzita značky není závislá na délce fragmentu
Polohy proužků na gelu se znázorní autoradiograficky
Je citlivější než barvící metody, ovšem dražší
Vzhledem k bezpečnostním komplikacím s použitím a skladováním radioaktivních látek je na ústupu
•
Hybridizací se značenou sondou (Šmarda et al., 2005)
Obarvený gel se obecně nazývá elektroforetogram. Po inkubaci s barvicím roztokem se na gelu objeví systém různě situovaných a různě intenzivních skvrn, které označujeme obecně jako „proužky“, přestože většinou mají elipsovitý až kruhový tvar. Každý proužek na gelu představuje jednu alelu o specifické velikosti.
25
2.4.2 Využití polymerázové řetězové reakce Praktický význam polymerázové řetězové reakce je nedozírný. Tím, že dokáže i z nepatrného množství nepurifikované DNA amplifikovat požadovaný úsek DNA je prakticky nezbytným krokem pro některé další molekulární metody, například pro sekvenování DNA (Zima et al., 2005).
2.4.2.1 Sekvenování Sekvenování je časově i finančně náročná metoda umožňující určení přesného pořadí nukleotidů v určité sekvenci DNA (Průša, 1997). Existují dvě varianty této metody: enzymová (Sangerovo sekvenování) a chemická (Maxamovo-Gilbertovo sekvenování). Chemická metoda využívá fragmenty DNA terminálně značené pomocí
32
P, které jsou
vystaveny působení chemických činidel štěpících specificky v určitém místě molekuly DNA (11). Chemická metoda se dnes provádí již výjimečně. Většina sekvenačních metod je založena na enzymatické reakci (Sanger et al., 1977). Enzymová metoda využívá při stanovení sekvence DNA matrici ve formě PCR produktu, ke které se pomocí DNA polymerázy komplementárně syntetizují různě dlouhé řetězce DNA. Tato metoda je používaná při automatickém sekvenování. Materiálem pro automatické sekvenování jsou fragmenty DNA, které vznikají při asymetrické PCR. První část tohoto uspořádání PCR probíhá standardně, tzn. se dvěma primery v jedné reakci. V druhé části probíhá vlastní asymetrická PCR, kdy je v jedné reakci použit vždy jen jeden primer. Dochází tak k amplifikaci jen jednoho ze dvou řetězců. V reakční směsi jsou spolu se standardními deoxyribonukleozidtrifosfáty (dNTPs) použity i jejich čtyři fluorescenčně značené analogy dideoxyribonukleozidtrifosfáty (ddNTPs) (11). Tyto analogy nemají OH skupinu nutnou pro navázání dalšího nukleotidu. Jejich zařazením do řetězce DNA se reakce zastaví. Tak jsou získány fragmenty různé délky končící vždy příslušným ddNTPs (Knoll a Vykoukalová, 2002). Tyto fluorescenčně značené produkty jsou následně elektroforeticky za denaturačních podmínek rozděleny na polyakrylamidovém gelu nebo v kapiláře automatického sekvenátoru a detekovány. U automatických přístrojů je délka fragmentů snímána pomocí laserového detektoru. Laserem excitované fluorescenční barvičky emitují záření různých vlnových délek podle typu použitého fluorochrómu. Pořadí nukleotidů je automaticky
26
odečítáno detektorem a zaznamenáváno v počítači. Sekvence je následně komplexně analyzována speciálním softwarovým programem (11). Reakce se provádí na termocykléru pomocí Taq DNA polymerázy, všechny čtyři reakce je možno provést v jedné zkumavce a elektroforetické dělení je také z jednoho vzorku (Průša, 1997).
2.4.2.2 Detekce polymorfismů Na polymorfismu, tj. variabilitě v sekvencích DNA, jsou založeny DNA markery. Jako DNA markery mohou být využity jen ty sekvence, které mají následující vlastnosti (Řepková a Relichová, 2001): •
vysoký polymorfismus
•
častý výskyt v genomu
•
nezávislost na podmínkách prostředí
•
snadné a rychlé testování
•
vysoká reprodukovatelnost
•
aplikovatelnost u všech organismů, kde je zvládnutá technika izolace DNA
•
aplikovatelnost i při minimálním množství biologického materiálu
Typy DNA markerů Podle cíle studia je třeba zvolit nejvhodnější typ markeru. Typy DNA markerů lze rozdělit dle několika kritérií, jedním z nich je např. rozdělení dle použité metody, jak uvádí Bednář a Vyhnánek (2004): •
Markery založené na hybridizaci DNA. DNA profily se vizualizují prostřednictvím hybridizace fragmentů DNA, štěpené restrikčním enzymem se značenou sondou (DNA sonda je fragment DNA známého původu a sekvence).
•
Markery založené na polymerázové řetězové reakci. Jsou to markery založené na in vitro amplifikaci určitých sekvencí DNA nebo lokusů prostřednictvím specifických i nespecifických primerů (nukleotidových sekvencí) za účasti termostabilního enzymu DNA polymerázy. Amplifikované fragmenty se separují elektroforeticky a spektra jsou detekována po obarvení (např. ethidium bromidem) nebo autoradiograficky.
27
2.4.2.2.1 Hybridizace nukleových kyselin Jde o laboratorní techniku umožňující identifikovat specifické nukleotidové sekvence pomocí značených nukleotidových sond. Sondou bývá jednořetězcová DNA o délce 10 až 1000 bází (2). Sondy hybridizují (za určitých podmínek) s vyšetřovanou nukleovou kyselinou pouze v případě, že obsahuje komplementární sekvenci. Můžeme si je přitom uměle připravit tak, aby měly námi zvolenou sekvenci. Sondami tedy můžeme vyšetřovat přítomnost určité konkrétní sekvence ve vzorku nukleových kyselin, např. vyšetřit přítomnost chorobné nebo zdravé alely genu (4). Abychom snadno prokázali, že k hybridizaci došlo, připojíme při syntéze sondy k její molekule chemickou značku pro její detekci. Značka může být radioaktivní (izotopy vodíku, uhlíku, fosforu) nebo neradioaktivní (fluorescein, biotin, digoxigenin). Průkaz radioaktivní sondy se provádí autoradiografií, průkaz neradioaktivních značek buď přímo detekcí fluorescence (značení fluoresceinem) nebo pomocí protilátky konjugované s enzymem poskytujícím barevnou reakci v místě kontaktu se značenou sondou (2). Hybridizační techniky jsou založeny na specifickém spojení komplementárních nukleotidových sekvencí pocházejících z různých molekul nukleových kyselin. Vyšetřovaná nukleová kyselina může být buď dvouvláknová - DNA nebo jednovláknová - RNA. Pokud jsou některé z molekul dvouvláknové, musíme je před hybridizací nejdříve vystavit podmínkám, které povedou k jejich denaturaci (oddělení komplementárních vláken DNA) - namísto prostého působení vysoké teploty se obvykle používá chemický roztok, obsahující denaturační činidlo (např. močovina nebo formamid). Při vlastní hybridizaci nejprve smísíme sondu s vyšetřovanou nukleovou kyselinou a zajistíme vhodné podmínky pro hybridizaci. Poté je potřeba odmýt sondu, která se nenavázala na vyšetřovanou nukleovou kyselinu, abychom při detekci "zviditelnili" jenom sondu navázanou na vyšetřovanou DNA. Proto je nutné, aby byla vyšetřovaná nukleová kyselina přichycena k pevnému podkladu. Používají se membrány (nitrocelulózová nebo nylonová), ke kterým lze nukleové kyseliny přichytit různými způsoby. Výhodou přichycení je nejen možnost odmýt nenavázanou sondu, ale také působit během hybridizace a při následné detekci značené sondy na přichycenou nukleovou kyselinu různými roztoky (4).
28
Faktory ovlivňující rychlost hybridizace (Šmarda et al., 2005) •
velikost sondy
•
teplota
•
iontová síla roztoku
•
stupeň komplementarity DNA a sondy
•
koncentrace sondy
•
komplexita sondy (přítomnost autokomplementárních sekvencí)
•
nukleotidové složení sondy
•
přítomnost denaturačních činidel (formamid)
•
viskozita
•
pH
2.4.2.2.1.1 Hybridizace na pevných nosičích Provádí se na pevných nosičích, na kterých je polynukleotid vázán a je současně schopen hybridizace, přestože kinetika této reakce je pomalá a relativně málo efektivní. Mezi varianty hybridizace na pevném nosiči patří např. Southernův přenos, Northernový přenos a hybridizace in situ. Imobilizace vzorku se provádí nejčastěji na membrány z nitrátu celulosy nebo nylonu. Přenosu DNA na pevný nosič předchází depurinace, alkalická denaturace a neutralizace. Přenos se uskuteční buď prostou difuzí na podkladě kapilárních sil nebo za pomoci vakua nebo působením elektrického proudu (electroblotting). Permanentní fixace na membránu se docílí např. působením UV světla (Průša, 1997).
Southernův přenos (blotting) Southernův blotting je starší metodou sloužící k identifikaci fragmentů DNA, které obsahují hledanou sekvenci. Tato metoda, kterou vyvinul Southern (1975), je považována za královnu mezi metodami molekulární genetiky. 5 až 10 µg DNA je štěpeno příslušnou restrikční endonukleasou. Vzniklé fragmenty DNA jsou separovány (většinou) na horizontální elektroforéze v agarózovém gelu, ve kterém se rozdělí podle velikosti. Tato mobilní fáze není vhodná pro další analýzu, a proto je DNA denaturována a následně fixována na pevném nosiči (nitrocelulosová nebo
29
nylonová membrána). Princip přenosu spočívá v kapilárním, vakuovém nebo elektrickém transferu (electroblotting) fragmentů DNA z mobilní fáze (z gelu) na pevnou fázi (membrána). Vazba na pevnou fázi je mechanická (působení teplem 2 hodiny při 80 °C) nebo chemická (kovalentní vazba). Pozice jednotlivých fragmentů po elektroforetickém rozdělení jsou během přenosu zachovány. Vzorky fixované na membráně jsou inkubovány se značenou sondou při 65 °C po dobu 12 - 24 hodin. Značená sonda hybridizuje k oblasti DNA, která je předmětem analýzy. Po odmytí přebytečných sond je vlhká membrána zabalena do potravinářské folie, přiloží se k ní RTG film a zesilovací fólie a autoradiografie probíhá 1 - 21 dnů dle intenzity signálu při -80 °C. Sondy jsou značeny před hybridizací, většinou radioaktivně, použitím radioaktivního fosforu navázaného na dNTP. Southernova analýza v porovnání s metodami PCR je časově náročná, ale velice spolehlivá při specifických analýzách (11).
Northernový přenos Jde o obdobu Southernova blottingu, kde se namísto DNA používá RNA.
In situ hybridizace Tato metoda je založena na tom, že hybridizace probíhá v morfologicky intaktní tkáni, v buňkách nebo na chromozomech, které jsou fixovány na mikroskopickém sklíčku. Demonstruje se genetická informace v morfologickém kontextu a metoda sdružuje standardní světelnou mikroskopii s detekcí hybridizace. Hybridizaci se značenou sondou může předcházet amplifikační reakce (nepřímá in situ PCR). Přímá in situ PCR inkorporuje marker vázaný na oligonukleotidový primer nebo na dNTP přímo. Následuje obvykle detekce protilátkou a vizualizace. Celý proces může být automatizován. Příkladem je metoda FISH (fluorescenční in situ hybridizace) (Průša, 1997).
2.4.2.2.1.2 Polymorfismus délky restrikčních fragmentů (RFLP) RFLP je jednou z nejjednodušších metod využívaných ke studiu polymorfismu i k mapování genů. Dnes je RFLP využívána především ve spojení s PCR. Tato PCRRFLP je někdy nazývána CAPS (cleaved amplified polymorfic sequence – štěpení amplifikovaných polymorfních sekvencí).
30
Pomocí polymorfismu délky restrikčních fragmentů (RFLP – Restriction Fragment Length Polymorphism) se identifikují alely (u klasické RFLP) na základě přítomnosti nebo absence specifického restrikčního místa. Genomová DNA je štěpena příslušnou restrikční endonukleasou, separována elektroforézou na agarózovém gelu a přenesena na pevnou membránu pomocí tzv. Southernova přenosu (Southern, 1979). Po hybridizaci se značenou sondou a vizualizaci lze zjistit polymorfismus ve velikosti restrikčních fragmentů DNA. Restrikční endonukleasy jsou enzymy, které se specificky vážou na DNA a štěpí ji ve specifických místech nacházejících se uvnitř nebo blízko rozpoznávací sekvence. Tyto enzymy jsou rozděleny do tří skupin: endonukleasy typu I, II a III. Endonukleasy typu I a III nemají přesnou polohu štěpení vzhledem k rozpoznávací sekvenci a proto se běžně nepoužívají. V molekulární diagnostice se používají endonukleasy tupu II. Tyto endonukleasy štěpí vždy ve stejném místě, které se nachází v rozpoznávací sekvenci a nebo v její těsné blízkosti. Rozpoznávací sekvence bývají většinou dlouhé 4 až 6 nukleotidů. Restrikční enzymy štěpí DNA dvěma způsoby: rozštěpí obě vlákna ve stejném místě (tzv. tupé konce) nebo štěpí každé vlákno v jiné poloze (tzv. kohezní konce) (Knoll a Vykoukalová, 2002). RFLP je technika spolehlivá, reproducibilní. Její nevýhodou je vysoká náročnost na zkušenost pracovníků a na kvalitu DNA připravené z analyzovaného materiálu (Helentjaris, 1987). Metoda je vhodná pro geny s větším polymorfismem nebo nekódující sekvence (analýzy intronů) (Knoll, 1998).
2.4.2.2.2 Modifikace polymerázové řetězové reakce Bylo vyvinuto mnoho modifikací polymerázové řetězové reakce, které umožňují detailní studium sekvencí DNA (RNA).
Náhodně amplifikovaná polymorfní místa (RAPD) AP-PCR (Arbitrarily Primed PCR) a RAPD (Randomly Amplified Polymorphic DNAs) jsou v podstatě stejné techniky. Hodně molekulárních biologů používá častěji RAPDs (Ovesná et al., 2002). RAPD je metoda založená na PCR, při které se používají velmi krátké primery (dlouhé okolo deseti nukleotidů) a nízké teploty zchlazení. Tyto primery se dají univerzálně použít pro prakticky jakýkoliv organismus.
31
Do reakční směsi pro PCR se přidává jen jeden primer, který má díky své malé délce řadu komplementárních míst na různých místech genomu. S velkou pravděpodobností se pak stane, že dva primery nasednou na komplementární vlákna DNA poměrně blízko sebe (zhruba do 1000 bp) a takto označený fragment se namnoží při PCR. Obvykle se při jedné PCR takových dvojic najde více a vzniká směs fragmentů o různé délce, které lze elektroforeticky analyzovat (běžně se používají horizontální agarózové gely). Soubor proužků na gelu, představujících jednotlivé fragmenty, může vytvářet druhově specifický vzor, popřípadě (při použití více primerů) mohou být v některých případech rozlišeny jednotlivé populace nebo dokonce jedinci. Vážnou komplikací je například nízká opakovatelnost experimentů. Liší se nejen výsledky stejných protokolů prováděných v různých laboratořích, ale někdy i opakování pokusů ve stejné laboratoři při zcela shodných podmínkách. Metoda je totiž velmi citlivá i na sebemenší změny i na nepatrné kontaminace. Jinou komplikací je také dominance fragmentů, která znemožňuje rozlišení heterozygotů od dominantních homozygotů. Velkým problémem RAPD je i to, že během PCR jsou často amplifikovány i fragmenty se sekvencemi, které se vůbec nevyskytují v DNA templátu. Jako vzor pro tyto fragmenty zřejmě slouží různě pospojované produkty předchozích cyklů (Zima, et al., 2005). Velkou výhodou RAPD je její jednoduchost, cenová dostupnost a rychlost. Touto technikou je možné analyzovat jakýkoliv organismus a není třeba mít žádné předběžné znalosti o jeho genomu (Iqbal et al., 2000).
Polymorfismus délek amplifikovaných fragmentů (AFLP) AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) je metoda využívající PCR a štěpení restrikčními enzymy. Výhodou této metody je, že dokáže rychle vygenerovat velké množství polymorfních markerů i u druhů, u kterých nemáme žádnou předchozí genetickou informaci. Na rozdíl od RAPD tato metoda vyniká vysokou mírou opakovatelnosti. Nevýhodou proti RAPD však je vyšší cena i technická náročnost. K vyhodnocení vzniklých fragmentů se totiž většinou používá sekvenátor (Zima, et al., 2005). AFLP probíhá v několika krocích: •
Štěpení
genomové
DNA
restrikční
endonukleasou
a
ligace
(připojení)
oligonukleotidkových adaptorů (Matthes et al.,1998). Nástavce jsou krátké úseky
32
•
DNA o známé sekvenci, které se vážou na konce fragmentů, vytvořených příslušnou restrikční endonukleasou. Restrikční štěpení a připojování nástavců probíhá současně a opětovnému spojení odštěpených fragmentů je zabráněno stálou přítomností restriktázy.
•
Preselektivní amplifikace
•
Selektivní amplifikace
•
Analýza fragmentů na polyakrylamidovém gelu nebo přesněji a snadněji v sekvenátoru.
Reverzní PCR (RT-PCR) RT-PCR je modifikace PCR, při které je jako templát využita RNA. Nejprve je RNA přepsána enzymem reverzní traskriptázou do DNA a ta je pak namnožena pomocí normální PCR. Využití RT-PCR je poměrně široké, nejčastěji se však používá k velmi přesné detekci a kvantifikaci konkrétní mRNA v různých tkáních. Úspěšnost RT-PCR je ovšem silně závislá na kvalitě izolované RNA a na stupni její degradace.
Real-Time PCR Tato metoda umožňuje přesně zjistit množství produktu během každého jednotlivého kroku (Zima et al., 2005). Amplifikace probíhá obvyklým způsobem jako standardní PCR. Reakční směs obsahuje kromě dvojice primerů ještě specifickou vnitřní sondu (Taq Man sonda), která je fluorescenčně značená na 3´ konci tzv. zhášečem (enhancer) a na 5´ konci tzv. reportérem. Pokud amplifikace neprobíhá, je energie vyzařovaná reportérem pohlcována zhášečem. V případě amplifikace dojde k rozštěpení této vnitřní sondy. V důsledku toho se reportér dostane z dosahu zhášeče a přístroj zaznamená fluorescenční signál (Bednář a Vyhnánek, 2004). Real-Time PCR samozřejmě vyžaduje speciální cyklér, který dokáže změřit množství fluorescenčně značených sond navázaných na fragmenty DNA, které vznikají během amplifikačních cyklů. Po srovnání se známými kalibračními křivkami je možné velmi přesně odhadnout množství DNA (nebo případně RNA), která vstoupila do reakce (tedy
33
množství původního templátu), přestože se často jedná i jen o několik molekul (Zima et al., 2005).
Výhody a nevýhody metod založených na principu PCR I když se polymerázová řetězová reakce stala základem pro řadu dalších speciálních technik, má široké uplatnění v celém biologickém výzkumu a stále častěji se stává metodou používanou pro objasňování genetické problematiky, tak i tato metoda má své výhody a nevýhody. Výhody: •
z malého počtu molekul templátové DNA lze amplifikovat velký počet kopií,
•
metoda je nenáročná na kvalitu templátové DNA,
•
celý proces amplifikace je plně automatizován (termocyklér),
•
pro PCR klonování není třeba živých vektorů (plazmidy, viry, cosmidy),
•
metoda je vysoce citlivá – možnost detekce bodových mutací,
•
PCR markery podávají přímou informaci o genetické výbavě organismu,
•
Počet PCR a RAPD markerů je téměř neomezený,
•
Metoda je aplikovatelná v různých sférách výzkumu,
•
Metoda je aplikovatelná u všech organismů,
•
Pro PCR analýzu lze použít téměř libovolnou část těla organismu,
•
PCR analýza je ve srovnání s RFLP časově méně náročná,
•
Při PCR nejsou ve srovnání s RFLP používány radioaktivní látky,
•
V současnosti existuje velký počet komerčních firem materiálově zajišťujících realizaci PCR
Nevýhody: •
velikost amplifikovaných fragmentů je omezená,
•
reakce termostabilních DNA polymeráz je zatížená určitou chybou,
•
existuje snadná možnost kontaminace PCR cizorodou DNA,
•
mnoho PCR markerů není kodominantních, (Vejl, 1997).
34
3. ZÁVĚR Cílem této bakalářské práce bylo prostudovat doporučenou literaturu a zpracovat ji formou literární rešerše v oblasti metod analýzy genomu kvasinek. Kvasinky jsou široce využívány v řadě oblastí vědy, technologie i medicíny. Některé druhy jsou nezastupitelné v potravinářském a farmaceutickém průmyslu, jiné jsou využívány jako biologické modelové systémy pro studium obecných regulací metabolismu eukaryotických buněk, další působí jako faktory vyvolávající onemocnění. K velkému pokroku v genetice došlo rozvojem molekulárně-genetických metod. Cílové nukleové kyseliny bývají často v analyzovaných vzorcích kvasinek přítomny v tak malých koncentracích, že je není možné po izolaci přímo detekovat. Proto je nezbytné je mnohonásobně namnožit. Pomocí takto získaných kopií DNA lze detekovat předpoklady organismů pro určitou vlastnost, jejíž projev je samozřejmě i výsledkem spolupůsobení vnějších vlivů. Nejčastěji používanou metodou pro amplifikaci nukleových kyselin se stala polymerázová řetězová reakce. Produkty polymerázové řetězové reakce jsou potom dále zpracovávány, separovány, vizualizovány, identifikovány a charakterizovány dalšími metodami (různé typy elektroforéz, hybridizační metody, sekvenování, atd.) sloužícími k detekci polymorfismu nukleových kyselin. PCR se i se svými modifikacemi za několik málo let po objevení rozšířila do laboratoří celého světa. Detailní studium genomu kvasinek je důležité pro zjištění sekvence genů a celé genetické informace. S takto získanými znalostmi pak můžeme manipulovat v genomu organismů, čímž se zabývá genové inženýrství. Geneticky modifikované kvasinky jsou producenty farmakologických preparátů pro prevenci i léčbu onemocnění. V budoucnu lze předpokládat ještě větší využití kvasinek v dalších průmyslových oblastech, jako je obnova zdrojů energie, environmentální biotechnologie a využití technologie rekombinantní DNA v humánní medicíně.
35
4. SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY
BEDNÁŘ, J., VYHNÁNEK, T.: Genetika rostlin. 1. vydání, Brno: MZLU, 2004, 147 s. BURKE, D., DAWSON, D., STEARNS, T.: Methods in yeasts genetics, New York, 2000, 205 s. HELENTHJARIS, T.: A genetic linkage map for maize based on RFLPs. Trends in Genetic, 1987, 3, 217-221. IQBAL, N., READER, S. M., CALIGARI, P. D. S., MILLER, T. E.: Characterization of Aegilops uniaristata chromosomes by comparative DNA marker analysis and repetitive DNA sequence in situ hybridization. Theoretical and Applied Genetics, 2000, 101, 1173-1179. KIDBY, D. K., DAVIES, R.: Invertase and disulphide bridges in the yeast wall. J. Gen. Microbiol., 1970 (3), 61, 327–333. KNOLL, A., VYKOUKALOVÁ, Z.: Molekulární genetika zvířat. První vydání, Brno: MZLU, 2002, 168 s. MATTHES, M. C., DALY, A., EDWARDS, K. J.: Amplified fragment length polymorphism (AFLP). In: KARP, A., ISAAC, P. G., INGRAM, D. S. (eds): Molecular Tools for Screening Biodiversity. Chapman and Hall, Cambridge, 1998 (1), 99, 183190. OVESNÁ, J., POLÁKOVÁ, K., LEIŠOVÁ, L.: DNA analyse and their Applicationc in Plant Breeding. Czech Journal of Genetics and Plant Breeding, 2002 (1), 38, 29-40. PRŮŠA, R.: Základy analytických metod v klinické molekulární biologii. Praha: 1997, 48 s. ROSYPAL, S.: Úvod do molekulární biologie díl druhý. Třetí inovované vydání, Brno: S. Rosypal, 1999, 274-556 s. ŘEPKOVÁ, J., RELICHOVÁ, J.: Genetika rostlin. První vydání, Brno: Masarykova univerzita, 2001, 269 s. SANGER, F., MICKLEN, S., COULSON, A.R.: DNA sequencing and chain terminating inhibitors. Proc. Natl. Acad. Sci.USA, 1977, 74, 5463-5467.
36
SOUTHERN, E.: Gel elektrophoresis of restriction fragments. Methods Enzymol., 1979, 68, 152-176 ŠILHÁNKOVÁ, L.: Mikrobiologie pro potravináře a biotechnology. Třetí vydání, opravené a doplněné, Praha: Academia, 2002, 363 s. ŠMARDA, J., DOŠKAŘ, J., PANTŮČEK, R., RŮŽIČKOVÁ, V., KOPTÍKOVÁ, J.: Metody molekulární biologie. První vydání, Brno: Masarykova univerzita, 2005, 194 s. ŠTORCHOVÁ, H.: Co lze přečíst v rostlinné DNA. Živa, 1999 (3), 47, 101-104 VEJL, P.: Polymerázová řetězová reakce. Praha: ČZU, 1997: 64 s. ZIMA, J., MACHOLÁN, M., MUNCLINGER, P., PIÁLEK, P.: Genetické metody v zoologii. 1.vydání, Praha: Karolinum, 2004, 239 s.
SEZNAM POUŽITÝCH INTERNETOVÝCH ADRES
(1) FELDMANN, H.: Yeast molecular biology. [online], [cit. 2006-02-07]. Dostupný z WWW:
. (2) KOTRBA, P., KNEJZLÍK, Z., CHODORA, Z.: Izolace, klonování a analýza DNA. [online],
[cit.
2006-04-01].
Dostupný
z WWW:
q=cache:hrq8BW1zXzoJ:www.otevrena-veda.cz/ImgPageC1/Biolog/1kotrba.pdf+ hybridizace+ nukleov%C3%BDch+kyselin&hl=en&ct=clnk&cd=46>. (3) MARKOŠ, A.: Geonomy všech tří říší v databázích. [online], [cit. 2005-12-20]. Dostupný z WWW: < http://www.vesmir.cz/clanek.php3?CID=4219>. (4) RACLAVSKÝ, V.: Metody molekulární genetiky. [online], [cit. 2005-10-23]. Dostupný z WWW: . (5) SLÁDEK, Z.: Struktura živočišné buňky. [online], [cit. 2005-02-06]. Dostupný z WWW: . (6) STORCHOVÁ, Z.: Molekuly na povel IV. [online], [cit. 2006-01-05]. Dostupný z WWW: .
37
(7) SULLIVAN, J. A.: Animal cell. [online], [cit. 2005-11-04]. Dostupný z WWW: . (8)
ŠÍPEK
A.:
Eukaryota.
[online],
[cit.
2006-02-11].
Dostupný
z WWW:
. (9) ŠUBRT, I.: Metody molekulárně genetické diagnostiky. [online], [cit. 2006-04-14]. Dostupný z WWW: .
(10)
Cellular
Organelles.
[online],
[cit.
2005-11-03].
Dostupný
z
WWW:
. (11) Používané metody. [online], [cit. 2006-04-19]. Dostupný z WWW: . (12) Vznik života na zemi. [online], [cit. 2005-04-19]. Dostupný z WWW: . (13)
What
is
a
cell?
[online],
[cit.
2005-12-15].
Dostupný
z WWW:
