MENDELOVA ZEMĚDĚLSKÁ A LESNICKÁ UNIVERZITA V BRNĚ AGRONOMICKÁ FAKULTA
DIPLOMOVÁ PRÁCE
BRNO 2008
VERONIKA BEŇOVÁ
Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav biologie rostlin
Vliv dusíkatých látek na dormanci semen Nicotiana benthamiana Diplomová práce
Vedoucí práce: Ing. Helena Vlašínová, Ph.D.
Vypracovala: Bc.Veronika Beňová
Brno 2008 2
PROHLÁŠENÍ
Prohlašuji, že jsem diplomovou práci na téma Vliv dusíkatých látek na dormanci semen Nicotiana benthamiana vypracovala samostatně a použila jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém seznamu literatury. Diplomová práce je školním dílem a může být použita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího diplomové práce a děkana AF MZLU v Brně.
dne………………………………………. podpis…………..……………………….
3
PODĚKOVÁNÍ.:
Tímto bych chtěla poděkovat vedoucí mé diplomové práce Ing. Heleně Vlašínové, PhD. za její ochotu a trpělivé vedení při zpracovávání této práce a celému osazenstvu laboratoře v budově F za příjemnou pracovní atmosféru.
4
ABSTRAKT: Cílem této práce bylo nalézt a porozumět mechanismům klíčení a odeznění dormance semen druhu N. benthamiana. U semen tohoto druhu dochází k odeznění dormance během procesu posklizňového dozrávání a také při 4 °C, přičemž posklizňové dozrávání je účinnější při pokojové teplotě. Různé sloučeniny jako kyanid draselný (KCN), ferikyanid draselný (PFC), nitroprussid sodný (SNP), azid sodný (NaN3) a gibeleriny (GA) ruší dormanci semen tohoto druhu v závislosti na použité koncentraci. Exogenní aplikace GA3 na semena neovlivňuje jejich klíčení, přičemž GA4+7 iniciuje klíčení dormantních semen. Paclubutrazol inhibuje klíčení nedormantních semen N. benthamiana. Kyselina abscisová (ABA) inhibuje průchod radikuly, ale neinhibuje prasknutí testy. Je-li ABA odstraněna, semena začínají klíčit. Oxid dusnatý (NO) se účastní procesu odeznění dormance u semen N. benthamiana. Dormantní semena vystavená exogenní aplikaci plynného NO začínají klíčit. Použili jsme průtokového systému k dodání plynného NO. Tento systém umožňuje přesného dodání NO v konstantním množství po delší časový úsek. K detekci plynného oxidu dusnatého produkovaného dormantními semeny jsme použili metodu oxidační kolony. K zjištění endogenní hladiny kyseliny abscisové jsme použili metodu radioimunoanalýzy (RIA). Klíčová slova: dormance semen, klíčení, oxid dusnatý, azid sodný, gibereliny, kyselina abscisová, kyanid draselný, nitroprussid sodný, posklizňové dozrávání
ABSTRACT: A target of this work was to find out and understand how it is possible to enhance germination and break dormancy of seeds of N. benthamiana. Seeds of N. benthamiana were released from seed dormancy by after-ripening at room temperature and also at 4°C during cold treatment. After-ripening at room temperature was proved to be more efficient than cold treatment. Different compounds such as potasium cyanide (KCN), pottassium ferricyanide (PFC), sodium nitroprusside (SNP), sodium azide (NaN3) and giberellins (GA) break seed dormancy of N. benthamiana in dose-dependent manner. Exogenous application of GA3 on seeds had no effect on their germination. However, GA4+7 promoted germination of dormant seeds. Paclobutrazol inhibited germination of non-dormant seeds of N. benthamiana. Abscisic acid (ABA) inhibited a protrusion of radicle but did not inhibite testa rupture. Whenever ABA was removed seeds started to germinate. Nitric oxide (NO) participates in the loss of dormancy of N. benthamiana seeds. An exposure dormant seed to exogenous gaseous NO is sufficient to trigger germination. We used of a flow-through apparatus for delivery of gaseous NO produced by dormant seeds. This apparatus delivers NO at a constant rate for prolonged periods of time. We used an Oxidizer column approach to detect nitric oxide in the gas phase. We used radio immuno assay (RIA) to detection of endogenous levels of abscisic acid (ABA).
Key words: seed dormancy, germination, nitric oxide, sodium azide, giberellins, abscisic acid, potasium cyanide, sodium nitroprusside, after-ripening
5
SEZNAM ZKRATEK: AAO3 - ABA aldehyd oxidáza 3 ABA – abscisová kyselina AOX – alternativní oxidáza BR - brassinosteroidy β Glu- glukan endo-1,3- β glukosidáza, β−1,3-Glukanáza CPS - ent-copalyl difosfát synthetáza c-PTIO - 2-(4-Carboxyphenyl)-4,4,5,5-tetramethylimidazoline-1-oxyl-3 oxid) Cys – aminokyselina cystein FD- fyziologická dormance FYD-fyzikální dormance GA –gibereliny GSH - glutation HR – hypersenzitivní reakce HPLC – vysokoúčinná kapalinová chromatografie LEA – (late embryogenesis abundant) proteiny nutné pro navození desikační tolerance MD- morfologická dormance MFD-morfofyziologická dormance NO-oxid dusnatý NOHA - N-hydroxy-arginin NOS - NO-syntáza Paclobutrazol-(2RS,3RS)-1-(4-chlorophenyl)-4,4-dimethyl-2-(1,2,4-triazolyl)-pentan3-ol) PFC – ferrikyanid draselný PCD – programovalá buněčná smrt PC2 – fytochelatin 2 PR (red) – forma fytochromu absorbující v oblasti vlnových délek 660 nm PFR (far red) - forma fytochromu mající absorpční spektrum v oblasti dlouhovlnného červeného záření při vlnové délce 730 nm ROS - (reactive oxygen species), reaktivní formy kyslíku RPK1 – (receptor-like protein kinase 1), receptor protein-kinázového typu SNP- nitroprussid sodný SOD – superoxid dismutáza
6
OBSAH: 1
ÚVOD........................................................................................................................................9
2
CÍLE PRÁCE ........................................................................................................................10
3
LITERÁRNÍ PŘEHLED.......................................................................................................11 3.1 STAVBA SEMENE ...................................................................................................................11 3.2 DORMANCE SEMEN ...............................................................................................................12 3.2.1 Primární (vrozená) dormance ..............................................................................................12 3.2.2 Sekundární (vyvolaná) dormance.........................................................................................13 3.2.3 Fyziologická dormance (FD) ...............................................................................................15 3.2.4 Morfologická dormance (MD) .............................................................................................16 3.2.5 Morfofyziologická dormance................................................................................................16 3.2.6 Fyzická dormance.................................................................................................................16 3.2.7 Dormance zapříčiněná obaly semene (coat-imposed dormancy).........................................17 3.2.8 Dormance zapříčiněná embryem (embryo dormancy) .........................................................17 3.3 KLÍČENÍ SEMEN .....................................................................................................................18 3.3.1 Podmínky klíčení - vnější......................................................................................................19 3.3.2 Podmínky klíčení semen – vnitřní.........................................................................................20 3.4 NICOTIANA BENTHAMIANA DOMIN ..........................................................................................20 3.5 HORMONÁLNÍ INTERAKCE PŘI UVOLNĚNÍ Z DORMANCE U TABÁKU (NICOTIANA SP.) .............21 3.5.1 ABA jako pozitivní regulátor dormance ...............................................................................23 3.5.2 Gibereliny ruší dormanci a podporují klíčení ......................................................................24 3.6 DUSÍKATÉ SLOUČENINY OVLIVŇUJÍCÍ KLÍČENÍ SEMEN ..........................................................25 3.6.1 Oxid dusnatý (NO)................................................................................................................25 3.6.2 Donory oxidu dusnatého ......................................................................................................28 3.6.3 Příklady ostatních dusíkatých sloučenin iniciujících klíčení................................................30 3.6.4 Kyanidové sloučeniny iniciují klíčení ...................................................................................31
4
MATERIÁL A METODY.....................................................................................................34 4.1 ROSTLINNÝ MATERIÁL ..........................................................................................................34 4.1.1 Nicotiana benthamiana Domin.............................................................................................34 4.1.2 Stanovení klíčivosti semen....................................................................................................34 4.1.3 Chemikálie............................................................................................................................34 4.2 POUŽITÉ METODY ..................................................................................................................35 4.2.1 Detekce oxidu dusnatého pomocí oxidační kolony...............................................................35 4.2.2 Průtokový systém..................................................................................................................37 4.2.3 Radioimunoanalýza (RIA) pro stanovení ABA .....................................................................38 4.2.4 HPLC (Vysoce účinná kapalinová chromatografie) pro stanovení thiolových sloučenin.....39
5
VÝSLEDKY ...........................................................................................................................41
7
5.1 STANOVENÍ KLÍČIVOSTI SEMEN .............................................................................................41 5.1.1 Vliv posklizňového dozrávání na dormanci semen ...............................................................41 5.1.2 Vliv kyanid-obsahujících sloučenin na klíčení semen ..........................................................42 5.1.3 Vliv dusíkatých sloučenin na klíčení semen N. benthamiana ...............................................44 5.1.4 Vliv fytohormonů na klíčení semen N. benthamiana ............................................................48 5.1.5 Vliv etanolu (C2H5OH) na klíčení semen N. benthamiana ...................................................53 5.2 DETEKCE NO PRODUKOVANÉHO SEMENY N. BENTHAMIANA POMOCÍ OXIDAČNÍ KOLONY .....54 5.2.1 Kalibrace oxidační kolony....................................................................................................54 5.2.2 Měření NO produkovaného semeny N. benthamiana ...........................................................55 5.3 STANOVENÍ THIOLOVÝCH SLOUČENIN V SEMENECH N.BENTHAMIANA PO OVLIVNĚNÍ NAN3 ..59 5.4 STANOVENÍ ENDOGENNÍ HLADINY ABA V SEMENECH PO OVLIVNĚNÍ NAN3 .........................61 6
DISKUZE ...............................................................................................................................62
7
ZÁVĚR ...................................................................................................................................65
8
LITERATURA.......................................................................................................................67
9
PŘÍLOHY...............................................................................................................................74 9.1 SEZNAM OBRÁZKŮ ................................................................................................................74 9.2 SEZNAM GRAFŮ .....................................................................................................................75
8
1 ÚVOD Semena hrají podstatnou roli ve výživě lidstva. Není proto překvapující, že biologie semen patří mezi jedno z nejrychleji se vyvíjejících výzkumných odvětví rostlinné fyziologie. Semena obsahují embrya, která tvoří základ nových rostlin, a jsou strukturálně i fyziologicky vybavena pro jejich budoucí růst a vývin. Jejich funkce je založení nové rostliny, a proto se může zdát podivující, že se u nich vyskytuje jev zvaný dormance, který způsobuje vnitřní zábranu klíčení. Je však nutné si uvědomit, že brzké vyklíčení nemusí být pro semeno výhodné, ba naopak, někdy by mohlo znamenat i smrt klíční rostlinky. Semena mnoha druhů rostlin nevyklíčí ihned po odloučení od mateřských rostlin a jsou až do jara dormantní. Tento stav, který je spojen s řadou mechanismů inhibujících klíčení, je rozšířen zvláště mezi druhy mírného pásu. Pro semena je výhodné odložit klíčení do doby, kdy jsou vhodné podmínky pro růst klíčních rostlinek. Vymanění semen z dormantního stavu mohou způsobit určité enviromentální faktory. Často se dormance projevuje jako požadavek dlouhodobého působení snížených teplot. V experimentálních podmínkách je toho dosaženo v procesu zvaném stratifikace, kdy dochází k uskladnění vlhkých semen při teplotách slabě nad nulou. U některých druhů lze pozorovat odeznění dormance i během skladování, v procesu zvaném posklizňové dozrávání, které může reprezentovat přírodní mechanismus kontrolující klíčení v oblastech se suchým klimatem. Neméně důležitým faktorem pro klíčení je i přítomnost světla. Některé druhy jsou fotodormantní a ve tmě neklíčí. Také je známa celá řada chemických sloučenin, které pozitivně ovlivňují klíčení. Tyto sloučeniny mohou být jak přírodní, tak syntetické. Přírodní sloučeniny zastupuje například kyanid, dusitan a dusičnan, k syntetickým pak patří například azid sodný. Takto tedy dormance optimalizuje dobu vyklíčení v populaci semen a svůj velký význam má například u obilovin, kde zabraňuje předčasnému vyklíčení obilky na mateřské rostlině (tzv. porůstání) ještě před sklizní. Jedná se o fenomén, který způsobuje vysoké ztráty v zemědělském průmyslu, a proto je velmi důležité poznat mechanismy spojené s klíčením a odpočinkem semen, aby bylo možné těmto ztrátám zabránit.
9
2 CÍLE PRÁCE Tato diplomová práce byla zaměřena na vliv fytohormonů (ABA, GA), dusíkatých a kyanid obsahujících sloučenin na klíčení semen Nicotiana benthamiana Domin. Také byl zahrnut vliv vybraných faktorů prostředí na dormanci semen tohoto druhu. Dílčí cíle: Sledování vlivu posklizňového dozrávání na vymanění semen z dormance. Vliv oxidu dusnatého na dormanci semen. Stanovení oxidu dusnatého pomocí oxidační kolony. Stanovení thiolových sloučenin v semenech ovlivněných azidem sodným pomocí vysokoúčinné kapalinové chromatografie (HPLC).
Sledování endogenní hladiny kyseliny abscisové (ABA) u semen ovlivněných azidem sodným.
10
3 LITERÁRNÍ PŘEHLED
3.1 Stavba semene Semeno má nejčastěji kulovitý tvar, je chráněno osemením (testou), které vzniká z vaječných obalů (integumentů). Osemení krytosemenných rostlin chrání zárodek proti nepříznivým podmínkám prostředí. Předpokládá se, že hraje roli v období dormance semen, kdy zabraňuje klíčení a omezuje škodlivé účinky fyzikálních a biologických faktorů při skladování semen (Debeaujon et al., 2000). U jednoho pólu semene zůstává jizva (cikatrikula), která je pozůstatkem po otvoru klovém u vajíčka. U druhého pólu se nachází pupek (hilum), jenž vzniká z chalazy, cévního svazku v poutku vajíčka. Na vnitřní stranu osemení navazuje u krytosemenných rostlin endosperm, vnitřní živné pletivo, které vzniká ze zárodečného vaku. Obsahuje škrob a vyživuje zárodek (embryo), který se nachází uprostřed semene (Černohorský, 1967). Zralé embryo tabáku (Nicotiana tabaccum) je obklopeno 2-3 vrstvami buněk endospermu a tenkým osemením (testou), které je z vnější strany tvořeno vrstvou kutinizovaných a lignifikovaných mrtvých buněk a z vnitřní strany vrstvou živých buněk. Při klíčení dochází k praskání endospermu a testy zpravidla na mikropylárním pólu semene (Manz et al., 2005).
Nemikropylární endosperm Dělohy Endosperm Mikropylární endosperm
Plumula
Embryo
o
Testa
Radicula
Obr. 1 Stavba semene Nicotiana tabaccum (upraveno podle Finch-Savage a Leubner-Metzger, 2006)
11
3.2 Dormance semen Dormance je podle Salisburyho (1996) definována jako stav semene (či jiného rostlinného orgánu), které nedokáže klíčit (nebo růst), ačkoliv bylo vystaveno podmínkám vhodným ke klíčení (vhodná vlhkost, teplota dostatek kyslíku), protože nedošlo k zajištění specifických podmínek (perioda nízké teploty, vhodné vlnové délky světla, narušení testy). V širším slova smyslu může být definována jako dočasné zastavení viditelných projevů růstu (Procházka, 2003). Podle řady dalších autorů (Hilhorst, 1995; Bewley, 1997; Li a Foley, 1997) lze tento pojem shrnout do definice: dormance semen je proces blokace klíčení neporušeného životaschopného semene za příhodných vnějších podmínek. Období klidu semen je vrozená vlastnost, jež je vymezena enviromentálními podmínkami, ve kterých je semeno schopné klíčit. Tyto podmínky jsou zčásti zrostředkovány rostlinnými hormony – především kyselinou abscisovou (ABA) a gibereliny (GA) (Finch –Savage a Leubner-Metzger, 2006). Blokace klíčení semen je velmi výhodná pro adaptaci růstu rostlin na sezónní a náhodné změny v podmínkách prostředí. K vyklíčení semene dojde až v době, kdy nastanou vhodné podmínky pro růst nové generace rostlin (Hilhorst, 1995). U velké většiny semen nedochází ke klíčení ihned po odloučení z mateřské rostliny, ale až po určité době klidu, což může trvat i několik let. Neklíčivost semen po uvedenou dobu lze vysvětlit přítomností inhibitorů růstu, především ABA (Kincl, 2000). Tento jev se označuje jako primární dormance (Bewley, 1997). 3.2.1 Primární (vrozená) dormance Tento typ dormance se vyskytuje právě u těch druhů rostlin, jejichž semena jsou neklíčivá ihned po dozrání na mateřské rostlině. Je navozena především inhibičními vlivy ABA během zrání semene na
mateřské rostlině (Finch–Savage a Leubner-
Metzger, 2006). Dormance tohoto typu se projevuje většinou bez ohledu na panující podmínky prostředí a chrání semena, aby nevyklíčila před nástupem nepříznivých podmínek (Hilhorst, 1995). K ukončení tohoto typu dormance je třeba vystavit semena po určitou dobu zvláštním podmínkám, které daný druh k překonání dormance potřebuje. U suchých semen některých druhů rostlin toho lze docílit během procesu
12
posklizňového dozrávání, aplikací rostlinných hormonů, především giberelinů (Kucera et al., 2005), působením např. i oxidu dusnatého (Bethke et al., 2006), dále pak během chladové stratifikace (perioda působení nízkých teplot). Během stratifikačního chlazení dochází k odbourání ABA a k růstu hladiny giberelinů (Procházka et al., 2003). 3.2.1.1 Posklizňové dozrávání Jedná se o proces, který lze charakterizovat jako období několika měsíců, kdy jsou semena uskladněna za pokojové teploty, během nichž dochází k přirozenému odeznění dormantního stavu (Leubner-Metzger, 2003; Kucera et al., 2005). V semenech během této doby dochází k poklesu koncentrace a citlivosti k ABA, zvýšení citlivosti ke giberelinům, a tím ke zvýšení rychlosti klíčení. Mezi parametry, které vymezují tento proces, patří vlhkost semene, obsah olejnatých látek, struktury obklopující embryo a teplota (Manz et al., 2005). K posklizňovému dozrávání nedochází u velmi suchých semen, neboť je vyžadována vlhkost semene dosahující nadprahových hodnot, a tento požadavek je také druhově specifický. Nedochází k němu také při skladování semen za velmi vysoké relativní vzdušné vlhkosti (Probert, 2000). Molekulární mechanismy tohoto procesu nejsou známy. Předpokládá se, že zde dochází k neenzymatickým reakcím, při nichž dojde k odstranění inhibitorů klíčení, reaktivních forem kyslíku (ROS) a antioxidantů. Dochází také ke změnám na membránách a specifické degradaci proteinů proteázami (Kucera et al., 2005). Během posklizňového dozrávání semen Nicotiana tabacum byla prokázána přechodná exprese genů β-1,3-glukanáz v obalových vrstvách semene. Tato exprese byla asociována s rapidním praskáním testy semen tabáku, které nastalo po cca. 60 dnech suchého skladování (Leubner-Metzger, 2005). 3.2.2 Sekundární (vyvolaná) dormance Sekundární dormance vzniká u klíčívých semen (t.j. těch, která primární dormanci již ukončila, nebo ji nikdy neměla) ležících v půdě, jako reakce na určité, většinou nepříznivé vnější podmínky. Sekundární dormance může být indukována u dormantních i nedormantních semen po přerušení kontaktu s mateřskou rostlinou, jsou-li semena vystavena vnějším stresům, které jim neumožňují klíčení (Holec et al., 2005).
13
Dříve byl za hlavní příčinu sekundární dormance považován nedostatek kyslíku nebo vysoký obsah oxidu uhličitého. Efekt anaerobních podmínek na indukci sekundární dormance je poměrně známý. Stejně tak ale může být sekundární dormance vyvolána dlouhodobým pobytem za vlhka v aerobních podmínkách, kdy však nedochází ke klíčení - např. při nízké či vysoké teplotě (Mudroch a Ellis, 2000). Bewley a Black (1994) rozlišují následující typy sekundární dormance: •
Termodormance – je vyvolána působením teplot přesahujících maximum pro klíčení. Tento způsob indukce je poměrně efektivní, uplatňuje se například i při indukci sekundární dormance u semen na povrchu půdy, naopak málokdy je termodormance příčinou sekundární dormance semen v půdě – v těchto podmínkách se obvykle nevyskytují teploty v požadované výši.
•
Skotodormance – nastává, jsou-li semena, která vyžadují ke klíčení světlo, vystavena po dobu několika dní temnu. Během této doby se semena stanou silně dormantními a často se u nich vyvine snížená senzitivita ke světlu. Většinou je tento typ sekundární dormance pozitivně ovlivňován teplotou.
•
Fotodormance – bývá indukována prodlouženou expozicí bílého světla nebo (častěji) dlouhovlnného červeného světla.
•
Jako další příčinu vzniku sekundární dormance je uváděn i osmotický stres, ovšem již bez speciálního pojmenování. Jako implicitní se zdá být termín osmodormance (Holec et al., 2005). Semena mohou plynule přecházet mezi stavy dormance a schopností okamžitě
klíčit, je možné vypozorovat roční sezónnost dormance u jednotlivých druhů (Baskin a Baskin, 2001). Zatím není zcela jasné, zda je
primární i sekundární dormance
ovládána stejnými mechanismy. Suché skladování má vliv na omezení obou typů dormance, což by svědčilo pro stejný mechanismus u obou typů. Zdá se, že zatímco krátké období bobtnání eliminuje dormanci primární, dlouhé období bobtnání indukuje dormanci sekundární (Mudroch a Ellis 2000).
14
Autoři Baskin a Baskin (2004) vytvořili základní systém klasifikace dormance a rozčlenili ji do 5 tříd: 1. fyziologická dormance (FD) 2. morfologická dormance (MD) 3. morfofyziologická dormance (MFD) 4. fyzikální dormance (FYD) 5. kombinovaná dormance (FYD+FD) 3.2.3 Fyziologická dormance (FD) Tato forma se často vyskytuje u semen nahosemenných rostlin a dále také u modelových rostlin např. huseníček rolní (Arabidopsis thaliana), slunečnice roční (Helianthus annuus), salát (Lactuca sativa), rajče jedlé (Lycopersicon esculentum) a u rodu tabák (Nicotiana sp). FD lze rozdělit do 3 úrovní: hluboká (deep), střední (intermediate) a nehluboká (nondeep) (Baskin a Baskin, 2004). 3.2.3.1 Hluboká FD Izolovaná embrya ve stavu hluboké fyziologické dormance se buď nebudou vyvíjet vůbec, nebo nastanou abnormality v růstu klíčních rostlinek. Ošetřením gibereliny (GA) nedojde ke zlomení jejich dormance. Ke zlomení dormance je vyžadováno několik měsíců chladové stratifikace (podtyp a) nebo tepelné stratifikace (podtyp b) (Baskin et al., 2005). Jako příklad lze uvést druh javor mléč (Acer platanoides). 3.2.3.2 Střední FD Střední fyziologická dormance je charakteristická např. pro druh javor klen (Acer pseudoplatanus).
15
3.2.3.3 Nehluboká FD Velká většina semen má právě tento podtyp fyziologické dormance. Ošetřením embryí GA dojde k vymanění semen z odpočinku v závislosti na rostlinném druhu. K dalším
mechanismům
rušících
dormantní
stav
patří
skarifikace
(narušení
palisádového sklerenchymu testy tvdých semen např. pískem či rozbitým sklem), tepelná i chladová stratifikace a uskladnění semen v suchém prostředí. Tento podtyp se ještě dále dělí v závislosti na rozmezí teplot indukujících klíčení. Podle mnoha autorů (Bewley a Black, 1994; Vleeshouwers et al., 2001; Baskin a Baskin, 2004; Kucera et al., 2005) je právě teplota rozhodujícím faktorem, který dokáže zlomit fyziologickou dormanci. 3.2.4 Morfologická dormance (MD) Tento typ je typický u semen, jejichž zárodek je malý, přičemž u něj došlo k diferenciaci (rozlišení děloh, hypokotylu). Tato embrya nejsou fyziologicky dormantní, ale jednoduše potřebují více času ke klíčení a růstu. Patří sem například semena miříku celeru (Apium graveolens). 3.2.5 Morfofyziologická dormance Jde o kombinaci obou předchozích typů. Vyskytuje se u embryí malých, u nichž existuje i další fyziologická zábrana klíčení. Proto je také nutné speciální ošetření semen, například kombinace chladové a tepelné stratifikace, která je v některých případech nahraditelná aplikací GA. Patří sem například jasan ztepilý (Fraxinus excelsior). 3.2.6 Fyzická dormance Je způsobena vrstvou palisádových buněk v obalu semene, přes kterou nemůže proniknout voda. Tato vrstva kontroluje pohyb vody semenem. K odstranění tedy pomůže mechanické či chemické narušení testy. Tento typ je častý u rodu komonice (Melilotus) a pískavice (Trigonella) z čeledi Fabaceae.
16
Autoři Finch-Savage a Leubner-Metzger (2006) rozlišují dva typy dormance způsobené strukturami semene. Jedná se o dormanci zapříčiněnou obaly semene a dormanci způsobenou embryem. 3.2.7 Dormance zapříčiněná obaly semene (coat-imposed dormancy) U mnoha druhů rostlin nemůže semeno klíčit, protože jeho obaly mohou tvořit nepropustnou bariéru pro vstup plynů, nejčastěji O2 a CO2.
Vrstva palisádového
sklerenchymu je také nepropustná pro vodu například u čeledi bobovitých (Fabaceae). Obaly semene tvoří mechanickou zábranu pro průnik vyvíjejícího se kořínku a mohou také obsahovat látky inhibiční povahy. Taková bariéra navíc neumožňuje vyplavení inhibitorů během bobtnání a semeno tak nemůže klíčit a dormance se prodlužuje. Výměna plynů v semeni je limitována a ve vyvíjejícím se embryu je redukována respirace (Procházka et al., 2003). Problémy se špatnou permeabilitou povrchové vrstvy mohou být překonány oslabením nebo narušením osemení, čehož může být dosaženo činností saprofytických hub, působením ohně (kombinace tepla a kouře) nebo působením chemikálií např. kyselinou sírovou. K nejčastějším izolovaným inhibitorům klíčení patří ABA a kumariny, dále mohou inhibovat klíčení semen i katechiny, taniny nebo fenoly. Tyto látky byly nalezeny v osemení a jako důkaz jejich inhibičního působení může sloužit pozorování, že dostane-li se izolované, zbobtnalé embryo do kontaktu s částmi osemení, dormance je znovu navozena (Adkins et al., 2002). V některých případech může dojít k vyplavení inhibitorů dešťovou vodou nebo rozkladem osemení. 3.2.8 Dormance zapříčiněná embryem (embryo dormancy) U mnoha rostlinných druhů ani po odstranění semenných obalů nedochází k iniciaci klíčení. Toto zjištění ukazuje, že zábranné vlivy mohou vycházet také přímo z embrya (Adkins et al., 2002). Dormance zapříčiněná zábrannými vlivy vycházejícími z embrya je charakterizovaná vysokým podílem ABA/GA, vysokou citlivostí k ABA a nízkou citlivostí k GA. Vymanění embrya z tohoto stavu zahrnuje změny v biosyntéze fytohormonů a degradace vedoucí ke snížení poměru ABA/GA a vzrůstu citlivosti k GA. Z toho plyne, že ABA ovládá proces odpočinku semen a GA se podílí na regulaci klíčení (Finch-Savage a Leubner-Metzger, 2006)
17
3.3 Klíčení semen Podle definice zahrnuje proces klíčení události začínající příjmem vody odpočívajícím suchým semenem a končící prodlužováním embryonální osy (Bewley a Black, 1994). Viditelným znakem konečného stadia klíčení je průnik struktur obklopujících embryo, především kořínku. Toto stadium pak označujeme jako viditelné klíčení. Následující události, zahrnující mobilizaci hlavních zásobních látek, jsou spojovány s růstem klíční rostlinky (Bewley, 1997). Semena, která se nevyskytují v endogenní dormanci, mohou klíčit při zbobtnání ve vodě, pokud jsou ovšem splněny další vnější podmínky jako teplota, obsah O2 a u některých druhů i intenzita světla. Tabák (Nicotiana tabacum) je druh, který je dlouhodobě využíván jako modelový systém pro studium klíčení semen obsahujících endosperm. Klíčení semen tabáku je rozděleno do několika událostí, které zahajuje prasknutí povrchových vrstev testy následované prasknutím endospermu. Zde uplatňuje svůj regulační vliv ABA, která specificky inhibuje průchod kořínku endospermem a fázi III. příjmu vody (viz Obr. 2), ale nezasahuje do I. a II. fáze bobtnání (Korneef et al., 2002).
Klíčení Fáze I.
Růst po klíčení Fáze III. Mobilizace rezerv
Fáze II.
Elongace buněk radikuly
Příjem vody
Dělení buněk a syntéza DNA Reparace DNA Syntéza proteinů za využití nových mRNA Syntéza proteinů za využití stávajících mRNA Reparace mitochondrií Syntéza mitochondrií Počátek respirace a syntézy proteinů
Čas
Obr. 2 Přehled hlavních událostí spojených s klíčením semen a následným růstem Upraveno podle Bewley (1997).
18
3.3.1 Podmínky klíčení - vnější Klíčivost semen závisí na mnoha faktorech, které můžeme rozlišit na vnější a vnitřní. Mezi vnější podmínky klíčení můžeme zařadit: vodu, kyslík, teplotu a světlo. •
Voda
Voda hraje roli při bobtnání semen. Při maturaci semen dochází k jejich extrémnímu vysušení a při styku semene s vodou dochází k okamžité absorpci. Tlak způsobený příjmem vody napomáhá k prasknutí testy při klíčení (Bewley a Black, 1994). •
Kyslík
Kyslík je další nezbytná podmínka klíčení, protože v semenech neprobíhá fotosyntéza a energie nezbytná pro klíčení se získává při aerobní respiraci. Nedostatek kyslíku (anoxie) se může projevit v inhibici růstu kořenů (Bewley a Black, 1994). •
Teplota.
Semena různých druhů rostlin klíčí při různých teplotách, které jsou mnohdy vyšší než teploty pokojové. Například semena Nicotiana tabaccum mají optimální teplotu ke klíčení pohybující se okolo 28°C, minimální teploty, při kterých je klíčení zahájeno, neklesají pod hranici 13° C a naopak maximum zpravidla nepřevyšuje 35° C (Procházka et al., 2003). •
Světlo
Světlo nebývá nezbytnou podmínkou klíčení, u mnohých semen působí světlo stimulačně, ale řada jiných semen klíčí naopak za tmy. K pozitivně fotoblastickým semenům, u nichž světlo klíčení stimuluje, řadíme např. i druh Nicotiana tabaccum. Klíčení v zásadě ovlivňuje červená a modrá oblast viditelného záření (Procházka et al., 2003). Za příjem světla v oblasti červeného záření jsou odpovědné fotoreceptory rostlin zvané fytochromy. Jedná se o fotoreverzibilní chromoproteid, který existuje ve dvou izomerních formách, a každá z nich má své charakteristické absorpční spektrum. PR (red) isomer absorbuje nejvíce v oblasti vlnových délek 660nm, zatímco druhá 19
aktivní forma fytochromu - PFR (far red) má absorpční spektrum v oblasti dlouhovlnného červeného záření při vlnové délce 730nm (Buchanan, 2002). Fytotochrom vratně přechází z jedné formy v druhou. Ve vratných reakcích je červené světlo absorbováno fytochromem PR a způsobuje jeho přeměnu na PFR, který absorbuje dlouhovlnné červené záření, a jeho působením se mění zpět na PR. Ve většině fotomorfogenetických reakcí aktivní formou je PFR,. Je to také labilnější forma, která z velké části podléhá destrukci na světle (Šetlík et al., 2004). V dnešní době je známo několik typů fytochromu, např. fytochrom A, jenž je zodpovědný za regulaci reakcí k dlouhovlnnému červenému záření (730nm) a reguluje například dlouživý růst. Naopak fytochrom B reguluje tuberizaci a kvetení a připisuje se mu klasická absorpce červeného světla (660nm). Fytochrom taktéž působí prostřednictvím stimulace biosyntézy fytohormonů, či zvýšení citlivosti k těmto látkám (Procházka et al., 2003). Červené světlo indukuje u Arabidopsis thaliana transkripci genů GA4 a GA4H, které kódují enzym giberelin 3β-hydroxylázu, katalyzující finální kroky syntézy biologicky aktivní formy giberelinů. Naopak dlouhovlnné červené světlo PFR reprimuje transkripci těchto genů (Bradford, 2007). 3.3.2 Podmínky klíčení semen – vnitřní Některá semena neklíčí, přestože jsou u nich splněny všechny vnější podmínky ke klíčení. Patří sem nepropustnost povrchových vrstev pro vodu a plyny, tuhá testa, nevyvinuté embryo, vysoký obsah inhibičních látek či negativní vlivy vycházející z mateřské rostliny (viz kapitoly 3.2.7 a 3.2.8.).
3.4 Nicotiana benthamiana Domin Nicotiana benthamiana Domin je druh tabáku pocházející z Austrálie. Výskyt australských druhů tabáků je často asociován s narušenou krajinou, často je můžeme najít na spáleništích nebo podél nově vystavených cest (Burbidge, 1960). Jedná se o amfiploidní druh s 38 chromosomy a předpokládá se, že tento druh vznikl po křížení druhů Nicotiana suaveolens (n=16) a Nicotiana debneyi (n=24). Tato jednoletá bylina dosahuje výšky 20 až 150 cm. Její tmavě zelené, široce vějčité listy mohou dosahovat délky až 10cm. Ve skleníku kvetou tyto rostliny po celý rok, avšak v přírodě běžně kvetou od května do září bílými květy v průměru 1 cm širokými a až 3,8 cm dlouhými. 20
Plodem je protáhlá tobolka, ve které se nachází větší množství tmavých ledvinovitých semen 0,5-0,7 mm velkých, jejich testa bývá většinou na okraji vlnitá (Horton, 1981). V současné době je využívána jako modelová rostlina pro studium interakcí mezi rostlinou a viry a studium postranskripčního utišování genů (Brigneti et al., 1998).
A)
B)
Obr. 3 A: Druh Nicotiana benthamiana Domin, B: detail tobolky
3.5 Hormonální interakce při uvolnění z dormance u tabáku (Nicotiana sp.) Klíčení semen tabáku (Nicotiana) probíhá ve dvou krocích. Prasknutí testy je následováno prasknutím endospermu. Uvolnění z dormance a počátek klíčení nastává během posklizňového dozrávání (uskladnění za sucha při pokojové teplotě po dobu několika měsíců) nebo působením světla a následné aktivace giberelinů (GA) během bobtnání (Finch-Savage a Leubner-Metzger, 2006).
21
Obr.
4
Hormonální regulace klíčení u Nicotiana sp. Během posklizňového dozrávání dochází
k akumulaci βGlu (β−1,3-Glukanáz) v endospermu semene. Dochází ke vzrůstu endogenní hladiny GA a poklesu ABA. Na prasknutí testy pozivně působí světlo a GA, prasknutí endospermu navíc pozitivně ovlivňuje i působení etylénu a brassinosteroidů (BR). Upraveno podle Finch-Savage a Leubner-Metzger, (2006).
Autoři Leubner-Metzger et al. (1995) poukazují na významnou úlohu β−1,3Glukanáz (β Glu, glukan endo-1,3- β glukosidáz) při klíčení semen tabáku. β Glu jsou hojně rozšířené enzymy vyskytující se u mnoha druhů vyšších rostlin. Pomáhají rostlinám bojovat proti infekcím patogenních hub, účastní se řady fyziologických procesů, např. při vývinu pylové láčky, při oplodnění, mobilizaci zásobních látek v endospermu a při buněčném dělení. Jsou rozděleny do několika tříd na základě primární struktury. V tabáku bývá třída I β−1,3-Glukanáz lokalizována primárně v epidermis spodních listů a v kořenech zdravých rostlin (Keefe et al., 1990). Při bobtnání semen na světle dochází k akumulaci β Glu v mikropylární části endospermu v místě, kudy prochází kořínek při klíčení semene. Podle autorů Leubner- Metzger et al. (1995)
tyto
enzymy
způsobují
oslabení
endospermu
následkem
hydrolýzy
polysacharidů buněčné stěny. Po ošetření semen ABA dochází ke zpoždění praskání endospermu inhibicí syntézy I β−1,3-Glukanáz, přičemž kinetika prasknutí testy není ovlivněna (Leubner-Metzger, 2003). Světlo a GA působí stimulačně na expresi β Glu v endospermu, naopak ABA, tma a osmotika ji potlačují. Stejně tak se ukazuje pozitivní vliv etylénu a brassinosteroidů (BR), pod jejichž vlivem praská endosperm a působí proti inhibičním účinkům ABA (Finch-Savage a Leubner-Metzger, 2006).
22
3.5.1 ABA jako pozitivní regulátor dormance Kyselina abscisová (ABA) je seskviterpenoid syntetizovaný z xantofylů. Ve velkém množství dochází k její akumulaci, je-li rostlina vystavena abiotickým stresům, například při nedostatku vody (Nambara a Poll, 2003). Během procesu maturace semen, kdy dochází k výrazné ztrátě vody až na 10% (Klein a Pollock, 1968), se uvnitř semen akumuluje ABA a její přítomnost je důležitá pro nastolení stavu primární dormance. Iniciace dormance je řízena interakcí kyseliny abscisové (ABA) a proteinů LEA (late embryogenesis abundant). Proteiny LEA se začínají objevovat v pozdní fázi embryogeneze a podílejí se na dehydrataci semene. Exprese genů pro tyto proteiny je indukovaná právě ABA. Po vzrůstu hladiny ABA dojde ke zvýšení permeability buněk především obalových pletiv semene, což má za následek enzymatickou inaktivaci a postupnou dehydrataci postupně všech pletiv semene (Radley, 1976). Zdrojem ABA může být samo maturující embryo nebo obalové vrstvy semene pocházející z mateřské rostliny. Pokusy s reciprokými kříženci mezi ABA-deficientními rostlinami a wild-type rostlinami Nicotiana plumbaginifolia (Frey et al., 1999) ukázaly, že pouze ABA produkovaná embryem samotným je nutná pro ustanovení trvalého stavu dormance. ABA maternálního původu, která je produkovaná obalovými vrstvami semene, podobně i aplikace ABA na semeno, neindukují dormantní stav. U Nicotiana tabacum je indukce dormance asociována s prudkým vzestupem obsahu ABA 15-20 dní po opylení následovaná rychlým poklesem během stádia pozdní maturace semene. Dormance u tabáku je stanovena v semenech sklizených 25 dní po opylení (Kucera et al., 2005). Přidání exogenní ABA během bobtnání má stejný efekt jako ABA maternálního původu. Neovlivňuje prasknutí testy, avšak zpožďuje praskání endospermu a má za následek formaci nové struktury sestávající se z rozšířené radikuly a prodlouženého endospermu (Leubner-Metzger, 2003). Exogenní aplikace ABA na nedormantní semena Arabidopsis thaliana také oddaluje jejich klíčení. Aplikace vedla ke změně akumulačního potenciálu 71 proteinů zapojených do procesu klíčení. Tato skutečnost naznačuje,
že
exogenní
aplikace
ABA
spouští
proteolytické
mechanismy
v nabobtnalých semenech (Chibani et al., 2006). V signalizační dráze ABA má velký význam receptor RPK1 (receptor-like protein kinase 1) bohatý na Lucin, který je asociovaný s proteinkinázou. Jedná se 23
o klíčový membránový protein rané signalizační dráhy ABA v semenech a klíčních rostlinách. Byly připraveny mutantní rostliny Arabidopsis thaliana, které exprimovaly geny pro biosyntézu ABA v nadměrném množství. U semen těchto rostlin byla následně zaznamenána nadprodukce ABA vedoucí k prohloubení dormance a zpožděného klíčení (Nambara a Marion-Poll, 2003). Dochází zde k blokování katabolického enzymu ABA 8´hydroxylázy. Dalším klíčovým enzymem je ABA aldehyd oxidáza 3 (AAO3), který katalyzuje finální krok biosyntézy ABA.
AAO3 mutanti Arabidopsis thaliana
s narušenou biosyntézou ABA vykazovali redukovanou dormanci. V kontrastu s nadprodukcí ABA, deficience tohoto hormonu během maturace semene má za následek absenci primární dormance (Kucera et al., 2005). 3.5.2 Gibereliny ruší dormanci a podporují klíčení Podle hypotézy semenné dormance autorů Karssen a Lacka (1986) působí ABA a GA během „života semen“ v různém čase na různém místě. ABA indukuje klid semen během jejich maturace, zatímco GA hrají zásadní úlohu při odeznění dormance a při iniciaci klíčení. GA jsou zapojeny v mnoha procesech jako např. při růstu embrya, příjmu asimilátů a při prevenci aborce semene u mnoha rostlin z čeledi Brassicaceae (Koornneef et al., 2002). Bioaktivní GA se akumulují v oblasti výčnělku radikuly a zdá se, že uvnitř zárodku se vyskytují ve dvou oddělených místech. Raná biosyntéza, zahrnující cyklizaci geranylgeranyl difosfátu katalyzované enzymem ent-copalyl difosfát syntetázou (CPS), se odehrává v provaskulárních tkáních. Pozdější biosyntéza zahrnující formaci bioaktivních GA za působení enzymu GA 3-oxidázy se odehrává v kortexu a endodermis kořenů (Kucera et al., 2005). GA zvyšují růstový potenciál embrya a jsou nezbytné k překonání mechanické bariéry obalových vrstev semene oslabením pletiv obklopujících radikulu (Bewley, 1997). Během procesu bobtnání dochází k syntéze GA de novo, což vyplývá z pozorování, že inhibitor biosyntézy giberelinů jako např. paclobutrazol blokuje klíčení (Nambara et al., 1991). Biosyntézu GA mohou navodit i faktory prostředí, především světlo. U Arabidopsis thaliana existují dva geny kódující enzym 3-β-hydoxylázu, které jsou indukovány fytochromem. Vystavení rostlin Arabidopsis thaliana chladu nestimuluje biosyntézu GA, ale výrazně zvyšuje jejich citlivost ke giberelinům (Debeaujon a Koornneef, 2000).
24
Pro vysvětlení role endogenních giberelinů při klíčení semen byly navrženy dva různé mechanismy působení. První z nich souvisí s expresí genů kódující enzymy, jejichž činností dochází k hydrolýze endospermu, který tvoří bariéru pro průchod radikuly klíčícího semene např. tabáku (Finch-Savage a Leubner-Metzger, 2006). Druhý mechanismus reprezentuje přímý stimulační vliv GA na růstový potenciál vyvíjejícího se embrya Arabidopsis thaliana, který je omezován produkcí ABA v embryu (Karssen a Lacka, 1986). 3.5.2.1 Inhibitory biosyntézy giberelinů a degradace ABA V dnešní době je známa skupina triazolových látek, které působí jako inhibitory anabolismu giberelinů a katabolismu ABA . Tyto sloučeniny obsahují ve své struktuře tři konzervované atomy dusíku uvnitř pětičlenného prstence, díky kterému se dokáží navázat na cytochrom P450 (Marshall et al., 2000). Cytochrom P450 monooxygenázy patří do rodiny metaloproteinů obsahujících hem, které přenáší hydroxylovou skupinu z molekulárního kyslíku na uhlík (Sponsel, 1995). Triazolové typy inhibitorů monooxygenáz vysoce redukují cytochrom P450 dependentní 8´hydroxylaci
ABA,
klíčový krok při degradaci ABA. Z toho důvodu dochází k nahromadění ABA v částech rostlinných pletiv ovlivněných triazolovými sloučeninami. Tyto sloučeniny také inhibují ent-kauren oxidázu – klíčový enzym při biosyntéze giberelinů, a to při oxidaci entkaurenu na ent-kaurenovou kyselinu. Tato inhibice pak vyúsťuje v nízkou hladinu endogenních giberelinů. Mezi tyto triazolové látky patří paclobutrazol (2RS,3RS)-1-(4-chlorophenyl)4,4-dimethyl-2-(1,2,4-triazolyl)-pentan-3-ol). V současné době se používá jako růstový regulátor, který vykazuje silné fungicidní účinky. Je složkou řady herbicidů, omezuje dělení buněk a přináší tak zvýšenou odolnost vůči chorobám (Marshall et al., 2000).
3.6 Dusíkaté sloučeniny ovlivňující klíčení semen 3.6.1 Oxid dusnatý (NO) Oxid dusnatý (NO) se stal jednou z nejsledovanějších molekul posledních deseti let. Roku 1992 časopis Science vyhlásil oxid dusnatý molekulou roku (Koshland 1992).
25
Je významnou signální molekulou v organizmu obratlovců a v poslední době se ukazuje, že hraje významnou roli i u rostlin (Víteček, 2006). 3.6.1.1 Chemické vlastnosti oxidu dusnatého Oxid dusnatý se v atmosférických podmínkách vyskytuje jako bezbarvý dráždivý plyn, který přispívá k znečišťování ovzduší, protože je součástí škodlivých oxidů dusíku NOX v atmosféře. Patří do skupiny relativně stabilních radikálů s 15 elektrony, z nichž jeden je nepárový. Má velmi krátký poločas rozpadu, jeho molekuly jsou schopny existence podobu 6-10 vteřin (Ginter a Wilhelm, 1993). Teplota tání NO je -163,6 °C, teplota varu -151,8 °C a hustota 1,3 kg.m-3 (Greenwood a Earnshaw, 1993). Malé molekuly NO lehce pronikají
buněčnými membránami a rychle reagují s různými
složkami buňky (Ginter a Wilhelm, 1993). Oxid dusnatý se v plynné fázi snadno oxiduje kyslíkem (tzv. autooxidace) za vzniku oxidu dusičitého NO2. Jde o reakci třetího řádu, takže při nízkých koncentracích je konverze NO na NO2 zpomalena. NO nereaguje v anaerobních podmínkách (Kupková a Beneš, 2004).Ve vodném roztoku je výhradním produktem autooxidace NO dusitan. Reakce probíhá podle rovnice: 2NO + O2 → 2NO2 3.6.1.2 Působení oxid dusnatého u živočichů Výzkum v posledních desetiletích ukázal, že oxid dusnatý hraje významnou roli v signalizaci u živočišných buněk. Podílí se na funkci nervového, kardiovaskulárního a imunitního systému (Mayer a Hemmens, 1997). NO je buněčný posel, který difúzí ovlivňuje
fyziologicky
i
patofyziologicky
různé
typy
savčích
buněk.
V kardiovaskulárním systému se oxid dusnatý podílí na udržování tonu cév a krevního tlaku, tlumí aktivaci leukocytů a má antiproliferační účinek.V centrálním nervovém systému působí jako buněčný posel. Hraje roli při morfogenezi mozku, reguluje tvorbu synapsí a výbojovou aktivitu neuronů. Oxid dusnatý také hraje významnou roli v programované buněčné smrti (PCD) nebo-li apoptóze buněk. Podílí se na inhibici apoptózy tím, že inhibuje apoptické fosforylační signály. V rámci imunitního systému je produkován aktivovanými makrofágy a spolu s reaktivními kyslíkovými radikály (ROS) se podílí na zabíjení patogenů (Kupková a Beneš, 2004).
26
3.6.1.3 Biosyntéza oxidu dusnatého u živočichů Oxid dusnatý vzniká oxidací guanidinového dusíku aminokyseliny L-argininu působením NO-syntázy (NOS) za vzniku L-citrulinu (Wendehenne et al., 2001). Na základě lokalizace a funkčních vlastností se rozlišují tři základní typy NOS: 1. endotheliální (eNOS) reguluje krevní tlak a průtok krve tkáněmi; 2. neuronální (nNOS ) se podílí na neurotransmisi; 3. inducibilní (iNOS) se uplatňuje v boji proti infekcím a tumorům. H NH2
NH2
+
NH2
NH
+N-OH
O
NH NADPH + H+ NADP+
NH2
NH ½ (NADPH + H+) 1/2NADP+
+ O2
NH3 +
COO-
L - arginín
H2 O
O2
NH3+
NO•
H2 O
NH3 +
COO-
N G -hydroxy-L-arginín
COO-
L - citrulín
Obr. 5 Mechanismus syntézy oxidu dusnatého (upraveno podle Wendehenne, et al. 2001)
3.6.1.4 Působení NO u rostlin Značnou pozornost si získal výzkum oxidu dusnatého u rostlin díky jeho úloze v regulaci růstu a vývoje. V nízké koncentraci (řádově 10-6 M) růst stimuluje, zatímco vyšší koncentrace (řádově > 10-5 M) působí inhibičně kvůli negativnímu ovlivnění různých metabolických drah (Víteček, 2006). Je-li rostlina vystavená suchu, dochází k syntéze ABA. Ta následně indukuje syntézu NO, který vyvolá uzavření průduchů (Desikan et al., 2002). Významnou roli hraje při indukci hypersenzitivní reakce (HR) po vystavení rostlin biotickým stresům. NO inhibuje signifikaci buněčné stěny, apoptózu, oddaluje také senescenci květů a plodů (del Río et al., 2004) a v neposlední řadě se také podílí na regulaci dormance semen (Bethke et al., 2004). Existuje mnoho důkazů, že semena v raných stadiích klíčení produkují oxid dusnatý (Sarath et al., 2006).
27
3.6.1.5 Biosyntéza oxidu dusnatého u rostlin Narozdíl od živočichů, rostliny disponují širším spektrem možností syntézy NO díky mnoha genům pro NO-syntázu (del Río et al, 2004). Oxid dusnatý může být syntetizován z dusitanu enzymaticky za využití nitrát-reduktázy (Yamasaki, 2000) a také neenzymaticky v kyselém prostředí. Tento způsob má význam zejména v apoplastu V aleuronové vrstvě ječmene (Hordeum vulgare) dochází k syntéze NO z NO2 (Bethke et al., 2004). Neenzymatická syntéza probíhá podle schématu:
Nitrit je protonován za vzniku dvou molekul kyseliny dusité (HNO2) ve volně reverzibilní reakci, ke které dochází při nízkém pH. V dalším sledu reakcí dvě molekuly kyseliny dusité interagují a dávají vznik NO a NO2. Dalším způsobem produkce NO je chemická redukce nitritu pomocí kyseliny askorbové při pH 3-6 a v neposlední řadě mohou rostliny redukovat nitrit na světle pomocí karotenoidů (del Río et al., 2004). Tvorba NO enzymatickou cestou je u rostlin značně rozmanitá a jako příklad si můžeme uvést tyto enzymy: 1. NO-syntáza, která je stejná jako u živočichů. V rostlinných buňkách se vyskytuje v matrixu peroxizomů, v chloroplastech a mitochondriích (Barroso et al., 1999). 2. NADPH- dependentní nitrát-reduktáza, která se vyskytuje v cytosolu a generuje NO z nitritu za využití NADH jako donoru elektronů a molybdenového kofaktoru. 3. NADPH-dependentní nitrit-reduktáza nacházející se v plastidech 4. peroxidáza křenu selského (Armoracia rusticana) produkuje NO a citrulin z N-hydroxy-argininu (NOHA) a peroxidu vodíku (del Río et al., 2004). 3.6.2 Donory oxidu dusnatého NO je vysoce reaktivní plyn, který ve vzduchu a ve vodném roztoku reaguje s kyslíkem. Z tohoto důvodu byly v dřívějších dobách v pokusech s klíčení semen využívány donory NO, které generují oxid dusnatý ve vodném roztoku. Mnoho donorů 28
však produkuje NO po omezenou dobu, což znemožňuje jejich použití při experimentech vyžadujících dlouhodobé vystavení semen NO. Navíc řada z nich produkuje mnoho dekompozičních produktů jako NO+ a NO-, které mohou negativně působit na buňky (Libourel et al., 2006). Jedním z donorů je i nitroprussid sodný (SNP). 3.6.2.1 Nitoprussid sodný (SNP) SNP stimuluje klíčení semen Arabidopsis thaliana (Bethke et al., 2004), prosa prutnatého (Panicum virgatum) (Sarath et al., 2006), semen jablek (Bogatek a Gniazdowska, 2006) a také semen salátu (Lactuca sativa) (Beligni a Lamattina, 2000). SNP je fotolabilní molekula, která po vystavení světlu uvolňuje kromě NO+ a NO- také kyanid (CN) a jiné Fe-obsahující intermediáty, z nichž některé jsou těkavé (Libourel et al., 2006). Ve srovnání s ostatními donory NO však SNP uvolňuje NO po mnoho hodin (Bethke et al.,2006). Těkavý kyanid produkovaný SNP interaguje s hem-obsahujícími proteiny a výrazně inhibuje celulární respiraci. Kyanid také stimuluje klíčení semen (Bewley, 1997). Schopnost SNP zlomit dormanci bývala spojována s jeho schopností uvolňovat NO (Beligni a Lamattina, 2000), ale podle novější práce autorů Bethke et al. (2005) se ukazuje, že právě kyanid uvolněný ze SNP je zodpovědný za odeznění dormance u semen Arabidopsis thaliana. NO v semenech reaguje s cytochrom-c oxidázou a je rapidně metabolizován na nitrit tímto enzymem. Kyanid se také váže na cytochrom-c oxidázu a právě NO redukuje inhibiční efekt kyanidu na tento enzym. To může vést k hypotéze, že aplikace kyanidu by mohla mít za následek zvýšení hladiny NO díky interakci s enzymem, který oxiduje NO. Pokud tomu tak skutečně je, pak aplikace kyanidu má pozitivní vliv na zvýšení koncentrace NO uvnitř semene (Libourel et al., 2006).
Obr. 6 Molekulární struktura nitroprussidu sodného (SNP) s donorovou NO skupinou
29
3.6.3 Příklady ostatních dusíkatých sloučenin iniciujících klíčení V práci autorů Bethkeho et al. (2006) se dále ukazuje, že kromě nitroprussidu sodného a kyanidu, přerušují dormanci semen Arabidopsis thaliana mechanismem závislým na oxidu dusnatém také dusitan (NO2-) a dusičnan (NO3-). Byly použity 0,5 1,5 mM koncentrace NaNO2 , které účinně odstranily dormanci semen Arabidopsis thaliana a navodily v průměru 50 % klíčivost semen. Ve
všech
předešlých
případech,
lapač
NO
Carboxyphenyl)-4,4,5,5-tetramethylimidazoline-1-oxyl-3
radikálů oxid)
c-PTIO
účinně
(2-(4-
podporuje
udržení dormance semen. Tato sloučenina ale neinhibuje klíčení posklizňově dozrálých semen a také neinteraguje přímo s dusitany, dusičnany a CN. V přítomnosti 100 µM cPTIO totiž klesá procento vyklíčených semen ošetřených 0,5 mM NaNO2 na 2 %, u 1,5 mM koncentrace pak na 15 %. C-PTIO efektivně odstraňuje NO produkovaný aleuronovou vrstvou ječmene obecného (Hordeum. vulgare), která byla ovlivněna dusičnanem sodným NaNO2. . Data z práce Bethkeho et al. (2006) tak podporují hypotézu, že NO je signální molekulou, která má významnou roli ve ztrátě dormance u semen a že CN je těkavou složkou SNP, která podporuje ztrátu dormance. 3.6.3.1 Azid sodný( NaN3 ) Azid sodný je z chemického hlediska vysoce toxická, bílá, ve vodě dobře rozpustná pevná látka. Připravuje se reakcí amidu sodného s oxidem dusným podle rovnice: NaNH2 + N2O→NaN3 +H2O. Po kontaktu s vodou či kyselinami se mění na toxický plyn štiplavého zápachu. Snadno se rozkládá podle rovnice: 2 NaN3 → 2 Na + 3 N2,
čehož se využívá například i při konstrukci automobilových airbagů
(http://en.wikipedia.org/wiki/Sodium_azide). Azid sodný je jedním z nejúčinnějších mutagenů, u vyšších rostlin indukuje genové mutace účinněji než alkylační látky, je proto využíván ve šlechtění kulturních rostlin. Mutagenní účinky vykazuje u hrachu, rýže, petúnií, ale je nemutagenní u Arabidopsis thaliana (Matusovic a Brindza, 1997). Azid sodný působí jako inhibitor aerobního dýchání a způsobuje inhibici důležitého enzymu cytochrom c oxidázy. Způsobuje klíčení dormantních semen mnoha 30
druhů plevelných rostlin jako například u semen ovsa hluchého (Avena fatua ), ježatky kuří nohy (Echinochloa crus-galli), jetele podzemního (Trifolium subterraneum) a u kulturní rýže seté (Oryza sativa) (Fay a Gorecki, 1978). Stejně tak u semen ječmene obecného (Hordeum vulgare) ruší azid sodný podobně jako kyanid dormanci a svým inhibičním vlivem na respirační procesy v semeni také zabraňuje absorpci kyslíku. Tato hypotéza poukazuje na nutnost oxidačních reakcí při klíčení semen. Tato oxidace není normální součástí respiračního řetězce a neuskutečňuje se v dormantních semenech. Ta mohou být stimulována rostoucí tenzí kyslíku nebo redukcí normální respirační cesty (Major a Roberts, 1968). V pokusech s dormantními semeny rýže seté (Oryza sativa) bylo prokázáno, že 0,5 mM koncentrace NaN3 účinně ruší dormanci a semena dosahují klíčivosti 80 % za 10 dní po 8 hodinovém působení tohoto činidla (Cohn a Hughes, 1986). 3.6.4 Kyanidové sloučeniny iniciují klíčení Kyanidy jsou známé prudké jedy. Za jejich toxicitu je zodpovědný kyanidový ion, CN-, který působí na přenos kyslíku inhibicí enzymu cytochrom c oxidázy. Kyanovodík (HCN) je plyn charakteristického hořkomandlového zápachu, kyanidy alkalických kovů (kyanid sodný, KCN) jsou tuhé látky. 3.6.4.1 Kyanovodík (HCN) Kyanid stimuluje klíčení semen různých druhů rostlin jako např. u salátu (Lactuca sativa), jabloní a trav z rodu Phalaris. U některých druhů byla pozorována emise HCN ze semen v pre-germinační periodě (Bogatek a Gniazdowska, 2006). Působením 1mM HCN po dobu 6 hodin na dormantní embrya jabloní došlo k eliminaci všech symptomů dormance a stimulaci klíčení (Bogatek et al., 1991). Pokusy z dormantními embryi jablek vedly k formulaci několika hypotéz o působení kyanidu na dormantní embrya: 1. Vlivem HCN dochází k aktivaci glykolýzy, která zásobuje buňky s ATP, a pentózo-fosfátového cyklu, jenž zajišťuje přísun NADPH (Lewak et al., 2000).
31
2. Působení HCN vede k aktivaci katabolismu zásobních cukrů. Ošetření kyanidem má za následek stimulaci alkalické invertázy v místě, kde je kotyledon v kontaktu s vodním prostředím (Lewak et al., 2000). 3. HCN vysoce zvyšuje produkci etylénu v dormantních embryích díky stimulaci genu pro ACC syntázu (ACS6) (Bogatek a Gniazdowska, 2006). Etylén láme dormanci semen mnoha druhů, avšak biochemický mechanismus jeho působení je málo prozkoumán (Kucera et al., 2005). 4. Krátké vystavení semen účinkům kyanidu vede k indukci oxidativního stresu a k akumulaci H2O2, následně pak k aktivaci antioxidativních enzymů, zejména glutathion reduktázy (GR), což může mít za následek aktivaci pentózo fosfátového cyklu (Bogatek a Gniazdowska, 2006). Molekuly NO i HCN jsou inhibitory cytochromového řetězce přenosu elektronů v mitochondriích. V práci Huanga et al. (2002) je naznačeno, že obě molekuly působí indukci alternativní cesty respiračního řetězce, která umožňuje přenos elektronů z ubichinolu na kyslík i bez účasti cytochromových komplexů. Funguje tedy i po jejich zablokování kyanidem, proto bývá též označována jako kyanid-rezistentní cesta. Transport elektronů z ubichinolu na kyslík přes komplex alternativní oxidázy (AOX) na vnitřní straně mitochondriální membrány není spojen s přenosem vodíkových iontů, a proto ani potenciální energetický rozdíl přenosu nelze využít pro tvorbu ATP. Předpokládá se, že částečná blokace cytochromového systému by mohla být nutná pro úspěšné vyklíčení semen. Endogenní produkce NO a kyanidu by mohla způsobit klíčení regulací oxidativního elektronového transportního řetězce, tj. částečnou inhibicí cytochromového řetězce a indukcí alternativní, kyanid-rezistentní cesty. U dormantních semen jabloní to však nebylo potvrzeno (Bogatek a Gniazdowska, 2006). Následné bobtnání semen a reaktivace metabolismu je významný zdroj reaktivních forem kyslíku (reactive oxygen species, ROS), které jsou důležité pro úspěšné vyklíčení semen. Indukce cesty AOX bude spojena se stimulací enzymů spojených s ROS eliminací. Bylo potvrzeno, že kyanid způsobuje klíčení semen australského stromu
Guilfoylia monostylis z čeledi Surianaceae zvýšením aktivity
enzymů degradujících H2O2 (Nkang, 2001). Kopyra a Gwozdz (2003) pozorovali pozitivní vliv NO na klíčení semen lupiny (Lupinus luteus) vystavených působení Pb,
32
Cd a salinitního stresu, což může být následek zvýšení aktivity antioxidačních enzymů, především superoxid dismutázy (SOD). 3.6.4.2 Další příklady kyanidových sloučenin K dalším sloučeninám, které ruší dormantní stav u semen Arabidopsis thaliana, patří ferrokyanid draselný (Fe(II)CN) a ferrikyanid draselný (Fe(III)CN). Tyto sloučeniny sdílí mnoho strukturních rysů se SNP, ale v jejich struktuře chybí nitroso skupina a tím pádem i možnost generovat NO. Vystavení semen Arabidopsis thaliana působení 100 µM SNP, 100 µM Fe(II)CN a 100 µM Fe(III)CN v uzavřeném systému mělo za následek 80 % klíčivost dormantních semen . Tento efekt je opět způsoben uvolněním plynného CN, který ruší dormantní stav (Bethke et al., 2006).
33
4 MATERIÁL A METODY
4.1 Rostlinný materiál 4.1.1 Nicotiana benthamiana Domin Semena N. benthamiana byla získána z rostlin pěstovaných ve skleníku v měsíci červnu a červenci. Pro naše pokusy byly rostliny pěstovány ve skleníku na plném slunci v nádobách se zeminou. Semena byla ihned sbírána po otevření tobolky. Následně byla sušena po dobu 24 hodin při pokojové teplotě a skladována v dobře uzavřených zkumavkách při –80 °C. Při Pro pozorování posklizňového dozrávání byla semena uložena v papírových sáčcích při pokojové teplotě. Při ovlivňování chladem byla ve zkumavkách v chladničce při 4 °C. 4.1.2 Stanovení klíčivosti semen Semena Nicotiana benthamiana byla umístěna po 50 kusech do 11 cm Petriho misek, obsahujících dvojitou vrstvu sterilního filtračního papíru (Whatman International Ltd, Anglie). Filtrační papír byl zvlhčen 10 ml sterilní destilované vody, která obsahovala příslušnou sloučeninu. Semena byla vystavena účinkům sloučenin po dobu 3 dnů. Potom byla semena umyta a přenesena do nové Petriho misky a zalita 10 ml sterilní destilované vody. Semena klíčila při 23 °C, fotoperiodě 16 hodin, v nepřetržitém toku chladného, bílého světla (Osram L 18/20). Pro inkubaci semen ve tmě byly Petriho misky zabaleny do hliníkové fólie. Testy klíčivosti byly provedeny třikrát po třech Petriho miskách s 50 semeny. Semena byla prohlášena za vyklíčená, došlo-li k průchodu radikuly přes testu semene. 4.1.3 Chemikálie Použité chemikálie byly v analytické čistotě. Pro přípravu roztoků byla použita demineralizovaná voda (18,2 MΩ, model Demiwa, Watek, Ledeč nad Sázavou, Česká republika).
34
•
nitroprussid sodný (SNP), kyanid draselný (KCN) a cis, trans – kyselina abscisová (ABA) - Sigma-Aldrich, Německo;
•
dusitan sodný (NaNO2) - Lachema, Brno, Česká republika;
•
GA3 (G 0907), GA4+7 (G 0938) a paclobutrazol (P 0922)-Duchefa Biochemie, Nizozemí;
•
pottassium ferricyanide (PFC) - ICN Biomedicals Inc., USA;
•
Griessovo činidlo
•
-
4 % sulfanilamid- Sigma-Aldrich, Německo;
-
0,2 % N-(1-naftyl)etyléndiamin-Sigma-Aldrich, Německo;
-
10 % kyselina fosforečná - Lachema, Brno, Česká republika;
NO (198 ppm NO v N2) – Siad, Česká republika.
4.2 Použité metody 4.2.1 Detekce oxidu dusnatého pomocí oxidační kolony Tato metoda slouží ke stanovení oxidu dusnatého (NO) v plynné fázi. Plyn obsahující NO nejdříve prochází přes oxidační kolonu na bázi oxidu chromového, který konvertuje NO na NO2. Dále následuje promývačka s Griessovým činidlem. Oxid dusičitý zde nejdříve reaguje s vodou za vzniku dusitanu, který s Griessovým činidlem poskytuje barevný produkt (Víteček, 2006). Detekční aparatura je složena podle Kleppera (1979) ze dvou uzavřených
promývaček (skleněná zkumavka o objemu
10 ml, uzavřená butylovou zátkou, kterou prochází plastová trubička) obsahujících 1 ml Griessova činidla. Mezi obě promývačky byla zařazena oxidační kolona. Tato kolona se skládá ze skleněné trubice o délce 30cm a průměru 1,5 cm a je naplněna skleněnými kuličkami o průměru 3 mm. Kuličky byly potaženy roztokem dichromanu draselného s kyselinou sírovou (4 g K2Cr2O7, 1,5 ml 98% H2SO4 a 25 ml vody). Barva kuliček se během sušení při 80 °C po dobu 40 minut změnila na cihlově červenou. Z obou stran je kolona uzavřena gumovými zátkami se skleněnou vatou.
35
První promývačka před kolonou sloužila pro zachycení kyseliny dusité. Druhá promývačka sloužila pro zachycení NO2 ve formě NO2-
za kolonou. Pro spojení
jednotlivých prvků aparatury byly použity silikonové hadičky (viz Obr. 7) Efektivita konverze NO na dusitan byla testována pro každou kolonu na základě známého množství NO (198 ppm NO v N2) vpuštěného do aparatury. Detekce dusitanu zachyceného v druhé promývačce probíhala spektrofotometricky minimálně za 10 minut po odebrání roztoku z promývačky při vlnové délce 545 nm. Kalibrace byla provedena pomocí roztoku NaNO2. Biologický vzorek v plastové testovací krabičce byl zařazen před první promývačku. Množství NO uvolněného tímto vzorkem bylo vypočítáno na základě koncentrace NO2- zachyceného v druhé promývačce a efektivity konverze použité kolony (Víteček, 2006).
Obr. 7 Schéma zapojení oxidační kolony
36
Obr. 8 Reálné zapojení detekční aparatury
4.2.2 Průtokový systém Tato metoda umožnuje kontinuální ovlivnění semen plynným oxidem dusnatým po dobu několika dní a díky počítačem řízené regulační jednotce je možné experimentálně nastavit přesný průtok plynu, což je velmi výhodné oproti použití donorů NO. Ty byly dříve hojně využívány, neboť práce s vysoce reaktivním plynným radikálem přinášela řadu těžkostí. NO donory však neuvolňují oxid dusnatý v konstantních množstvích a také jsou účinné po omezenou dobu (několik hodin). Navíc jejich použití nese i riziko uvolňování dekompozičních produktů, které pak mohou interagovat s buňkami (Libourel et al., 2006). Metoda průtokového sysrému byla použita pro ovlivnění semen plynným oxidem dusnatým. Pomocí počítačem řízené regulační jednotky, která nastavuje konstantní průtok do jednotlivých regulátorů průtoku (MFC – mass flow controller), je NO posléze vháněn do promývačky s 0,5 mM roztokem KOH. Zde dojde k ovlhčení a pročištění směsi, která je následně hnána do zkumavky se vzorkem, kde dochází k ovlivnění semen.
37
Obr. 9 Schéma zapojení průtokového systému
4.2.3 Radioimunoanalýza (RIA) pro stanovení ABA Základem imunoanalytických metod je kompetitivní reakce antigenu (či haptenu) a značeného antigenu (haptenu) se specifickými rozpoznávacími místy protilátky. Kompetitivní reakce antigenu (haptenu) a jeho značeného analoga s protilátkou je imunoprecipitace a probíhá do ustavení precipitační rovnováhy. Nejčastějí se používá dvojího značení antigenů (haptenů) - pokud je na hapten navázán radioizotop, pak stanovení probíhá metodou RIA (radio immuno assay). Radioimunoanalytické stanovení (RIA) kyseliny abscisové (ABA) je vysoce citlivá kvantitativní imunochemická metoda stanovení ABA, využívající schopnosti rozpoznání molekuly ABA monoklonální protilátkou MAC 252 (Quarrie et al., 1988) s velmi vysokou specifitou. Princip metody spočívá v kompetici nativní nebo standardní ABA (hapten) a radioaktivně značené 3H-ABA (radioligand) ve vazbě na protilátku MAC a
3
252.
H-ABA
Za a
předpokladu přebytku
konstantního
nativní
ABA
množství
dochází
k
protilátky vytěsňování
MAC
252
radioligandu
z vazby s protilátkou a k vazbě haptenu s protilátkou. Tvorby komplexů haptenprotilátka a radioligand-protilátka je dosaženo po inkubaci za nízké teploty (+ 4 oC). Separace volných haptenů a radioligandů od komplexů protilátek s haptenem či radioligandem je provedena vysrážením v síranu amonném a oddělením následnou 38
centrifugací. 3H-aktivita sedimentu je pak měřena technikou kapalné scintilace na scintilačním spektrofotometru PACKARD 2000 CA, výsledky jsou přepočteny na obsah ABA v analytu v ng pomocí programu Securia PACKARD (Klemš et al., 1997). komponenty radioimunoanalýzy: - monoklonální protilátka MAC 252 - radioligand (3H-ABA) - standard (hapten, +/- cis,trans-ABA) - extrahovaná volná ABA z rostlinného materiálu (hapten) 4.2.4 HPLC (Vysoce účinná kapalinová chromatografie) pro stanovení thiolových sloučenin Pro analýzu thiolových sloučenin se používají rozličné metody, avšak nejčastěji se využívá vysoce účinná kapalinová chromatografie (HPLC) ve spojení s různými typy detektorů (Zítka et al., 2007). Vysoce účinná kapalinová chromatografie s dvanácti kanálovým elektrochemickým detektorem (ED) je skvělým nástrojem pro analýzu širokého
spektra
elektro-aktivních
sloučenin,
především
pro
analýzu
nízkomolekulárních thiolů (glutathion, cystein, fytochelatiny). Systém HPLC-ED je složený ze dvou chromatografických pump Model 582 a chromatografické kolony s reverzní fází Polaris C18A a dvanácti-kanálového CoulArray elektrochemického detektoru. Detektor je složen z průtočné analytické komůrky, která obsahuje referentní (hydrogen paládiová), pomocnou a dvanáct porézních grafitových elektrod (Supalkova et al., 2007). V řídícím modulu je uložena chromatografická kolona, elektrochemický detektor. Prostor je termostatovaný. Vzorek (10 µl) je pak injektován pomocí autosampleru. Vzorek semen o průměrné hmotnosti 0,2 g byl zmražen v kapalném dusíku. Destrukce semen probíhala pomocí tyčového homogenizátoru po přidání 2 ml fosfátového pufru o pH 7,0. Vzniklý roztok byl homogenizován na třepačce Vortex-2 Genie (Scientific Industrie, USA) po dobu 30 min při 4 °C. Homogenát byl centrifugován při 15 000 ot/min (centrifuga Universal
32R, Hettich-Zentrifugen
GmbH, Německo) po dobu 30 min opět při teplotě 4 °C. Před analýzou bylo nutné supernatant filtrovat přes membránový filtr (0,45 µm, Milipore, USA).
39
Obr 10 Základní schéma HPLC-ED (Upraveno podle Adam et al., 2004)
40
5 VÝSLEDKY
5.1 Stanovení klíčivosti semen Klíčivostí rozumíme počet klíčících semen schopných dalšího vývoje. Stanovuje se nejčastěji v procentech (Procházka et al., 2003). Klíčivost semen N. benthamiana byla stanovena standardním způsobem jako podíl klíčících semen ku všem semenům, přičemž stanovení probíhalo po dobu 12 dnů. Podle Zákona č. 219/2003 Sb. o oběhu osiva a sadby a příslušných směrnic se energie klíčení semen určuje podle takzvaného prvního vybírání při hodnocení zkoušky klíčivosti. Tudíž je metodika pro zkoušku energie klíčení shodná s metodikou pro zkoušku klíčivosti, kde je uvedeno, po kolika dnech klíčení se uskutečňuje první vybírání. Z tohoto důvodu v následujících výsledcích není energie klíčení jako samostatný údaj uvedena. 5.1.1 Vliv posklizňového dozrávání na dormanci semen U semen N. benthamiana dochází k vymanění z dormance během posklizňového dozrávání. Vymanění semen z dormance je rychlejší při pokojové teplotě (25 °C), než při skladování semen v lednici při 4 °C (Graf 1). Jedná se o vlastnost, která je častá u druhů pocházejících z teplých a suchých oblastí (Probert 2000), což také koresponduje s australským původem N. benthamiana. A)
41
B)
Graf 1 Posklizňové dozrávání semen N. benthamiana: (A) při pokojové teplotě 25 °C a (B) při 4 °C.
5.1.2 Vliv kyanid-obsahujících sloučenin na klíčení semen V pokusech bylo zjišťováno, jaký vliv budou mít sloučeniny kyanid draselný (KCN), nitroprussid sodný (SNP, donor NO) a ferrikyanid draselný (PFC) v koncentracích 10 µM, 100 µM a 250 µM na klíčení dormantních semen N. benthamiana (Graf č 2 ).
Graf 2: Sledování vlivu KCN, SNP a PFC na klíčivost semen N. benthamiana.
42
Tabulka 1 Vliv KCN, SNP a PFC na klíčivost semen N. benthamiana
Z výsledků vyplývá, že všechny tyto sloučeniny mohou indukovat klíčení dormantních semen N. benthamiana. Zvýšení klíčivosti po 3-denním působení a následném opláchnutí semen v destilované vodě bylo pozorováno již při aplikaci těchto látek v 10 µM koncentraci. Nejvyšší klíčivosti bylo dosaženo působením 250 µM koncentrace PFC, která po 12 dnech působení dosáhla 50 %. Jestliže nebyla semena po 3 dnech působení těchto látek opláchnuta, nedošlo k jejich vyklíčení. Tento jev pravděpodobně souvisí s toxickým působením KCN, SNP a PFC, protože tyto látky inhibují klíčení i nedormantních semen. V další části jsme zjišťovali, jaký vliv budou mít tyto sloučeniny na zrušení dormance, pokud budou semena ponechána bez přístupu světla. Jestliže byla dormantní semena vystavena 3-dennímu působení 10 µM SNP, KCN i PFC bez následného opláchnutí destilovanou vodou, bylo pozorováno zpoždění klíčení semen umístěných první 3 dny ve tmě oproti semenům ovlivňovaným na světle (Graf č.3). To poukazuje na možnou fotodormanci semen N. benthamiana. A)
43
B)
Graf 3 Vliv světla (A) a tmy (B) na klíčení dormantních semen N. benthamiana po ovlivnění 10 µM SNP, PFC a KCN.
5.1.3 Vliv dusíkatých sloučenin na klíčení semen N. benthamiana V experimentech jsme sledovali vliv dusitanu sodného (NaNO2), dusičnanu sodného (NaNO3), azidu sodného (NaN3) a plynného oxidu dusnatého (NO) na vymanění semen z dormance (Graf č. 4).
Graf 4 Vliv dusíkatých sloučenin na dormanci semen N. benthamiana.
44
Tabulka 2 Vliv dusíkatých sloučenin na dormanci semen N. benthamiana
Z grafu a tabulky je patrné, že nejúčinnější sloučeninou podporující klíčení semen je azid sodný (NaN3). Klíčivost semen po aplikaci 10 µM NaN3 dosahovala vysokých 74 %, při koncentraci 100 µM pak 83,33 %. Klíční rostlinky měly ve srovnání s kontrolou vyvinutější kořínek a růst nadzemní části byl oproti kontrole nepatrně zbržděn. Ve vyšších koncentracích se projevil mutagenní efekt azidu sodného a klíční rostlinky měly deformovaný kořínek. K pozitivnímu ovlivnění klíčivosti dusitanem a dusičnanem sodným docházelo až za vysokých koncentrací (500 a 1000 µM), přičemž účinnější sloučeninou byl dusitan sodný (NaNO2). Vymanění semen z dormance za působení těchto sloučenin je silně závislé na pH příslušné sloučeniny, jak ukazují Graf č. 5 a Graf č. 6.
Graf 5 Účinnost odstranění dormance působením NaNO2 v závislosti na pH
45
Graf 6 Účinnost odstranění dormance působením NaNO3 v závislosti na pH
Dusitan o koncentraci 0,5 mM a pH 3 zvýšil klíčivost dormantních semen na 90,67 % oproti stejné koncentraci při pH 10, kdy klíčivost semen dosahovala 8 %, u kontrolní varianty pak 1,3 %. Stejná situace nastala i v případě ovlivnění semen dusičnanem sodným, kdy tato sloučenina způsobila 74,67% klíčivost semen při pH = 3 a 3,33 % při pH = 10. Dusitan neinhiboval klíčení semen pokud nebyla opláchnuta destilovanou vodou a podobně jako u 10 µM koncentrace SNP, KCN a PFC se i zde projevilo zpoždění klíčení semen ovlivňovaných ve tmě (viz kapitola 5.1.2., Graf č. 3) oproti semenům ovlivňovaných na světle (Graf č 7).
46
Graf 7 Vliv světla a tmy na klíčení semen po ovlivnění NaNO2. T-tma, S-světlo
5.1.3.1 Vliv NO na klíčení semen N. benthamiana Pro spolehlivé zjištění vlivu NO se současným vyloučením potenciálního vlivu kyanidu na klíčení semen byla použita kalibrační směs NO (198 ppm NO, SiadCzech). Ta byla pomocí průtokového systému (Obr. 9) ředěna na koncentraci 50 ppm a 30 ppm a aplikována na dormantní semena N. benthamiana po dobu 3 dní. V průtokovém systému se díky oxidaci NO akumuloval dusitan v koncentraci okolo 100 µM. Tato koncentrace však není schopná vyvolat klíčení dormantních semen N. benthamiana. NO zvyšoval klíčivost v závislosti na jeho koncentraci (Graf č. 8). Současná aplikace PTIO (odklízeč NO) vedla u dormantních semen ke snížení klíčivosti oproti semenům ovlivněným jen NO (data neuvedena). Působení NO a PTIO jak odděleně, tak i současně na nedormantí semena neovlivnilo jejich kličivost. Tato data poukazují na specifický efekt NO při redukci dormance semen N.bentamiana.
47
Graf 8 Vliv NO na klíčení semen N. benthamiana při celkovém průtoku 80 ml/min.
5.1.4 Vliv fytohormonů na klíčení semen N. benthamiana 5.1.4.1 Vliv GA3 a GA4+7 Gibereliny pozitivně ovlivňují klíčení semen mnoha druhů rostlin. V naší práci jsme se zaměřili na zkoumání účinku kyseliny giberelové (GA3) a GA4+7. U semen N. benthamiana nedošlo ke změně klíčivosti při aplikaci GA3 jak u dormantních, tak u klíčivých semen (Graf č. 9 A, B). Z giberelinů pozitivně působí na klíčení dormantních semen N. benthamiana GA4+7 (Graf č. 10 A,). Při použití tohoto giberelinu vyklíčí i semena N. benthamiana, která se nechají klíčit ve tmě. Bez použití tohoto giberelinu semena ve tmě nevyklíčí (data neuvedena). Inhibitor syntézy giberelinů paclobutrazol inhiboval klíčení klíčivých semen N. benthamiana (Graf č. 11), a tím potvrdil zásadní důležitost tohoto fytohormonu pro klíčení semen N. benthamiana.
48
A)
B)
Graf 9 Vliv kyseliny giberelové (GA3) na klíčení semen A) nedormantních , B) dormantních
Z grafu lze vyčíst, že kyselina giberelová není fyziologicky aktivním giberelinem,
který
se
podílí
na
odstranění
dormance
semen
N. benthamiana.U nedormantních semen se klíčivost kontroly pohybovala kolem 99 %, u 10 µM a 100 µM koncentrace GA3 pak dosahovala 98 %. U dormantních semen se hodnoty klíčivosti pohybovaly v rozmezí 10-14 %.
49
A)
. B)
Graf 10 Vliv GA4+7 na klíčení semen A) dormantních , B) nedormantních
GA4+7 u dormantních semen v 10 µM koncentraci zvýšil klíčivost semen na 44 % oproti kontrole (12 %) a v 100 µM koncentraci na 99 %. Klíčivost nedormantních semen nebyla ovlivněna a ve všech případech dosahovala hodnot 98-99 %.
50
Graf 11 inhibiční vliv Paclobutrazolu na klíčení nedormantních semen
Paclobutrazol
působil
inhibičně
na
klíčivost
nedormantních
semen
N. benthamiana v koncentraci 100 µM a 200 µM. Při použití 100 µM klesla klíčivost semen z 99 % ( kontrola) na 27,3 % a při 200 µM koncentraci až na 0,7 %. 10 µM koncentrace klíčivost semen neovlivnila. 5.1.4.2 Vliv kyseliny abscisové (ABA) Kyselina abscisová působí protichůdně oproti giberelinům. Podle předpokladu, i v našich pokusech ABA blokovala klíčení semen (Graf č. 12). Nedocházelo však k zablokování prasknutí testy, pouze k blokaci prasknutí endospermu. Klíčivost dormantních semen vlivem účinku ABA dokonce klesla z 25 % (kontrola) na 18 % při použití 10 µM koncentrace a na 0,7 % při 100 µM koncentraci. Klíčivost nedormantních semen dosahovala podobných hodnot jako kontrola (98 %) za použití 10 µM i 100 µM koncentrace.
51
Graf 12 Vliv ABA na klíčení semen, n-nedormantní, d-dormantní semena
V dalších experimentech jsme sledovali současné působení azidu sodného (NaN3) a kyseliny abscisové (ABA) na klíčivost dormantních semen (Graf č. 13).
Graf 13 Současné působení kyseliny abscisové a azidu sodného na klíčivost semen N. benthamiana
52
Tabulka 3 Současné působení kyseliny ABA a NaN3 na klíčivost semen N. benthamiana
Z uvedených hodnot vyplývá, že azid sodný účinně překonává vliv kyseliny abscisové, když mnohonásobně zvyšuje klíčivost semen ve všech případech oproti kontrole (4,5 %). Nejúčinněji zvyšuje klíčivost 100 µM koncentrace azidu sodného v kombinaci s 10 µM koncentrací ABA, když klíčivost dormantních semen dosahuje 94,5 %. Působení 10 µM azidu sodného a 10 µM ABA pak způsobuje 88,5% klíčivost dormantních semen N. benthamiana. 5.1.5 Vliv etanolu (C2H5OH) na klíčení semen N. benthamiana Kromě dusíkatých a kyanidových sloučenin jsme v našich pokusech zkoumali i vliv etanolu na dormanci semen. Etanol účinně odstraňuje dormanci u semen okurky (Cucumis sativus) (Sreenivasulu a Amritphale, 2000), ovsa hluchého (Avena fatua) (Adkins et al., 1985) a u mnoha druhů trav, např. u prosa vidlicokvětého (Panicum dichotomiflorum) (Taylorson a Hendricks, 1979). Podle autorů Halleta a Bewley (2002) primární alkoholy, mezi které patří i etanol, a monokarboxylové kyseliny způsobují zlomení dormance semen, protože navozují změny na membráně zvýšením její fluidity. Umožňují zvýšení rozestupu fosfolipidových hlavic, a tím usnadňují vazbu a aktivaci periferních membránových proteinů účastnících se přenosu signálu v procesu klíčení. V našich experimentech jsme prokázali pozitivní vliv etanolu na vymanění semen N. benthamiana z dormance, když 100 µM i 250 µM koncentrace etanolu účinně navodila klíčivost semen v 93,3 % a v 92 % oproti kontrole (1,3 %). 10 µM nebyla tak účinná, klíčivost dosahovala pouze 18 % (Graf č. 14)
53
Graf 14 Vliv etanolu na klíčení semen N. benthamiana
5.2 Detekce NO produkovaného semeny N. benthamiana pomocí oxidační kolony Princip metody spočívá v oxidaci NO prostřednictvím CrO3 (náplň kolony) na oxid dusičitý (NO2), který se snadno rozpouští v Griessově činidle za vzniku NO2a NO3-. NO2- poskytuje s Griessovým činidle fotometricky detekovatelný produkt (azobarvivo) (viz. kapitola 4.2.1). Průtok vzduchu byl ve všech experimentech nastaven na 40 ml/min. Za těchto podmínek činil limit detekce cca 0,2 µmol NO. Touto metodou lze stanovit NO uvolněný rostlinným materiálem do plynné fáze a oddělit tak zdroj NO od detekční reakce. Docílí se tak minimální interference biologického systému při stanovení NO. V pokusech bylo umístěno 200 mg semen do 8 ml nádobky s 1 ml destilované vody nebo se 100 µM roztokem azidu sodného. Azid je schopen blokovat energetický metabolismus buněk. Zabývali jsme se otázkou, zda tento typ stresu je schopen ovlivnit syntézu NO dormantními semeny. 5.2.1 Kalibrace oxidační kolony V experimentech jsme nejprve provedli kalibraci, jejímž cílem je zjistit efektivitu konverze NO na NO2-, který se detekuje prostřednictvím Griessova činidla.
54
Pro kalibraci se využívá komerčně dodávaný NO (198 ppm NO v N2, SIAD Czech). Přívodní hadičku je třeba napojit prostřednictvím injekční jehly k „vialce na vstřikování vzorku“, na počítačové jednotce se nastaví průtok NO 50 ml/min stejným způsoben se nastaví průtok vzduchu na 40 ml/min a nechá se protékat 10 min. Po této době se pomocí řídící počítačové jednotky zastaví NO a systém se nechá protékat vzduchem 40 ml/min, aby veškerý NO mohl zreagovat na oxidační koloně a následně v Griessově činidle. Po zastavení průtoku vzduchu se napipetuje do zkumavky s roztokem Griessova činidla s vzniklým azobarvivem (což je přeměněný NO) 1 ml destilované vody. Důkladně promícháme a přeneseme do kyvety. Po 10 min vložíme kyvetu do fotometru a změříme absorbanci roztoku při 545 nm proti 1 ml Griessova činidla zředěného 1 ml destilované vody. Naměřenou absorbanci přepočítáme na NO. Pro standardizaci se použije 10 µl 1 mM dusitanu sodného přidaného do 1 ml Griessova činidla. Tato směs se před měřením zředí 1 ml destilované vody. Přepočet absorbance na množství NO probíhá dle následujících vzorců:
detekované množství NO[µmol ] =
A545,VZ − A545, BLANK × KoncentraceSTD [µM ]×VGriess [l ] A545, STD − A545, BLANK
Skutečné množství se pak vypočítá podle stavové rovnice pro ideální plyn:
[ ]
p[Pa ]× V m 3 R × T[K ]
pV = nRT
n[mol] =
n[µmol] =
p[Pa ] NO[ppm ] × průtok ml × min −1 × čas[min ]× 10 −6 × 10 6 × R × T[K ] 10 6
[
]
5.2.2 Měření NO produkovaného semeny N. benthamiana Pro měření NO se celá aparatura zapojí podle schématu na Obr. 7 uvedeném v kapitole 4.2.1. Nádobka se vzorkem se nechá promývat vzduchem po dobu 5 minut při průtoku 40 ml/min. Po 5 min se celý systém nechá promývat 10 min vzduchem při průtoku 40 ml/min, aby veškerý NO zreagoval v oxidační koloně a mohl konvertovat na 55
azobarvivo s Griessovým činidlem. Po ukončení promývání se do Griessova činidla s azobarvivem přidá 1 ml vody a změří se absorbance roztoku na fotometru při 545 nm proti proti 1 ml Griessova činidla zředěného 1 ml destilované vody. Přepočet pak probíhá podle následujících vzorců:
skutečné množství NO =
detekované množství NO Efektivita konverze
detekované množství NO[µmol ] =
A545,VZ − A545, BLANK × KoncentraceSTD [µM ]× VGriess [l ] A545, STD − A545, BLANK
5.2.2.1 Produkce NO dormantními semeny po ovlivnění NaN3
Graf 15 Produkce NO v dormantních semenech N. benthamiana
Výsledky z Grafu č. 15 ukazují, že v semenech ovlivněných 100 µM azidem sodným výrazně stoupá produkce oxidu dusnatého (NO) během 24 hodin působení této látky oproti kontrole. V dalších 2 dnech produkce NO semeny ovlivněnými NaN3 klesá. Od 6. dne u semen ovlivněných NaN3 dochází k opětovnému nárůstu produkce NO. 6. den totiž u těchto semen začíná docházet ke zvýšení klíčivosti na 4 % oproti kontrole (0,7 %). V následujících dnech díky azidu sodnému dochází k dalšímu nárůstu klíčivosti, která 12. den dosahuje 32,5 %; klíčivost kontrolních semen se již nemění (viz Graf č. 16). 56
Graf 16 Klíčivost dormantních semen po ovlivnění 100µ µM NaN3
5.2.2.2 Produkce NO nedormantními semeny po ovlivnění NaN3 U nedormantních semen ovlivněných 100 µM azidem sodným nastala opačná situace. Působení azidu sodného (100 µM) vyvolalo snížení produkce NO v prvních 3 dnech (Graf č.17). 6. den došlo k masivnímu zvýšení produkce NO jak u kontroly, tak i u varianty s azidem sodným, což může souviset také s poměrně velkým nárůstem klíčivosti semen 6. den (kontrola 55,3 %, azid sodný 33,3 %), jak je uvedeno v Grafu
č. 18. Z tohoto grafu je i patrné, že azid sodný způsobuje u nedormantních semen zpoždění klíčení, například 3. den u varianty s azidem sodným dosahovala klíčivost hodnoty 3,3 %, zatímco u kontroly to bylo 36,7 %.
57
Graf 17 Klíčivost nedormantních semen po ovlivnění 100µ µM NaN3
Graf 18 Klíčivost nedormantních semen po ovlivnění 100µ µM NaN3
58
5.3 Stanovení thiolových sloučenin v semenech N.benthamiana po ovlivnění NaN3 Je známo, že pokud jsou rostliny vystaveny účinkům stresů, jako je např. působení těžkých kovů, zahájí rostlinné buňky syntézu thiolových sloučenin, jako jsou glutathion (GSH) a fytochelatiny (PC). Glutathion je malý tripeptid skládající se z glutaminu, cysteinu a glycinu (γ-glutamyl-cysteinyl-glycin). Je nejrozšířenějším neproteinovým thiolem, vyskytujícím se prakticky ve všech buňkách rostlinných organismů. Z glutathionu (GSH) tzv. transpeptidizační reakcí probíhá syntéza fytochelatinů (PC) katalyzovaná enzymem γ-Glu-Cys dipeptidyl transpeptidázou (triviálně fytochelatin syntetáza, PC-syntetáza) (Zítka et al., 2007). Z hlediska fyziologie stresu je ovšem důležité zabývat se pouze určitými thiolovými sloučeninami jako je aminokyselina cystein, tripeptid glutathion nebo oligopeptid fytochelatin. Jmenované sloučeniny jsou významné pro detoxikaci aktivních forem kyslíku a těžkých kovů. Thiolové sloučeniny také mohou sloužit jako „zásobárna“ NO v živých soustavách. V následujících experimentech nás zajímalo, jaká změna nastane v obsahu thiolových sloučenin glutathionu (GSH), fytochelatinu 2 (PC 2) a aminokyseliny cysteinu (Cys) po vystavení semen N. benthamiana stresu v podobě aplikace 100 µM azidu sodného U semen N. benthamiana ovlivněných azidem došlo k vzrůstu koncentrace volného cysteinu (Graf č. 19, B) a poklesu koncentrace glutathionu (Graf č. 19, A). Tato data naznačují, že se azid sodný může podílet na inhibici syntézy glutationu (GSH).
59
A)
B)
C)
Graf 19 Stanovení thiolových sloučenin u semen ovlivněných NaN3. A) GSH, B) Cys, C) PC2
60
5.4 Stanovení endogenní hladiny ABA v semenech po ovlivnění NaN3 V těchto experimentech jsme se snažili zjistit, jak se změní endogenní hladina kyseliny abscisové po aplikaci 100 µM azidu sodného. Podle výsledku experimentu uvedeném v Grafu č.13 jsme předpokládali, že azid sodný může v semenech potlačovat inhibiční účinky ABA tím, že sníží její endogenní hladinu v semenech. Vzorky pro stanovení ABA z rostlinného materiálu RIA metodou se extrahují do vody. Před extrakcí není potřeba tyto vzorky lyofilizovat, uchovávají se cca 7 až 14 dní v mrazícím boxu (při -20 ˚C). Zhomogenizují se pomocí mořského písku a opět uchovávají alespoň 7 až 14 dní v mrazícím boxu. Poté se vzorky centrifugují a ABA zůstává v supernatantu, který je následně analyzován.
Graf 20 Obsah endogenní ABA v semenech ovlivněných azidem sodným
Z výsledků uvedených v Grafu č. 20 plyne, že ve všech případech (kromě hodnot po 24 hodinách působení NaN3) byl obsah endogenní ABA u kontrolní varianty vyšší, než u varianty s azidem sodným. Po 72 hodinách působení azidu sodného v semenech dochází dokonce k trojnásobnému poklesu hladiny kyseliny abscisové (8,15 ng/g ABA u semen ovlivněných NaN3 oproti 26,91 ng/g ABA u kontroly). Hodnota u kontroly po 24 hodinách by mohla být zkreslena chybou experimentátora při přípravě vzorků či nesprávným změřením. 61
6
DISKUZE Dormance semen je podle autorů Finch-Savage a Leubner-Metzger (2006)
vysvětlena jako jev, kdy nedochází k vyklíčení intaktního životaschopného semene za příhodných podmínek. Tato vlastnost je rozšířená zvláště mezi druhy mírného pásu, pro které je výhodné odložit klíčení do doby, než nastanou vhodné podmínky pro růst klíčních rostlinek (Bewley, 1997). V suchých semenech mohou probíhat procesy, které vedou k ukončení dormance (Finch-Savage a Leubner-Metzger 2006). Takovým procesem je posklizňové dozrávání, které podle Proberta (2000) reprezentuje přírodní mechanismus kontrolující klíčení v oblastech se suchým klimatem. Semena N. benthamiana přestala být dormantní díky posklizňovému dozrávání, které proběhlo při pokojové teplotě. K odeznění dormance došlo i při nižších teplotách (při 4 °C). Porovnáním obou výsledků vyšlo najevo, že pokojová teplota je, v případě N. benthamiana, účinnější pro ukončení dormance semen než chlad (4 °C). Rozdíl činil 4 týdny skladování. Tento stav lze pravděpodobně vysvětlit klimatickými podmínkami v místě původu tohoto druhu, v Austrálii, kde tato rostlina roste zejména na zastíněných místech, jako jsou kaňony a ústí jeskyní (Horton, 1981). Gibereliny mají zásadní vliv na klíčení semen u Arabidopsis thaliana (Debeaujon a Koornneef, 2000). U rostlin je známo více jak 100 různých GA, pouze několik z nich je však biologicky aktivních. Mezi ně patří GA3 a GA4 (Crozier et al. 2000). Aplikace GA3 na dormantní i nedormantní semena N. benthamiana neměla žádný vliv na jejich klíčení. Úspěšné bylo ovlivnění semen GA4+7, když dormantní semena klíčila v závislosti na použité koncentraci a klíčení nedormantních semen nebylo ovlivněno. GA4+7 též pozitivně ovlivňuje klíčení ve tmě. Tato data jsou v souladu s výsledky Li et al. (2005) a jejich pokusy s Descurania sophia, kde došlo ke klíčení semen pouze po aplikaci GA4, ne GA3. Paclobutrazol je znám jako inhibitor syntézy GA. Je-li aplikován na semena
Arabidopsis thaliana, pak tato semena neklíčí (Nambara et al. 1991). Paclobutrazol inhiboval klíčení nedormantních semen N. benthamiana, kdy 100 µM koncentrace
62
zredukovala klíčení na 27,3 % oproti kontrole (99 %). U 200 µM koncentrace dokonce na 0,7 %. Při pokusech s kyselinou abscisovou (ABA) a mutanty s blokovanou syntézou ABA bylo zjištěno, že tato látka hraje zásadní úlohu při ustanovování a zachovávání dormance (Korneef et al. 2002, Leubner-Metzger et al. 2005). Autoři Leubner-Metzger
et al. (1995) uvádějí, že u Nicotiana tabaccum ABA nezabraňuje prasknutí testy, brání pouze prasknutí endospermu. Tento efekt byl také pozorován u semen N. benthamiana, kdy u semen ovlivněných 100 µM ABA došlo k prasknutí testy, ale nedošlo k vývoji radikuly, který byl inhibován. KCN, PFC a SNP zvyšují klíčivost dormantních semen N. benthamiana v závislosti na použité koncentraci. Toto zjištění je v souladu s prací Bethkeho et al. (2004), jejichž pokusy ukázaly, že KCN, PFC, SNP a dusitan ruší dormanci u Arabidopsis thaliana. 100 µM a 250 µM koncentrace těchto sloučenin jsou účinnější, avšak při použití 10 µM koncentrace příslušné látky se neprojevil toxický efekt těchto sloučenin a nebylo nutné semena umýt, aby začala klíčit. Předpokládali jsme, že SNP zvyšuje klíčivost dormantních semen prostřednictvím uvolněného NO. SNP je schopen zároveň s NO uvolňovat i kyanid. S použitím odpovídajících koncentrací PFC a KCN byly dosaženy podobné výsledky. Tato data poukazují na skutečnost, že v případě SNP je za zvýšení klíčivosti odpovědný spíše kyanid uvolněný ze SNP než NO. Klíčení semen N. benthamiana podporoval i dusitan a dusičnan sodný, ale v mnohem vyšších koncentracích (500 µM a 1000 µM). Bylo zjištěno, že efekt dusitanu i dusičnanu sodného je závislý na pH použité sloučeniny. Azid sodný u semen ječmene (Hordeum vulgare) ruší dormanci a svým inhibičním vlivem na respirační procesy v semeni také zabraňuje absorpci kyslíku. Tato hypotéza poukazuje na nutnost oxidačních reakcí při klíčení semen (Major a Roberts, 1968). Podle autorů Hendrickse a Taylorsona (1974) iniciuje azid sodný klíčení semen svým inhibičním vlivem na dekompozici H2O2 enzymem katalázou. U semen N. benthamiana podporoval azid sodný klíčení nejlépe ze všech dusíkatých sloučenin. Podařilo se nám prokázat, že azid sodný aplikovaný na semena současně s ABA překonává inhibiční vliv kyseliny abscisové a dojde k vyklíčení
63
dormantních semen. Zároveň jsme potvrdili, že azid sodný až trojnásobně snižuje obsah endogenní ABA v semenech. Z těchto výsledků se dá usuzovat, že odstranění dormance semen N. benthamiana azidem sodným může být způsobeno jeho vlivem na degradaci ABA v semeni. Je-li tato cesta přímá či nepřímá prozatím neznáme. Plynný oxid dusnatý stimuluje klíčení dormantních semen Arabidopsis thaliana (Libourel et al., 2006). K těmto pokusům byla sestavena aparatura dodávající NO v přesně regulovaném množství. Za normálních podmínek reaguje NO rapidně s kyslíkem, což dříve znemožnilo aplikaci plynného NO přímo na semena, a proto byly aplikovány donory NO (např. SNP), které generují oxid dusnatý ve vodném roztoku. Za aerobních podmínek NO interaguje s cytochrom c oxidázou a je rapidně metabolizován na nitrit tímto enzymem (Libourel et al., 2006). Nitrit pak účinně ruší dormanci semen (Hendricks a Taylorson, 1974). Podle autorů Bethke et al. (2005) také ztráta dormance semen iniciovaná kyanidem, dusičnanem a dusitanem je závislá na NO. Tyto sloučeniny zvyšují koncentraci NO v semeni buď zvýšením jeho syntézy, nebo poklesem jeho degradace. Kyanid má navíc také schopnost interakce s cytochrom c oxidázou, což může mít za následek inhibici katabolismu NO tímto enzymem V naší práci jsme prokázali specifický efekt NO na redukci dormance semen
N.bentamiana. NO zvyšoval klíčivost v závislosti na jeho koncentraci. Současná aplikace PTIO (odklízeč NO) vedla u dormantních semen ke snížení klíčivosti oproti semenům ovlivněným jen NO (data neuvedena). Existuje mnoho důkazů, že semena v raných stadiích klíčení produkují oxid dusnatý (Sarath et al., 2006). V práci byla použita metoda oxidační kolony pro stanovení oxidu dusnatého (NO) v plynné fázi (Klepper, 1979). V pokusech s nedormantnními semeny N. benthamiana bylo prokázáno, že u klíčících semen skutečně dochází k produkci NO. Autoři Hendricks a Taylorson (1974) navrhli, že aplikací azidu na semena dochází ke zvýšené emisi NO. V našich pokusech jsme zjistili, že u dormantních semen ovlivněných 100 µM azidem sodným skutečně došlo po 24 hodinách působení této sloučeniny ke zvýšené produkci NO. U nedormantních semen pak aplikace azidu sodného způsobila opačný efekt, klíčící semena se vyznačovala nižší produkcí NO oproti kontrole.
64
7 ZÁVĚR Hlavním záměrem této diplomové práce bylo přiblížit a charakterizovat průběh a odstranění dormance semen australského druhu tabáku Nicotiana benthamiana, Domin. Tato modelová rostlina je v současné době využívána ke studiu interakcí mezi rostlinou a viry a studium postranskripčního utišování genů. Avšak o dormanci semen tohoto druhu neexistují bližší informace, proto jsme se rozhodli prozkoumat některé aspekty tohoto procesu. V této práci jsme došli k těmto závěrům:
U semen N. benthamiana dochází k vymanění z dormance během posklizňového dozrávání, které je rychlejší při pokojové teplotě (25 °C) než při skladování semen při 4 °C.
Semena N. benthamiana jsou fotodormantní.
Na procesu zlomení dormance se podílí řada chemických sloučenin. Byl prozkoumán vliv některých dusíkatých a kyanid-obsahujících sloučenin a došli jsme k závěru, že nejúčinnější dusíkatou sloučeninou při zlomení dormance je azid sodný v 100 µM koncentraci. U kyanidových sloučenin pak účinně láme dormanci semen 250 µM ferrikyanid draselný (PFC) a 250 µM kyanid draselný (KCN).
Vymanění semen z dormance za působení dusitanu a dusičnanu sodného je silně závislé na pH, nejúčinnější je pH = 3.
Pomocí průtokového systému jsme byli schopni aplikovat plynný oxid dusnatý (NO) na semena v přesně regulovaných dávkách. Vyhnuli jsme se tak negativnímu působení donorů NO (např. SNP) na biologický materiál. Plynný NO zvyšuje klíčivost dormantních semen, klíčivost je však nižší, než při aplikaci vodných roztoků ostatních dusíkatých sloučenin, neboť obalové vrstvy semene tvoří špatně průchodnou bariéru pro vstup plynu.
65
Pomocí oxidační kolony jsme stanovili NO v plynné fázi, zjistili jsme, že při klíčení semen dochází k uvolňování NO. Semena ovlivněná azidem sodným uvolňují NO nejvíce po 24 hodinách působení této sloučeniny.
Biologicky aktivním fytohormonem, který ruší dormanci semen N. benthamiana je směs giberelinů GA4+7 , kyselina giberelová (GA3) se na odeznění dormance nepodílí.
Kyselina abscisová blokuje klíčení dormantních semen.
Pomocí radioimuno analýzy (RIA) se nám podařilo potvrdit, že aplikace azidu sodného na semena sníží trojnásobně obsah endogenní ABA v semenech po 72 hodinách působení.
Stanovením thiolových sloučenin vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií s elektrochemickou detekcí (HPLC-ED) bylo prokázáno, že po vystavení semen stresu v podobě aplikace 100 µM azidu sodného dojde k syntéze některých thiolových sloučenin, např. cysteinu (Cys). Naopak azid sodný způsobuje snížení hladiny glutathionu (GSH).
66
8 LITERATURA 1. Adam, V., R. Kizek, et al. (2004). Analýza thiolových sloučenin pomocí vysoko-učinné kapalinové chromatografie s elektrochemickou detekcí. Sborník abstraktů IV pracovní setkání fyzikálních chemiků a elektrochemiků. Brno,
Česká republika, Masarykova univerzita v Brně: 7-8. ISBN: 80-210-3319-3 2. Adkins, S. W., S. M. Bellairs, et al. (2002). "Seed dormancy mechanisms in warm season grass species." Euphytica 126: 13-20. 3. Adkins, S. W., G. M. Simpson, et al. (1985). "The physiological basis of seed dormancy in Avena fatua. VII. Action of organic acids and pH." Physiologia Plantarum 65(3): 310-316. 4. Barroso, J. B., F. J. Corpas, et al. (1999). "Localization of nitric-oxide synthase in plant peroxisomes." J. Biol. Chem. 274(51): 36729-36733. 5. Baskin, C. C. and J. M. Baskin (2001). Seeds - Ecology, Biogeography, and Evolution of Dormancy and Germination. San Diego, Academic Press. ISBN: 01-20802635 6. Baskin, J. M. and C. C. Baskin (2004). "A classification system for seed dormancy." Seed Science Research 14: 1-16. 7. Beligni, M. V. and L. Lamattina (2000). "Nitric oxide stimulates seed germination and de-etiolation, and inhibits hypocotyl elongation, three lightinducible responses in plants." Planta 210(2): 215-221. 8. Bethke, P. C., F. Gubler, et al. (2004). "Dormancy of Arabidopsis seeds and barley grains can be broken by nitric oxide." Planta 219(5): 847-855. 9. Bethke, P. C., I. Libourel, et al. (2005). "Sodium nitroprusside, cyanide, nitrate and nitrite break Arabidopsis seed dormancy in a nitric oxide dependent manner." Planta 223: 805-812. 10. Bethke, P. C., I. G. L. Libourel, et al. (2006). "Nitric oxide reduces seed dormancy in Arabidopsis." J. Exp. Bot. 57(3): 517-526. 11. Bewley, J. D. (1997). "Seed Germination and Dormancy." The Plant Cell 9: 1055-1066. 12. Bewley, J. D. and M. Black (1994). Seeds physiology of development and germination. New York, Plenum Press. ISBN:0306416875
67
13. Bogatek, R., K. Dziewanowska, et al. (1991). "Hydrogen cyanide and embryonal dormancy in apple seeds." Physiologia Plantarum 83(3): 417-421. 14. Bogatek, R. and A. Gniazdowska (2006). "Nitric oxide and HCN reduce deep dormancy of apple seeds." Acta Physiologiae Plantarum 28(3): 281-287. 15. Bradford, K. J. and H. Nonogaki (2007). Seed development, dormancy and germination. Oxford; Ames, Iowa, Blackwell Pub. ISBN: 1405139838 16. Brigneti, G., O. Voinnet, et al. (1998). "Viral pathogenicity determinants are suppressors of transgene silencing in Nicotiana benthamiana." The EMBO Journal 17: 6739-6746. 17. Buchanan, B. B., W. Gruissem, et al. (2002). Biochemistry & molecular biology of plants. Rockville, American society of plant biologists. ISBN: 0-943088-39-9 18. Burbridge, N. T. (1960). "The Australian species of Nicotiana L. (Solanaceae)." Aust. J. Bot. 8: 342-380. 19. Cernohorský, Z. (1967). Základy rostlinné morfologie. Praha,
Státní
pedagogické nakladatelství. 20. Cohn, M. A. and J. A. Hughes (1986). "Seed dormancy in red rice. V. Response to azide, hydroxylamine, and cyanide." Plant Physiol 80: 531-533. 21. Crozier, A., Y. Kamiya, et al. (2000). Biosynthesis of hormones and elicitor molecules. Biochemistry and Molecular Biology of Plants. B. B. Buchanan, W. Gruissem and R. L. Jones, American Society of Plant Physiologists: 850-865. ISBN: 0-943088-39-9 22. Davies, P. J. (2004). Plant hormones biosythesis, signal transduction, action! Dordrecht; Boston, Kluwer Academic. ISBN: 1402026854 23. Debeaujon, I. and M. Koornneef (2000). "Gibberellin requirement for Arabidopsis seed germination is determined both by testa characteristics and embryonic abscisic acid." Plant Physiology 122: 415-424. 24. Debeaujon, I., K. M. Leon-Kloosterziel, et al. (2000). "Influence of the Testa on Seed Dormancy, Germination, and Longevity in Arabidopsis." Plant Physiol.
122(2): 403-414. 25. Desikan, R., R. Griffiths, et al. (2002). "A new role for an old enzyme: Nitrate reductase mediated nitric oxide generation is required for abscisic acid-induced stomatal closure in Arabidopsis thaliana." Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.
99(25): 16314-16318.
68
26. Fay, P. K. and R. S. Gorecki (1978). " Stimulating germination of dormant wild oat (Avena fatua) seed with sodium azide." Weed Sci 26: 323-326. 27. Finch-Savage, W. E. and G. Leubner-Metzger (2006). "Seed dormancy and the control of germination." New Phytologist 171(3): 501-523. 28. Frey, A., C. Audran, et al. (1999). "Engineering seed dormancy by the modification of zeaxanthin epoxidase gene expression." Plant Molecular Biology 39(6): 1267-1274. 29. Ginter, E. and J. Wilhelm (1993). "Oxid dusnatý, molekulární děvěčka pro všechno." Vesmír 72(5): 255-257. 30. Greenwood, N. N. and A. Earnshaw (1993). Chemie prvků. Praha, Informatorium. ISBN 80-85427-38-9. 31. Halletta, B. P. and J. D. Bewley (2002). "Membranes and seed dormancy: beyond the anaesthetic hypothesis." Seed Science Research 12: 69-82. 32. Hendricks, S. B. and R. B. Taylorson (1974). "Promotion of Seed Germination by Nitrate, Nitrite, Hydroxylamine, and Ammonium Salts." Plant Physiol 54: 304-309. 33. Hilhorst, H. W. M. (1995). "A critical update on seed dormancy. I. Primary dormancy." Seed Science Research 5: 61-73. 34. Holec, J., P. I. Dobrev, et al. (2005). Indukce osmodormance u semen ozimé
řepky. Vliv abiotických a biotických stresorů na vlastnosti rostlin, Výzkumný ústav rostlinné výroby, Praha-Ruzyně.ISBN: 80-86555-63-1 35. Hopkins, W. G. (1995). Introduction to plant physiology environmental approach, John Wiley & Sons. ISBN: 0471545473 36. Horák J., Linhart I., et al. (2004). Úvod do toxikologie a ekologie pro chemiky, Vydavatelství VŠCHT Praha.ISBN: 80-7080-548-X 37. Horton, P. (1981). " A taxonomic revision of Nicotiana (Solanaceae) in Australia." J. Adelaide Bot. Gard. 3(1): 1-56. 38. Huang, X., U. von Rad, et al. (2002). "Nitric oxide induces transcriptional activation of the nitric oxide-tolerant alternative oxidase in Arabidopsis suspension cells." Planta 215: 914-923. 39. Chibani, K., S. Ali-Rachedi, et al. (2006). "Proteomic Analysis of Seed Dormancy in Arabidopsis Plant Physiol. 142(4): 1493-1510. 40. Karssen, C. M. and E. Laçka (1986). A revision of the hormone balance theory of seed dormancy: Studies on gibberellin and/or abscisic acid-deficient mutants 69
of Arabidopsis thaliana. Plant growth substances 1985. M. Bopp. Berlin, Germany, Springer-Verlag: 315–323. 41. Keefe, D., U. Hinz, et al. (1990). "The effect of ethylene on the cell-typespecific and intracellular localization of β-1,3-glucanase and chitinase in tobacco leaves." Planta 182(1): 43-51. 42. Kincl, M. and V. Krpes (2000). Základy fyziologie rostlin. Ostrava, Montanex. ISBN: 8072250418 43. Klein, S. and B. M. Pollock (1968). "Cell Fine Structure of Developing Lima Bean Seeds Related to Seed Desiccation." American Journal of Botany 55(6): 658-682. 44. Klemš, M., J.-. Balla, et al. (1997). Stanovení kyseliny abscisové RIA metodou. MendelNET '97, Brno, Mendelova zemědělská a lesnická univerzita, Agronomická fakulta, Brno.ISBN: 599-009 45. Klepper, L. A. (1979). "Nitric oxide (NO) and nitrogen dioxide (NO2) emissions from hebicide-treated soybean plants." Atmos. Environ 13: 537-542. 46. Koornneef, M., L. Bentsink, et al. (2002). "Seed dormancy and germination." Current Opinion in Plant Biology 5: 33-36. 47. Kopyra, M. and Gwozdz (2003). "Nitric oxide stimulates seed germination and counteracts the inhibitory effect of heavy metals and salinity on root growth of Lupinus luteus." Plant Physiology and Biochemistry 41(11): 1011-1017. 48. Koshland, D. E. (1992). "The molecule of the year." Science 258: 1861-1861. 49. Kucera, B., M. A. Cohn, et al. (2005). "Plant hormone interactions during seed dormancy release and germination." Seed Science Research 15: 281-307. 50. Kyjovská, O. Z. (2006). "Genetická determinace embryogeneze u Arabidopsis thaliana (L.) Heynh." Disertační práce: 126. 51. Leubner-Metzger, G. (2003). "Functions and regulation of β-1,3-glucanase during seed germination, dormancy release and after-ripening." Seed Science Research 13: 17-34. 52. Leubner-Metzger, G., C. Frundt, et al. (1995). "Class I [beta]-1,3-Glucanases in the Endosperm of Tobacco during Germination." Plant Physiol. 109(3): 751759. 53. Lewak, S., R. Bogatek, et al. (2000). Sugar catabolism in apple embryos. Dormancy i plants. From whole plant behavior to cellular control. J. D. Viemont and J. Crabbe, CABI Publishing: 47-57. 70
54. Li, B. L. and M. E. Foley (1997). "Genetic and molecular control of seed dormancy." Trends in Plant Science 2: 384-389. 55. Li, W., X. Liu, et al. (2005). "Hormonal and environmental regulation of seed germination in flixweed (Descurania sophia)." Plant Growth Regulation 45: 199207. 56. Libourel, I. G. L., P. C. Bethke, et al. (2006). "Nitric oxide gas stimulates germination of dormant Arabidopsis seeds: use of a flow-through apparatus for delivery of nitric oxide." Planta 223(4): 813-820. 57. Major, W. and E. H. Roberts (1968). "Dormancy in Cereal Seeds I. The effects ox oxygen and respiratory inhibitors " Journal of Experimental Botany 19(1): 77-89. 58. Manz, B., K. Muller, et al. (2005). "Water Uptake and Distribution in Germinating Tobacco Seeds Investigated in Vivo by Nuclear Magnetic Resonance Imaging" Plant Physiol. 138(3): 1538-1551. 59. Marshall, J., T. Beardmore, et al. (2000). "The effects of paclobutrazol, abscisic acid, and gibberellin on germination and early growth in silver, red, and hybrid maple." Can. J. For. Res. 30: 557-565. 60. Matuskovic, J. and J. Brindza (1997). "Vliv chemomutagenu NaN3 na formovanie habitusu rastlin granátového jablka." Záverečná zpráva (VE-A34/01/5), SPU Nitra: 10-11. 61. Mayer, B. and B. Hemmens (1997). "Biosynthesis and action of nitric oxide in mammalian cells." Trends Biochem. Sci. 22(12): 477-481. 62. Moore, R. (1996). Botany. Volume Two, Plant diversity. Dubuque, Iowa, Brown.ISBN: 0697166570 63. Mudroch, A. J. and R. H. Ellis (2000). Dormancy, Viability and Longevity. Seeds: The Ecology of Regeneration in Plant Communities. M. Fenner. Wallingford, UK., CABI Publishing: 183-214. ISBN: 0851994040 64. Nambara, E., T. Akazawa, et al. (1991). "Effects of the gibberellin biosynthesis inhibitor uniconazol on mutants of Arabidopsis." Plant Physiol 97: 736-738. 65. Nambara, E. and A. Marion-Poll (2003). "ABA action and interactions in seeds." Trends in Plant Science 8: 213-217. 66. Nkang, A. (2001). "Effect of cyanide pre-treatment on activities of polyphenoloxidase and peroxidase in seeds of Guilfoylia monostylis." Seed science and technology 29(3): 557-565. 71
67. Probert, R. J. (2000). The role of temperature in the regulation of seed dormancy and germination. Seeds: The Ecology of Regeneration in Plant Communities. M. Fenner. Wallingford, UK., CABI Publishing: 261–292.ISBN: 0851994040 68. Procházka, S., I. Macháčková, et al. (2003). Fyziologie rostlin. Praha, Academia Praha: 484. ISBN: 80-200-0586-2 69. Procházka, S. and J. Sebánek (1997). Regulátory rostlinného růstu. Praha, Academia. ISBN: 8020005978 70. Quarrie, S. A., P. N. Whitford, et al. (1988). "A monoclonal antibody to (S)abscisic acid: its characterization and use in a radio immunoassay for measuring abscisic acid in crude extracts of cereal and lupin leaves." Planta 173: 330–339. 71. Radley, M. (1976). "The Development of Wheat Grain in Relation to Endogenous Growth Substances." J. Exp. Bot. 27(5): 1009-1021. 72. Salisbury, F. B. and International Association for Plant Physiology. (1996). Units, symbols, and terminology for plant physiology a reference for presentation of research results in the plant sciences. New York, Oxford University Press.ISBN: 019509445X 73. Sarath, G., P. C. Bethke, et al. (2006). "Nitric oxide accelerates seed germination in warm-season grasses." Planta 223(6): 1154-1164. 74. Sponsel, V. M. (1995). Gibberellin biosynthesis and metabolism. Plant hormones. Physiology, biochemistry and molecular biology. P. J. Davies. London, Kluwer Academic: 66-97.ISBN: 0792329848 75. Sreenivasulu, Y. and D. Amritphale (2000). "Changes in protein composition in cellular membranes of various parts of secondary dormant cucumber seeds treated with ethanol." Seed Science Research 10(1): 61-70. 76. Šetlík, I., F. Seidlová, et al. (2004). "Fyziologie rostlin." [online], dostupné z :http://www.natur.cuni.cz/biochem/kucera/rostliny/is/fyzros.html. 77. Šupálková, V., D. Húska, et al. (2007). "Electroanalysis of plant thiols." Sensors
7(6): 932-952. 78. Taylorson, R. B. and S. B. Hendricks (1979). "Overcoming dormancy in seeds with ethanol and other anesthetics." Planta 145(5): 507-510. 79. Víteček, J. (2006). "Oxid dusnatý ve stresové reakci rostlin" Disertační práce: 60
72
80. Vleeshouwers, L. M. and H. J. Bouwmeester (2001). "A simulation model for seasonal changes in dormancy and germination of weed seeds." Seed Science Research 11: 77-92. 81. Wendehenne, D., A. Pugin, et al. (2001). "Nitric oxide: comparative synthesis and signaling in animal and plant cells." 6: 177-183. 82. Yamasaki, H. (2000). "Nitrite-dependent nitric oxide production pathway: implications for involvement of active nitrogen species in photoinhibition in vivo." Phil.Trans. R. Soc. Lond. B 355: 1477-1488. 83. Zítka, O., K. Stejskal, et al. (2007). "Využití elektrochemických technik pro analýzu biologických vzorků." Chemické listy 101(3): 225-231. 84. Wikipedia, The free Encyclopedia, [on-line], Wikimedia Foundation, Inc., USA [cit. 10. února 2008]. Dostupné na WWW: http://en.wikipedia.org/wiki/Sodium_azide
73
9 PŘÍLOHY
9.1 Seznam obrázků Obr. 1 Stavba semene Nicotiana tabaccum .................................................................. 11 Obr. 2 Přehled hlavních událostí spojených s klíčením semen a následným růstem ..... 18 Obr. 3 A: Druh Nicotiana benthamiana Domin, B: detail tobolky................................ 21 Obr. 4 Hormonální regulace klíčení u Nicotiana sp ..................................................... 22 Obr. 5 Mechanismus syntézy oxidu dusnatého ........................................................... 27 Obr. 6 Molekulární struktura nitroprussidu sodného (SNP) …………………………...29 Obr. 7 Schéma zapojení oxidační kolony ...................................................................... 36 Obr. 8 Reálné zapojení detekční aparatury................................................................... 37 Obr. 9 Schéma zapojení průtokového systému............................................................. 38 Obr. 10 Základní schéma HPLC-ED ………………………………………………......37
74
9.2 Seznam grafů Graf 1 Posklizňové dozrávání semen N. benthamiana: (A) při pokojové teplotě a (B) 4°C. ................................................................................................................................. 42 Graf 2 Sledování vlivu KCN, SNP a PFC na klíčivost semen N. benthamiana. ............ 42 Graf 3 Vliv světla (A) a tmy (B) na klíčení dormantních semen N. benthamiana po ovlivnění 10µM SNP, PFC a KCN................................................................................. 44 Graf 4 Vliv dusíkatých sloučenin na dormanci semen N. benthamiana. ........................ 44 Graf 5 Účinnost odstranění dormance působením NaNO2 v závislosti na pH ............... 45 Graf 6 Účinnost odstranění dormance působením NaNO3 v závislosti na pH ............... 46 Graf 7 Vliv světla a tmy na klíčení semen po ovlivnění NaNO2. T-tma, S-světlo ......... 47 Graf 8 Vliv NO na klíčení semen N. benthamiana při celkovém průtoku 80 ml/min... 48 Graf 9 Vliv kyseliny giberelové (GA3) na klíčení semen A) nedormantních, B) dormantních .................................................................................................................... 49 Graf 10 Vliv GA4+7 na klíčení semen A) dormantních , B) nedormantních................... 50 Graf 11 inhibiční vliv Paclobutrazolu na klíčení nedormantních semen........................ 51 Graf 12 Vliv ABA na klíčení semen, n-nedormantní, d-dormantní semena .................. 52 Graf 13 Současné působení kyseliny abscisové a azidu sodného na klíčivost semen N. benthamiana.................................................................................................................... 52 Graf 14 Vliv etanolu na klíčení semen N. benthamiana ................................................. 54 Graf 15 Produkce NO v dormantních semenech N. benthamiana .................................. 56 Graf 16 Klíčivost dormantních semen po ovlivnění 100µM NaN3 ................................ 57 Graf 17 Klíčivost nedormantních semen po ovlivnění 100µM NaN3 ............................ 58 Graf 18 Klíčivost nedormantních semen po ovlivnění 100µM NaN3 ............................ 58 Graf 19 Stanovení thiolových sloučenin u semen ovlivněných NaN3. A) GSH, B) Cys, C) PC2............................................................................................................................. 60 Graf 20 Obsah endogenní ABA v semenech ovlivněných azidem sodným ................... 61
75
