MENDELOVA ZEMĚDĚLSKÁ A LESNICKÁ UNIVERZITA V BRNĚ AGRONOMICKÁ FAKULTA
BAKALÁŘSKÁ PRÁCE
BRNO 2007 ANDERLOVÁ
KRISTÝNA
1
Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav morfologie, fyziologie a genetiky zvířat
Genetické metody ověřování původu koně Bakalářská práce
Vedoucí práce: Prof. Ing. Josef Dvořák, Csc. Anderlová
Vypracovala: Kristýna 2
PROHLÁŠENÍ
Prohlašuji, že jsem bakalářskou práci na téma Genetické metody ověřování původu koně vypracovala samostatně a použila jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém seznamu literatury. Bakalářská práce je školním dílem a může být použita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího diplomové práce a děkana AF MZLU v Brně.
dne………………………………………. podpis studenta…………………………..
3
Ráda bych poděkovala svému vedoucímu práce panu Prof. Ing. Josefu Dvořákovi, CSc. a Ing. Ireně Vrtkové za poskytnutí dat z LAGu. V neposlední řadě srdečně děkuji své rodině za podporu ve studiu.
4
ABSTRAKT Cílem práce bylo rozdělit a popsat metody stanovení a ověření rodičovství u koní. V současnosti se celosvětově používá genetická metoda založená na detekci a porovnání DNA mikrosatelitů doporučených ISAGem. Byly vypočítány frekvence alel v panelu doporučených lokusů u vybrané populace českého teplokrevníka, pravděpodobnosti vyloučení nesprávného rodiče podle Jamiesona a Taylora (1997), které byly uspokojivě vysoké. V poslední části bylo provedeno ověření rodičovství, v prvním případě nesouhlasil uvedený otec a druhý příklad nevyloučil rodičovství. Klíčová slova: kůň, mikrosatelit, původ
ABSTRACT The goal of this bachelor thesis was to separate and define the methods of the horse parentity determination and verification. Currently we are using the genetics method flowing from detecting and comparing of DNA microsatellites recommended by the ISAG. It was calculated frequencies of alleles of the recommended panel by the chosen population of Czech-Warm blooded horses, probabilities of parentage exclusion published by Jamieson and Taylor (1997), which were in a satisfactory manner high. In the last part was verified pedigree, in the first case the paternity was exluded and in the second sample the pedigree agrees the parents. Key words: horse, microsatellite, pedigree
5
OBSAH 1
ÚVOD ........................................................................................................................8
2
LEGISLATIVA V ČR ...............................................................................................9 2.1 Označování a evidence koní ....................................................................................9 2.2 Chovatelské požadavky ...........................................................................................9
3
AKREDITOVANÉ LABORATOŘE ......................................................................10
4
MEZINÁRODNÍ SPOLEČNOST PRO GENETIKU (ISAG) ................................11
5
PŮVODNÍ METODY OVĚŘOVÁNÍ RODIČOVSTVÍ........................................12 5.1 Biochemický polymorfismus proteinů a krevní skupiny.......................................12 5.2 Testování lymfocytů .............................................................................................13
6
GENETICKÉ METODY OVĚŘOVÁNÍ RODIČOVSTVÍ ....................................14 6.1 Genetické markery a DNA mikrosatelity .............................................................14 6.2 Jiné genetické metody ..........................................................................................15 6.2.1 SNPs...............................................................................................................15 6.2.2 DNA minisatelity ...........................................................................................15 6.3 Laboratorní provedení ověření rodičovství ..........................................................15
7
VYHODNOCENÍ ÚDAJŮ ZE STANOVENÍ GENETICKÉHO TYPU................18 7.1 Charakteristika ověřovaného souboru jedinců .....................................................18 7.2 Alelová četnost ......................................................................................................18 7.3 Pravděpodobnosti vyloučení nesprávného rodiče ................................................23 7.4 Příklad ověření rodičovství...................................................................................25 7.4.1 Vyloučení otcovství ........................................................................................25 7.4.2 Souhlasné rodičovství .....................................................................................25
8
ZÁVĚR.....................................................................................................................27
9
POUŽITÁ LITERATURA.......................................................................................28 6
10 SEZNAM ZKRATEK..............................................................................................30 11 SEZNAM TABULEK..............................................................................................31
7
1
ÚVOD
V současné době neodmyslitelně stoupá význam studia genetiky v zemědělské produkci, které napomáhá k docílení ekonomických požadavků úzce souvisejících s genetickým ziskem. Výchozím krokem pro úspěšné naplňování cílů chovatelů hospodářských zvířat je jednoznačná identifikace zvířete a správné určení rodičovství související s narůstajícím užíváním moderních biotechnologických metod při reprodukci, ke kterým patří umělá inseminace a transfer embryí, dále pak mezinárodní obchod a transport koní. Celou problematiku verifikace vyjasňuje Zákon č. 154/2000 Sb., o šlechtění, plemenitbě a evidenci hospodářských zvířat (plemenářský zákon). Koně jsou dle zákona registrováni a identifikováni na základě testů DNA, které téměř stoprocentně vylučují vytvoření chybných údajů při vedení rodokmenu zvířete. Běžně a celosvětově užívanou molekulárně genetickou metodou při určování a ověřování rodičovství je analýza polymorfismu mikrosatelitů, ty jsou svými vlastnostmi (vysoce polymorfní, rovnoměrně rozmístěny po genomu, jednoduše detekovatelné pomocí PCR metody, kodominance alel) předurčeny pro identifikaci jedince. Cílem předkládané rešerše je provedení základního rozdělení užívaných metod při provádění ověřování rodičovství, stanovení významu a praktické přiblížení problematiky pro širokou veřejnost.
8
2
LEGISLATIVA V ČR
Podkladem pro vysvětlení příčin provádění určování a ověřování původu je zákon 154/2000 Sb. „O šlechtění, plemenitbě a evidenci hospodářských zvířat a o změně některých souvisejících zákonů (plemenářský zákon)“ a pozdější vyhlášky 136/2004 Sb. ( nov. 199/2007 Sb.) a 448/2006 Sb. Zákon upravuje následující.
2.1 Označování a evidence koní Chovatelé všech koní (tedy i bez plemenné příslušnosti) jsou povinni vyžádat si od pověřené osoby průkaz koně, ve kterém je zaznamenáno označení koně: a) slovním popisem a grafickým popisem se stanoveným genetickým typem b) slovním a grafickým popisem a výžehem Každé hříbě koně, osla a jejich kříženců se označuje před odstavením, nejpozději však do 8 měsíců ode dne narození. Od 1.7. 2009 lze očekávat změny v označování. Koně, kteří nejsou evidováni v žádné v ČR vedené plemenné knize, koně bez plemenné příslušnosti se budou označovat slovním a grafickým popisem a čipem. Některá chovatelská sdružení budou také vyžadovat označení prostřednictvím čipu.
2.2 Chovatelské požadavky Podstatu výše uvedeného zákona naplňuje šlechtitelská činnost a šlechtitelská opatření spočívající ve zjišťování a evidenci původu a v ověřování a osvědčování původu nebo stanovování genetického typu plemenných zvířat dle požadavků jednotlivých řádů plemenných knih. Původ musí být ověřen: • • • •
u hříbat narozených po inseminaci nebo po přenosu embryí u hříbat plemene anglický plnokrevník a klusák namátkově u potomstva testovaných plemeníků pro výkon dozorčí činnosti
Genetický typ musí být stanoven u hřebců vybraných pro plemenitbu. Jednotlivé řády plemenných knih uznaných chovatelských sdružení vymezují další příčiny pro provedení genetického ověřování původu. Například SCHČT - Svaz chovatelů českého teplokrevníka požaduje vystavení potvrzení, existují-li pochybnosti o udaném původu v případě, že: • klisna byla v průběhu říje připuštěna dvěma nebo více hřebci • hříbě nebylo identifikováno pod matkou
9
3
AKREDITOVANÉ LABORATOŘE
Původ plemenných zvířat ověřují a jejich genetický typ stanovují oprávněné osoby. Dokládají osvědčení o akreditaci, účast v mezinárodních srovnávacích testech a trvale splňují jejich kritéria (Anonym 1, 2009). V České republice provádí tuto činnost:
•
ČMSCH a.s., Laboratoř imunogenetiky 252 09 Hradištko pod Medníkem www.cmsch.cz
•
Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně Laboratoř agrogenomiky Zemědělská 1, 613 00 Brno http://www.lamgen.cz/index1.php
•
GENSERVICE s.r.o. Palackého 1-3 612 42 Brno http://www.almara.cz/genservice/
Hlavní vlastnosti těchto kvalifikovaných laboratoří majících celosvětové osvědčení spočívají v přesnosti, opakovatelnosti a cenové dostupnosti DNA testů chovatelům čistokrevných koní. Pravděpodobnost správnosti výsledků se blíží 100% (Bowling, 1996). Laboratoře různých zemí používají ve své metodologii stejnou sadu mikrosatelitních markerů a tedy výsledky o jedinci mohou být mezinárodně porovnávatelné a v případě importu zvířete ze zahraničí není nutné provedení přetestování (Bowling, Ruvinsky, 2000). Oslovená akreditovaná laboratoř v Německu (Gunreben, 2009) potvrdila užívání lokusů mikrosatelitů doporučených ISAGem, v případě nejasností používají panel rozšířený. Vzorky jsou odebírány z koňských žíní nebo krve, veterináři zasílají přímo EDTA vzorky, krev je po vyvázání vápníku nesrážlivá.Nejvíce se testují zástupci plemene německý teplokrevník, německý pony a arabští koně. Laboratoř imunogenetiky při ČMSCH (Vondrová, 2009) v roce 2001 přešla z ověřování původu krevními skupinami na DNA testování. Od té doby bylo ověřeno 30 000 koní (v roce 2008 přes 2800 koní). Ročně se vyhodnotí 3 až 4 případy nesouhlasného otcovství. 10
4
MEZINÁRODNÍ SPOLEČNOST PRO GENETIKU ZVÍŘAT
The International Society for Animal Genetics neboli ISAG vzešla ze série každoročních workshopů na poli imunogenetiky, biochemické genetiky a molekulární genetiky zvířat. Společnost podporuje účinnou výměnu myšlenek v oblasti výzkumu a aplikace do praxe, pořádá konference, porovnávání testů mezi laboratořemi, publikuje časopis „Animal Genetics“. Pro účely identifikace jedince a ověřování rodičovství byl vědeckou společností sestaven a doporučen panel devíti mikrosatelitů (zvýrazněnéných v tab.1), osm dalších mikrosatelitů bylo přidáno pro zvýšení pravděpodobnosti vyloučení nesprávného rodiče. ISAG poskytuje i matematicko statistické vzorce dle Jamiesona a Taylora publikované roku 1997, kterých je využíváno při provádění analýz efektivnosti používaných mikrosatelitů v ověřování parentity. Zobrazení a vysvětlení uplatnění vzorců bude provedeno v kapitole 7.3.
Tab.1 Panel mikrosatelitných markerů doporučený ISAGem Lokalizace na chromozomu T
ATH4 ATH5 HMS1 HMS2 HMS3 HMS6 HMS7 HTG4 HTG6 HTG7 HTG10 VHL20 ASB2 ASB17 ASB23 CA425 LEX3
24 8 15 10 9 4 1 9 15 4 21 30 15 2 3 28 x
11
5
PŮVODNÍ METODY OVĚŘOVÁNÍ RODIČOVSTVÍ
5.1 Biochemický polymorfismus proteinů a krevní skupiny Od 60. let 20. století se identita koně začala potvrzovat především sérologickými a biochemickými testy. Na základě proměnlivosti krevních skupin, sérových bílkovin a izoenzymů se porovnávaly genotypy otce, matky a potomka. Principem sérologického testu je určení antigenu červených krvinek (krevně specifického faktoru). Proteinový polymorfismus vychází ze stanovení genetických variant daných proteinů elektroforetickou metodou. Tato technika využívá elektrického proudu k rozdělení směsi molekul zapravených v opěrném médiu (agaróze nebo PAGE). Rozdílná vzdálenost migrujících proteinů od startu vypovídá o jejich genetických variantách.
Obr. 1 Schéma migrace proteinů při elektroforéze (Anonym 2, 2009) Tato testování byla technicky jednoduše proveditelná a finančně nenáročná. Nevýhodou je potřeba vzorku čerstvé, nesražené krve, kterou může odebírat pouze veterinární lékař.
12
5.2 Testování lymfocytů Major histokompatibity complex (MHC), geneticky kontrolovaný systém tkáňových antigenů, se projevuje jako odmítnutí transplantované tkáně mezi nepříbuznými jedinci. Při zkouškách koňských lymfocytních antigenů (Equine Lymphocyte Antigens, ELA systému) pro účely studia nemocí a ověřování původu byly pojmenovány 2 histokompatibilní markery: ELA-A a ELA-B (Bowling, 1996).
13
6
GENETICKÉ METODY OVĚŘOVÁNÍ RODIČOVSTVÍ
Četné výhody molekulárně genetických metod nahradily v současnosti metody tradiční. Zvýšila se i pravděpodobnost správného vyhodnocení testovaných případů. Celosvětově se při identifikaci a ověření rodičovství využívá sady DNA mikrosatelitních markerů doporučené ISAGem.
Výhody DNA testů podle Dvořáka (2002): • biologický vzorek pro analýzu DNA může pocházet nejen z krve, ale i chlupových cibulek (vytrhávají se koňské žíně), spermatu, z těl uhynulých zvířat atd. • DNA je uchovatelné po dlouhou dobu, proto se nabízí možnost opakování testů • Vysoký polymorfismus na úrovni DNA zvyšuje pravděpodobnost vyloučení nesprávně uvedeného původu • Využívá se automatizace a sériové zpracování vzorků
Avšak testy DNA se vyznačují i vyššími náklady na přístroje a použité chemikálie a vyšší náročností zvolených technologií.
6.1 Genetické markery a DNA mikrosatelity Genetické markery jsou snadno a spolehlivě detekovatelné úseky DNA. Používá se vysoce variabilních, kodominancích a děděných bez vlivu prostředí . Knoll a Vykoukalová (2002) uvádí tyto výhody a vlastnosti molekulárně genetických markerů: • • • •
Početnost a snadnost detekovatelnosti Vysoká informativnost Detekovatelnou z minima biologické tkáně Snadná archivovatelnost a dostupnost k pozdějším analýzám
Mikrosatelity se řadí mezi genetické markery, které slouží jako experimentální sondy ke zjištění informací o jedinci. Jsou to nekódující sekvence molekuly DNA Vlastnosti mikrosatelitů (Zima et al., 2004): • • • •
přesná identifikace kodominancích alel vysoká proměnlivost jednoduchost analýzy možnost analýzy mikrosatelitů u vymřelých druhů (viz výhody PCR)
14
6.2 Jiné genetické metody 6.2.1 SNPs Jednonukleotidový polymorfismus (Single Nukleotide Polymorphysm) se prosazuje jako další metoda identifikace jedince. Na základě vzniku variability způsobené bodovou mutací (záměna jedné báze, ztrátou jedné báze, přehození nebo vložení bazí). 6.2.2 DNA minisatelity Další možností je použití minisatelitní DNA, délka se pohybuje v rozmezí 10 a 60 bp. Pro detekci je třeba značené DNA sondy a štěpení restrikčními enzymy, v praxi se pro relativní technickou náročnost tato metoda neujala (Dvořák et al., 2001).
6.3 Laboratorní provedení ověření rodičovství Laboratorním metodám testování předchází získání biologického vzorku obsahujícího DNA, u koní obvykle veterinární lékař odebere krev nebo chovatel zasílá koňské žíně (důležitou součástí jsou chlupové cibulky) přímo do akreditované laboratoře. Následně se vzorek homogenizuje (zpracovává) pro další kroky, kterými jsou: •
Izolace DNA
- můžeme provést proteinázovou metodou, fenol-chloroformovou extrakcí nebo kolonkovou metodou, ta je řazena mezi jednoduché a kvalitní metody. Principem je adsorpce DNA na silikát. Následně se kontroluje kvalita izolované DNA elektroforeticky. •
Multiplex PCR
- v této fázi se amplifikují všechny MS sekvence najednou. - PCR (polymerázová řetězová reakce) neboli Polymerase Chair Reaction je metoda syntézy nukleových kyselin v podmínkách in vitro (Vyhnálek, Ježíková, 2005), vychází z komplementarity dvouřetězcové DNA a krátkých specifických sekvencí DNA (primerů, jednořetězcových oligonukleotidů).Anylýza zvýrazňuje a potvrzuje genetické modifikace a jejich procento ve vzorku (Bednář et al., 2005) Složení reakční směsi: DNA obsahuje reakční směs pufr pro DNA polymerázu, směs nukleotidů (DTP), pár specifických primerů pro cílovou sekvenci, termostabilní DNA polymerázu a aditiva zvyšující účinnost a specifitu reakce.
15
Teplotní a časový průběh reakce: Probíhá inkubace vzorků při třech různých teplotách ve třech postupných krocích v amplifikačním cyklu (denaturace, annealing a elongace). Dvouvláknová DNA je denaturována krátkým zahřátím vzorku na 90 - 95º C, při krátkém ochlazení na 40 60 º C nasedají příslušné primery na své komplementární sekvence, pak následuje další zahřátí na 72º C a primery se prodlužují pomocí Taq polymerázy.
Obr. 2 Schéma průběhu PCR (Anonym 3, 2009)
16
•
Fragmentační analýza
- konečné vyhodnocení sledovaných polymorfismů se stanoví prostřednictvím fragmentační analýzy DNA v automatickém sekvenátoru. Výstupy jsou umožněny pomocí genetických softwarových programů.
Obr. 3 Sekvenátor ABI PRISM 310 (Anonym 4, 2009)
17
7
VYHODNOCENÍ ÚDAJŮ ZE STANOVENÍ GENETICKÉHO TYPU
7.1 Charakteristika ověřovaného souboru jedinců Pro analýzu rutinně používaných mikrosatelitních markerů bylo v LAGu vybráno 20 náhodných jedinců plemene český teplokrevník s rozlišením pohlaví, které je v ČR nejrozšířenější (Anonym 7, 2009) a provádí se tedy u něj nejvíce stanovení genetického typu a verifikace původu. Poskytnutá data v tab.2 obsahují i laboratorní číslo, které se objeví v průkazu koně jako genetický typ. Byla vyhodnocena četnost jednotlivých alel v souboru. Matematicko statistickými vzorci (Jamieson, Taylor, 1997), byly vypočítány jednotlivé pravděpodobnosti vyloučení nesprávného rodiče ve třech uvedených situacích. Pro názornost je uvedený příklad ověření zadaného rodičovství na základě výsledků laboratorních analýz DNA plynoucí z případové studie.
7.2 Alelová četnost Při počítání četností alel se vycházelo z výchozích údajů uvedených v tab. 2. V dalších tabulkách (3. a 4.) je shrnuta četnost absolutní a frekvence alel v lokusu. V poskytnuté populaci českého teplokrevníka se počet alel v lokusech pohybuje mezi 4 (lokus HMS 1 a HTG 7) a 10 (lokus ASB 2). Nejčastěji se v jednotlivých lokusech objevilo 7 alel, avšak průměrný počet alel v lokusu byl 6,294. Byla zaznamenána frekvence alel v souboru mikrosatelitů, její rozmezí bylo od 0,025 do 0,475.
18
Tab. 2 Výchozí údaje o populaci českého teplokrevníka POHLAVI LAB.CISLO AHT4 AHT5 HMS1 HMS2 HMS3 HMS6 HMS7 HTG4 HTG6 HTG7 HTG10 VHL20 ASB2 ASB17 ASB23 CA425 LEX3 hřebec
130/04
H J
klisna
136/04
klisna
J
K
J
J
K
L
G M K O I
K
I
M
K
N N
R
J
K
N
N
N N
J
O N N
J
J
K
M M N
O
M M G O K O I
O
I
R
B
P
N
Q
T
U
N
N
L
P
137/04
J
O K N
J
M K
K
J
O
L
I
Q
L
R
B
N N
Q
U
U
N
N
L
P
hřebec
138/04
J
J
I
O M P
J
M K
M G M K K
Q
R
N
R
N R G
G
L
U
I
J
M M
klisna
139/04
H J
K M I
I
M P
P
J
N
K
K
K O N
O
I
M
K
Q M
N
J
J
N
N
O P
klisna
162/04
O O J
K
hřebec
163/04
H M J
O L
M H J
P
P
L
M J
P
K
M J
M P
K
O L
N
L
Q G O N N
klisna
167/04
J
J
J
N
O M P
L
O
K
M J
klisna
170/05
H J
K K
I
P
M O J
P
hřebec
171/05
J
K O J
M H K
I
O M O J
O
klisna
178/05
H J
J
M J
M I
L
I
O O P
L
M L
klisna
179/05
J
K
M I
K
I
O O P
J
L
klisna
180/05
H O K O I
J
L
L
O P
hřebec hřebec
199/05
H J
K N
J
L
H L
20/05
J
J
J
J
L
klisna
210/04
H J
K M J
M K
klisna
214/04
K O K O J
klisna
215/04
klisna klisna
K N
O J J
O J
L
M M P
P
K
I
M M P
M H L
I
M H I
M M H J J
L
L
M M H L
L
I
O O P K
M O R J
J
K K
I
I
M
I
L
N
N
I
J
G
J
F
K
N
M
N
K
M N
S
J
U
N
O
M M
M N O K
O
M
M
K
N G
N
J
L
M
N
H K
K
M G G O O O
S
I
N
P
Q N
R
J
K
J
O
K P
K
K
R
N
P
M Q N
R
J
K
O
O
P P
M G G N O -
N
I
N
I
K
G
M
J
J
J
J
F
H
M G R
K O M
N
I
M
I
N G
M
J
L
J
N
F
O
K
O O O I
G G O O O
H
K
P
O P
M M G J
O O M
O
I
I
K
Q I
N
J
L
J
N
H M
N
Q P
P
J
L
M M I
J
O O O
R
I
N
K
Q N
Q
K
U
M
N
H H
I
-
M P
L
O
K
K
J
R
N O L
O
I
N
Q Q G
R
J
U
H
O
P P
M I
P
M P
O P
K
P
O O K M M
O
M
N
K
M M
M
K
S
J
N
L
M K
L
I
O L
M L
O
K
K
G G K M O
R
I
M
K
M N
R
K
K
J
O
H H
H O K M I
M K
K
I
P
L
P
M K
K
G J
K
O
I
M
K
O N
R
J
K
J
O
H P
220/04
H O K N
M H L
N
P
M P
O K O L
M
N
O
K
K
N
R
K
L
J
N
L
M
229/04
O O N O J
M K
I
N
M M J
J
O
I
M
M O N
R
J
K
N
O
L
P
J
K
I
L
L
L
N O
M M J
M K
19
M J
K K
N O M
M
Tab. 3 Absolutní četnost alel
lokus ATH4 ATH5 HMS1 HMS2 HMS3 HMS6 HMS7 HTG4 HTG6 HTG7 HTG10 VHL20 ASB2 ASB17 ASB23 CA425 LEX3
B
F
G
H 10
8
I
5 3 13
J 16 8 16 2
9 15
1
2 6 1 3
1 9
5 14 3 1 1 1
K 1 16 11 3 1 17
L
3 14 13 3 9 3
11 13 4
15 11
12
2 1 1
10
5
2
5
M 1 4 16 2 4 12 5 17 3 2 5 11 5 5 2 7
N 7
5 3
6 4 9 5 16 16 2
20
O 12 5
P
Q
8 6 9
8 16 4 2
1
7 19 12 1 2
8 2
R
S
T
U
1
7
1 3 2
1 2
10
7 3
4 3 1 8
1
1 1
Tab. 4 Frekvence alel lokus ATH4 ATH5 HMS1 HMS2 HMS3 HMS6 HMS7 HTG4 HTG6 HTG7 HTG10 VHL20 ASB2 ASB17 ASB23 CA425 LEX3
B
F
G
H
I
0,25
0,2
0,125 0,075 0,325
J
K
0,4 0,2 0,4 0,05
0,025 0,4
0,225 0,375
0,275 0,075 0,025 0,425
L
M 0,025
0,075 0,35 0,075 0,225 0,075
0,025 0,275
0,125 0,35 0,05 0,075 0,15 0,025 0,025 0,375 0,025 0,025 0,025 0,025 0,075 0,225
0,325 0,1 0,3
0,05 0,025 0,025
0,25
0,125
0,05
0,125
21
0,4 0,05 0,1 0,3 0,125 0,425 0,075 0,05 0,125 0,275 0,125 0,125 0,05 0,175
N
O
P
Q
0,2 0,4 0,1 0,05
0,025
R
S
T
U
0,025
0,175
0,3 0,175 0,125
0,125 0,075
0,15 0,1 0,225 0,125 0,4 0,4 0,05
0,2 0,15 0,225 0,175 0,475 0,3 0,025 0,05
0,2 0,05
0,025 0,075 0,05
0,025 0,05
0,25
0,175 0,075
0,1 0,025 0,075 0,025 0,2 0,025 0,025
Obr. 4 Výstup ze sekvenátoru 22
7.3 Pravděpodobnosti vyloučení nesprávného rodiče Stanovení pravděpodobnosti: 1)
PE1(Parentage exclusion): vyloučení nesprávného rodiče v případě zjištění genotypu potomka a obou rodičů (rodič špatně určen),
2)
PE2: vyloučení nesprávného rodiče v případě zjištění genotypu pouze jednoho z rodičů,
3)
PE3: vyloučení obou rodičů v případě zjištění genotypu potomka a obou rodičů (při záměně vzorků).
P …. pravděpodobnost vyloučení pro jeden lokus pi … četnost i-té alely n …. počet alel
4)
CEP (Combined exclusion probability): vyloučení nesprávného rodiče s použitím panelu mikrosatelitů o k lokusech z jednotlivých pravděpodobností.
23
Byla provedena analýza efektivnosti použitých mikrosatelitů pomocí matematicko statistických vzorců dostupných z ISAGu pro pravděpodobnosti vyloučení nesprávného rodiče v uvedených případech. Bylo třeba počítat s alelovými četnostmi v rámci samostatných lokusů, poslední vzorec podává výpověď o pravděpodobnosti vyloučení nesprávného rodiče pro celý panel mikrosatelitů. Pro stanovení daných pravděpodobností se v genetickém software běžně využívá programu Microsatellite ToolKit. Tab. 5 poskytuje výsledky pravděpodobností řešených situací. V případě, kdy známe genotyp potomka a jeho rodičů (vzorec PE 1), se hodnoty u jednotlivých lokusů pohybují od 44,336% (lokus AHT4) do 70, 257% (HTG 10). Při využití celého panelu mikrosatelitů byla pravděpodobnost vyloučení nesprávného rodiče (vzorec CEP) 99,9999%. Pravděpodobnost vyloučení nesprávného rodiče, pokud známe genotyp potomka a jen jednoho rodiče (vzorec PE 2), je v rozpětí od 45,256% (lokus AHT 4) do 58,093% (HTG 10). Odpovídající pravděpodobnost při využití sady mikrosatelitů je 99,9999%. Konečně při výpočtech pravděpodobnosti odhalení obou nesprávně vyhodnocených rodičů (PE 3) se vyskytovaly mezi 55,757% (lokus HMS1) a 87,164% (HTG 10).
Tab. 5 Výsledky daných pravděpodobností lokus AHT 4 AHT 5 HMS 1 HMS 2 HMS 3 HMS 6 HMS 7 HTG 4 HTG 6 HTG 7 HTG 10 VHL 20 ASB 2 ASB 17 ASB 23 CA 425 LEX 3 CEP
PE 1 PE 2 PE 3 0,44336 0,45256 0,58358 0,544424 0,47346 0,710517 0,430882 0,467879 0,55757 0,542668 0,474773 0,7133 0,598738 0,501148 0,774536 0,503534 0,465123 0,661732 0,637598 0,526112 0,811912 0,414182 0,55812 0,523268 0,534088 0,472318 0,701817 0,430909 0,474929 0,540732 0,702565 0,580923 0,871642 0,529006 0,469818 0,697403 0,684312 0,565199 0,856353 0,570197 0,487277 0,741081 0,545181 0,475787 0,714587 0,507983 0,46695 0,667733 0,662442 0,54642 0,835472 0,999999 0,99999217 1
Reprezentativní a tedy i uplatnitelné širší zobecnění výsledků je možné při analýze většího počtu jedinců v souboru. Přesto je možné tvrdit, že populace českého teplokrevníka vykazuje genetickou variabilitu (Misař, Jiskrová, 2001). Objevuje se patrná diverzita alel, předpokládá i jejich širokou kombinovatelnost, ta zvyšuje pravděpodobnost výskytu právě jednoho jedince se stanoveným genotypem. Chovatelé českého teplokrevníka usilují o zvýšení především skokové výkonnosti, proto při šlechtění používají i evropská skoková plemena koní. Mluvíme o syntetické populaci sportovních koní.
24
7.4 Příklad ověření rodičovství Pro vysvětlení principu ověření původu je třeba definovat genetický termín alela. Obecně se označuje jako konkrétní forma daného genu, dědí se vždy jedna od otce a jedna od matky. Proto je v případě potvrzování rodokmenu třeba znát nejen genotyp hříběte, ale také klisny a hřebce a jednotlivé kombinace mezi sebou porovnávat. Pro demonstraci byla použita starší data poskytnutá z LAMGenu (tab. 6A a tab. 6B), v prvním případě nesouhlasit původ otce, druhý příklad rodičovství nevyvrátil.
7.4.1 Vyloučení otcovství Zaznamenaný otec byl vyloučen, nesouhlasily alely 4 lokusů (AHT 4, ASB 2, HMS 2 a HTG 10). Formálně se do dokumentů, které obdrží chovatel žádající o ověření původu u svého koně, napíše citace z vyhlášky Mze ČR, kterou se upravuje formulace výsledku ověření parentity zvířete, tedy: „původ nesouhlasí s uvedenými rodiči – nesouhlasí otec“.
7.4.2 Souhlasné rodičovství Z poskytnutých údajů lze usuzovat, že genotyp potomka byl předurčen kombinací alel uvedené klisny a hřebce. Výsledek analýzy formulujeme takto: „původ souhlasí s uvedenými rodiči“.
25
Tab. 6A: Polymorfní lokusy s uvedenými genotypy (nesprávný otec) AHT 4 Hřebec K K
HMS 7 L L
HTG 4 L M
VHL 20 I L
AHT 5 K K
ASB 2 N P
Klisna Hříbě
M L
L L
L I
N K
R
J
H
J J
HTG 6 Hřebec G J Klisna I J Hříbě G J
O O
HMS 2 H K L M R L
L M
HMS 3 I P M N I N
M M
HTG 10 J L I K R I
O N
Q
R R
HTG 7 K M M N K N
HMS 6 K L K O L O
Tab. 6B: Polymorfní lokusy s uvedenými genotypy AHT 4 Hřebec K K Klisna J J Hříbě K J
HMS 7 L L M O L O
HTG 4 L M L L L M
VHL 20 I L L M I M
AHT 5 K K N O K N
ASB 2 N P R R N R
HTG 6 Hřebec G J Klisna I J Hříbě G J
HMS 2 H K L M H L
HMS 3 I P M N I N
HTG 10 J L I K I L
HTG 7 K M M N K N
HMS 6 K L K O L O
26
8
ZÁVĚR
Ověřování rodičovství a samotná jednoznačná identifikace jedince má nenahraditelný význam v chovu hospodářských zvířat respektive koní a celou problematiku šlechtění a plemenitby upravuje daný zákon s příslušnými vyhláškami. V současné době pro potvrzování původu používáme genetické metody prostřednictvím stanovení genetického typu pomocí mikrosatelitních markerů, u koní se používá základní panel 12 mikrosatelitů doporučených ISAGem, který je často rozšířen na 17 pro zvýšení hodnověrnosti výsledků. Tato metoda je celosvětově rozšířena, proto je možno provádět mezinárodní porovnávání testů. Byly analyzovány alelové četnosti sedmnácti mikrosatelitů ve vybrané populaci plemene český teplokrevník. Jednotlivé lokusy vykazovaly od 4 (lokus HTG 7 a HMS 1) do 9 alel (lokus ASB 2). Nejvíce se v souboru lokusů objevilo 7 alel. Vypočítaný aritmetický průměr dosáhnul hodnoty 6,294 Populace českého teplokrevníka tedy i na základě zjištěných četností a frekvencí alel potvrzuje genetickou variabilitu, předpokladem je užívání plemeníků z různých (Svazem chovu ČT uznaných) plemen Evropy. Zřejmá genetická proměnlivost uvnitř plemene zvyšuje pravděpodobnost vyloučení nesprávně označeného rodiče, kdy se stoupajícím počtem alel zvyšuje jejich kombinovatelnost a existence právě jednoho originálního souboru sledovaných genotypů.
27
9
POUŽITÁ LITERATURA
Animal Genetics [online] 2009 .[cit. 4. dubna 2009] Dostupné z:
ANONYM 1. Českomoravská společnost chovatelů, a. s. [online] 2009 [cit. 2. května 2009] Dostupné z: ANONYM 2. Med4You.at [online] 2009 [cit. 2. května 2009] Dostupné z: ANONYM 3. Learn. Genetics TM (GENETIC SCIENCE LEARNING CENTER [online] 2009 [cit. 3. května 2009] Dostupné z: ˂http://learn.genetics.utah.edu/content/labs/pcr/index.html˂ ANONYM 4. GeneTiCa s.r.o.[online] 2009 [cit. 2. května 2009] Dostupné z: ANONYM 5. Laboratoř aplikované molekulární genetiky (LAMGen) [online] 2009 [cit. 5. května 2009] Dostupné z: ANONYM 6. Ministerstvo zemědělství České republiky [online] 2009 [cit. 2. května 2009] Dostupné z: BEDNÁŘ, J., KUCIEL, J., Genetika. 1. Vydán Brno: Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně, 2005. 148s. ISBN 978-80-7157-862-8. BOWLING, A. T., Horse genetics. Cambridge: The University press, 1996. 200s. ISBN 0-85199-101-7 BOWLING, A. T., RUVINSKY, A., The Geneticg of the Horse., 2000. 527 s. ISBN 085199-429-6 DVOŘÁK, J., PUTNOVÁ, L., VRTKOVÁ, I., Ověřování parentity u prasat, skotu a koné. Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně, 2002 GUNREBEN, Baerbel. Re: WG: Student' s work. [online]. Zpráva pro: Kristýna Anderlová. 7. dubna 2009 [cit. 3. května]. Osobní komunikace. International Society for Animal Genetics. [online] 2009 .[cit. 29. Dubna 2009] Dostupné z:
28
JAMIESON, A., TAYLOR, S.S. Comparisons of free probability formulae for parentage exclusion. Animal Genetics, 1997, vol. 28, 397-400. [online] 2009 . [cit. 29. dubna 2009] Dostupné z: KNOLL, A., VYKOUKALOVÁ, Z. Molekulární genetika zvířat [skriptum]. Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně, 2002, vydání první, 168 s. ISBN 80-7157-6166. MISAŘ, D., JISKROVÁ, I. : Chov a šlechtění koní. Brno, Mendelova zemědělská a lesnická univerzita, [skriptum] 2001, 170 s. – Mendelova zemědělská a lesnická univerzita. ISBN 80-7157-510-0. Portál veřejné správy České republiky: Zákon č. 154/2000 Sb. o šlechtění, plemenitbě a evidenci hospodářských zvířat. [online] 2003-2007 . [cit. 29. dubna 2009] Dostupné z: Svaz chovatelů českého teplokrevníkas. [online] 2009 . [cit. 29. dubna 2009] Dostupné z: VONDROVÁ, Denisa. Re: Informace o laboratoři IG[online]. Zpráva pro: Kristýna Anderlová. 17. dubna 2009 [cit. 3. května]. Osobní komunikace. VYHNÁLEK, T., JEŽÍŠKOVÁ, I.: Genetika :(úkoly do cvičení pro GENF) 1. Vydání. Brno: Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně, 2005. 80s. ISBN 80-7157898-3. ZIMA, J., MACOLÁN, M., MUNCLINGER, P., PIÁLEK, J. Genetické metody v zoologii. UK v Praze, 2004, vydání první, 240 s. ISBN 80-246-0795-6.
29
10
SEZNAM ZKRATEK
CEP
cmbined exclusion probability - kombinovaná pravděpodobnost vyloučení rodičů
ČT ČMSCH
plemeno český teplokrevník Českomoravský svaz chovatelů
DNA
deoxyribonukleotide acid – deoxyribonukleová kyselina
EDTA
ethylendiaminetetraacetc acid – kyselina ethylendianintetraoctová
ELA
equine lymphocyte antigens - lymfocytní antigeny koně
ISAG
The International Society for Animal Genetics - Mezinárodní společnost pro genetiku zvířat
LAG (LAMGen)
Laboratoř aplikované molekulární genetiky
MHC
major histokompatibity complex - velký histokompatibilní komplex
MS
microsatellite - mikrosatelit
PAGE
polyacrylgelelectrophoresis - užití polyakrylového gelu při elektroforéze
PE
parentage exclusion - vyloučení nesprávného rodiče
SCHČT
Svaz chovatelů českého teplokrevníka
SNPs
single nukleotide polymorphysm - jednonukleotidový polymorfismus
30
11
SEZNAM TABULEK
Tab.1 Panel mikrosatelitných markerů doporučený ISAGem ……………………………11 Tab.2 Výchozí údaje o populaci českého teplokrevníka………………..………………19 Tab.3 Absolutní četnost alel………………………………….………………………..20 Tab.4 Frekvence alel …………………………………………………………… …...21 Tab. 5 Výsledky daných pravděpodobností………………...…………………………. 24 Tab. 6A Polymorfní lokusy s uvedenými genotypy.…………………………………….26 Tab. 6B Polymorfní lokusy s uvedenými genotypy…….……………………………….26
31
