MENDELOVA ZEMĚDĚLSKÁ A LESNICKÁ UNIVERZITA V BRNĚ AGRONOMICKÁ FAKULTA DIPLOMOVÁ PRÁCE

MENDELOVA ZEMĚDĚLSKÁ A LESNICKÁ UNIVERZITA V BRNĚ AGRONOMICKÁ FAKULTA

DIPLOMOVÁ PRÁCE

BRNO 2008

Bc. MARTIN MICHÁLEK

Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav morfologie, fyziologie a genetiky zvířat

Analýza variability v genech odolnosti k E.coli u prasat Diplomová práce

Vedoucí práce: prof. Ing. Josef Dvořák, CSc.

Vypracoval: Bc. Martin Michálek

Brno 2008

2

PROHLÁŠENÍ O AUTORSTVÍ

Prohlašuji, že jsem diplomovou práci na téma Analýza variability v genech odolnosti k E.coli u prasat vypracoval samostatně a použil jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém seznamu literatury. Diplomová práce je školním dílem a může být použita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího diplomové práce a děkana AF MZLU v Brně.

V Brně dne 25.5.2008

Bc. Martin Michálek

3

PODĚKOVÁNÍ Za odborné vedení a poskytnuté konzultace v průběhu zpracování diplomové práce děkuji vedoucímu práce prof. Ing. Josefu Dvořákovi, CSc. Všem svým blízkým pak děkuji za pochopení a podporu.

4

ABSTRAKT Diplomová práce se zabývá analýzou variability v genech odolnosti k E. coli u prasat. Rezistence nebo vnímavost k onemocněním selat – neonatálnímu průjmu sajících selat, průjmu odstávčat a edémové nemoci, vyvolávanými kmeny Escherichia coli obdanými faktory virulence - fimbriálními adheziny F18 a F4, je určována geny FUT1 a MUC4. Vnímavost je u obou genů vázána na dominantní alelu, pouze recesivní homozygoti jsou rezistentní. Práce shrnuje teoretické poznatky o kolibakteriózách selat, genetické podstatě odolnosti/rezistence vůči ETEC fimbriálnímu typu F18 a F4 a zabývá se metodami detekce bialelických polymorfizmů v genech FUT1 a MUC4. Jde o bodové mutace, FUT1 je lokalizován na 6. chromozómu, MUC4, je lokalizován na 13. chromozómu, přesná poloha se doposud upřesňuje. Sleduje výskyt recesivních/dominantních alel obou zmíněných genů ve třech skupinách prasat: farma A – soubor 67 kanců různých plemen (ČL, ČBU, H, PN), farma B 114 kanců plemene duroc v deseti liniích. Třetí soubor prasat tvoří 431 prasat různých plemen z komerčních chovů, 55 přeštických černostrakatých prasat z genetické rezervy ČR a 48 kanců LW, 77 prasnic LW a 19 kanců LA z mateřských chovů ČR a 171 kanců plemene PN a 102 kanců plemene D z otcovských chovů ČR. Stanoví frekvence genotypů, frekvence alel, predikuje teoretické alelové frekvence a hodnotí shodu. Vyhodnocuje podíl recesivních homozygotů ve FUT1, MUC4 a jejich kombinaci. V souladu s literárními údaji se u analyzovaných plemen ve FUT 1 vyskytovala alela A s frekvencí 0,15 u MUC4 měla alela A frekvenci 0,725. Nejvyšší hodnoty v obou parametrech vykazovalo plemeno duroc, dále přeštické černostrakaté prase. Procento recesivních homozygotů v genu FUT1 je v průměru ve všech sledovaných souborech 5,28%. Podíl recesivních homozygotů v genu MUC4 je 43,5%. Podíl prasat nesoucích obě recesivní alely byl sledován pouze u plemen duroc 19,3%. Klíčová slova: prasata, selata, FUT1, MUC4, gen, rezistence, kolibakteriózy

My thesis studies variability in FUT1 and MUC4 genes associated with resistance/succeptibility to diseases caused by bacteria E. coli in pigs. Only recessive

5

homozygote are resistant. Resumes knowledge about E. coli bacteria caused diseases of piglets, genetical nature of resistance/succeptibility to ETEC of F18/F4 fimbriotypes. Describes methods of polymorphism detection of FUT1 and MUC4 bialelic point mutation placed on the 6th chromosome (FUT1) and 13th chromosome (MUC4) exact spot of which is a matter of further research. Number of genotypes, allele frequencies, including prediction, recessive homozygote portion in populations of three groups of animals were investigated and compared. According to so far presented studies the allele A in FUT1 displayed freuency 0,15 , in MUC4 0,725. The average frequency of AA recesive genotypes was 5,28% in FUT1 and 43,5% in MUC4. The percentage of homozygote in both FUT1 and MUC4 was 19,3% only visible in Duroc pigs. Key words: pigs, piglets, gene, FUT1, MUC4, resistence, coli-bacteriosis.

6

OBSAH 1. ÚVOD

10

2. CÍL PRÁCE

12

3. LITERÁRNÍ PŘEHLED

13

3.1.

Escherichia coli

13

3.2

Kolibakteriózy prasat

15

3.2.1

Septikemické koliinfekce u novorozených selat (Septicemic E. coli Infection of Newborn Piglets).

3.2.2

15

Enterální (ETEC) koliinfekce u novorozených selat, viz. také ETEC koliinfekce novorozených a mladých sajících selat. (Neonatal Escherichia coli Diarrhea). 16

3.2.3 Enterální koliinfekce selat po odstavu. (PWECD Postweaning Escherichia coli Diarrhea of pigletts and Edema Disease )

17

3.2.3.1 Průjem odstávčat

18

3.2.3.2 Edémová nemoc (Edema Disease, ED)

19

3.2.4 Další emoci prasat způsobené patogenními Escherichia coli

20

3.3

Zdravotní a ekonomický dopad kolibakterióz

20

3.4

Genová podstata odolnosti prasat proti bakteriálním infekcím způsobeným Escherichia coli

22

3.4.1 Polymorfismus genu alfa-(1,2)-fucosytransferázy FUT1 u prasat

23

3.4.2 Polymorfismus mucin 4 genu MUC4 u prasat

24

3.5

26

Metody stanovení polymorfismu v genech FUT1 a MUC4

3.5.1 Genetický polymorfizmus

26

3.5.2

26

Metody detekce polymorfismů v genech

3.5.3 Využití genetických markerů při studiu polymorfizmů u prasat

28

3.5.3.1 Genetické markery

28

3.5.4. Nejčastěji používané postupy při detekci polymorfizmů u prasat

30

3.5.4.1.Stanovení polymorfizmu délky restrikčních fragmentů u produktů PCR – Polymerase Chain Reaction- Restriction Fragments Lenght Polymorphism (PCRRFLP)

31

3.5.4.2 Polyformizmus konformace jednořetězců – Single Strand Conformation Polymorphism, (SSCP)

31

7

3.5.4.3 Denaturační gradientová gelová elektroforéza – Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE)

31

3.5.4.4 Náhodná amplifikace polymorfní DNA – Random Amplified Polzmorphic DNA (RAPD)

32

3.5.4.5 Polymorfizmus délky amplifikovaných fragmentů – Amplified Fragment Lenght Polymorphism (AFLP) známá též jako amplifikace vzácných restikčních míst (IRS-PCR) nebo selektivní amplifikace restrikčních fragmentů DNA podmíněná primerem (SRFA) , (Šmarda, 2005).

32

3.5.4.6 DNA Array, též biočipy, DNA chips, biochips

33

3.5.4.7 Metody na principu přímého sekvencování

33

3.5.4.8 Další metody používané při stanovení genetické variability

33

4. MATERIÁL A METODIKA

34

4.1

Charakteristika sledovaných populací prasat

34

4.2.

Metodika odběru a zpracování vzorků

34

4.2.1 Izolace DNA z krve, spermatu, mléka a dalších tělních tekutin

34

4.2.2. Izolace DNA ze vzorků tkáně

35

4.2.3. Polymerázová řetězová reakce (PCR)

36

4. 2.4 Restrikční analýza (RFLP)

36

4.2.5. Gelová elektroforéza na agarózovém gelu

37

4.2.6 Výsledné genotypy prasat a jejich vztah k rezistenci/ vnímavosti k Escherichia coli

39

4.2.7. Biometrické zpracování

43

5. VÝSLEDKY PRÁCE A DISKUSE

44

5.1

Srovnání frekvecí genotypů a alel mezi farmamou A a farmou B

44

5.2

Srovnání frekvecí genotypů a alel zastoupených plemen-farma A

45

5.3

Srovnání frekvecí genotypů a alel plemenných linií plemene Duoc v rámci farmy B

5.4

47

Srovnání frekvecí genotypů a alel u prasat různých plemen v komerčních chovech

5.5

52

Srovnání frekvecí genotypů a alel u prasat plemene PČP v genové rezervě ČR 53

5.6

Srovnání frekvecí genotypů a alel u prasat plemen LW a L v mateřských chovech v ČR

54

8

5.7

Srovnání frekvecí genotypů a alel u prasat plemen PN a D v otcovských chovech v ČR

55

6. ZÁVĚR

59

7. SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY

61

8. SEZNAM TABULEK

63

9

1. ÚVOD Nemoci prasat zapříčiňují mnohem větší škody v chovu prasat, než chybné technologie, výživa či špatně zvolené a prováděné směry šlechtění. Z tohoto důvodu je nezbytně nutno zaměřit pozornost především na prevenci vzniku chorob a tedy na podmínky či okolnosti, za kterých nemoci propukají. Nezanedbatelný vliv na příčiny vzniku onemocnění má mimo jiné také genetická výbava jedince. Mutace v průběh fylogeneze daly vzniknout genové variabilitě v genech nesoucích informaci mimo jiné o vnímavosti nebo naopak odolnosti k určitému infekčnímu agens. Výrazné ekonomické ztráty u selat v období po porodu a odstavu způsobuje vedle jiných bakterie Escherichia coli. Onemocnění vyvolávají tzv. enterotoxigenní kmeny E. coli (ETEC) vybavené specifickými kolonizačními faktory, zpravidla typu F18 a F4. Vlastní onemocnění se projevuje jako septická koliinfekce novorozených selat respektive enterální koliinfekce novorozených selat s charakteristickou apatií až somnolencí, diarea vedoucí k dehydrataci a exitu. Onemocnění zejména projeví-li se v prvním dnu po narození bývá provázeno vysokou mortalitou. Selata v době po odstavu musejí zvládat infekce tvorbou vlastních protilátek poté, co se přerušil přísun gamaglobulinů v mateřském mléce a zejména v kolostru. U selat v době po odstavu mají koliinfekce obraz enterální koliinfekce selat po odstavu ve formě diarrhoické nebo edémové nemoci, případně jejich kombinace. První z nich charakterizuje těžký profůzní průjem, druhou rychlé úhyny selat ve zdánlivě dobrém výživném stavu, inapetence, diskoordinace, ataxie a paralýzy. PA nález ukáže otoky podkoží a ascites v tělních dutinách. Mortalita je rovněž vysoká 50-90%. Organismus vnímavých jedinců, je-li vybaven genetickou informací pro tvorbu receptorů kompatibilních zmíněným kolonizačním faktorům reaguje při styku s původcem propuknutím nemoci. Vnímavost k ETEC u selat určují geny FUT1 a MUC4 umístěné na prasečím chromozomu 6 a 13. Resistence je vázána v obou případech na recesivní alely zmíněných genů. Využití genetiky při šlechtění prasat umožňuje selekci s využitím genetických markerů (Marker Assisted Selection) jako doplněk k tradičním selekčním metodám. Principem je zjišťování genetické vazby mezi markery-většinou mikrosatelity a fenotypovými hodnotami sledovaných vlastností. Mikrosatelity jsou krátké opakující se

10

sekvence vykazující variabilitu. Vlastní detekce polymorfismů se provádí s využitím PCR

(Polymerase

Chain

Reaction),

RFLP

(Restriction

Fragments

Lenght

Polymorphysm) a následným Southernovým přenosem (Southern Blott). Rizikem MAS může být blízkost či vazba selektovaného genu s jiným ekonomicky významným lokusem. Může tak docházet k současnému zvýšení frekvence žádané alely jednoho ETL a nežádoucí alely jiného ETL. V poslední době se pozornost výzkumu ETL (Economical Trait Loci) rozšiřuje od primárně produkčních vlastností zvířat, jako jsou např. výška hřbetního tuku, kvantita a kvalita osvalení nebo odolnost vůči stresu rovněž na odolnost proti infekčním chorobám. Selekce zvířat na tento typ vlastností slibuje přinést nemalé úspory na veterinární prevenci, profylaxi a léčbu, minimalizaci ztrát brakacemi, odchov v daném případě většího počtu selat a tím zvýšení rentability a konkurenceschopnosti. Počet odchovaných selat od prasnice za rok je jedním z nejdůležitějších ekonomických ukazatelů rozhodujícím o úspěchu či neúspěchu farmy. Prasata se oproti jiným hospodářským zvířatům vyznačují vysokou plodností-až 15 selat ve vrhu, 2,4 vrhu za rok na prasnici, krátkou dobou výkrmu a rychlou intenzitou růstu. Tyto vlastnosti zakládají předpoklad pro úspěšný odchov cca 25 selat na prasnici a rok. Producenti vepřového masa v ČR musejí vzhledem k poklesu produkce a rentability výroby zejména po vstupu ČR do EU hledat všechny cesty, jak snížit náklady na výrobu 1 kg masa. Ty podle prezidenta Agrární komory Jana Veleby překračovaly v roce 2007 o 5 korun následný zisk z prodeje. V roce 2007 podle údajů ČSÚ bylo v ČR vyrobeno 340.863 tun vepřového masa. Oproti roku 2006 to byl nárůst o 2,4%, který však zapříčinila likvidace řady chovů a snížení stavu prasnic. Chov prasat v podmínkách ČR má svá specifika. Riziky jsou neexistence společné produkčněodbytové politiky, špatná provázanost výzkumu s praxí a nedostatečná informovanost chovatelů ve vztahu k moderním poznatkům vědy. Stále neumíme plně využít genetického potenciálu chovaných zvířat, navíc v mnoha chovech často panují nepřijatelné zoohygienické podmínky. Rezervy jsou rovněž ve výživě zvířat a zajištění optimálních chovných podmínek a wellfare.

11

2. CÍL PRÁCE Cílem této práce je: •

Zpracovat literární rešerši k polymorfismu genů FUT1 a MUC4 a metodám jejich stanovení

•

Pojednat zdravotní dopad E. coli na odchov selat

•

Seznámit se s molekulárně genetickou diagnostikou mutací daných genů v LAMGenu

•

Vyhodnotit diference ve frekvencích alel a genotypů ve vybraných populacích prasat: 1. Soubor kanců v nejmenované SOSK – Farma A 2. Soubor prasnic plemene duroc – Farma B 3. Soubor prasnic plemene české bílé ušlechtilé, prasat komerčních chovů, PČP, mateřské a otcovské chovy ČR

Určit jednotlivé alelové frekvence, porovnat s normálním rozložením, provést srovnání uvedených populací.

12

3. LITERÁRNÍ PŘEHLED 3.1 Escherichia coli

Obr.1 Escherichia coli E. coli jsou gram-negativní, nesporulující tyčinky, dosahující délky 2-6 mikrometrů, v průměru 1 mikrometr. Naleží do čeledi Enterobacteriaceae. Většina kmenů je vybavena pouzdrem (kapsula) a peritrichními bičíky (flagella), podmiňujícími jejich pohyblivost v tekutém prostředí. U četných kmenů lze elektronovým mikroskopem prokázat povrchové filamentózní struktury ve formě pili a fimbrií, které se uplatňují při konjugaci nebo v adhezi k substrátům, tzv. adhezivní a kolonizační faktory (Dražan et al., 1987). Kromě adhezinů se jako faktory virulence uplatňují také enterotoxiny. V patogenezi enterálních koliinfekcí velmi často spolupůsobí několik různých typů fimbrií i toxinů (Drábek a Dubanský, 2001). Z možných principů

13

rozdělení druhu do sérotypů nejlépe vyhovuje členění podle zmíněných faktorů virulence –antigenů somatických O, kapsulárních K, flagelárních H a fimbriálních F (Barbara.E.Straw et al., 2006).

Tab.č.1 Antigeny baktérií Escherichia coli (Dražan et al., 1987): Antigen

Somatický

Kapsulární

Flagelární

Fimbriový Enterotoxin termolabiln í Enterotoxin termostabil ní Vázotoxin

Symb ol

Lokalizace

Podstata

polysacharid buněčná stěna S- neutrální O, R forem, b. stěna nebo kyselý. R- a S- forem R je oligosacharid povrch polysacharid K bakteriální kyselý buňky povrch bakteriální protein H buňky u pohyblivých kmenů

Termická inaktivace

Účast v patogenitě

rezistentní

netoxická součást endotoxinu

60-120 °C

u některých odolnost ke komplementu

100°C

Počet typů v r. 1984 O 170, R5

?

103

56

F

povrch bakteriální buňky, někdy překryt K

protein

60°C

adheze ke sliznicím

12

LT

vylučován do prostředí

protein m.h. 91 000

85°C

aktivace adenylcyklázy

1

ST


protein m.h. 2000

rezistentní

aktivace guanylcyklázy

2

EDP


protein m.h. 50 000-100 000

100°C

poškození krevních kapilár

1

Barbara.E.Straw et al. (2006) uvádí, že v posledních několika letech byl zaveden pojem „patotyp“, identifikující kmeny E. coli na základě mechanismu jejich virulence. Tento pojem jako první zavedl Gyles and Fairbrother v r. 2004. Uvádí patotypy ETEC – enterotoxinogenní, EDEC kmeny vyvolávající edémovou nemoc a AEEC (Attaching and Effacing) E. coli zahrnující enterohaemorrhagickou EHEC a enteropatogenickou EPEC formu. Příčinou patogenity patotypů ETEC jsou exotoxiny spouštějící sekreci tekutin do lumina střevního. U typu EDEC způsobují systémové onemocnění. Buněčná stěna 14

většiny kmenů E. coli je obdána rovněž endotoxiny, které se však uplatňují pouze u extraintestinálních infekcí – septikémie, mastitida, infekce urologického traktu (Barbara.E.Straw et al., 2006).

3.2 Kolibakteriózy prasat Klasifikace kolibakterióz se v detailech liší, Barbara.E.Straw et al. (2006) rozeznává tři základní nozologické jednotky: neonatální průjem, průjem sajících selat a průjem selat po odstavu. Kritériem je především období života selat, ve kterém se onemocnění projevují. Escherichia coli hraje zásadní roli u neonatálního průjmu, tj. v období několika dní post partem a diarea selat po odstavu. Diarea sajících selat v období od prvního týdne do odstavu je zapříčiněna více agens, včetně gastrovirů, rotavirů i kokcidií (Biehl and Hoefling, 1986). Drábek a Dubanský (2001) uvádějí shodně s Dražanem et al. (1987) navíc septikemickou diareu novorozených selat, postihujícící selata do 4 dnů věku.

3.2.1

Septikemické koliinfekce u novorozených selat (Septicemic E. coli Infection of Newborn Piglets).

Etiologie Vyskytuje se ojediněle u novorozených selat. Jde o horečnaté, zpravidla fatální onemocnění, někdy provázené průjmy. Uplatňují se zde invazivní kmeny E. coli bez tvorby toxínů. Jsou komplement rezistentní, schopné vázat Fe prostřednictvím sideroforu enterochelinu (Dražan et al., 1987). Faktory virulence jsou zastoupeny především fimbriemi, kapsulárními polysacharidy, O-antigeny, lipopolysacharidy a hemolyziny. Převažují serotypy O9, O20 a s převahou tzv. netypovatelných kmenů. Obraz onemocnění je převažující gastroinestinální nebo respirační porucha, případně umbilikální infekce. Průběh perakutní, subakutní. E. coli zasahuje v důsledku zvýšené permeability stěny střevní p.partem řadu vnitřních orgánů včetně mozku. Rozvíjí se nervové příznaky – inkoordinace, parézy, paralýzy, prostrace (neschopnost udržet vzpřímenou polohu), plovací pohyby, tonicko-klonické křeče. Rizikovou skupinou jsou bezkolostrální selata hypo- respektive selata agamaglobulinemická (Drábek a Dubanský, 2001).

15

3.2.2

Enterální (ETEC) koliinfekce u novorozených selat, viz. také ETEC koliinfekce novorozených a mladých sajících selat. (Neonatal Escherichia coli Diarrhea).

Etiologie Enterální koliinfekce se vyskytuje nejčastěji u selat ve věku 0-4 dny. Kmeny ze skupiny ETEC vyvolávající onemocnění tvoří jeden nebo více fimbriálních adhezinů F4 (K88), F5 (K99), F6 (987P) a F41 (Barbara.E.Straw et al., 2006). Označení kmenů v závorkách vychází z chybného předpokladu, že jde o antigeny kapsulární, případně berou jako specifikum proteinovou povahu. Tento pohled je v současnosti již překonán (Drábek a Dubanský, 2001). Vyjmenované kmeny kolonizují lumen tenkého střeva a produkují jeden nebo více enterotoxinů – termostabilní STa (STI), STb (STII), EAST1 nebo termolabilní LT. Donedávna patřily k nejčastějším serotypům spojovaným s enterální koliinfekcí novorozených selat O149, O8, O147 a O157, F4 pozitivní s produkcí LT a STb, jak uvádějí Harel et al. (1991) a jiní citováni Barbarou E.Straw et al., 2006). Ta upozorňuje na posun k serotypům O9, O64 a O101 s F5, F6 a (nebo) F41 pozitivitou a převažující produkcí enterotoxinu STa. Epizootologie Výskyt onemocnění je výslednicí spolupůsobení faktorů prostředí, infekčního agens a jistými hostitelskými faktory. Sele při porodu se cestou ke struku setkává s těžce kontaminovaným prostředím na těle matky a prostředím porodny. Rizikové jsou nízká úroveň imunizace matky a tím nízký titr mateřských protilátek, stejně jako nedostupost kolostra obecně (Barbara.E.Straw et al., 2006). Vyšší výskyt onemocnění je spojován s nízkými teplotami na porodnách jež vedou k zpomalení pasáže střevní a delší expozici (Drábek a Dubanský, 2001). K nákazám před zavedením imunoprofylaxe docházelo v chovech enzooticky, delším stykem prasnic s infekčním agens docházelo k přirozené imunizaci stáda, po zavlečení nového sérotypu docházelo ve vlnách k novému vypuknutí nákaz (Drábek a Dubanský, 2001). Patogeneze Sliznice střevní zdravých selat je osídlena četnými bakteriálními druhy s převahou Laktobacilů. Fyziologicky jsou zastoupeny zejména v jejunu a kaudální části tenkého střeva také různé sérotypy E. coli. V případě propuknutí onemocnění převládne jeden sérotyp ETEC a dojde současně k enormnímu nárustu početnosti o cca 3 řády. Prostřednictvím adhezivních faktorů vytvářejí ETEC na povrchu střevním souvislý 16

povlak. Zástupci ETEC jsou převážně neinvazivní, zůstávají na povrchu sliznice. Mechanismem působení je zvýšení sekrece do lumina střeva a snížená resorbce iontů, obé vedoucí k profůzním průjmům. Hrozí dehydratace a úhyn (Dražan et al., 1987). Dražan et al. (1987) uvádí experimentální výskyt enteroinvazivních kmenů ETEC, které destruují mikroklky enterocytů resultující v malabsorbci v důsledku vilózní atrofie. Drábek a Dubanský (2001) a řada dalších autorů v devadesátých letech označují tuto specifickou skupinu ETEC jako AEEC (Attaching and Effacing E. coli). Tyto dle B.E.Straw (2006) mohou, ale nemusí být asociovány s tzv. Eae-genem, o kterém se předpokládalo, že kóduje syntézu intiminu, proteinu zodpovědného za destrukci mikroklků. AEEC netvoří enterotoxiny ani typické adheziny (Drábek a Dubanský, 2001). Klinické příznaky Charakteritické jsou somnolence, kachexie, dehydratace, průjem, zimomřivost, zježení srsti, svěšený ocásek, někdy i vomitus. Teplota zvýšená, ante finem snížená. Úhyny částé, hlavně pokud onemocní selata v prvních dnech života, někdy bez příznaků. Řídce tekutý, nažloutlý někdy vločkující trus (Dražan et al., 1987). Vážnost průběhu je dána faktory virulence, věkem selat a úrovní jejih imunitní výbavy. Mortalita starších selat do odstavu bývá prokazatelně nižší (Barbara.E.Straw et al., 2006). Patologicko-anatomický nález Zevně uvádí Dražan et al. (1987) nápadná vyhublost, cyanóza boltců, zapadlé bulby, znečištění výkaly. Při sekci nález nespecifický, dilatovaný žaludek se zbytky nestráveného sraženého mléka, dilatace tenkého střeva, překrvení stěny střevní (Barbara.E.Straw et al., 2006). V případě subakutního průběhu ztluštění střevní stěny (Drábek a Dubanský, 2001). Histologický obraz závisí na typu manifestního kmene E. coli, u ETEC F4 pozitivních izolátů bakteriální povlaky na sliznici tenkého střeva jejuna a ilea, u ostatních ETEC izolátů zadního jejuna a/nebo ilea. U prasat infikovaných AEEC izoláty degenerativní změny kartáčového lemu enterocytů s mírně až středně vyjádřeným zánětem lamina propria hlavně v ileu (Helie et al. (1990), citace Barbara.E.Straw et al., 2006).

17

3.2.3 Enterální koliinfekce selat po odstavu. (PWECD Postweaning Escherichia coli Diarrhea of pigletts and Edema Disease ), viz. také Stresové onemocnění prasat po odstavu. Průjem odstávčat (PWECD) a edémová nemoc (ED) jsou spojovány vzhledem k tomu, že se objevují u selat stejného věku – v období prvních dvou týdnů po odstavu (Dražan et al., 1987), shodují se i faktory virulence a některé kmeny E. coli způsobují obě onemocnění. Tyto se mohou projevovat také samostaně (Barbara.E.Straw et al., 2006). Dražan et al. (1987) rozlišuje 3 nozologické jednotky: 3.2.3.1 Průjem odstávčat Etiologie Průjem odstávčat je spojovaný s enterotoxigenními kmeny E. coli (ETEC), vybavenými kolonizačními fakory (nověji faktory virulence, Drábek a Dubanský, 2001) F4 (starší autoři K88) a schopností produkovat enterotoxíny analogicky koliinfekcím novorozených selat. Průjem odstávčat se manifestuje těžkými průjmy s následnou dehydratací. Uplatňují se sérotypy O 139 produkující fimbriální variantu F18ac a především O149 s produkcí fimbrií typu F4ac (Barbara.E.Straw et al., 2006). Nejnovější poznatky ukazují, že kromě tradičních původců průjmových koliinfekcí selat po odstavu ETEC se uplatňují skupiny enteropatogenní EPEC a enterohemoragické EHEC vykazující výrazný „attaching-efacing“ efekt (B.E.Straw et al. 2006 tyto skupiny sdružuje pod označením AEEC) a konečně enteroagregativní EAggEC. Efektem vyjmenovaných skupin je destrukce povrchu sliznice střevní různého rozsahu spojená s tvorbou „Shiga-like“ toxínů. EAggEC tvoří termostabilní enterotoxin 1 (EAST1). Z uvedeného mimojiné vyplývá snadný mezidruhový přenos infekce včetně člověka, složitější způsoby ochrany s vlivem epizootologické situace konkrétní oblasti (Drábek a Dubanský, 2001). Epizootologie Výskyt v chovech enzootický, 4.-14. den po odstavu. Morbidita až 80%, mortalita 5% (Dražan et al., 1987). Drábek a Dubanský (2001) doplňují údaj o průměrné morbiditě na 30-40%, mortalitu předpokládají vyšší – až 26%, šíření nákupem infekčních plemenných zvířat.

18

Patogeneze V rozvoji onemocnění se uplatňují faktory kolonizace tenkého střeva a

následný

průjem. U kombinací průjmu ostávčat s edmovou nemocí navíc faktor enterotoxémie (Barbara.E.Straw et al., 2006). Kmeny vyvolávající průjem odstávčat produkují hemolyzín, zatímco koliflóra GIT selat v období před odstavem a krátce po odstavu je typicky nehemolytická (Dražan et al., 1987). Právě v období této změny dochází k rozvoji nemoci Drábek a Dubanský (2001). Kolonizace a přemnožení hemolytických kmenů vede k produkci exotoxínů – enterotoxínů s analogickým mechanismem vzniku průjmů jak bylo popsáno u neonatální diarei (Barbara.E.Straw et al., 2006). Klinické příznaky Profúzní průjem 3-5 dní (Drábek a Dubanský, 2001), zapáchající nažloutlé feces, teplota nezvýšená, příjem krmiva beze změn, žíznivost (Dražan et al., 1987). Cyanózy, diskoordinace, ataxie. Nejčastější úhyny 6.-10. den (Drábek a Dubanský, 2001). Patologicko-anatomický nález Nespecifický, dehydratace, zapadlé oční bulby (Dražan et al., 1987). U infekcí smíšené etiologie se spoluúčastí AEEC respektive EPEC, EHEC a EAggEC kmenů je histologický obraz charakterizován různým stupněm postižení sliznice tenkého střeva, petechie, nastříknuté cévy, krváceniny, eroze kartáčového lemu ve smyslu „attachingafacing“ změn (Drábek a Dubanský, 2001).

3.2.3.2 Edémová nemoc (Edema Disease, ED) Etiologie Edémovou nemoc vyvolávají sérotypy O138, O139 a O141 charakterizované fimbriálním typem F18ab a produkcí „Shiga-like“ (SLT) toxinu Stx2e, někdy také adhezinu učastnícího se difusní adherence (AIDA) (Barbara.E.Straw et al., 2006). Drábek a Dubanský (2001) zmiňují také kmen O157, tento je zmiňován v souvislosti s přenosem na člověka jako jeden z nejdůležitějších patogenů v produkci a nakládáním s potravinam. Zúčastněné kmeny E.coli neprodukují ST a LT enterotoxiny, s vyjímkou kombinované formy onemocnění (Dražan et al., 1987). Podle Drábka a Dubanského (2001) toto platí pouze za předpokladu, že edémová nemoc by byla způsobena verotoxigenními kmeny E. coli (VTEC), ve skutečnosti se na vzniku onemocnění podílí také ETEC kmeny, EAggEC kmeny a EHEC kmeny s produkcí variant LT i ST toxínů, termostabilního toxínu EAST1 i „Shiga-like“ toxínů jinde označovaných jako verotoxíny (Drábek a Dubanský, 2001). 19

Epizootologie Edémová nemoc postihuje odstavená selata 7.-10. den po odstavu (4.-14. den podle Dražan et al., 1987), úhyny za 24-48 hodin od objevení klinických příznaků. Morbidita kolem 16% (Dražan et al. 1987 uvádí 30-40% nemocných selat ve vrhu), mortalita až 64%. Nejvyšší je u selat v nejlepším výživném stavu (Drábek a Dubanský, 2001). Patogeneze Dražan et al.(1987) uvádí tři různé hypotézy o mchanismu vzniku edémové nemoci: •

Edémovou nemoc může způsobovat speciický toxin označovaný jako: vázotoxin, neurotoxin, angiotoxin nebo Edema Disease Principle.

•

Edémová nemoc vzniká v důsledku vstřebání endotoxinu E. coli, tedy endotoxémie

•

Edémová nemoc je hypersenzitivní odpovědí imunitního systému selat na specifické antigeny E. coli Drábek a Dubanský (2001) a zejména Barbara.E.Straw et al. (2006) potvrzují první

hypotézu s upřesněním, že na vzniku edémové nemoci selat se mohou podílet vedle VTEC také EHEC, EAggEC kmeny. V případě současného uplatnění ETEC kmenů může onemocnění probíhat jako kombinace průjmové kolitidy odstávčat a edémové nemoci. Podstatnou roli na vzniku edémů má „Shiga-like“ toxin Stx2e, způsobující degenerativní angiopatie arterií a arteriol, tím mírné zvýšení permeability stěn a edematosnízměny v řadě tkání a orgánů. Klinické příznaky Onemocnění se zpravidla projeví náhlým úhynem skupiny selat bez jakýchkoli příznaků. Klinické příznaky u dalších se vyvíjí postupně (Dražan et al., 1987). U lehčích forem pozorovatelné otoky víček, nosu. Změny na hlasivkách resultují ve změně hlasových projevů. Pohyblivost zcela zachována. Těžší formy charakterizují diskoordinace, poruchy pohybu, inapetence, parézy a paralýzy. Selata hynou do 24 hodin se zrychleným charakteristicky chraplavým dechem. S vyjímkou kombinovaných forem nemoci je typická obstipace (Drábek a Dubanský, 2001). Patologicko-anatomický nález Kůže uhynulých selat bývá bledá, výživný stav dobrý, možný podkožní edém. Žaludek naplněn nestrávenou potravou, naopak tenké střevo bývá prázdné. V oblasti kardie viditelné edémy submukózy. Mezenteriální mízní uzliny jsou oteklé a překrvené. Na perikardu, pleuře a mezentériu serózní exudát a fibrinová vlákna (Barbara.E.Straw et al., 2006). Dražan et al. (1987) popisuje hyperemickou sliznici petechie na sliznici 20

žaludku v kontrastu s Drábkem a Dubanským (2001), kteří uvádějí obraz anemické sliznice žaludku. V histologickém obrazu převládá angiopatie malých arteií a arteriol (nezjistitelné u akutních a subakutních případů, Dražan et al. 1987), v případě uplatnění EHEC na střevní sliznici typické detruktivní „attaching-efacing“ změny (Drábek a Dubanský, 2001).

3.2.4 Další nemoci prasat způsobené patogenními Escherichia coli Pro doplnění Barbara.E.Straw et al., (2006) uvádějí jako další onemocnění vyvolaná již popsano neonatální septikémii selat, koliformní mastitidy kojících prasnic a kliinfekce urogenitálního tratu.

3.3 Zdravotní a ekonomický dopad kolibakterióz Escherichia coli je běžnou součástí střevní mikroflóry člověka a teplokrevných zvířat. Patří mezi významné indikátory fekálního znečištění a špatné úrovně hygieny a sanitace. Je však také významným patogenním mikroorganismem, způsobujícím závažná onemocnění po konzumaci kontaminovaných potravin. V současné době je rozlišováno šest skupin patogenních E. coli, z nichž mezi nejrizikovější patří enterohemoragické kmeny E. coli (EHEC), reprezentované především sérotypy O157, O26, O45, O111. Typickým příznakem onemocnění je nekrvavý vodnatý průjem, který často přechází v těžkou hemoragickou kolitidu. Život ohrožujícími stavy jsou komplikace

v

podobě

hemolyticko-uremického

syndromu

či

trombotická

trombocytopenická purpura (Cupáková, 2001). Přenos nákazy vyvolané E. coli se děje především fekálně orální cestou, špinavýma rukama nebo kontaminovanými potravinami či vodou. Výskyt tohoto akutního průjmového onemocnění se ročně pohybuje mezi 2 –3 tisíci hlášených případů a trend výskytu je po mnoho let neměnný. Vyšší výskyt infekce pozorujeme v letních měsících. Výskyt serovaru O157 : H7, který patří k enterohemorragickému typu E. coli, je v ČR doposud velmi nízký. Jeho počet v roce 2003 činil 35 případů. Epidemiologický význam akutního průjmového bakteriálního onemocnění je dán především serotypy E. coli produkujícími verotoxiny (shigatoxiny) (Drápal et al., 2005). Bernardy (2008) komentuje současné náklady producentů vepřového za veterinární péči. Popisuje podnik s asi 500kusy prasnic. Porodna, předvýkrm i výkrm

21

jsou v jednom objektu, praktikován je turnusový odstav, v halách z konce 70.let. Způsob ventilace a kapacita neodpovídají současným potřebám, podlahu kryjí kovové lamely, příliš úzké, aby na nich prasata mohla svými úzkými spárky pohodlně stát. Prasnice se střídají na porodně ve skupině 35 zvířat a na to navazuje turnusově provozované ustájení selat v předvýkrmu a výkrmu. úhyn selat na porodně byl běžně do 10

%,

nejčastější

příčinou

ztrát

bylo

zalehnutí

nebo

průjem.

V posledních několika měsících se však zvyšuje podíl málo životných selat, vyšší je počet zalehnutých selat a také průjmy sajících selat. Podíl úhynů v předvýkrmu je okolo 12 až 15 %, někdy dosahuje 20 %. Prasnice se vakcinují před porodem proti průjmovým onemocněním selat, způsobovaným E. coli. účty za léčbu pohybují někdy přes 150 000 Kč měsíčně, běžně 120.000 až 130.000Kč,výjimečně pod 100.000Kč. Náklady na léčiva a veterináře se však do celkové výkupní ceny za kilogram promítají podílem nejvýše tří korun, obvykle v rozmezí 3 až 5%. Výdaje za léčiva přesto zatěžují celkový rozpočet, prosperitu a především cash flow podniku.

3.4 Genová podstata odolnosti prasat proti bakteriálním infekcím způsobeným Escherichia coli Selekce na odolnost vůči chorobám je na rozdíl od selekce na produktivní vlastnosti výrazně náročnější výzvou; přesto se v posledních letech výzkumu rezistence k onemocněním prasat věnuje stále více pozornosti (Barbara.E.Straw et al., 2006). Již Dražan et al. (1987) připouští možnost, že vnímavost selat k E. coli mohou ovlivňovat genetické faktory, když popisuje existenci dvou fenotypů prasat s rozdílnou vnímavostí k infekci ETEC s kolonizačním faktorem F88 (dnes označovaném F4). O dvacet let později Barbara.E.Straw et al. (2006) uvádí, že rezistence vůči E. coli vybaveným faktory virulence povahy adhezinu F18 je řízena genem alfa(1,2) fucosyltranferázy FUT1 kódujícím informaci pro vytvoření příslušného receptoru pro uchycení antigenu baktérie na sliznici střevní. Lokalizace genu FUT1 je na prasečím 6. chromozómu. E. coli fimbriálního typu F18 se uplatňuje jako jeden z hlavních původců průjmu odstávčat (Post Weaning E. coli Diarrhea). Obdobně vnímavost nebo rezistenci prasat k E. coli fimbriálního typu F4 (K88), které jsou spojovány převážně s enterálními koliinfekcemi novorozených selat, určuje dle Barbary.E.Straw et al. (2006) zatím formálně nedefinovaný lokus F4R na 13.

22

chromozómu zodpovědný za přítomnost nebo absenci receptorů pro vazbu bakteriálních vazebných struktur. Filistowicz and Jaszek (2006) v citaci Cirera et al.(2004) uvádějí, že F4R lokus lze považovat za podobný (takřka shodný) s lokusem MUC4, který je v silné vazbě s lokusy F4abR a F4acR (K88abR, K88acR), a tak použít alel A a B genu MUC4 pro vyšetření vnímavosti prasat k infekcím způsobovaným kmeny E. coli fimbriálního typu F4 (K88).

3.4.1 Polymorfismus genu alfa-(1,2)-fucosytransferázy FUT1 u prasat Vnímavost prasat k E. coli s fimbriemi typu F18 je v oblasti genů spojovaných s rezistencí k chorobám

ojedinělým případem monogenní mendelistické dědičnosti.

Exprese E. coli F18 receptorů na sliznici tenkého střeva prasete řídí dominantní alela G. Umožňuje

alfa-(1,2)-fukosylaci

glykolypidových

a

glykoproteinových

struktur

akceptorů a účastní se vzniku krevněskupinových antigenních struktur umožňujících adherenci bakterií na buněčné membrány enterocytů (Barbara.E.Straw et al., 2006). Coddens (2007) studoval korelaci F18 E. coli adherence a výskytu krevněskupinových antigenních struktur H-2 HBGAs a A-2 HBGAs. Na souboru prasat zjistil pozitivní korelaci výskytu dominantní, adherenci kódující alely lokusu FUT1 s krevním typem A-2 HBGAs . Zpomalení pasáže v důsledku adheze bakterií na stěnu střevní podporuje rozvoj onemocnění (Drábek a Dubanský, 2001). Gen FUT1 je v těsné genetické vazbě s krevněskupinovým lokusem S(A-0) na prasečím chromozómu 6, a tedy i s genem RYR1 kontrolujícím náchylnost vůči stresu. Selekce na zvýšenou rezistenci vůči F18 E. coli může v důsledku vazebné nerovnováhy zvyšovat frekvenci alely HALn a naopak (Čepica, 2007). Coddens (2008) vyvrací tuto obavu a selekci na rezistenci vůči F18 E. coli naopak doporučuje jako perspektivní. Na základě pokusu na 131 náhodně vybraných belgických hybridech prověřoval genetickou vazbu FUT1 a RYR1. Vazbová nerovnováha sledovaných genů byla prokazatelně blízká nule. Znamená to, že alely FUT(A) a RYR(n) nejsou ve vzájemné vazbě. Přesto studie provedená Filistowiczem and Jasekem (2002) ukazuje na možné negativní korelace selektovaných vloh pro rezistenci k E. coli a produkčních vlastností plodnosti a počtu odchovaných selat. Výsledkem jejich práce provedené na souboru 92 prasnic je závěr, že zatímco genotypy FUT1 neměly na sledované parametry užitkovosti

23

signifikantní vliv, vnímavost nesoucí genotypy AB a BB lokusu MUC4 se projevily zejména ve druhém a třetím vrhu pozitivně. San et al. (2003) popisuje vliv F18 rezistentní alely lokusu FUT1 na jiné produkční znaky – průměrný denní přírůstek, konverzi živin, výšku hřbetního tuku a věk dosaření porážkové hmotnosti 110kg. Provedl studii na 375 kancích plemen duroc, landrasse a yorkshire. Recesivní rezistentní alela AA měla negativní korelaci s výškou hřbetního tuku, ostatní produkční ukazatele nevykazovaly žádnou závislost. Příčinou varibility v genu FUT1 je jeho bodová mutace na pozici 307. páru bazí (Meierink et al., 1997) G307A, tj. záměna guaninu (M307G) tvořícího kodon pro alanin za adenin (M307A), čímž vzniká kodon

řadící alternativně threonin.

E coli F18

rezistentní je genotyp nesoucí obě alely A, kódující threonin, recesivní M307AA homozygot. Genotypy M307GG i M307GA jsou vnímaví (Barbara.E.Straw et al., 2006). Na základě studie provedené na 21 plemenech prasat zahrnujících komerčně využívaná plemena prasat evropských, čínských a jednoho evropského divokého bylo prokázáno, že mutace M307AA se vyskytuje pouze u plemen evropských, konkrétně plemen Duroc a Yorkshire, Lingao a hybridů. U prasete divokého a ostatních čínských plemen byly prokázány výhradně alely M307GG. Lze tak předpokládat původ mutace od evropského prasete Sus Crofa L. (Wu et al., 2007).

Tab.č.2 Převažující sérotypy E. coli u fatálních případů průjmových onemocnění selat po odstavu a edémové choroby ve švýcarských chovech prasat ( Imberechts et al., 1994): Sérotyp O139:K12:H1 O141ab:H4 O149:K91:H10

Kolonizační faktory F18ab F18ac F4ac

Enterotoxiny SLT-IIe SLT-IIe, LT, STII LT, STII

Drábek a Dubanský (2001) popisují kmeny, které se účastní na vzniku průjmových kolibakterióz selat po odstavu v dánských chovech podle Ojeniyi et al. (1994). Největší počet kmenů – 41% vyvolávajících onemocnění odstávčat tvoří adheziny F18. Menší izolovaných kmenů - 28% tvoří adhezin F4 (K88). Nezanedbatelný počet kmenů E. coli – 24% žádný adhezin netvoří.

3.4.2 Polymorfismus mucin 4 genu MUC4 u prasat

24

MUC4 (respektive kandidátní lokus F4bcR podle Barbara.E.Straw et al., (2006), Filistowicz and Jaszek (2006) v citaci Cirera et al.(2004) však oba termíny ztotožňují) řídí tvorbu receptorů pro vazbu klonizačních faktorů ETEC (Drábek a Dubanský, 2001). Receptory se tvoří ve třech antigenních variantách: 4ab, 4ac a 4ad. Gen MUC4 (respektive F4bcR) je spojován s variantami 4ab a 4ac. Umístění genu MUC4 je na 13. chromozómu, dědičnost je mendelistická, obdobně jako FUT1, vnímavost k ETEC fimbriálního typu F4 je vázána na dominantní alelu S. Pouze recesivní homozygot ss je ETEC F4 resistentní (Barbara.E.Straw et al., 2006). U ETEC kmenů izolovaných odnovorozených a starších sajících selat jsou nejdůležitější čtyři adheziny: F4(K88), F5(K99), F6(987P) a F41, přičemž mnoho izolovaných kmenů ETEC tvoří simultánně několik různých fimbriálních adhezinů. Některá selata nemají receptory pro F4(K88) fimbrie a jsou proti F4 pozitivním fimbriím rezistentní. Až donedávna převažovaly u průjmů sajících selat tzv. klasické séroskupiny O149, O8, O157 a O147 jejichž hlavním adhezinem je F4(K88), v období 1996-2001 se stále častěji izolovaly séroskupiny O8, O9, O64 a O101 s adheziny F5(K99), F6, (987P) a F41 s převažující produkcí STa (STI). Posum je k vyšší incidenci u selat ve věku 0-6 dní post partem . V případě spoluúčasti kmenů VTEC, EHEC a EPEC není selekce proti vnímavosti k F4 ani F18 řešením, až 92% kmenů nemusí tvořit žádný adhezin. Šlechtění na vyšší odolnost selat proti F4 pozitivním ETEC naopak podporuje fakt, že vakcinační postupy se doposud jevily málo účinnými, když na rozdíl od F18 kolonizačních faktorů adheziny F4 nejsou dostatečně imunogenní (Drábek a Dubanský, 2001). Jörgnsen et al. (2003) cituje Edfors-Lilja et al. (1995), kteří první určili pozici lokusu pro receptor F4ab/F4ac na 13. chromozóm prasete (SSC13) a upřesňuje lokalizaci mezi mikrosatelitní markery Sw207 a Sw225. S použitím PCR a FISH in situ hybridizace dále upřesňuje polohu na SSC13q41-->q44 interval. Zhang et al. (2008) přináší do lokalizace lokusu pro vnímavost/rezistenci k F4 kolonizačním faktorům novou informaci. Připisuje lokusu SSC13q41 kandidátní gen MUC13 pro ETEC F4ab/ac receptor (Wang et al. (2007) tento lokus označuje jako lokus TFRC pro transferrin receptor, nalézá dva exonové polymorfismy, vyšetřuje okolí exonů a určuje v intronové sousední části SNP polymorfismus na pozici 291 C>T. Dalším šetřením uzavírá,že nejde o příčinnou mutaci, ale o polymorfismus s výraznou vazbou k rezistenci/vnímavosti zejména F4ac ETEC. Gen pro tranferrin receptor a tři 25

další kandidátní geny vyšetřoval Python et al. (2005), ten zmíněný polymorfismus na pozici 291 nenalezl. Vysvětluje ale proč se při počtu tří fimbriálních typů F4ab, F4ac a F4ad objevuje jen šest fenotypových variant. Chybějící dva fenotypy F4abR/F4acR+/F4adR+ a F4abR-/F4acR+/F4adR- ukazují, že selata vnímavá k F4ac jsou vždy vnímavá také k F4ab. Popisuje také tzv. slabé a silné F4 receptory). Na základě studie provedené na zakladatelích 19 chovných linií a celkem 727 hybridech White DurocxErhulian v F2 prokazuje silnou vazbovou nerovnováhu mezi MUC13 a ETEC F4ab/ac receptorovým lokusem, čímž se stává potenciálním markerem pro selekci na rezistenci k F4 pozitivní E. coli. Byl zjištěn polymorfismus MUC13 ve třech pozicích: 576C>T, 908A>G a 935A>C. Haplotyp [C;G;A] určuje vnímavost k F4 ETEC, naopak téměř všechna zvířat s haplotypem [T;G;C] a většina [C;A;A]/[T;G;C] byla F4 ETEC rezistentní. Peng et al. (2007) připisuje lokusu SSC13q41 gen MUC4, na zakladě šetření prováděném na souboru zvířat shodujícím se s dvěma předcházejícími studiemi (Wang et al. (2007) a Zhang et al. (2008)) předpokládá, že receptory pro adhezní fenotypy F4ab a F4ac jsou řízeny dvěma blízo sebe ležícími ale odlišnými lokusy v oblasti MUC4. Hodnoty vazebné nerovnováhy F4ab a F4ac se od sebe liší. K opačnému závěru dochází Python et al. (2002) když předpokládá, že F4ac receptor váže i F4ab antigenní struktury ETEC a je kontrolován jedním lokusem na chomozómu 13 v oblasti ohraničené lokusy S0068 a Sw1030. Tvrzení opírá o výskyt silného F4 receptoru u fenotypu F4abR+/F4acR+ a slabého F4 receptoru u fenotypu charakterizovaném F4abR+/F4acR- při současném chybění fenotypu F4abR-/F4acR+ .

3.5 Metody stanovení polymorfismu v genech FUT1 a MUC4 3.5.1 Genetický polymorfizmus Ford (1950) definuje genetický polymorfismus jako společný výskyt dvou nebo více variant téhož znaku v populaci v poměru nezavdávajícím doměnce, že nejméně vyskytující se varianta je pouhou opakovanou mutací. Výskyt dvou nebo více variant jednoho znaku v populaci je geneticky podmíněn výskytem dvou nebo více alel alternujících na jednom chromozomálním lokusu (Urban, 2006).

26

3.5.2

Metody detekce polymorfismů v genech

Existují dvě hlavní strategie detekce ekonomicky významných lokusů – asociační testy kandidátních genů a intervalové mapování genomu založené na zjišťování vazby mezi anonymními DNA markery a kvantitavními znaky. Metoda kandidátních genů se vyznačuje vysokou citlivostí a větší časovou náročností, když detekuje i lokusy s malým efektem a na druhé straně může zahrnout velký počet kandidátních genů pro jednu vlastnost. Rovněž interpretace testů kandidátních genů musí být velmi opatrná vzhledem k riziku falešných výsledků v důsledku vazbové nerovnováhy

s příčinnými geny nebo nesprávně nastavenému prahu statistické

významnosti (Čepica S., 2007). Přístup kandidátních genů využívá znalost již známých genů, nazývaných jako kandidátní pro QTL/ETL. Je-li znám jen polymorfizmus DNA, pak se předpokládá že tento marker pro danou oblast DNA se nachází blízko QTL/ETL – přístup genetických markerů. Metoda kandidátních genů závisí na předpokladu, že známe působení kandidátního genu na genetické a fyziologické úrovni. Musí být známy geny a jejich sekvence DNA. Výběr správného genu by měl být prováděn na základě dobré znalosti jeho pozice v metabolických drahách. Aditivní efekty pro různé alely těchto kandidátních genů se pak porovnávají navzájem, aby se prokázaly substituční efekty alely. Používají se rozdílné techniky na úrovni populací nebo rodin (Urban T., 2006). Princip intervalového mapování QTL/ETL spočívá ve zjišťování genetické vazby mezi markery (většinou mkrosatelity) a naměřenými fenotypovými hodnotami sledovaných vlastností. Testují se markery rozmístěné na chromozomu zhruba ve vzdálenostech 20 cM, čím vzniknou na chromozómech intervaly ohraničené dvěma sousedními markery. Vrámci těchto intervalů se pro jednotlivé lokusy počítá pravděpodobnost , s níž potomek zdědil konkrétní úsek chromozómu. V běžné šlechtitelské práci se pak používají tři typy DNA testů: Testy založené na zjištěné vazbě mezi markery a QTL chromozómovým úsekem – zde je nutná identifikace příčinného genu, testy založené na asociaci markeru s příčinou mutací v důsledku vazbové nerovnováhy – metoda je relativně jednodušší, přesto asociace v populaci musí být opakovaně prokázána a testy založené na známé příčinné mutaci – velmi spolehlivý, náročný na přípravu a vlastní identifikaci příčinné mutace (Čepica S., 2007). Šmarda (2005) klasififikuje metody detekce polymorfizmů na metody přímé a metody nepřímé. 27

Přímé metody přímo stanovují sekvenci variabilní oblasti DNA. Přímé sekvencování je v současné době založeno na dvou nejpoužívanějších metodách: Maxamovo-Gilbertovo sekvencování – chemické metodě využívající sledu chemických modifikací s cílem přerušení řetězce DNA v předem vytvořených zeslabených místech a především Sangerově sekvencování – využívajícím DNA-polymerázu pro syntézu komplementárních řetězců ruzné délky náhodně ukončených ddNTP obsaženým vevhodném poměru v reakční směsi. Vyhodnocení fragmentů se u obou metod provádí elektroforeticky. Obdobou Sangerova sekvencování je mtoda minisekvencování založená na prodloužení 3´-konce o jediný značený nukleotid, který slouží jako terminátor. Slouží k ověření jednonukleotidových polymorfismů (SNP). Produkty hybridizace se analyzují elektroforeticky. Nepřímé metody jsou využívány častěji. Jsou založeny na amplifikaci DNA (Polymerázové

řetězové reakci – PCR a jejích variantách a modifikacích) nebo

využívají rozdílné pohyblivosti fragmentů DNA obsahujících standardní a mutantní varianty genu v elektrickém poli (Polymorfismus délky restrikčních fragmentů – RFLP, Polymorfismus délky amplifikovaných fragmentů – AFLP, Polymorfismus délky fragmentů DNA vytvořených cleavasou – CFLP, Polymorfismus konformace jednořetězců – SSCP, polymorfismus konformace dvouřetězců – DSCP a další metody). Mezi nepřímé metody patří i Sekvencování pomocí hybridizace – SBH, též Metoda DNA-mikročipů,

DNA-microarray.

Podstatou

je

hybridizace

značených

oligonukleotidových sond se sekvencemi analyzované DNA.

3.5.3 Využití genetických markerů při studiu polymorfizmů u prasat

3.5.3.1 Genetické markery

Základními pomůckami používané ke studiu genetické variability v a mezi populacemi jsou genetické markery. Markery umožňují určovat, které alely jsou přítomné v populaci. Jejich využití je mimo jiné i ve šlechtění – Marker assisted selection (MAS) (Urban, 2006). Genetický marker je polymorfní znak, jehož varianty vykazují mendelistickou dědičnost a mohou být v asociaci s variabilitou znaku důležitou pro šlechtitele zvířat (Knoll, 2003).

28

Urban (2006) dělí genetické markery na viditelné, diskrétní, podmíněné jedním nebo někdy dvěma lokusy polymorfizmy, které dovolují odhalovat jen malou část genetické variability. Nejsou zpravidla ovlivněny prostředím a neodhalují dostatek genetické variability. Druhou skupinu tvoří molekulární markery proteinové povahy. Pomocí elektroforézy byl odhalován polymorfizmus mléčných bílkovin (kaseiny, albuminy, ...), bílkovin krevního séra a pod. Bylo důležité, aby mezi alelami byl vztah kodominance, aby mohl být rozeznán heterozygotní genotyp. Největší nevýhodou proteinových markerů je, že odhalují jen malou část skutečné variability v DNA sekvencích. Knoll (2003) zahrnuje oba jmenované typy markerů mezi tzv. klasické genetické markery. Třetí skupinu genetických markerů tvoří molekulárně genetické markery. První metody pro odhalování variability v DNA sekvenci se objevily v sedmdesátých letech minulého století - jednalo se o štěpení řetězce DNA na malé části specifickými enzymy a jejich separaci na gelu s následnou vizualizací radioaktivním značením a později fluorescenčními značkami. Tato technika se nazývá polymorfizmus délky restrikčních fragmentů (RFLP). RFLP markery jsou kodominantní, takže lze odhalovat heterozygotní genotypy. Ve spojení s polymerázovou řetězovou reakcí (PCR), která umožňuje multiplikovat milióny kopií specifických úseků DNA, došlo k revoluci v celé molekulární genetice. Vznikla široce používaná kombinovaná metodika PCR-RFLP pro odhalování bodových mutací v DNA. Dalšími metodami jsou RAPD, SPAR, CAPS, AFLP. Novější technikou je VNTRS (variabilní počet tandemových opakování), která identifikuje minisatelity a mikrosatelity. Tato metoda odhaluje opakující se kopie sekvencí např. (AC)10, které jsou velmi vysoce polymorfní (desítky alel) a jsou vhodné pro sledování variability v a mezi populacemi. Další novější metodou je určování jednonukleotidových polymorfizmů (SNP), které mají sice méně alel než mikrosatelity, ale jsou rovnoměrně distribuovány po celém genomu (Urban, 2006). Molekulárně genetické markery splňujípodle Brascampa et al. (1995) v citaci Urbana (2006) několik důležitých podmínek: kodominanci, jednotkovou heritabilitu, snadnou detekovatelnost a interpretovatelnost. Navíc mohou být některé molekulárně genetické markery stanovovány bez ohledu na věk zvířete nebo post mortem (Knoll, 2003). Genetické markery vedou k zjištění informací o dvou typech genetických lokusů - genetických markerů, využitelných v šlechtění. Prvním typem jsou kandidátní geny 29

přímé markery. Kandidátní geny mohou být charakterisovány dvěma typy polymorfismů: funkční markery (Funkcional Marker), což je vlastní příčinná mutace, přímé markery (Direct Marker), což je polymorfismus DNA přímo v sekvenci genu . Druhým typem jsou polymorfismy, které samy o sobě nemají vliv na projev znaku, ale jsou ve vazbě s QTL - nepřímé markery. Nepřímé markery je z hlediska praktického využití třeba rozdělit na dva typy: LD markery - markery které jsou s QTL ve vazbové nerovnováze (Linkage Disequilibrum Markers) a LE markery - markery, které jsou s QTL ve vazbové rovnováze (Linkage Equilibrum Markers) Z hlediska molekulární genetiky mohou být nepřímé genetické markery dvojího typu: vysoce variabilní mikrosatelitní sekvence (MS), nazývané také krátké tandemové repetice (STR; Short Tandem Repeats) a markery v kódujících i nekódujících sekvencích v intronech genů nebo mimo geny, v nichž se odhalil polymorfismus podmíněný záměnou (mutací) jedné baze v DNA. Tyto markery se označují zkratkou SNPs (Single Nucleotide Polymorphism) (Urban, 2006). Knoll (2003) klasifikuje molekulárně genetické markery do tří skupin podle (O´Brien et al., 1999): I. typ tvoří kódující exprimované geny, které mohou být kandidátními geny pro QTL/ETL. Mají malou hladinu polymorfizmu (malý počet alel) a jsou vhodné pro komparativní mapování. II. typ zahrnuje vysoce variabilní sekvence, zejména mini- (VNTR) s využitím krátkých oligonukleotidů a mikrosatelity (STR) charakteru tandemových repetic. Nemají přímo vliv na variabilitu znaku, ale mohou být ve vazbě s QTL/ETL. III. typ tvoří jednonukleotidiové polymorfizmy (SNP), které mohou být lokalizovány uvnitř kódujících genů, častěji ale v nekódujících intronech nebo intergenových oblastech. Mikrosatelity (STR) jsou vzhledem k početnosti a náhodnému rozmístění ideálními markery. Jejich polymorfizmus může být rychle a spolehlivě testován pomocí PCR a polyakrylamidové gelové elektroforézy (PAGE) nebo kapilární elektroforézy s možností automatizace analýzy i vyhodnocení. Jednonukleotidové polymorfizmy (SNP) se stávají nejpoužívanějšími markery. Mají vyšší četnost než mikrosatelity a nižší mutační rychlost. V praxi umožňují shromáždit více markerů v oblasti zájmového lokusu. Většina testů na SNP využívá ( Saiki et al., 1985; Innis et al., 1990) k amplifikaci sekvence s SNP polymerázovou řetězovou reakci (PCR) (Knoll, 2003).

30

3.5.4. Nejčastěji používané postupy při detekci polymorfizmů u prasat

3.5.4.1. Stanovení polymorfizmu délky restrikčních fragmentů u produktů PCR – Polymerase Chain Reaction- Restriction Fragments Lenght Polymorphism (PCRRFLP) PCR-RFLP je modifikace standardní PCR používaná k typizaci cílové frekvence, obvykle určitého genu, obsahujícího sekvenční polymorfismus. Podstatou stanovení je multiplikace vyšetřovaných sekvencí o délce až 5kb, které se následně štěpí restrikční endonukleázou na různě dlouhé fragmenty na základě přítomnosti nebo absence specifického restrikčního místa a analyzují metodou PAGE ( Šmarda, 2005). Výhodou PCR-RFLP je nenáročnost provedení a možnost volby restrikčního místa. Nevýhodou je nízká pravděpodobnost detekce mutace. S rostoucím počtem štěpících enzymů tato pravděpodobnost roste. Metoda je vhodná pro geny s větším polymorfismem a lze jí určit přesnou lokalizaci polymorfního místa a jeho případný vliv na záměnu aminokyseliny v polypeptidu ( Knoll, 2003).

3.5.4.2 Polyformizmus konformace jednořetězců – Single Strand Conformation Polymorphism, (SSCP) Poprvé uvedena Oritaet al. (1989) citace ( Knoll, 2003). Metoda využívá rozdílné sekvenčně specifické intramolekulární struktury jednořetězcové nukleové kyseliny ovlivňující její mobilitu v nedenaturujícím agarózovém gelu. Homozygotní DNA vytváří dvě elektroforetické formy, heterozygotní DNA obsahující sekvence dvou různých alel vytváří čtyři elektroforetické formy. Obvykle se používá pro detekci sekvenčních rozdílů mezi různými alelami téhož genu ( Šmarda, 2005). Po optimalizaci detekuje mutace s 90% spolehlivostí, pokud tyto neleží v okrajových částech segmentu. Vizualizace se provádí barvením stříbrem nebo autoradiograficky ( Knoll, 2003).

3.5.4.3. Denaturační gradientová gelová elektroforéza – Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE) Umožňuje sledovat rozdíly v sekvencích (např. bodové mutace) v krátkých molekulách DNA o stejné délce. Využívá rozdílné elektroforetické mobility u částečně

31

denaturované DNA a DNA v nedenaturovaném stavu. Fragmenty DNA obsahující polymorfismus se připravují metodou PCR. Nanášejí se na gel s lineárním denaruračním gradientem zajištěným rostoucí koncentrací denaturačního činidla nebo teploty. Dvouřetězcová DNA postupně na gelu denaturuje a tvoří na základě své struktury (sekvence) rozdílné větvené struktury. To se projevuje na různém zpomalení pasáže ( Šmarda, 2005).

3.5.4.4 Náhodná amplifikace polymorfní DNA – Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD) Je metodou pro tvorbu genomového fingerprintingu u druhů, u kterých máme málo údajů o sekvenci , kterou chceme amplifikovat. K zahájení PCR se používá nespecifický oligonukleotid , který se váže na příslušná místa amplifikované DNA. První dva cykly se provádějí s jedním náhodným primerem za nižší stringence intenzity odmývání, zachovávající i tzv. pozadí, tj. četnost nespecifické, málo komplementární hybridizace (Vokurka M., 2002), a další cykly se specifickými primery za vyšší stringence ( Knoll, 2003). Výsledkem je amplifikace mnoha fragmentů s různou délkou a molárním množstvím

v závislostina

kvalitě

izolátu

DNA.

Separace

se

děje

gelovou

elektroforézou. Metoda je vysoce účinná, ale problémem může být reprodukovatelnost a interpretace výsledků ( Šmarda, 2005). Knoll (2003) uvádí i výhody – nízkou pracnost a náklady a vysoký stupeň polymorfizmu.

3.5.4.5

Polymorfizmus délky amplifikovaných fragmentů – Amplified Fragment

Lenght Polymorphism (AFLP) známá též jako amplifikace vzácných restikčních míst (IRS-PCR) Metodou AFLP lze vizualizovat sadu restrikčních fragmentů pomocí PCR bez znalosti jejich ukleotidové sekvence ve čtyřech krocích: úplné rozštěpení genomové DNA jednou nebo dvěma restrikčními nukleázami, ligacr genomové DNA s oligonukleotidovými adaptory konstruovanými tak, aby nedošlo

k obnově

restrikčního místa za přítommosti restriktáz bránicích spojování restrikčních fragmentů, selektivní amplifikace sady restrikčních fragmentů pomocí jednoho či dvou selektivních AFLP-primerů, nedenaturující gelová elktroforéza amplifikovaných fragmentů (Šmarda, 2005). 32

Výhodou je, že není nutné znát sekvenci zkouman DNA . Díky vysoké hustotě markerů je vhodná pro poziční klonování ( Knoll, 2003).

3.5.4.6 DNA Array, též biočipy, DNA chips, biochips Je to moderní avšak při přípravě čipů nákladná metoda. Způsob provedení hybridizace na čipech je opačný s principem klasické hybridizace typu Southern Blott. U klasických technik jakou je Southernův přenos je vyšetřovaná nukleová kyselina imobilizována na filtr a zde podrobena hybridizaci se specifickou, značenou sondou. U DNA čipů se postupuje opačně, k pevnému podkladu s upevní neznačené specifické fragmenty (sondy) a ty jsou hybridizovány se značenou cílovou molekulou (Šmarda, 2005). Po promytí nenavázaných molekul je možno provádět detekci pomocí fluorescenčního mikroskopu nebo skeneru a data vyhodnotit na počítači. Výhodou je možnost provádět takovou hybridizaci na stovky až tisíce různých známých sekvencí DNA a testovat tak velké množství genů obsažených ve vzorku ( Knoll, 2003).

3.5.4.7. Metody na principu přímého sekvencování Vedle již zmíněných Maxamova-Gilbertova sekvencování – chemické metody využívající

sledu

chemických

modifikací

a

častěji

používaného

Sangerova

sekvencování – využívajícím DNA-polymerázu nšly v oblasti molekulární genetiky prasete některé další, moderní metody, např. PCR v reálném čase, MALDI-TOF apod.

3.5.4.8. Další metody používané při stanovení genetické variability Jde

v

podstatě

(denaturující/nedenaturující),

o

pomocné

metody

elektroforetickou

Western

separaci

na

Blotting, agarózovém

PAGE gelu,

kapilárová elektroforéza a další (Šmarda, 2005). Většina z nich byla již výše zmíněna. Metodikou těchto postupů, stejně jako detaily PCR, metody dostatečně známe se tato práce nezabývá.

33

4. MATERIÁL A METODIKA

4.1. Charakteristika sledovaných populací prasat V předložené diplomové práci jsou sledovány, vyhodnoceny a porovnány tři populace prasat u kterých byly v letech 2005-2008 odebrány vzorky krve, spermatu a/nebo tkáně na testaci rezistence proti onemocnění narozených selat a selat po odstavu vyvolaným E. coli.

I.

První soubor tvoří 57 kanců plemen: pietrain ( 29), české bílé ušlechtilé ( 13), česká landrasse (10) , hampshire (5). Odběr spermatu probíhal v době 20.3 – 28.3. 2006 na nejmenované farmě. Sleduje se četnost genotypů a rozložení alel genů FUT1 a MUC4.

II.

Druhý soubor je skupina kanců plemene duroc čítající 96 zvířat 10- ti linií. Sleduje se opět četnost genotypů a alelové frekvence FUT1 a MUC4.

III.

Třetí soubor je skupina 486 prasat, z toho 431 prasat z komerčních chovů plemen velké bílé (125), landrasse (19), duroc (102) a pietrain (171). Dále 55 prasat plemene přeštické černostrakaté z genetických zdrojů ČR.

Práce stanovuje rozložení, frekvence genotypů, alel a teoretické alelové frekvence v genech FUT1, MUC4. Test průkaznosti rozdílů mezi skupinami X2 (chy:kvadrát) testem.

4.2. Metodika odběru a zpracování vzorků 4.2.1 Izolace DNA z krve, spermatu, mléka a dalších tělních tekutin

Do 1,5 ml eppendorfovy zkumavky napipetujeme 200 µl krve nebo jiné tělní tekutiny. Přidáme 20 µl proteinasy (20mg/ml), promícháme, přidáme 200 µl pufru. Velmi důkladně promícháme. Nepřidáváme proteinasu přímo k pufru, ale nejdříve vzorek krve (tělní tekutiny) promícháme s enzymem a pak přidáváme pufr. Inkubujeme 10 min při 58oC . Ke směsi přidáme 200 µl ethanolu a ihned a důkladně promícháme,

34

abychom zabránili vysrážení nukleové kyseliny. Připravíme

2 ml centrifugační

zkumavky, do kterých vložíme micro-spin kolonky. Kolonky zachytí DNA na speciální křemičité membráně. Do takto připravených kolonek přepipetujeme celý objem vzorku a centrifugujeme při 10 600 rpm 1 minutu . Slijeme odfiltrovanou tekutinu a kolonku opět vložíme do centrifugační zkumavky. Přidáme 500 µl KX pufru a centrifugujeme při 10 600 rpm 1 minutu. Slijeme odfiltrovanou tekutinu a kolonku opět vložíme do centrifugační zkumavky. Přidáme 500 µl pufru a centrifugujeme. Slijeme odfiltrovanou tekutinu a kolonku opět vložíme do centrifugační zkumavky a centrifugujeme prázdnou kolonku bez přidání jakýchkoli pufrů při maximální rychlosti centrifugy. Kolonku vyjmeme a vložíme do čisté 1,5 ml eppendorfovy zkumavky. Přidáme 100 µl elučního pufru vytemperovaného na 70oC. Tento pufr aplikujeme přímo do středu křemičité membrány. Tím zajistíme kontakt celé membrány s pufrem a důkladné vymytí DNA z membrány. Eluční pufr necháme inkubovat s membránou kolonky 2 minuty při pokojové teplotě a poté centrifugujeme při 10 600 rpm 2 minuty. Ve zkumavce je nyní čistá DNA.

4.2.2. Izolace DNA ze vzorků tkáně

Do 1,5 ml eppendorfovy zkumavky nařežeme skalpelem 25 mg tkáně nebo nastříháme 20 ks chlupových cibulek. Přidáme 200 µl pufru a důkladně promícháme, přidáme 20 µl proteinasy K (20mg/ml), důkladně promícháme a necháme inkubovat 2 hodiny při 58oC. Během inkubace několikrát promícháme . Vzorek přepipetujeme do čisté eppendorf. zkumavky, přidáme 200 µl pufru a důkladně promícháme. Necháme inkubovat 10 minut při teplotě 70oC. Vzorek přibližně 1 minutu zchladíme při pokojové teplotě a přidáme 200 µl ethanolu. Krátce a důkladně protřepeme, abychom předešli srážení DNA. Připravíme 2 ml centrifugační zkumavky, do kterých vložíme micro-spin kolonky. Kolonky nám zachytí DNA na speciální křemičité membráně. Do takto připravených kolonek přepipetujeme celý objem vzorku a centrifugujeme při 10 600 rpm 1 minutu. Slijeme odfiltrovanou tekutinu a kolonku opět vložíme do centrifugační zkumavky. Přidáme 500 µl TX pufru a centrifugujeme při 10 600 rpm 1 minutu. Slijeme odfiltrovanou tekutinu a kolonku opět vložíme do centrifugační zkumavky. Přidáme 500 µl T3 pufru a centrifugujeme při 10 600 rpm 1 minutu. Slijeme odfiltrovanou tekutinu a kolonku opět vložíme do centrifugační

zkumavky a

centrifugujeme prázdnou kolonku bez přidání jakýchkoli pufrů při maximální rychlosti 35

centrifugy (13 000 rpm) 1 minutu. Kolonku vyjmeme a vložíme do čisté 1,5 ml eppendorfovy zkumavky.Přidáme 100 µl elučního pufru vytemperovaného na 70oC. Tento pufr aplikujeme přímo do středu křemičité membrány. Tím zajistíme kontakt celé membrány s pufrem a důkladné vymytí DNA z membrány. Eluční pufr necháme inkubovat s membránou kolonky 2 minuty při pokojové teplotě a poté centrifugujeme při 10 600 rpm 2 minuty. Ve zkumavce je nyní čistá DNA.

4.2.3. Polymerázová řetězová reakce (PCR)

K amplifikaci požadovaného fragmentu bylo využito metody PCR, která byla optimalizována na přístrojové vybavení Laboratoře aplikované molekulární genetiky. Reakční objem 25 µl zahrnuje mimo 3 – 10 µl DNA (dle koncentrace po izolaci) 15 µl tzv. Master-mixu ve složení: 7,9 µl H2O, 2,5 µl 10 x PCR Buffer (bez MgCl2), 2 µl dNTP (10 mM), 0,5 µl obou primerů (10 pmol/µl), 0,13 µl Taq DNA Polymerase recombinant (5 U/µl, výrobce Fermentas UAB, Litva) a 1,5 MgCl2 (25 mM). V případě, že se do reakční směsi přidá méně než 10 µl lyzátu DNA, je nutno do tohoto objemu doplnit destilovanou vodu. Master-mix je připravován na ledu a přidáván k templátové DNA až po její počáteční denaturaci při 95 °C po dobu 3 min. Teplotní profil PCR reakce (celkem 30 cyklů) je následující: počáteční denaturace 95 °C / 3 min, denaturace 95 °C / 30 s, annealing 56 °C / 30 s, elongace 72 °C / 30 s, závěrečná elongace 72 °C / 7 min. Pro amplifikaci je možno využít jednoho zpětného (R) a dvou přímých primerů (F): 1) P1 (R) 5´- CTT CAG CCA GGG CTC CTT TAA G – 3´ 2) P2 (F) 5´ - CTG CCT GAA CGT CTA TCA AGA TC – 3´ P3 (F) 5´ - CTT CCT GAA CGR CTA TCA AGA CC – 3´ Kvalita a množství amplifikovaného fragmentu (délka 421 bp) je kontrolována pod UV-světlem na 2 % agarosovém gelu (Agarose Serva for DNA electrophoresis, výrobce Serva Eelectrophoresis GmbH, Německo), na který je naneseno 5 µl PCR– produktu (napětí 100 V, 20 min.).

36

4. 2.4. Restrikční analýza (RFLP)

Vlastní detekce jednotlivých polymorfních variant mutace M307 genu FUT1 je založena na polymorfismu délky restrikčních fragmentů (RFLP). Pro štěpení PCR produktu je možno použít endonukleasu CfoI, která rozeznává sekvenci GCG↓C/C↓GCG nebo endonukleasu Hin6I. Tato endonukleása přerušuje molekulu DNA ve stejné sekvenci, ale mezi jinými nukleotidy (G↓CGC / CGC↓G). Tato modifikace však neovlivňuje vlastní podstatu stanovení polymorfismu M307. Štěpení amplifikovaného fragmentu je prováděno přidáním 5 µl Master-mixu k 20 µl PCR-produktu. Master-mix obsahuje 2,6 µl dest. vody, 2 µl 10x Buffer Y+/TangoTM (s BSA) a 0,4 µl enzymu Hin6I (10 U/µl, výrobce Fermentas UAB, Litva). Vzorky jsou inkubovány v termostatu při 37 °C po dobu 3 hod. Genotypy jednotlivých zvířat jsou odečítány po elekroforetické separaci štěpeného PCR-produktu a visualizaci pod UV-světlem. Elektroforéza je prováděna na 3,5 % agarosovém gelu (Agarose Serva for DNA electrophoresis, výrobce Serva Eelectrophoresis GmbH, Německo) obarveném ethidium bromidem cca 30 min při napětí 120 V. V amplifikovaném fragmentu genu FUT1 je jedno stálé restrikční místo a jedno polymorfní místo pro endonukleasu Hin6I (CfoI). Proto je stabilně z PCR-produktu o délce 421 bp odštěpován fragment délky 93 bp. V případě přítomnosti polymorfního restrikčního místa je fragment o délce 328 bp rozštěpen na fragmenty délky 241 a 87 bp. Mutovaná alela ztrácí restrikční místo a fragment o délce 328 bp zůstává nedotčen.

4.2.5. Gelová elektroforéza na agarózovém gelu

Pro přípravu 1% (2%,4%) agarozového gelu navážíme 1g (2g,4g ) agarozy do 100 ml elektroforetického pufru . Povaříme v mikrovlnné troubě do úplného rozvaření agarozy. Do rozvařeného gelu přidáme 4µl ethidium bromidu (0,5 mg/ml) a promícháme. Při barvení se využívá vlastnosti fluorescenční molekuly ethidium bromidu vmezeřovat se do vlákna DNA. Gel nalijeme do připravené vaničky a vsuneme do ní hřebeny, které vytvoří jamky pro umístění vzorků a necháme gel ztuhnout. Po ztuhnutí vyjmeme z gelu hřebínky a vložíme gel do elektroforetické vany s elektroforetickým pufrem (pufr je

37

těšně nad povrchem gelu). Do jamek v gelu naneseme 5 µl vzorku. Zapojíme kabely elektroforetické vany ke zdroji elektrického napětí tak, aby DNA putovala k anodě. Optimální velikost napětí je 5V/cm .Doba separace dle potřeby. Po skončení elektroforézy vyjmeme gel a položíme ho na desku transiluminátoru - zdroj UV světla a vyhodnotíme fragmenty vzorků. Po separaci na agarosovém gelu je pak možno vidět následující fragmenty (obr. č.2): 1) genotyp M307AA – fragmenty 328 a 93 bp 2) genotyp M307GG – fragmenty 241, 93 a 87 bp 3) genotyp M307AG – fragmenty 328, 241, 93 a 87 bp Fragmenty o velikosti 93 a 87 bp na agarosovém gelu splývají, což však nebrání správnému odečtení genotypu, neboť je rozhodující přítomnost či absence fragmentů 328 a 241 bp.

93 a 87 bp

M307 AG

241 bp

M307GG

M307 GG

328 bp

M307 AA

Obr. č.2 Polymorfismus délky restrikčních fragmentů v místě M307 genu FUT1 po štěpení restrikčním enzymem Hin6I

38

4.2.6 Výsledné genotypy prasat a jejich vztah k rezistenci/

vnímavosti

k Escherichia coli FUT1 A/A

=

odolný vůči faktorům virulence F18 ETEC (recesivní homozygot)

A/G

=

vnímavý

G/G

=

vnímavý

A/A

=

odolný vůči faktorům virulence F4 ETEC (recesivní homozygot)

A/B

=

vnímavý

B/B

=

vnímavý

MUC4

Tab.č.3 Farma A – zjištěné genotypy kanců různých plemen pořadové číslo zvířete 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23

FUT1

MUC4

AG AG GG AG AG GG GG GG AA AG GG AG GG AG GG GG GG GG GG GG GG GG GG

AA AB AB AB AB AB AB AB AB AB AA AB AB AB AB AB AB AA AB AB AB AB AA

39

24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66

GG AG GG GG GG GG AG GG AG GG GG GG GG AG AG GG GG AG AG AA AA GG GG AG GG AG GG GG AG AG AG GG GG GG GG GG GG AG AG GG GG AG GG

AB AA AB AA AA AA AB AA AB AA AA AA AA AA AA AB AA AB AA AA AA AA AA AB AA AA AB AB AB AB AA AB AB AA AA AB AA AB AB AA AB AA AA 40

67 AG AA Tab.č.4 Farma B – zjištěné genotypy kanců plemene Duroc linie

zkratka registr

č.zkum. MUC 4 FUT 1

DIREKT DOMEK DIREKT DIREKT DRUID DANTES DURMAN DURMAN IDARED DRUID DIEGO DUEL DUEL DURMAN IDARED DRUID DANTES DANTES DIEGO DIREKT DUEL DUEL IDARED DINAR IDARED DARDANEL DIEGO DIEGO IDARED DRUID DURMAN DIREKT DRUID DARDANEL DIREKT DURMAN DINAR DRUID

DKT DMK DKT DKT DID DTS DUM DUM IDR DID DIE X-DU X-DU DUM IDR DID DTS DTS DIE DKT X-DU X-DU IDR DNR IDR DDL DIE DIE IDR DID DUM DTK DID DDL DKT DUM DNR DID

A9/68 A2/15 A2/16 A4/70 A19/22 A0/32 A2/14 A9/41 A10/44 A19/39 A1/24 A2/5 A4/59 A2/13 A10/43 A19/36 A1/59 A4/22 A2/63 A0/39 A2/6 A4/60 A10/73 A13/10 A10/46 A2/77 A1/58 A4/21 A13/57 A23/48 A2/12 A14/22 A23/49 A6/68 A9/51 A4/65 A16/2 A27/25

1 1 2 2 21 21 21 22 24 24 24 24 24 24 25 25 25 25 25 25 25 25 26 27 27 27 27 27 28 28 28 29 29 29 29 29 30 30

41

AA AA AA AA AA AA AA AB AA AA AA AA AA AA AA AA AA AA AA AA AA AA AA AA AA AA AA AA AA AA AA AB AA AA AA AA AA AB

AG AA GG GG AG GG AG GG GG AG AG GG GG AG AG AA GG GG GG AG GG GG AG AG AG AA AA AA GG AG AA AG AG GG GG AA GG GG

DARDANEL DINAR DRUID DIREKT DRUID DANTES DIREKT DARDANEL IDARED DRUID DANTES DIREKT DINAR IDARED DRUID DARDANEL DUEL DINAR DRUID DUEL DIREKT DINAR DARDANEL IDARED DUEL DOMEK DIREKT DRUID DOMEK DRUID DIREKT DINAR DIEGO DIEGO DRUID DOMEK DIREKT DOMEK DIREKT DINAR DIREKT DINAR DRUID

DDL DNR DID DKT DID DTS DKT DDL IDR DID X-DTS DTK DNR IDR DID DDL DUL DNR DID DUL DKT DNR DDL IDR DUL DMK DKV DID DMK DID DKT DNR X-DIE DIE DID DMK DKT DMK DKT DNR DKT DNR DID

30 31 31 32 32 32 33 33 33 33 34 34 34 34 34 34 34 35 35 35 36 36 36 36 36 37 37 37 38 38 39 39 41 41 41 42 42 43 44 44 44 46 47

A6/76 A16/10 A23/33 A10/20 A24/17 A5/81 A10/21 A19/21 A23/50 A24/22 A13/9 A12/22 A16/11 A24/45 A24/22 A29/6 A9/77 A17/75 A24/3 A9/38 A14/49 A17/13 A34/71 A39/2 A9/72 A19/9 A15/52 A26/23 A17/76 A26/26 A17/14 A26/11 A13/8 A16/4 A28/3 A27/75 A36/33 A29/30 A14/30 A34/25 A41/35 A35/27 A32/56 42

AA AA AA AA AA AA AA AA AA AA AA AB AA AA AA AA AB AA AA AB AB AA AA AA AA AA AA AA AA AA AB AA AA AA AA AA AA AA AB AA AA AA AA

GG AG AG AG AA AG AA AG AG AA AG AG AA GG AG GG AG AA AA AG AG AG GG GG AG AG AG AA GG AG AA AG AG AG AG AG GG AG GG AA AG AG GG

DINAR DRUID DINAR DINAR DOMEK DRUID DOMEK DRUID DOMEK DOMEK DOMEK DOMEK DURMAN DIEGO DINAR DARDANEL

DNR DID DNR DNR DMK DID DMK DID DMK DMK DMK DMK DUM DIE DNR DDL

DOMEK DOMEK DRUID

DMK DMK DID

DOMEK

DMK

48 48 49 50 50 52 52 53 53 55 57 58 59

A36/52 A32/57 A37/49 A39/13 A37/53 A34/39 A39/13 A36/53 A39/14 A39/53 A39/79 A40/2 A2/11 A13/75 A14/59 A29/32 A32/20 A32/21 A32/22 A32/14 A32/13 A29/31 A31/12 A32/61 A32/60 A34/19 A39/60 A34/69 A39/8 A41/72 A41/73 A41/44 A25/24

AA AA AA AA AA AA AA AA AA AA AA AA AA AA AA AA AA AA AA AA AA AA AA AA AA BB AA AA AA AA AA AA AA

AA AG AA AG AA AA AG GG AG AG AG AG AA GG AA GG AA GG AG GG AG AG AG GG GG GG GG AG AA GG GG GG GG

4.2.7. Biometrické zpracování Soubory byly zpracovány ručně. Statistické výpočty byly provedeny pomocí X2 testu. Označení v tabulkách „Výsledky a diskuse“: „ks“

=

absolutní počty genotypů

„%“

=

relativní počty genotypů

„P“

=

predikce četnosti genotypů (teoretická četnost dle HW)

43

5. VÝSLEDKY PRÁCE A DISKUSE 5.1 Srovnání frekvecí genotypů a alel mezi farmamou A a farmou B Tab.č.5 Distribuce genotypů a alel lokusu FUT 1 u kanců různých plemen Soubor Kanci Farma A

n 57

Genotyp FUT 1 A/A ks 1 % 1,8 P 2,2

A/G 15 26,3 25,4

G/G 41 71,9 72,4

Frekvence alel A=0,149 G=0,851

Populace je v rovnováze, hodnota X2 vypočítaného je 0,108 < tab. hodnota X2 5,99, pro hladinu významnosti 0,05 a 9,21 pro hladinu významnosti 0,01

Tab.č.6 Distribuce genotypů a alel lokusu MUC 4 u kanců různých plemen Soubor Kanci Farma A

n 57

Genotyp MUC 4 A/A ks 26 % 45,6 P 53,0

A/B 31 54,4 39,6

B/B 0 0 7,4


Rozdíl mezi skutečnou hodnotou frekvence alel a predikcí je vysoce průkazný na hladině významnosti 0,01, hodnota naměřeného X2 je 13,992 > tab. hodnota X2 5,99, pro hladinu významnosti 0,05 i 9,21 pro hladinu významnosti 0,01

Tab.č.7 Distribuce genotypů a alel lokusu FUT 1 u kanců různých plemen Soubor Kanci Farma B

n 96


A/G 47 49,0 49,6

G/G 29 30,2 29,9



Tab.č.8 Distribuce genotypů a alel lokusu MUC 4 u kanců různých plemen Soubor

n

Genotyp MUC 4 A/A A/B

44

B/B

Frekvence alel

Kanci Farma B

96

ks % P

88 91,7 91,8

8 8,3 8,0

0 0 0,2

A=0,958 B=0,042


5.2 Srovnání frekvecí genotypů a alel zastoupených plemen v rámci farmy A Tab.č.9 Distribuce genotypů a alel lokusu FUT 1 u kanců Plemeno Farma A pietrain

n 29

Genotyp FUT 1 A/A ks 0 % 0 P 1

A/G 7 24 21

G/G 22 76 78



Tab.č.10 Distribuce genotypů a alel lokusu MUC 4 u kanců Genotyp MUC 4 Plemeno n A/A A/B B/B ks 14 15 0 Farma A 29 % 48 52 0 pietrain P 55 38 7

Frekvence alel A=0,74 B=0,26


Tab.č.11 Distribuce genotypů a alel lokusu FUT 1 u kanců Plemeno Farma A č.landrasse

n 10


A/G 3 30 26

G/G 7 70 72


Populace je v rovnováze, hodnota X2 vypočítaného je 2,670 < tab. hodnota X2 5,99, pro hladinu významnosti 0,05 a 9,21 pro hladinu významnosti 0,01 45

Tab.č.12 Distribuce genotypů a alel lokusu MUC 4 u kanců Plemeno

n

Farma A 10 č.landrasse

Genotyp MUC 4 A/A ks 4 % 40 P 49

A/B 6 60 42

B/B 0 0 9



Tab.č.13 Distribuce genotypů a alel lokusu FUT 1 u kanců Plemeno Farma A č.bílé ušlechtilé

n 13


A/G 4 30 36

G/G 8 62 59



Tab.č.14 Distribuce genotypů a alel lokusu MUC 4 u kanců Plemeno Farma A č.bílé ušlechtilé

n 13


A/B 8 62 43

B/B 0 0 10



Tab.č.15 Distribuce genotypů a alel lokusu FUT 1 u kanců Plemeno

n

Farma A 5 hampshire


A/G 1 20 18 46

G/G 4 80 81


Populace je v rovnováze, hodnota X2 vypočítaného je 1,234 < tab. hodnota X2 5,99, pro hladinu významnosti 0,05 a 9,21 pro hladinu významnosti 0,01 Tab.č.16 Distribuce genotypů a alel lokusu MUC 4 u kanců Plemeno

n

Farma A 5 hampshire


A/B 2 40 32

B/B 0 0 4


Rozdíl mezi skutečnou hodnotou frekvence alel a predikcí je průkazný na hladině významnosti 0,05, hodnota naměřeného X2 je 6,250 > tab. hodnota X2 5,99, pro hladinu významnosti 0,05

5.3 Srovnání frekvecí genotypů a alel plemenných linií plemene duroc v rámci farmy B Tab.č.17 Distribuce genotypů a alel lokusu FUT 1 u kanců plemene duroc Linie Farma B Domek

n 13


A/G 9 70 50

G/G 2 15 25



Tab.č.18 Distribuce genotypů a alel lokusu MUC 4 u kanců plemene duroc Linie Farma B Domek

n 13


A/B 0 0 0

B/B 0 0 0



47

Tab.č.19 Distribuce genotypů a alel lokusu FUT 1 u kanců plemene duroc Linie Farma B Druid

n 19


A/G 10 52 49

G/G 3 16 17



Tab.č.20 Distribuce genotypů a alel lokusu MUC 4 u kanců plemene duroc Linie Farma B Druid

n 19


A/B 1 5 6

B/B 0 0 0



Tab.č.21 Distribuce genotypů a alel lokusu FUT 1 u kanců plemene duroc Linie Farma B Dardanel

n 7


A/G 1 14 33

G/G 5 72 63



Tab.č.22 Distribuce genotypů a alel lokusu MUC 4 u kanců plemene duroc Linie Farma B Dardanel

n 7


A/B 0 0 0

48

B/B 0 0 0


Populace je v rovnováze, hodnota X2 vypočítaného je 0,0 < tab. hodnota X2 5,99, pro hladinu významnosti 0,05 a 9,21 pro hladinu významnosti 0,01 Tab.č.23 Distribuce genotypů a alel lokusu FUT 1 u kanců plemene duroc Linie Farma B Dinar

n 12

Genotyp FUT 1 A/A ks 5 % 42 P 44,5

A/G 6 50 44,5

G/G 1 8 11



Tab.č.24 Distribuce genotypů a alel lokusu MUC 4 u kanců plemene duroc Linie Farma B Dinar

n 12


A/B 0 0 0

B/B 0 0 0



Tab.č.25 Distribuce genotypů a alel lokusu FUT 1 u kanců plemene duroc Linie Farma B Diego

n 7

Genotyp FUT 1 A/A ks 2 % 28,5 P 25

A/G 3 43 50

G/G 2 28,5 25



Tab.č.26 Distribuce genotypů a alel lokusu MUC 4 u kanců plemene duroc Linie Farma B Diego

n 7


A/B 0 0 0

49

B/B 0 0 0


Populace je v rovnováze, hodnota X2 vypočítaného je 0,0 < tab. hodnota X2 5,99, pro hladinu významnosti 0,05 a 9,21 pro hladinu významnosti 0,01 Tab.č.27 Distribuce genotypů a alel lokusu FUT 1 u kanců plemene duroc Linie Farma B Durman

n 5


A/G 2 40 48

G/G 1 20 16


Populace je v rovnováze, hodnota X2 vypočítaného je 2,777 < tab. hodnota X2 5,99, pro hladinu významnosti 0,05 a 9,21 pro hladinu významnosti 0,01 Tab.č.28 Distribuce genotypů a alel lokusu MUC 4 u kanců plemene duroc Linie Farma B Durman

n 5


A/B 1 20 20

B/B 0 0 1


Populace je v rovnováze, hodnota X2 vypočítaného je 0,012 < tab. hodnota X2 5,99, pro hladinu významnosti 0,05 a 9,21 pro hladinu významnosti 0,01 Tab.č.29 Distribuce genotypů a alel lokusu FUT 1 u kanců plemene duroc Linie Farma B Direkt

n 14


A/G 7 50 48

G/G 5 36 37


Populace je v rovnováze, hodnota X2 vypočítaného je 0,177 < tab. hodnota X2 5,99, pro hladinu významnosti 0,05 a 9,21 pro hladinu významnosti 0,01 Tab.č.30 Distribuce genotypů a alel lokusu MUC 4 u kanců plemene duroc Linie Farma B Direkt

n 14


A/B 4 29 24

B/B 0 0 2



50

Tab.č.31 Distribuce genotypů a alel lokusu FUT 1 u kanců plemene duroc Linie Farma B Dantes

n 4


A/G 2 50 38

G/G 2 50 56



Tab.č.32 Distribuce genotypů a alel lokusu MUC 4 u kanců plemene duroc Linie Farma B Dantes

n 4


A/B 0 0 0

B/B 0 0 0


Populace je v rovnováze, hodnota X2 vypočítaného je 0,0 < tab. hodnota X2 5,99, pro hladinu významnosti 0,05 a 9,21 pro hladinu významnosti 0,01 Tab.č.33 Distribuce genotypů a alel lokusu FUT 1 u kanců plemene duroc Linie Farma B Idared

n 8


A/G 4 50 38

G/G 4 50 56


Rozdíl mezi skutečnou hodnotou frekvence alel a predikcí je vysoce průkazný na hladině významnosti 0,01, hodnota naměřeného X2 je 10,432 > tab. hodnota X2 5,99, pro hladinu významnosti 0,05 i 9,21 pro hladinu významnosti 0,01 Tab.č.34 Distribuce genotypů a alel lokusu MUC 4 u kanců plemene duroc Linie Farma B Idared

n 8


A/B 0 0 0

51

B/B 0 0 0


Populace je v rovnováze, hodnota X2 vypočítaného je 0,0 < tab. hodnota X2 5,99, pro hladinu významnosti 0,05 a 9,21 pro hladinu významnosti 0,01 Tab.č.35 Distribuce genotypů a alel lokusu FUT 1 u kanců plemene duroc Linie Farma B Duel

n 7


A/G 3 43 33

G/G 4 57 63


Rozdíl mezi skutečnou hodnotou frekvence alel a predikcí je průkazný na hladině významnosti 0,05, hodnota naměřeného X2 je 7,601 > tab. hodnota X2 5,99, pro hladinu významnosti 0,05. Tab.č.36 Distribuce genotypů a alel lokusu MUC 4 u kanců plemene duroc Linie Farma B Duel

n 7


A/B 2 29 24

B/B 0 0 2



5.4 Srovnání frekvecí genotypů a alel u prasat různých plemen v komerčních chovech Tab.č.37 Distribuce genotypů a alel lokusu FUT 1 u prasat různých plemen Soubor Prasata různých plemenkomerční chovy

n

431

Genotyp FUT 1 A/A ks 41 % 9,5

A/G 178 41,3

G/G 212 49,2

P

42

49

9



52

Tab.č.38 Distribuce genotypů a alel lokusu MUC 4 u prasat různých plemen Soubor Prasata různých plemenkomerční chovy

n

431

Genotyp MUC 4 A/A A/B ks 269 121 % 62,4 28,1

B/B 41 9,5

P

5

59

36


Rozdíl mezi skutečnou hodnotou frekvence alel a predikcí je průkazný na hladině významnosti 0,05, hodnota naměřeného X2 je 7,802 > tab. hodnota X2 5,99, pro hladinu významnosti 0,05.

5.5 Srovnání frekvecí genotypů a alel u prasat plemene PČP v genové rezervě ČR Tab.č.39 Distribuce genotypů a alel lokusu FUT 1 u prasat plemene PČP Soubor

n

přeštické černostrakaté 55 prasegenetická rezerva


A/G 9 16,4

G/G 0 0

P

20

2

78


Populace je v rovnováze, hodnota X2 vypočítaného je 3,050 < tab. hodnota X2 5,99, pro hladinu významnosti 0,05 a 9,21 pro hladinu významnosti 0,01 Tab.č.40 Distribuce genotypů a alel lokusu MUC 4 u prasat plemene PČP Soubor

n

přeštické černostrakaté 55 prasegenetická rezerva

Genotyp MUC 4 A/A A/B ks 33 22 % 60 40

B/B 0 0

P

4

64

32


Rozdíl mezi skutečnou hodnotou frekvence alel a predikcí je průkazný na hladině významnosti 0,05, hodnota naměřeného X2 je 6,250 > tab. hodnota X2 5,99, pro hladinu významnosti 0,05.

53

5.6 Srovnání frekvecí genotypů a alel u prasat plemen LW a L v mateřských chovech v ČR Tab.č.41 Distribuce genotypů a alel lokusu FUT 1 u kanců LW Plemeno

n

Mateřské chovy ČR 48 Large whitekanci


A/G 17 35,4

G/G 30 62,5

P

32

64

4


Populace je v rovnováze, hodnota X2 vypočítaného je 1,299 < tab. hodnota X2 5,99, pro hladinu významnosti 0,05 a 9,21 pro hladinu významnosti 0,01 Tab.č.42 Distribuce genotypů a alel lokusu FUT 1 u kanců LW Plemeno

n

Mateřské chovy ČR 48 Large whitekanci


B/B 9 18,8

P

25

25

50


Rozdíl mezi skutečnou hodnotou frekvence alel a predikcí je průkazný na hladině významnosti 0,05, hodnota naměřeného X2 je 6,151 > tab. hodnota X2 5,99, pro hladinu významnosti 0,05. Tab.č.43 Distribuce genotypů a alel lokusu FUT 1 u prasnic LW Plemeno

n

Mateřské chovy ČR 77 Large whiteprasnice


A/G 33 42,9

G/G 42 54,5

P

36

58

6



Tab.č.44 Distribuce genotypů a alel lokusu FUT 1 u prasnic LW Plemeno

n

Genotyp MUC 4 A/A A/B

54

B/B

Frekvence alel

Mateřské chovy ČR 77 Large whiteprasnice

ks %

22 28,6

36 46,8

19 24,6

P

27

50

23

A=0,519 B=0,481


Tab.č.45 Distribuce genotypů a alel lokusu FUT 1 u kanců plemene L Plemeno

n

Mateřské chovy ČR 19 landrassekanci

Genotyp FUT 1 A/A ks 0 % 0

A/G 4 21,1

G/G 15 78,9

P

19

80

1


Populace je v rovnováze, hodnota X2 vypočítaného je 1,247 < tab. hodnota X2 5,99, pro hladinu významnosti 0,05 a 9,21 pro hladinu významnosti 0,01 Tab.č.46 Distribuce genotypů a alel lokusu MUC 4 u kanců plemene L Plemeno

n

Mateřské chovy ČR 19 landrassekanci


B/B 8 42,1

P

33

18

49



5.7 Srovnání frekvecí genotypů a alel u prasat plemen PN a D v otcovských chovech v ČR Tab.č.47 Distribuce genotypů a alel lokusu FUT 1 u kanců plemene PN Plemeno

n

Otcovské chovy ČR 171 pietrain


A/G 71 41,5 41,6

55

G/G 85 49,7 49,7



Tab.č.48 Distribuce genotypů a alel lokusu FUT 1 u kanců plemene PN Plemeno

n

Otcovské chovy ČR 171 pietrain


A/B 38 22,2 21,6

B/B 2 1,2 1,5



Tab.č.49 Distribuce genotypů a alel lokusu FUT 1 u kanců plemene D Plemeno

n

Otcovské chovy ČR 102 duroc


A/G 49 48 49,4

G/G 32 31,4 30,7



Tab.č.50 Distribuce genotypů a alel lokusu MUC 4 u kanců plemene D Plemeno

n

Otcovské chovy ČR 102 duroc


A/B 8 7,8 7,5

B/B 0 0 0,2



Z výše uvedených zjištěných hodnot lze usoudit, že v souboru Farma A zastoupeném kanci plemen PN, ČL, ČBU a H je distribuce recesivní alely A genu FUT1 na spodní hranici frekvencí uváděných jinými autory pro odobné soubory prasat. Průměrná hodnota alelové frekvence alely A byla 0,15. Jiní autoři (Dvořák et al.,

56

a další) uvádějí hodnoty v rozmezí 0,17 – 0,21. V našem souboru dosahovalo nejvyšších hodnot alelové frekvence pro alelu A plemeno ČBU. Soubor Farma B složený z deseti linií kanců plemene duroc ukazuje odlišné hodnoty. Frekvence recesivní alely A pro FUT1 v celém souboru byla 0,453, tj. trojnásobně vyší než u souboru prasat různých plemen Farma A. Nejvyšší frekvence alely A byla nalezena u linie Dinar (0,666), Durman (0,600) a Druid (0,580). Tyto hodnoty násobně překračují uváděné průměrné hodnoty souborů složených z různých plemen. Jsou naopak v korelaci s výsledkem šetření souboru Otcovské chovy ČR plemeno duroc, kde byla zjištěna hodnota frekvence alely A = 0,446. Ostatní plemena souborů Otcovské chovy ČR a Mateřské chovy ČR nevykazovala odchylky od ve zdrojích uváděných hodnot. Vysoké zastoupení recesivní alely A pro FUT1 bylo sledováno u souboru přeštické černostrakaté – genet. rezerva ČR, když frekvence s hodnotou 0,882. Tato hodnota výrazně ovlivňovala celkový průměr alelové frekvence všech vyšetřovaných souborů. Z výsledků vyplývá, že plemena duroc a PČP vykazují nadprůměrnou frekvenci alely A, a lze předpokládat také vyšší odolnost selat těchto plemen proti onemocněním způsobeným E. coli fimbriálního typu F18. Tvrzení o vyšší odolnosti plemene duroc podporuje také fakt, že v jediném ze souborů - Farma B byli sledováni recesivní homozygoti v obou genech FUT1 a MUC4 najednou. Tuto vlastnost mělo 22 kanců z celkového počtu 114, tj. 19,3%. K distribuci recesivní alely A pro gen MUC4 je komentář následující: frekvence alely A v celém souboru byla 0,725 a odpovídá rozmezí hodnot uváděných jinými autory, intervalu 0,520 – 0,800. Vypočtený průměr je ovlivněn především vysokou hodnotou alelové frekvence u sledovaných souborů kanců plemene duroc. V souboru Farma B byla naměřena hodnota frekvence alely A = 0,958, obdobně kanci souboru Otcovské chovy ČR plemeno duroc vykazovali frekvenci A = 0,961. Také prasata plemene přeštické černostrakaté dosahují nadprůměrných hodnot výskytu alely A pro MUC4, obdobně jako pro FUT1 s frekvencí A = 0,800. Relativně nízký podíl alely A vykazoval oubor prasnic LA z Mateřských chovů ČR, když frekvence A byla jen 0,421. Z výledků lze vyvozovat, že plemeno duroc se jeví potenciálně jako vysoce odolné proti nákazám selat způsobeným E. coli s fimbriálními faktory F18 a F4. Přitom ale platí, že některé patogeny E. coli tyto faktory virulence netvoří vůbec. Podíl takových kmenů může být kolem 25%. Dále již bylo uvedeno, že v posledních letech dochází ke 57

zvýšenému výskytu izolátů s adheziny F5, F6 a F41, proti kterým sledovaná rezistence nechrání (Drábek a Dubanský, 2001). Vysoké zastoupení recesivní alely v obou genech u PČP podporuje doměnku, že původem a místem rozšíření recesivní alely A pro FUT1 je i vzhledem k relativní blízkosti genotypu Sus Crofa L. a PČP evropský kontinent, když bodová mutace AA307 nebyla u asijkých plemen pozorována (Wu et al., 2007). Závěrem lze doporučit šlechtitelům a chovatelům prasat věnovat problematice rezistence/

vnímavosti

pozornost

s přihlédnutím

k možnému

riziku

ovlivnění

produkčních vlastností, ačkoliv dosavadní studie potvrdily negativní korelaci pouze u frekvence alely A pro gen FUT1 a výšky hřbetního tuku (San et al., 2003).

58

6. ZÁVĚR Cílem práce bylo sledovat variabilitu v genech FUT1 a MUC4. Zmíněné bialelické lokusy nesou genetickou informaci o vnímavosti a odolnosti k onemocněním sajících selat a selat po odstavu, která jsou vyvolávána patogenními kmeny Escherichia coli tvořícími adheziny - faktory virulence nebo také kolonizačními faktory F18 a F4. Adheziny umožňují přichycení bakterií na povrchu sluznice tenkého střeva selat a zpomalení jejich pasáže gastrintestinálním traktem. Kolibakteriózy mají ze zdravotního a tím i ekonomického hlediska značný význam. Příčinné bodové mutace jsou lokalizovny na 6. a 13. prasečím chromozómu. Byla posuzována genová variabilita v genech FUT1 a MUC4 u tří souborů prasat: Farma A – soubor 57 kanců různých plemen (PN, ČBU, ČL, H), Farma B soubor 96 kanců plemene duroc, dále soubor 431 prasat různých plemen českých produkčních chovů bez udání plemenného zastoupení, soubor 55 prasat plemene přeštické černostrakaté z genových rezerv ČR a soubory 48 kanců plemene LW, 77 prasnic LW a 19kanců L z mateřských chovů ČR a soubory 171 kanců plemene PN a 102 kanců plemene D z otcovských chovů ČR. Nejvyšší frekvenci recesivní alely A zakládající odolnost vůči onemocnění vyvolané ETEC fimbriotypu F18 pro FUT1 a rovněž recesivní alely A zakládající odolnost vůči onemocnění vyvolané ETEC fimbriotypu F4 pro MUC4 vykazovali kanci plemene duroc v rámci souborů Farma B a otcovských chovů ČR. Nadprůměrných hodnot dosahovala rovněž prasata plemene PČP. Sledované frekvence alel se zásadně nelišily od frekvencí udávaných jinými autory. Byly stanoveny rovněž frekvence genotypové a vyslovena predikce pro teoretické frekvence. Bylo testováno rozložení genotypů na HW rovnováhu populací. Byl zmíněn proces hledání příčinné mutace u lokusu MUC4, která se nadále upřesňuje, když dosavadní konsensus je výrazná asociace výskytu polymorfismu v genu MUC4

s genem

MUC4,

který

někteří

autoři

označují

jako

lokus

F4bcR

(Barbara.E.Straw et al., 2006). Byl zmíněn pravděpodobný původ mutace v evropském Sus Crofa L. Primitivní, původní plemena prasat vykazují vysoké alelové frekvence recesivních alela i genotypovou frekvenci recesivních homozygotů AA. Naopak plemena asijská mutaci ve FUT1 na 307pb nemají.

59

Podle současných poznatků neexistuje korelace mezi variabilitou ve FUT1 a sledovanými užitkovými vlastnostmi, s vyjímkou výšky hřbetního tuku. Selekce prasat na odolnost proti kolibakteriózám je perspektivní a schůdná možnost ozdravění komerčních chovů prasat a zvýšení rentability produkce vepřového masa.

60

7. SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY BERNARDY J., Vakcinace sama o sobě vše nevyřeší. Zemědělec 04/2008 BIEHL L.G, HOEFLING D.C., Diagnosis and treatment of diarrhea in 7-to 14-day-old pigs. Journal of American Vet Medical Association188, 1986, p.1144-1146 CODDENS A., The possibility of positive selection for both F18(+)Escherichia coli and stress resistant pigs opens new perspectives for pig breeding. Vet Microbiology 126(13):210-5, 2008, ISSN 0378-1135 CODDENS et al., The age-dependent expression of the F18+ E. coli receptor on porcine gut epithelial cells is positively correlated with the presence of histo-blood group antigens. Veterinary Microbiology 122(3-4):332-41, 2007, ISSN 0378-1135 CUPÁKOVÁ Š., Rizika konzumace syrového kravského mléka. Veterinářství 51;2001, s.182-184. ČEPICA S., Možnosti molekulární genetiky při šlechtění prasat. Náš chov LXVII/1/2007, ISSN 0027-8068, 2007, s.88-93. DRÁBEK J. a DUBANSKÝ V., Zdravotní problematika prasat II. Bakteriální choroby. VFU Brno, 2001, ISBN 80-7305-423-X, s.241 DRÁPAL J. et al., Alimentární onemocnění, VVP: ALIM/2005/1/deklas/rev2 SZÚ Brno, 2005 DRAŽAN J. et al., Nemoci prasat. Státní zemědělské nakladatelství, Praha, 1987, 07063-87, s.240 FILISTOWICZ M., JASEK S., Preliminary Study on the Effect of FUT1 and MUC4 Loci on the Fertility of Sows and on Breeding Success of Piglets. Acta fytotechnica et zootechnica-mimoriadne číslo, Nitra, 2002, s. 23 IMBERECHTS H. et al., Characterisation of F18 fimbrial genes fed E and fed F involved in adhesion and lenght of enterotoxemicEscherichia coli strain 107/86. Microbiological Pathogenetics 21, 1996, p. 183-192 KNOLL A., Detekce polymorfismu a analýza struktury vybraných kandidátních genů u prasete a jejich mapování. Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně, Brno, 2003, s.157 MEIJERIK E. et al., A molecular test for the detection of E. coli F18 receptors: a breakthrough in the struggle against edema disease and post-weaning diarrhea in swine. Schweiz Arch Tierheilkd 139(11):479-84, 1997, ISSN 0036-7281 PYTHON P. et al., Fine-mapping of the intestinal receptor locus for enterotoxigenic Escherichia coli F4ac on porcine chromosome 13. Animal Genetics 33(6):441-7, 2002, ISSN 0268-9146.

61

PENG Q.L. et al., The g.243A>G mutation in intron 17 of MUC4 is significantly associated with susceptibility/resistance to ETEC F4ab/ac infection in pigs. Animal Genetics 38(4):397-400, 2007, ISSN 0268-9146 SAN Y. H. et al., Association of polymorphism in alpha (1,2) fucosyltransferase gene with growth performance of pig population in Taiwan. Asian-Australasian Journal of Animal Sciences, vol. 16, no1, 2003, , pp. 100-103, ISSN 1011-2367 STRAW B.E. et al., Diseases of Swine. Blackwell Publishing, Iowa USA, 9th Edition, 2006 1145p., ISBN-13 978-0-8138-1703-3 ŠMARDA J. et al., Metody molekulární biologie. MU PF, 1. vydání, Brno, 2005, ISBN 80-210-3841-1, s.188 URBAN T., Virtuální svět genetiky III. Genetika kvantitativních znaků. Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně, Brno, 2006. VOKURKA M., Praktický slovník medicíny, vyd. Maxdorf, s.r.o., Praha, 7. rozšířené vydání, 2002. WANG Y. et al., Characterization of polymorphisms of transferrin receptor and their association with susceptibility to ETEC F4ab/ac in pigs. Journal of Animal Breeders Genetics 124(4):225-9 , 2007, ISSN 0931-2668. WU S.L. et al., Analysis of genetic variations at M857 locus of the a1-Fucosy- transferase (FUT1) ORF in pigs. Yi Chuan 29(9):1071-6, 2007, ISSN 0253-9772 ZHANG B. et al., Investigation of the porcine MUC13 gene: isolation, expression, polymorphisms and strong association with susceptibility to enterotoxigenic Escherichia coli F4ab/ac. Animal Genetics 39(3):258-66, ISSN 1365-2052.

62

8. SEZNAM TABULEK Tab.č.1 Antigeny baktérií Escherichia coli (Dražan et al., 1987) Tab.č.2 Převažující sérotypy E. coli u fatálních případů průjmových onemocnění selat po odstavu a edémové choroby ve švýcarských chovech prasat ( Imberechts et al., 1994) Tab.č.3 Farma A – zjištěné genotypy kanců různých plemen Tab.č.4 Farma B – zjištěné genotypy kanců plemene duroc Tab.č.5 Distribuce genotypů a alel lokusu FUT 1 u kanců různých plemen Tab.č.6 Distribuce genotypů a alel lokusu MUC 4 u kanců různých plemen Tab.č.7 Distribuce genotypů a alel lokusu FUT 1 u kanců různých plemen Tab.č.8 Distribuce genotypů a alel lokusu MUC 4 u kanců různých plemen Tab.č.9 Distribuce genotypů a alel lokusu FUT 1 u kanců Tab.č.10 Distribuce genotypů a alel lokusu MUC 4 u kanců Tab.č.11 Distribuce genotypů a alel lokusu FUT 1 u kanců Tab.č.12 Distribuce genotypů a alel lokusu MUC 4 u kanců Tab.č.13 Distribuce genotypů a alel lokusu FUT 1 u kanců Tab.č.14 Distribuce genotypů a alel lokusu MUC 4 u kanců Tab.č.15 Distribuce genotypů a alel lokusu FUT 1 u kanců Tab.č.16 Distribuce genotypů a alel lokusu MUC 4 u kanců Tab.č.17 Distribuce genotypů a alel lokusu FUT 1 u kanců plemene duroc Tab.č.18 Distribuce genotypů a alel lokusu MUC 4 u kanců plemene duroc Tab.č.19 Distribuce genotypů a alel lokusu FUT 1 u kanců plemene duroc Tab.č.20 Distribuce genotypů a alel lokusu MUC 4 u kanců plemene duroc Tab.č.21 Distribuce genotypů a alel lokusu FUT 1 u kanců plemene duroc Tab.č.22 Distribuce genotypů a alel lokusu MUC 4 u kanců plemene duroc Tab.č.23 Distribuce genotypů a alel lokusu FUT 1 u kanců plemene duroc Tab.č.24 Distribuce genotypů a alel lokusu MUC 4 u kanců plemene duroc Tab.č.25 Distribuce genotypů a alel lokusu FUT 1 u kanců plemene duroc Tab.č.26 Distribuce genotypů a alel lokusu MUC 4 u kanců plemene duroc Tab.č.27 Distribuce genotypů a alel lokusu FUT 1 u kanců plemene duroc Tab.č.28 Distribuce genotypů a alel lokusu MUC 4 u kanců plemene duroc Tab.č.29 Distribuce genotypů a alel lokusu FUT 1 u kanců plemene duroc Tab.č.30 Distribuce genotypů a alel lokusu MUC 4 u kanců plemene duroc Tab.č.31 Distribuce genotypů a alel lokusu FUT 1 u kanců plemene duroc

63

Tab.č.32 Distribuce genotypů a alel lokusu MUC 4 u kanců plemene duroc Tab.č.33 Distribuce genotypů a alel lokusu FUT 1 u kanců plemene duroc Tab.č.34 Distribuce genotypů a alel lokusu MUC 4 u kanců plemene duroc Tab.č.35 Distribuce genotypů a alel lokusu FUT 1 u kanců plemene duroc Tab.č.36 Distribuce genotypů a alel lokusu MUC 4 u kanců plemene duroc Tab.č.37 Distribuce genotypů a alel lokusu FUT 1 u prasat různých plemen Tab.č.38 Distribuce genotypů a alel lokusu MUC 4 u prasat různých plemen Tab.č.39 Distribuce genotypů a alel lokusu FUT 1 u prasat plemene PČP Tab.č.40 Distribuce genotypů a alel lokusu MUC 4 u prasat plemene PČP Tab.č.41 Distribuce genotypů a alel lokusu FUT 1 u kanců LW Tab.č.42 Distribuce genotypů a alel lokusu FUT 1 u kanců LW Tab.č.43 Distribuce genotypů a alel lokusu FUT 1 u prasnic LW Tab.č.44 Distribuce genotypů a alel lokusu FUT 1 u prasnic LW Tab.č.45 Distribuce genotypů a alel lokusu FUT 1 u kanců plemene L Tab.č.46 Distribuce genotypů a alel lokusu MUC 4 u kanců plemene L Tab.č.47 Distribuce genotypů a alel lokusu FUT 1 u kanců plemene PN Tab.č.48 Distribuce genotypů a alel lokusu FUT 1 u kanců plemene PN Tab.č.49 Distribuce genotypů a alel lokusu FUT 1 u kanců plemene D Tab.č.50 Distribuce genotypů a alel lokusu MUC 4 u kanců plemene D

64

MENDELOVA ZEMĚDĚLSKÁ A LESNICKÁ UNIVERZITA V BRNĚ AGRONOMICKÁ FAKULTA DIPLOMOVÁ PRÁCE

Recommend Documents