MENDELOVA ZEMĚDĚLSKÁ A LESNICKÁ UNIVERZITA V BRNĚ AGRONOMICKÁ FAKULTA
DIPLOMOVÁ PRÁCE
BRNO 2007
Marta Kubicová
Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav technologie potravin
Analýza vybraných polyfenolických látek v pivu technikou HPLC Diplomová práce
Vedoucí práce:
Vypracoval:
Ing. Tomáš Gregor
Marta Kubicová Brno 2007
PROHLÁŠENÍ
Prohlašuji, že jsem diplomovou práci na téma Analýza vybraných polyfenolických látek v pivu technikou HPLC vypracovala samostatně a použila jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém seznamu literatury. Diplomová práce je školním dílem a může být použita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího diplomové práce a děkana AF MZLU v Brně.
dne……………………………......... podpis diplomanta………………….
PODĚKOVÁNÍ
Děkuji především Ing. Tomáši Gregorovi, Ph.D. za lidský přístup, cenné připomínky k práci a trpělivost. Ing. Haně Šulcerové patří dík za pomoc při zpracování dat ze senzorického hodnocení a panu Dušanu Táborskému, vedoucímu výrobního oddělení pivovaru Vyškov, za poskytnutí vzorků a příjemnou spolupráci. V neposlední řadě patří velký dík mé rodině.
Abstrakt
Práce se zabývá problematikou polyfenolů jak v hotovém pivu tak i v meziproduktech při výrobě: sladině, mladině, zeleném pivu, chmelu a sladu. Vlivem polyfenolů na varní proces a na stabilitu skladovaného piva. Dále pojednává také o působení polyfenolů na lidské zdraví. Cílem je teoreticky se seznámit s různými metodami stanovení a následně vybrat a zavést vhodnou metodu použitelnou v podmínkách laboratoře Ústavu technologie potravin, a to vzhledem k přístrojovému vybavení a dostupnosti chemikálií a financí. Předpokladem pro zvládnutí je znalost pivovarského procesu, klasifikace jednotlivých polyfenolických látek a metody stanovení celkových polyfenolů, jejich skupin a jednotlivých složek.
Klíčová slova: pivo, polyfenoly, chmel, zdraví, slad
Anotation
The work deals with the issue of polyphenols both in finished beer and in semi products during the production: beer wort, hopped wort, green beer, hops and malt; and the influence of polyphenols on the brewing process and the stability of stored beer. Further, it deals with the effects of polyphenols on human health. The objective of this work is to theoretically apprise oneself of various methods of overall polyphenols assessment and subsequently choose and implement a suitable method applicable in laboratory conditions of Ústav technologie potravin (Institute of food technology) with respect to the device equipment and availability of chemicals and financial resources. Good knowledge of the brewing process is required as well as classification of particular polyphenolic elements and methods of assessment of overall polyphenols, their groups and individual components.
Keywords: beer, polyphenols, hop, healt, malt
Obsah 1 ÚVOD............................................................................................................................ 9 2 LITERÁRNÍ PŘEHLED ............................................................................................. 10 2.1. Pivovar Vyškov.................................................................................................... 10 2.2. Chemické složení polyfenolů............................................................................... 10 2.3. Původ polyfenolů v pivu...................................................................................... 16 2.3.1 Ječmen ........................................................................................................... 16 2.3.2 Chmel............................................................................................................. 18 2.3.3 Chemické změny v průběhu vaření piva........................................................ 19 2.3.3.1 Typy zákalů piva..................................................................................... 21 2.3.3.2 Stabilizace............................................................................................... 22 2.3.3.3 Stárnutí piva............................................................................................ 23 2.4 Pivo a zdraví ......................................................................................................... 23 2.4.1 Pivo jako celek............................................................................................... 23 2.4.2 Polyfenoly...................................................................................................... 24 2.5 Stanovení polyfenolů v pivu ................................................................................. 27 2.5.1 Celková antioxidační kapacita piva a meziproduktů ..................................... 27 2.5.1.1 Metoda FRAP (Ferric Reducing Ability of Plasma) .............................. 27 2.5.1.2 Metoda spoluoxidace β–karotenu v linoleátovém modelovém systému 27 2.5.1.3 Chemiluminiscence................................................................................. 28 2.5.2 Celkové polyfenoly........................................................................................ 28 2.5.2.1 Metoda dle EBC...................................................................................... 28 2.5.2.2 Metoda dle Folin – Ciocaulteau.............................................................. 28 2.5.3 Skupiny polyfenolů........................................................................................ 29 2.5.3.1 Anthokyanogeny dle Harrise a Ricketse................................................. 29 2.5.3.2 Tanoidy dle Chapona .............................................................................. 29 2.5.3.3 Stanovení flavonoidů .............................................................................. 29 2.5.4 Jednotlivé látky.............................................................................................. 29 2.5.4.1 GC........................................................................................................... 30 2.5.4.2 HPLC ...................................................................................................... 30 3 CÍL PRÁCE ................................................................................................................. 32 4 MATERIÁL A METODY........................................................................................... 33 4.1 Várka z níž byly odebrány vzorky k analýze........................................................ 33 4.2 Stanovení celkových fenolických látek metodou Folin – Ciocaulteau................. 34 4.2.1 Princip............................................................................................................ 34 4.2.2 Použité chemikálie a roztoky......................................................................... 34 4.2.3 Přístroje a zařízení ......................................................................................... 34 4.2.4 Postup............................................................................................................. 34 4.2.4.1 Kalibrace na kyselinu ferulovou ............................................................. 34 4.2.4.2 Měření vzorků......................................................................................... 35 4.3 Stanovení polyfenolů chromatograficky............................................................... 35 4.3.1 Princip............................................................................................................ 35 4.3.2 Použité chemikálie a roztoky......................................................................... 35 4.3.3 Přístroje a zařízení ......................................................................................... 36 4.3.4 Postup............................................................................................................. 37 4.3.4.1 Volba vhodného sorbentu ....................................................................... 37 4.3.4.2 Příprava standardu a kalibrační křivky ................................................... 37 4.3.4.3 Měření vlastních vzorků ......................................................................... 38 4.4 Senzorické hodnocení ........................................................................................... 38 4.4.1 Postup............................................................................................................. 38
5 VÝSLEDKY A DISKUZE.......................................................................................... 39 5.1 Stanovení celkových fenolických látek metodou Folin – Ciocaulteau................. 39 5.2 Stanovení polyfenolů chromatograficky............................................................... 42 5.2.1 Zavedení metody............................................................................................ 42 5.2.2 Měření vzorků a výsledky.............................................................................. 46 5.3 Senzorické hodnocení ........................................................................................... 48 6 ZÁVĚR ........................................................................................................................ 50 7 POUŽITÁ LITERATURA .......................................................................................... 51 Příloha 1.......................................................................................................................... 57 Seznam obrázků.......................................................................................................... 57 Příloha 2.......................................................................................................................... 58 Seznam tabulek ........................................................................................................... 58 Příloha 3.......................................................................................................................... 61 Seznam grafů .............................................................................................................. 61
1 Úvod
1 ÚVOD
Pravděpodobnou kolébkou piva je Mezopotámie, kde Sumerové první pivo vyrobili náhodou někdy ve 4. tisíciletí před Kristem. Na území dnešní ČR vařili pivo už staří Keltové, ale objev chmelení piva se připisuje právě Slovanům (Basařová G., 2003). Pivo bylo v naší provenienci vždy velmi oblíbené a jeho obliba neklesá ani dnes. ČR patří se svými 162 litry piva na osobu a rok mezi špičku ve světové spotřebě. Pivo je isotonický roztok, složený z makromolekul bílkovin, sacharidů, nukleových kyselin, lipidů, vitaminů, minerálních látek. Zdroj energie představují sacharidy a alkohol. Díky širokému spektru polyfenolů (rostlinných antioxidantů) je pivo v centru zájmu mnoha světových výzkumných institucí. Polyfenoly mají význam jednak jako hořké látky dodávající hořkosti piva jemný charakter, jednak jako významný prvek ovlivňující koloidní stabilitu. V neposlední řadě se zkoumá jejich vliv na lidské zdraví díky jejich antioxidační aktivitě. Výzkum v této oblasti je velmi perspektivní a přinese jistě ještě mnohá překvapení. V budoucnu možná budou lékaři předepisovat pivo jako lék. V této souvislosti bych zakončila slovy pana Miloše Heide, sládka pivovaru Budějovický Budvar: „Nikdy jsme nechtěli, aby lidé pili piva hodně. Zato mne těší, když naše pivo střídmě, pro chuť a pro radost pije hodně lidí.“ (Basařová G., Hlaváček I., 1999).
9
2 Literární přehled
2 LITERÁRNÍ PŘEHLED
2.1. Pivovar Vyškov
Z historických pramenů se můžeme domnívat, že pivo se na vyškovsku vařilo už od středověku. Jako oficiální rok se však uvádí datum dokončení výstavby tamního pivovaru. A to rok 1680. Pivovar byl vybudován nařízením olomouckého biskupa Karla. Dnes je součástí Jihomoravské pivovary a. s. (www 3). Pivo je zde vyráběno klasickým způsobem, na dva rmuty. Slad je používán ze sladovny Záhlinice nebo CASTELLO Prostějov, chmel žatecký je ve formě granulí typ 90 a 45 a odrůdy Premiant a Sládek také jako extrakt na bázi CO2. Stabilizace piva se provádí u exportních piv pomocí stabilizačního přípravku Polyclar 10, což je nerozpustný zesítěný polyvinylpyrrolidon s extrémně vysokým poměrem povrchu k hmotnosti (Rehmanji M., Gopal Ch. et al., 2002 in Malinová, 2005). Pro piva určená k tuzemskému prodeji pivovar používá techniku stabilizace do ztracena, tj. bez regenerace stabilizačního prostředku, pomocí Stabiquick Strong. U silných piv pak ještě do ležáckého tanku přípravek Stabiquick Sedi. Vyráběná piva: Atlet, Desítka, Džbán, Březňák, Řezák, Havran, Generál, Bira, Jubiler a Exportní (www 3). Poslední vysoký výstav pivovaru činil v roce 2000 78 234 hl (www 1). Od této doby docházelo k poklesu až po loňský výstav, který činil činil 47 500 hl.
2.2. Chemické složení polyfenolů
Rostlinné polyfenoly jsou amorfní látky fenolické povahy vykazující stejné charakteristické vlastnosti jako je srážení roztoků želatiny a alkaloidů, tvorba tmavých sraženin se železitými solemi, oxidace v alkalickém prostředí, srážejí i soli těžkých kovů (proto se např. černý čaj doporučuje jako protijed otravy těžkými kovy) aj. V přírodě jsou značně rozšířené, chrání rostlinu před oxidačním stresem, dávají jí charakteristické zbarvení, plodům chuť a vůni. Konzumaci těchto rostlin býložravci
10
2 Literární přehled omezuje trpce svíravá chuť polyfenolů a jejich schopnost inhibovat trávicí enzymy. Mezi polyfenoly se zařazují sloučeniny obsahující v molekule jeden či více aromatických kruhů substituovaných jednou nebo více hydroxylovými skupinami a jejich funkční deriváty. Některé polyfenoly jsou toxické, prokarcinogenní, jiné naopak zdraví prospěšné pro své antioxidační, protizánětlivé, antialergické, antimikrobiální vlastnosti, případně pro svou estrogenní aktivitu (Stratil P., 2005). Protože je fenolických látek velmi mnoho, je roztřídění do jednotlivých skupin poměrně složité. Snad nejčastěji se setkáme s obecným tříděním podle počtu uhlíků do 9 hlavních skupin (viz. Tab. 1) (Velíšek J., 2002).
Tab. 1 Hlavní skupiny fenolových sloučenin Základní skelet
Počet C
Skupina
C1
6
jednoduché fenoly, benzochinony
C6 – C1
7
fenolové kyseliny
C6 – C2
8
acetofenony, fenyloctová kyselina
C6 – C3
9
C6 – C4
10
naftochinony
C6 – C1 – C6
13
xanthony
C6 – C2 – C6
14
stilbeny, antrachinony
C6 – C3 – C6
15
flavonoidy, isoflavonoidy
(C6 – C3)2
18
ligniny, neolignany
(C6 – C3 – C6)2
30
bioflavonoidy
(C6 – C3 – C6)n
n
flavolany
(C6 – C3)n
n
lignin
skořicové kyseliny, fenylpropeny, kumariny, chromony
Jiné dělení používá ve své práci Kellner a spol. A to dělení z hlediska hlavních zástupců polyfenolů v pivu (viz. Tab. 2,3).
11
2 Literární přehled Tab. 2 Hlavní skupiny polyfenolů piva flavonoidy kumarinové deriváty chinony a ubichinony štěpné produkty šestinových kyselin deriváty kyseliny chlorgenové volné fenolové kyseliny
Tab. 3 Dělení flavonoidů flavonoidy
1) chalkony 2) flavanoidy
a) flavony, izoflavony b) flavandioly c) flavanoly d) flavanony e) izoflavony, neoflavony
3) flavonoly 4) anthokyanidiny (Kellner V., Čulík J. a spol., 2003).
Nejnovější a nejjednodušší rozdělení publikoval Ros, který rozdělil polyfenoly na dvě hlavní skupiny: 1) složky o nízké molekulové hmotnosti tedy fenolické kyseliny, které zahrnují: a) deriváty kyseliny benzoové (kys. salicylová, gentisová, gallová, syringová, p–hydroxybenzoová, protokatechová, vanilinová) b) deriváty kyseliny skořicové (kyselina kávová, sinapová, ferulová, p–kumarová) (viz. Obr. 1) 2) složky o vyšší molekulové hmotnosti tedy skupina flavonoidů, které se dále dělí: a) flavany b) anthokyany c) flavonoly
12
2 Literární přehled OH R1
R4 R2
R 3
COOH
Deriváty kys. p-hydroxybenzoové k. p-hydroxybenzoová k.protokatechová k. gallová k. vanilinová k. syringová
R 5
C H
R1
R2
H OH OH H OCH3
H H OH OCH3 OCH3
C H
Deriváty kyseliny skořicové k. skořicová k. p-kumarová k. kávová k. ferulová k. sinapová
COOH
R3
R4
R5
H H H H OCH3
H OH OH OH OH
H H OH OCH3 OCH3
Obr. 1 Deriváty kyselin p–hydroxybenzoové a skořicové (Čepička J., Karabín M., 2002)
Volné aromatické kyseliny jsou v pivu obsaženy v menší míře a z pivovarského hlediska nejsou tak významné. Flavonoidy jsou nejvíce zastoupenou skupinou a význam z hlediska tvorby zákalů je velký. Jejich struktura je odvozena od heterocyklického flavanu (viz. Obr. 2)
O A
B
C Obr. 2 Flavan
Flavonoidy jsou v neutrálním a kyselém prostředí bezbarvé, v alkalickém intenzívně žluté až žlutooranžové barvy. Mají výrazné antioxidační a volné radikály zhášející vlastnosti, účinek je synergický s vitamínem C. Z chmele se do piva dostávají též flavonoidy prenylované, z nichž až 80% tvoří xanthohumol. Ten byl ve chmelových hlávkách objeven již roku 1913. Dlouhou dobu se pivovarnický průmysl zabýval jen jeho vlivem na chuť piva. Ukazuje se však, že jeho účinek proti nádorovým buňkám karcinomu prsu, tlustého střeva, vaječníků a prostaty bude velmi významný (Bognár P., 2005).
13
2 Literární přehled Prekurzory flavonoidů se nazývají chalkony. U nich nedošlo k úplné cyklizaci na flavonoidní skelet. Jsou to vpodstatě deriváty fenylstyryl ketonů. V přírodě se zpravidla vyskytují více či méně hydroxylovány. Číslování pozic substituentů na jádrech je opačné než u většiny ostatních flavonoidů (viz. Obr. 3).
3 2
4 B
5´ 4´
6´ 6
A
5
3´ 2´ O Obr. 3 Chalkon
Mezi flavonoly (viz. Obr. 4) patří také barvivo kvercetin (viz. Obr. 5), vyskytující se hojně v přírodě např. ve chmelu. Je oranžově hnědý a je aglykonem několika glykosidů, např. rutinu. V glykosidické formě se v mladině a pivu nachází i kempferol. Tyto glykosidy mohou teoreticky snadno přecházet při chmelovaru do mladiny, ale neděje se tak a v hotovém pivu se nalézají v nízkých koncentracích. Přes svoji vysokou antioxidační aktivitu se na redukční síle mladiny podílejí malou měrou (Čepička
J.,
Karabín
M.,
2002).
Dále
sem
patří
katechin,
proanthokyanidiny.
R 2´ HO
7
8
C
A 6
3
4
5 OH
B
1´ 2
O
6´ OH
O
Obr. 4 Flavonol
14
3´
OH 4´ 5´
R
epikatechin,
2 Literární přehled
4´ OH HO
O
7
3´ OH 3
5
OH
OH Obr. 5 Kvercetin
Anthokyanidin (viz. Obr. 6) je aglykonová část anthokyanů. Jako cukr zde většinou figuruje glukosa či galaktosa. Dosud je známo asi 25 aglykonů a 300 anthokyanů. Anthokyany zodpovídají za barvu rostlin. Při různém pH mohou být zbarveny od červené až po modrou.
B
+ O A
OH Obr. 6 Anthokyanidin
Flavanoidy jsou deriváty fenylchromanu a odvozují se od 3 základních skeletů: flavan, isoflavan, neoflavan (viz. Obr. 7).
5
4 3
6
2 7
8
2´ 3´
O
4´
6´
O
5´
Obr. 7 Flavan, isoflavan, neoflavan
15
O
2 Literární přehled V přírodě se nejčastěji vyskytují flavany, velmi vyjímečně neoflavany. V rostlinách fungují flavanoidy jako žlutá, červená až modrá barviva (Moravcová J., 2006).
2.3. Původ polyfenolů v pivu
Polyfenoly se jako sekundární metabolity rostlin do piva dostávají z chmele a ječmene, přičemž varním procesem dochází ke změnám v chemické struktuře. K dalším změnám pak dochází v průběhu stárnutí piva. Schopnost polyfenolů reagovat s bílkovinami na komplexy, které se vylučují z roztoku zapřičiňuje zhoršování koloidní stability, zároveň je však nenahraditelná při chlazení mladiny a vzniku horkých kalů, kdy se mladina čiří. Přínosem pro organoleptickou stabilitu a lidské zdraví jsou naopak antioxidační schopnosti fenolických látek (Dvořáková M., Dostálek P. a spol., 2006).
2.3.1 Ječmen
Ječmeny obsahují 80 – 88% sušiny, kterou tvoří z 60 – 65% škroby, z 10 – 12% dusíkaté látky a zbytek připadá na nízkomolekulární sacharidy, neškrobnaté polysacharidy, minerální látky a tuky. Polyfenoly tvoří 0,1 – 0,6% sušiny (Kosař K., 2000).
Hlavní skupiny sladových polyfenolů dle Harrise a Rickettse jsou: 1) deriváty 5,7 dihydroxyflavanu a) leukoanthokyanidiny Ve formách: aa) monomerní glykosidy (anthokyaniny) ab) biflavonoidní proanthokyanidiny (anthokyanogeny) ac) polymerní anthokyaniny ad) oxidované a polymerní formy základních flavonoidních složek
16
2 Literární přehled b) katechiny Hlavní zástupci jsou katechin, gallokatechin a stereoisomery epikatechin, epigallokatechin. Molekuly katechinů mezi sebou kondenzují a tyto produkty mají tzv. tříslovinnou sílu. To je schopnost srážet bílkoviny, což je v pivovarnictví významné. Zvláště při
chmelovaru.
Katechiny kondenzují
mezi
sebou
a
tyto
vysokomolekulární komplexy pak sráží bílkoviny. c) kumarinové deriváty Zejména jde o deriváty laktonů kyseliny o–hydroxyskořicové. Tyto látky jsou regulátory klíčení. Kumarin v máčecí vodě ječmene působí jako inhibitor růstu kořínků ( Moštek J., 1975). 2) deriváty kyseliny chlorgenové Enzymatickou hydrolýzou kyseliny chlorgenové vznikají kyseliny chinová a kávová. 3) aromatické hydroxykyseliny a štěpné produkty testinových kyselin Jde o deriváty kyseliny benzoové a skořicové. 4) chinony Mohou být toxické a způsobovat sněť. 5) ubichinony Jinak zvané též lipoidní chinony či koenzym Q (Harris G, Ricketts R. W., 1958 in Moštek J., 1975).
Tak jako v ostatních rostlinách, i v ječmeni je většina polyfenolů vázána na cukernou složku. Zde to nejčastěji bývá D–glukosa, L–rhamnosa, může to být i kyselina glukuronová, galaktosa, rutinosa (Rosa Z., 2006; Slanina J., Táborská E., 2004). V obilce jsou lokalizovány hlavně v obalových částech a v aleuronové vrstvě. Zde některé fungují jako inhibitory klíčení a při máčení se částečně vyluhují (viz. kumarinové deriváty). Klíčením tedy obsah polyfenolů klesá, avšak při hvozdění se Maillardovou reakcí vytváří nové a v konečné fázi slad obsahuje více polyfenolů než ječmen (Selecký R., Šmogrovičová D., 2006). Nepřímo úměrně na sobě závisí obsah polyfenolů a bílkovin. Podskupina polyfenolů zvaná anthokyanogeny je v aleuronu vázaná na bílkovinu hordein. Zahřátím v kyselém prostředí, tedy při rmutování, kdy se pH pohybuje kolem 5,5, se mění na barevné anthokyanidiny a tím se podílí na barvě piva (Krofta K., 2006). 17
2 Literární přehled Složitější polyfenoly s větší molekulou mají tzv. tříslovinnou sílu, tj.schopnost tvořit s bílkovinami komplexy, které pak vypadávají z roztoku (viz. katechiny). Tato síla je u ječných polyfenolů větší než u chmelových. Je důležitá zejména při chlazení mladiny, kdy vzniká lom mladiny. Komplexy bílkovin a polyfenolů na sebe strhávají také nečistoty a mladina se tak vyčeří. Nezreagované polyfenoly zůstávají v pivu a mohou i nadále reagovat za tvorby chladových zákalů, což je však nežádoucí. Proto se zbytky z piva odstraňují.
2.3.2 Chmel
O chmelu se říká, že je duší piva, protože mu dává charakteristickou hořkost a aroma. Sklizený chmel obsahuje 8 – 12% vody, 40 – 50% celulózy, 1 – 3% lipidů, 12 – 15% dusíkatých látek a 6 – 8% minerálních látek. Polyfenoly patří spolu s 14 – 20% pryskyřic a silic mezi cenné složky. Tvoří 2 – 6% sušiny, v závislosti na odrůdě, ročníku, podnebí a agrotechnice. Nejvyšší obsahy mívají jemné aromatické odrůdy jako je žatecký poloraný červeňák. Ten dosahuje hodnot až 4,5 – 6,0%. Ostatní odrůdy (Agnus, Premiant, Bor…) dosahují maximálně hodnot do 4% (Rosa Z., 2006). Žatecký poloraný červeňák tvoří v České republice zhruba 93% z veškerých ploch osázených chmelem (www 2). Dosud bylo z chmele izolováno přes sto fenolických látek. A to metodami využívající vysokotlakou kapalinovou chromatografii (HPLC) ve spojení s diodovým detektorem záření (DAD) (Forster A., 1999). Nejčetněji zastoupenou složku tvoří flavonoidy. Další významné složky, avšak méně zastoupené jsou: katechin, epikatechin, rutin, kvercetin, kempferol, xanthohumol. Xanthohumol má některé vlastnosti, pro které se řadí mezi pryskyřice, ale po chemické stránce náleží mezi prenylované flavonoidy (Hofta P., 2004). Odrůda Agnus je na xanthohumol velmi bohatá, šištice ho obsahují 0,8 – 1,1%, čímž se řadí mezi špičku světových odrůd. Obsah celkových polyfenolů je však nízký (Rosa Z., 2006). Chemické složení polyfenolů chmele je obdobné jako sladových, avšak mění se poměr jednotlivých složek. Chmelové polyfenolické látky mají vliv na barvu a koloidní stabilitu piva, podílí se na vylučování hořkých kalů a ovlivňují charakter hořkosti.
18
2 Literární přehled Do mladiny přejde více polyfenolů použije–li se ke chmelení chmelových šištic nebo pelet. U chmelových extraktů je přechod do mladiny nižší. Většina těchto látek je totiž obsažena v listenech (Selecký R., Šmogrovičová D., 2006).
Na obsahu polyfenolů v pivu se podílí chmel asi z jedné pětiny a slad ze čtyř pětin (Kosař K., 2000). Racek tento poměr demonstruje v grafu pro obsah antioxidantů v tmavých a světlých pivech (viz. Obr. 8). V tmavých pivech kromě polyfenolů přispívají k antioxidační aktivitě i melanoidiny vzniklé hvozděním při vysokých teplotách (Racek J., 2001).
Obr. 8 Podíl sladových (1) a chmelových (2) antioxidantů ve světlých a tmavých pivech
Předpokládá se, že chmelové polyfenoly jsou účinnějšími antioxidanty než sladové, protože se při výrobě vaří mnohem kratší dobu a mají tak více zachovánu antioxidační aktivitu (Rosa Z., 2006).
2.3.3 Chemické změny v průběhu vaření piva
V průběhu vaření dochází k četným změnám, hlavně v době chmelovaru, kvašení, filtrace a stabilizace. Neméně významné jsou i reakce v procesu stárnutí piva. Tyto se projevují snížením senzorické stability dlouho skladovaného piva. Po chemické stránce se jedná hlavně o reakce izomerační, hydrolytické, kondenzační a oxidoredukční. Hydrolytickými reakcemi se štěpí glykosidy na příslušný cukr a aglykon. V pivovarském procesu nejsou významné a kvalitu piva též neovlivňují.
19
2 Literární přehled Při
chmelovaru
dochází
k nejznámější
izomerační
reakci,
k izomeraci
xanthohumolu na izoxanthohumol (viz. Obr. 9) (Čepička J., Karabín M., 2002).
HO
HO
OH
O
OH
OH
O-CH 3
O-CH 3
Obr. 9 Izomerace xanthohumolu na isoxanthohumol
Při chlazení mladiny dochází ke kondenzačním a polymeračním reakcím, zároveň se snižuje pH. Dochází tak k tvorbě vysokomolekulárních sloučenin schopných srážet bílkoviny mladiny. Tyto polymery mají tříslovinnou sílu, patří sem např. kondenzáty katechinů. Tvoří se polyfenol – bílkovinné komplexy, které se mohou vylučovat z roztoku a vytváří tak horké kaly, které se při tangenciálním nátoku do vířivé kádě usazují uprostřed kuželovitého dna. Tyto hořké kaly se po ochlazení mladiny při spílání do sklepa odstraňují. Podle Škacha hrubé kaly obsahují 40 – 70% bílkovin, 10 – 20% chmelových látek, 7 – 8% polyfenolů a 7 – 10% sacharidů (Škach J.). Vazba polyfenolů na bílkovinu se uskutečňuje na základě nekovalentních interakcí a tvorbou můstků mezi molekulami. Polyfenoly totiž obsahují dvě a více vazebných míst a ty reagují s vazebnými místy zákalotvorných bílkovin. Počet těchto míst
je v přímé souvislosti
s obsahem
prolinu
v molekule
(Siebert
K.
J.,
Troukhanova N. V. et al., 1996 in Čepička J., Karabín M., 2002). Pokud reagují slabými vazebnými interakcemi jako jsou vodíkové můstky, dojde ke vzniku chladového reversibilního zákalu. Pokud se vazba zpevní na kovalentní, vzniká zákal irreversibilní, nevratný. Oba typy zákalů patří mezi nebiologické, neohrožují tedy zdraví konzumenta, ale po senzorické stránce jsou nepřijatelné. Aby se této situaci předcházelo je nutné dodržovat správný postup přípravy mladiny s povařováním dílčích rmutů, optimální intenzitu a dobu chmelovaru a správný postup chlazení mladiny. Tyto úkony pokud jsou správně provedeny mají významný čiřící účinek. Tj. předchází vzniku zejména chladových zákalů.
20
2 Literární přehled 2.3.3.1 Typy zákalů piva
Biologické zákaly Dříve se pilo pivo nefiltrované i se zbytky kvasnic. Od začátku 20. stol. ovšem zákazník začal požadovat pivo čiré a proto se přistoupilo k filtraci piva. Odstraněním kvasinek se pivo stalo náchylné k pomnožení kontaminující mikroflóry. Tento problém se vyřešil zavedením pasterace.
Nebiologické zákaly Pivo jako složitá koloidní soustava během skladování prodělává mnoho změn, které dříve či později vedou k vylučování zákalů. Je to problém, který nastal snahou o prodloužení údržnosti piva. Dříve se pivo po vykvašení vypilo a neskladovalo. Nebiologický zákal chladový, reversibilní se v pivu tvoří při poklesu teplot na 0ºC. Po zahřátí na 20ºC se opět rozpustí. Tvoří jej malé částice o průměru 0,1 – 1,0 µm, které jsou spojeny vodíkovými můstky. Nebiologický zákal stálý, irrereversibilní se rozpouští až při teplotách 40 – 70ºC, což je při skladování piva nemyslitelné. Částice jsou větší (1 – 10 µm) a spojené pevnou kovalentní vazbou (Basařová G., 2005). Velký význam při vzniku těchto zákalů mají polyfenoly. Jejich reaktivita stoupá s molekulovou hmotností, s počtem hydroxylových skupin v molekule, záleží i na jejich pozici a geometrii. Dále se uplatňují polypeptidy. U této skupiny hraje roli též molekulová hmotnost, dále pořadí aminokyselin a obsah prolinu, methioninu a kyseliny glutamové. Méně důležitou roli hrají polysacharidy (typ β glukanu), jednoduché sacharidy, různé kovové ionty (Fe, Cu, Mn, Ca…), glykosidy polyfenolů (Basařová G., 2005). Přesný mechanismus tvorby zákalů není dosud znám. Ve stočeném pivu záleží na podmínkách prostředí (skladovací teplota, světlo, nárazy…). Zda jsou vhodné k tomu, aby se komplex z roztoku vyloučil. Proto se zákalotvorné částice z hotového piva odstraňují. A to hlavně při výrobě exportních piv, kdy zákazník žádá až 18ti měsíční záruku na trvanlivost. Proto se pivo stabilizuje.
21
2 Literární přehled 2.3.3.2 Stabilizace piva
Stabilizace se provádí na principu adsorpce, pomocí enzymatických preparátů nebo antioxidačních prostředků. K adsorpci se používají: a) bentonity Zachycují bílkoviny i polyfenoly, negativně ovlivňují chuť a pěnivost, dochází k vysokým neekonomickým ztrátám piva (Katzke, 1996). b) silikagely Adsorbují vysokomolekulární bílkoviny, jsou poměrně drahé, obvykle se ještě přidává vitamin C. Zároveň fungují jako filtrační prostředky. c) PVP (polyvinylpyrrolidon) Adsorbuje polyfenoly, dávkuje se buď tzv. na ztraceno do proudu piva při křemelinové filtraci nebo je naplavován ve speciálním filtru a pak regenerován.
Enzymatická stabilizace se používá jako doplněk adsorpčních a srážecích metod. Enzymy štěpí složité bílkoviny a omezují tak tvorbu zákalů. Dávkují se přímo do ležáckého tanku a určitý podíl zůstává i ve stočeném pivu po pasteraci.
Antioxidační prostředky brání vzniku zákalů tím, že zneškodňují singletový kyslík, který je jedním z iniciátorů vzniku zákalů (Hlaváček F., Lhotský A., 1972).
Dnes je nejčastější stabilizace na bázi zesítěného PVPP (Dvořáková M., Dostálek P. a spol., 2006). PVPP odstraňuje všechny skupiny polyfenolů, existuje však i přípravek Lucilite, který adsorbuje jen polyfenoly s více hydroxylovými skupinami v molekule. Platí totiž, že čím více hydroxylů, tím je polyfenol reaktivnější. V poslední době však výzkumy ukazují na pozitivní vliv polyfenolů na lidské zdraví a proto se možná budou z piva odstraňovat spíše jen zákalotvorné bílkoviny (Kellner V., 2004).
22
2 Literární přehled 2.3.3.3 Stárnutí piva
Senzorické stárnutí piva je jedním z problémů, jímž se současný pivovarský výzkum intenzivně zabývá. Platí tzv. radikálová teorie, která říká, že při stárnutí se uplatňují organické a anorganické sloučeniny podporující průběh radikálových procesů. Významné místo zaujímají sloučeniny kyslíku a jeho excitované stavy. Jedna z teorií totiž předpokládá vznik těkavých aldehydů, které jsou senzoricky nepřijatelné, katalytickou oxidací za spolupůsobení polyfenolů a kyslíku. Jiná přisuzuje vznik těchto látek přeměně alkoholů za účasti melanoidinů vznikajících ze sacharidů. Polyfenoly jsou také antioxidanty, které chrání pivo před stárnutím dvěma různými mechanismy. Jednak jako lapače volných radikálů a jednak jako inhibitory aktivních lipoxygenáz (Boivin P., Malanda M. et al., 1995 in Čepička J., Karabín M., 2002). Aktivita vzrůstá spolu s počtem hydroxylových skupin na aromatickém jádře B (viz. Obr. 2,3,4). Flavanoidy váží těžké kovy do komplexů, čímž snižují možnost průběhu radikálové oxidace. Tytéž sloučeniny ovšem mohou za vhodných podmínek (zhoršení redox prostředí) kondenzovat a s polypeptidy vytvářet nebiologické zákaly (Basařová G., 2005).
2.4 Pivo a zdraví
2.4.1 Pivo jako celek
Kellner v internetové diskusi upozorňuje na pozitivní vliv na lidské zdraví piva jako celku. Pivo je i přes svůj obsah alkoholu vhodným nápojem k pití. Protože obsahuje kolem 92% vody, brání dehydrataci organismu, k níž jinak dochází při pití jiných alkoholických nápojů. Osmolalita piva, zvláště nízkoalkoholického, odpovídá osmolalitě krve. Pivo je tedy izotonický nápoj a jako takový vhodný pro tělesně aktivní osoby k rychlému doplnění tekutin a energie. S osmolalitou souvisí obsah minerálních látek, které pocházejí hlavně ze sladu. Těch je v pivu značné množství. Významný je poměr Na/K. Ten je v pivu 1/10, což je zcela opačný poměr než u většiny jídel konzumovaných dnešní společností. Dále obsahuje zinek, důležitý při tvorbě inzulínu, ochraně proti kožním chorobám. 23
2 Literární přehled Fluor chrání před zubním kazem, křemík brzdí absorpci hliníku v těle a tím zřejmě působí preventivně proti vzniku Alzheimerovy choroby. Navíc je ve fyziologicky využitelném stavu, ve formě kyseliny křemičité. Z kvasnic do piva přechází chrom, který podporuje aktivitu insulinu. Dále jsou obsaženy vitaminy. A to hlavně vitaminy skupiny B (thiamin, riboflavin, niacin, pyridoxin, kobalamin) dále kyselina pantotenová, vitamin H (biotin). Denní potřeba jednotlivých vitaminů je při konzumaci 1 litru piva podle literárních údajů kryta asi z 10 až 50%. Zvýšené riziko kardiovaskulárních chorob se dává do souvislosti s vyšším obsahem homocysteinu v krvi. Právě vitaminy skupiny B (hlavně B12), včetně kyseliny folové a folátů účinně působí na snižování jeho hladiny v plasmě a tím snižují riziko vzniku kardiovaskulárních chorob (Anton M., Mikyška A., 2007). Celkově 1 litr piva obsahuje asi 200 mg biologicky aktivních látek. Velmi sporný je obsah alkoholu v pivu. Odpůrci alkoholu proto často pivo neprávem degradují až na škodlivý nápoj. Obsah ethanolu je však nízký a vzhledem k ostatním prospěšným látkám zanedbatelný. Alkohol konzumovaný v malých dávkách má dokonce příznivé účinky na zdraví. Zvyšuje hladinu HDL cholesterolu v krvi, jež má antiaterogenní účinky, podporuje vstřebávání polyfenolů ve střevě, čímž zvyšuje antioxidační kapacitu organismu (Kellner V., 2004).
2.4.2 Polyfenoly
V organismu existuje určitá rovnováha mezi prooxidanty a antioxidanty (asi 1:3), kterou je třeba udržovat. Porušením rovnováhy směrem k prooxidantům vzniká oxidační stres, který je možným spouštěčem různých chorob jako je diabetes, aterosklerosa, vznik karcinomů, Parkinsonova nebo Alzheimerova choroba. O tom zda látka působí jako prooxidant nebo antioxidant rozhoduje její redox potenciál. Prooxidanty mohou v organismu vzniknout exogenně (kouření, radiace…) nebo endogenně. Byl by však omyl domnívat se, že volné radikály (prooxidanty) působí pouze škodlivě. V malé míře jsou pro organismus potřebné, např. napomáhají zneškodnění patogenů fagocyty nebo plní funkci druhého posla v buněčné signalizaci. Důležitý je právě ten správný poměr 1:3 (Vejražka M., 2004). Polyfenoly příjímané z piva v organismu působí jako antioxidanty. Účinek se dá přirovnat k působení vitaminů C a E nebo selenu, které patří mezi významné
24
2 Literární přehled antioxidanty. Tyto látky jsou schopny likvidovat v těle volné radikály a zabraňovat tak jejich škodlivému působení na citlivé biostruktury jako jsou polynenasycené mastné kyseliny v biomembránách, aminokyseliny v proteinech, různé sacharidy, nukleové kyseliny. Napadením nukleových kyselin volným radikálem může dojít k poškození genetické informace a vzniku nádoru. Stejně tak oxidované LDL jsou cytotoxické pro mnoho buněk, zvláště pro buňky cévní výstelky. Basařová ve své knize České pivo píše: „…význam polyfenolových sloučenin je srovnatelný s významem vitamínů C a E i karotenů. Lze počítat s průměrným příjmem 15 – 25 mg rostlinných polyfenolů na osobu a den. Nápoje jsou vhodným a přirozeným zdrojem těchto látek...” (Basařová G., Hlaváček I., 1999). Celkový denní příjem polyfenolů ve stravě byl podle některých autorů odhadnut na 1g. Což je více než příjem antioxidačních vitaminů (Modrianský M., Valentová K. a spol., 2003).Jiní se přiklání k příjmu 26 mg na osobu a den (Lachman J., Hamouz K. a spol., 2005). Z potravin, které obsahují hodně polyfenolů můžeme jmenovat červené víno, pivo, černý čaj, hořká čokoláda, soja, višně, káva. Zanedbatelným zdrojem nejsou ani brambory. Obsah polyfenolů zde není vysoký, ale jejich příjem v potravě je pravidelný a poměrně vydatný (Slanina J., Táborská E., 2004). Polyfenoly se tedy v lidské stravě běžně vyskytují a jejich příjem se spojuje hlavně se snížením rizika kardiovaskulárních chorob. Známý je tzv. francouzský paradox, kdy při poměrně vysokém obsahu tuků používaném ve francouzské kuchyni je Francie mezi posledními v žebříčku úmrtí na kardiovaskulární onemocnění. Příčinou je tady zřejmě vysoký příjem vína, které obsahuje ještě více polyfenolů než pivo. A to v rozmezí 200 – 1000 mg/l. Víno bílé má obsah o něco nižší než červené (Fajtová K., Hejtmánková A. a spol., 2004). Mnoho fenolických látek se řadí mezi rostlinné fytoestrogeny, které působí analogicky jako ženské hormony estrogeny. Ženy chrání před vznikem mnoha závažných chorob jako je karcinom prsu či dělohy. Muže před vznikem rakoviny prostaty. Estrogeny jsou produkovány ve vaječnících a v přechodu jejich produkce ustává, což způsobuje klimakterické potíže (návaly horka, pocení, nespavost, migrény). Pravidelným pitím piva lze tyto příznaky zmírnit, protože chmel, tedy i pivo, je též zdrojem fytoestrogenů. Estrogenní aktivita se však připisuje hlavně rostlinám z čeledi Fabaceae, zejména soje. První studie na toto téma vycházejí ze skutečnosti, že východodasijské země jsou staisticky na spodní příčce žebříčku výskytu rakoviny prsu, osteoporózy a srdečně cévních onemocnění. Příčinou bude zřejmě tamní styl stravování, který denně 25
2 Literární přehled do jídelníčku zařazuje produkty ze soji. Příjem isoflavonů zde činí 20 – 50 mg/den. Ve střední Evropě je to jen 1 mg/den (Kalač P., 2006). Mezi nejsilnější rostlinné fytoestrogeny vůbec patří 8–prenylnaringenin (viz. Obr. 10).
OH HO
O
OH
O
Obr. 10 8–prenylnaringenin
Většina piv ho obsahuje méně než 100 µg/l. Což je asi 1000× nižší množství, než dávka, která může vyvolat negativní růst děložní sliznice (Kuřec M., Hofta P. a spol., 2005). Fytoestrogenní látky přijímané ve vysokém množství totiž mohou být také prokarcinogeny (viz. rovnováha mezi pro– a antioxidanty). S estrogenní aktivitou úzce souvisí i schopnost xanthohumolu inhibovat resorpci vápníku z kostí a působit tak proti osteoporóze. Ta je též častým problémem žen v klimakteriu. Xanthohumol rovněž působí na nádorové buňky. Jednou z možností, jak ovlivnit tato onemocnění hned v počátku je inhibice cytochromů P450, které mohou být iniciátory vzniku nádorového procesu. Dalším způsobem je vyvolání aktivity chinonreduktázy. Enzymu, který se účastní detoxikace karcinogenů. Toto opatření je účinné zejména v počátečních stádiích vzniku nádoru. Pivo však není všelék. Chmel xanthohumolu obsahuje hodně, ale během vaření piva, zejména během chlazení mladiny, kvašení a stabilizace dochází ke značným ztrátám. Organismus si navíc neumí vytvářet zásoby tohoto antioxidantu. Resorpce polyfenolů probíhá v tenkém a tlustém střevě. A to ve formě glykosidů či esterů. Po přestupu přes střevní stěnu je metabolismus podobný metabolismu léčiv. Tj., fenolická látka se váže na kyselinu glukuronovou či glycin nebo podléhá methylaci. Většina dalších reakcí probíhá v játrech. Teprve konjugované polyfenoly se mohou vázat na povrch LDL částic a bránit tak jejich oxidaci (Slanina J., Táborská E., 2004).
26
2 Literární přehled Bylo zveřejněno mnoho studií zabývajících se problematikou fenolických látek a jejich působení na organismus. Např. Racek píše o účincích vazorelaxačních, antikoagulačních, antikancerogenních (Racek J., 2001). Mikyška přidává působení antimikrobiální, antitirombotické a imunomodulační (Mikyška A., Krofta K. a spol., 2006). Lze tedy říci, že pivo je z hlediska zdravé výživy v přiměřeném množství vhodným nápojem.
2.5 Stanovení polyfenolů v pivu
Můžeme sledovat: 1) celkovou antioxidační kapacitu 2) celkové polyfenoly 3) skupiny polyfenolů 4) jednotlivé látky
2.5.1 Celková antioxidační kapacita piva a meziproduktů
2.5.1.1 Metoda FRAP (Ferric Reducing Ability of Plasma)
Metoda původně určená pro lékařské účely. Pro stanovení v pivovarnictví ji poprvé použili Selecký a Šmogrovičová. Je založena na redukci železitého tripyridyltriazinového komplexu antioxidanty ze vzorku na modře zbarvenou železnatou formu. Absorbance při 593 nm (Selecký R., Šmogrovičová D., 2006).
2.5.1.2 Metoda spoluoxidace β–karotenu v linoleátovém modelovém systému
β–karoten je výborným pohlcovačem radikálů (díky systému dvojných vazeb v řetězci). Po přidání do vzorku je spolu s ním podroben oxidaci. Měří se pokles absorbance β–karotenu při 470 nm za a bez přítomnosti antioxidantů ve vzorku.
27
2 Literární přehled Antioxidační vlastnosti se vyjádří jako procento inhibice oxidace β–karotenu (Karabín M., Dostálek P a spol., 2006).
2.5.1.3 Chemiluminiscence
Fyzikální metoda pro stanovení intenzity oxidace lipidů. Walter stavěl na práci Kaneda a Kobayashi a vyvinul metodu založenou na reakci luminolu s peroxidem vodíku za přítomnosti zesilovače (1,1,4,7,7–diethylentriaminpentaoctová kyselina), který luminiskuje. Přítomnost antioxidantu způsobuje zhášení luminiscence a snížení intenzity signálu (Karabín M., Dostálek P. a spol., 2006).
2.5.2 Celkové polyfenoly
2.5.2.1 Metoda dle EBC
Polyfenoly reagují v alkalickém prostředí s trojmocnými ionty železa na červeně zbarvené komplexy. Absorbance těchto komplexů je při 600 nm. Výsledek je dán vzorcem a vyjádřen v mg/l (Analytica EBC, 1998 in Dvořáková M., Dostálek P. a spol., 2006).
2.5.2.2 Metoda dle Folin – Ciocaulteau
Fenoly oxidují v zásaditém prostředí za produkce O2-, který reaguje s molybdenem za vzniku barevného oxidu molybdenu, MoO4+. Absorbance probíhá při 750 nm.
28
2 Literární přehled 2.5.3 Skupiny polyfenolů
2.5.3.1 Anthokyanogeny dle Harrise a Ricketse
Polyfenoly ze vzorku se nejprve adsorbují na polyamidový prášek, pak se z něj uvolní za tepla směsí butanol–chlorovodíkové kyseliny. Vzniklé oxoniové soli se měří spektrofotomericky při 550 nm. Závislost anthokyanogenů na naměřené hodnotě je tabelována (Basařová G., Čepička J. a spol., 1993).
2.5.3.2 Tanoidy dle Chapona
Při dávkování polyvinylpyrrolidonu (PVP) do vzorku obsahujícího tanoidy vzniká zákal, který se měří nefelometricky. Při vyvázání veškerých tanoidů se zákal již dále nezvyšuje a množství tanoidů proporcionálně odpovídá množství PVP, které se musí přidat k dosažení maxima zákalu. Výsledek je dán vzorcem a vyjádřen v mg PVP/l (Basařová G., Čepička J. a spol., 1993).
2.5.3.3 Stanovení flavonoidů
Flavonoidy
ze
vzorku
reagují
na
barevný
komplex
s chromogenem
p–dimethyl–aminocinnaldehydem. Absorbance při 640 nm. Výsledek dán vzorcem a vyjádřen v katechinových ekvivalentech v mg/l (Analytica EBC, 1998 in Dvořáková M., Dostálek P. a spol., 2006).
2.5.4 Jednotlivé látky
Uplatňují se zejména nejrůznější typy chromatografií (plynová, kapalinová, kapalinová vysokotlaká) s různými typy detektorů (fluorescenční, hmotnostní, UV/VIS, plamenoionizační, elektrochemický…)
29
2 Literární přehled 2.5.4.1 GC
Isoflavony mají nízkou těkavost, proto je nutné provést jejich derivatizaci, která vede ke zvýšení těkavosti a tím ke zvýšení citlivosti a selektivity. Derivatizačním činidlem může být N,O–bis–(trimethylsilyl)–trifluoracetamid nebo pyridin–hexamethyldisilazan–trimathylchlorsilan. Analýza probíhá na nepolárních kapilárních kolonách s užitím lineárního teplotního gradientu.
2.5.4.2 HPLC
Nejčastěji jde o separace s reverzní fází na alkylovaných silikagelech C18, C8 nebo na modifikovaných sorbentech diolovou či fenylovou skupinou. Separace se provádí pomocí izokratické nebo gradientové eluce mobilní fází. Tou je směs acetonitrilu, methanolu, n–propanolu, tetrahydrofuranu nebo etanolu s vhodnými tlumiči. Detekce je obvykle spektrofotometrická v UV oblasti (254 – 280 nm). Identifikace na základě porovnání retenčních časů, metodou standardního přídavku nebo porovnáním spektra s absorpčními spektry uloženými ve spektrální knihovně. Jedna z modifikací je tzv. HPLC – MS after 2D – SPE (vysokoúčinná kapalinová chromatografie s hmotnostní detekcí po dvoudimenzionální extrakci tuhou fází). Principem této extrakce na tuhé fázi je selektivní zadržování skupiny látek na sloupci či membráně v krátké kolonce, tzv. cartridge. SPE se používá k eliminaci rušivých složek, k zakoncentrování vzorku, k izolaci stopových látek či změně rozpouštědel vzorku. Dvou dimenzionální extrakce je dokonalejší než jednoduchá extrakce na tuhé fázi. Technika se skládá z mnoha promývacích kroků, kdy se pomocí vhodných úprav pH vzorek optimálně zkoncentruje a vyselektují se látky, které mají být následně stanoveny HPLC. SPE sorbenty musí umožňovat práci v poměrně širokém rozmezí hodnot pH. Metodou 2D – SPE lze získat jednou extrakční kolonkou během jedné separace vzorek s žádanými izoláty bez interferujících látek. Získaný izolát se pak podrobí HPLC. Identifikace analytů se provádí na základě retenčních časů a pomocí srovnání hmotnostních či absorpčních spekter se spektry isoflavonoidů v knihovně (Klejdus B., Vítámvásová – Štěrbová D. et al., 2001).
30
2 Literární přehled V roce 2003 byl na 29th EBC Internetional Congress prezentován nový způsob detekce a to pomocí elektrochemického detektoru CoulArray. V současné době nejpřesnější způsob detekce (Kellner V., Čulík J., a spol., 2004). K separaci se využívá systému obrácených fází, kdy stacionární fázi představuje nepolární a mobilní fázi polární rozpouštědlo. Vodivost mobilní fáze je zvyšována přídavkem soli. CoulArray detektor představuje 8 – 32 průtočných cel, na které jsou vloženy různé potenciály. Každá cela pak poskytuje samostatný signál. Výhodou je vysoká citlivost a snadná příprava vzorku (Škeříková V., Grynová L. a spol.).
31
3 Cíl práce
3 CÍL PRÁCE
Cílem je vybrat vhodnou jednoduchou metodu na principu HPLC ke stanovení jednotlivých volných fenolových kyselin ve sladině, mladině a pivu. A to tak, aby byla aplikovatelná na podmínky laboratoře na Ústavu technologie potravin. Předpokladem ke zvládnutí je znalost pivovarského procesu, klasifikace polyfenolů a metody stanovení. K porovnání byla použita metoda stanovení celkových polyfenolů dle Folin – Ciocaulteau kalibrovaná na kyselinu ferulovou. Vyškovské pivo (10°, 11°, 12°) bylo hodnoceno též senzoricky za účelem pozorování vlivu obsahu polyfenolů na charakter hořkosti piva.
32
4 Materiál a metody
4 MATERIÁL A METODY
4.1 Várka z níž byly odebrány vzorky k analýze
K vystírce na vaření světlé desítky bylo použito 2205 kg plzeňského a 4 kg barevného sladu na 140 hl vody. Povařovaly se dva rmuty. Chmelovar trval 1,5 hodiny a bylo použito 25,5 kg žateckého chmele odrůdy Sládek a 1,5 kg odrůdy Premiant a 0,3 kg extraktu. Extrakt a část granulovaného chmele byly dávkovány na začátku varu, hlavní podíl granulovaného chmele po hodině varu a 10 minut před koncem ještě část žateckého chmele. Navíc byl přidán asi 1 kg do vířivé kádě. Kvašení probíhalo poměrně pomalu, za sedm dní bylo ve stadiu bílých kroužků, za dalších pět ve stadiu hnědých kroužků. Sudovalo se za 16 dní od uvaření várky.
Odebrané vzorky: 1) sladina SL 2) během chmelovaru po 10 minutách, celkem tedy 9 vzorků CH 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 3) mladina za vířivou kádí ML 4) 3 vzorky během hlavního kvašení, po cca 3 dnech KV 1, 2, 3 5) 2 vzorky během dokvašování, po týdnu DOKV 1, 2 6) hotová piva Desítka (10°), Džbán (11°), Březňák (12°)
33
4 Materiál a metody
4.2 Stanovení celkových fenolických látek (poly– a monofenolů) metodou Folin – Ciocaulteau
4.2.1 Princip
Principem je oxidace fenolů v zásaditém prostředí za produkce O2-, který reaguje s molybdenem za vzniku oxidu molybdenu, MoO4+, který vykazuje silnou absorbanci v 750 nm.
4.2.2 Použité chemikálie a roztoky
činidlo Folin – Ciocaulteau (PENTA, p.a.) 20% Na2CO3 (LACHEMA, p.a.) kyselina ferulová (SIGMA CHEMICAL CO, FOR HPLC GRADE)
4.2.3 Přístroje a zařízení
spektrofotometr SPEKOL11, CARL ZEIS, JENA laboratorní sklo
4.2.4 Postup
Nejprve byla provedena kalibrace na kyselinu ferulovou a poté se přistoupilo k analýze vlastních vzorků.
4.2.4.1 Kalibrace na kyselinu ferulovou
Do 50 ml odměrných baněk byla připravena kalibrační sada ředění o koncentracích 0,75 mg/l, 3 mg/l, 7,5 mg/l, 11,3 mg/l a 20 mg/l. K naředěným
34
4 Materiál a metody roztokům bylo přidáno 2,5 ml činidla Folin – Ciocaulteau. Pečlivě se promíchalo a nechalo chvíli odpočinout. Pak se přidalo 7,5 ml 20% Na2CO3, opět promíchalo, doplnilo destilovanou vodou po rysku 50 ml odměrné baňky a nechalo 2 hodiny stát. Vzniklá sada modře zbarvených roztoků byla proměřena při 765 nm. Absorbance byly zaznamenány ke zhotovení kalibrační křivky (viz. Příloha 3, Graf 20).
4.2.4.2 Měření vzorků
Vzorky byly odvzdušněny na ultrazvukové lázni a do 25 ml odměrných baněk dávkovány v množství 2,5 ml (ředění 10krát). Pak bylo přidáno trochu destilované vody ke zvýšení objemu a následně se postupovalo jako u kalibrační řady. Tzn. 1,25 ml činidla Folin – Ciocaulteau, pečlivě se promíchalo a nechalo odpočinout. Pak se přidalo 3,7 ml 20% roztoku Na2CO3, opět promíchalo, doplnilo destilovanou vodou po rysku 25 ml odměrné baňky a nechalo 2 hodiny stát. Vzorky byly proměřeny při 765 nm.
4.3 Stanovení polyfenolů chromatograficky
4.3.1 Princip
Pro stanovení vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií je nejdůležitější vhodná separace stanovovaných látek. V tomto případě jde adsorpci na PVP a následně se polyfenoly extrahují acetonem, zahustí a znovu extrahují ethylacetátem. Po oddestilování rozpouštědla se vlastní vzorek rozpustí v methanolu a analyzuje na kapalinovém chromatografu ECOM s UV/VIS detektorem při 280 nm, na koloně C18. Mobilní fází je methanol.
4.3.2 Použité chemikálie a roztoky PVP (A.E.B.) Sephadex LH–20 (LACHEMA, p.a.) 80% vodný roztok acetonu (LACHEMA, p.a.)
35
4 Materiál a metody ethylacetát (LACHEMA, p.a.) methanol (LACHEMA, p.a.) síran sodný, bezvodý (LACHEMA, p.a.) kyselina ferulová (SIGMA CHEMICAL CO, FOR HPLC GRADE)
4.3.3 Přístroje a zařízení třepačka GFL 3005 vakuová odparka IKA Labortechnik HB4 basic laboratorní sklo
Podmínky pro chromatografii: kapalinový chromatograf ECOM s UV/VIS detektorem kolona: 250×4 mm, náplň Nucleosil 120–5 C18 mobilní fáze: methanol průtoková rychlost: 0,5 ml/min nástřik: 5 µl délka analýzy: 6 minut
Obr. 11 Schema HPLC
36
4 Materiál a metody 4.3.4 Postup
100 ml mladiny či piva zbaveného CO2 se třepe 30 minut se 40 g polyamidu. Suspenze se pak kvantitativně přefiltruje a promyje 300 ml destilované vody. Polyamid s nasorbovanými polyfenoly se kvantitativně převede do baňky a třikrát extrahuje 15 minut na třepačce 80 ml vodného roztoku acetonu. Spojené extrakty se zahustí na poloviční objem ve vakuové odparce při teplotě 40°C. Tento roztok se pak extrahuje čtyřikrát 10 minut na třepačce 40 ml ethylacetátu. Spojené extrakty se vysuší bezvodým síranem sodným a dekantací převedou do baňky a na vakuové odparce odpaří při 40°C do sucha. Izolát polyfenolů se před analýzou rozpustí v 10 ml methanolu (Basařová G., Čepička J. a kol., 1993).
4.3.4.1 Volba vhodného sorbentu
K dispozici byl PVP, polyamidový prášek a Sephadex. Polyamidový prášek byl vyřazen hned zpočátku, protože se rozkládal působením 80% acetonu, který se v metodice používá k extrakci polyfenolů ze sorbentu. Nakonec byl zvolen PVP pro svou snadnou dostupnost. Bylo zjištěno, že kyselina ferulová se na PVP sorbuje z 98% (viz. Kap. 5.2.1).
4.3.4.2 Příprava standardu a kalibrační křivky
Příprava standardu kyseliny ferulové rozpuštěním navážky v malém množství methanolu a doplněním destilovanou vodou se neosvědčila, proto byla sada ředění připravena rozpuštěním v čistém methanolu. Tyto roztoky byly proměřeny a sestavena z nich kalibrační křivka a tabulka. Na chromatogramu se objevuje pík provázející kyselinu ferulovou, který může patřit rozkladnému produktu této kyseliny (viz. Graf 5 a Graf 6).
37
4 Materiál a metody 4.3.4.3 Měření vlastních vzorků
Experimentálně byl zjištěn optimální objem vzorku a PVP, a to 20 ml vzorku a 10 g PVP. Filtrace byly prováděny po předchozím centrifugování. Těmito úpravami došlo k urychlení procesu izolace.
4.4 Senzorické hodnocení
4.4.1 Postup
Byla zpracována metodika pro hodnocení základních deskriptorů piva. Hodnotitelský panel byl složen z 52 školených osob. Průměrný věk respondentů byl 24 let. Hodnotitelům byly anonymně předloženy 3 vzorky piv a to: Desítka (10°), Džbán (11°) a Březňák (12°) a také vytvořený formulář, kam posuzovatelé zaznamenávali hodnocení jednotlivých deskriptorů piv (viz. Příloha 2, Tab. 7). Tabulka četnosti odpovědí je uvedena v Příloze 2, Tab. 8. Z této tabulky byly zhotoveny grafy pro jednotlivé deskriptory piv a srovnávací graf. Tyto grafy jsou uvedeny v Příloze 3, Graf 11 – 19.
38
5 Výsledky a diskuze
5 VÝSLEDKY A DISKUZE
5.1 Stanovení celkových fenolických látek (poly– a monofenolů) metodou Folin – Ciocaulteau
Vzorky byly proměřeny a z výsledků sestavena tabulka (viz. Tab. 4). Z naměřených hodnot byl sestaven graf vlivu technologického procesu na obsah polyfenolů (viz. Graf 1). I když byla kalibrace polyfenolů provedena na kyselinu ferulovou, stanovení metodou s pomocí Folin – Ciocaulteauova činidla zahrnuje při reakci veškeré fenolické látky, účastnící se reakce (viz. Kap. 3.5.2.2). Tab. 4 Obsah polyfenolů ve vzorcích měřený metodou Folin – Ciocaulteau vzorek A [765 nm] polyfenoly [mg/l] 0,585 120,6 SL 0,386 83,9 CH10 0,404 87,3 CH20 0,382 83,2 CH30 0,344 76,2 CH40 0,429 91,9 CH50 0,430 92,0 CH60 0,434 92,8 CH70 0,458 97,2 CH80 0,493 103,6 CH90 0,355 78,2 ML 0,310 70,4 KV1 0,343 76,0 KV2 0,361 79,3 KV3 0,304 68,8 DOKV1 0,337 75,0 DOKV2 0,258 60,4 Desítka 0,260 60,7 Džbán 0,299 67,9 Březňák
39
5 Výsledky a diskuze Graf 1 Změny obsahu polyfenolů během varního procesu (Folin – Ciocaulteau) 140
120
PF [mg/l]
100
80
60
40
20
0 SL
CH10
CH20
CH30
CH40
CH50
CH60
CH70
CH80
CH90
ML
KV1
KV2
KV3
DOKV1 DOKV2
PIVO 10°
technologická fáze
Z grafu lze pozorovat úbytek obsahu polyfenolů při zcezování sladiny, kdy dochází zřejmě k zadržování fenolických látek na filtrační vrstvě. Ve sladu jsou totiž polyfenolové
látky
obsaženy
zejména
v pluchách
a
aleuronu
(Selecký
R.,
Šmogrovičová D., 2006). Při chmelovaru naopak množství polyfenolů vzrůstá vlivem přechodu z chmele. Na začátku chmelovaru byl dávkován chmelový extrakt na bázi CO2. Tato dávka není v grafu zvlášť výrazná, neboť chmelové extrakty jsou na polyfenoly chudé (Selecký R., Šmogrovičová D., 2006). Zvláště výrazné je chmelení po hodině varu, kdy se přidával granulovaný žatecký chmel Sládek, typ 90. U žateckého poloraného červeňáku byl touto metodou stanoven obsah polyfenolů na 600 mg/l chmelového extraktu (Rosa Z., 2006). Poslední dávka byla sypána 10 minut před ukončením chmelovaru a tato je z grafu též patrná. Prudký úbytek obsahu polyfenolů po zchlazení mladiny je způsoben vylučováním polyfenol – bílkovinných komplexů na vířivé kádi. Poklesy během kvašení jsou způsobeny strháváním fenolických látek do kvasných pokrývek na stoupajících bublinkách CO2 a adsorpcí na kvasinkách (Hlaváček F., Lhotský A., 1972). Po stabilizaci piva pomocí přípravku Stabiquick Strong dochází také ke snížení obsahu polyfenolů. 40
5 Výsledky a diskuze
Podle knihy Beer And Coolers je u piva plzeňského typu stanoven obsah celkových polyfenolů a jednotlivých složek takto:
Tab. 5 Obsah jednotlivých polyfenolových složek v pivu Složka polyfenoly celkově antokyanogeny katechin epikatechin rutin quercetin kyselina chlorogenová kyselina chinová kyselina p–kumarová kyselina ferulová kyselina sinapová kampferol myricetrin kyselina gallová kyselina p–hydroxybenzoová (www 6)
Obsah [mg/l] 172 46 5 – 55 9 – 24 1–6 5 – 125 2 – 20 1–5 1–7 2 – 21 1 – 20 5 – 20 1 5 – 29 5 – 20
Naměřené hodnoty se tedy pohybují v rozmezí pro obsah polyfenolů v pivu.
41
5 Výsledky a diskuze
5.2 Stanovení polyfenolů chromatograficky
5.2.1 Zavedení metody
Graf 2 Chromatogram kyseliny ferulové rozp. v destilované vodě
Příprava standardu kyseliny ferulové rozpouštěním v malém množství methanolu a doplněním destilovanou vodou se neosvědčilo. Na chromatogramu se objevovaly ještě další píky (viz. Graf 2). Standardy tedy byly připravovány rozpouštěním v čistém methanolu.
Graf 3 Stabilita kyseliny ferulové
42
5 Výsledky a diskuze
doba od přípravy
barva chromatogramu c [mg/100ml]
1 hod. modrá 3 hod. červená 8 hod. v temnu a atmosféře N2 zelená
0,61 0,40 0,46
Bylo zjištěno, že standard kyseliny ferulové podléhá po několika hodinách pozvolné oxidaci vzdušným kyslíkem, a na chromatogramu jsou pak vidět její rozkladné produkty jako píky ve 3. minutě. Standardy proto byly uchovávány ve tmě a zásobní roztoky v atmosféře dusíku. Po těchto opatřeních k pozvolnému rozkladu prakticky nedocházelo (viz. Graf 3).
Graf 4 Sorbce kyseliny ferulové na PVP
vzorek barva c [mg/100ml] % obsah standard modrá 0,6282 100 promytý podíl červená 0,6163 98,1 Při použití 10 g PVP na 20 ml vzorku se standard kyseliny ferulové sorboval z 98,1% (viz. Graf 4). Zde použitá modifikace je velmi podobná extrakci na tuhou fázi (SPE) s tím rozdílem, že sorpce neprobíhala v kolonkách nebo mikrokolonkách, ale přímo v suspenzi vzorku a PVP. PVP byl pak oddělen po promytí vodou centrifugací a podíly k analýze získány několikanásobnou reextrakcí 80% acetonem a ethylacetátem (viz. Kap. 4.3.4). 2% standardu kyseliny ferulové, která se nesorbuje, je v mezích chyby stanovení. Od tohoto se odvíjelo další stanovení.
43
5 Výsledky a diskuze Graf 5 Chromatogram standardních roztoků kyseliny ferulové
c [mg/100ml] 0,576 0,384 0,192
barva modrá červená zelená
c dle kalibrační křivky [mg/100ml] 0,6101 0,4631 0,1718
Z chromatogramů standardních roztoků kyseliny ferulové (viz. Graf 5) byla zhotovena kalibrační křivka a tabulka (viz. Graf 6).
Graf 6 Kalibrační křivka s tabulkou ředění
44
5 Výsledky a diskuze Graf 7 Analýza piva (Desítka 10º)
V tomto chromatogramu je patrný velký spojitý pík vzniklý při analýze piva zbaveného CO2 bez předchozí sorbce na PVP. Pík je charakterizován souborem všech nerozdělených píků látek, pro analytické stanovení je takto neupravené pivo nepoužitelné (viz. Graf 7, červený chromatogram). Malý pík modré barvy charakterizuje polyfenoly rozdělené chromatografickou kolonou po předchozí sorbci na PVP a následné reextrakci acetonem a ethylacetátem, patrný je vysoký pík kyseliny ferulové (viz. Graf 7). Po odečtení pomocí zhotovené kalibrační křivky byla hodnota obsažené kyseliny ferulové stanovena na 1,22 mg/100ml tj. 12,2 mg/l. Tato hodnota odpovídá rozmezí uváděném pro obsah kyseliny ferulové v pivu (viz. Tab. 5). Pokud bychom chtěli analyzovat i další polyfenoly, bylo by třeba lépe odladit chromatografickou analýzu změnou mobilní fáze, zavedením teplotního gradientu nebo použitím gradientové eluce. V tomto modelovém případě analýzy pouze kyseliny ferulové je takto modifikovaná a používaná chromatografická analýza plně dostačující.
45
5 Výsledky a diskuze 5.2.2 Měření vzorků a výsledky
Graf 8 Chromatogram vzorku CH10
Podobně jako tento chromatogram vypadají i ostatní chromatogramy vzorků odebraných během technologického procesu a hotových piv (viz. Graf 8). Z těchto chromatogramů byly odečteny hodnoty obsahu kyseliny ferulové v jednotlivých vzorcích a sestaveny do tabulky (viz. Tab. 6).
Tab. 6 Obsah kyseliny ferulové ve vzorcích měřený metodou HPLC vzorek kys. ferulová [mg/l] 33,3 SL 25,5 CH10 27,2 CH20 27,0 CH30 26,5 CH40 27,1 CH50 26,9 CH60 28,1 CH70 30,3 CH80 31,1 CH90 19,8 ML 13,9 KV1 14,3 KV2 15,1 KV3 13,3 DOKV1 13,4 DOKV2 12,2 Desítka 12,1 Džbán 13,6 Březňák
46
5 Výsledky a diskuze Dle Briggse et al. je obsah kyseliny ferulové ve sladině 13 mg/l (Briggs D. E., Boulton C. A., 2004). Rozdíl v naměřených hodnotách může být způsoben rozdílným typem sladu používaným v ČR a v zahraničí. Grynová a spol. ve své práci sledovala obsahy jednotlivých polyfenolických látek v českých a zahraničních pivech metodou HPLC s CoulArray detekcí. U českých výčepních piv byl obsah kyseliny ferulové stanoven na 2,2 mg/l a 2,5 mg/l u českých ležáků. Zahraniční piva měly obsah kyseliny ferulové o něco nižší (Grynová L., Škeříková V. a spol., 2003). Při srovnání výsledků je opět vidět rozdíl v naměřených hodnotách. Zde může být způsoben zejména odlišnými metodami stanovení, kdy Grynová a spol. používá HPLC s gradientovou elucí a CoulArray detektorem. Tato metodika byla lépe odladěná na stanovení mnoha různých frakcí polyfenolů a proto přesnější.
Z tabulky výsledných hodnot kyseliny ferulové ve vzorcích byl stejně jako u metody Folin – Ciocaulteau sestaven graf vlivu technologie na změny obsahu polyfenolů (viz. Graf 9).
Graf 9 Změny obsahu polyfenolů během varního procesu (HPLC) 35
30
PF [mg/l]
25
20
15
10
5
0 SL
CH10
CH20
CH30
CH40
CH50
CH60
CH70
CH80
CH90
ML
KV1
KV2
KV3
DOKV1 DOKV2
PIVO 10°
technologická fáze
V tomto grafu lze pozorovat taktéž úbytek polyfenolů při zcezování sladiny, nárust během chmelovaru a prudké snížení během vylučování hořkých kalů na vířivé kádi, během kvašení a po stabilizaci piva. 47
5 Výsledky a diskuze Graf 10 Srovnání metody Folin – Ciocaulteau a HPLC 140
120
PF [mg/l]
100
80
60
40
20
0 SL
CH10
CH20
CH30
CH40
CH50
CH60
CH70
CH80
CH90
ML
KV1
KV2
KV3
DOKV1 DOKV2
PIVO 10°
technologická fáze
Metodou Folin – Ciocaulteau (červený graf) se stanoví celkové množství polyfenolů ve vzorku, proto jsou hodnoty vyšší než při stanovení kyseliny ferulové metodou HPLC (modrý graf). Průběh změn během technologie je však velmi podobný. Křivky kopírují dosud známé poznatky o pohybu obsahu polyfenolů v meziproduktech při výrobě.
5.3 Senzorické hodnocení
Data z vyplněných formulářů byla zpracována do grafů uvedených v příloze a vyhodnocena takto: Nejvýraznější ve vůni byla hodnocena Desítka. Pět bodů jí přidělilo 9 hodnotitelů. Džbán byl nejčastěji hodnocen třemi a dvěma body a Březňák taktéž (viz. Příloha 3, Graf 11). Nejsilnější v chuti byla označena 12º – Březňák. Nejčetnější byly odpovědi se čtyřmi body, ohodnotilo jej tak 30 hodnotitelů. Džbán hodnotilo 26 hodnotitelů třemi body a jen 10 hodnotitelů pěti body. Desítku vyhodnotilo 30 respondentů třemi body a 13 respondentů dvěma body (viz. Příloha 3, Graf 12). Jako pivo plné, tedy čtyřmi body, byl nejčastěji označen Březňák. Džbán získal také poměrně dost odpovědí se čtyřmi body, jako pivo plné jej hodnotilo 48
5 Výsledky a diskuze 33 dotazovaných. Desítka byla nejčastěji hodnocena dvěma a třemi body. Jako pivo plné a zaokrouhlené, tedy pěti body byl celkem 13 krát označen Březňák (viz. Příloha 3, Graf 13). Jako pivo řízné byl cekem 41 krát označen Březňák. Získal 11 odpovědí s pěti body, tedy pivo příjemné, řízné. Džbán měl nejčetnější odpovědi v oblasti tří a čtyř bodů a Desítka byla nejčastěji hodnocena jako pivo málo řízné (viz. Příloha 3, Graf 14). Charakter hořkosti Desítky byl označen jako jemný až velmi jemný, Džbánu jako jemný až ulpívající a Březňáku jako jemný až mírně ulpívající (viz. Příloha 3, Graf 15). Z grafů uvedených v příloze plyne, že 12º Březňák vynikal zejména v řízu a plnosti, 11º Džbán v řízu i plnosti s drsnějším charakterem hořkosti a ne tak výraznou chutí. 10º Desítka pak vynikala zejména ve vůni. V žebříčku se tedy umístila jako poslední, nikoli však jako nejhorší (viz. Příloha 3, Graf 16 – 19). Podle Miloše Hrabáka (někdejší vedoucí Pokusného a vývojového střediska Výzkumného ústavu pivovarského a sladařského v Praze) jsou česká piva v chuti a vůni nadprůměrná. V pivu by se neměly vyskytovat cizí příchutě a vůně. Mezi základní patří příchuť ovocná, která je u některých piv žádoucí, u českého ležáku je ale chybou. Poměrně často se vyskytuje příchuť pasterizační či oxidační, která se může objevit například u piva těsně před vypršením trvanlivosti. Její vznik ovlivňuje mimo jiné způsob plnění a uchovávání piva (www 4). Charakter hořkosti byl hodnocen jako nejjemnější u Desítky, která měla shodně u stanovení dle Folin – Ciocaulteau i HPLC nejnižší obsah polyfenolů (viz. Tab. 4,6). Velmi podobný obsah fenolických látek jako u Desítky měl i Džbán, jehož charakter hořkosti byl nejčastěji označován jako ulpívající. V obsahu polyfenolů se od předcházejících piv výrazněji lišil Březňák. Obsah byl vyšší a přesto byl charakter hořkosti nejčastěji označován jako mírně ulpívající. Několik hodnotitelů jej však označilo jako silně ulpívající, a to jako u jediného z piv. Lze tedy říci, že charakter hořkosti je závislý na obsahu polyfenolů v pivu. Čím více fenolických látek, tím drsnější charakter hořkosti. Produkty vyškovského pivovaru získávají ocenění i na různých soutěžních akcích. Namátkou např. Džbán získal Českou pivní pečeť 2007 a Zlatý pohár PIVEX PIVO 2005. Březňák získal v Žatci na 48. ročníku Dočesné (rok 2005) 4. místo v kategorii výčepních piv (www 5).
49
6 Závěr
6 ZÁVĚR Obsah polyfenolů byl stanoven dvěma různými metodami. První metoda zahrnuje zástupce metod stanovujících polyfenoly v jejich celkovém obsahu, a to metoda Folin – Ciocaulteau a druhá, modelová, je metoda HPLC. V modelové studii na ústavu Technologii potravin byla použita kyselina ferulová, jako zástupce polyfenolů při HPLC analýze v klasickém uspořádání s UV detektorem. Jako vzorky byly použity sladina, mladina, vzorky odebrané během chmelovaru a kvašení a hotová piva pivovaru Vyškov, u nichž byla provedena i senzorická analýza. Metoda Folin – Ciocaulteau podala informace o obsahu celkových polyfenolů, jejichž obsah se v meziproduktech se pohyboval od 60 do 120 mg/l. Nejvyšší obsah měla sladina a nejnižší 10° pivo. Ostatní vzorky se pohybovaly mezi těmito hodnotami. Metoda HPLC s UV detekcí umožňuje stanovit jednotlivé polyfenolické látky po sorbci na PVP. Modelovým standardem byla kyselina ferulová, jejíž nejvyšší obsah (33 mg/l) byl také stanoven ve sladině a nejnižší (12,1 mg/l) v 11° pivu. Po senzorické stránce 10° pivo s nejnižším obsahem polyfenolů odpovídalo nejjemnějšímu charakteru hořkosti. A to jak při stanovení metodou Folin – Ciocaulteau tak i HPLC. 11° pivo se obsahem polyfenolů velmi podobalo 10°. Přesto byl charakter hořkosti u 10° piva hodnocen mírněji než u piva 11°. Výrazněji se v obsahu polyfenolů lišil pouze 12° Březňák. Metodou Folin – Ciocaulteau byl obsah fenolických látek stanoven na 67,9 mg/l a metodou HPLC obsah kyseliny ferulové na 13,6 mg/l. Také charakter hořkosti byl častěji označován jako silně ulpívající. Nejvíc hodnotitelů se však shodlo na mírně ulpívajícím charakteru hořkosti. Spotřebitelé tedy i přes vyšší obsah polyfenolů nebudou nepříjemně překvapeni opravdu drsným a ulpívajícím charakterem hořkosti, který může být pro některé senzoricky nepřijatelný. Lze tedy říci, že charakter hořkosti je do jisté míry závislý na obsahu polyfenolů v pivu. Čím více fenolických látek, tím drsnější charakter hořkosti. Vyškovské pivo obsahuje poměrně vysoké množství kyseliny ferulové a také i polyfenolů. Je tedy možno říci, že umírněné pití (0,5 – 1l/den) tohoto produktu bude mít příznivý vliv na zdraví konzumentů. Obecně je doporučováno pití piva během jídla, kdy je jeho vstřebávání pomalejší a ochranný účinek delší.
50
7 Použitá literatura
7 POUŽITÁ LITERATURA (1)
Analytica EBC, Metod No. 9.11, 5. European Brewery Convention, 5. edition Hans Carl Geränke – Fachverlag; Nürnberg 1998 in DVOŘÁKOVÁ M., DOSTÁLEK P., HULÍN P. Analytické metody stanovení polyfenolů ve sladinách, mladinách a pivech. Kvasný průmysl, 2006, roč. 52, s. 111 – 114
(2)
BASAŘOVÁ G. Cesty piva. Vesmír, 2003, č. 82, s. 550 – 554
(3)
BASAŘOVÁ G. Fyzikálně – chemická (koloidní) stabilita piva. Potravinářská revue, 2005, č. 2, s. 24 – 27
(4)
BASAŘOVÁ G., ČEPIČKA J., DOLEŽALOVÁ A., KAHLER M., KUBÍČEK J., POLEDNÍKOVÁ M., VOBORSKÝ J. Pivovarsko – sladařská analytika. Merkanta Praha, 1993, 965 s.
(5)
BASAŘOVÁ G., HLAVÁČEK I. České pivo. NUGA Pacov, 1999, ISBN 80 – 85903 – 08 – 3, 231 s. (cit. s. 128)
(6)
BOIVIN P., MALANDA M., MAILLARD M. N., BERSET C., RICHARD H., HUGUES M., RICHARD – FORGET F., NICOLAS J. Proc. EBC Congr., Brussels 1995, s. 159 in ČEPIČKA J., KARABÍN M. Polyfenolové látky piva – přirozené antioxidanty. Chemické listy, 2002, č. 96, s. 90 – 95
(7)
BRIGGS D. E., BOULTON C. A., BROOKES P. A., STEVENS R. Brewing. Woodhead Publishing Limited, 2004, ISBN 1 5573 490 7, 881 p.(cit. p. 157)
(8)
ČEPIČKA J., KARABÍN M. Polyfenolové látky piva – přirozené antioxidanty. Chemické listy, 2002, č. 96, s. 90 – 95
(9)
DVOŘÁKOVÁ M., DOSTÁLEK P., HULÍN P. Analytické metody stanovení polyfenolů ve sladinách, mladinách a pivech. Kvasný průmysl, 2006, roč. 52, s. 111 – 114
(10) FAJTOVÁ K., HEJTMÁNKOVÁ A., LACHMAN J., PIVEC V., DUJDAK J. The contens of total polyphenolic compounds and trans – resveratrol in white Riesling originated in the Czech Republic. Czech J. Food Sci., 2004, vol. 22, p. 215 – 221 (11) HARRIS G., RICKETTS R. W. J. Inst. Brew., 1958, vol. 64, p. 22 in MOŠTEK J. Sladařství. SNTL Praha. 1975, typové číslo L18 – B2 – IV – 31/81963, 487 s. (cit. s. 131)
51
7 Použitá literatura (12) HLAVÁČEK F., LHOTSKÝ A. Pivovarství. SNTL Praha, 1972, typové číslo L18 – B2 – IV – 32/81882, 540 s. (13) HOFTA P. Xanthohumol – chmelová pryskyřice nebo polyfenol? Chemické listy, 2004, roč. 98, s. 825 – 830 (14) KALAČ P. Potravní fytoestrogeny a zdraví žen během klimakteria a po něm. Výživa a potraviny, 2006, roč. 61, s. 137 – 139 (15) KARABÍN M., DOSTÁLEK P., HOFTA P. Přehled metod pro stanovení antioxidační aktivity v pivovarství. Chem. Listy, 2006, roč. 100, s.184 – 189 (16) KELLNER V., ČULÍK J, JURKOVÁ M., HORÁK T. Charakterizace rozdílů senzorických profilů mezi skupinami tuzemských a zahraničních piv. Zpráva Výzkumného ústavu pivovarského a sladařského, a.s. Projekt České pivo, evidenční číslo úkolu VÚ 1/2002, 2003, 91 s. (17) KELLNER V., ČULÍK J., ČEJKA P., HORÁK T., JURKOVÁ M., GRYNOVÁ L., JANDERA P. Nová moderní metoda stanovení některých fenolických látek. Kvasný průmysl, 2004, č. 7 – 8, s. 210 (18) KLEJDUS B., VÍTÁMVÁSOVÁ – ŠTĚRBOVÁ D., KUBÁŇ V. Identification of isoflavone conjugates in red clover (Trifolium pratense) by liquid chromatography–mass
spektrometry
after
two–dimensional
solid–phase
extraction. Analytica Chimica Acta, 2001, vol. 450, p. 81 – 97 (19) KOSAŘ K. Technologie výroby sladu a piva. Praha. Výzkumný ústav pivovarský a sladařský, 2000, ISBN 80 – 902658 – 6 – 3, 398 s. (20) KROFTA K. Chmel – bohatý zdroj látek prospěšných pro lidské zdraví. Potravinářská revue, 2006, č. 1, s. 28 – 31 (21) KUŘEC M., HOFTA P., DOSTÁLEK P. Složky chmele s estrogenními účinky a jejich využití. Kvasný průmysl, 2005, roč. 51, s. 342 – 347 (22) LACHMAN J., HAMOUZ K., ORSÁK M. Červeně a modře zbarvené brambory, významný zdroj antioxidantů v lidské výživě. Chem. listy, 2005, roč. 99, s. 474 – 482 (23) MIKYŠKA A., KROFTA K., HAŠKOVÁ D. Hodnocení antioxidačních vlastností chmele a chmelových výrobků. Kvasný průmysl, 2006, č. 7 – 8, s. 214 – 225 (24) MODRIANSKÝ M., VALENTOVÁ K., PŘIKRYLOVÁ V., WALTEROVÁ D. Přírodní látky v prevenci onemocnění trávicího traktu. Chemické listy, 2003, roč. 97, s. 540 – 547
52
7 Použitá literatura (25) MOŠTEK J. Sladařství. SNTL Praha. 1975, typové číslo L18–B2–IV–31/81963, 487 s. (26) RACEK J. Zdravotní účinky piva z hlediska volných radikálů a antioxidantů. Kvasný průmysl, 2001, č. 7 + 8, roč. 47, s. 206 – 208 (27) REHMANJI M., GOPAL CH., MOLA A. A novel stabilisation of beer with Polyclar Brewbrite. MBAA Techn. Quart.39, 2002, No.1, p. 24 – 28 in MALINOVÁ Š., Změny kvality piva z produkce pivovaru Starobrno a.s. v průběhu jeho skladování. Diplomová práce, MZLU, 2005 (28) SELECKÝ R., ŠMOGROVIČOVÁ D. Antioxidačná aktivita medziproduktov při výrobe piva. Kvasný průmysl, 2006, roč. 52, s. 226 – 227 (29) SIEBERT K., TROUKHANOVA N., LYNN P. Nature of Polyphenol–Protein Interactions. J. Agric. Food Chemistry, 1996, vol. 44, p. 80 – 85 in ČEPIČKA J., KARABÍN M. Polyfenolové látky piva – přirozené antioxidanty. Chemické listy, 2002, č. 96, s. 90 – 95 (30) SLANINA J., TÁBORSKÁ E. Příjem, biologická dostupnost a metabolismus rostlinných polyfenolů u člověka. Chemické listy, 2004, roč. 98, s. 239 – 245 (31) STRATIL P. Přírodní antioxidanty. Doktorská disertační práce, 2005, Chemie P 1407, 150 s. (32) VEJRAŽKA M., Signální funkce volných radikálů. Vesmír, 2004, roč. 83, s. 170 – 172 (33) VELÍŠEK J. Chemie potravin. OSSIS. 2002, ISBN 80–86659–01–1, 320 s., (cit. s. 203)
WWW zdroje
(34) ANTON M., MIKYŠKA A. Pivo a klimakterium. 2007 [on – line] http://www.vetrnemlyny.cz/rozrazil/online/tisk.php?clanek_id=57 [cit. 2007 – 02 – 16] (35) BOGNÁR P. Protirakovinové látky v pive. 2005 [on – line] http://www.kamnapivo.sk/webtron/protirakovinove-latky-pivo.html [cit. 2006 – 12 – 03] (36) FORSTER A. Polyfenoly v žateckém chmelu. Chmelařství, 1999, č. 8–9 [on–line] http://www.beer.cz/chmelar/international/polyf.html [cit. 2006 – 10 – 02] 53
7 Použitá literatura (37) GRYNOVÁ L., ŠKEŘÍKOVÁ V., JANDERA P., KELLNER V., HORNA A. Porovnání výskytu fenolických látek a flavonoidů v českých a zahraničních pivech metodou HPLC s CoulArray detekcí. Konference vitaminy 2003 [on – line] http://www.vitamins.cz/archiv/2003/doc/l/L_11C.doc [cit. 2007 – 05 – 08] (38) KATZKE Záznam z přednášky firmy INTERMAG. 1996 [on – line] www.pafpraha.cz/upl/albertfrey/100001s_Stabilizace.doc [cit. 2007 – 02 – 08] (39) KELLNER V. Pivo pod mikroskopem. 2004 [on – line] http://www.scienceworld.cz/sw.nsf/0/186A9691DC52695CC1256E9700492024? OpenDocument&cast=1 [cit. 2006 – 11 – 24] (40) MORAVCOVÁ J. Biologicky aktivní přírodní látky. 2006 [on – line] http://www.vscht.cz/lam/new/bapl2003-01.pdf [cit. 2006 – 11 – 23] (41) ROSA Z. Český chmel 2006. 2006 [on – line] www.mze.cz/UserFiles/File/Cesky%20chmel%202006.pdf [cit 2007 – 02 – 08] (42) ŠKACH J. Chmel a chmelovar. [on – line] www.homebrewing.cz/download.php?soubor=4 [cit. 2006 – 11 – 03] (43) ŠKEŘÍKOVÁ V., GRYNOVÁ L., JANDERA P. Využití CoulArray detektoru pro analýzu přírodních antioxidantů. [on – line] http://webak.upce.cz/~kalch/merck2003/pdf/15.pdf [cit. 2007 – 02 – 12] (44) www 1 Přehled výstavu českých pivovarů v ČR v letech 1990 – 2000 [on – line] http://www.beers.cz/dokumenty/2.pdf [cit. 2006 – 10 – 23] (45) www 2 Vývoj vybraných ukazatelů na zemědělství Ústeckého kraje [on – line] http://www.czso.cz/xu/edicniplan.nsf/t/96002C143E/$File/4234k03.pdf [cit. 2007 – 02 – 06]
54
7 Použitá literatura (46) www 3 www.pivovyskov.cz [cit. 2006 – 09 – 27] (47) www 4 http://www.radio.cz/cz/zpravy/69435 [cit. 2007 – 05 – 02] (48) www 5 http://www.svetpiva.cz/article.php?cat=21&ID=748 [cit. 2007 – 05 – 02] (49) www 6 http://www.sweb.cz/pivnistranky/Hodnoty.htm [cit. 2007 – 05 – 02]
55
POUŽITÉ ZKRATKY
ČR
Česká republika
DAD
detektor s diodovým polem
FRAP
(Ferric Reducing Ability of Plasma) schopnost plazmy redukovat železité ionty
HDL
(High Density Lipoproteins) lipoproteiny o vysoké hustotě
HPLC
(High Performance Liquid Chromatography) vysokotlaká účinná chromatografie
LC–MS po 2D–SPE (Liquid Chromatography – Mass Spectrometry after two – Dimensional Solid – Phase Extraction) kapalinová chromatografie po dvoudimenzionální extrakci tuhou fází LDL
(Low Density Lipoproteins) lipoproteiny o nízké hustotě
PF
polyfenoly
PVP
polyvinylpyrrolidon
PVPP
polyvinylpolypyrrolidon
56
Příloha 1
PŘÍLOHA 1 Seznam obrázků Obr. 1 Deriváty kyselin p–hydroxybenzoové a skořicové.............................................. 13 Obr. 2 Flavan .................................................................................................................. 13 Obr. 3 Chalkon................................................................................................................ 14 Obr. 4 Flavonol ............................................................................................................... 14 Obr. 5 Kvercetin ............................................................................................................. 15 Obr. 6 Anthokyanidin ..................................................................................................... 15 Obr. 7 Flavan, isoflavan, neoflavan ................................................................................ 15 Obr. 8 Podíl sladových (1) a chmelových (2) antioxidantů ve světlých a tmavých pivech ........................................................................................................................................ 19 Obr. 9 Izomerace xanthohumolu na isoxanthohumol..................................................... 20 Obr. 10 8–prenylnaringenin............................................................................................ 26 Obr. 11 Schema HPLC ................................................................................................... 36
57
Příloha 2
PŘÍLOHA 2 Seznam tabulek
Tab. 1 Hlavní skupiny fenolových sloučenin ................................................................. 11 Tab. 2 Hlavní skupiny polyfenolů piva .......................................................................... 12 Tab. 3 Dělení flavonoidů ................................................................................................ 12 Tab. 4 Obsah kyseliny ferulové ve vzorcích měřený metodou Folin – Ciocaulteau ...... 39 Tab. 5 Obsah jednotlivých polyfenolových složek v pivu.............................................. 41 Tab. 6 Obsah kyseliny ferulové ve vzorcích měřený metodou HPLC ........................... 46 Tab. 7 Senzorické hodnocení piva.................................................................................. 59 Tab. 8 Tabulka četnosti odpovědí................................................................................... 60
58
Příloha 2 Tab. 7 Senzorické hodnocení piva Znak jakosti
Body
Slovní charakteristika
Vůně
5 4 3 2 1 5 4 3 2 1 5 4 3 2 1 5 4 3 2 1 5 4 3 2 1
Velmi silná Silná Střední Slabá Velmi slabá Velmi silná Silná Střední Slabá Velmi slabá Plné, zaokrouhlené Plné Málo plné Nezaokrouhlené Prázdné Příjemné, řízné Řízné Málo řízné Zvětralé Velmi zvětralé Velmi jemná Jemná Mírně ulpívající Ulpívající Silně ulpívající
Chuť
Plnost
Říz
Charakter hořkosti
59
Vzorek číslo 1 2
3
4
Příloha 2 Tab. 8 Tabulka četnosti odpovědí Znak jakosti Vůně
Chuť
Plnost
Říz
Charakter hořkosti
Vzorek č. 1 9 26 25 9 1 6 20 30 13 5 28 27 8 4 27 36 4 18 26 18 8 1
Body 5 b. 4 b. 3 b. 2 b. 1 b. 5 b. 4 b. 3 b. 2 b. 1 b. 5 b. 4 b. 3 b. 2 b. 1 b. 5 b. 4 b. 3 b. 2 b. 1 b. 5 b. 4 b. 3 b. 2 b. 1 b.
60
2 1 16 28 24 1 10 24 26 8 7 33 23 4 1 10 31 25 3 10 21 21 19 -
3 3 12 28 20 5 13 30 23 5 13 41 17 1 11 41 16 7 21 23 13 2
Příloha 3
PŘÍLOHA 3 Seznam grafů
Graf 1 Změny obsahu polyfenolů během varního procesu (Folin – Ciocaulteau).......... 40 Graf 2 Chromatogram kyseliny ferulové rozp. v destilované vodě................................ 42 Graf 3 Stabilita kyseliny ferulové ................................................................................... 42 Graf 4 Sorbce kyseliny ferulové na PVP ........................................................................ 43 Graf 5 Chromatogram standardních roztoků kyseliny ferulové ..................................... 44 Graf 6 Kalibrační křivka s tabulkou ředění .................................................................... 44 Graf 7 Analýza piva (Desítka 10º).................................................................................. 45 Graf 8 Chromatogram vzorku CH10 .............................................................................. 46 Graf 9 Změny obsahu polyfenolů během varního procesu (HPLC) ............................... 47 Graf 10 Srovnání metody Folin – Ciocaulteau a HPLC ................................................. 48 Graf 11 Senzorické hodnocení vůně............................................................................... 62 Graf 12 Senzorické hodnocení chuti............................................................................... 62 Graf 13 Senzorické hodnocení plnosti............................................................................ 63 Graf 14 Senzorické hodnocení řízu ................................................................................ 63 Graf 15 Senzorické hodnocení charakteru hořkosti........................................................ 64 Graf 16 Celkové senzorické hodnocení 10º piva............................................................ 64 Graf 17 Celkové senzorické hodnocení 11º piva............................................................ 65 Graf 18 Celkové senzorické hodnocení 12º piva............................................................ 65 Graf 19 Senzorické hodnocení všech tří piv – srovnání ................................................. 66 Graf 20 Kalibrační křivka na kyselinu ferulovou ........................................................... 66
61
Příloha 3 Graf 11 Senzorické hodnocení vůně Vůně 30
četnost odpovědí
25
20
10° 11° 12°
15
10
5
0 5 b.
4 b.
3 b.
2 b.
1 b.
body
Graf 12 Senzorické hodnocení chuti Chuť 35
četnost odpovědí
30
25
10° 11° 12°
20
15
10
5
0 5 b.
4 b.
3 b.
body
62
2 b.
1 b.
Příloha 3 Graf 13 Senzorické hodnocení plnosti Plnost 45
40
četnost odpovědí
35
30
10° 11° 12°
25
20
15
10
5
0 5 b.
4 b.
3 b.
2 b.
1 b.
body
Graf 14 Senzorické hodnocení řízu Říz 45 40
četnost odpovědí
35 30 10° 11° 12°
25 20 15 10 5 0 5 b.
4 b.
3 b. body
63
2 b.
1 b.
Příloha 3 Graf 15 Senzorické hodnocení charakteru hořkosti Charakter hořkosti 30
četnost odpovědí
25 20 10° 11° 12°
15 10 5 0 5 b.
4 b.
3 b.
2 b.
1 b.
body
Graf 16 Celkové senzorické hodnocení 10º piva Desítka 40
35
četnost odpovědí
30
25
20
15
10
5
0 5 b. 4 b. 3 b. 2 b. 1 b. 5 b. 4 b. 3 b. 2 b. 1 b. 5 b. 4 b. 3 b. 2 b. 1 b. 5 b. 4 b. 3 b. 2 b. 1 b. 5 b. 4 b. 3 b. 2 b. 1 b. vůně
chuť
plnost
deskriptory
64
říz
ch. hořkosti
Příloha 3 Graf 17 Celkové senzorické hodnocení 11º piva Džbán 35
četnost odpovědí
30
25
20
15
10
5
0 5 b. 4 b. 3 b. 2 b. 1 b. 5 b. 4 b. 3 b. 2 b. 1 b. 5 b. 4 b. 3 b. 2 b. 1 b. 5 b. 4 b. 3 b. 2 b. 1 b. 5 b. 4 b. 3 b. 2 b. 1 b. vůně
chuť
plnost
říz
ch. hořkosti
deskriptory
Graf 18 Celkové senzorické hodnocení 12º piva Březňák 45
40
četnost odpovědí
35
30
25
20
15
10
5
0 5 b. 4 b. 3 b. 2 b. 1 b. 5 b. 4 b. 3 b. 2 b. 1 b. 5 b. 4 b. 3 b. 2 b. 1 b. 5 b. 4 b. 3 b. 2 b. 1 b. 5 b. 4 b. 3 b. 2 b. 1 b. vůně
chuť
plnost
deskriptory
65
říz
ch. hořkosti
Příloha 3 Graf 19 Senzorické hodnocení všech tří piv – srovnání Senzorické hodnocení piv-srovnání 45
40
četnost odpovědí
35
30
25
10° 11° 12°
20
15
10
5
0 5 b. 4 b. 3 b. 2 b. 1 b. 5 b. 4 b. 3 b. 2 b. 1 b. 5 b. 4 b. 3 b. 2 b. 1 b. 5 b. 4 b. 3 b. 2 b. 1 b. 5 b. 4 b. 3 b. 2 b. 1 b. vůně
chuť
říz
plnost
ch. hořkosti
deskriptory
Graf 20 Kalibrační křivka na kyselinu ferulovou
y = 0,0543x - 0,0698
1,2
1
0,8
0,6 A 0,4
0,2
0 0
5
10
15
-0,2 c [mg/l]
66
20
25
