MENDELOVA ZEMĚDĚLSKÁ A LESNICKÁ UNIVERZITA V BRNĚ AGRONOMICKÁ FAKULTA
DIPLOMOVÁ PRÁCE
BRNO 2009
PAVEL MACHÁŇ
Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav chemie a biochemie
Stanovení cizorodých látek ve víně Diplomová práce
Vedoucí práce: doc. Ing. Jan Pospíchal, CSc.
Vypracoval: Pavel Macháň Brno 2009
Poděkování Rád bych poděkoval vedoucímu mé diplomové práce doc. Ing. Janu Pospíchalovi, CSc. za vysoce odborné a cenné rady, nekonečnou trpělivost a vstřícnost díky které jsem mohl tuto diplomovou práci dokončit. Dále bych rád poděkoval Ing. Elišce Glovinové, PhD., bez níž by nikdy má práce rovněž nedosahovala nynějších kvalit.
PROHLÁŠENÍ
Prohlašuji, že jsem diplomovou práci na téma Stanovení cizorodých látek ve víně vypracoval(a) samostatně a použil(a) jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém seznamu literatury. Diplomová práce je školním dílem a může být použita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího diplomové práce a děkana AF MZLU v Brně.
dne…………………….………………….
podpis diplomanta……………………….
Obsah: 1
Úvod .............................................................................................................................8
2
Cíl .................................................................................................................................9
3
Antinutriční a toxické látky........................................................................................10 3.1
Rozdělení cizorodých látek ................................................................................10
3.2
Toxické látky......................................................................................................12
3.3
Aditivní látky......................................................................................................12
3.3.1 4
5
Výroba vína ................................................................................................................15 4.1
Bílé víno .............................................................................................................15
4.2
Červené víno ......................................................................................................16
4.3
Růžové víno (rosé) .............................................................................................16
4.4
Rozdělení vín......................................................................................................16
Cizorodé látky ve víně................................................................................................17 5.1
Aditivní látky......................................................................................................17
5.1.1
Konzervanty ...................................................................................................17
5.1.2
Stabilizátory a čiřící prostředky .....................................................................23
5.1.3
Regulátory kyselosti .......................................................................................25
5.2
6
Kategorie přídatných látek .............................................................................12
Kontaminanty a toxikologicky významné látky.................................................26
5.2.1
Biogenní aminy ..............................................................................................26
5.2.2
Rezidua pesticidů ...........................................................................................26
5.2.3
Ethylkarbamát ................................................................................................27
5.2.4
Mykotoxiny ....................................................................................................27
Metody pro analýzu cizorodých látek ve víně ...........................................................28 6.1
Odměrná analýza................................................................................................28
6.1.1
Acidobazické titrace .......................................................................................28
6.1.2
Komplexotvorné titrace..................................................................................28
6.1.3
Srážecí titrace .................................................................................................29
6.1.4
Oxidačně-redukční titrace ..............................................................................29
6.2
Nukleární magnetická rezonance .......................................................................29
6.3
Chromatografie...................................................................................................30
6.4
Elektromigrační separační metody.....................................................................31
6.5
Elektroforéza ......................................................................................................31
6.5.1
Kapilární zónová elektroforéza ......................................................................32
6.5.2
Micelární elektrokinetická chromatografie ....................................................32
6.5.3
Kapilární gelová elektroforéza .......................................................................32
6.5.4
Kapilární elektrochromatografie ....................................................................32
6.5.5
Kapilární izoelektrická fokusace ....................................................................33
6.6 6.6.1 6.7
7
8
Izotachoforéza ....................................................................................................33 Speciální izotachoforetické techniky .............................................................37 Jevy doprovázející kapilární ITP........................................................................38
6.7.1
Elektroosmóza ................................................................................................38
6.7.2
Joulovo teplo ..................................................................................................41
6.7.3
Difúze .............................................................................................................41
6.7.4
Gravitace ........................................................................................................41
6.7.5
Samozaostřující efekt .....................................................................................42
6.7.6
Vliv čistoty a složení elektrolytů....................................................................42
Izotachoforetická analýza...........................................................................................43 7.1
Kvalitativní analýza............................................................................................43
7.2
Kvantitativní analýza..........................................................................................44
7.2.1
Pracovní postupy ............................................................................................44
7.2.2
Volba pracovních elektrolytů .........................................................................46
Materiál a metodika....................................................................................................47 8.1
Laboratorní technika ..........................................................................................47
8.2
Elektrolyty..........................................................................................................47
8.3
Postup analýzy....................................................................................................47
8.4
Vyhodnocení ......................................................................................................52
8.4.1
Příklad výpočtu ..............................................................................................52
9
Diskuze.......................................................................................................................54
10
Závěr...........................................................................................................................58 10.1
11
Seznam obrázků a tabulek:.................................................................................59
Seznam použité literatury:..........................................................................................60
Abstrakt Tato práce se zabývá problematikou stanovení cizorodých látek vyskytujících se ve víně se zaměřením na jejich analýzu pomocí kapilární izotachoforézy. Hlavní cizorodé látky zahrnují přídatné látky a kontaminanty. Přídatné látky jsou látky, které jsou použity při výrobě potravin a stávají se jejich součástí, i když nemusí mít žádnou výživovou hodnotu. Kontaminanty jsou látky, které nejsou záměrně přidávány do potravin, ale jsou jejich součástí. Obsah těchto látek ve víně je omezen legislativou České Republiky a EU. Pro analýzu byla použita kapilární izotachoforéza a elektrolyty navrženy k analýze cizorodých látek aniontové povahy. Vedoucí elektrolyt se skládal z 0,01MHCl, β-alaninu jako protiionu a 0,001% HPMC jako modifikátoru elektroosmotického toku. Koncový elektrolyt byl 0,015M kyselina glutamová. Analýza vzorku trvala 30 minut. Izotachoforéza se ukázala být rychlou, spolehlivou a přesnou analytickou metodou pro stanovení vybraných přídatných látek a kontaminantů v potravinách. Klíčová slova: Kapilární zónová izotachoforéza, víno, přídatné látky, kontaminanty.
Abstract This work deals of extraneous substances contained in wine and its determination with focus on capillary isotachophoretic analysis. Main extraneous substances contains additives and contaminants. Food additive is any substance not used in food production as ingredient of the food, even though it may not have its nutritive values. Contaminants is any substance not intentionally added to food, which is present in food as a result of the production. Presence of this substances in food is regulated by legislation of Czech Republic and EU. For its determination was used capillary isotachophoresis and electrolyte solution proposed to anionic constituent analysis of extraneous substances present in wine. Leading electrolyte contains of 0,01M HCl, βAlanine as counter ion and electroosmotic flow modifyer 0,001% HPMC. Terminating electrolyte was 0,015M Glutamic acid. Results of analysis were resolved in 30 minutes. Isotachophoresis proofed to be a rapid, reliable and precise analytical method for determination of selected food aditives and contaminants. Keywords: Capillary isotachophoresis, wine, food aditives, contaminants.
1
ÚVOD Spotřeba vína má v České republice v posledních letech stabilně stoupající charakter.
V roce 1995 byla spotřeba vína na osobu 15,4l, v roce 2003 16,3l, v roce 2007 se spotřeba pohybovala už kolem 18,5l vína na osobu a rok (Bublíková a kol., 2009). Cizorodé látky (kontaminanty, rizikové látky) jsou látky organické i anorganické povahy, které nejsou přirozenou složkou potravního řetězce nebo jejich přítomnost, popř. zvýšení přirozeného obsahu v jednotlivých částech potravního řetězce, se může projevovat škodlivě až toxicky (Černá a Hrabětová, 1997). Cizorodými látkami ve víně rozumíme zejména potravinová aditiva (např. oxid siřičitý) a některé sekundárně při výrobě vzniklé látky, jako například biogenní aminy či uretan. Cizorodé látky mohou představovat pro spotřebitele bezprostřední či perzistentní nebezpečí, proto je jejich obsah ve víně legislativně omezen. Je důležité důsledně dodržovat a neustále zdokonalovat správné výrobní postupy minimalizující riziko vzniku a potřebu použití těchto látek. Pro přesné stanovení cizorodých látek se používají separační metody a to zejména metody elektromigrační a chromatografické. S vyššími legislativními omezeními obsahu nejen na obsah cizorodých látek přichází i větší nároky nejen na kvalitu a rychlost analytických metod, ale také i na jejich snadnou proveditelnost. Perspektivní analytickou metodou cizorodých látek ve víně se z pohledu spotřeby vzorku, rychlosti analýzy a nákladů se jeví kapilární izotachoforéza. Jedná se o přesnou a spolehlivou metodu, která si jistě zaslouží větší pozornost.
8
2
CÍL Cílem mé diplomové práce bylo vytvořit ucelený přehled problematiky cizorodých látek
ve víně se zaměřením na jejich analýzu s využitím moderních analytických metod. Dalším cílem bylo také navržení experimentálního izotachoforetického elektrolytového systému na přístroji CS Isotachophoretic analyser I. (Spiššká Nová Ves) schopného analyzovat volný oxid siřičitý ve víně.
9
3
ANTINUTRIČNÍ A TOXICKÉ LÁTKY Potraviny přijímané člověkem obsahují nejen látky prospěšných či indiferentních, ale
obsahují také látky antinutriční a toxické. Antinutriční látky ovlivňují aktivitu některých enzymů, vitamínů a minerálních látek, stravitelnost a využitelnost základních živin, a tím také výživovou hodnotu potravin (Velíšek, 2002). Toxické látky mohou v závislosti na rozsahu expozice (dávce) způsobit onemocnění či poškození organismu. Látky s toxickými účinky se označují jako jedy nebo toxika. Pokud jsou přírodního původu, nazývají se toxiny. Antinutriční a toxické látky jsou podle původu dvě základní skupiny sloučenin: •
Přirozené součásti potravin, tj. přírodní antinutriční a toxické látky; v potravinách se nacházejí jako důsledek genetických dispozic rostlinných nebo živočišných organismů je syntetizovat.
•
Cizorodé látky (Velíšek, 2002).
3.1 Rozdělení cizorodých látek Cizorodé látky se podle způsobu, jakým se do potravin dostávají, dělí na látky: •
Přidávané záměrně za účelem zvýšení kvality potravin při zpracování, skladování a dalších operacích (prodloužení jejich údržnosti, zlepšení senzorické, výživové nebo technologické jakosti), jsou proto látky přídatné neboli látky aditivní.
•
Dostávající se do potravin náhodně při výrobě, skladování, dopravě, prodeji aj. manipulacích (např. pesticidy z chemizace v zemědělství); vznikají fyzikálními a chemickými procesy (např. ozařováním, vzájemnými reakcemi složek potravin), jsou látky znečišťující kontaminující nebo kontaminanty, případně mohou být potraviny kontaminovány toxiny některých mikroorganismů (bakteriální toxiny a mykotoxiny) (Velíšek, 2002).
10
Toxické látky přírodní či cizorodé povahy vykazují různé účinky na živé organismy (biologické účinky). Biologické účinky nežádoucí, přinášejí riziko možné intoxikace (otravy), se nazývají toxické účinky. Toxické účinky se mohou projevovat jako: •
Akutní, po jednorázovém podání toxinu.
•
Pozdní, např. chronické, po opakovaném nebo kontinuálním podávání toxické látky (Velíšek, 2002).
Podle výše možného rizika (souvisejícího s dávkou) se nejčastěji rozlišují: •
Kontaminanty (zejména toxiny mikroorganismů, průmyslové kontaminanty, rezidua veterinárních léčiv a pesticidů), u kterých mohou být rizika značná, dlouhodobé účinky je ale těžké určit.
•
Přírodní toxické látky, kde určitá rizika stále existují, ale znalosti o účincích jsou vesměs nedostatečné.
•
Přídatné látky, u kterých jsou rizika malá (až na výjimky, kterými jsou dusitany a některé složky aromat).
•
Antinutriční látky, kde existují spíše jen rizika potenciální než reálná (odvozená většinou z antinutričních účinků projevujících se u zvířat) (Velíšek, 2002).
Množství přírodních toxických látek, aditivních látek a kontaminujících látek, které se mohou vyskytovat v zdravotně nezávadných potravinách a tabákových výrobcích se udává jako nejvyšší přípustné množství (NPM v mg/kg nebo mg/dm3), případně jako přípustné množství (u potravin denních potřeby, ale také např. u lahůdek) nebo jako speciální množství (např. u kojenecké
a
dětské
výživy).
Tato
data
jsou
výsledkem
toxikologických
a epidemiologických studií ( využívá se údajů o spotřebě příslušných potravin). Zahrnují takové bezpečnostní faktory, aby potraviny obsahující toxickou látky mohly být konzumovány denně po celý život bez prokazatelných negativních účinků (Velíšek, 2002). Cizorodé látky ve víně představují zejména látky záměrně přidané v samotném procesu výroby (aditivní látky), látky, které se do vína dostaly z kontaminované suroviny a látky, které ve víně vznikly nežádoucími mikrobiologickými a enzymatickými procesy. Mezi cizorodé látky
11
ve víně tedy patří zejména konzervanty, stabilizátory, čiřidla, biogenní aminy, rezidua pesticidů a ethylkarbamát.
3.2 Toxické látky Přírodní toxické látky se dělí na látky vyvolávající potravní nesnášenlivost (intoleranci), jsou toxické jen pro určité jedince a látky, které jsou toxické pro všechny jedince (Velíšek, 2002).
3.3 Aditivní látky Aditivní látky (přídatné látky) jsou látky, které se z technologických důvodů záměrně přidávají do potravin při jejich výrobě a stávají se tak součástí konečné potraviny. Jako potravina se nepoužívají samostatně a nemusí mít výživovou hodnotu. Podmínky pro jejich použití a kritéria stanovuje Vyhláška č. 304/2004 Sb., Vyhláška č. 318/2003 Sb. změna vyhlášky o zdravotních požadavcích na přídatné látky, Vyhláška č. 54/2002 Sb. zdravotní požadavky na identitu a čistotu přídatných látek a Vyhláška č. 113/2005 Sb. o způsobu označování potravin a tabákových výrobků. 3.3.1
Kategorie přídatných látek Dle Vyhlášky č. 304/2004 Sb. se přídatné látky podle účelu použití zařazují do níže
uvedených kategorií. Zařazení přídatné látky do kategorie je provedeno na základě její hlavní funkce, kterou látka v potravině obvykle plní. Zařazení přídatné látky do určité kategorie však nevylučuje možnost použití této látky pro další účely.
1. Antioxidanty – kterými jsou látky, které prodlužují údržnost potravin a chrání je proti zkáze způsobené oxidací, jejímiž projevy jsou např. žluknutí tuků a barevné změny potravin. 2. Barviva, kterými jsou látky, které udělují potravině barvu, kterou by bez jejich použití neměla, nebo které rekonstruují barvu, která byla poškozená či zeslabena během technologického procesu. 3. Konzervanty, kterými jsou látky, které prodlužují údržnost potravin a které je chrání proti zkáze způsobené činností mikroorganismů. 12
4. Kyseliny, kterými jsou látky, které zvyšují kyselost potraviny, nebo které jí udělují kyselou chuť. 5. Regulátory kyselosti, kterými jsou látky, které mění či udržují kyselost či alkalitu potraviny 6. Tavící soli, kterými jsou látky, které mění vlastnosti bílkovin při výrobě tavených sýrů za účelem zamezení oddělování tuku. 7. Kypřící látky, kterými jsou látky, nebo směsi látek, které vytváří plyny, a tak zvyšují objem těsta. 8. Sladidla, kterými jsou látky, které udělují potravinám sladkou chuť a nahrazují přírodní sladila a med. 9. Látky zvýrazňující chuť a vůni, kterými jsou látky, které zvýrazňují již existující chuť nebo vůni potraviny. 10. Zahušťovadla, kterými jsou látky, které zvyšují viskozitu potraviny. 11. Želírující látky, kterými jsou látky, které udílejí potravině texturu tím, že vytváří gel. 12. Modifikované škroby, kterými jsou látky, získávané výlučně chemickým zpracováním jedlých škrobů v nativním stavu nebo škrobů předtím pozměněných fyzikálními nebo enzymovými postupy nebo pozměněným působením kyselin, zásad nebo bělících činidel. 13. Stabilizátory, kterými jsou látky, které umožňují udržovat fyzikální vlastnosti potraviny. Mezi stabilizátory patří látky, které umožňují udržování homogenní disperze dvou nebo více nemísitelných látek v potravině. Dále sem patří látky, které stabilizují, udržují nebo posilují existující zbarvení potraviny. 14. Emulgátory, kterými jsou látky, které umožňují tvorbu stejnorodé směsi dvou nebo více nemísitelných kapalných fází nebo které tuto směs udržují. 15. Nosiče a rozpouštědla, kterými jsou látky, které se užívají k rozpouštění, ředění, disperzi (rozptylování) a jiné fyzikální úpravě přídatné látky, potravního doplňku a arómatu, aniž přitom mění jejich technologickou funkci nebo mají vlastní technologický efekt a jejichž užití usnadňuje manipulaci, aplikaci nebo použití přídatné látky. 16. Protispékavé látky, kterými jsou látky, které snižují tendenci jednotlivých částic potraviny ulpívat vzájemně na sobě.
13
17. Leštící látky, kterými jsou látky, které po nanesení na vnější povrch udělují potravině lesklý vzhled nebo vytváří ochranný povlak. Povlaky, které jsou jedlé nebo které jsou snadno odstranitelné, se nepovažují za leštící látky. 18. Balící plyny, kterými jsou plyny jiné než vzduch, které se zavádí do obalu před, během, nebo po plnění potraviny do obalu. 19. Propelanty, kterými jsou plyny jiné než vzduch, které vytlačují potravinu z obalu 20. Odpěňovače, kterými jsou látky, které zabraňují vytváření pěny nebo snižující pěnění. 21. Pěnotvorné látky, kterými jsou látky, které umožňují vytváření stejnorodé disperze plynné fáze v kapalné nebo tuhé potravině. 22. Zvlhčující látky, kterými jsou látky, které chrání potravinu před vysycháním tím, že působí proti účinkům vzduchu s nízkou relativní vlhkostí. Dále jsou to i látky, které podporují rozpouštění práškovitých potravin ve vodném prostředí. 23. Plnidla, kterými jsou látky, které přispívají k objemu potraviny, aniž významně zvyšují její energetickou hodnotu. 24. Zpevňující látky, kterými jsou látky, které činí tkáně ovoce a zeleniny pevnými nebo křehkými nebo tuto pevnost udržují a dále látky, které reakcí se želírujícími látkami ztužují gely. 25. Sekvestranty, kterými jsou látky, které vytvářejí chemické komplexy s ionty kovů. 26. Látky zlepšující mouku, kterými jsou látky jiné než emulgátory, které se přidávají k mouce, nebo do těsta za účelem zlepšení pekařské kvality.
14
4
VÝROBA VÍNA Víno má být vyráběno jen z čistých hroznů, přídatných a konzervačních látek, které
odpovídají požadavkům stanovených vinařským zákonem (Kraus a kol., 2000). Základní surovinou pro výrobu vína je hrozen révy vinné složený z bobulí a třapiny. Třapina se při většině používaných výrobních postupů odděluje od bobulí jako odpad. Bobule jsou pro výrobu vína nejdůležitější. Je složena ze slupky, peciček a dužiny. Slupka obsahuje zejména barviva a aromatické látky. Pecičky obsahují olej a třísloviny. Dužina je složena z cévních svazků a sladké šťávy – moštu (Kraus a Kopeček, 2002). Technologie výroby vína je závislá na tom, z jakých hroznů ho vyrábíme a jaký má být hotový výrobek. Proto postupujeme podstatně jinak při výrobě bílého vína, než při výrobě vína červeného či růžového (Kraus a kol. 2000)
4.1 Bílé víno Bílé víno je vyráběno ze žlutých, růžových a červených hroznů. Pro jeho výrobu jsou nejvhodnější růžové odrůdy. Sklizené hrozny jsou co nejdříve převezeny z vinice ke zpracování, kde je bobule oddělena od třapin a její slupka je narušena. Takto upravené bobule s narušenými slupkami bez třapin se nazývají rmut. Běžné odrůdy na výrobu bílých vín jsou ihned lisovány. U aromatických odrůd je rmut ponechán naležet nebo částečně nakvasit. Účelem nakvášení je vyloužení co největšího množství aromatických látek (Kraus a kol., 2000). Rmut se následně lisuje na různě konstruovaných zařízeních, která pod tlakem oddělují mošt od slupek a peciček. Získaný mošt se odkaluje, oddělují se mechanické nečistoty a část mikroorganismů sedimentací a následným stočením. Odkalený mošt se nechává prokvášet. Nejdůležitější částí při kvašení je přeměna jednoduchých
cukrů kvasinkami (saccharomyces cerevisiae) obsažené v moštu
na alkohol, oxid uhličitý a teplo. Ve fázi kvašení se kvasicí mošt nazývá burčákem. Je to meziprodukt při každé výrobě bílého vína. Burčák obsahuje asi 6% ethanolu, je sladký a obsahuje velké množství vitálních kvasinek, jejichž biomasa obsahuje množství vitamínů skupiny B. Postupně všechen cukr prokvasí, kvasinky odumírají a sedimentují na dno nádoby. Víno se začíná samovolně čistit. Mladé víno se stáčí, čímž se oddělují odumřelé kvasinky a ostatní sedimenty. Víno se následně školí – připravuje se na láhvování (Kraus a Kopeček, 2002).
15
4.2 Červené víno Červené barvivo je až na výjimky uloženo pouze ve slupkách bobulí. Kdyby byly hrozny na výrobu červeného vína ihned po sklizni lisovány menším tlakem, získáme bezbarvý mošt, ze kterého po prokvašení vznikne bílé víno, které se nazývá klaret. Chceme-li vyrobit víno červené, musíme barvivo ze slupek bobulí vyluhovat. Obdobně jako u bílých hroznů je nejdříve připraven rmut, který je uložen v otevřené nebo uzavřené nádobě a je nechán prokvášet. Při prokvášení vzniká ethanol, který urychluje vyluhování barviva do roztoku. Vedle barviva se však uvolňují i jiné látky obsažené v bobulích. Je to především trpký a svíravý tanin (Kraus a Kopeček, 2000). Proto je důležité odhadnout dobu vyluhování tak, abychom získali dostatek barvy, ale aby víno nebylo příliš svíravé chuti. Délka nakvašování je závislá na množství rmutu, teplotě místnosti i průběhu kvašení a obvykle trvá 5 – 10 dní. Dlouhé nakvášení je nevhodné, protože vzniká také riziko naoctění vína. Pro nakvášení je nejvhodnější teplota 20 – 25°C (Kraus a kol., 2000). Červené víno zpravidla bývá svíravé – trpké, záleží však na poměru těchto svíravých látek s obsahem kyselin, cukrů, alkoholů a hořkých látek (Kraus a Kopeček, 2002).
4.3 Růžové víno (rosé) V posledních letech se zvyšuje mezi lidmi zvyšuje popularita vín růžových. Jsou to vína univerzální, neboť studená chutnají jako bílá a po zahřátí jako červená. Růžové víno je možno vyrobit několika základními způsoby: 1. Míchání modrých a bílých hroznů. Hrozny obou barev se sklidí, nechají několik hodin odležet a pak se lisují. 2. Míchání hotového bílého a červeného vína. Jedná se o nejméně z hlediska kvality uznávaný technologický postup. 3. Výroba z modrých hroznů, které jsou ponechány ležet jen po krátkou dobu, po kterou se ještě nestačí vyluhovat barviva ze slupky (Kraus a Kopeček, 2002).
4.4 Rozdělení vín Zákon č. 321/2004 Sb. dělí vína do jakostních tříd. Výchozím kritériem pro třídění je stanovená minimální cukernatost moštu ve stupních normovaného moštoměru (°NM). Základní kategorie vín tvoří vína stolní, jakostní a jakostní s přívlastkem. Tato vína musí být
16
pocházet pouze z vinic vhodných pro tvorbu jakostních vín stanovené oblasti a pro tvorbu jakostních vín a objem produkce nesmí překročit maximální stanovený výnos 12t/ha za rok.
Tab. 1 Rozdělení vín Kategorie vína
Minimální cukernatost moštu
Stolní víno Zemské víno Jakostní víno
odrůdové známkové Jakostní víno s přívlastkem: Kabinetní víno Pozdní sběr Výběr z hroznů Ledové víno Slámové víno Výběr z bobulí Výběr z cibéb
5
11°NM 14°NM 15°NM 15°NM 19°NM 21°NM 24°NM 27°NM 27°NM 27°NM 32°NM
CIZORODÉ LÁTKY VE VÍNĚ
5.1 Aditivní látky 5.1.1
Konzervanty Jsou látky prodlužující údržnost potravin. Jejich účinek spočívá v potlačení rozvoje
mikroorganismů, čímž se omezí jejich znehodnocení (Velíšek, 2002). Chemosterilace, při níž dochází k usmrcení mikroorganismů se uplatňuje pouze výjimečně a většinou nepřímo, tedy nikoli k jejich usmrcení v potravině, nýbrž v obalech a v prostředí. Chemoanabióza činnost mikroorganismů pouze omezuje a její rozsah uplatnění je poměrně široký. Velmi často se chemoanabióza využívá v kombinaci s jinými anabiotickými i abiotickými konzervačními metodami. Při chemoanabióze se činnost mikroorganismů pouze potlačuje. Ovšem nelze vyloučit, že při dlouhé době působení a vysoké koncentraci konzervantů, byť to není hlavním cílem, může docházet i k jejich usmrcení (Ingr, 2007).
17
Chemická činidla ochromují mikroorganismy napadením jejich buněčné stěny, významných enzymů, jiných klíčových složek mikrobiální buňky (např. nukleové kyseliny), nebo působením na prostředí mikroorganismů (Ingr, 2007).
5.1.1.1 Oxid siřičitý a siřičitany Oxid siřičitý a některé z jeho sloučeniny slouží nejen jako konzervační a antioxidační prostředky, ale používají se také k inhibici reakcí enzymového a neenzymového hnědnutí a k bělení. Podstatou mikrobiologické funkce SO2 je, že působí degradačně na mikrobiální apoenzymy a z biochemických procesů odnímá aldehydy (Velíšek, 2002). Tímto způsobem redukuje nástup oxidačních tónů acetaldehydu ve vůni vína (oxidační buket), které jsou ve většině případů nežádoucí (Rájecký, 2002). Přídavek oxidu siřičitého do vína (tzv. síření) plní víceré úlohy: Pomáhá tvárnit víno, udržuje jej ve svěžím a zdravém stavu, redukuje mnohé látky vína (polyfenoly, anthokyanové barviva, třísloviny), čímž zvyšuje stabilitu a kvalitu vína. Zabraňuje tvoření stařinky ve vínech, udržuje jeho redukční prostředí a usměrňuje rychlost kvašení. Při čiření moštů pomáhá srážení koloidů, podporuje extrakci barviv, zabraňuje tvorbě železitých zákalů. Nejdůležitější jsou však jeho antimikrobní a antioxidační vlastnosti (Malík, 1994).
Ve vodných roztocích oxidu siřičitého (SO2 se rozpouští až na 9,5% roztok při 20°C) vzniká kyselina siřičitá, jejímž anhydridem je oxid siřičitý. Kyselina disociuje do dvou stupňů (pK1 = 1,76, pK2 = 7,2). V závislosti na pH prostředí jsou proto v roztocích kromě SO2 a nedisociované kyseliny přítomny hydrogensiřičitanové ionty(HSO3-) a siřičitanové ionty(SO32-). V kyselých potravinách převládají hydrogensiřičitany: SO2 + H2O ↔ H2SO3 ↔ H+ + HSO3- ↔2H+ + SO32-
Jako konzervant se uplatňuje nedisociovaná kyselina, jediná forma účinná proti kvasinkám, proto jsou oxid siřičitý a siřičitany účinné v kyselých potravinách (Velíšek, 2002). Kyselina siřičitá ve víně potlačuje rozvoj nejen kvasinek, ale i bakterií zodpovědných za sekundární a nežádoucí fermentační projevy – druhotné kvašení. Hlavně pro tuto vlastnost se SO2 přidává do vína již více než 100 let (Rájecký, 2002).
18
Mechanismus působení H2SO3 na mikroorganismy se vysvětluje blokováním apoenzymu dehydrogenázy a vitamínu thiaminu. Ušlechtilé vinné kvasinky si však thiamin dokáží syntetizovat, proto jsou na oxid siřičitý adaptabilní. Oxid siřičitý působí proti některým baktériím již v koncentracích kolem 1 - 2mg/l, kde se jedná o bakteriostatický účinek, vyšší koncentrace působí baktericidně. Koncentrace 1-10mg/l (při pH 3,5) např. inhibují v ovocných výrobcích mléčné kvašení (Velíšek 2002). Na potlačení rozvoje bakterií, vláknitých hub a divokých kvasinek postačí koncentrace 50-150mg/l SO2. Na potlačení činnosti ušlechtilých vinných kvasinek je potřebná koncentrace 300-600mg/l SO2- (Malík, 1994). Do vína se přidává v množství 30 – 50mg/l (Rájecký, 2002). Antioxidační účinek spočívá v reakci s různými složkami mikrobiálních buněk (interakce s thiolovými skupinami strukturních proteinů a enzymů, s kofaktory enzymů, nukleovými kyselinami a lipidy) (Velíšek, 2002). Oxid siřičitý tvoří ve víně řadu adičních produktů s aldehydy, ketony a také s cukry, ve kterých je ireverzibilně vázán. S některými meziprodukty reakcí neenzymového hnědnutí tvoří stabilní produkty. Oxid siřičitý také štěpí disulfidové vazby v proteinech, štěpí thiamin na neúčinné sloučeniny, tvoří adukty s riboflavinem, nikotinamidem, vitaminem K a chrání vitamin C před oxidací. Redukuje o-chinony vzniklé reakcemi enzymového hnědnutí zpět na o-difenoly a odbarvuje anthokyany ovoce (Velíšek, 2002).
Síření vína Oxid siřičitý se ve víně nachází ve formě volné i vázané kyseliny siřičité. Kvantitativní rozměr mezi těmito formami je závislý na pH a teplotě. Volná kyselina siřičitá se ve víně nachází převážně v disociované formě (HSO3-, SO32-), jen její velmi malé množství se nachází v účinné formě nedisociovaných molekul (H2SO3) 1-3mg/l. Vázaná kyselina siřičitá se nachází ve formě kyseliny acetaldehydsiřičité. Množství celkové i vázané kyseliny siřičité závisí na koncentraci acetaldehydu. Čím je pH vína nižší, tím větší podíl kyseliny siřičité je ve víně obsažen a tím je i větší antimikrobiální účinnost (Malík, 1994).
19
Obr. 1 Procentuelní zastoupení jednotlivých forem kyseliny siřičité v závislosti na pH (Rájecký, 2002).
Obr. 2 Spotřeba SO2 pro dosažení biologické a oxidační stability vína v závislosti na pH (Rájecký, 2002).
20
Antioxidační vlastnosti kyseliny siřičité jsou dány tím, že oxid siřičitý odebírá prostředí kyslík a oxiduje se na oxid sírový (SO3). Rozpustnost kyslíku ve víně vzrůstá zvyšováním tlaku, snižováním teploty, nižším obsahem extraktu a snižováním koncentrace SO2 (Malík, 1994). Vinný mošt je během drcení a lisování, včetně operací nakvášení u červených vín, vystaven velkému působení vzdušného kyslíku. Ten způsobuje oxidační hnědnutí a to díky přítomnosti enzymu polyfenoloxidázy, který je obsažen v hroznech a silně podporuje oxidační hnědnutí v těchto fázích (Rájecký, 2002). Rychlost rozpouštění kyslíku ve vodném prostředí urychluje přítomnost alkoholu. Obsah kyslíku ve víně se pohybuje v rozmezí 0,5 - 7,0mg/l. Na vázání 1mg O2 je potřeba 6mg SO2 (Malík, 1994). Z hlediska výživy člověka je potřebné přísun SO2 do organismu omezit. Průměrný denní příjem by neměl přesáhnout 40mg SO2. Bolesti hlavy, nevolnost a jiné subjektivní těžkosti můžou být způsobené tím, že SO2 způsobuje v organismu degradaci sirných aminokyselin a hromadění intermediátů v krvi a v játrech (Malík, 1994). Siřičitany mohou vyvolávat těžké, dokonce život ohrožující astmatické reakce. Prevalence přecitlivělosti na siřičitany byla u dospělých astmatiků stanovena na přibližně 5 %. U těžkého kortikodependentního průduškového astmatu se zdá prevalence vyšší (Ettlerová, 2003). Způsoby síření vína Intenzita síření závísí na chemickém složení, zdravotním stavu, charakteru, věku a hodnotě redoxního potenciálu vína. Slabé síření je výhodné pro vína, ve kterých ještě neproběhlo jablečno-mléčné kvašení. Střední stupeň síření se aplikuje u zdravých vín, silné síření u moštů a vín vyrobených z poškozené suroviny. Velmi silné síření se výjimečně doporučuje při odkalování moštů a při ošetřování nemocných vín (Malík, 1994). Mošt i víno možné sířit spalováním sirných plátků, dávkováním siřičitanu draselného nebo kapalného oxidu siřičitého. Spalováním se síra oxiduje na oxid siřičitý (Malík, 1994). Sirné plátky se vyrábějí přetahováním podložky přes roztavenou síru. Ve vinařské malovýrobě používáme nekapavé sirné plátky s hmotností síry 3 – 6g. Spálením jednoho sirného pásku se do prostředí uvolní 6 - 12g SO2. Když počítáme s 30 – 70% využitím oxidu siřičitého, spálením jednoho plátku ve stolitrové nádobě se 1l vína nasytí 30-60mg celkového SO2. Ošetřované víno není možné přesířit, ale také není možné přesně určit dávku síření. Další nevýhodou je, že ošetřované víno je možné plynným oxidem siřičitým sířit jen při jeho stáčení (Malík, 1994).
21
Při síření disiřičitanem draselným se K2S2O5 ve víně rozkládá kyselinou vinnou na oxid siřičitý, hydrogenvinan draselný a vodu. Molekula K2S2O5 do vína reálně uvolní cca 50% SO2. Při použití disiřičitanu sodného se působením kyselin uvolní 67% SO2. Způsob aplikace disiřičitanů je velmi jednoduchý. Vypočítané množství se nejdříve rozpustí ve víně a v menší nádobě, poté se přelije do sudu a promíchá. Výhodou tohoto síření, za předpokladu přesného odvážení a důkladného rozmíchání, je přesné dávkování SO2. Disiřičitany je potřeba skladovat ve vzduchotěsných obalech (Malík, 1994). Pro vinařskou velkovýrobu je nejvhodnější způsob síření kapalným nebo stlačeným SO2. Přesné dávkování zabezpečuje dávkovací zařízení Dávkování a koncentrace oxidu siřičitého se udává v mg/l (Malík, 1994). Nepozorným dávkováním je možné víno lehce přesířit. Přesíření vína nepříznivě ovlivňuje jeho vůni a chuť. Přesířené mladé víno můžeme poměrně snadno napravit provzdušněním. Přesíření starších vín působí větší problémy, protože provzdušňování ochuzuje víno o buket a urychluje proces stárnutí. Starší přesířené vína napravujeme scelováním s méně sířenými víny (Malík, 1994).
Tab. 2 Dávky pro síření rmutu Zasíření
Dávka na 100 litrů Disiřičitanu draselného v g
Sirných knotů
Velmi slabé
3
0,3
Slabé
6
0,5
Střední
10
1
Silné
15
1,5
Velmi silné
20
2 (Kraus a kol., 2000)
Jiné způsoby odsíření vín v malovýrobě nepřicházejí v úvahu. Použití peroxidu vodíku na odsíření je velmi nebezpečné - vína dostávají těžko odstranitelnou kovovou příchuť, ale obsahují i zdraví nebezpečné oxidační zplodiny peroxidu. V průmyslové praxi se na odsíření vína a zahuštěných moštů používají speciální odsiřovací zařízení (Malík, 1994).
22
Limity pro obsah SO2 stanovuje vyhláška č. 304/2004 Sb. U tichých vín nesmí celkový obsah SO2 překročit 160 mg/l u červeného vína a 210 mg/l u bílého nebo růžového vína. Pokud je obsah zbytkového cukru vyšší než 5 g/l, zvyšuje limit na 210 mg/l pro červené víno a na 260 mg/l pro bílé nebo růžové víno. Některá česká vína mají výjimky a to 300 mg/l pro pozdní sběr, 350 mg/l pro výběr z hroznů a 400 mg/l pro výběr z bobulí, výběr z cibéb, ledové víno, slámové víno. U šumivých a perlivých vín je hranice stanovena na 235 mg/l.
5.1.1.2 Kyselina sorbová a sorbáty Jedná se o vysoce účinnou konzervační látku, která blokuje dehydrogenázový systém kvasinek a plísní. Ve vinařství se používá spolu s její solí sorbátem draselným zároveň jako stabilizátor. Zejména cenné je její působení proti toxikogenním houbám (A. flavus, A. ochraceus) (Ingr, 2007). Kyselina sorbová je ve vodě a víně téměř nerozpustná a proto nemůže být přidávána přímo do vína. Dobře se rozpouští v 96% ethanolu zahřátém na 35 - 45°C. Je výhodnější používat její soli rozpustné ve víně, např. sorbát draselný, se kterým se snadněji manipuluje a je levnější. Při výpočtu potřebné dávky se vychází z toho, že 100mg kyseliny sorbové odpovídá 134mg sorbátu draselného. Sudová vína se ošetřují sorbátem draselným pokud v nich chceme udržet zbytkový cukr. Kyselina sorbová ani sorbát draselný neovlivňují celkový vývin a zrání vína. Zásadně přidáváme sorbáty či kyselinu sorbovou pokud vína mají přes 5g/l zbytkového cukru. Maximální množství přidané kyseliny sorbové a sorbátů ve víně omezuje vyhláška č. 304/2004 Sb. na 200mg/l (Kraus a kol., 2000).
5.1.2
Stabilizátory a čiřící prostředky Cílem stabilizace je omezení biochemických procesů, při nichž dochází k vysrážení látek
nacházejících se ve víně v době skladování, nalahvování a při přepravě. Většinou jde o látky koloidní povahy, které tvoří zákal vína. Stabilizovat se musí zejména proto, abychom vyrobili vína mladá, svěží a se zbytkem nezkvašeného cukru. Stabilizační látky zpravidla ochuzují víno o bílkoviny, soli organických kyselin, barvivo a většinu kovových kationů (Kraus a kol., 2000). 23
5.1.2.1 Bentonit Jedná se o zeminy obsahující silikáty vápníku, sodíku a hliníku, které se vyznačují adsorpční schopností vůči rozpuštěným bílkovinným látkám ve víně. Bentonity se dělí na vápenaté bentonity, které mají mírný odkyselovací efekt a uvolňují do vína vápník, sodné bentonity, které uvolňují do vína sodík a směsné bentonity, které zprůměrňují vlastnosti předchozích bentonitů. Aby se zabránilo zvýšení obsahu sodíku ve víně, mohou se používat jen čisté vápenaté nebo směsné bentonity (Steidl, 2002).
5.1.2.2 Hexakyanoželeznatan draselný Používá se na odstranění železa, mědi a dalších kovů. Při použití hexakyanoželeznatanu draselného se jedná o tzv. „modré čiření“. Po přidání rozpuštěného hexakyanoželeznatanu draselného se víno zbarví modře, po pár hodinách vzniknou vločky, které se usadí na dně (Steidl, 2002). 5.1.2.3 Želatina Bílkovinný preparát, který je vyráběný z kostí a chrupavek. Želatina reaguje s tříslovinami za vzniku snadno sedimentujícího komplexu (Steidl, 2002).
5.1.2.4 Gel kyseliny křemičité Jedná se o tekutou kyselinu křemičitou, která při hodnotách pH vína vykazuje na svém povrchu záporný elektrický náboj. Používá se zejména u mladých vín k oddělení kvasnic a ke zlepšení filtrovatelnosti (Steidl, 2002).
5.1.2.5 Vyzina Je klasický čiřící prostředek, který pochází ze sušených vzduchových měchýřů vyzy, jesetera nebo sumce. Vyzina se do vína přidává v množství 1 – 2 g/hl (Steidl, 2002).
5.1.2.6 Kasein Mléčná bílkovina kasein se získává z odstředěného mléka. Reaguje s tříslovinami, ale i barvivy. Lze jím snížit vysokou barvu bílého vína (Steidl, 2002).
24
5.1.2.7 Bílek Nejstarší čiřidlo získávané ze slepičích vajec, které zjemňuje zejména tvrdá vína. Účinnou látkou je bílkovina albumin (Steidl, 2002).
5.1.2.8 PVPP Polyvinylpolypyrrolidon je specifický bílkovinný přípravek vykazující vysokou adsorpční schopnost ke tříslovinám a vysoké barvě vína. V nízkých dávkách výrazně snižuje obsah tříslovin bez ovlivnění aroma vína (Steidl, 2002).
5.1.2.9 Tanin Tanin je tříslovina s záporným povrchovým nábojem. Je chuťově neutrální a vhodný zvláště pro bílá vína (Steidl, 2002).
5.1.3
Regulátory kyselosti Částečné odkyselování moštu je a mladého vína je povoleno v jakémkoliv rozsahu, v již
hotovém víně je povoleno odkyselování maximálně o 1g/l. Minimální množství titrovatelných kyselin je u stolního vína 3,5g/l, ostatních vín 4,0g/l. Obsah kyseliny vinné musí být přinejmenším 0,4g/l vína. Maximální obsah uhličitanu vápenatého ve víně může být nejvýše 220mg/l (Seidl, 2002).
5.1.3.1 Uhličitan vápenatý Odkyselování vína se provádí nejběžněji uhličitanem vápenatým, který reaguje s kyselinou vinnou za vzniku vinanu vápenatého. 100g kyseliny vinné reaguje s 67g uhličitanu vápenatého. Pokud je odkyselován již mošt, tak zůstane ve víně vyšší obsah draslíku, který během kvašení reaguje s kyselinou vinnou za vzniku hydrogenvinanu draselného, který se s rostoucí koncentrací ethanolu postupně vysráží z roztoku. Jestliže se kyselina vinná váže na dodaný vápník a vysráží se, zůstane ve víně více draslíku, který se vyznačuje dobrými tlumícími schopnostmi – vína i s vyšším obsahem kyselin nechutnají kysele (Seidl, 2002).
25
5.2 Kontaminanty a toxikologicky významné látky 5.2.1
Biogenní aminy Biogenní aminy jsou skupinou alifatických, aromatických nebo heterocyklických bází,
které vykazují různé biologické účinky. Některé biogenní aminy mají samy významné biologické vlastnosti, neboť jsou například tkáňovými hormony (histamin), protoalkaloidy (hordenin, gramin) a stavebními látkami, které se účastní biosyntézy dalších hormonů živočichů (fenylethylamin), fytohormonů neboli auxinů, alkaloidů a dalších sekundárních metabolitů rostlin. Biogenní aminy odvozené od bazických aromatických (heterocyklických) aminokyselin jsou v nízkých koncentracích přirozenou složkou řady potravin, neboť v živočišných tkáních a rostlinných pletivech vykonávají řadu důležitých funkcí. Vznikají z aminokyselin působením karboxyláz (dekarboxyláz obsahujících jako kofaktor pyridoxalfosfát) nebo z aminokyselin karbonylových sloučenin působením transamináz. Při jejich transformaci na další biologicky aktivní produkty se uplatňují některé oxygenázy a methyltransferázy (Velíšek, 2002). Biogenní aminy vznikají ve víně zejména v průběhu technologického procesu výroby. Jejich obsah je závislý na použité technologii a surovině. Jejich obsah lze účinně snížit stabilizací a čiřením. Např. červená vína obsahují více histaminu než obsahují vína bílá. Zatímco kadaverinu, putrescinu a tyraminu obsahují více vína bílá. Koncentrace biogenních aminů se ve víně pohybuje od 0 do 200mg/dm3 (Velíšek, 2002).
5.2.2
Rezidua pesticidů Přechod reziduí pesticidů použitých k ochraně hroznů do finálního produktu je podmíněn
rozpustností dané látky ve vodě a rychlostí její degradace, především hydrolýzy. Kupříkladu s totálním transferem reziduí do finálního produktu je nutné počítat u polárního benomylu. Snížení hladin reziduí ve vinařství často používaných fungicidů, jako je polpet, kaptafol, propikonazol, triadimefon či vinklozolin, je naopak v procesu výroby vína značné, zejména díky sorbci zmíněných sloučenin na pevné odpady fermentačního procesu. (Velíšek, 2002). Opatrnosti je potřeba dbát při konzumaci burčáku či moštu, ve kterém mohou být buněčnou hmotou kvasinek obsahy jednotlivých pesticidů významně zvýšeny.
26
Tab. 3 Změny obsahu některých pesticidů při výrobě vína (% pokles oproti obsahu v hroznech) Pesticid Benomyl Polpet Chlorthalonil Iprodion Kaptafol Metalaxyl Vinklozolin
5.2.3
Čiřený mošt 0 95 60-80 95 30-50 80
Mošt 0 50 12-33 45-70 50 0 59-88
Víno 0,8 100 70-78 100 66 89-93 (Velíšek, 2002)
Ethylkarbamát Ethylkarbamát neboli uretan je přirozenou toxickou složkou potravin, která vzniká
zejména fermentací. Významným vlivem na množství obsahu ethylkarbamátu je také sluneční světlo. Ethylkarbamát je potenciálním karcinogenem. Jeho tolerovatelná dávka je 20ng/kg hmotnosti a den (Velíšek, 2002). Vyhláška č. 305/2004 Sb. stanovuje nejvyšší přípustné množství uretanu pro víno na 0,03mg/l.
5.2.4
Mykotoxiny Mykotoxiny jsou toxiny tvořené patogenními druhy plísní, přičemž mykotoxiny jsou
jejich sekundární metabolity. Mykotoxiny patří mezi mutagenní, neurotoxické, hepatotoxické, neurotoxické, teratogenní, estrogenní a karcinogenní látky. Jsou zpravidla odolné vůči vysokým teplotám. Mykotoxiny představují riziko zejména u potravin, které jsou vystaveny vyšší teplotě a vlhkosti, tedy podmínkám vhodným pro růst toxikogenních plísní (Velíšek, 2002). Ve víně představují riziko zejména plísně, které tvoří ochratoxin A. Tento toxin se vyskytuje ve zvýšeném množství zejména ve středomoří, kde se stal zdrojem významných problémů. Toxicita ochratoxinu A spočívá v tom, že se svou fenylalaninovou částí zapojuje do proteosyntézy a tím ji zastaví. Způsobuje tumory močového ústrojí (Velíšek, 2002). Výskyt ochratoxinu A v českých vínech a moštech je pod mezí stanovitelnosti. Riziko akutních toxických účinků je v českých vínech považováno za minimální (Ostrý a kol., 2005).
27
6
METODY PRO ANALÝZU CIZORODÝCH LÁTEK VE VÍNĚ
6.1 Odměrná analýza Odměrná analýza je založena na stanovení obsahu látek z objemu roztoku titračního činidla ke kvantitativnímu zreagování stanovované složky (Jančářová a Jančář, 2003). Činidlo, které je přidáváno ke stanovované látce se nazývá odměrný roztok, k úplnému zreagování stanovované složky dojde v tzv. bodě ekvivalence. Bod ekvivalence je možno indikovat metodami vizuálními nebo instrumentálně. Při vizuální indikaci se využívá viditelných změn, které probíhají při titraci. Při instrumentálních indikačních metodách se sledují změny různých veličin (pH, vodivost, absorbance, atd.) (Jančářová a Jančář, 2003). Podle hlavních uplatňujících se reakcí, lze rozdělit analýzy na několik základních typů: 1. Acidobazické. 2. Komplexotvorné. 3. Srážecí. 4. Oxidačně-redukční (Holzbecher, 1987).
6.1.1
Acidobazické titrace Acidobazické titrace jsou založeny na acidobazických reakcích. Základem všech
acidobazických titrací je rovnice: H+ + OH- H2O U alkalimetrie se jako odměrné roztoky používají zásady a stanovují se kyseliny. U acidimetrie se jako odměrné roztoky používají kyseliny a stanovují se zásady (Jančářová a Jančář, 2003). Pomocí acidobazických titrací se ve víně stanovuje obsah veškerých kyselin. 6.1.2
Komplexotvorné titrace Při
komplexotvorných
reakcích
vznikají
komplexy,
tedy
sloučeniny,
v nichž
se k centrálnímu atomu nebo iontu vážou ligandy dativní vazbou. Centrální atom nebo ion musí
28
mít ve svém elektronovém obalu volné orbitaly a ligand naopak musí poskytnout elektronový pár (Holzbecher, 1987). 6.1.3
Srážecí titrace U srážecích reakcí dochází ke vzniku málo rozpustné látky – sedliny. Vyloučením sedliny
z roztoku můžeme oddělit jednu nebo více složek od ostatních. Vznik charakteristicky zabarvené sedliny můžeme použit jako důkazu pro přítomnost určitého iontu. Sedlinu následně můžeme použít ke kvantitativnímu vážkovému stanovení (Holzbecher, 1987). 6.1.4
Oxidačně-redukční titrace Oxidačně-redukční titrace jsou založeny na redoxních reakcích mezi stanovovanou látkou
a odměrným roztokem. U oxidimetrických titrací se jako odměrný roztok používá roztok oxidačních činidel (jod, manganistan draselný). U reduktometrických titrací se jako odměrný roztok používá redukční činidlo (chlorid či síran amonný) (Jančářová a Jančář, 2003). Oxidačně redukční titrace mají význam při analýze volného i celkového oxidu siřičitého ve víně. Jako odměrný roztok se používá roztok iodu, který přímo oxiduje volný oxid siřičitý. Pro analýzu veškerého oxidu siřičitého je nutné pomocí NaOH narušit jeho vazby s karbonylovými sloučeninami. Jako indikátor se v obou případech používá škrobový maz (Balík, 1998).
6.2 Nukleární magnetická rezonance Atomová jádra některých prvků mají magnetický moment a ve vnějším magnetickém poli se
orientují
do
poloh,
kterým
odpovídají
určité
energetické
hladiny.
Absorpcí
elektromagnetického záření v oblasti krátkých rádiových vln dochází k přechodu jádra na vyšší energetické hladiny (Klouda, 2003). Deuterium obsažené v cukrech a vodě v hroznech je po kvašení rozděleno do tří molekul. Přidání exogenního cukru před zkvašením moštu má vliv na distribuci deuteria. Pomocí této metody lze určit, zda do vína nebyly přidán exogenní cukry. Tato metoda je schopna dle Nařízení komise EHS č. 2676/90 rozlišit vzájemně přídavek řepného, kukuřičného a třtinového cukru.
29
6.3 Chromatografie Chromatografie patří mezi separační metody. Využívá dělení látek obsažené ve vzorku mezi mobilní a stacionární fází. Vzorek je umístěn do mobilní fáze, kterou je unášen přes stacionární fázi. Stacionární fáze jednotlivé složky vzorku zachycuje, čímž dochází k separaci (Klouda, 2003). Chromatografické metody se člení do mnoha skupin dle skupenství mobilní fáze, uspořádání stacionární fáze a povahy děje, který probíhá při separaci. Dle skupenství mobilní fáze se dělí na: •
Kapalinovou chromatografii – mobilní fází je kapalina.
•
Plynovou chromatografii – mobilní fází je plyn.
Dle uspořádání mobilní fáze: •
Kolonová chromatografie – stacionární fáze je umístěna v koloně.
•
Plošné techniky – papírová chromatografie a tenkovrstvá chromatografie.
Dle povahy děje, který převládá při separaci: •
Rozdělovací chromatografie – o separaci rozhoduje odlišná rozpustnost složek vzorku.
•
Adsorpční chromatografie – o separaci rozhoduje různá schopnost složek adsorbovat se na povrch stacionární fáze.
•
Iontově výměnná chromatografie – o separaci rozhodují elektrostatické přitažlivé síly mezi vzorkem a stacionární fází.
•
Gelová chromatografie – složky se separují podle velikosti na pórovité struktuře gelu stacionární fáze.
•
Afinitní chromatografie – složky vzorku jsou děleny dle afinity ke stacionární fázi (Klouda, 2003)
Pro analýzu vína se z chromatografických separačních metod využívá zejména vysokoúčinné kapalinové chromatografie HPLC, pomocí které je možné stanovit ve víně obsažené organické i anorganické kyseliny (Bevilacqua a kol., 2004), (Wei a kol., 1999), biogenní aminy (Saaid a kol., 2009), rezidua pesticidů, aj. Tenkovrstvé a plynové chromatografie se dle nařízení komise EHS č. 2676/90 používá pro stanovení např. kys. sorbové.
30
6.4 Elektromigrační separační metody Elektromigrační separační metody jsou založeny na dvou elektrokinetických jevech – elektroforéze a elektroosmóze. V prostředí obsahujícím roztok s nabitými částicemi a pevné povrchy stýkající se s roztokem, které mohou nést elektrické náboje (stěny kapiláry, povrchy přítomných částic), se vytvářejí elektrické dvojvrstvy. Časem vzniká určité rovnovážné rozdělení nábojů. V elektromigračních separačních metodách je na toto prostředí připojeno stejnosměrné elektrické pole, které poruší rovnováhu v rozložení nábojů a vyvolá jejich pohyb (Klouda, 2003).
Elektroforéza – po aplikaci napětí se nabité částice dle náboje pohybují k opačně nabité elektrodě. Elektroosmóza – po aplikaci napětí se v křemenné nebo skleněné kapiláře pohybuje elektrolyt k záporné elektrodě (Klouda, 2003).
Základním kritériem dle kterého probíhá v elektrickém poli separace jednotlivých složek je rychlost jejich migrace (tzv. elektroforetická pohyblivost). (Klouda, 2003). Elektroforetická pohyblivost závisí na velikosti náboje a velikosti iontu. Elektromigrační separační metody tvoří jako chromatografické metody řadu modifikací, v nichž se používá jak samotné elektroforézy a její kombinace s elektroosmózou, tak i dalších separačních principů, které doplňují využití odlišných elektroforetických pohyblivostí o další rozdíly v chování analytů v daném prostředí (např. molekulově síťový efekt, rozdělování a adsorpce) (Klouda, 2003). Dle principu separace lze elektromigrační metody dělit na elektroforézu (CZE, MEKC, aj.), izotachoforézu a kapilární izoelektrickou fokusaci.
6.5 Elektroforéza Elektroforéza představuje analytický systém složený ze dvou elektrod a kontinuálního vodivého elektrolytu. Elektroforetické metody se dle použitého nosiče dělí na papírovou elektroforézu, gelovou elektroforézu (SDS-page, CGE) a kapilární elektroforézu (CZE, CE, MEKC, CEC).
31
6.5.1
Kapilární zónová elektroforéza Při kapilární zónové elektroforéze (CZE) dochází k separaci na základě velikosti rozdílu
náboje a velikosti látek. Složení elektrolytu je konstantní v celé kapiláře. Vzorek je nadávkován do jednoho konce kapiláry, poté je do systému připojeno konstantní napětí, jednotlivé ionty migrují k záporně nabité elektrodě. Průchodem kapilárou jsou rozseparovány dle výše uvedených kritérií a na konci kapiláry jsou identifikovány vhodným detektorem (Klouda, 2003). 6.5.2
Micelární elektrokinetická chromatografie Tato metoda je používána pro separaci a analýzu neutrálních látek, které nelze běžnou
elektroforézou dělit. V roztoku je přítomno vysoké množství povrchově aktivních látek (např. SDS – sodium dodecyl sulphate), které s neutrálními látkami vzorku vytvoří micely s nábojem, pomocí kterého se dokáží pohybovat k elektrodě. Dělení látek proběhne na základě velikosti, přičemž větší látky jsou schopny na svůj povrch přichytit více povrchově aktivních látek a tím vytvořit větší náboj. Této metody je možno využít i k měření molekulové hmotnosti biopolymerů (Klouda, 2003). 6.5.3
Kapilární gelová elektroforéza Tato metoda je vhodná pro analýzu vysokomolekulárních látek jako jsou proteiny,
nukleové kyseliny, komplexní lipidy, aj. Směs látek je nadávkována do kapiláry, která obsahuje porézní gel. Po zapojení separačního napětí dochází k dělení látek podle jejich velikosti. Největší polymery jsou zadržovány v gelu nejdéle a vychází jako poslední (Klouda, 2003). 6.5.4
Kapilární elektrochromatografie Jedná se o techniku, která kombinuje principy vysokoúčinné kapalinové chromatografie
a kapilární zónové elektroforézy. Kapilára při elektrochromatografii je plněna jako u HPLC mikročásticemi. Pro posun mobilní fáze není používáno čerpadla, ale elektroosmotického toku. V koloně nastává separace na stejných principech jako při HPLC. Pro účinnost separace je výhodný pístový profil toku při elektroosmotickém toku oproti laminárnímu proudění v chromatografické kapiláře (Klouda, 2003).
32
6.5.5
Kapilární izoelektrická fokusace Tato metoda využívá principu separace v gradientu pH dle různého izoelektrického bodu.
Gradient je vytvořen pomocí série pufrů s postupně se zvyšujícím pH. Vzorek je nadávkován do konce kapiláry s nižším pH a na to konec je připojena anoda. Amfolyty v vzorku migrují v kapiláře jako anionty a zastaví se jakmile dosáhnout pH, které odpovídá jejich izoelektrickému bodu (Klouda, 2003).
6.6 Izotachoforéza Začátek rozvoje kapilární izotachoforézy jako moderní instrumentální analytické metody se datuje do konce 60. a začátku 70. let a tento rozvoj byl iniciován pracemi Evaraetse a kol. (Boček, 1987). V izotachoforéze je vzrorek po nadávkování separován v diskontinuálním elektrolytovém systému vytvořeném vedoucím (Leading) a koncovým (Terminating) elektrolytem (Churáček J. a kol, 1993). Tyto elektrolyty jsou voleny tak, aby ionty vedoucího elektrolytu měly nejvyšší pohyblivost (mobilitu) v daném systému a ionty koncového elektrolytu tak, aby měly nejnižší pohyblivost. Na rozdíl od ostatních elektromigračních metod používáme upravené kapiláry, abychom eliminovali elektroosmotický tok. Při separaci aplikujeme konstantní stejnosměrný elektrický proud (Kvasnička, 2009). Separují se buď jenom kationty, nebo jenom anionty. Při separaci aniontů (analogicky pro kationty) se vzorek vnáší mezi vedoucí elektrolyt a elektrolyt koncový. Vedoucí elektrolyt je na začátku separace obsažen v anodovém prostoru a v koloně, přičemž elektrolyt koncový je obsažen v katodovém prostoru. Kromě separovaných aniontů jsou vždy obsaženy i opačně nabité protiionty, jejichž přítomnost je podmínkou zachování elektroneutrality v zónách. Je vhodné, aby protiionty ve všech elektrolytech (vedoucím, separovaném i koncovém) byly stejné (Klouda, 2003). Po připojení stejnosměrného napětí se udržuje konstantní proud řádově 102 µA, který začne separovat vzorek dle elektroforetické pohyblivosti. Rychlejší anionty se dostávají dopředu zóny přičemž pomalejší se v zóně opožďují. Po jisté době separace se ionty rozdělí a ustaví se stacionární stav. Anionty v něm tvoří jednotlivé zóny, ve kterých jsou rozděleny
33
dle své elektroforetické pohyblivosti. Po ustavení stacionárního stavu se zóny v kapiláře pohybují stejnou rychlostí, přičemž koncentrace iontu je uvnitř jeho zóny konstantní. Koncentrace iontu závisí na jeho elektroforetické pohyblivosti a na koncentraci a druhu vedoucího elektrolytu. Obsahuje-li vzorek více určitých aniontů, vytvoří širší zónu (Klouda, 2003). Tab. 4 Absolutní iontové pohyblivosti m0 vybraných látek při 25°C Kation m0 . 109 [m2 V-1 s-1] H3O+
Anion m0 . 109 [m2 V-1 s-1] 362,5
OH-
-205,5
K+
76,2
SO42-
NH4+
76,1
Br-
-81
Pb2+
71,5
Cl-
-79,1
Ca2+
59,3
F-
-57,4
Cd2+
54
HCOO-
-56,6
Zn2+
54
CITR2-
-54,7
Fe2+
54
HSO4-
-52
Mg2+
53
HCO3-
-46,1
Mn2+
52
H2PO4-
-35,1
-82,9
ß-Ala+
36,7
CH3(CH2)4COO-
-30,2
HIS+
29,6
GLU-
-28,9 (Kvasnička, 2009)
34
Vlastnosti izotachoforetických zón můžeme popsat následujícím způsobem: 1. Za vedoucí zónou obsahující vedoucí ion L migruje zóna iontu A; společným protiontem je R. Zóna A migruje stejnou rychlostí jako vedoucí zóna L.
v = u A E A = uL EL 2. Hustota hnacího proudu je konstantní pro konstantní průřez kapiláry. i = E A χ A = EL χ L 3. V zónách platí podmínka elektroneutrality. cR , L = cL cR, A = c A
4. Vodivosti v zónách jsou dány vztahy.
χ L = FcL ( u L + u R ) χ A = Fc A ( u A + u R ) Kombinací těchto vztahů dostaneme:
c A = cL
u A uL + uR uL u A + uR
Tato rovnice je též známá jako „Kohlrauschova regulační funkce“ explicitně vyjadřuje koncentraci látky A v její zóně. Koncentrace iontu A v jeho zóně je tedy pro daný vedoucí elektrolyt pevně dána (adjustována) nezávisle na koncentraci iontu v původním vzorku. Tímto mechanismem se upraví koncentrace všech druhů iontů ve svých zónách. Tudíž zředěný vzorek se zkoncentruje anebo se koncentrovaný vzorek naředí přechodem přes stacionární rozhraní. (Churáček J. a kol, 1993)
35
Obr. 3 Schéma separace směsi dvou látek v izotachoforetickém systému (Kvasnička, 2009)
Základní rozdíly izotachoforézy proti elektroforéze jsou tyto: •
Pracujeme s konstantním proudem (u elektroforézy s konstantním napětím).
•
Jednotlivé zóny se liší potenciálovým spádem, který silně závisí na pohyblivosti daných iontů (u elektroforézy byl potenciálový spád po délce kapiláry nebo desky rovnoměrný).
•
Rychlost pohybu zón je ve stacionárním stavu konstantní, v elektroforéze jsou odděleny.
•
Nehrozí promísení zón díky samozaostřujícímu efektu (u elektroforézy se zóny molekulární difuzí rozšiřují) (Klouda, P.)
36
Izotachoforéza může být realizována na stabilizujících nosičích (papír, gel) nebo ve volném roztoku, v analytickém či preparativním uspořádání. Uspořádání izotachoforézy ve volném roztoku v kapiláře je velmi výhodné pro využití v chemické analýze. Přednosti kapilárního uspořádání jsou zejména: •
Dělení a vyhodnocení analýzy se provádí ve volném roztoku, což eliminuje nedefinované interakce analytu s nosičem.
•
Kapilára o vnitřním průměru 100 až 1000 µm vykazuje antikonvekční stabilizující efekt (podobně jako gel či papír).
•
Elektroosmotický tok se potlačuje použitím vhodných materiálů na výrobu kapilár a aditiv do vedoucího elektrolytu.
•
On-line vyhodnocení analýzy (kvalitativní i kvantitativní) pomocí fyzikálních metod detekce.
•
Volbou vhodných podmínek analýzy (průměr kapiláry, koncentrace elektrolytů) lze dosáhnout velmi nízkých detekčních limitů.
•
Použitím kapilár malých průměrů se dá vzhledem na dobrý odvod tepla aplikovat vysoká proudová hustota, a tím urychlení analýzy.
•
Celý proces analýzy v kapilárním uspořádání lze automatizovat (Kvasnička, 2009).
6.6.1
Speciální izotachoforetické techniky
Izotachoforetickým přístrojem rozumíme nejen zařízení se separací v jedné kapiláře, ale také složitější zařízení pro speciální postupy a techniky, které zvyšují efektivitu izotachoforetické analýzy pro daný úkol. Mezi tyto techniky patří zejména spojování objemů a kolon, koncentrační kaskáda, protiproud vedoucího elektrolytu, preparativní kontinuální izotachoforéza (Kvasnička, 2009).
37
6.7 Jevy doprovázející kapilární ITP Kapilární izotachoforézu doprovází několik jevů, které vycházejí jednak z principu metody jako takové a jednak z použité instrumentace. Společným působením těchto jevů je zpravidla zhoršení kvality separace, případně opakovatelnosti stanovení. Potlačení těchto jevů proto bývá často významnou součástí optimalizace metody.
6.7.1
Elektroosmóza
Elektroosmóza se vztahuje k pohybu celého objemu roztoku v kapiláře po vložení potenciálového spádu na tuto kapiláru. Po naplnění kapiláry roztokem dochází v°závislosti na pH tohoto roztoku k ionizaci funkčních skupin, které jsou vázány na vnitřní stěnu kapiláry. Podstatu elektroosmózy vysvětlíme nejlépe na křemenné kapiláře, která má na svém povrchu vázány silanolové skupiny. Tyto se chovají jako středně silná kyselina, a ionizují podle schéma: Si – OH ↔ Si – O-+ H+
Znamená to, že vnitřní stěna kapiláry naplněné vodným roztokem elektrolytu nese negativní náboj. Tento náboj je kompenzován kationty přítomnými v roztoku, které jsou elektrostaticky přitahovány ke stěně kapiláry (Kvasnička, 2009). Vytváří se tak elektrická dvojvrstva, jejíž vnitřní část tvoří kationty pevněji elektrostaticky vázané na stěnu kapiláry a vzniká tzv. Sternova vrstva. Vnější část elektrické dvojvrstvy, kterou tvoří kationty slaběji vázáné a difúzně vyměňované s roztokem představuje tzv. difúzní vrstvu. Po vložení napětí na kapiláru prochází roztokem elektrolytu elektrický proud a současně dochází k hydrodynamickému toku kapaliny v kapiláře, v našem případě směrem ke katodě (Kvasnička, 2009).
38
Rychlost toku kapaliny v kapiláře v
EOF
VEOF = −
lze určit pomocí tzv. Smoluchowského rovnice
ες E η
Kde ε je permitivita roztoku, ζ tzv. elektrokinetický potenciál (zeta-potenciál), který vyjadřuje potenciál mezi vnitřním roztokem a rovinou oddělující vnitřní a vnější část elektrické dvouvrstvy a η představuje viskozitu roztoku. Analogicky se vztahem pro rychlost pohybu iontů v elektrickém poli lze zavést veličinu elektroosmotická pohyblivost m
EOF
m EOF = −
, definovanou jako
ες η
Fenomén elektroosmotického toku je v kapilární izotachoforéze potlačován. Naopak v kapilární elektroforéze je často využíván při optimalizaci analýz (ovlivnění rychlosti stanovení a rozlišení). V CITP je nutné elektroosmózu redukovat vzhledem k tomu, že jejím vlivem dochází k deformaci izotachoforetických zón. Elektroosomotický tok má při CITP negativní vliv v tom směru, že způsobuje deformaci rozhraní mezi zónami a tím jeho rozostření. Tento negativní vliv je markatnější při anionické analýze. Redukovat elektroosmózu lze buď zvýšením viskozity roztoku přídavkem vhodného aditiva (různé deriváty celulóz), či snížením elektrokinetického potenciálu přídavkem neionogenního smáčedla (PVA, PEG, Triton), nebo modifikací vnitřního povrchu kapiláry (coating = potahování) (Kvasnička, 2009). Elektroosomotiocký tok také závisí na druhu materiálu, ze kterého je vyrobena separační kapilára, a na pH elektrolytu. V kyselé oblasti je elektroosmotický tok minimální a se zvyšujícím se pH roste.
39
Obr. 4 Závislost elektroosmotického toku druhu materiálu kapiláry a pH elektrolytu (Kvasnička, 2009).
40
6.7.2
Joulovo teplo
Při průchodu elektrického proudu sloupcem elektrolytu je produkováno Joulovo teplo. Elektrický ohřev je hlavním limitujícím faktorem pro používání velkých elektrických napětí, a tím i proudů, a tedy i elektrických výkonů, při snaze o zrychlení analýzy. Je zřejmé, že dvojnásobné zrychlení analýzy vyžaduje dvojnásobný tepelný proud, avšak tepelný výkon tím stoupne čtyřikrát. Joulovým teplem se zvyšuje střední teplota zón, což má za následek jak ovlivňování efektivních mobilit migrujících látek, tak může vést i k destrukci termolabilních látek, např. denaturaci proteinů. Další problémy plynou z toho, že teplo vzniká v celém objemu sloupce elektrolytu, avšak je odváděno jenom na okrajích, kde se elektrolyt stýká se stěnami separační kolony. Tím je dáno, že vnitřní část sloupce elektrolytu je teplejší než okrajové části. Přítomnost teplotních gradientů může mít za následek nehomogenitu dalších fyzikálně chemických vlastností, jako jsou mobility, pH, hustota atd. Teplotní efekty mohou být minimalizovány optimalizací elektrických systémů či konstrukcí aparatury, která spočívá zejména ve zlepšení odvodu tepla ze separačního
kanálu. (Churáček a kol, 1993) 6.7.3
Difúze
Na rozhraní mezi izotachoforetickými zónami se koncentrace látek mění skokem. Látky mají ve svých vlastních zónách adjustované koncentrace, v sousedních zónách je jejich koncentrace nulová. Výsledkem tohoto stavu je difuzní tok ve směru klesající koncentrace. S postupem času se ostrý skok koncentrací (pokud nepůsobí jiná síla proti) plynule rozmývá difúzí. Proti vzniklému difuznímu toku působí tzv. samozaostřující efekt. (Kvasnička, 2009) Molekulární difuze je hlavní příčinou rozšiřování zón rozpuštěných složek při průchodu kapilárou. Tato difuze je nejmenší u velkých molekul (Klouda, 2003). 6.7.4
Gravitace
Gravitace se při elektroforéze projevuje v souvislosti s hustotními diferencemi tím, že zóny s větší hustotou, jsou-li umístěny nad zónami s hustotou nižší, se rozmývají, vzniká tzv. přirozená konvekce. V horizontálním uspořádání elektroforézy se gravitace projevuje tím, že zóna, která má vyšší hustotu, se v daném prostředí rozmývá směrem ke dnu 41
separačního kanálu. Výsledkem je promíchání zóny dané látky se sousedními látkami. Při vertikálním uspořádání se zóna o vyšší hustotě „propadá“ středem separační kolony a znehodnocuje tak analýzu. (Churáček a kol, 1993) Nežádoucí vliv gravitace lze potlačit separací v inertních nosičích a gelech, v tenké kapiláře, v hustotním gradientu neionogenní látky, v podmínkách nulové gravitace, stabilizací zón rotací. Kapilární izotachoforéza využívá k potlačení gravitace právě tenké kapiláry o průměru 0,8mm a menším (Kvasnička, 2009). 6.7.5
Samozaostřující efekt
Jakmile se ion v kapiláře o určité efektivní pohyblivosti dostane v důsledku difúze do předcházející zóny, poklesne rychlost jeho migrace, protože intenzita elektrického pole je v této zóně nižší. Pokles rychlosti migrace má za následek návrat iontu do příslušné zóny. Analogicky, když ion difunduje do zóny komponenty o nižší efektivní pohyblivosti, vyšší intenzita elektrického pole v této zóně zrychlí jeho migraci a ion se vrátí do vlastní zóny.
Jako
výsledek
obou
protichůdně
působících
dějů
má
rozhraní
mezi
izotachoforetickými zónami reálný podélný rozměr nazývaný šířka rozhraní, která se pohybuje za obvyklých experimentálních podmínek okolo 0,01mm. Šířku rozhraní můžeme ovlivnit řadou faktorů jako např. koncentrací elektrolytů, hnacím proudem aj. U zón dostatečně dlouhých můžeme šířku rozhraní zanedbat. Avšak při kvantitativním vyhodnocení velmi krátkých zón je šířka rozhraní hlavním zdrojem nepřesností (Kvasnička, 2009). 6.7.6
Vliv čistoty a složení elektrolytů
Analytická izotachoforéza vyžaduje vysokou čistotu všech chemikálií, z nichž se skládá operační systém elektrolytů. Vysoké požadavky jsou kladeny především na čistotu zakončujícího elektrolytu. Obsahuje-li koncový elektrolyt nečistotu o vyšší efektivní pohyblivosti, než má zakončující ion dochází k jejímu pronikání do zón vzorku. Nečistota dle své efektivní pohyblivosti vytvoří ve vzorku svou vlastní zónu. V průběhu analýzy se zóna nečistoty postupně prodlužuje. Je-li pohyblivost nečistoty značně větší, než pohyblivost koncového iontu, dochází k rychlému vyčištění rezervoáru koncového elektrolytu a po několika analýzách nečistota prakticky vymizí. Naopak je-li pohyblivost nečistoty jen o málo vyšší než pohyblivost koncového elektrolytu, tak se rezervoár čistí 42
velice pomalu a můžeme ho pak použít jen pro stanovení iontů rychlejších než je pohyblivost nečistoty. Nečistoty z koncového elektrolytu poznáme tak, že se jejich zóny při opakované analýze zkracují. Obsahuje-li vedoucí elektrolyt méně pohyblivou nečistotu než vedoucí ion, tvoří směsné zóny všechny ionty pohyblivější než nečistota. Nečistoty ve vedoucím elektrolytu vedou k reprodukovatelným nadbytečným zónám při opakovaném pokusu. Požadavky na čistotu chemikálií pro přípravu vedoucího elektrolytu jsou méně přísné, protože se nečistoty koncentrují jen z relativně malého objemu separační kapiláry (Kvasnička, 2009).
7
IZOTACHOFORETICKÁ ANALÝZA Izotachoforetickou analýzou rozumíme hlavně tu část analýzy, která zahrnuje
samotný nástřik vzorku, separaci a jeho detekci. Cílem analýzy je úplná vzájemná separace, tak že jednotlivé složky vytvoří jednotlivé zóny, které je možno detekovat a záznam z detektoru úspěšně použít pro kvalitativní i kvantitativní analýzu. Obecně je výhodné uskutečnit separaci i detekci v co nejkratším čase a s minimální spotřebou vzorku. Rychlost separace je závislá např. na složení vedoucího elektrolytu, použité hodnotě hnacího proudu atd. (Boček, 1987).
7.1 Kvalitativní analýza Izotachoforéza není schopna podobně jako ostatní separační metody poskytnout přímý údaj o kvalitativním složení vzorku. Kvalitativní analýzou v izotachoforéze rozumíme zejména vyloučení či potvrzení identity látky v izotachoforetické zóně obsažené a látky předpokládané (standardu). To znamená, že se vždy při analýze vychází ze standardní směsi takového složení, jaké předpokládáme ve vzorku. Výšky vln izotachoforegramu jsou identifikovány a přiřazeny k jednotlivým standardům a následně použity pro identifikaci výšky vln izotachoforegramu vzorku (Kvasnička, 2009). Jestliže standard vytvoří na izotachoforegramu vlnu, která se neshoduje s vlnami vzorku, pak lze říci, že tato látka není ve vzorku přítomna. Jestliže se ale výška vlny standardu shoduje
s vlnou vzorku, pak je přítomnost této látky ve vzorku pravděpodobná (Churáček a kol, 1993).
43
7.2 Kvantitativní analýza Délka zón se po dosažení ustáleného stavu s časem nemění a je za daných podmínek úměrná množství látky v analyzovaném vzorku. Protože se zóna pohybuje konstantní rychlostí, je čas, po který zóna pobývá v detektoru, přímo úměrný její délce, a tím i délce vlny izotachoforegramu. Koncentrace separovaného iontu v jakékoliv zóně je jednoznačně určena koncentrací vedoucího iontu.
c x = K x .cL Kde cx je koncentrace vzorku, Kx specifická vodivost zóny x a cL koncentrace vedoucího ionu. Dvojmocný ion dané pohyblivosti tvoří dvojnásobně dlouhou zónu než ion jednomocný. Velmi důležitým praktickým důsledkem je tzv. „zřeďovací„ nebo „zakoncentrovávací„ efekt. Při analýze vzorku obsahujícího sledovanou složku o vyšší koncentraci, než je koncentrace v ustáleném stavu, dojde ke snížení koncentrace (naředění) a naopak při analýze vzorku o nižší koncentraci složky dojde k zakoncentrování. Tento fakt má zásadní význam při nasazení izotachoforézy ve stopové analýze nebo jako prekoncentrační techniky (Kvasnička, 2009). Otevřeným problémem dosud zůstává přesné a správné odečetení kvalitativního parametru
–
na
reálném
izotachoforegramu
nejsou
vlny
ideálně
pravoúhlé.
Při vyhodnocování se reálné vlny nahrazují idealizovanými, jejichž hranice se při běžně užívaném způsobu kladou do inflexních bodů reálných vln, tj. délka vlny se odečítá ze záznamu jako vzdálenost dvou maxim (Boček, 1987).
7.2.1
Pracovní postupy
V principu jsou pro kvantitativní analýzu izotachoforegramu použitelné všechny pracovní techniky vyvinuté pro kolonovou chromatografii, avšak z praktických důvodů se uplatnily jenom techniky vnějšího i vnitřního standardu a standardního přídavku. Podstatou těchto technik je experimentální určení kalibračních konstant pro vyjádření vztahů mezi množstvím analyzovaných látek a experimentálně zjištěným kvantitativním parametrem (Boček, 1987).
44
7.2.1.1 Metoda kalibrace vnějším standardem
Při této metodě se vzorek i standard dávkují odděleně a na izotachoforegramu se porovnávají délky vln jim odpovídající. Analýza musí probíhat za identických podmínek. Jako standard se používá jakákoliv dostatečně čistá látka, která je za daných podmínek separovatelná, tedy i jiná než analyzovaná látka. Metoda kalibrace vnějším standardem tvoří dvě modifikace (Boček, 1987). •
Metoda přímého srovnání Tato metoda spočívá ve dvou oddělených bězích, kdy jsou analyzovány známé
objemy analyzovaného vzorku a roztoku standardu. Analýza probíhá za stejných podmínek a vyhodnocení probíhá pomocí rovnice (Boček, 1987).
c x = cs
lx ls
Kde cx je koncentrace vzorku, cs koncentrace standardu, lx délka vlny vzorku a ls délka vlny standardu. Výhodou metody je její jednoduchost, ale nevýhodou je její citlivost na případné nečistoty přítomné v elektrolytovém systému a tím i její nepřesnost (Boček, 1987). •
Metoda kalibrační křivky Jedná se o jednu z nejpoužívanějších metod kvantitativní analýzy. Její princip
je sestrojení kalibračního grafu na základě série měření délky vln známých standardů o různých koncentracích či různých objemech. Následně se měří délka vlny vzorku a její příslušná hodnota koncentrace se odečte z kalibračního grafu (Boček, 1987). Výhodný je lineární tvar kalibrační křivky. Je-li kalibrační křivka nelineární, bývá měření zatíženo větší chybou. Dbáme na to, aby bod na kalibrační křivce, který patří vzorku, ležel mezi standardy (Klouda, 2003). Výhodou této metody je možnost eliminace systematické chyby v měření. Nevýhodou je její větší pracnost, protože roztoky pro konstrukci kalibračního grafu je potřeba odměřovat s vysokou přesností (Boček, 1987).
45
7.2.1.2 Metoda vnitřního standardu
Při této metodě se provádí pouze jeden nástřik vzorku do kolony. Principem je přimíchání definovaného množství standardní látky do vzorku. Výhodou této metody je její rychlost, protože není nutné odměřovat množství nastříknuté směsi. Nevýhodou je riziko, že přidávaný standard bude reagovat s látkou přítomnou ve vzorku a tím celé měření zatíží velkou chybou (Boček, 1987).
7.2.1.3 Metoda standardního přídavku
Analyzujeme vzorek X a tentýž vzorek, do kterého jsme přidali známé množství standardu s. Oba roztoky doplníme na stejný objem a proměříme. Zvýšení hodnoty naměřené veličiny je přímo úměrné přidanému množství. Z této úměry vypočítáme obsah složky ve vzorku (Klouda, 2003).
c x = cs
S1 Vs ∆S Vx
Kde cx je koncentrace vzorku, cs koncentrace standardu, S1 signál vzorku, ∆S signál standardu, Vs objem standardu a Vx objem vzorku (Klouda, 2003).
7.2.2
Volba pracovních elektrolytů
Výběr vhodného elektrolytového systému je problematika velmi komplexní, která zahrnuje předběžné znalosti o kvalitativním i kvantitativním složení vzorku. Podstatnou roli mimo přístrojové techniky hraje volba správného složení vedoucího a koncového elektrolytu. Pro úspěšnou izotachoforetickou analýzu je především třeba nalézt vhodný operační systém, v němž po nástřiku vzorku obdržíme od všech analyzovaných látek korektně izotachoforetické a analyticky stabilní zóny. Tyto zóny musí obsahovat konstantní množství příslušných nastříknutých látek a jejich rozhraní musí vykazovat samozaostřující efekt (Kvasnička, 2009).
46
8
MATERIÁL A METODIKA
8.1 Laboratorní technika Pro analýzu byl použit izotachoforetický přístroj CS Isotachophoretic Analyser I (Spišská Nová Ves) v dvojkolonovém uspořádání o šířce kapilár
0,8mm a 0,3mm
zhotovených z FEP (kopolymer perfluorovaného polyethylenu a polypropylenu). Kapilára o šířce 0,8mm a délce 20cm slouží jako separační, kapilára o šířce 0,3mm a délce 15cm souží jako analytická. Separační kapilára je vybavena konduktometrickým detektorem, který poskytuje informace o stavu separace před vstupem do analytického bloku, ve kterém se délka zóny vzorku prodlouží asi sedmkrát, čímž dosáhneme zvýšení limitu detekce. Vzorek byl nastřikován do septa kolony injekční stříkačkou a nebo byl dávkován dávkovacím kohoutem o objemu 30µl. Pro měření v analytické části byl použit také konduktometrický detektor.
8.2 Elektrolyty Elektrolytový systém byl navrhnut pro analýzu aniontů s ohledem na jejich elektroforetickou pohyblivost. Jako vedoucí elektrolyt (LE) sloužil při měření chloridový ion (0,01M HCl), pro zvýšení vodivosti systému a pufrační kapacity byl jako protiion v roztoku přítomen β-alanin (0,01M) a pro eliminaci elektroosmotického toku byla ve vedoucím elektrolytu obsažena i hydroxypropyl methyl celulóza (0,001%). Hodnota pH byla optimalizována simulací, pro měrení byla použita optimální hodnota 2,7. Jako koncové elektrolyty (TE) byly použity roztoky kyseliny kaprylové, kyseliny vinné, ale jako nejvhodnější se pro analýzu ukázala kyselina glutamová (0,015M).
8.3 Postup analýzy Všechny analýzy byly nejdříve nasimulovány pomocí počítače a programu Simul 5.0 (Karlova Univerzita, Praha). Simulace sloužily zejména k ověření správnosti výběru elektrolytů, napětí, účinnosti separace a zjištění pořadí jednotlivých zón látek ve vzorku.
47
Pro experimenty zobrazení pohybujícího se rozhraní a pro indikaci doby průchodu rozhraní separační kapilárou pro daný proud a napětí bylo použito aniontového barviva SPADNS, z této doby se dále vycházelo při dalších analytických stanoveních. Čistota rozhraní jednotlivých elektrolytů byla zkontrolována slepým pokusem. Analýza probíhala v propojených kapilárách- separační i analytické a trvala přibližně 30minut. Vzorky vína bylo nutné kvůli separační kapacitě kapilár pro analýzu ředit. Empiricky byl zjištěn jako nejvýhodnější faktor ředění 1:30, při kterém se již netvořily nežádoucí směsné zóny a dosahovaly se optimální délky zón. Pro kvalitativní i kvantitativní analýzu byl do vzorku přidáván 0,0005M standard. Pro stanovení siřičitanů 0,0005M Na2SO3, síranů 0,0005M MgSO4 . 7H2O, a 0,0005M KH2PO4 pro stanovení fosforečnanů. Pro minimalizaci oxidace a jiných nežádoucích potenciálních změn byly elektrolyty i vzorek skladovány při teplotách 6-8°C. Pro ředění vzorků, přípravu standardu i pracovních elektrolytů se používala deionizovaná voda, ze které byl odstraněn volný kyslík převařením.
Obr. 5 Simulace analýzy v programu Simul 5.0; modrá:β-alanin, červená:kyselina chlorovodíková, zelená:glutamová kyselina, khaki:kyselina sírová, rudá:kyselina siřičitá, žlutá:kyselina fosforečná
48
Obr. 6 Isotachophoretic Analyser I
Obr. 7 Migrující barvivo SPADNS
Obr. 8 Zdroj el. proudu pro Isotachophoretic Analyser.
49
Obr. 9 Izotachoforetický záznam vzorek: 1ml vzorek MP + 30 ml H2O; LE: 0,01M HCl +0,01M β-Ala; TE: 0,015M Glu; proud 25µA; nástřik 30µl
Obr 10 Izotachoforetický záznam vzorek 1ml vzorek MP + 30 ml standardní přídavek 0,0005M Na2SO3; LE: 0,01M HCl +0,01M β-Ala; TE: 0,015M Glu; proud 25µA; nástřik 30µl
50
Výsledný rozdíl vodivosti zón separovaného vzorku procházejících kolonou byl detekován konduktometrickým detektorem, jehož signál byl průběžně zaznamenáván a vyhodnocen pomocí počítače a programu Clarity (Data Apex, Praha). Jednotlivé zóny aniontů byly identifikovány pomocí standardního přídavku, kterým se také vyloučily případné reakce s matricí vzorku. Výsledné hodnoty signálu se odečítaly v inflexních bodech jednotlivých zón izotachoforegramu. Vzorek bílého vína byl odrůdy Veltlínské zelené, kategorie vína byla jakostní odrůdové, ročník 2008, víno pocházelo z vinařského závodu v Žabčicích, které bylo volně prodáváno v akademické vinotéce MZLU v Brně. Vzorek červeného vína byl Modrý Portugal, jednalo se o víno jakostní odrůdové z roku 2008, původem z Vinařství Sýkora, Čejkovice.
Všechny vzorky i slepé pokusy byly pro minimalizaci chyby analyzovány třikrát, z měření byl pro vyhodnocení vypočten aritmetický průměr a směrodatná odchylka.
51
8.4 Vyhodnocení 8.4.1
Příklad výpočtu
Jak již bylo výše bylo uvedeno, pro kvantitativní analýzu bylo použito metody standardního přídavku. Standard siřičitanu byl přidáván ku vzorku v koncentraci 0,0005M a v poměru 30:1. Dosazením odezvy signálu vzorku a standardu do vzorce pro výpočet koncentrace z metody standardního přídavku dostaneme pro vzorek vína (Modrý Portugal, Vinařství Sýkora):
c x = cs
S1 Vs ∆S Vx
Kde je cx původní koncentrace vzorku cs výchozí koncentrace standardu S1 signál vzorku ∆S změna signálu po přidání standardu
Vs objem standardu Vx objem vzorku
c x = 0,0005
2,34 30 50,46 1
c x = 0,000696mo l/l Výpočet hmotnostní koncentrace ve vzorku:
cm SO2 = M SO2 .cSO2 cm SO2 = 64,054 .0,000696 cm SO2 = 0,0446g/l cm SO2 = 44,6mg / l
52
Tab. 5 Délka zón izotachoforegramu vybraných aniontů ve vzorcích vín pro dané podmínky 25µA, nástřik 30µl; LE: 0,01M HCl +0,01M β-Ala; TE: 0,015M Glu
Modrý Portugal [min]
R.S.D. [%]
Veltlínské Zelené [min]
R.S.D. [%] n
Sírany
0,984
1,57
0,683
1,83
3
Siřičitany
0,039
2,11
0,022
2,01
3
Fosforečnany
0,254
1,96
0,181
1,85
3
Tab. 6 Koncentrace vybraných aniontů ve vzorcích vín pro dané podmínky 25µA, nástřik 30µl; LE: 0,01M HCl +0,01M β-Ala; TE: 0,015M Glu
Modrý Portugal [mg/l] Sírany Siřičitany Fosforečnany
Veltlínské Zelené [mg/l]
1684,85
1169,46
44,6
23,56
430,38
306,69
53
9
DISKUZE Analýza cizorodých látek pomocí izotachoforézy je poměrně nenáročná a snadno
proveditelná metoda. Doba jednotlivých stanoveních při proudu 50µA v předseparační a 25µA v separační kapiláře byla přibližně 30minut. Nespornou výhodou izotachoforézy je možnost simultánně stanovit při jedné analýze několik iontových látek. V porovnání s jinými metodami provozní náklady metody vzhledem k množství použitých chemikálií a spotřebě vzorku jsou nízké. Pomocí této metody se podařilo stanovit simultánně siřičitany, sírany a fosforečnany se směrodatnou odchylkou, která se pohybovala od 1,57 do 2,11%. Z konzervačních látek lze např. kyselinu sorbovou stanovit v potravinách pomocí kapilární zónové elektroforézy v například hydrodynamicky uzavřeném separačním oddílu. Přičemž se jedná se o jednoduchou, selektivní a rychlou metodu pracující při pH elektrolytu 5,2 (Kaniansky a kol., 1994). Další alternativou kapilární elektroforézy je metoda schopná stanovit simultánně z konzervačních látek nejen sorbovou a benzoovou kyselinu, ale také i
širší skupinu
organických kyselin. Samotná separace trvá 3,5 minuty s jednoduchým elektrolytovým systém složeným z nosného fosfátového pufru (7,5mM NaH2PO4, 2,5mM Na2HPO4), 2,5 mM TTAOH jako regulátoru elektroosmotického toku a 0,24mM CaCl2 jako selektivního modifikátoru upravující pH na hodnotu 6,4. Tato metoda využívá spektrofotometrické detekce v UV oblasti při vlnové délce 185nm. Pracovní napětí je –25kV při teplotě 25°C. Metoda využívá jednoduchou úpravu vzorků spočívající pouze v ředění a filtraci. Metoda je rychlá protože separační čas trvá 2-6krát méně, než separace pomocí konvenčních technik CZE. Je také jednoduchá a levná díky nízkým spotřebám chemikálií a vzorků (Mato a kol., 2006). Další modifikací kapilární elektroforézy pro stanovení konzervačních látek ve víně je stanovení pomocí co-elektroosmotického toku, který je moderován hexadimethrin bromidem (HDB) jako vrstvou, která vytváří stabilní elektroosmotický tok, kterým jsou v elektrolytu neseny i málo pohyblivé aniony a to i bez adice polymerů (Bianchi a kol., 2005).
54
K analýze konzervantů je možno použít i další elektromigrační metodu využívající modifikaci elektroosmotického toku. Jedná se o jednoduchou techniku pro rutinní stanovení organických kyselin pomocí kapilární elektroforéze. Při analýze byl použit elektrolytový systém stávající se z 3nM fosfátu a 0,5nM myristyltrimethylamonium bromidu (MTAB) jako regulátoru elektroosmotického toku při pH 6,5. Metoda vykazuje citlivost mezi 0,015 a 0,054mg/l. Kyseliny byly stanoveny přibližně do 6 minut. (Castineira a kol.,2000) Mezi používané techniky stanovení konzervačních látek patří i techniky chromatografické, zejména pak metody vysoko účinné kapalinové chromatografie (HPLC) a plynové chromatografie (GC). Kupříkladu vysoko účinné kapalinové chromatografie v tandemové modifikaci s detekcí hmotnostní, spektrometrem. Pomocí této metody byla ve vínech identifikována benzoová a skořicová kyselina, přičemž bylo zjištěno, že červená vína obsahují skořicové a benzoové kyseliny více, než obsahují vína bílá (Bevilacqua a kol., 2004). Pomocí HPLC s fotodiodovým detektorem byla zjišťována přítomnost benzoové a sorbové kyseliny v brazilských vínech a moštech. Celkem bylo otestováno 49 vzorků vín červených, bílých a moštů. Ačkoliv použití benzoové kyseliny není ve vínech ani moštech
povoleno, byla zjištěna ve třech vzorcích. Obsah se pohyboval od 295,6 do 608,4 mg/l. Sorbová kyselina byla zjištěna v 49% vzorků a její obsah se pohyboval od 91 do 309,5 mg/l. Šest červených vín nesplňovalo předpisy na obsah kys. sorbové (Machado a kol., 2007). Kvantitativní vysoko účinná tenkovrstevná chromatografie (HPTLC) byla použita pro stanovení konzervantů v nápojích. Jedná se o jednoduchou kvantifikační metodu pro stanovení sorbové, benzoové a dehydrooctové kyseliny v nápojích bez nutnosti extrakce či čištění. Poměrné vzorky a standardy jsou chromatograficky rozděleny na silikagelu nebo C-18 silikagelu obsahujících fluorescenční indikátor a zóny, ve kterých je utlumována fluorescence jsou porovnávány skenováním hustoty (Khan a kol., 1994). Pomocí stir-bar sorpční extrakce (SBSE) a termické desorpce (GC-MS) je možné stanovit simultánně až 7 konzervantů (sorbová, benzoová, p-hydroxybenzoová kyselina a její estery). Pokusná analýza byla provedena v nápojích, octu a vodových omáčkách a dokáže detekovat koncentrace v rozmezí 1-1000 µg/l pro sorbovou kyselinu, 10-1000 µg/l
55
pro benzoovou kyselinu a 0,1-100 µg/l pro p-hydroxybenzoovou kyselinu a její estery. Metoda dosahuje limitu detekce od 0,015 do 3,3µg/l (Ochai a kol., 2002). Kyselina benzoová i kyselina sorbová mohou být simultánně stanoveny i pomocí plynové chromatografie s hmotnostní spektrometrickou detekcí, přičemž metoda dosahuje limitu detekce 200-500pg a je citlivá a selektivní bez vlivu na vyšší koncentrace rozpouštědla či jiných kontaminantů. Tuto metodu je možné aplikovat i prostanovení konzervantů v jídlech (KAKEMOTO, 1992). Elektromigrační metody nalezly uplatnění i pro stanovení siřičitanů a síranů ve víně. Sumárně lze oxid siřičitý ve víně stanovit pomocí kapilární zónové elektroforézy s izotachoforetickou kvantifikací síranu na čipu po oxidaci celkového siřičitanu ve vzorku. Stanovení kombinuje oxidaci siřičitanu peroxidem vodíku, separaci a kvantifikaci pomocí zónové elektroforézy na čipu v online spojení s izotachoforézou. Izotachoforéza slouží k oddělení matrice vzorku od analytu. Metoda dosahuje limitu detekce 15mg/l (Masár a kol., 2005). Volný siřičitan lze ve víně stanovit i metodou zónové elektroforézy technikou spojených kolon čipu s izotachoforetickou přípravou. Siřičitan je kvůli oxidačním ztrátám ve vzorku konvertován pomocí formaldehydu na hydroxymethylsulfonát (HMS). Izotachoforéza při této metodě slouží k oddělení matrice vzorku ze separačního oddílu a zároveň pro oddělení HMS pro finální separaci zónovou elektroforézou na čipu. Pomocí tohoto zapojení bylo možné dosáhnout limitu detekce 3mg/l (Masár a kol., 2004). Volný siřičitan lze stanovit kapilární elektroforézou s derivatizací siřičitanu v kapiláře pomocí jodu a zone-passing techniky s přímou UV detekcí vytvořeného jodidu. Při analýze byl použit optimalizovaný elektrolyt roztoku 20mmol/l trichloroctové kys. (pH 8,5) s následnou UV detekcí při vlnové délce 214nm. Limit detekce byl 2 . 10-6mol/l (Jankovskiene a kol., 2001). Volný i celkový siřičitan lze stanovit pomocí molekulové absorpce záření sulfidu uhelnatého v acetylenovém plamenu za použití absorpční spektrometrie s vysokým rozlišením. Jednotlivé formy síry mohou být rozlišeny díky rozdílným odpovídajícím citlivostem sulfidu uhelnatého na molekulární absorpci. Citlivost na oxid siřičitý je přibližně třikrát větší než na vázaný oxid siřičitý a sulfát. Metoda dosahuje limitu detekce volného oxidu siřičitého 1,8mg/l (Huang a kol., 2008).
56
Další metodou je stanovení siřičitanů ve víně pomocí gas-diffusion flow injection analýzy využívající spektrofotometrickou pH-detekci. Metoda je založena na změně absorbance indikátorového roztoku při rozptýlení oxidu siřičitého přes propustnou membránu do indikátorového roztoku, který lokálně změní pH. Jako indikátor byla použita bromkresolová zeleň. Metoda je použitelná pro roztoky o koncentraci siřičitanu od 1 do 20mg/l a dosahuje limitu detekce 0,1mg/l. Oxid uhličitý přítomný v šumivých a perlivých vínech nepříznivě ovlivňuje výsledky měření proto pro ně není tato metoda vhodná (Decnopweever a Kraak, 1997). Při analýze celkového obsahu oxidu siřičitého je možné použít i vysokotlakou kapalinovou chromatografii s flourescenční detekcí. Jde o vysoce citlivou metodu s detekčním limitem 1 µg/l (Wei a kol., 1999).
57
10 ZÁVĚR Tato práce je zaměřena na cizorodé látky ve víně a problematiku jejich stanovení s navržením konkrétního elektrolytového systému pro izotachoforézu. Izotachoforéza se vyznačuje nízkou spotřebou vzorku, krátkou dobou analýzy a vysokou citlivostí. Pro navržení vhodného elektrolytového systému bylo důležité se seznámit s teoretickými základy metody, zejména efektivní pohyblivosti iontů, která byla výchozím kritériem pro separaci. Dále bylo důležité vyloučit možné interakce elektrolytů či standardů s matricí vzorku a navrhnout optimální poměr ředění pro efektivní využití separační kapacity kapilár. Navržené složení elektrolytů bylo před samotnou analýzou nasimulováno pomocí počítačové techniky, která ověřila správnost výběru. Podmínkou bylo, aby separace všech stanovovaných látek proběhla současně. Simulace sloužily také k přibližnému určení pořadí zón v izotachoforegramu. Výsledné složení systémových elektrolytů bylo pro LE 0,01M HCl jako vedoucí ion a 0,01M β -alanin jako protiion, pro TE: 0,015M glutamová kyselina. Navržený elektrolytový systém je možné použít pro stanovení anorganických aniontů – síranů, siřičitanů, fosforečnanů, ale také i běžně se ve víně vyskytujících organických kyselin (např. kyselina vinná, jablečná, citronová, mléčná). Pro identifikaci zón a kvantitativní analýzu bylo použito metody standardního přídavku, která také vyloučila možnou interakci analytu s matricí vzroku. Metoda byla spolehlivá a přesná, relativní směrodatná odchylka mezi jednotlivými měřeními se pohybovala pod 2,11%. Zjištěná množství volných siřičitanů byly 44,6 a 23,6mg/l pro vzroky vína červeného a bílého, tedy hodnoty pro tato vína odpovídající. Obsah síranů a fosforečnanů není legislativně omezen, může však být nepřímým důkazem technologických či jiných vad (např. zvýšená oxidace siřičitanů vzdušným kyslíkem). Analýza jednotlivých vzorků trvala přibližně 30minut, přičemž jedna analýza poskytuje kvantitativní i kvalitativní informace o více látkách. Izotachoforéza je metoda vhodná pro stanovení volného siřičitanu, vzhledem k její spotřebě vzorku, množství a koncentraci použitých elektrolytů, nízkým detekčním limitům a vysoké přesnosti. Finanční náklady na jednu analýzu jsou vzhledem k množství spotřebovaných elektrolytů i vzorku velmi nízké.
58
10.1 Seznam obrázků a tabulek: Obr. 1 Procentuelní zastoupení jednotlivých forem kyseliny siřičité v závislosti na pH (Rájecký, 2002). Obr. 2 Spotřeba SO2 pro dosažení biologické a oxidační stability vína v závislosti na pH (Rájecký, 2002). Obr. 3 Schéma separace směsi dvou látek v izotachoforetickém systému (Kvasnička, 2009) Obr. 4 Závislost elektroosmotického toku druhu materiálu kapiláry a pH elektrolytu (Kvasnička, 2009). Obr. 5 Simulace analýzy v programu Simul 5.0 Obr. 6 Isotachophoretic Analyser I Obr. 7 Migrující barvivo SPADNS Obr. 8 Zdroj el. proudu pro Isotachophoretic Analyser. Obr. 9 Izotachoforetický záznam vzorek: 1ml vzorek MP + 30 ml H2O; LE: 0,01M HCl +0,01M β-Ala; TE: 0,015M Glu; proud 25µA; nástřik 30µl
Obr 10 Izotachoforetický záznam vzorek 1ml vzorek MP + 30 ml standardní přídavek 0,0005M Na2SO3; LE: 0,01M HCl +0,01M β-Ala; TE: 0,015M Glu; proud 25µA; nástřik 30µl
Tab. 1 Rozdělení vín Tab. 2 Dávky pro síření rmutu Tab. 3 Změny obsahu některých pesticidů při výrobě vína (% pokles oproti obsahu v hroznech)
Tab. 4 Absolutní iontové pohyblivosti m0 vybraných látek při 25°C Tab. 5 Délka zón izotachoforegramu vybraných aniontů ve vzorcích vín pro dané podmínky 25µA, nástřik 30µl; LE: 0,01M HCl +0,01M β-Ala; TE: 0,015M Glu
Tab. 6 Koncentrace vybraných aniontů ve vzorcích vín
59
11 SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY: BALÍK, J. Vinařství: Návody do laboratorních cvičení. Brno: MZLU, 1998, 96 s., ISBN 80-7157-317-5
BEVILACQUA, L., BUIARELLI, F., COCCIOLI, F., JASIONOWSKA, R. Identification of compounds in wine by HPLC-tandem mass spectrometry. Annami di chimica, 2004, vol. 94, no. 9-10, p. 679-689.
BIANCHI, F., CARERI, M., CORRANDINI, C. Novel approach for the rapid determination of water-soluble organic acids in wine by co-electroosmotic flow capillary zone electrophoresis. Journal of separation science, 2005, vol. 28, no. 9-10, p. 898-904.
BOČEK, P., DEML, M., GEBAUER, P., DOLNÍK, V. Analytická kapilární izotachoforéza. Praha: Academia, 1987, 131 s. 21-106-87
BUBLÍKOVÁ, L., Situační a výhledová zpráva. Réva vinná a víno – duben 2009, Praha: MZe ČR, 2009, 91 s., ISBN 978-80-7084-793-0
CASTINEIRA, A., PENA, R.M., HERRERO, C., GARCIA-MARTIN, S. Simultaneous determination of organic acids in wine symplex by capillary electrophoresis and UV detection: Optimization with five different background electrolytes. HRC-Journal of high resolution chromatography, 2000, vol. 23, no. 11, p. 647-652.
ČERNÁ, E., HRABĚTOVÁ, S. Systém kontroly a monitoringu cizorodých látek v rezortu
zemědělství. Chemické Listy, 1997, vol. 91, p. 830.
DECNOPWEEVER, L.G., KRAAK, J.C. Determination of sulphite in wines by gasdiffusion flow injection analysis utilizing spectrophotometric pH-detection. Analytica chimica acta, 1997, vol. 337, no. 2, p.125-131.
60
ETTLEROVÁ, K. Potravinová přecitlivělost: alergie a intolerance [on-line]. [publ. 200311-19], [cit. 2009-05-09], Dostupné z: http://www.chpr.szu.cz/vedvybor/dokumenty/vvpdokumenty.htm
HOLZBECHER, Z., CHURÁČEK, J. Analytická chemie. Praha: Polygrafia, 1987, 664 s., 04-612-87
HUANG, M.D., BECKER-ROSS, H., FLOREK, S., HEITMANN, U., OKRUSS, M., PATZ, C.D., Determination of sulfur forms in wine including free and total sulfur dioxide based on molecular absorption ofcarbon monosulfide in air-acetylene flame. Analytical and bioanalytical chemistry, 2008, vol. 390, no. 1, p. 361-367.
CHURÁČEK, J. a kol: Nové trendy v teorii a instrumentaci vybraných analytických metod. Praha: Academia, 1993, ISBN 80-200-0010-0
INGR, I.: Základy konzervace potravin, Brno: MZLU, 2007, s.119, ISBN 978-80-7375110-4
JANKOVSKIENE,
G.,
DAUNORAVICIUS,
Z.,
PADARAUKAS,
A.
Capillary
electrophoreticdetermination of sulfite usány the zone-passing technique of capillary derivatization, Journal of Chromatography A, 2001, vol. 934, no. 1-2, p. 67-73.
KAKEMOTO, M. Simlutaneous determination of sorbic acid, dyhedroacetic acid and benzoic-acid by gas-chromatography mass-spectrometry. Journal of Chromatography, 1992, vol. 594, no. 1-2, p. 253-257
KANIANSKY, D., MASÁR, M., MADAJOVA, V., MARAK, J. Determination of sorbic acid in food-products by capillary zone electrophoresis in a hydrodynamically closed separation compartment. Journal of Chromatography A, 1994, vol. 667, no. 1, p. 179-185.
61
KHAN, S.H., MURAWSKI, M.P., SHERMA, J. Quantitative high-performance thin-layer chromatographic determination of organic-acid preservatives in beverages. Journal of Liquid Chromatography, 1994, vol. 17, no. 4, p. 855-865.
JANČÁŘOVÁ, I., JANČÁŘ, L. Analytická chemie. Brno: MZLU, 2003, 195 s., ISBN 807157-647-6
KLOUDA, P. Moderní analytické metody. Ostrava: Pavel Klouda, 2003, 129 s., ISBN 8086369-07-2
KRAUS, V., HUDÁČEK, V., ACKERMAN P. Rukověť vinaře. Praha: Brázda, 2000, 284 s. ISBN 80-209-0286-4
KRAUS, V., KOPEČEK, J. Setkání s vínem. Praha 3: Radix, 2002, 158 s., ISBN 80-8603136-5
KVASNIČKA, F. CITP v analýze potravin [online]. [cit. 2009-05-10]. Dostupné z: http://www.vscht.cz/ktk/www_324/lab/texty/cze/cze_itp.pdf
MACHADO, R.M.D., TFOUNI, S.A.V., VITORINO, S.H.P., VICENTE, E., TOLEDO, M.C.D.F. Presence of benzoic and sorbic acids in Brazilian wines and ciders. Ciencia e technologia de alimentos, 2007, vol 27, no. 4, p. 847-850.
MALÍK, F. Dobré víno. Bratislava: Polygrafia SAV, 1994, 326 s., ISBN 80-88780-04-7
SAAID, M., SAAD, B., HASHIM, H.N., ALI, A.S.M., SALEH, M.I. Determination of biogenic amines in selected Malayisan food. Food chemistry, 2009, vol. 113, no. 4, p. 1356-1362
MASÁR, M., DANKOVÁ, M., OLVECKÁ, E., STACHUROVÁ, A., KANIANSKY, D., STANISLAWSKI, B. Determination of total sulfite in wine. Zone electrophoresis-
62
isotachophoresis quantitation of sulfate on a chip after an in-sample oxidation of total sulfite. Journal of Chromatography A. 2005, vol. 1084, no. 1-2, p.101-7.
MASÁR, M., DANKOVÁ, M., OLVECKÁ, E., STACHUROVÁ, A., KANIANSKY, D., STANISLAWSKI, B. Determination of free sulfite in wine by zone electrophoresis with isotachophoresis
sample
pretreatment
on
a
column-coupling
chip.
Journal
of
Chromatography A, 2004, vol. 1026, no. 1-2, p. 31-39.
MASÁR, M., KANIANSKY, D., BODOR, R., JOHNCK, M., STANISLAWSKI, B. Determination of organic acids and inorganic anions in wine by isotachophoresis on a planar chip. Journal of Chromatography A, 2001. vol. 916, no. 1-2, p. 167-174.
MATO, I., HUIDOBRO, J.F., SIMAL-LOZANO, J., SANCHO, M.T. Simultaneous determination of organic acids in beverages by capillary zone electrophoresis. Analytica chimica acta, 2006, vol. 565, no. 2, p. 190-197.
NAŘÍZENÍ KOMISE (EHS) č. 2676/90
OCHAI, N., SASAMOTO, K., TAKINO, M., YAMASHITA, S., DAISHIMIA, S., HEIDEN, A.C., HOFFMANN, A. Simultaneous determination of preservatives in beverages, vinegar, aqueous sauces, and quasi-drug drings by stir-bar sorptive extraction (SBSE) and thermal desorption GC-MS, Analytical and bioanalytical chemistry, 2002, vol. 373, no. 1-2, p. 56-63.
OSTRÝ, V., ŠKARKOVÁ, J., HAJŠLOVÁ, J. Informace vědeckého výboru potraviny ve věci: Výskyt ochratoxinu A ve víně. [on-line]. [publ. 2005-07-28], [cit. 2009-05-09], Dostupné z: http://www.chpr.szu.cz/vedvybor/dokumenty/vvpdokumenty.htm
STEIDL, R. Sklepní hospodářství. Valtice: Národní salon vín, 2002, 307 s., ISBN 80903201-0-4
63
VELÍŠEK, J. Chemie potravin 3. Tábor: Ossis, 2002, 326 s., ISBN 80-86659-02-X
Vyhláška č. 304/2004 Sb.
Vyhláška č. 305/2004 Sb
WEI, F., CHEN, M.S., YU, L., CHANG, L., LI, D.M. Determination of total sulfite in wine by high performance liquid chromatography (HPLC) with fluorescence detection. Chinese journal of Chromatography A, 1999, vol. 17, no. 6, p. 583-585.
64
