MENDELOVA ZEMĚDĚLSKÁ A LESNICKÁ UNIVERZITA V BRNĚ AGRONOMICKÁ FAKULTA DIPLOMOVÁ PRÁCE

MENDELOVA ZEMĚDĚLSKÁ A LESNICKÁ UNIVERZITA V BRNĚ AGRONOMICKÁ FAKULTA

DIPLOMOVÁ PRÁCE

BRNO 2009

VÍT MAREČEK

Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav chemie a biochemie

Stanovení organických kyselin ve víně Diplomová práce

Vedoucí práce: doc. Ing. Jan Pospíchal, CSc. Brno 2009

Vypracoval: Vít Mareček

ZADÁNÍ

PROHLÁŠENÍ

Prohlašuji, že jsem diplomovou práci na téma Stanovení organických kyselin ve víně vypracoval samostatně a použil jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém seznamu literatury. Diplomová práce je školním dílem a může být použita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího diplomové práce a děkana AF MZLU v Brně.

V Brně dne ……………….……..… podpis diplomanta …………..…….

Touto cestou bych chtěl poděkovat panu doc. Ing. Janu Pospíchalovi, CSc., za odborné vedení a cenné rady a připomínky při koncipování mé diplomové práce.

ABSTRAKT Moje práce je zaměřena na stanovení organických kyselin ve víně. Pro stanovení jsem použil kapilární izotachoforézu s konduktometrickou detekcí. Analýza byla zaměřena na čtyři hlavní organické kyseliny, které se ve víně nacházejí a nejvíce ovlivňují jeho organoleptické vlastnosti (kys. vinná, jablečná, citronová, mléčná). Celkový obsah kyselin ve víně se pohybuje v rozmezí 5 až 6 g/l. Použil jsem elektrolytový systém navržený pro analýzu těchto organických kyselin. Elektrolytový systém se skládal z vedoucího a koncového elektrolytu. Vedoucí elektrolyt obsahoval 0,01M HCl, β-alaninu a 0,001% HPMC jako modifikátoru elektroosmotického toku. Koncový elektrolyt se skládal z 0,015M kyseliny glutamové a 0,015M histidinu jako protiionu. Separace vzorku bylo dosaženo za 25 minut. Směrodatná odchylka mezi jednotlivými analýzami byla nižší než 2,5 %. Výsledky dosažené touto byly srovnatelné s jinými metodami, přičemž zde prezentované výsledky byly přesnější. Klíčová slova: izotachoforéza, víno, organické kyseliny, analýza

ABSTRACT My work deals with determination of organic acids in wine. I used for analysis capillary isotachophoretic method with conductometric detection. Analysis was aimed on four most important organic acids currently present in wine, which are responsible for its sensoric quality (tartaric, malic, citric, lactic acids). Total contents of acids in wine varies from 5 to6 g/l. I used an electrolyte system proposed to determination of these organic acids. Electrolyte system contained of leading and terminating electrolyte. Leading electrolyte contained of 0,01M HCl, β-Alanine and electroosmotic flow modifier 0,001% HPMC. Terminating electrolyte consists of 0,015M Glutamic acid and 0,015M Histidine as counter ion. Complete separation was obtained in 25 minutes. Obtained RSD (Relative Standard Derivation) was better than 2.5 %. Results were comparable with other methods, but isotachophoretic method seems to be more precise. Keywords: isotachophoresis, wine, organic acids, analysis

1 2 3

OBSAH ÚVOD .................................................................................................... 8 CÍL PRÁCE .......................................................................................... 9 LITERÁRNÍ PŘEHLED................................................................... 10 3.1 Složení vína .................................................................................................... 10 3.1.1 Sacharidy................................................................................................. 11 3.1.2 Pektiny .................................................................................................... 13 3.1.3 Kyseliny .................................................................................................. 13 3.1.3.1 Kyselina vinná..................................................................................... 14 3.1.3.2 Kyselina jablečná................................................................................ 16 3.1.3.3 Kyselina mléčná .................................................................................. 16 3.1.3.4 Kyselina citronová .............................................................................. 17 3.1.4 Dusíkaté látky ......................................................................................... 17 3.1.5 Třísloviny................................................................................................ 17 3.1.6 Barviva ve vínech ................................................................................... 18 3.1.7 Alkohol ................................................................................................... 19 3.1.8 Těkavé kyseliny ...................................................................................... 21 3.1.9 Aromatické a buketní látky..................................................................... 21 3.1.10 Cizorodé látky ve víně ............................................................................ 22

4

PŘEHLED ELEKTROMIGRAČNÍCH METOD.......................... 24 4.1 Kapilární zónová elektroforéza (CZE) ....................................................... 25 4.1.1 Přístrojové provedení .............................................................................. 27 4.1.1.1 Separační kapiláry .............................................................................. 28 4.1.1.2 Dávkování vzorku................................................................................ 29 4.1.1.3 Detekční zařízení................................................................................. 29 4.1.2 Elektroforéza........................................................................................... 30 4.1.3 Elektroosmotický tok .............................................................................. 31 4.2 Kapilární gelová elektroforéza (CGE) ........................................................ 34 4.3 Micelární elektrokinetická chromatografie (MECC)................................ 34 4.4 Kapilární elektrochromatografie (CEC) .................................................... 35 4.5 Kapilární izoelektrická fokusace (CIEF).................................................... 36 4.6 Kapilární izotachoforéza (CITP)................................................................. 37 4.6.1 Průvodní jevy při kapilární izotachoforéze............................................. 38 4.6.1.1 Elektroosmóza..................................................................................... 38 4.6.1.2 Jouleovo teplo ..................................................................................... 39 4.6.1.3 Gravitace............................................................................................. 40 4.6.1.4 Difúze .................................................................................................. 40

5

MATERIÁL A METODY ZPRACOVÁNÍ..................................... 41 5.1 Přístroje ......................................................................................................... 41 5.2 Vzorky............................................................................................................ 42 5.2.1 Úprava vzorků......................................................................................... 42 5.3 Použité roztoky.............................................................................................. 43 5.4 Vlastní stanovení ........................................................................................... 44 5.5 Vyhodnocení výsledků .................................................................................. 46 5.5.1 Výpočet množství kyseliny vinné ve vzorku bílého vína ....................... 46

6 7 8 9

VÝSLEDKY A DISKUZE................................................................. 48 ZÁVĚR ................................................................................................ 50 SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY .............................................. 51 SEZNAM OBRÁZKŮ...................................................................... 533

1

ÚVOD Vinná réva (Vitis vinifera) doprovází lidskou civilizaci od počátku jeho

existence a řadí se mezi jedny z nejstarších kulturních plodin vůbec. Předpokládá se, že rostla již v období druhohor (před 150 miliony lety). Pravděpodobně nejstarší nalezené víno pochází ze starého Sumeru, z oblasti dnešního Iránu a Iráku a je přibližně 7 000 let staré. O již relativně vyspělém vinařství se dá hovořit v antickém Řecku, kde se víno stalo jednou ze základních životních potřeb a začalo se považovat i za nedílnou součást tehdejší kultury. Ačkoli je Česká republika považována za pivní velmoc, má zde pěstování, výroba i konzumace vína dlouholetou tradici a v posledních letech se těší stále větší oblibě. Co se týče pěstování vinné révy, nemá naše republika zcela ideální podmínky. Kvalita a výsledná jakost vína je totiž úzce spjata s obsahem organických kyselin obsažených již ve vinných hroznech, přičemž největší vliv na celkový dojem z vína mají kyseliny jablečná, vinná a mléčná. Celkový obsah kyselin ve víně se pohybuje v rozmezí 5 až 6 g/l. Rozhodující je ovšem jejich poměrové zastoupení, které je ovlivněno především vyzrálostí hroznů a technologickým zpracováním. .

8

2 CÍL PRÁCE Cílem mé práce bylo navržení optimálního elektrolytového systému pro stanovení organických kyselin ve víně pomocí metody kapilární izotachoforézy a ověření jejich vhodnosti pomocí experimentálního stanovení organických kyselin ve vzorcích vína, které jsem prováděl na přístroji CS Isotachophoretic Analyser firmy Spišská Nová Ves, SR.

9

3 LITERÁRNÍ PŘEHLED Podle zákona č. 115/1995 Sb., o vinohradnictví a vinařství se vínem rozumí produkt, který byl získán úplným nebo částečným alkoholovým kvašením rmutu nebo hroznového moštu z odrůd révy vinné, registrovaných ve Státní odrůdové knize. Víno se v České republice těší stále větší oblibě, a proto není divu, že se jeho konzumace neustále zvyšuje. Průměrná spotřeba na jednoho obyvatele se od roku 1995 zvýšila přibližně o jeden a půl litru vína a v roce 2004 činila 16 litrů na osobu za rok, přičemž průměrná spotřeba vína v Evropské unii dosahuje hodnot dvojnásobných.

Spotřeba vína v litrech na osobu a rok (2004) 60

Spotřeba (l)

50 40 30 20 10

ČR

Ra ko us ko

aď ar sk o

M

D án sk o

Itá lie Ch or va ts ko S lo vi ns ko Š vý ca rs ko Š pa ně ls ko Ar ge nt in a

Fr an ci e P or tu ga ls ko

Lu

ce m

bu rs ko

0

Země

Obr. 1 Spotřeba vína ve světě v litrech na osobu a rok

3.1

Složení vína Víno obsahuje látky, jež byly původní součástí moštů nebo rmutů, látky

vznikající při kvašení a látky cizorodé, které se do vína dostávají v průběhu technologického procesu a patří buď k běžným žádaným složkám, nebo do vína vůbec nepatří. K původním součástem moštů se řadí sacharidy, organické kyseliny, třísloviny, dusíkaté látky, minerální látky, barviva a v neposlední řadě i látky tvořící chuťové a aromatické složky vína [1].

10

3.1.1 Sacharidy Souhrnným

názvem

sacharidy

se

označují

polyhydroxyaldehydy

a polyhydroxyketony, které ve své molekule obsahují alespoň tři alifaticky vázané atomy uhlíku, a také sloučeniny, které vznikly jejich vzájemnou kondenzací za vzniku acetalových vazeb, tj. látky, ze kterých vznikají sacharidy hydrolýzou. Mezi sacharidy se však také řadí i sloučeniny, které vznikly ze sacharidů oxidačními, redukčními, substitučními či jinými reakcemi. Základní a nejčastěji používané dělení sacharidů je podle počtu stavebních jednotek. Monosacharidy jsou složeny z jedné cukerné jednotky, oligosacharidy se dvou až deseti stejných nebo různých monosacharidů navzájem spojených glykosidovými (poloacetalovými) vazbami. Polysacharidy obsahují ve své molekule více než 10 stejných nebo různých monosacharidů. Pro svoji sladkou chuť a často i mnoho společných vlastností bývají monosacharidy a oligosacharidy označovány souhrnným názvem cukry, přičemž dříve užívaný název glycidy, se již používat nedoporučuje [2]. Stanovení množství sacharidů v moštech je velmi důležité již během dozrávání hroznů a zejména v době sklizně a zpracovávání hroznů pro jejich případnou úpravu. Vinné mošty získané z hroznů pěstovaných v České republice obsahují průměrně od 16 do 24 % cukru, ve výjimečně dobrých letech přesahuje jejich obsah hodnotu 24 %. Naopak v letech nepříznivých mohou obsahovat tyto mošty i pod 15 % sacharidů, které se zde vyskytují ve formě glukózy a fruktózy, kdy poměr obsahu fruktózy nepatrně převládá. Z ostatních sacharidů jsou ve víně také ve velmi malém množství přítomny pentózy a pentosany, které však nemají na jakost vína prakticky žádný vliv [1]. Obsah sacharidů v moštu (cukernatost) se v praxi používají refraktometry nebo takzvané moštoměry, které jsou založeny na principu Archimédova zákona, avšak vyjadřování této hodnoty se v různých státech nepatrně odlišuje. V České republice se používá Český normalizovaný moštoměr (°NM), který udává počet kilogramů cukru ve 100 litrech moštu při 15 °C. V Rakousku se ke stejnému účelu využívá Klosterneuburský

moštoměr

(°KMW),

který

udává

počet

kilogramů

cukru

na 100 kilogramů moštu. V Německu, Slovinsku a Švýcarsku je rozšířeno využívání Oeschlova moštoměru (°Oe), což je hodnota hustoty moštu v gramech na litr snížená o tisíc [3]. Podle zákona č. 110/1997 Sb. o potravinách a tabákových výrobcích, ve znění zákona č. 456/2004 Sb. a vyhlášky č. 321/2004 Sb., o vinohradnictví a vinařství

11

a o změně některých souvisejících zákonů (zákon o vinohradnictví a vinařství), se pro česká a moravská vína používá následující dělení založené na obsahu sacharidů ve zpracovávaných hroznech v době jejich sklizně (cukernatosti, vyzrálosti).

Tab. 1 Kategorie vín podle vyzrálosti hroznů Kategorie vín Stolní víno Zemské víno Jakostní víno - odrůdové - známkové Jakostní víno s přívlastkem - kabinetní víno - pozdní sběr - výběr z hroznů - výběr z bobulí - výběr z cibéb - ledové víno - slámové víno

Minimální cukernatost hroznů 11 °NM 14 °NM 15 °NM 15 °NM

19 °NM 21 °NM 24 °NM 27 °NM 32 °NM 27 °NM 27 °NM

Vína vyrobené z vinných hroznů vypěstovaných na území České republiky podléhají zatřídění:

♦ jakostní víno, ♦ jakostní víno s přívlastkem, ♦ jakostní šumivé víno stanovené oblasti ♦ aromatické jakostní šumivé víno stanovené oblasti, ♦ pěstitelský sekt, ♦ jakostní perlivé víno, ♦ jakostní likérové víno.

Podle §26 ods. 10 zákona č. 321/2004 Sb., o vinohradnictví a vinařství, ve znění podlejších předpisů se zveřejňuje obchodní označení vína, evidenční číslo jakosti, šarže, zeměpisné údaje původu vína, ročník vína a výrobce vína.

12

Sacharidy přítomné v hroznech a po jejich vylisování i v moštech, jsou při etanolovém kvašení rozkládány na etanol a oxid uhličitý, a z tohoto důvodu se již vyrobené víno člení na základě cukernatosti vína (obsahu zbytkového cukru v 1 litru), do čtyř základních skupin, a to na vína:

♦ suchá – obsahují nejvýše 4 g zbytkového cukru na litr vína, ♦ polosuchá – obsahují 4,1 – 12 g zbytkového cukru na litr vína, ♦ polosladká – obsahují 12,1 – 45 g zbytkového cukru na litr vína, ♦ sladká – obsahují více než 45 g zbytkového cukru na litr vína.

3.1.2 Pektiny Pektiny jsou deriváty kyseliny polygalakturonové, jejíž karboxylové skupiny jsou esterifikovány methanolem. V moštech jsou obsaženy jen ve velmi malém množství (přibližně 0,2 %), avšak i to je dost na to, aby mohly ztěžovat jejich čiření, což je technologický proces nutný při zpracování ne zcela zdravých hroznů. Jelikož se při kvašení hydrolyzují, je jejich obsah ve víně menší než v původním moštu. I tak se ale mohou zúčastňovat na procesu vysražování nestabilních koloidních látek při zrání vína. Při odbourávání pektinů vzniká kromě jiných látek i malé množství methanolu, zvláště pak u vín nakvašovaných společně s třapinami a u matolinových vín (tzv. druháků) [1].

3.1.3 Kyseliny Karboxylové kyseliny jsou významné složky především produktů rostlinného původu. Ovlivňují průběh enzymových a chemických reakcí, mikrobiologickou stabilitu během skladování a zpracování a v neposlední řadě také organoleptické i technologické vlastnosti. V potravinách se vyskytují především karboxylové kyseliny alifatické, alicyklické a aromatické nebo heterocyklické. Mohou v molekule obsahovat jednu karboxylovou skupinu (monokarboxylové kyseliny) nebo několik karboxylových skupin. Často se pak označují jako polykarboxylové kyseliny.

13

Řada karboxylových skupin obsahuje současně další funkční skupiny, například hydroxylovou skupinu (hydroxykyseliny), karbonylovou skupinu (oxokyseliny), respektive aldehydokyseliny nebo ketokyseliny, aminoskupinu (aminokyseliny), merkaptoskupinu (merkaptokyseliny) a jiné. Jako kontaminanty se vyskytují také některé halogenkyseliny, které ve své molekule obsahují nejčastěji jeden nebo několik atomů chloru. Jako vonné a chuťové látky se uplatňují především nižší mastné a některé aromatické kyseliny. Jako chuťové látky mají největší význam vícesytné karboxylové kyseliny, z alifatických kyselin pak octová a mléčná kyselina, které jsou významnými nositeli kyselé chuti potravin. Jistý význam jako vonné a chuťové látky však mají také mastné kyseliny se středně dlouhým uhlíkovým řetězcem, které jsou zejména ve formě triacylglycerolů složkami tuků. Řada karboxylových kyselin je prekurzorem dalších vonných a chuťových látek jako jsou například příslušné estery a laktony [4]. Kromě stanovení obsahu sacharidů, je velmi důležité již během dozrávání hroznů a zejména v období sklizně a zpracovávání hroznů, zjišťovat pro jejich případnou úpravu i obsah kyselin, který stanovujeme titračně. Z organických kyselin je ve víně obsažena kyselina vinná, jablečná a ve velmi malém množství i kyselina citronová, jantarová a octová. Organické kyseliny mají konzervační účinky, povzbuzují trávicí žlázy a zesilují chuť k jídlu. pH moštů a mladých vín se pohybuje v rozmezí 3 až 4 a během zrání vína se mírně zvyšuje. Kyselost vína se vyjadřuje jako obsah titrovatelných kyselin v gramech na litr vína, přepočítaných na kyselinu vinnou. Jejich obsah je závislý především na

odrůdě, půdě, poloze vinic, stupni zralosti

zpracovávaných hroznů a na ročníku. V průměrných ročnících je běžná hodnota kyselin 6 – 12 g na jeden litr moštu, zatím co ve špatných ročnících může obsah titrovatelných kyselin stoupnout až na hodnoty kolem 20 g na litr moštu. V průběhu výroby vína a jeho zrání se obsah všech kyselin cíleně mění a upravuje tak, že jejich celkový obsah je průměrně 5 až 6 g/l vína [1].

3.1.3.1 Kyselina vinná Kyselina vinná (2,3-dihydroxybutandiová, někdy označovaná také jako dihydroxyjantarová) je zástupcem organických hydroxydikarboxylových (aldarových) kyselin a může se vyskytovat ve třech prostorových isomerech. V přírodě se vyskytuje 14

prakticky výhradně jako L-(+)-vinná, ojediněle i jako D-(-)-vinná kyselina. Symetrická kyselina meso-vinná (erythrarová) se v přírodě nevyskytuje vůbec. V hroznech a různém dalším ovoci vzniká kyselina vinná z D-glukosy. Racemická směs D a L isomerů, která se nazývá hroznová kyselina, byla prokázána ve šťávě hroznů. Kyselá sůl hroznové kyseliny, kalium-hydrogen-vinan (tartarát), je špatně rozpustná a vylučuje se jako tzv. vinný kámen [4]. Kyselina vinná má jemnou chuť a její původní obsah se pohybuje přibližně kolem 6 g na litr moštu, který se při vylučování vinného kamene snižuje a tím se snižuje i celková kyselost vína. Vinný kámen je přirozený úkaz zvláště u vín z dobrých ročníků, kdy mošty obsahují vyšší množství kyseliny vinné i minerálních látek (K, Ca, Mg) a vysražuje se většinou již během kvašení, neboť jeho rozpustnost klesá se stoupajícím obsahem alkoholu, stejně jako při snižující se teplotě vína. Nebezpečí dodatečného vysražování vinného kamene v lahvích tkví v tom, že kyselý vinan draselný i vinan vápenatý vytvářejí snadno přesycené roztoky, z nichž se mohou vysražovat až po nějakém silnějším vnějším popudu, jako je například rychlé zchlazení vína v lahvích [1]. Aby nedošlo k jeho nežádoucímu vysražování v lahvích, urychluje se jeho vypadávání ochlazením a přidáním práškového vinného kamene do vína. Nutno ovšem dodat, že krystalické sraženiny vinného kamene nejsou v žádném případě vadou vína, ale důkazem, že víno nebylo ošetřeno proti vysrážení vymražováním nebo přídavkem kyseliny metavinné [6]. Jak zde již bylo jednou řečeno, je to přirozený úkaz zvláště u dobrých ročníků, kdy mošty obsahují vyšší množství kyseliny vinné i minerálních látek. Vinný kámen se tvoří buď v jednotlivých krystalcích, které odrážejí světelné paprsky a lesknou se, nebo ve velkých plátech formovaných podle zakřivení stěn láhve. Vinný kámen je těžký a klesá ke dnu, takže se při opatrném nalévání nemusí do pohárů vůbec dostat. Je zdravotně zcela nezávadný a chuť vína nikterak neovlivňuje. Nejčastěji se vyskytuje ve vínech brzy lahvovaných nebo ve vínech archivních [7].

15

3.1.3.2 Kyselina jablečná Kyselina

jablečná

(hydroxybutandiová)

je

organická

dikarboxylová

hydroxykyselina, která patří k významným nositelům kyselé chuti. Vyskytuje se pouze jako L-isomer. Má intenzivní ostrou, hrubou až trpkou chuť a spolu s kyselinou vinnou se nejvíce podílí na celkovém dojmu při konzumaci vína. Je-li její poměr vůči ostatním kyselinám a složkám ve víně nevyvážený, nazývá se takové víno jako tvrdé [4]. Obsah kyseliny jablečné je závislý především na ročníku a stupni zralosti hroznů při jejich zpracování a pohybuje se od 1 do 13 g/l moštu. Při nižší kyselosti moštů obsahuje mošt relativně méně kyseliny jablečné [1]. Během kvašení její obsah klesá a dosahuje průměrných hodnot ve víně 3 až 5 g/l. Vzhledem k její velmi ostré chuti se často využívá po skončení ethanolového kvašení i kvašení jablečno-mléčné (malolaktické). Tento proces bývá také často označován jako biologické odbourávání kyselin a spočívá ve využití bakterií mléčného kvašení, nacházejících se přirozeně na slupkách hroznů, a v následné přeměně kyseliny jablečné na chuťově příznivější kyselinu mléčnou. Podmínkami tohoto procesu jsou vyšší teploty (přibližně 25 °C) a dostatek živného média, který je ovšem zajišťován kvasinkami [5].

3.1.3.3 Kyselina mléčná Kyselina mléčná (2-hydroxypropanová) vzniká při anaerobním mléčném kvašení sacharidů a vyskytuje se ve dvou formách ( L-(+) a D-(-) mléčná kyselina) [4]. Ve víně vniká spolu s oxidem uhličitým jako produkt jablečno-mléčného kvašení (biologické odbourání kyselin) z kyseliny jablečné a na rozdíl od ní, dodává vínu hladkou chuť a stabilitu [6]. Klimatické podmínky našich vinařských oblastí jsou z hlediska tvorby dostatečného obsahu kyselin víceméně optimální, avšak při ošetřování moštů a vín s relativně nízkou koncentrací kyselin (Malinger, Mőller-Thurgau, Iršay Oliver) je potřebné technologicky zamezit všemu, co způsobuje odbourávání kyselin, jelikož mošty a vína s s nízkou koncentrací kyselin jsou fádní, neharmonické, rychle stárnou a jsou

více

náchylné

k bakteriálním

chorobám.

Nejjednodušším

a

zároveň

i nejpoužívanějšími způsoby jak upravit obsah kyselin je scelování s mošty a víny, které

16

obsahují více kyselin nebo je možné provést okyselení přídavkem kyseliny vinné v maximálním množství 2 g/l [6].

3.1.3.4 Kyselina citronová Kyselina citronová (2-hydroxypropan-1,2,3-trikarboxylová) je nejvýznamnějším zástupcem trikarboxylových hydroxykyselin. Její molekula neobsahuje žádná prvek asymetrie. Ve víně je obsažena jen v malém množství, má ostrou chuť a její přidávání do vína je zakázáno [4].

3.1.4 Dusíkaté látky Dusíkaté látky jsou ve víně obsaženy jako jednoduché bílkoviny (proteiny) i ve formě produktů jejich rozpadu, jako jsou albuminy, peptony, aminokyseliny a aminy. Obsah těchto převážně rozpustných dusíkatých látek vznikajících při autolýze kvasinek má velký význam pro tvorbu chuťových a aromatických látek i jako výživa pro bakterie způsobující biologické odbourávání kyselin a pro kvasinky rozmnožující se při kvašení moštů. Obsah dusíkatých látek v moštech a ve vínech závisí na podmínkách při zrání hroznů i na způsobu technologie. Ve vinném moštu se nachází průměrně 240 až 1600 mg/l celkového dusíku. Proteiny jsou také součástí koloidního systému ve vínech a postupnou oxidací a reakcemi s tříslovitými látkami koagulují, srážejí se a postupně z tohoto systému vypadávají. Při nedokonalé stabilizaci koloidního systému jsou původci bílkovinných zákalů u lahvovaných vín. Jedná se hlavně o bílkoviny, které je možno vysrážet rovněž změnami teplot nebo přídavkem taninu [1]. V průběhu kvašení se obsah dusíkatých látek snižuje, avšak po kvasném procesu se opět v důsledku pokračující autolýzy kvasinek zvyšuje [6].

3.1.5 Třísloviny Třísloviny ve víně zvané také oenotanin, jsou směsí chemicky příbuzných látek, skládajících se z více jednotek fenolů a katechinů a vysokomolekulárních taninů. Je možné je zařadit do skupiny emulzních koloidů, neboť jsou to amorfní hygroskopické

17

látky, které dávají s vodou, alkoholem i jinými látkami snadno koloidní roztoky. Protože jsou obsaženy především v třapinách a ve slupkách bobulí, liší se jejich obsah ve víně podle toho, jak dlouho s nimi byl mošt ve styku. Z tohoto důvodu vína vyrobená z moštů lisovaných bez předchozího odzrnění nebo červená vína nakvášená na rmutech mají vždy více taninu než vína bílá vyráběná běžným způsobem s odzrňováním hroznů. Vyšší obsah tříslovin mají i vína, která byla uložena v dubových sudech. Třísloviny obsažené ve vinném moštu a víně dělíme na hydrolyzovatelné a kondenzovatelné a jejich obsah v moštech bílých odrůd bývá od 0,1 do 1,0 g/l, v moštech modrých odrůd pak 1,0 až 1,3 g/l [6]. Oenotanin je velmi důležitou látkou, jelikož s bílkovinami obsaženými ve víně tvoří sraženiny a významně tak přispívá k samočištění vína. Při vyšším obsahu mohou třísloviny podstatně ovlivnit chuť bílých i červených vín. U červených vín dodává oenotanin vínu typický charakter a kromě toho působí příznivě také na rozpuštění a stabilitu červeného barviva. Enzymatickou oxidací tříslovin se tvoří flobafeny, což jsou deriváty kondenzovaných tříslovin – katechinů. Mají hořkou příchuť a předpokládá se, že hnědnutí výlisků a nesířených moštů vzniká právě díky těmto reakcím [1].

3.1.6 Barviva ve vínech Z barviv obsahuje víno zbytky zeleného barviva chlorofylu a příbuzné červené barvivo karotin a žluté xantofyl, obsažená původně ve slupkách bobulí. Tato barviva dodávají bílým vínům různé odstíny zelenkavé až žluté barvy. Vína ze samotoku nebo rychle lisovaná jsou zelenkavá, zatímco vína, jejichž mošt byl delší dobu ve styku se slupkami, mívají barvu zlatožlutou. U červených vín jsou tato barviva zakryta červenými antokyanovými barvivy. Větší množství chlorofylu se může dostat do vína při delším styku moštu s nevyzrálými zelenými třapinami při zpracovávání nezralých hroznů. Vyšší obsah chlorofylu může vínům udělit nečistou travní chuť a rovněž mění barvu na žlutou až hnědou. Tyto změny se však přisuzují i vlivu oxidovaných tříslovin. Červené barvivo oenin patří z chemického hlediska mezi antokyany. To jsou glykosidy, které se vlivem účinků kyselého prostředí štěpí na cukr a vlastní složky barviva - antokyanidy. Červené nebo modré barvivo se nachází ve slupkách bobulí uvnitř tříslovinných plastidů. Ty při zvyšujícím se obsahu alkoholu v kvasícím rmutu křehnou, při promíchávání se rozpadají a uvnitř uložené barvivo se uvolňuje. Barva 18

antokyanů závisí na kyselosti prostředí. Červená vína s vyšším obsahem kyselin mají světlejší barvu a vína s nižším obsahem kyselin mají barvu tmavě červenou. Účinkem vzdušného kyslíku a stářím se oenin rozkládá a stává se nerozpustným. To je možno pozorovat při delším skladování červených vín, u kterých se vylučuje tmavě červená sraženina. Intenzita červené barvy závisí podle Riberaua-Gayona na vzájemném poměru obsahu antokyanů a tříslovin, které mají samy žlutou barvu. Červená vína s vyšším obsahem tříslovin mívají tmavší rubínově červenou barvu. Při jejich stárnutí se antokyany rychle rozkládají a barva vín se mění na cihlově červenou [1].

3.1.7 Alkohol Při ethanolovém kvašení jsou přítomné sacharidy prokvášeny divokými tzv. apikulátními kvasinkami (Kloeckera apiculata) a

vinnými kvasinkami rodu

Saccharomyces cerevisiae především za vzniku alkoholu a oxidu uhličitého. Alkoholy bývají primárními i sekundárními vonnými a chuťovými složkami potravin rostlinného a také živočišného původu. Běžně se vyskytují alifatické alicyklické, aromatické a heterocyklické alkoholy, alkoholy primární , sekundární a terciární a alkoholy obsahující více hydroxyskupin ( dioly, trioly atd.). Jako aromatické látky se uplatňují zejména volné primární alkoholy a jejich estery, převážně u ovoce a alkoholických nápojů.

Přírodními vonnými látkami jsou především nižší alifatické nenasycené alkoholy, zvláště pak monoterpenové a seskviterpenové alkoholy. Vyšší terpeny se mohou jako vonné látky uplatnit prostřednictvím svých rozkladných produktů. Pro aromatizaci potravin se používají alkoholy, které mají nejvýše 15 až 18 atomů uhlíku v molekule. Použití vyšších alkoholů je spíše výjimkou. Nižší alkoholy slouží k výrobě příslušných esterů, acetalů a jiných sloučenin používaných k aromatizaci potravin nebo také jako potravinářská aditiva (například rozpouštědla). Jako vonné látky se uplatňují jen nepatrně nebo se vůbec neuplatňují málo těkavé vyšší alifatické alkoholy (například tzv. mastné alkoholy, které jsou složkou vosků), polární alifatické a alicyklické dioly, trioly, ostatní polyoly, diterpenové alkoholy, triterpenové alkoholy a steroly, které jsou doprovodnými látkami lipidů. 19

Neuplatňují se také aminoalkoholy, jako je 2-aminoethanol (kolamin) a cholin, které se vyskytují

jako

součást

fosfolipidů,

hydroxykyseliny

a

další

polární

hydroxyderiváty [4]. Po naplnění moštu do kvasných nádob a sudů má velký vliv na kvašení nejen dostatečné množství zkvasitelného cukru, ale i teplota prostředí. Množství a aktivita kvasinek je nejlepší v rozmezí teploty od 22 do 27 °C. Nejvhodnější teplota sklepa a kvasírny by v době kvašení měla být 15 až 16 °C, při níž mošty dobře a rovnoměrně kvasí. Nízké teploty jsou příčinou pomalého a nedokonalého prokvášení. Vyšší teploty nad 20 °C jsou nevhodné, protože při nich mošty rychle prokvášejí, čímž dochází ke ztrátám buketu a alkoholu. Alkoholické kvašení hroznového moštu rozdělujeme na tři fáze, a to na začátek, bouřlivé kvašení a dokvášení. Kvašením se štěpí cukr na alkohol a oxid uhličitý. Dále při alkoholickém kvašení vznikají četné vedlejší produkty, které ovlivňují budoucí charakter vína. Jsou to glycerol, estery, aldehydy, kyseliny a jiné. Při bouřlivém kvašení nastává větší uvolňování oxidu uhličitého, a tím se zvyšuje teplota moštu, která může dosáhnout 30 i více °C. Proto ji musíme regulovat chlazením nebo větráním kvasíren. Kovové nádoby můžeme přímo ochlazovat studenou vodou. Při větším množství moštu se stále více osvědčují průtokové výměníky tepla ponořené do kvasných nádob. Kvašení do určité míry regulujeme tím, že mošty odkalíme, a tím kvašení zpomalíme. Rozkvašený hroznový mošt v době bouřlivého kvašení, kdy ještě obsahuje více cukru než alkoholu, se nazývá burčák a pro svou zvláštní chuť, vůni i vzhled se stal velmi populárním a vyhledávaným nápojem. Při bouřlivém kvašení dochází k odbourávání cukru, jeho přeměně na alkohol a k tvorbě dalších produktů kvašení. Burčák je chuťově nejvhodnější asi v polovině kvašení moštu, když obsahuje nejméně 6 objemových procent alkoholu a nezkvašený zbytkový cukr, který mu dodává hladkost a dojem nealkoholického nápoje. Jeho příjemnou svěžest vytváří oxid uhličitý. Burčák také upoutává svou výraznou vůní. V rozkvašeném moštu se prolíná buket odrůdy s kvasným. Slabou stránkou burčáku je, že se nedá přesně určit časové rozpětí a nejvýhodnější doba pro jeho konzumaci s větším předstihem. Jelikož je burčák dostupný jen ve velmi krátkém časovém rozmezí, začíná se vyrábět již z nejranějších odrůd vinné révy. Postupnou sklizní pozdnějších odrůd se prodlužuje délka jeho sezóny [5]. Alkohol se tvoří při kvašení moštů rozkladem cukru kvasinkami na alkohol a oxid uhličitý. Vyšší obsah alkoholu zajišťuje vyšší stabilitu vína proti kvasničním 20

zákalům i různým bakteriálním onemocněním, jako je octovatění vína, mléčné kvašení, křísovatění a další. Obsah 10 % obj. alkoholu ve vínech je minimální hranicí zajišťující určitou mikrobiologickou stabilitu vína. Při kvašení vzniká i malé množství glycerolu, který chuť vína zjemňuje a ovlivňuje příznivě i jeho plnost [1]. Ethanol má výrazný vliv na charakter chuti vína. Jeho obsah souvisí s obsahem cukrů v moštu, tedy se stupněm zralosti hroznů a se stupněm prokvašení. Je korekčním faktorem kyselé chuti. Například vodný roztok obsahující ethanol v množství 30 g/l je sladší než roztok sacharosy o koncentraci 20 g/l, slabě alkoholický roztok sacharosy je sladší než její vodný roztok. U červených vín bohatých na třísloviny ethanol koriguje jejich hořkou a svíravou chuť [4]. Rovnice ethanolového kvašení: C6H12O6 → 2C2H5OH + 2CO2 + energie

3.1.8 Těkavé kyseliny Kyseliny octová, mléčná, máselná a propionová se tvoří v malém množství jako vedlejší produkty alkoholického kvašení. Ve větším množství se tvoří při takzvaném nečistém kvašení, způsobeným různými druhy bakterií, jež působí onemocnění vína. Nejčastěji se tvoří u nízkoalkoholických vín kyselina octová. Obsah těchto kyselin je limitován zákonnými předpisy uvádějícími maximální množství těkavých kyselin v g/l vína v přepočtu na kyselinu octovou [1].

3.1.9 Aromatické a buketní látky

Organoleptické vlastnosti a kvalitu vín ovlivňuje mnoho různých faktorů. Kvalita vůně a chuti závisí totiž také na vyváženosti dílčích vůní a chutí. Jednotlivá vína se vzájemně liší v závislosti na odrůdě révy, zralosti hroznů, eventuálním napadení mikroorganismy (zvláště plísní Botrytis cinerea), podmínkách během kvašení moštu (dominantním druhem mikroorganismů jsou kvasinky Saccharomyces cerevisiae, proto při fermentaci hraje důležitou roli pH a teplota) a dalších faktorech.

21

Odhaduje se, že vína obsahují 400 až 600 sloučenin v celkovém množství 0,8 až 1,2 g/l. Aroma je ve vinařské terminologii označením pro vůni mladých vín, transformací aroma během stárnutí vína chemickými reakcemi vzniká buket [4]. Je to souhrn dnes již ve větší míře zjistitelných a definovaných látek patřících mezi estery, aldehydy, acetaly, vyšší alkoholy a štěpné produkty bílkovin, které vytvářejí komplexy látek vyznačujících se specifickými chuťovými i aromatickými vlastnostmi. Jejich charakter je však možno zjistit pouze senzoricky. Rozdělují se na odrůdové primární, jež jsou charakteristické pro jednotlivé odrůdy révy, a sekundární, u kterých jsou primární buketní látky pozměněné alkoholickým kvašením. Jsou však stále charakteristické pro jednotlivé odrůdy. Kromě toho se tvoří vlivem činnosti kvasinek během kvašení takzvaný kvasný buket, charakteristický pro prokvašené víno. Během ležení a zrání vína v sudech i v lahvích se vytváří takzvaný ležácký buket, jenž sice odpovídá zpracovaným odrůdám révy, ale je charakteristický pro oxidativní procesy probíhající při postupném zrání vína. Tyto změny se týkají jak chuti, tak i vůně vína [1].

3.1.10 Cizorodé látky ve víně

Jedním ze základních používaných dělení cizorodých látek, a to nejen ve víně, je podle způsobu, kterým se do potraviny dostávají. První skupinou jsou látky, které se do potravin přidávají záměrně, za účelem zvýšení celkové kvality potravin, a jsou tak nazývány látkami aditivními neboli přídatnými. Druhou skupinou jsou látky, které se do potravin dostávají náhodně, a tudíž jsou chápány a souhrnně nazývány jako látky kontaminující neboli znečišťující [8].

Prakticky stálou, a proto nejvýznamnější cizorodou látkou ve víně, je volná i vázaná kyselina siřičitá, která se jako výborný antioxidační a částečně i konzervační prostředek používá běžně při výrobě vín. Kyselina siřičitá je u bílých vín vázána slaběji než ve vínech červených. Maximální obsah volné i vázané kyseliny siřičité ve víně je dán zákonnými předpisy ve formě norem a uvádí se, že pokud nejsou tyto povolené

22

hodnoty překročeny, obvykle není možné kyselinu siřičitou ve víně senzoricky rozpoznat. V opačném případě se jedná o víno čerstvě sířené nebo přesířené [1].

23

4 PŘEHLED ELEKTROMIGRAČNÍCH METOD Pro kvalitativní a kvantitativní analýzu je dnes dostupné široké spektrum analytických metod, které jsou založené na různých principech. Mezi jedny z nejvyužívanějších se řadí i metody elektromigrační či elektroforetické, což je soubor technik, které využívají toho, že ionizované částice mají ve stejnosměrném elektrickém poli rozdílnou pohyblivost. Tyto metody existují v celé řadě modifikací a kombinují jednak využití elektroforézy s elektroosmózou, tak i jiné principy využívající rozdílných elektroforetických pohyblivostí a několik dalších odlišností v chování analyzovaných látek ve známém prostředím jako je například rozdělování, adsorpce nebo využití dokonce i molekulově sítového efektu [9]. Jestliže dojde k vzájemné interakci roztoku, který obsahuje nabité částice a pevného povrchu, který rovněž nese elektrický náboj, dojde na jejich rozhranní ke vzniku elektrických dvojvrstev. Po krátké době zde nastane určité rovnovážné rozložení nábojů. Jestliže připojíme elektrický stejnosměrný proud o velké intenzitě, vzniklá rovnováha v rozdělení nábojů se naruší, což vede k tomu, že se elektricky nabité částice roztoku začnou pohybovat. Jsou-li látky, které nesou elektrický náboj rozpuštěny v elektrolytu a ten je následně umístěn do elektrického pole, dojde k tomu, že se tyto látky začnou pohybovat konstantní rychlostí. Ta je přímo úměrná velikosti jejich náboje. Směr pohybu kationtů je ke katodě (kladně nabitá elektroda) a naproti tomu anionty se pohybují směrem k anodě (záporně nabitá elektroda). Elektromigrační metody nacházejí své uplatnění pro separaci jak látek vysokomolekulárních, tak i těch nízkomolekulárních [10]. Jednou z nejvíce používaných modifikací jsou kapilární elektromigrační metody, které jsou označovány jako vysokoúčinná kapilární elektroforéza (HPCE – High Performance Capillary Electrophoresis). Mnozí odborníci tuto analytickou separační metodu považují za vůbec jednu z nejcitlivějších, nejúčinnějších a neperspektivnějších. Toto velmi příznivé hodnocení si kapilární elektromigrační metody získaly díky své citlivosti na úrovni femto-zeptomol (10-15 až 10-21 mol) stanovované látky v nanolitrových až pikolitrových objemech analyzovaného vzorku. Uváděná účinnost těchto metod dosahuje běžně hodnot stovek tisíc až milionů teoretických pater. Dalším významným

faktorem,

podílejícím

se

na

četném

využívání

kapilárních

elektromigračních metod je i fakt, že analýza proběhne za relativně krátkou dobu, která

24

se podle druhu anylytů a analyzovaného vzorku pohybuje v řádech několika minut až desítek minut [11].

Kapilární elektromigrační metody jsou poměrně rozšířené také především díky jejich univerzálnosti, která spočívá v různých principech (módech) separace. Jednotlivé módy jsou založeny na využívání různých separačních mechanismů, přičemž ve velké většině případů postačí ke změně módů změnit složení elektrolytového systému.

Kapilární elektroforéza se člení na následující typy:

♦ Kapilární zónová elektroforéza (CZE) ♦ Kapilární gelová elektroforéza (CGE) ♦ Micelární elektrokinetická kapilární chromatografie (MECC) ♦ Kapilární elektrochromatografie (CEC) ♦ Kapilární izoelektrická fokusace (CIEF) ♦ Kapilární izotachoforéza (CITP)

Kapilární elektroforéza má ve srovnání s klasickou elektroforézou v plošném uspořádání hned několik výhod, jako například již zmiňovanou účinnost a citlivost, podstatně menší spotřebu vzorku a kratší doba potřebná pro jednotlivé analýzy. Největšími výhodami pak jsou možnost automatizace těchto technik a on-line detekce a vyhodnocení všech výsledků analýzy [11].

4.1

Kapilární zónová elektroforéza (CZE) Tato moderní a velmi perspektivní metoda je považována za jednu

z nejúspěšnějších v současnosti, a to především díky své jednoduchosti, širokému spektru využití a s tím souvisejícím velkým rozšířením. Kapilární zónová elektroforéza využívá principů klasické elektroforézy v podobě, jakou již známe téměř celé století. Metoda bývá také někdy označována jako vysokoúčinná kapilární elektroforéza, elektroforéza ve volném roztoku (podle anglického názvu FSCE – free solution capillary electrophoresis) a nebo se můžeme s touto metodou můžeme setkat

25

pod názvem „open-tube“. Jak již zde bylo uvedeno, kapilární zónová elektroforéza je jednou z nejrozšířenějších elektromigračních metod, což je pravděpodobně i zásluhou toho, že v řadě aplikací předčí plynovou chromatografii (GC) i vysokoúčinnou kapalinovou chromatografii (HPLC) [12].

Kapilární zónová elektroforéza je analytická metoda, která ke stanovení stanovovaných látek využívá dvou základních transportních jevů, a to: ● elektroforetické migrace iontů – po připojení ke zdroji stejnosměrného napětí se začnou elektricky nabité částice pohybovat k opačně nabité elektrodě, ● elektroosmotického toku kapaliny (EOF) – po připojení ke zdroji stejnosměrného napětí se začne ve skleněné nebo křemenné kapiláře pohybovat celý elektrolytový systém k záporně nabité elektrodě.

Aby kapilární zónová elektroforéza mohla správně probíhat a poskytovat tak kvalitní informace, musí být splněno několik hlavních podmínek. Provozní kapilára musí být naplněna roztokem základního elektrolytu, který vede elektrický proud, přičemž oba konce kapiláry musí být společně s elektrodami z inertního materiálu (nejčastěji Pt) ponořeny do zásobníků s tímto vodivým elektrolytem. Obě elektrody jsou připojeny ke zdroji stejnosměrného vysokého napětí, které lze snadno regulovat v rozmezí 10 až 30 kV. Jednou z největších výhod kapilární elektroforézy je možnost zkrácení času potřebného pro analýzu, který je tím kratší, čím větší je použité napětí. S rostoucím na použitým napětím ovšem také stoupá množství vznikajícího tepla, které je ale stěnou kapiláry efektivně odváděno do okolního prostoru termostatu a analýza tak může probíhat bez větších negativních ovlivnění výsledků. Naproti tomu použití napětí blízkých hodnotám 30 kV při elektroforetickém stanovení v klasickém provedení by došlo k podstatnému ohřevu elektrolytového systému, což by vedlo ke zvýšení turbulence a difůze a následně ke znehodnocení výsledku celé analýzy [10]. Skutečnost, že se pro kapilární zónovou elektroforézu využívají kapiláry z křemene znamená, že na migraci celého elektrolytového systému se výrazně podílí vznikající elektroosmotický tok. Vnitřní povrch používaných křemenných kapilár se totiž chová jako slabě kyselý katex a při pH > 4 postupně dochází k neustále se zvyšujícímu nahrazování vodíkových iontů, za ionty běžně se vyskytující v roztoku základního elektrolytu. Vzhledem ke svým elektroforetickým vlastnostem a hydrataci se pak všechny tyto ionty společně s veškerým roztokem přítomným v křemenné 26

kapiláře začnou pohybovat ke katodovému konci kapiláry, před kterým bývá ve většině případů připojeno detekční zařízení. Velikost elektroosmotického toku je nejvíce závislá na pH elektrolytového systému. Při pH < 4 je tento jev prakticky zanedbatelný, avšak při zvyšujících se hodnotách pH se rovněž zvyšuje i vliv elektroosmotického toku. Tento jev je natolik důležitý, že jeho pochopení a schopnost regulace jsou pro úspěšný průběh celé analýzy nezbytné. Podstatný vliv na výsledky analýzy má také délka použité separační kapiláry, protože výsledná rychlost pohybu iontů je dána vektorovým součtem jejich elektroforetické rychlosti a rychlosti pohybu elektroosmotického toku. Tím dochází k separaci iontů po celou dobu jejich migrace k detekčnímu zařízení [11]. Objem dávkovaného vzorku je 1 až 10 nl, což jsou hodnoty zhruba tisíckrát menší než objemy vzorků pro chromatografické metody. Zavádění vzorku do systému se většinou provádí na anodovém konci. Jako detekční zařízení se většinou využívá detektor fotometrický, přes který kapilára prochází a vyhodnocuje se zde absorpce ultrafialového záření. Díky spojení detekčního zařízení s moderní výpočetní technikou je umožněno on line zpracování a vyhodnocení získaných údajů [10]. Výsledný záznam, na kterém je uvedena závislost odezvy detekčního zařízení na čase je velmi podobný výstupnímu záznamu při chromatografickém stanovení a nazývá se elektroforegram. Kvalitativní ukazatele jsou migrační čas (doba od začátku separace po průchod vzorku detekčním zařízením) nebo poloha píku (vzdálenost od startu k maximu píku). Kvantitativní vyhodnocení stanovované látky se provádí podle plochy nebo výšky píků [12].

4.1.1 Přístrojové provedení Potřebné vybavení pro kapilární zónovou elektroforézu zahrnuje zdroj vysokého napětí, výpočetní techniku pro zpracovávání získaných dat, detekční zařízení, dvě elektrody z inertního materiálu, dva zásobníky na základní elektrolyt a křemennou separační kapiláru.

27

Obr. 2 Schématické znázornění provedení kapilární zónové elektroforézy

4.1.1.1 Separační kapiláry Metoda kapilární zónové elektroforézy sice má několik specifických požadavků, co se týká používaných separačních kapilár, avšak ty splňují i kapiláry běžně používané při plynové kapilární chromatografii. Jelikož jsou vyráběny z taveného syntetického křemene, jsou velmi křehké, a proto jsou proti mechanickému poškození alespoň částečně chráněny tenkou vrstvou polyimidu, která by však znemožnila správnou funkci detekčního zařízení, a proto se v detekční části odstraňuje. Také vnitřní povrch používaných kapilár musí projít speciální úpravou, a to konkrétně kvůli omezení elektroosmotického toku a sorpce analytu na vnitřní povrch kapiláry. Vůbec nejběžněji využívané separační kapiláry mají délku 20 až 100 cm, jejich vnitřní průměr se pohybuje v rozmezí 50 až 75 µm a vnitřní povrch mají chemicky modifikovaný (modifikace dynamická nebo kovalentní) [11].

28

4.1.1.2 Dávkování vzorku Jak zde již bylo uvedeno, jednou z největších výhod kapilární zónové elektroforézy je její velmi nízká potřeba vzorku nutná pro úspěšnou analýzu a může se pohybovat v řádech několika nanolitrů. Vzorek se dávkuje ve formě roztoku v drtivé většině na anodovém konci separační kapiláry. Také zde existuje několik variant, z nichž nejvíce využívané jsou dva základní způsoby, a to hydrodynamický a elektrokinetický. Hydrodynamický způsob dávkování je vůbec nejběžněji užívaný. Jeho princip spočívá v tom, že separační kapilára je na svém anodovém konci ponořena do nádobky obsahující roztok vzorku. Vlastní hydrodynamické dávkování může proběhnout třemi způsoby. Při dávkování vzorku se vyvine tlak v místě jeho aplikace nebo se využije podtlaku na straně opačné. Poslední možnost hydrodynamického dávkování vzorku je využití hydrostatického rozdílu hladin. Elektrokinetický neboli elektromigrační způsob je při dávkování vzorku ten méně využívaný. Především se využívá v případech, kdy pro dávkování nemůžeme použít hydrodynamický způsob. Tento způsob je založen na ponoření jednoho konce kapiláry do nádobky, která obsahuje roztok vzorku a následném připojení ke zdroji elektrického napětí. Patrně největší nevýhodou tohoto způsobu dávkování je, že dochází k rozdílnému dávkování různých složek vzorku. Připojením ke zdroji elektrického napětí totiž začne probíhat separace již při dávkování vzorku a do vlastní separační kapiláry již vstupuje tak vstupuje větší množství částic, které mají větší elektroforetickou pohyblivost a naopak méně částic, které mají elektroforetickou pohyblivost menší [10].

4.1.1.3 Detekční zařízení Nároky na detekční zařízení využívané při kapilární zónové elektroforéze jsou velmi vysoké. Mimořádné nároky na citlivost všech používaných detekčních zařízení jsou dány především tím, že pro separaci se používají především kapiláry s velmi malým vnitřním průměrem. Detekčních zařízení, která vyhovují těmto náročným požadavkům, existuje hned několik. Nejvíce používanými jsou detektory absorpční,

29

které jsou založeny na rozdílné absorpci ultrafialového záření migrujících zón analytů a nosného elektrolytu. Velkou výhodou těchto detektorů je jejich velmi široké spektrum použitelnosti pro nejrůznější aplikace. Dalšími používanými optickými metodami detekce jsou fluorescenční detektory. Ve srovnání s absorpčními detekčními zařízeními poskytují citlivost vyšší až o tři řády, avšak nemá tam široké spektrum použitelnosti. Další detektor je velmi drahý, avšak v kapilární zónové elektroforéze se osvědčil jako nejcitlivější. Jedná se o detekční zařízení a laserem indukovanou fluorescencí (Laser Induced Fluorescence – LIF). V posledních letech se začínají čím dál více využívat kombinace selektivní elektroforézy a hmotnostní spektrometrie. Tato metoda má své přednosti v tom, díky velkému množství informací, které poskytuje o vzorku a jeho složení, umožňuje jeho velmi snadnou identifikaci [10].

4.1.2 Elektroforéza Pod pojmem elektroforéza rozumíme soubor technik, využívajících k separaci jednotlivých látek, jejich odlišné vlastnosti a chování v elektrickém poli. Každá volná částice vykazující elektrický náboj se v elektrickém poli pohybuje. Směr pohybu je dán orientací elektrického pole a znaménkem náboje částice. Na rychlosti pohybu se podílí společně několik fyzikálně-chemických vlastností, jako jsou náboj částic, tvar částic a velikost částic. Velkou roli zde ovšem také samozřejmě hraje i odpor prostředí. Z uvedených informací je tedy zřejmé, že pro rychlost dvou stejně objemných částic v jednom prostředí bude rozhodující velikost náboje částic. Veličina která tuto vlastnost popisuje se nazývá elektroforetická pohyblivost, popřípadě elektroforetická mobilita. Ta vyjadřuje rychlost pohybu částice nebo iontu v jednotkovém elektrickém poli. Symbolů označujících elektroforetickou pohyblivost je v literatuře používáno mnoho, jako například M, m, U, u. Avšak jediné a správné označení pro elektroforetickou pohyblivost je pouze symbol µ.

30

Základní vztah pro výpočet rychlosti pohybu iontu v roztoku :

v = µ∗E = µ∗

U l

kde E = intenzita elektrického pole, U = napětí, l = vzdálenost na které vzniká gradient napětí. Základní jednotkou elektroforetické pohyblivosti je m2V-1s-1, případně cm2V-1s-1. Protože se s přirozenými čísly operuje nejsnáze, bylo ujednáno, že se jednotky elektroforetické mobility budou násobit 109, respektive 105 a na počest jednoho z největších průkopníků v oboru elektroforézy, Arne Tiselia (v roce 1948 obdržel Nobelovu cenu za chemii), bývá také někdy jednotka v této podobě nazývána jako jednotka Tiseliova [13].

4.1.3 Elektroosmotický tok Analýza prováděná pomocí kapilárních elektroforetických metod a tudíž i veškeré její výsledky jsou kromě elektroforetických vlastností stanovované látky zásadně ovlivněny také působením vznikajícího elektroosmotického toku. Ten je natolik významný, že se řadí mezi jedny z nejdůležitějších transportních jevů vznikajících při kapilárních elektromigračních metodách. Elektroosmotický tok vzniká na rozhraní fází mezi roztokem elektrolytu a vnitřním povrchem stěny křemenné kapiláry, kdy dochází ke specifické adsorpci kladně nabitých vodíkových iontů z elektrolytu na povrch kapiláry. Adsorpcí těchto kladných iontů vzniká na fázovém rozhraní přebytek náboje, jež se vyrovná nábojem záporně nabitých iontů, které jsou přítomny v roztoku a vytváří se elektrická dvojvrstva (takzvaná Sternova vrstva). Vnitřní část Sternovy vrstvy se skládá z elektrostaticky vázaných iontů na ionty sorbované. Naproti tomu část vnější zahrnuje slaběji vázané ionty, které jsou z roztoku vyměňovány pomocí difůze [11]. Jak zde již bylo uvedeno, kapilární elektroforetické metody využívají separační kapiláry vyráběné z taveného křemene. Ty na své vnitřní stěně obsahují silanolové skupiny, které jsou ionizovatelné a absorbované ionogenní molekuly z roztoku elektrolytu. Po naplnění kapiláry roztokem elektrolytu totiž dochází k jeho disociaci, která je silně závislá na pH prostředí. Silanolové skupiny na povrchu stěny křemenné

31

kapiláry tak přitahují kladně nabité ionty (kationty) z roztoku elektrolytu a to má za následek vznik elektrické dvojvrstvy. Při tomto jevu se současně vytváří i rozdíl potenciálů, který se označuje jako zeta potenciál a někdy se můžeme setkat i s názvem elektrokinetický potenciál. Kationty nenacházející se v blízkosti stěny kapiláry a tudíž nejsou vázány silanolovými vrstvami, vytváření takzvanou difúzní vrstvu, která se po připojení ke zdroji stejnosměrného elektrického napětí začne pohybovat směrem ke katodě. Díky své solvataci ovšem vyvolá zároveň i pohyb celého elektrolytu, který se nachází v separační kapiláře. Elektroosmotický tok je dokonce tak silný, že ke katodě jsou unášeny i anionty. Z tohoto důvodu se většinou detekční zařízení umisťuje před katodu. Elektroosmotický tok unáší všechny přítomné ionty v roztoku elektrolytu stejnou rychlostí, což znamená, že ze separačního hlediska je to síla neselektivní. Neutrální částice, které jsou přítomné v roztoku elektrolytu, se pohybují pouze rychlostí elektroosmotického toku, částice vykazující elektrický náboj navíc uplatňují ještě rychlost podle svojí specifické elektroforetické pohyblivosti. To má za následek, že kationty se pohybují a anionty pomaleji. Výsledná rychlost iontů je dána rychlostí elektroosmotického

toku

a

specifické

elektroforetické

pohyblivosti.

Směr

elektroosmotického toku je ve většině případů směrem ke katodě a vzorek se dávkuje na anodovém konci kapiláry. V tomto případě je výsledná rychlost kationtů vektorovým součtem elektroosmotické a elektroforetické rychlosti a rychlost aniontů se rovná rozdílu těchto rychlostí. Z tohoto důvodu se v tomto případě neutrální částice unášené pouze elektroosmotickým tokem pohybují rychleji než anionty. Celý tento jev, který vzniká při použití separačních kapilár vyrobených z křemenného skla se nazývá elektroosmóza a pohyb tímto jevem vyvolaný se označuje jako elektroosmotický tok (Electro-osmotic Flow – EOF) [14].

Vztah pro výpočet pohyblivosti elektroosmotického toku:

µ EOF =

ε ⋅ζ 4 ⋅ π ⋅η ⋅ r

kde: ε - dielektrická konstanta základního elektrolytu, ζ - elektrochemický (zeta) potenciál,

32

η - viskozita prostředí, r - poloměr kapiláry.

Z uvedeného vztahu je patrné, že velikost a vliv elektroosmotického toku lze s úspěchem měnit jednak složením základního elektrolytového systému, ale i volbou použité kapiláry, kde je rozhodující její poloměr, popřípadě vnitřní úprava jejího povrchu. Elektroosmotický tok ovšem nemusí být při separaci vždy nutně vítaným jevem, a proto jsou vyvinuty postupy pro jeho eliminaci. Využívá se skutečnosti, že disociace silanolových skupin na vnitřním povrchu křemenné kapiláry je silně závislá především na pH roztoku elektrolytového systému, kterým je kapilára naplněna. Použijeme-li elektrolyt, který vykazuje pH > 4, disociace přítomných silanolových skupin je tak malá, že výsledný elektroosmotický tok dosahuje hodnot, které neovlivňují průběh analýzy a proto ho můžeme zanedbat. Na druhou stranu při použití elektrolytu, který vykazuje hodnoty pH > 9, jsou veškeré silanolové skupiny na vnitřním kapilárním povrchu plně disociovány a elektroosmotický tok tak dosahuje nejvyšších možných hodnot, kterých lze v tomto systému dosáhnout. V tomto případě však nastává jeho částečné snížení, jelikož na iontové síle roztoku základního elektrolytu je také závislý zeta potenciál, který je snižován vlivem větší iontové síly, jež stlačuje elektrickou dvojvrstvu k vnitřnímu kapilárnímu povrchu [11]. Případů, kdy elektroosmotický tok chápeme jako jev nežádoucí, a proto usilujeme o jeho minimalizaci je celá řada. Jedním z těchto případů je i stav, kdy v uzavřených kapilárách dochází vlivem elektroosmózy ke vzniku takzvané hydrodynamické smyčky, kdy kapalina proudí jedním směrem při stěnách kapiláry a u uzavřeného konce kapiláry se tok kapaliny obrátí a vrací se zpět jejím středem. Tento stav vnímáme jako nepříznivý, protože jednotlivá zónová rozhranní jsou silně rozmývána a výsledky analýzy tak ztrácí svoji vypovídající hodnotu. Možností, jak ovlivnit elektroosmotický tok , existuje hned několik a nejčastěji používanými způsoby spočívají ve změně pH používaného elektrolytového systému nebo přídavek povrchově aktivní látky, změnou teploty, při které separace probíhá či použití speciálních separačních kapilár, které mají upraven vnitřní povrch tak, aby byl elektroosmotický tok co nejvíce potlačen [11].

33

4.2

Kapilární gelová elektroforéza (CGE) Kapilární gelová elektroforéza je metoda vhodná především pro dělení velkých

iontů a využívá se pro analýzu peptidů, bílkovin, sacharidů a částí DNA nebo RNA. Metoda je založena na kombinovaném využívání rozdílných elektroforetických mobilit a současně zde dochází k využití molekulově sítového efektu, kdy dochází k separaci molekul podle jejich velikosti. Celá kapilára je uvnitř naplněna porézním gelem, skrze který ionty migrují. Přítomnost gelu uvnitř kapiláry má za následek i to, že nedochází ke vzniku elektroosmotického toku. Z tohoto důvodu může být během jednoho experimentu separován jen jeden druh iontu (kationty nebo anionty) [12].

4.3

Micelární elektrokinetická chromatografie (MECC) Tato metoda byla vyvinuta poměrně nedávno a to konkrétně v roce 1984

a jelikož byly všechny ostatní příbuzné metody vyvinuty před tímto datem, označuje se micelární

elektrokinetická

chromatografie

jako

nejmladší

z kapilárních

elektromigračních metod. Byla úspěšně vyvíjena za účelem separace sloučenin, které nevykazují žádný elektrický náboj a tudíž se nedaly separovat běžnou kapilární elektroforézou. Tuto metodu lze navíc také aplikovat pro analýzu hydrofilních a hydrofobních látek. Metoda je založena na kombinaci známých elektrokinetických jevů a chromatografie. Kromě elektroforézy a elektroosmózy se navíc využívá distribuce všech analyzovaných látek mezi vodní a micelární fází, čímž se dosáhne požadované separace [11]. Separace probíhá ve vodném roztoku elektrolytu s vysokým pH, do kterého je přidána povrchově aktivní látka v nadkritické koncentraci. Takto vysoká koncentrace povrchově aktivní látky má za následek vznik micel, které se označují jako pseudostacionární fáze. Nejčastěji se jako povrchově aktivní látka používá dodecylsíran sodný (sodium dodecylsulphate SDS). Vzniklá micely mají záporný náboj a tudíž se v systému pohybují na základě elektroforetických zákonů směrem k anodě. V elektrolytovém systému se však uplatňuje i další z transportních jevů a to elektroosmotický tok, který je tak silný,

34

že celý systém se pohybuje směrem ke katodě, a z tohoto důvodu se před ni umisťuje detekční zařízení [11]. Analýza elektroneutrálních částic je možná díky tomu, že jsou navázány na micely pseudostacionární

fáze

vzniklé

přidáním

povrchově

aktivní

látky

v nadkritické koncentraci a jsou unášeny elektroosmotickým tokem. Principem separace je rozdílná afinita neutrálních látek, kdy se rozdělují mezi vodní a micelární fázi, která svým zpětným pohybem látky zpomaluje [13].

4.4

Kapilární elektrochromatografie (CEC) Tato metoda se využívá především pro separaci neutrálních molekul a iontů a je

velmi často využívána ve farmaceutickém průmyslu nebo pro toxikologické analýzy. Podobně jako micelární elektrokinetická chromatografie je kapilární chromatografie kombinovaná metoda, která využívá základní principy kapilární elektroforézy a vysokoúčinné kapalinové chromatografie. Separace přítomných složek vzorku probíhá na základě jejich rozdílných rozdělovacích koeficientů mezi mobilní a stacionární fázi. Pohyb mobilní fáze v kapiláře je zajišťován pomocí elektroosmotického toku ložem stacionární fáze. Elektroosmotický tok vzniká v systému po připojení ke zdroji stejnosměrného elektrického napětí, ovšem v tomto případě s drobným rozdílem, že vzniká především na povrchu stacionární fáze. Separace probíhá v kapilárách naplněných drobnými částicemi stacionární fáze o rozměrech 1 až 5 µm. Elektricky neutrální částice analyzovaných vzorků se separují na základě rozdílné distribuce mezi stacionární a mobilní fází systému a separace nabitých analytů je podporována díky rozdílům v jejich elektroforetických mobilitách. Asi největší výhodou této analytické metody je skutečnost, že elektroosmotický tok má pístový rychlostní profil, což umožňuje dosažení větší účinnosti než u vysokoúčinné kapalinové chromatografie [12].

35

4.5

Kapilární izoelektrická fokusace (CIEF) Tato metoda nachází široké uplatnění především pro stanovení aminokyselin

a bílkovin. Kapilární izoelektrická fokusace je využívána k dělení molekul majících amfolytickou

povahu,

přičemž

se využívá

rozdílných

izoelektrických

bodů.

Izoelektrický bod je definován jako hodnota pH, při které má studovaná částice celkový náboj roven nule, a proto se v elektrickém poli již nemůže sama pohybovat. Amfolyty jsou sloučeniny, jejichž molekuly se v roztoku mohou vyskytovat ve formě anionu, kationu a dokonce i jako částice s neutrálním celkovým nábojem. Podobu, v jaké se momentálně vyskytuje určuje pH konkrétního prostředí. Princip separace kapilární izoelektrické fokusace je takový, že molekuly analytu se rozdělují v gradientu pH, který vzniká jako důsledek působení elektrického pole na směs amfolytů, kterými je kapilára naplněna a jsou schopny pufrovat celý požadovaný rozsah pH a vytvořit tak spojitý pH gradient. Stanovované látky se pohybují tímto roztokem až do té doby, než fokusují. To znamená, že se dostaly do oblasti, kde pH odpovídá jejich izoelektrickému bodu. V ten okamžik se jejich elektrický náboj stane neutrálním, což způsobí konec jejich migrace a následně dojde k vytvoření úzké zóny neboli fokusaci. Při tomto druhu analýzy je elektroosmotický tok chápán jako nepříznivý jev, jelikož by mohl být příčinou vymývání amfolytů a stanovení by nemohlo proběhnout úspěšně. Z těchto důvodů se pro metodu kapilární izoelektrické fokusace používají kapiláry s upraveným vnitřním povrchem. Druhou možností, jak zabránit vzniku elektroosmotického toku je přídavek hydroxymethylcelulosy [10]. Po dokončení izoelektrické fokusace je důležité správně identifikovat vzniklé zóny, k čemuž je zapotřebí detekční zařízení. To se ovšem nachází u konce separační kapiláry a z tohoto důvodu se musí analyty uvést zpět do pohybu. Toho se docílí buďto tlakem nebo elektroforeticky po přídavku solí. Další možností, jak získat potřebná data je využití pohyblivého skenujícího detektoru [12].

36

4.6

Kapilární izotachoforéza (CITP) Tato metoda je určena převážně pro analýzu vzorků, ve kterých jsou přítomny

směsi malých iontů. Kapilární izotachoforézy vznikla v polovině šedesátých let minulého století a je založena na principu rozdílných elektroforetických pohyblivostí stanovovaných iontů. Rozdíl oproti elektroforéze je takový, že je separační prostředí tvořeno vedoucím a koncovým elektrolytem, které mají odlišné elektroforetické pohyblivosti. Při jedné analýze je možné separovat pouze jednoho druhu iontů, protože systém použitého vedoucího a koncového elektrolytu musí obsahovat striktně ionty, které mají shodný náboj s ionty, které jsou přítomné ve zkoumaném vzorku. To znamená, že pokud chceme stanovovat například anionty, musí být navržen aniontový systém provozních elektrolytů a musí být dodrženy základní podmínky. Vedoucí elektrolyt (LE) je vybírán tak, aby jeho ionty měly v konkrétním systému nejvyšší elektroforetickou pohyblivost a koncový elektrolyt (TE) musí obsahovat ionty, které vykazují nejnižší elektroforetickou pohyblivost v daném systému. Aby mohlo izotachoforetické stanovení vůbec proběhnout, musí být ve všech zónách zachovaná elektroneutralita pomocí přítomných protiiontů. Ty by měly být ve všech elektrolytech stejné [14]. Po připojení ke zdroji stejnosměrného napětí se všechny přítomné ionty v systému začnou vlivem elektrického pole pohybovat k opačně nabité elektrodě a vzhledem k jejich různé elektroforetické pohyblivosti dochází k jejich separaci. Po určité době průběhu analýzy se v kapiláře vytvoří ustálený rovnovážný (stacionární) stav, kdy jsou všechny přítomné ionty vzorku odseparovány a vzhledem k jejich snižujícím se elektroforetických pohyblivostí sestupně seřazeny těsně za sebou mezi vedoucím a koncovým elektrolytem. Jednou z výhod kapilární izotachoforézy je fakt, že ostrá rozhraní, které vznikly mezi jednotlivými zónami, se ani po delší době nerozmývají a zóny se od sebe nevzdalují. V jednotlivých izotachoforetických zónách je koncentrace iontů vždy konstantní, přičemž délka zóny je vždy určována látkovou koncentrací dávkované látky a je ovlivněna koncentrací látky v předcházející izotachoforetické zóně, od vodícího elektrolytu počínaje [15]. Po dosažení rovnovážného (stacionárního) stavu, se všechny přítomné ionty začnou pohybovat stejnou rychlostí. Tohoto stavu je možné dosáhnout, jelikož se pro každou izotachoforetickou zónu vytvořil jiný potenciálový gradient, označován někdy také jako potenciálový spád. Existence tohoto jevu tedy znamená, že čím méně

37

pohyblivé ionty se v dané izotachoforetické zóně nacházejí, tím větší gradient potenciálu je zde vytvářen, a proto na méně pohyblivé ionty působí větší hnací síla [14]. Již zmiňovanou předností izotachoforetického stanovení je, že rozhraní vzniklá mezi jednotlivými zónami jsou ve stacionárním stavu vždy velmi ostrá a ani po delší době nedochází k jejich rozmývání. Tento jev je zapříčiněn samozaostřujícím efektem. Jeho princip je takový, že když se ion vlivem difůze dostane do zóny, ve které se nacházejí méně pohyblivé ionty, začne na něj ihned působit větší gradient potenciálu. Tím se ion navrátí zpět do zóny, ze které se původně nacházel. Samozaostřující efekt se uplatňuje i v případě, kdy se ion dostane do izotachoforetické zóny pohyblivějších iontů, kde na něj v tomto případě začne působit menší potenciálový gradient, a díky tomu se ion dostane do své původní zóny [15].

4.6.1 Průvodní jevy při kapilární izotachoforéze

4.6.1.1 Elektroosmóza V kapilárních elektromigračních metodách jsou elektroosmóza společně s elektroforetickým

pohybem

dva

nejdůležitější

transportní

jevy.

Význam

elektroosmotického toku spočívá především v tom, že jeho působením dochází k migraci veškerého přítomného elektrolytu v kapiláře. Elektroosmotický tok vzniká po připojení kapiláry ke zdroji stejnosměrného elektrického napětí, začne působit na difúzní část elektrické dvojvrstvy, která vznikla na fázovém rozhraní pevné a kapalné fáze u vnitřní stěny křemenné kapiláry [11]. Nezbytným předpokladem pro vznik elektroosmotického toku je takové pH roztoku základního elektrolytu, jímž se separační kapilára naplněna, aby došlo k ionizaci adsorbovaných ionogenních skupin elektrolytu a funkčních skupin, které obsahuje vnitřní stěna křemenné kapiláry. K vytvoření elektrické dvojvrstvy dojde tím, že ionizací vzniklý záporný náboj na stěně kapiláry přitahuje kladně nabité ionty z roztoku základního elektrolytu, čímž se vytváří elektrokinetický potenciál. Připojením ke zdroji elektrického napětí, dojde ke vzniku hydrodynamického toku celého elektrolytového systému.

38

Elektroosmotický tok nemusí být vždy jevem vítaným, jelikož jeho vlivem může v některých situacích dojít k deformaci vzniklých rozhraní, čímž se výrazně snižuje citlivost analytického stanovení. Při izotachoforéze se snažíme elektroosmotický tok co nejvíce eliminovat například snížením elektrokinetického potenciálu (přídavek neionogenních smáčedel do roztoku základního elektrolytu) nebo zvýšením viskozity základního elektrolytu (přídavek lineárního polyakrylamidu do roztoku vedoucího elektrolytu).

4.6.1.2 Jouleovo teplo Při průchodu elektrického proudu každým elektricky vodivým materiálem dochází k přeměně části elektrické energie na energii tepelnou, která se nazývá Jouleovo teplo.

Vztah pro výpočet Jouleova tepla (Q):

U2 Q= ⋅t R kde: U – elektrické napětí, R – odpor vodiče, t – čas.

Při izotachoforetickém stanovení platí, že čím vyšší je použité napětí, tím kratší je celková doba potřebná pro analýzu, což ovšem úzce souvisí s množstvím vzniklého Jouleova tepla, způsobující elektrický ohřev, který je v tomto případě vnímán jako negativní jev doprovázející separaci. Elektrický ohřev totiž znemožňuje použití vyšších hodnot napětí a tím podstatně zkrátit dobu analýzy, jelikož: výrazně ovlivňuje iontové a efektivní pohyblivosti, vodivost, pH a hustotu látek přítomných v systému a může dokonce vést až k destrukci termolabilních látek (denaturace bílkovin).

39

Všechny nežádoucí vlivy související se vznikem Jouleova tepla můžeme alespoň částečně snížit chlazením systému, popřípadě omezit jeho vznik použitím nižších hodnot napětí [15].

4.6.1.3 Gravitace Gravitace je jedním z těch jevů, které působí na izotachoforetické stanovení negativně, jelikož díky rozdílným hustotám izotachoforetických zón, dochází k výrazné deformaci jejich rozhraní, a tím se snižuje účinnost separace. Pro snížení vlivu gravitace a stabilizaci jednotlivých zón, se při izotachoforetickém stanovení používají především kapiláry s vnitřním průměrem menším než 0,8 mm [15].

4.6.1.4 Difúze Přirozenou snahou každé látky je přecházet z prostředí se svou vyšší koncentrací do prostředí, kde je jeho koncentrace nižší. Koncentrace látek se na rozhraní mezi izotachoforetickými zónami mění skokem, a z tohoto důvodu dochází ke vzniku difúzního toku ve směru koncentračního spádu. Proti tomuto vzniklému jevu působí samozaostřující efekt a výsledkem obou proti působících dějů je, že rozhraní mezi zónami má podélný rozměr a nazývá se šířka rozhraní a je hlavním zdrojem nepřesností při kvalitativním hodnocení velmi krátkých zón [15].

40

5

MATERIÁL A METODY ZPRACOVÁNÍ

5.1

Přístroje Firem, které se dnes zabývají vývojem a výrobou přístrojů pro kapilární

izotachoforézu existuje celá řada. Pro svá měření jsem měl k dispozici přístroj CS ISOTACHOPHORETIC ANALYSER, který vyrábí Ústav radioekologie a využití jaderné techniky ve Spišské Nové Vsi na Slovenské Republice.

Obr. 3 Schématické znázornění přístroje CS Isotachophoretic analyser T – terminátorový blok, K – dávkovací kohout, S – sept, C1 – separační kapilára, D1 – cela pomocného detektoru, R – rozvětvovací blok, P – pomocná elektroda, ↑ - vstup vedoucího elektrolytu, C2 – analytická kapilára, D2 – analytická detekční cela, L – blok cílové elektody

Tento přístroj má především analytické využití pro analýzu aniontů i kationtů ve vodných prostředích, přičemž jsou pro analýzu přípustná i směsná prostředí (voda a 40 % methanolu). Přístroj je dvoukolonový, přičemž využívá dvě odlišné kapiláry.

41

První v systému je kapilára separační, která je dlouhá 20 cm a její průměr je 0,8 mm a je vybavena samostatným vodivostním detektorem, který poskytuje informace o stavu separace vzorku a indikuje průchod čela vzorku. Jako druhá je v systému zapojena kapilára analytická, která je dlouhá 15 cm a její průměr činí 0,3 mm. Analytická kapilára je rovněž vybavena samostatným vodivostním detektorem.

5.2

Vzorky ♦ bílé víno – Veltlínské zelené, jakostní víno odrůdové z roku 2008, původ

z vinařství Sýkora, Čejkovice ♦ červené víno – Modrý Portugal, jakostní víno odrůdové z roku 2008, původ z vinařství Sýkora, Čejkovice

Všechny používané roztoky a vzorky jsem z důvodu lepší údržnosti a eliminace nežádoucích změn skladoval v lednici při teplotě +5ºC.

5.2.1 Úprava vzorků Aby mohla proběhnout separace všech analyzovaných složek v roztoku vzorku, je důležité také správně zvolit ředění vzorku, kdy musíme brát v úvahu především předpokládaný obsah stanovovaných látek a v souvislosti s ním i separační kapacitu kapiláry. Při jejím překročení by se na výsledném izotachoforegramu objevila směsná zóna nerozseparovaných složek, což by mohlo vést k chybnému závěru, že se ve vzorku nachází ještě další látka. Z tohoto důvodu jsem provedl více stanovení, kdy jsem při zachování stejného nastavení přístroje i systému elektrolytů měnil pouze poměr, v jakém jsem ředil vzorek vína s destilovanou vodou. To, že jsem nepřekročil separační kapacitu kapiláry jsem zjistil, když se po větším zředění vzorku nezměnil počet zón v elektroforegramu a zůstal stejný i po identifikaci látek, kdy se po přídavku známé látky do vzorku vždy jen jedna zóna prodloužila. Pro všechna další stanovení jsem používal vzorky, které jsem připravil ředěním vzorku vína s destilovanou vodou v poměru 1:30.

42

5.3

Použité roztoky Pro všechna izotachoforetická stanovení je nezbytné předem vědět, jaké látky

budeme stanovovat a podle toho zvolit nastavení přístroje a systém elektrolytů. Před vlastním stanovením jsem provedl několik simulací pomocí elektroforetického simulačního software SIMUL 5 (Karlova Univerzita, Praha), abych si ověřil, zda-li za zvolených podmínek proběhne separace všech složek, které chci ve vzorku stanovit. Při izotachoforetickém stanovení anionů je zapotřebí vytvořit systém elektrolytů, v němž vedoucí elektrolyt (LE -leading) obsahuje ionty s nejvyšší elektroforetickou pohyblivostí a koncový elektrolyt (TE - terminátor), který obsahuje ionty s nejnižší elektroforetickou pohyblivostí. V mém případě sloužil jako vedoucí elektrolyt chloridový ion (Cl-) (0,01 M HCl) s přídavkem roztoku β-alaninu jako protiiontu a 0,001% roztoku

HPMC

(hydroxypropylmethylcelulozy)

pro

potlačení

elektroosmotického toku. Vzniklý roztok vykazoval hodnotu pH 2,72 která byla na základě všech modelových simulací separací vybrána jako nejvíce vyhovující. Jako koncový elektrolyt jsem používal roztok kyseliny glutamové (0,015 M Glu) s přídavkem histidinu (0,015 M His)jako protiiontu pro zvýšení vodivosti elektrolytu.

Obr. 4 Ukázka počítačové simulace průběhu separace --β-alanin, --chloridový anion, --kys. glutamová, --kys. citronová, --kys.jablečná, --kys. mléčná, --kys.octová, --kys.vinná

43

5.4

Vlastní stanovení Při prvním stanovení jsem do vzorku vína přidal několik kapek roztoku

indikátoru SPADNS. Získal jsem tak přehled o průchodu vzorku přístrojem a dokázal jsem lépe odhadnout čas pro přesunutí analyzovaného vzorku ze separační kapiláry do kapiláry analytické, kde se při použití stejného elektrolytového systému dosáhne přibližně sedminásobného prodloužení zóny vzorku, což vede ke zvýšení citlivosti. Díky tomuto postupu můžeme dosáhnout podstatně přesnějších výsledků. Celková doba jedné analýzy se pohybovala kolem 25 minut.

Obr. 5 Ukázka laboratorního vybavení (CS Isotachophoretic analyser) 44

Obr. 6 Izotachoforegram vzorku bílého vína (1ml vzorku vína + 30 ml destilované vody, LE: 0,01M Cl- + β-alanin, pH 2,72; TE: 0,015MGlu + 0,015M histidin)

Obr. 7 Izotachoforegram vzorku červeného vína (1ml vzorku vína + 30 ml destilované vody, LE: 0,01M Cl- + β-alanin, pH 2,72; TE: 0,015MGlu + 0,015M histidin)

45

5.5

Vyhodnocení výsledků Pro kvantitativní vyhodnocení jsem použil techniku kalibrace vnějším

standardem, konkrétně metodu přímého srovnání, jenž spočívá v odděleném nadávkování definovaného množství vzorku a standardu o známé koncentraci. Jako standard jsem použil roztok příslušné kyseliny o koncentraci 0,001 mol/l. Množství stanovovaných kyselin ve víně jsem vypočítal na základě porovnání odpovídajících zón na izotachoforegramech. Metoda je použitelná za předpokladu, že všechny potřebné izotachoforetické cykly budou provedeny za naprosto totožných podmínek. Jelikož přístroj, na kterém jsem prováděl svá stanovení, je vybaven dávkovacím kohoutem o objemu 30 µl, mohl jsem pro výpočet koncentrace stanovovaných kyselin ve vzorcích použít rovnici zredukovanou na tvar:

c x = cs ⋅

lx ls

kde: cx - koncentrace stanovované látky (mol·l-1) cs - koncentrace standardní látky (mol·l-1) lx - délka zóny stanovované látky (sek.) ls - délka zóny standardní látky (sek.)

5.5.1 Výpočet množství kyseliny vinné ve vzorku bílého vína Standard: kyselina vinná o koncentraci 0,001 mol/l délka zóny standardu ls = 96 s

ckys.vinné = cs tan . ⋅

l kys.vinná l s tan dardu

ckys.vinné = 0,001 ⋅

66 96

c kys.vinné = 0,0006875 mol / l

46

Výpočet hmotnostní koncentrace:

c mkys .vinné = M kys .vinné ⋅ c kys .vinné

Mkys. vinné= 150,087 kg/mol

c mkys.vinné = 150,087 ⋅ 0,0006875

c mkys.vinné = 0,10318481g / l Přepočet na zředění vzorku:

c mkys .vinné = 0,10318481 ⋅ 30

c mkys .vinné = 3,0955443 g / l

c mkys .vinné = 3095,5mg / l Tab. 2 Obsah organických kyselin v bílém víně při použití konstantního elektrického proudu 25 µA. LE: 0,01M HCl + 0,01M β-Ala; TE:0,015M Glu + 0,015M His Průměrná

Relativní

délka zóny

směrodatná

(sek)

odchylka (%)

vinná

66

citronová

Organická

Koncentrace

Počet

(mg/l)

stanovení

2,02

3095,5

3

9

2,25

540,4

3

jablečná

60

1,72

2514,1

3

mléčná

36,6

1,84

1030,3

3

kyselina

Tab. 3 Obsah organických kyselin v červeném víně při použití konstantního elektrického proudu 25 µA. LE: 0,01M HCl + 0,01M β-Ala; TE:0,015M Glu + 0,015M His Průměrná

Relativní

délka zóny

směrodatná

(sek)

odchylka (%)

vinná

68,4

citronová

Organická

Koncentrace

Počet

(mg/l)

stanovení

2,12

3208,1

3

7,8

1,93

468,3

3

jablečná

21,6

2,23

905,1

3

mléčná

66,6

2,32

1874,8

3

kyselina

47

6

VÝSLEDKY A DISKUZE Elektromigračních metod, které se dají použít pro stanovení organických kyselin

ve víně existuje celá řada a vzhledem k tomu, že jednotlivé metody mohou být proveditelné v různých módech přizpůsobených konkrétním požadavkům, řadí se proto v tomto odvětví mezi jedny z nejvíce využívaných. Stanovení hlavních organických kyselin v hroznové šťávě a víně lze provést například také pomocí kapilární zónové elektroforézy (CZE) s přímou UV detekcí. V tomto případě byly analyzovány vzorky bílých, červených a růžových vín i hroznové šťávy. Úprava vzorku před jejich analýzou spočívala v jejich filtraci. Vlastní elektroforetická analýza vzorku trvala přibližně 3 minuty a díky využití UV detektoru bylo také možné snížit celkový počet jednotlivých stanovení v porovnání s běžně prováděnými CZE metodami. Díky tomu, že je tato metoda dosahuje velmi přesných a rychlých výsledků, se jeví jako vhodné její použití například ke kontrole zralosti vína a stejně dobře může být také využita k monitorování nežádoucích změn vzniklých při výrobě a skladování vína [16]. Jako velmi dobrá metoda, pro stanovení organických kyselin ve víně, se také osvědčila i kapilární zónová elektroforéza (CZE) s nepřímou UV detekcí. Tato metoda byla použita pro analýzu tentokrát vína Portského. Analyzované vzorky vína se v tomto případě nemusely nijak zvlášť upravovat, jako v předchozím případě a i přesto bylo dosaženo relevantních a cenných výsledků a úspory času současně [17]. Další velmi zajímavá a perspektivní metoda pro stanovení organických kyselin ve víně je mikročipová kapilární elektroforéza. V tomto případě se jako nejvýhodnější ukázalo použití ampérometrického detektoru. Pozornosti si zasluhuje především díky širokému spektru možných uplatnění, velmi nízké spotřebě vzorku a

svoji

rychlosti [18]. Velmi nadějných výsledků bylo dosaženo kombinací klasické kapilární elektroforézy s pervaporací (separace přes membránu). Metodou byly stanovovány těkavé organické kyseliny ve víně a celková doba analýzy byla 11 minut [19]. Pro stanovení aminokyselin byla vyvinuta metoda micelární elektrokinetické kapilární chromatografie. Podmínkou úspěšného stanovení bylo dodržení pH 9,7. Nespornou výhodou této metody je její citlivost a krátká doba potřebná pro analýzu [20].

48

Jedna z vůbec nejúspěšnějších metod pro stanovení organických kyselin ve víně vznikla úpravou klasické zónové elektroforézy pomocí konduktometrické detekce na polymethylakrylátovém čipu. To má za následek značnou rychlost a přesnost této metody [21].

49

7

ZÁVĚR Tato diplomová práce se zabývala problematikou stanovení organických kyselin

ve víně metodou kapilární izotachoforézy. Pomocí počítačových simulací v programu SIMUL 5 jsem navrhnul elektrolytový systém umožňující separaci organických kyselin, které se běžně vyskytují ve víně. Pro tyto účely jsem veškeré simulace prováděl na modelové směsi pěti organických kyselin (vinná, jablečná, mléčná, citronová, octová). Jako nejvhodnější pro separaci zmíněných organických kyselin, jsem po sérii simulací zvolil následující elektrolytový systém. Vedoucí elektrolyt (LE) obsahoval jako vedoucí ion chloridový, zde 0,01 M HCl s přídavkem roztoku 0,01M β-alaninu jako protiiontu do pH 2,72 a 0,001% roztok HPMC (hydroxypropylmethylcelulozy) pro potlačení elektroosmotického toku. Koncový elektrolyt (TE) obsahoval 0,015M kyselinu glutamovou s přídavkem 0,015M histidinu (His) jako protiiontu pro zvýšení vodivosti. Díky tomuto elektrolytovému systému bylo možné provádět skutečnou izotachoforetickou analýzu vzorků vína, při které došlo k separaci kyseliny vinné, jablečné, mléčné a citronové během jednoho stanovení. Metodou vnějšího standardu jsem provedl jejich kvantitativní analýzu a jejich výsledky uvádím v tabulkách 1 a 2. Všechna měření jsem prováděl třikrát a relativní směrodatná odchylka mezi jednotlivými analýzami nepřekračovala hodnoty 2,5 %. Mé výsledky obsahu organických kyselin ve vzorcích vín jsem porovnal s výsledky několika autorů, kteří se zabývali podobnou problematikou a dospěl jsem k závěru, že mezi výsledky nebyl žádný podstatný rozdíl, které by mohly znamenat chybu v metodice či postupu analýzy. Drobné rozdíly byly způsobeny rozdílností vzorků, které byly analyzovány, jelikož obsah organických kyselin se může výrazně lišit především v závislosti na odrůdě, druhu vína, klimatických podmínkách při pěstování a v neposlední řadě i na ročníku, kdy bylo víno vyrobeno. Jedna analýza trvala přibližně 25 minut a vzhledem k nízké ceně používaných chemikálií pro přípravu elektrolytů, přesnosti a věrohodnosti získaných dat, se metoda kapilární izotachoforézy jeví jako velmi vhodná pro stanovení organických kyselin ve víně.

50

8

SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY 1. KRAUS,V., KUTTELVAŠER,B., VURM,B., Encyklopedie českého a moravského vína. Praha: Nakladatelství Melantrich, 1997. 223 s. ISBN 80-7023250-1. 2. VELÍŠEK, J., Chemie potravin 1. Tábor, Ossis, 2002, 331 s. ISBN 80-8665900-3. 3. KRAUS, V., HUBÁČEK, V., ACKERMANN, P., Rukověť vinaře. ČZS Květ, Praha, 2000. 261 s. ISBN 80-85362-34-1. 4. VELÍŠEK, J., Chemie potravin 2. Tábor, Ossis, 2002, 320 s. ISBN 80-8665901-1 5. HUBÁČEK, V., Výroba révového vína. Institut výchovy a vzdělání MZe ČR v Praze, 1996. 40 s. ISBN 80-7105-140-3. 6. MALÍK, F., Dobré víno. Bratislava, Polygrafia, 1996, 341 s. ISBN 80-8878004-7 7. KRAUS, V., KOPEČEK, J., Setkání s vínem. Praha, Radix, 2002. 158 s. ISBN 80-86031-36-5 8. VELÍŠEK, J., Chemie potravin 3. Tábor, Ossis, 2002, 326 s. ISBN 80-8665902-X 9. KÁŠ, J., KODÍČEK, M., VALENTOVÁ, O. Laboratorní techniky biochemie, Praha: VŠCHT, 2006, 258 s. ISBN 80-7080-586-2 10. KLOUDA, P. Moderní analytické metody, Ostrava: Pavel Klouda, 2003, 129 s.ISBN 80-86369-07-2 11. KAŠIČKA, V. Teoretické základy a separační principy kapilárních elektromigračních metod, Chemické Listy, 1997, vol. 91, s. 320 – 329 12. ŠÍMA, J., Separační analytické metody.[on line], [cit.2009-04-20], Dostupné z: http://tomcat.bf.jcu.cz/sima/analyticka_chemie/separb.htm 13. DRBAL, K., KŘÍŽEK, M. Analytická chemie. České Budějovice: Jihočeská univerzita, 1999, s. 185 14. CHURÁČEK, J. a kol. Analytická separace látek, Praha, SNTL, 1990, s. 384 15. BOČEK, P., DEML, M.; GEBAUER, P., DOLNÍK, V. Analytická kapilární izotachoforéza, Praha: Academia, 1987, 133 s. 21-106-87 16. MATO, I., SUAREZ-LUQUE, S., HUIDOBRO, J. F. Simple determination of main organic acids in grape juice and wine by using capillary zone

51

electrophoresis with direct UV detection, Food chemistry, 2007, vol. 102, no.1, p. 104-112. 17. ESTEVES, V. I., LIMA, S. S. F., LIMA, D. L. D., DUARTE, A. C. Using capillary electrophoresis for the determination of organic acids in Port wine, Analytica ACTA, 2004, vol. 513, no.1, p. 163-167. 18. SCAMPICCHIO, M., WANG, J., MANNINO, S., CHATRATHI, M. P. Microchip capillary electrophoresis with amperometric detection for rapid separation and detection of phenolic acids, Journal of chromatography A, 2004, vol. 1049,no. 1-2,p. 189-194. 19. RUIZ-JIMENEZ, J., de CASTRO, M. D. L. On-line pervaporation-capillary electrophoresis for the determination of volatile acidity and free sulfur dioxide in wines, Electrophoresis, 2005, vol. 26, no. 11, p. 2231-2238. 20. CARVILLA, D., MORENO-ARRIBAS, M. V., FANALI, S., CIFUENTES, A. Chiral MEKC-LIF of amino acids in foods: Analysis of vinegars, Electrophoresis, 2006, vol. 27, no. 13, p. 2551-2557. 21. MASAR, M., POLAIKOVA, K., DANKOVA, M., KANIANSKY, D., STANISLAWSKI, B. Determination of organic acids in wine by zone electrophoresis on a chip with conductivity detection, Journal of separation science, 2005, vol. 28, no. 9-10, p. 905-914.

52

9

SEZNAM OBRÁZKŮ A TABULEK

Obr. 1 Spotřeba vína ve světě v litrech na osobu a rok

10

Obr. 2 Schématické znázornění provedení kapilární zónové elektroforézy

28

Obr. 3 Schématické znázornění přístroje CS Isotachophoretic analyse

41

Obr. 4 Ukázka počítačové simulace průběhu separace

43

Obr. 5 Ukázka laboratorního vybavení (CS Isotachophoretic analyser)

44

Obr. 6 Izotachoforegram vzorku bílého vína

45

Obr. 7 Izotachoforegram vzorku červeného vína

45

Tab. 1 Kategorie vín podle vyzrálosti hroznů

12

Tab. 2 Obsah organických kyselin v bílém víně při použití konstantního elektrického proudu 25 µA. LE: 0,01M HCl + 0,01M β-Ala; TE:0,015M Glu + 0,015M His

47

Tab. 3 Obsah organických kyselin v červeném víně při použití konstantního elektrického proudu 25 µA. LE: 0,01M HCl + 0,01M β-Ala; TE:0,015M Glu + 0,015M His

53

47