Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav biologie rostlin
BAKALÁŘSKÁ PRÁCE
Brno 2008
Kamila BEDŘICHOVÁ
0
Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav biologie rostlin
MOLEKULÁRNĚ GENETICKÁ PREDIKACE TOLERANCE JEČMENE VŮČI HOUBOVÝM PATOGENŮM
Bakalářská práce
Vedoucí práce:
Vypracovala:
Doc. Ing. Jan Bednář, CSc.
Kamila Bedřichová
Brno 2008
1
Zadání bakalářské práce
2
3
Prohlášení:
Prohlašuji, že jsem bakalářskou práci na téma Molekulárně genetická predikace tolerance ječmene vůči houbovým patogenům vypracovala samostatně a použila jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém seznamu literatury. Souhlasím, aby práce byla uložena v knihovně Mendelovy zemědělské a lesnické univerzity v Brně a zpřístupněna ke studijním účelům.
V Brně dne:
Podpis:
4
Poděkování:
Ráda bych poděkovala svému školiteli panu Doc. Ing. Janu Bednářovi, CSc. a Ing. Haně Nevimové za cenné rady, obětavou pomoc a podporu při vytváření této bakalářské práce.
5
Abstrakt: Předmětem bakalářské práce je molekulárně genetická predikce tolerance rodu Hordeum vůči houbovým patogenům, především k Rhynchosporium secalis. V úvodu práce je stručná charakteristika rodu Hordeum a dále i vybraných fytopatogenních rodů z komplexu listových skvrnitostí – Cochliobolus sativus, Pyrenophora teres a Rhynchosporium secalis. Je zde uvedena jejich stručná charakteristika jako je výskyt, ekologické nároky či biologický cyklus, pro přehlednější pochopení vztahů mezi hostitelskou rostlinou a patogenem. Dále je práce zaměřena na typy obrany proti fytopatogenním houbám, ať již agrotechnickými postupy, použitím fungicidů, biologickou ochranou nebo záměrnou geneticko - šlechtitelskou úpravou rostlin. Detekce tolerance byla prováděna pomocí DNA markerů. Jako molekulární markery byly použity sekvence mikrosatelitů – SSR. Byl teoreticky a prakticky zvládnut protokol detekce mikrosatelitů, včetně nezbytné optimalizace postupu, založeného na PCR reakci a elektroforetické separaci.
6
Annotation: The theme of bachelor work is molecular genetic prediction of genus Hordeum´s toleration against fungi´s pathogenes. Early this work is short characteristic of genus Hordeum and further part is characteristic of phytopatologi´s genuses from complex of leaf – spot, especially species Cochliobolus sativus, Pyrenophora teres and Rhynchosporium secalis. There are similar qualities such as habitation, ecological demands or biological cycle. It is for easier uderstanding of relation between host plant and phatogen. Next chapter is focused on type of defence against fungi´s pathogenes – for example by agricultural procedur, using of pecticides, biological protect or by purposeful genetic cultivated plant. Prediction was doing by means of DNA molecular markers. As molecular markers was using sequences of microsatelit – simple sequence repeat - SSR. Protocol of microsatelit´s predicaton was managed abstractedly and practically too, including important optimizing process, which princip is polymerase chain reaction – PCR and electrophoresis´s separation.
7
OBSAH
1. ÚVOD
9
2. CÍL PRÁCE
10
3. LITERÁRNÍ PŘEHLED
11
3. 1 Základní charakteristiky rodu Hordeum
11
3. 1. 1 Historie ječmene
11
3. 1. 2 Taxonomie ječmene
11
3. 1. 3 Přehled užitkových směrů ječmene
13
3. 1. 4 Požadavky ječmene na prostředí
14
3. 2 Fytopatogenní houby komplexu listových skvrnitostí
16
3. 2. 1 Taxonomie fytopatogenních hub
16
3. 2. 2 Komplex listových skvrnitostí
17
3. 3 Typy obrany proti fytopatogenním houbám
20
3. 3. 1 Agrotechnický způsob ochrany
20
3. 3. 2 Chemická ochrana
21
3. 3. 3 Biologická ochrana
22
3. 3. 3. 1 Geneticko – šlechtitelská ochrana
3. 4 Molekulární markery
24 25
3. 4. 1 Typy DNA markerů
25
4. PRAKTICKÁ ČÁST
28
4. 1 Metodika predikce tolerance
28
4. 1. 1 Izolace DNA z rostlinného materiálu
28
4. 1. 2 Kontrola čistoty a koncentrace izolované DNA
29
4. 1. 3 SSR amplifikace
29
4. 1. 4 Elektroforetická separace amplifikačních produktů
30
4. 1. 5 Vizualizace, vyhodnocení a dokumentace
31
5. ZÁVĚR
32
6. SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY
33
7. PŘÍLOHY
38
8
1. ÚVOD Ječmen je jedna z nejstarších obilovin na zemi, což potvrzují i hojné historické prameny. Člověk jej pěstuje po mnoho tisíc let, od doby, kdy se stal sběračem a posléze uvědomělým zemědělcem. V dřívějších dobách se ječmen používal k přípravě běžných pokrmů – chleba, vdolků či kaše. V dnešní době má v Česku nezastupitelnou úlohu ve sladovnickém průmyslu, což dokládají osevní plochy ječmene jarního, které tvoří 25% z celkové plochy obilovin pěstovaných v roce 2005. Ačkoliv ozimý ječmen nepatří k nejrozšířenějším obilovinám u nás, má i on bohaté využití. Největší podíl produkce slouží ke krmným účelům, poslední dobou však roste jeho obliba k přípravě potravin a vhodný se jeví i k průmyslovému zpracování. V posledních desetiletích vzrostla spotřeba potravin (obilovin) v hospodářsky vyspělých státech v důsledku zvyšující se životní úrovně a v rozvojových zemích díky neustálé populační explozi. To má za následek vyšší tlak na kvalitu i kvantitu potravinářských výrobků a s tím související zemědělskou produkci. Přitom příčin snižování výnosů a kvality zrna je celá řada - nevhodné abiotické faktory (klimatické podmínky), nesprávný agrotechnický postup nebo nežádoucí vliv biotických činitelů (choroby a škůdci). Mezi nejvážnější choroby ječmene v České republice patří houbová onemocnění z komplexu listových skvrnitostí. Postihují převážně listovou část rostliny, ale způsobují škody i na kořenech a obilkách. Šlechtitelé proti těmto chorobám bojují šlechtěním tolerantních nebo úplně rezistentních odrůd. K zefektivnění šlechtitelské práce může významnou měrou přispět detekce donorů rezistence a detekce zabudování jejich genomu v hybridních potomstvech technikami molekulárně genetických markerů, principielně využívajících polymorfizmu DNA.
9
2. CÍL PRÁCE Cílem předložené bakalářské práce je zpracování literární rešerše k problematice molekulárně genetické predikce tolerance ječmene vůči houbovým patogenům se zřetelem na Rhynchosporium secalis. Dále zvládnutí teoreticky a prakticky vybrané metodiky detekce polymorfismu mikrosatelitů u experimentálního objektu Hordeum vulgare. Dosažení tohoto cíle předpokládá zvládnutí jednotlivých dílčích kroků: 1. Teoretické a praktické zvládnutí metodiky izolace DNA z rostlinného materiálu 2. Teoretické a praktické zvládnutí kontroly čistoty a koncentrace izolované DNA 3. Teoretická a praktické zvládnutí protokolu PCR 4. Teoretické a praktické zvládnutí elektroforetické separace amplifikačních produktů 5. Teoretické a praktické zvládnutí vizualizace a dokumentace elektroforeogramů
10
3. LITERÁRNÍ PŘEHLED
3. 1 Základní charakteristiky rodu Hordeum
3. 1. 1 Historie ječmene
Pěstování ječmene sahá do počátku uvědomělého zemědělství. Historické studie prokazují jeho pěstování již od 5. stol. př. n. l., avšak z literárních zdrojů vyplývají mnohem starší zmínky- např. z Iráku ze 7. stol. př. n. l. a z Egypta z 8. stol. př. n. l. (Zimolka et al., 2006). Za oblast původu je považována Asie - konkrétně oblast tzv. úrodného půlměsíce (východoasijská oblast, Přední Asie a Palestina). Odtud se šířil jednak přes Anatolii, Řecko, Balkán nebo od Černého moře přes Karpaty k Baltskému moři do Evropy (Špaldon, 1982). V našich zemích je prokázáno pěstování ječmene v době asi 500 let př. n. l. Na území v ČR jsou naleziště např. v Bylanech u Kutné hory, u Jevišovic na západní Moravě či v Býčí skále severně od Brna. Dodnes je však sporné, zda se dříve pěstoval ječmen dvouřadý či víceřadý (Zimolka et al., 2006).
3. 1. 2 Taxonomie ječmene (www – 2)
Zařazení ječmene do systému:
Říše:
Rostliny (Plantae)
Podříše:
Cévnaté rostliny (Tracheobionta)
Oddělení:
Krytosemenné (Magnoliophyta)
Třída:
Jednoděložné (Liliopsida)
Řád:
Lipnicotvaré (Poales)
Čeleď:
Lipnicovité (Poaceae)
Podčeleď:
Vlastní lipnicovité (Pooideae)
Rod:
Ječmen (Hordeum)
11
K rodu Hordeum patří asi 30 druhů ječmenů, z čehož asi 16 divokých, které se vyskytují v Evropě, Asii, v Severní a Jižní Americe (Hraška, 1989). Za předchůdce dnešních ječmenů se převážně považuje víceřadý Hordeum agriocrithon Äberg. Dal pravděpodobně vzniknout ječmenům dvouřadým. Všechny kulturní odrůdy ječmene patří do jediného diploidního druhu Hordeum vulgare L., ječmen setý (n=14), který se dále dělí na convariety vulgare (víceřadý), intermedium (přechodný) a distichon (dvouřadý). Convarieta vulgare se dále dělí na dva typy šestiřadý (hexastichon) a čtyřřadý (tetrastichon) (obr. 1). Také ječmen dvouřadý se vyskytuje v několika varietách. Nejdůležitější z nich je nutans (nící, háčkující), kam patří většina sladovnických odrůd. Další variety jsou erectum (vzpřímený), zeocrithon (paví), nudum (nahý) či labile (různotvarý) (Zimolka et al., 2006).
Obr. 1 Schematické uspořádání klásků convariety vulgare a distichon (převzato z www – 1).
12
3. 1. 3 Přehled užitkových směrů ječmene
V současné době lze ječmen rozdělit dle užitkovosti na sladovnický, krmný, průmyslový, potravinářský a pícninářský.
1. Sladovnický Jakost sladovnického ječmene se posuzuje dle ČSN 46 1100 - 5 „Ječmen sladovnický“. Za sladovnický ječmen se považují domácí odrůdy zapsané ve Státní odrůdové knize nebo odrůdy dovezené, které však svojí kvalitou odpovídají odrůdám domácím. Kvalita sladovnického ječmene je posuzována jak subjektivně tak objektivně. Mezi subjektivní hodnocení patří barva zrna, biologické poškození, lesk a vůně či porostlost ječmene. Objektivními metodami zjišťujeme např. podíl předního zrna, objemovou hmotnost, vlhkost nebo obsah škrobu v sušině. Znaky jsou hodnoceny stupnicí 1 - 9 (výpočet hodnoty sladovnické jakosti podle vzorce, srovnání podle kontrolních odrůd). Pokud je odrůda ohodnocena alespoň 4 body, je zařazena mezi odrůdy sladovnické (www - 1). Sladovnická jakost zrna je ze 2/3 ovlivněna vnějšími podmínkami jako jsou půda, počasí, agrotechnika a z 1/3 geneticky, to znamená odrůdou (Zimolka, Ehrenbergerová, 1997).
2. Krmný Do této skupiny řadíme ječmeny víceřadé i dvouřadé, formy ozimé i jarní, pluchaté i bezpluché. V zrnu je vyžadován vysoký obsah bílkovin, esenciálních aminokyselin a škrobu. Požadavky uvádí norma ČSN 46 1200 - 3 (Zimolka et al., 2006).
3. Průmyslový K průmyslovým účelům se využívá především jarní ječmen a to hlavně k produkci ethanolu. Dále na výrobu whisky, ve škrobárenském průmyslu, k výrobě detergentů, kosmetických či farmaceutických přípravků. Preferuje se bezpluchá forma, která má vyšší energetickou hodnotu a extrakční schopnost (Hellebrandová, 2006).
13
4. Potravinářský Nejen jako funkční potravina, ale také jako prevence proti kardiovaskulárním chorobám můžeme použít potravinářský ječmen. Žádoucí jsou odrůdy s vysokým obsahem β – glukanů a vyšším obsahem dietní vlákniny (Zimolka et al., 2006). Ječmen se využívá k výrobě pečiva, krup, krupek, vloček, müsli výrobků a pro přípravu kulinářských specialit.
5. Pícninářský Ječmen má využití také jako podsev především u víceletých pícnin (vojtěška, jetel). Vhodné jsou ranější odrůdy, které méně odnožují a jsou odolné vůči polehání. Při moderním způsobu sklizně (pomocí GPS) a v období voskové zralosti, kdy má ječmen nejvyšší energii ze všech obilnin jej můžeme použít také na senáž, sušení a granulování (Zimolka, Ehrenbergerová, 1997).
3. 1. 4 Požadavky ječmene na prostředí
Ozimý ječmen
Většina odrůd ozimého ječmene není náročná na předplodinu a nevadí jí ani pěstování po obilovině (pšenici). Z důvodu přenosu chorob mezi jarními a ozimými ječmeny (choroby pat stébel, skvrnitosti) by se ječmeny neměly sít alespoň 2 roky po sobě. Nejvyšších výnosů i nejvyšší kvality sklizně lze u ozimého ječmene dosáhnout po luskovinách. Ozimý ječmen se vyrovná i se zhoršenými půdně - klimatickými podmínkami, s nižší hladinou živin, některé odrůdy tolerují i ne zcela přesné dodržení agrotechnických termínů a zásahů. Ozimý ječmen je však citlivý na nedostatek půdního vzduchu (utužené souvratě, zamokřená místa), nesnáší předčasné výsevy (před 10.9.) a při normálním
průběhu
zimy
ani
příliš
pozdní
výsevy
(po
5.
10.)
(www - 4).
Jarní ječmen
Pěstování jarního ječmene je možné ve všech oblastech. Ovšem kvalitní sladovnický ječmen je možné vypěstovat pouze v oblastech nejvhodnějších, tj. 14
v Polabské nížině, nižších polohách Středočeské pahorkatiny a na střední Moravě, především na Hané (tab. 1). Nároky ječmene na teplotu a vláhu nejsou velké, ale má vysoké nároky na půdu. Nejvhodnějšími půdami jsou černozemě, hnědozemě, dále pak hlinité, jílovito-hlinité a písčito-hlinité půdy. Důležitá je půdní kyselost, která by v řepařské oblasti měla mít pH v rozmezí 6,2 - 7,2, v bramborářské oblasti 5,8 - 6,2. Nevhodné jsou zhutnělé půdy. Nejvhodnějšími předplodinami jsou okopaniny (cukrovka, brambory, kukuřice). Zaorávání chrástu cukrovky přináší pro ječmen určitá rizika, při pozdním rozkladu chrástu v půdě dochází k pozdnímu uvolňování dusíku a tím k nebezpečí poléhání. Posklizňové zbytky kukuřice mohou být nežádoucím zdrojem infekce houbami rodu Fusarium. Dalšími možnými předplodinami pro jarní ječmen jsou olejniny a luskoviny, je zde ale větší riziko poléhání ječmene. Jeteloviny nejsou vhodnými předplodinami pro jarní
ječmen. Při pěstování jarního ječmene pro sladovnické účely jsou nároky na
předplodinu přísnější (www – 3).
Tab. 1 Přehled hlavních vlastností vybraných sladovnických odrůd (převzato z www - 3, upraveno dle ÚKZUZ). Přehled hlavních odrůd
Akcent
Amulet
Atribut
Kukuřičnou
***
****
**
Řepařskou
****
****
****
Obilnářskou
***
****
***
Bramborářskou
***
****
****
Vegetační doba (dny)
117
109
106
Délka stébla (cm)
74
73
73
Odolnost proti poléhání (9-1)
6
6
6
Odolnost proti
Padlí travní
6
6,3
8,1
chorobám:
Rez ječná
7
6,1
5,6
(9-1)
Hnědá skvrnitost
2
7.8
6,8
Rynchosporiová skvrnitost
2
7.3
6,7
Hmotnost 1000 zrn (g)
45
47
46
oblast kukuřičná
78
92
81
oblast řepařská
85
95
87
oblast obilnářská
76
92
81
oblast bramborářská
86
94
88
Sladovnická jakost (9-1)
5
5
6
Vhodnost pro oblast:
Agronomická data:
Zrno:
Podíl zrna nad 2,5mm (%)
15
3. 2 Fytopatogenní houby komplexu listových skvrnitostí 3. 2. 1 Taxonomie fytopatogenních hub
Ve starším pojetí polyfyletická říše hub (Fungi) sdružovala heterotrofní organismy bez plastidů z různých taxonomických skupin, s odlišnou biologií, které byly vymezeny především ekologicky jako destruenti, reducenti nebo dekompozitoři. Na základě studia rDNA byl navržen systém pěti říší: Chromista, Protista, Fungi, Plantae a Animalia. První tři uvedené říše zahrnují původní říši hub.
Zařazení vybraných fytopatogenních hub komplexu listových skvrnitostí do systému:
Říše:
Houby (Fungi)
Oddělení:
Buněnkotvaré (Chytridiomycota) Pravé houby (Eumycota)
Pododdělení:
Houby spájivé (Zygomycotina) Houby stopkovýtrusé (Basidiomycotina)
Pomocné pod.:
Lišejníky (Lichenes) Houby vřeckaté (Ascomycotina)
Pomocné pod.:
Deuteromycotina
Třída:
Ascomycetes
Řád:
Pleosporales
Čeleď:
Pleosporaceae
Rod:
Cochliobolus
Druh:
Cochliobolus sativus
Rod:
Pyrenophora
Druh:
Pyrenophora teres
Rod:
Rhynchosporium
Druh:
Rhynchosporium secalis
16
Třída Ascomycetes
Tato třída zahrnuje houby s mikroskopickou nebo makroskopickou stélkou, které vytvářejí často plodnice. Stélka je přehrádkovaná a tvoří ji většinou jednoduchý centrální pór. Buněčná stěna obsahuje chitin a polyglukan. U této skupiny rozlišujeme dva typy rozmnožování – nepohlavní a pohlavní. Nepohlavní rozmnožování je typické tvorbou nepohyblivých jedno – nebo vícebuněčných konidií, které se vytváří na specializovaných hyfách (konidioforech). Při pohlavním rozmnožování splynou gamety (vznik v gametangiích) anebo celé gametangie (askogon, antheridium) (obr. 2). Zástupci této třídy jsou převážně saprofyté, případně parazité, několik zástupců je považováno za mykorhizní a asi třetina patří k tzv. lichenizovaným houbám. Třída se dělí zhruba do 38 řádů. Ze snahy uspořádat tyto řády do systematických skupin jsou používány dva způsoby dělení. První je podle typu plodnic a druhý dle ontogeneze plodnic (obr. 3). Avšak rozvíjející se poznání tato jednoduchá dělení komplikuje, proto se od nich postupně upouští (Řepka, Koblížek, 2007).
3. 2. 2 Komplex listových skvrnitostí
Cochliobolus sativus Skvrnitost ječmene může způsobovat houba Cochliobolus sativus (obr. 4). Její konidiové stádium se nazývá Bipolaris sorokiniana. Houba se vyskytuje ve všech světadílech, zejména v jižní a střední Evropě. V České republice napadá především jarní ječmen a pšenici, ale i ozimy, oves, žito, kukuřici a mnoho druhů trav (přes 100 druhů rostlin). Šíření choroby podporuje teplejší a vlhčí klima (Čača et al., 1981). Houba napadá všechny části rostliny po celé vegetační období. Napadení klíční rostliny se projevuje mezerovitým vzcházením, klíční rostliny padají (obr. 9). Protože jsou však optimální teploty pro infekci rostlin vysoké – až 24°C, jsou škody na klíčních rostlinách u nás méně významné. Dalším symptomem jsou hnědé skvrny na pochvách listů, stéblech, kolénkách popřípadě i klasech (Čača et al., 1990). Spodní kolénka a dolní části stébla později trouchniví. Při silném napadení postihuje rostlinu suchá, černohnědá hniloba kořenů (obr. 10). Rostliny lze pak lehce vytáhnout z půdy (Häni et al., 1993).
17
Na napadených rostlinách se vytváří jednotlivé konidiofory (obr. 7) s tmavohnědými vřetenovitými vícebuněčnými konidiemi (obr. 8). Houba se přenáší především infikovaným osivem a přežívá na zbytcích napadených rostlin. Při klíčení obilky prorůstá houba do kořenů a koleoptile a poté se horizontálně i vertikálně rozrůstá do všech pletiv hostitele (Čača et al., 1981). Z hlediska preventivní ochrany je třeba respektovat povinné agrotechnické zásahy - střídání plodin, úklid slámy a důkladné zaorávání strniště. Důležité je také používat osivo jen ze zdravých a nenapadených porostů (Čača et al., 1990).
Pyrenophora teres
Hnědou skvrnitost listů způsobuje houba Pyrenophora teres (obr. 5), jejíž konidiové stádium je Dreschlera teres (obr. 12). Patogen se u nás dříve vyskytoval hlavně v mírných oblastech s vlhčími a chladnějšími podmínkami. Nyní se vyskytuje i v typických obilnářských oblastech a silně postihuje krátkostébelné odrůdy jarního ječmene (Čača et al., 1990). Houba vyvolává na listech rostlin dva typy symptomů. Při typické formě se v horních částech listových čepelí tvoří síťkovité, vřetenovitě vejčité skvrnky, které mají zelenohnědý okraj. Skvrny na okraji vystřelují paprskovitě mechovitě a později postupně splývají do podélných pruhů. Pigment je ve skvrnách soustředěn do úzkých podélně nebo příčně orientovaných čárek. Celý list později žloutne a od vrcholu zavadá (obr. 11). Nespecifická forma tvoří zřetelné hnědé, elipsovité skvrny bez síťování (Baudyš, 1949). Houba přežívá na rostlinných zbytcích a také je přenosná osivem, kde se infekce projevuje již na koleoptile jako světle hnědé proužky. Během vegetace se šíří pomocí spór (perithecium s askosporami). Napadá ozimý a jarní ječmen (Häni et al., 1993). Ochrana spočívá v používání zdravého mořeného osiva, dodržování osevního postupu a likvidace posklizňových zbytků a výdrolu ječmene. Fungicidní postřik aplikujeme během sloupkování. Vybrat si můžeme například Acanto, Alert beta, Capitan 25 EW, Fandango 200 EC, Harvesan, Lyric, Mirage 45 ECNA, Proline 250 EC, Sfera 267, 5 EC, Stereo 312 nebo Swing top (www – 12).
18
Rhynchosporium secalis
Tato houba způsobuje nemoc známou jako listová skvrnitost (obr. 6). Je to běžná nemoc ječmene, žita a některých trav, speciálně v chladných a vlhkých oblastech. Je rozšířená v Evropě, Severní Americe a Austrálii (www – 11). V České republice dělá problémy především v podhorských oblastech – podhůří Šumavy či Jeseníků. Během sloupkování se na listech vytvářejí vejčité nepravidelné skvrny, které mohou být velké až dva centimetry. Barva skvrn se mění. Ze začátku jsou modrozelené, později světle zelené a nakonec slámově žluté s hnědými koncentrickými pruhy. Jejich okraje jsou lemovány hnědým až černým okrajem (www – 10). V pokročilém stádiu choroby se pletivo uvnitř skvrny začne trhat a vypadávat a napadené listy předčasně odumírají. Mycelium pod pokožkou vytváří kompaktní pletivo (stroma). Na ně nasedají většinou dvoubuněčné válcovité konidie. Jejich horní buňka je protažena v zoban. Využitím moderní obrazové technologie detekující živé buňky můžeme pozorovat průběh infekce na buněčné úrovni. Použitím fluorescenční sondy obarvíme živou buňku a houbu zeleně, zatímco buněčnou stěnu, mrtvé jádro nebo umírající buňku zbarvíme barvou magenta. Poté přeneseme klíčící spory na kultivar ječmene náchylného k nákaze a pozorujeme penetraci kutikuly a rychlý růst hyf (obr. 13). Po osmi dnech od inokulace můžeme vidět rozsáhlou síť hyf a epidermální buňky, z nichž některé již vykazují poškození (obr. 14). V konečném stadiu pozorujeme zhroucení buněk a také plochu mrtvých hyf (obr. 15) ( www – 16). Za optimálních podmínek se napadení může projevit již na podzim. Houba přezimuje na rostlinných zbytcích a na jaře napadá nejdříve ozimé formy, poté přechází na jařiny. Za vegetace se spory šíří větrem a deštěm. Houbám může usnadnit napadení poškození listů savým hmyzem (Häni et al., 1993). Ochrana závisí na vhodně zvoleném osevním postupu, na zničení posklizňových zbytků hlubokou orbou a samozřejmě na výběru vhodné odrůdy pro dané stanoviště. Také střídání plodin slouží jako prevence. Především pšenice a oves, které jsou vůči skvrnitosti odolné. K účinné chemické ochraně patří fungicidní přípravky s obsahem hydroxidu měďnatého (Champion 50 WP), oxidchloridu mědi (Kuprikol 50), metiramu (Polyram WG) a mancozebu (Novozir MN 80 New) (www – 15).
19
3. 3 Typy obrany proti fytopatogenním houbám Ochrana ječmene před onemocněním fytopatogenními houbami je jakýkoliv zásah, který ovlivňuje podmínky prostředí tak, aby nedošlo k projevu a rozvoji choroby. Dle principu působení rozdělujeme zásahy do tří skupin. Snížení populace nebo likvidace patogena v prostředí, zabránění proniknutí patogena do rostliny a likvidace patogena (Prokinová, 1996). Toho můžeme dosáhnout několika způsoby.
3. 3. 1 Agrotechnický způsob ochrany
Je jednou z nejdůležitějších součástí integrované ochrany. Vytváří totiž vhodné podmínky pro růst a vývin rostlin ječmene a tím i pro jejich dobrý zdravotní stav. Mezi agrotechnické způsoby ochrany zařazujeme všechna pěstitelská opatření jako je zpracování půdy, hnojení, setí, osevní postup, kultivační práce, sběr i uskladnění produktů. Prvním a důležitým počinem je výběr vhodné lokality pro pěstování vybraného druhu. Musíme sjednotit biologicko -
ekologické nároky rostlin se stanovištními
podmínkami, to znamená docílit ekologické optimum. Protože vysoká rozdílnost požadavků rostlin a podmínek prostředí je živnou půdou pro snazší napadení rostlin patogenem (Kostelanský et al., 1997). Po výběru lokality přichází na řadu zpracování půdy. Orba, především hluboká, zapracovává zbytky rostlin (i napadených) hluboko do půdy a tak se ničí zdroj infekce. Také hnojení přispívá ke zdraví rostlin. Pokud mají vyvážený poměr základních živin i mikroprvků, nehrozí jim oslabení fyziologickými poruchami a tím i možnost nákazy patogenem. Před setbou osivo čistíme a třídíme a oddělujeme napadené zrno. Správným termínem setby zase předcházíme hromadnému výskytu chorob v citlivé vývojové fázi rostliny. Důležitá je i hloubka setby – tu upravuje norma ČSN 465451, která je závazná pro všechny pěstitele. Příznivý vliv má i setba do sponu, kde rostliny nevytváří husté porosty a patogen se tak hůř šíří. Osevní postup má rozhodující význam nejenom pro ochranu ječmene, ale také pro zvýšení výnosů. Řazení a střídání skupin i jednotlivých plodin je žádoucí. Obilné sledy by se měly přerušovat na jeden až tři roky se zařazením zlepšujících plodin. Tyto
20
takzvané přerušovače mají totiž významný fytosanitární účinek a víceletá absence hostitelské rostliny snižuje výskyt patogena v půdě. Střídáním pěstovaných druhů předcházíme půdní únavě, která se projevuje po dlouhodobém pěstování obilnin, ale také lnu, cukrovky či košťálové zeleniny (Kostelanecký et al., 1997). Sběr je jedním z posledních agrotechnických úkonů. Věnuje se pozornost včasnému sběru i výšce zanechaného strniště.
3. 3. 2 Chemická ochrana
Významnou složkou ochrany ječmene proti fytopatogenním houbám je používání pesticidů, přesněji fungicidů. Z hlediska působení a účinku je dělíme na fungistatické (brzdí klíčení spor, omezují růst mycelia) a fungicidní (usmrcují houby v jakémkoliv vývojovém stádiu). Fungicidy můžeme použít k prevenci (profylakčně) – k moření osiva, sadby nebo k půdní desinfekci či k léčbě (kurativní účinek), kdy ničí hyfy rozrostlé na povrchu nebo uvnitř hostitelské rostliny. Podle místa působení používáme kontaktní fungicidy (povrch listů), lokálně systémové (pronikají do povrchových pletiv) nebo systémové (hubí patogena i v nových přírůstcích). Vliv na účinnost fungicidů má i počasí. Azoly dobře působí za teplého počasí, morfoliny za chladnějšího a vlhčího, tudíž jsou efektivnější v boji proti houbám z komplexu listových skvrnitostí – především hnědé a Rhynchosporiové skvrnitosti. Z hlediska účinné substance je dělíme na anorganické (rtuťnaté, měďnaté, sirné) a organické (deriváty dithiokarbamidových kyselin, chlorované aromatické
sloučeniny,
dikarboximidy,
amidické
sloučeniny
a
organociničité
sloučeniny). Zvláštní skupinu tvoří systémové fungicidy. Zahrnují početnou skupinu různých účinných látek a využívají se jak k profylakčním, tak kurativním účelům. Nejčastěji jejich chemickou podstatu tvoří deriváty benzimidazolu, ethirimol a dimethirimol, carboxin a oxycarboxin a tridemorph (Čača et al, 1981). Orientaci mezi používanými chemickými látkami znesnadňuje skutečnost, že je jich na trhu velké množství. Větší část přípravků pochází ze zahraničí - na 16 tuzemských výrobců připadá 79 zahraničních. K rozšiřování sortimentu dochází z několika důvodů. Šíří se nové introdukované organismy, je snaha o předcházení rezistence proti dlouhodobě používaným pesticidům nebo přizpůsobení novým pěstebním technologiím a agrotechnice. Také zavádění nových odrůd s různou odolností
21
proti chorobám a rozdílnou citlivostí na pesticidy (především herbicidy) přispívá k tvorbě dalších ochranných prostředků. Mnohé z nich nahradili starší typy, které byly v dnešní době z toxického hlediska nepřijatelné. Nezanedbatelným faktorem vývoje stále nových produktů jsou i rozdílné cenové relace, které se promítají v nákladech na hektar (Vacek, 1989). V České republice se užití přípravků řídí dle „Seznamu registrovaných přípravků na ochranu rostlin“ (obr. 16), který vydává Státní rostlinolékařská správa (dále SRS). Obsahuje výčet všech přípravků k hubení škůdců, chorob rostlin a plevelů, které je možno u nás používat. Povolení přípravek získá po přezkoušení SRS, Národním referenčním centrem pro pesticidy, Centra zdraví a životních podmínek Státního zdravotního ústavu v Praze a na základě závazného posudku Ministerstva zdravotnictví ČR. Seznam nabývá účinnost dnem vydání, oznámeném ve Sbírce zákonů ČR (Kolektiv SRS, 2000).
3. 3. 3 Biologická ochrana
V dnešní době se prohlubuje problém ochrany životního prostředí a s tím související snížení používání chemických látek. Zemědělství je jedním z hlavních zdrojů chemikálií, proto se stále častěji přechází na nechemické metody. Jednou z nich je biologická ochrana. Základem biologické ochrany je využití přirozených vztahů mezi organismy a prostředím. Tyto vztahy můžeme rozdělit do tří skupin na indiferentní, synergistické a antagonistické. V indiferentním vztahu organismy žijí vedle sebe, bezprostředně se neovlivňují a nekonkurují si v nárocích na prostor a živiny. Synergistické soužití je pro organismy vzájemně výhodné. Zato antagonistický vztah je zcela nepřátelský – organismy se bezprostředně negativně ovlivňují. V biologické ochraně mluvíme o antagonistech jako organismech, které mají schopnost zasahovat do životních procesů fytopatogenů (Prokinová, 1996). Nejvíce využívanou metodou biologické ochrany je introdukce antagonisty do prostředí. Ten by měl být z prostředí, do kterého bude opětovně vnášen. Nenaruší se tím totiž křehké přirozené vztahy systému a zaručuje se tím lepší schopnost přežití antagonisty v daném „domácím“ prostředí. Antagonistické projevy mikroorganismů mají tři příčiny. Kompetici o živiny a prostor, antibiózu, při které dochází k destrukci jednoho organismu působením produktů metabolismu jiného organismu a za třetí 22
hyperparazitismus (Prokinová, 1996). Houby, které jsou parazity fytopatogenních hub, jsou nazývány mykoparazitické. Praktickým využitím antagonistických mikroorganismů v ochraně obilovin je půdní houba Trichoderma lignorum. Pokud zapravíme její inokulum do půdy, omezuje napadení pat stébel obilnin houbami Cochliobolus sativus, Alternaria tenuis nebo Fusarium sp. Podmínkou úspěchu je dostatek organických látek v půdě, dostatečná teplota a vlhkost, aby se houba mohla normálně množit (Čača et al., 1981). Další metodou je indukce rezistence rostliny. Každá rostlina má schopnost více či méně odolávat napadení. Toho se využívá i ve šlechtění kulturních rostlin. Rezistence však není universální. Pojem indukovaná rezistence znamená zvýšení celkové imunity rostliny. Zvýšení odolnosti lze vyvolat jak abiotickými tak biotickými faktory (Reuveni et al., 1996). Biologická ochrana využívá hlavně biotické faktory, jako jsou mikroorganismy a jejich metabolity. Indukce rezistence má často stimulační vliv na rostliny. Tento jev byl popsán především u tak zvaných Plant – growth – promoting bacteria (PGPB). Po jejich aplikaci na rostliny došlo ke zvýšení výnosů. Jedná se především o bakterie rodu Pseudomonas (Veselý, 1991). Také oslabení patogena je jednou z variant ochrany. Obecně to znamená změnit podmínky prostředí tak, aby se stalo pro patogena nevhodným. V biologické ochraně máme na mysli oslabit patogenní aktivitu patogena. K tomu využíváme nepatogenní (avirulentní) nebo slabě patogenní (hypovirulentní) kmeny fytopatogenních hub. Tyto kmeny nemají (nebo mají velmi malou) schopnost vyvolat onemocnění u rostliny, ačkoliv jsou splněny všechny podmínky vzniku infekce. Vznik nepatogenních kmenů není jednoznačně vysvětlen. Je však známo, že obsahují virům podobné částice, kterým pravděpodobně vděčí za svoji „sterilitu“. Aplikace takovýchto kmenů může zajistit potlačení populace kmenů patogenních (Cook, Baker, 1989). Supresivita jako pojem pochází z anglického „suppressive soils“ a označuje půdu, ve které je výrazně potlačena možnost napadení rostliny patogenem. Tento jev nebyl zatím dostatečně vysvětlen. Jedna z teorií považuje za základ vztahy mezi mikroorganismy a vlastnostmi půdy. Významnou úlohu zde hrají pseudomonády, které mají schopnost tvořit siderofory – extracelulární metabolity bakterií s vysokou afinitou k trojmocnému železu. Bakterie tak mají zajištěn dostatek železa, ale zároveň se ho již nedostává pro jiné mikroorganismy, které ho potřebují pro svůj život a tím se elminuje populace patogenních mikromycetů a dochází k „ozdravění“ půdy (Veselý, 1991).
23
Ačkoliv je nabídka biologické ochrany velice pestrá, v ochraně obilovin proti fytopatogenním houbám dosud nenašla větší uplatnění.
3. 3. 3. 1 Geneticko – šlechtitelská ochrana
Samostatnou skupinou biologické ochrany je šlechtění obilovin na rezistenci. Využití rezistentních rostlin snižuje množství chemických látek v prostředí a přispívá tak k ekologické stabilitě. Zároveň umožňuje pěstovat ječmen i v oblastech ohrožených patogeny a snižovat ztráty na výnosech v letech jejich přemnožení. Odolnost rostlin se projevuje v různém stupni. Imunita je absolutní odolnost rostliny, kdy při setkání hostitele s patogenem nevzniká žádný biologický vztah. Tato schopnost je výsledkem dědičných vlastností druhu nebo kultivaru a při zachování výnosu a kvality má velkou šlechtitelskou hodnotu. Odolnost neboli rezistence je soubor dědičných vlastností, které brzdí vývoj a rozmnožování patogena. Genetická analýza vztahu hostitel – patogen ukázala v řadě případů, že každému genu, který řídí rezistenci, odpovídá specifický gen pro virulenci. Kolik genů rezistence má hostitel, tolik genů virulence, specificky odpovídajících genům rezistence, má patogen, aby mohl hostitele napadnout. Tuto hypotézu gen proti genu formuloval již v roce 1956 fytopatolog H. H. Flor (Bednář, Vyhnánek, 2004). Rezistenci můžeme rozdělit do několika kategorií. Na vertikální (specifická, diferencující rezistence), horizontální (rasově nespecifická, všeobecná, stálá rezistence) a na pseudorezistenci (nepravá, zdánlivá rezistence). Vertikální rezistence je rasově specifická pouze vůči některým rasám patogena. Odolnost je řízena jedním genem, tzv. major geny (geny velkého účinku). Geny rezistence mohou působit buď samostatně nebo se projevují různé genové interakce. Například u ječmene odolného proti hnědé skvrnitosti (Pyrenophora teres) bylo prokázáno epistatické spolupůsobení genů a geny částečné rezistence proti tomuto patogenu vykazují komplementární spolupůsobení. U ječmene jsou geny podílející se na rezistenci k houbovým patogenům rozptýleny na všech chromozomech. Horizontální rezistence je účinná proti všem nebo většině fyziologickým rasám patogena. Zpravidla je založena polygenně, tzv. minor geny (geny malého účinku). Projevuje se u ní silná interakce genotypu s prostředím.
24
Pseudorezistence
je způsobena tím, že vývoj rostliny a patogena nejsou
synchronizovány. Pseudorezistence není genenticky determinována (Bednář, Vyhnánek, 2004). Osobitá forma odolnosti je tolerance. Je to schopnost rostlin určitým způsobem kompenzovat činnost patogenů. Opakem odolnosti je náchylnost neboli susceptibilita, která je definována jako neschopnost rostlin překonat působení patogena.
3. 4 Molekulární markery Molekulární markery jsou molekuly, které identifikují přítomnost určitého genu a jím podmíněného znaku ve studovaném genotypu. Dříve se jako markery používaly morfologické znaky (barva) nebo charakteristika výnosu. Tyto znaky mají ovšem ve fenotypu jen několik málo variant a nemohou odhalit dostatek genetické variability. Dnes se nejčastěji používají proteinové a DNA markery, které poprvé použili S. Lander a D. Botstein v roce 1989 (Vejl, 2002).
3. 4. 1 Typy DNA markerů
DNA markery jsou založeny na polymorfismu, což je variabilita v sekvencích DNA. Marker je úsek DNA, který je ve vazbě s určitým genem a pokud jsme schopni identifikovat daný úsek, potvrdíme zároveň i přítomnost sledované vlastnosti. Marker musí být lokalizován na stejném chromozomu a v takové blízkosti genu, aby se spolu s ním přenášel do následující generace. Jako markery lze použít jen ty sekvence, které splňují následující požadavky – vysoký polymorfismus, kodominantní charakter dědičnosti, častý výskyt v genomu, nezávislost na podmínkách prostředí, vysoká reprodukovatelnost a snadné a rychlé testování. Princip DNA markerů spočívá ve specifickém restrikčním štěpení analyzované DNA a následné hybridizaci se značenou sondou, dále na amplifikaci specifických fragmentů v in vitro podmínkách nebo na různých kombinacích restrikčního štěpení (Kuciel et al.., 2004). Dle cíle studia volíme nejvhodnější typ markerů. Z hlediska použité metody se DNA markery dělí na markery založené na hybridizaci DNA a na markery založené na
25
polymerázové řetězové reakci – PCR (Polymerase Chain Reaction). V první skupině markerů se DNA profily vizualizují prostřednictvím hybridizace fragmentů DNA štěpené restrikčním enzymem se značenou sondou. V druhé skupině jsou markery založené na in vitro amplifikaci určitých sekvencí DNA nebo lokusů prostřednictvím specifických
i
nespecifických
primerů
(nukleotidových
sekvencí)
za
účasti
termostabilního enzymu DNA polymerázy. Amplifikované fragmenty se separují elektroforeticky a spektra jsou detekována po obarvení nebo autoradiograficky (Bednář, Vyhnánek, 2004).
Jednokopiové a vícekopiové sondy
RFLP (Restriction fragment length polymorphism) markery jsou založeny na změnách v sekvencích DNA, ke kterým docházelo během evoluce. Analýza RFLP využívá štěpení restrikčními enzymy, elektroforetické rozdělení získaných fragmentů a vizualizaci hybridizací se speciální sondou. Jde o kodominantní markery, které umožňují určit, zda je vázaný znak přítomen u určitého jedince v homozygotním nebo heterozygotním stavu. SSCP (Single strand conformation polymorphism) je vhodná metoda pro analýzu genů zvláště při detekci bodových mutací a zjišťování DNA polymorfizmu (Řepková, Relichová, 2001).
Mnohokopiové sondy
RAPD (Random amplifified polymorphic DNA), AP – PCR (Arbitraity primed PCR) a DAF (DNA amplification fingerprinting) využívají jednoho nebo více syntetických oligonukleotidů rozdílné délky jako hraniční sekvence pro specifická i nespecifická místa v genomu. Většinou jde o dominantní markery, které neodlišují heterozygoty od dominantních homozygotů. SSR (Simple sequence repeats) využívá polymorfizmu sekvencí mikrosatelitů. To jsou sekvence DNA složené z mnohokrát se opakujících motivů jednoho až šesti nukleotidů a jsou součástí nekódujících sekvencí genomu. SSR jsou kodominantní markery, takže umožňují rozlišení homozygotů a heterozygotů po elektroforéze. Obvyklá délka fragmentu je 100 – 250 bp (Bednář, Vyhnánek, 2004).
26
VNTR (Variable number tandem repeats) kombinuje sondy, které jsou hybridizovány s membránami obsahujícími DNA, která byla štěpena restrikčními enzymy. Polymorfizmus je způsoben rozdíly v počtu opakování. DGGE (Denaturing gradient gel – electrophoresis) umožňuje rozlišit dva fragmenty podobné nebo stejné délky. Metoda je vhodná pro autogamní druhy a teké při fylogenetické analýze a identifikaci odrůd. SCAR (Sequence characterised amplified regions) využívá polymorfního RAPD markeru, který je klonován a sekvencován. AFLP (Amplified fragment length polymorphism) kombinuje postupy jak RFLP tak PCR. Je založena na detekci fragmentů DNA získaných štěpením restrikčními endonukleázami prostřednictvím PCR amplifikace. Spektrum fragmentů je možné získat bez předcházející znalosti sekvence. Metoda je vhodná především k detekci polymorfizmu u blízce příbuzných genotypů. CAPS (Cleaved amplified polymorphic sequences) jsou založeny na polymorfizmu pro restrikční štěpení endonukleázami (Řepková, Relichová, 2001)
Tab. 2 Přehled nejčastěji používaných DNA markerů a jejich charakteristika (Bednář,Vyhnánek, 2004). Typ dědičnosti
RFLP
RAPD
SSR
AFLP
Kodominantní
Většinou
Kodominantní
Dominantní
Vysoký
Velmi
kodominantní Polymorfizmus
Střední
Vysoký
vysoký Detekce alel
Ano
Ne
Ano
Ne
Počet detekovaných
1-3
1 - 10
1-5
20 - 100
Obtížnost
Střední
Malá
Malá
Střední
Reprodukovatelnost
Vysoká
Střední
Vysoká
Vysoká
Výchozí koncentrace
20 – 30 µg
1 – 100 ng
50 – 100 ng
100 ng
Genová DNA
Oligonukleotid
Specifická
Specifická
cDNA klon
oktamer
repetice
DNA
Časová náročnost
Náročné
Rychlé
Rychlé
Střední
Spolehlivost
Vysoká
Střední
Vysoká
Vysoká
lokusů
DNA Typ sondy
27
4. PRAKTICKÁ ČÁST Na základě dostupných literárních pramenů a praktických zkušeností Laboratoře molekulární genetiky Ústavu biologie rostlin AF MZLU v Brně, byla pro detekci tolerance vůči listovým houbovým patogenům – Rhynchosporium secalis zvolena metodika SSR markerů.
4. 1 Metodika predikce tolerance Metodika predikce tolerance ječmene vůči Rhynchosporium secalis na základě detekce polymorfismu mikrosatelitů má tyto kroky: 1. Izolace DNA z rostlinného materiálu 2. Kontrola čistoty a koncentrace izolované DNA 3. SSR amplifikace 4. Elektroforetická separace amplifikačních produktů 5. Vizualizace, vyhodnocení a dokumentace
4. 1. 1 Izolace DNA z rostlinného materiálu
Cílem izolace z rostlinného materiálu je získat dostatečné množství čisté genomové DNA z listů klíčních rostlin, které jsou staré 6 dní, pomocí izolačního kitu Qiagen DNeasy Plant Mini Kit od firmy Qiagen. Nukleové kyseliny je při izolaci nutné zbavit všech nežádoucích látek (sacharidy, proteiny, polyfenoly), které by mohly bránit v činnosti specifickým enzymům používaným v následné analýze. Během izolace byly použity dva druhy separačních kolon. Pomocí fialových kolon došlo k odstranění kontaminujících látek (rozrušených buněčných zbytků, proteinů a polysacharidů, které interferují s některou ze složek PCR reakce). V bílé koloně se zachytila izolovaná DNA, přičemž zbytkové kontaminanty byly odstraněny dvěma vymývacími kroky jedním z pufrů. Nakonec byla DNA z kolony vymyta dalším pufrem. Doba izolace byla přibližně 120 minut.
28
4. 1. 2 Kontrola čistoty a koncentrace izolované DNA
Kvalita a koncentrace izolované DNA je ověřena elektroforézou v 0,8% agarózovém gelu. K 1 µl vzorku DNA je přidáno 10 µl H2O a 3 µl loading pufru a směs je nanesena na gel. DNA je vizualizována ethidiumbromidem (0,3 µl/ 60ml gelu) a detekována pod UV lampou. Koncentrace DNA vzorku je odhadnuta srovnáním se standardem λ Hind III. Vzorky DNA jsou naředěny na pracovní koncentraci.
4. 1. 3 SSR amplifikace
Detekce polymorfizmu sekvencí mikrosatelitů SSR (Simple sequence repeats) je metoda založená na principu PCR (Polymerase Chain Reaction). Polymerázová řetězová reakce je metoda syntézy nukleových kyselin v podmínkách in vitro, při které jsou replikovány určité segmenty původní (templátové) DNA. Detekce polymorfizmu mikrosatelitních markerů u vybraných genotypů Hordeum vulgare byla provedena pomocí 70 primerových párů, které byly získány z databáze Grain Genes (Ramsay et al., 2000) a z literatury, kde jsou uvedeny také jejich sekvence a lokalizace. Vybrané oligonukleotidy byly syntetizovány firmou Metabion International AG (GE), purifikovány odsolením a dodávány v lyofilizované formě v množství
20 nmol. Polymerázová
řetězová reakce probíhala v T3
Thermocycleru combi (Biometra, GE) (obr. 17), kde byl nastaven tento teplotní a časový režim: 1. Počáteční denaturace 2 minuty při 93°C 30 cyklů: 1. Denaturace 1 minutu při 93°C 2. Annealing 2 minuty při 54°C 3. Elongace 2 minuty při 72°C
Seznam použitých primerů, složení a receptář přípravy reakční směsi je součástí dokumentace Laboratoře molekulární genetiky Ústavu biologie rostlin AF MZLU v Brně.
29
4. 1. 4 Elektroforetická separace amplifikačních produktů
Principem elektroforetické separace je pohyb nabitých molekul v elektrickém poli. Pohyblivost látek závisí na velikosti náboje, velkosti a tvaru molekul, podmínkách prostředí a síle elektrického pole. Velikost náboje molekul je ovlivňována stupněm ionizace, pH a iontovou silou prostředí. Nukleové kyseliny se díky záporně nabitým fosfátovým skupinám pohybují od záporně nabité elektrody (katody) ke kladně nabité (anodě). Kratší fragmenty migrují gelem rychleji vzhledem k menší třecí síle (Vyhnánek, Ježíšková, 2005). Na základě posouzení výsledků různých způsobů elektroforetické separace SSR markerů byla pro vlastní analýzy doporučena elektroforetická separace na polyakrylamidových gelech. K separaci SSR markerů na nedenaturačních polyakrylamidových gelech o velikosti 17 x 18 cm byla použita desková vertikální jednorozměrová elektroforéza Maxigel (Whatman – Biometra, GE) se systémem chlazení vodou a zdroje stabilizovaného stejnosměrného napětí EC 135 (E – C Apparatus Corporation, USA) a P1 Model (OMNI – BIO, CZE). Pro sestavení použijeme čisté elektroforetické desky, z nichž jedna je s drážkami. Na tu položíme silikonové těsnění a přiklopíme druhou skleněnou deskou. Sestavu po bocích sepneme 3 malými svorkami z každé strany a spodní část sestavy bude sepnutá 2 velkými svorkami. Poté si připravíme PAA (polyakrylamidový) gel. Množství je uvedeno pro jednu soupravu desek. Smísíme: 27,5 ml
destilované vody
2,5 ml
10x TBE
16,7 ml
zásobní roztok akrylamidu/bisakrylamidu
350 µl
10%roztok persíranu amonného (APS)
40 µl
TEMED
Směs necháme na míchačce velmi krátce promíchat (TEMED je iniciátorem polymerizační reakce) a ihned ji naléváme mezi skleněné desky. Pro vytvoření jamek vložíme do prostoru mezi skly hřeben. Polymerizace gelu trvá přibližně hodinu. Po ztuhnutí gelu opatrně vyjmeme hřeben a jamky v gelu vytvořené hřebenem naplníme pomocí stříkačky 10x TBE pufrem. Do krajní jamky aplikujeme velikostní marker a do ostatních jamek 12 µl vzorku. Poté sestavíme elektroforetickou aparaturu. Separace mikrosatelitních markerů probíhá nejprve při konstantním napětí 100 V po dobu 15 minut a poté při konstantním napětí 310 V. Doba průběhu elektroforézy 30
závisí na velikosti očekávaného produktu (bp). Nejčastěji se pohybuje kolem 6 – 7 hodin. Čím jsou produkty větší, tím se doba elektroforézy zvyšuje.
4. 1. 5 Vizualizace, vyhodnocení a dokumentace
Metoda barvení stříbrem je citlivá jednoduchá metoda pro vizualizaci a dlouhodobé uchování gelů s mikrosatelity (Merril et al., 1981). Po skončení elektroforézy se vloží špachtle mezi skla a opatrně se oddělí skla od sebe. Gel se opatrně ručně přenese do nádoby s fixačním roztokem a třepe se na třepačce po dobu 3 minut. Následně gel přeneseme do nové nádoby s roztokem 0,2% dusičnanu stříbrného AgNO3 a za mírného třepání inkubujeme po dobu asi 5 minut ve tmě z důvodu citlivosti dusičnanu stříbrného ke světlu. Následně gel 3x propláchneme destilovanou vodou, vložíme do nádoby s čerstvou vývojkou a za mírného třepání inkubujeme tak dlouho (10 – 15 minut), než se na gelu objeví produkty. Promytím v 10 % kyselině octové gely stabilizujeme. Gely přeneseme na PVC folii, filtračním papírem odsajeme přebytečnou tekutinu, zatavíme do potravinářské folie a uchováváme v ledničce při 4°C. Pro dlouhodobější uchování byly gely skenovány na skeneru Umax 1220S (UMAX, GE). Získané elektroforeogramy po proběhlé vertikální elektroforéze na polyakrylamidovém gelu vyhodnocujeme pomocí binární matice systémem jedniček a nul. Jednička představuje přítomnost produktu a nula znamená nepřítomnost. Tímto způsobem vytvořenou matici dále statisticky zpracováváme počítačovým programem FreeTree vere 9.1. s použitím konstrukční metody UPGMA a podobnostního koeficientu Jaccard. Z těchto údajů lze následně pomocí počítačového programu TreeWiew verze 1.6. sestavit dendrogram, který vyjadřuje genetickou příbuznost analyzovaného souboru genotypů ječmene setého (Hordeum vulgare).
31
5. ZÁVĚR Teoreticky a prakticky byla zvládnuta predikce odolnosti ječmene setého (Hordeum vulgare) vůči listovým skvrnitostem – speciálně Rhynchosporium secalis pomocí molekulárně genetických SSR markerů. Jako experimentální materiál byly použity genotypy ječmene setého z kolekce genetických zdrojů Zemědělského výzkumného ústavu Kroměříž, s. r. o. Optimalizace metody detekce polymorfizmu DNA a vlastní molekulárně genetické analýzy byly prováděny na Ústavu biologie rostlin Agronomické fakulty MZLU v Brně. V průběhu testování experimentálního materiálu bylo dosaženo splnění stanovených cílů bakalářské práce. Byla zvládnuta izolace DNA z rostlinného materiálu, detekce polymorfismu DNA metodikou PCR a využití DNA markerů při predikci tolerance vůči Rhynchosporium secalis. Vše bylo doplněno literární rešerší k dané problematice.
32
6. SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY BAUDYŠ, E. : Význačné choroby a škůdci polních plodin a obrana proti nim. Nakladatelství Rovnost v Brně, Brno, 1949, 271 s.
BEDNÁŘ, J., VYHNÁNEK, T. :Genetika rostlin. MZLU, Brno, 2004, 147 s.
COOK, R., BAKER, K. : The nature Practice of Biological Control of Plant Pathogens. APS Press, St. Paul, 1989, 539 p.
ČAČA, Z., DUŠEK, J., ŘÍMOVSKÝ, K., SVÍTIL, J. : Ochrana polních a zahradních plodin. SZN, Praha, 1990, 368 s.
ČAČA, Z., KOLLÁR, V., NOVÁK, J., ZVÁRA, J. : Zemědělská fytopatologie. SZN, Praha, 1981, 344 s.
HÄNI, F. et al. : Obrazový atlas chorob a škůdců polních plodin. Scientia, Praha, 1993, 336 s.
HELLEBRANDOVÁ, L. : Predikace odolnosti vůči fuzáriím DNA markery se zřetelem na kvalitu zrna ječmene. DP, MZLU, Brno, 2006, 64 s.
HRAŠKA, Š. : Špeciálna genetika plnohospodářských rostlin. Príroda, Bratislava, 1989, 211 s.
KOLEKTIV SRS : Seznam registrovaných přípravků na ochranu rostlin. SRS, Praha, 2000, 256 s.
KOSTELANSKÝ, F. et al. : Obecná produkce rostlinná. MZLU, Brno, 1997, 212 s.
KOTOVICOVÁ, J. et al. : Ochrana životního prostředí. MZLU, Brno, 2004, 78 s.
33
KUCIEL, J., BEDNÁŘ, J., URBAN, T. : Genetika zemědělských produktů. MZLU, Brno, 2004, 137 s.
KŮDELA, V. et al. : Obecná fytopatologie. Academia, Praha, 1989, 387 s.
PROKINOVÁ, E. : Biologická ochrana proti houbovým chorobám rostlin. ÚZPI, Praha, 1996, 39 s.
RAMSAY et al. : A simple sequence repeat – based linkage map of barley. Genetics, 2000, 156 p. : 1997 - 2005
REUVENI, R. et al. : Foliar sprays of NPK fertilizers induce systemic protection against Puccina sorghi and Exserohilum turcicum and growth response in maize. Europ J. Plant Pathology, 1996, 102 p.
ŘEPKA, R., KOBLÍŽEK, J. : Systematická botanika. MZLU, Brno, 2007, 245 s.
ŘEPKOVÁ, S., RELICHOVÁ, J. :Genetika rostlin. MU, Brno, 2001, 269 s.
ŠPALDON, E. et al. : Rostlinná výroba. SZN, Praha, 1982, 720 s.
VACEK, L. : Organická chemie. Státní pedagogické nakladatelství, Praha, 1989, 284 s.
VEJL, P., SKUPINOVÁ, S., SEDLÁK, P. : Analýza rostlinného genomu. Česká zemědělská univerzita, Praha, 2002, 238 s.
VESELÝ, D. : Biologická regulace bakteriálních a houbových chorob kulturních rostlin. VŠZ, Praha, 1991, 64 s.
VYNÁNEK, T., JEŽÍŠKOVÁ, I. : Genetika – úkoly do cvičení pro GENF. MZLU, Brno, 2005, 89 s.
34
ZIMOLKA, J. et al. : Ječmen – formy a užitkové směry v České republice. Profi Press, Praha, 2006, 200 s.
ZIMOLKA, J. , EHRENBERGEROVÁ, J. : Zaměření ječmenářství v ČR, výsledky a perspektiva. MZLU, Brno, 1997, 64 s.
35
Internetové zdroje (www) - 1 CERKAL, R. , HRSTKOVÁ, P. , STŘEDA, T. : Prezentace obilniny; http://old.mendelu.cz/~upsr/prezentace/obilniny/
(www) – 2 : Ječmen http://cs.wikipedia.org/wiki/Ječmen
(www) – 3 : Atlas plodin. Převzato z http://www.selgen.cz/ http://www.agromanual.cz/cz/atlas/plodiny/plodina/jecmen-jarni.html
(www) – 4 : Atlas plodin. Převzato z http://www.selgen.cz/ http://www.agromanual.cz/cz/atlas/plodiny/plodina/jecmen-ozimy.html
(www) – 5 SEDLÁŘOVÁ, M. , LEBEDA, A. : Obecná a speciální fytopatologie. http://botany.upol.cz/prezentace/sedlarova/FP1.pdf
(www) – 6 : Hnědá skvrnitost, Rhynchosporiová skvrnitost http://www.vukrom.cz/www/ochrana/prehled/index.htm
(www) – 7 : Rhynchosporium secalis http://en.wikipedia.org/wiki/Rhynchosporium_secalis
(www) – 8 : Pyrenophora teres http://en.wikipedia.org/wiki/ Pyrenophora_teres
(www) – 9 : Cochliobolus sativus http://en.wikipedia.org/wiki/ Cochliobolus_sativus
(www) – 10 : Atlas – choroby; Rhynchosporiová skvrnitost http://www.bayercropscience.cz/skodlivy_cinitel.php?ExtSort=5&CinType=Choroby&I dAkt=194
36
(www) – 11 : Leaf scald; Rhynchosporium secalis http://www.hannafords.com/disease.php?id=11
(www) – 12 : Atlas chorob; Pyrenophora teres http://www.agromanual.cz/cz/atlas/choroby/choroba/hneda-skvrnitost-jecmene.html
(www) – 13 : New disease reports; First report on Pyrenophora teres causing lesions of wheat leaves in Hungary http://www.bspp.org.uk/NDR/july2007/2007-57.asp
(www) – 14 CHARLTON, N. D. : Bipolaris sorokiniana (teleomorph Cochliobolus sativus) http://www.cals.ncsu.edu/course/pp728/Cochliobolus/Bipolaris_sorokiniana.htm
(www) – 15 : Fungicidy http://www.agromanualshop.cz/4-fungicidy/
(www) – 16 : Plant pathology; Rhynchosporium secalis on barley http://www.scri.ac.uk/research/pp/cbi/rhynchosporium
(www) – 17 : Státní rostlinolékařská správa, Věstník http://www.srs.cz/portaldoc/pripravky_na_ochranu_rostlin/informace_pro_zemedelce/ registrace/VESTNIK_2008_LEDEN.pdf
37
7. PŘÍLOHY Obr. 2
Cyklus nepohlavního a pohlavního rozmnožování třídy Ascomycetes
Obr. 3
Reprodukční orgány hub
Obr. 4
Cochliobolus sativus
Obr. 5
Pyrenophora teres
Obr. 6
Rhynchosporium secalis
Obr. 7
Bipolaris sorokiniana – konidiofory s konidiemi
Obr. 8
Bipolaris sorokiniana – konidie
Obr. 9
Mladé rostlinky napadené Cochliobolus sativus a zdravé rostliny
Obr. 10
Kořeny rostlin napadené Cochliobolus sativus a kořeny zdravých rostlin
Obr. 11
Symptomy napadení houbou Pyrenophora teres
Obr. 12
Dreschlera teres - konidie
Obr. 13
Kultivar ječmene naočkovaný Rhynchosporium secalis
Obr. 14
Rozsáhlá síť hyf Rhynchosporium secalis
Obr. 15
Zhroucení napadených buněk
Obr. 16
Seznam registrovaných přípravků
Obr. 17
Tříkomorový termocycler firmy Biometra – thermoblock T3
38
Obr. 2 Cyklus nepohlavního a pohlavního rozmnožování třídy Ascomycetes, (převzato z přednášek mikrobiologie).
Obr. 3 Reprodukční orgány hub (dle Kůdely et al, 1989).
39
Obr. 4 Cochliobolus sativus (převzato z www – 9).
Obr. 5 Pyrenophora teres (převzato z www – 8).
Obr. 6 Rhynchosporium secalis (převzato z www – 7).
40
Obr. 7 Bipolaris sorokiniana – konidiofory s konidiemi (převzato z www – 14).
Obr. 8 Bipolaris sorokiniana – konidie (převzato z www - 14).
Obr. 9 Mladé rostlinky napadené Cochliobolus sativus (vlevo) a zdravé rostliny (vpravo) (převzato z www - 14).
Obr. 10 Kořeny rostlin napadené Cochliobolus sativus (vlevo) a kořeny zdravých rostlin (vpravo) (převzato z www – 14).
41
Obr. 11 Symptomy napadení houbou Pyrenophora teres (převzato z www – 13).
Obr. 12 Dreschlera teres – konidie (převzato z www – 13). 42
Obr. 13 Kultivar ječmene
Obr. 14 Rozsáhlá síť hyf
Obr. 15 Zhroucení
naočkovaný Rhynchosporium Rhynchosporium secalis
napadených buněk
secalis ( převzato z www – 16). (převzato z www - 16).
(převzato z www -16).
Obr. 16 Seznam registrovaných přípravků (převzato z www – 17).
43
Obr. 17 Tříkomorový termocycler firmy Biometra – thermoblock T3
44
