Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav biologie rostlin

Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav biologie rostlin

Využití molekulárně biologických metod pro detekci mikrobiologických kontaminací Bakalářská práce

Vedoucí práce:

Vypracoval:

prof. RNDr. Ladislav Havel, CSc.

Václav Trojan

Brno 2007

PROHLÁŠENÍ

Prohlašuji, že jsem bakalářskou práci na téma Využití molekulárně biologických metod pro detekci mikrobiologických kontaminací vypracoval samostatně a použil jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém seznamu literatury. Bakalářská práce je školním dílem a může být použita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího diplomové práce a děkana AF MZLU v Brně.

dne………………………………………. podpis bakaláře………………………….

Začátkem práce je mojí ctí a povinností poděkovat prof. RNDr. Ladislavu Havlovi, CSc. za jeho obrovskou obětavost, čas a spoustu nedocenitelných rad při tvorbě bakalářské práce, které přinesly nejen tuto bakalářskou práci, ale i spoustu postřehů do mého dalšího života. Dále Mgr. Lence Dvorské, Ph.D. ze Státní zemědělské a potravinářské inspekce a MVDr. Martinu Válkovi ze Státního veterinárního ústavu Olomouc, pracoviště Kroměříž za poskytnutí podkladových materiálů, bez kterých by byl vznik této práce nemožný. A v neposlední řadě svému dědečkovi pplk. vv. Václavu Stoklasovi za jeho celoživotní péči o mě, který se bohužel ukončení mé práce nedočkal.

Abstrakt

Na diagnostiku patogenních mikroorganismů je kladen čím dál větší důraz. Vedle klasických diagnostických metod nabývají na důležitosti i postupy, které využívají k detekci mikroorganismů poznatky molekulární biologie. V práci jsou shrnuty nejdůležitější molekulárně biologické metody, které nacházejí v této oblasti největší uplatnění. Jejich využití je ukázáno na příkladech patogenních bakterií, které se vyskytují v potravinách na území naší republiky. Kromě toho je u těchto bakterií věnována pozornost i základním aspektům jejich biologie, patogeneze, patogenity, epidemiologie případně terapie.

Klíčová slova: patogenní bakterie, potraviny, diagnostika, PCR

Abstract

Detection of disease-causing microbes in foods has always been a challenging undertaking. Because pathogenic microbes may be present at very low levels, they can be difficult to detect in foods amid the indigenous microflora, and components of the foods may also interfere with their detection. The thesis summarises the most important methods of molecular biology used in diagnostics of food born pathogenic bacteria that are found in the Czech Republic. The basic information about their biology, pathogenesis, pathogenity, epidemiology and therapy is also mentioned.

Keywords: pathogenic bacteria, food, diagnostics, PCR

Seznam používaných zkratek BP - bezpečnost potravin bp - páry bází DOP - degenerované oligonukleotidové primery PCR- polymerasová řetězová reakce PCR-RLFP - stanovení polymorfismu délky restrikčních fragmentů produktů PCR RFLP - polymorfismus délky restrikčních fragmentů ssDNA - jednořetězcová DNA Tm - střední bod teplotního intervalu, během něhož dochází k denaturaci dvouřetězcové DNA

Obsah 1. Úvod…………………………………………………………………………………10 1.1. Bezpečnost potravin „food safety“………………………………………...10 1.2. Cíl práce……………………………………………………………………11 2. Kontaminace potravin obecně……………………………………………………….13 2.1. Fyzikální kontaminace……………………………………………………..13 2.2. Chemické kontaminace…………………………………………………….14 2.2.1. Konzervační látky………………………………………………..14 2.2.2. Rezidua antibiotik………………………………………………..14 2.2.3. Pesticidy………………………………………………………….15 2.2.4. Herbicidy……………………………………………...…………16 2.2.5. Fungicidy………………………………………………………...16 2.2.6. Dioxiny…………………………………………………………..16 2.2.7. Polychlorované bifenyly…………………………………………17 2.3. Biologické kontaminace…………………………………………………...18 2.3.1. Mykotoxiny………………………………………………………18 2.3.2. Fytotoxiny………………………………………………………..20 2.3.3. Priony…………………………………………………………….21 2.3.4. Viry………………………………………………………………22 2.3.5. Bakterie…………………………………………………………..22 3. Principy a aplikace genetických technik na detekci, identifikaci a typizování patogenních mikroorganismů obsažených v potravinách………………...………….25 3.1. Molekulární sondy…………………………………………………………28 3.1.1. Hybridizace DNA………………………………………………..28 3.1.2. Hybridizační podmínky………………………………………….28 3.1.3. Způsoby hybridizace……………………………………………..29 3.1.4. Značení molekulárních sond……………………………………..31 3.2. Základní principy polymerasové řetězové reakce (PCR)………………….32 3.2.1. Citlivost detekce………………………………………………….36 3.2.2. Přesnost detekce………………………………………………….36 3.2.3. Výběr primerů……………………………………………………37 3.2.4. Optimalizace reakčních podmínek……………………………….38 3.2.5. Zamezení kontaminací…………………………………………...39

3.3.Varianty a modifikace PCR………………………………………………...39 3.3.1. Stanovení polymorfismu délky restrikčních fragmentů produktů PCR (PCR−RFLP)…..……………………………………………40 3.3.2. Mnohonásobná PCR (multiplex PCR)…………………………...40 3.3.3. Odstupňovaná PCR neboli PCR využívající vnějších a vnitřních primerů (nested PCR)…………………………………………….41 3.3.4. PCR kolonií………………………………………………………42 3.3.5. Obrácená neboli inverzní PCR (IPCR)…………………………..42 3.3.6. Modifikace konců DNA prostřednictvím 5'-konců primerů……..43 3.3.7. Alelově specifická PCR (AS-PCR)………………………………43 3.3.8. Zpětná PCR (RT-PCR)…………………………………………..44 3.3.9. Rychlá amplifikace konců cDNA (RACE)………………………44 3.3.10. Asymetrická PCR……………………………………………….44 3.3.11. PCR s degenerovanými oligonukleotidovými primery ………...45 3.3.12. Degenerovaná PCR (D-PCR)…………………………………...45 3.3.13. In situ PCR…………….…………………………...…………...46 3.3.14. Amplifikace vnitřních přepisovaných mezerníků (ITS-PCR) PCR-ribotypizace……………………………………………….46 3.3.15. Náhodná PCR (AP-PCR) neboli náhodná amplifikace polymorfní DNA (RAPD)…………………………………………………..47 3.3.16. Interrepetitivní PCR (REP-PCR)……………………………….48 3.3.17. Polymorfismus délky amplifikovaných fragmentů (AFLP)……49 3.3.18. PCR kombinovaná s imunologickými metodami (imuno-PCR)..51 3.3.19. Amplifikační systémy založené na transkripci (TAS A 3S)...….51 3.3.20. Amplifikace DNA vytěsňováním řetězce (SDA)……………….52 4. Konkrétní mikrobiální kontaminace sledované v praxi……………………………...53 4.1. Gramnegativní nefermentující bakterie………………………………...….54 4.1.1. Čeleď Pseudomonadaceae……………………………………….54 4.1.1.1. Rod Pseudomonas……………………………………...55 4.2. Gramnegativní mikroaerofilní tyčinky…………………………………….58 4.2.1. Čeleď Campylobacteriaceae………………………………….....58 4.2.1.1. Rod Campylobacter……………………………………58 4.3. Gramnegativní fakultativně anaerobní tyčinky…………………………….62 4.3.1. Čeleď Enterobacteriaceae……………………………………….62

4.3.1.1. Rod Yersinia……………………………………………65 4.3.1.2. Rod Shigella……………………………………………67 4.3.1.3. Rod Escherichia………………………………………..69 4.3.1.4. Rod Salmonella………………………………………...74 4.3.2. Čeleď Vibrionaceae……………………………………………...82 4.3.2.1. Rod Vibrio……………………………………………...82 4.3.3. Čeleď Staphylococcaceae………………………………………..85 4.3.3.1. Rod Staphylococcus……………………………...…….85 4.3.4. Čeleď Streptococcaceae…………………………………………91 4.3.4.1. Rod Streptococcus…………………………….………..91 4.4. Grampozitivní sporulující aerobní tyčinky………………………………...95 4.4.1. Čeleď Bacillaceae………………………………….…………….95 4.4.1.1. Rod Bacillus……………………………………………95 4.5. Fakultativně anaerobní tyčinky…………………………………………….98 4.5.1. Čeleď Listeriaceae……………………………………………….98 4.5.1.1. Rod Listeria…………………………………………….98 4.6. Grampozitivní sporulující tyčinky………………………………………..102 4.6.1. Čeleď Clostridiaceae…………………………………………...102 4.6.1.1. Rod Clostridium………………………………………102 5. Závěr……………………………………………………………………………......108 6. Seznam použité literatury…………………………………………………………..109 7. Seznam obrázků, tabulek a příloh………………………………………………….116 8. Přílohy

1. ÚVOD

1.1. Bezpečnost potravin „food safety“ V poslední době se hodně mluví o „bezpečnosti potravin“ (dále jen BP), a proto považuji za velmi důležité, vysvětlit význam tohoto pojmu hned v úvodu své práce. Ve smyslu „nezávadnost potravin“ začal být pojem BP používán jako překlad anglického „food safety“, pojem, který je obsažený v tzv. Bílé knize EU /White paper on food safety/ (2006). Cílem tohoto materiálu bylo harmonizovat způsoby a postupy zajišťování BP v celé EU. Z materiálu Bílá kniha EU vychází i mnoho dalších dokumentů, zabývajících se zmíněnou problematikou. V těchto textech a předpisech, se pojem BP používá právě ve smyslu zdravotní a hygienické nezávadnosti potravin jako naprosto základní předpoklad, který musí být v potravinovém řetězci splněn. Zahrnuje však i bezpečnost před možností zranění např. při explozi produktu nebo z nevyhovujícího obalu. Obdobně definuje BP i Codex Alimentarius (2006), dle kterého „bezpečná potravina je ta, která nevyvolá poškození konzumenta, je-li připravena a snědena k účelu, pro který je určena“. Většina odborné veřejnosti prohlašuje za významově správnější, používat termín „zdravotní nezávadnost“, místo termínu „bezpečnost“, který je již zaveden a zakořeněn do našeho vědomí. Nejednou z příčin

může být i jazykový negativismus slova

„nezávadnost“. Do pozadí tak ustupuje BP ve smyslu dostatečného zásobení lidí potravinami, jak se někdy používala např. při hodnocení situace v rozvojových zemích. Na zajištění a zachování BP se podílí zemědělská produkce, zpracovatelé potravin, dovozci, distributoři, státní orgány, ale i spotřebitelé! Stát popř. společenství států (u nás EU) vytváří pravidla a podmínky pro všechny složky zúčastněné v potravinovém řetězci a kontroluje jejich dodržování. Tím poskytuje přiměřenou ochranu konzumenta před zraněním nebo onemocněním z potravin a přiměřenou záruku, že potravina je vhodná pro konzumaci. Také posiluje důvěru v mezinárodně obchodovatelné potraviny. Úkolem státu je i vzdělávání spotřebitelů. Potravinářský průmysl musí vyrábět jen potraviny bezpečné a vhodné pro konzumaci a poskytovat spotřebitelům jasné a snadno pochopitelné informace

o jednotlivých potravinářských výrobcích a o zacházení s nimi, uvedené především na obalech.

A nakonec má pro dodržení BP nezastupitelnou úlohu spotřebitel při nakládání s potravinami (nákup, uchovávání, kuchyňská úprava, hygiena, konzumované množství). Na základě poskytnutých informací a na základě znalosti rizik, která vyplývají z určitých potravin a z určitých praktik používaných při zacházení s potravinami, má spotřebitel možnost ochránit potraviny před kontaminací a před nežádoucími změnami.

1.2. Cíl práce Jedním z nejdůležitějších aspektů bezpečnosti potravin je jejich kontaminace patogenními bakteriemi. Detekce mikroorgamismů obsažených v potravinách byla vždy spojena se značnými problémy. Podle United States Centres for Disease Control a Prevention bylo etiologické agens v průběhu 5 let zjištěno jen v 38 % případů po propuknutí nemocí evidentně způsobených potravinami (Bean et al. 1990). Patogenní mikroorganismy mohou být přítomny ve velmi malých množstvích, a proto může být těžké detekovat je mezi vnitřní mikroflórou často obsaženou v potravinách. Také různé součásti potravin mohou též interferovat s detekcí mikroorganismů a tím ji znesnadňovat nebo i znemožňovat. Je tedy potřebné stále zdokonalovat staré a vyvíjet nové rychlé techniky k identifikaci mikrobiálních patogenů a jejich hustoty v potravinách (Hill a Jinneman 2000). Mezi nejnovější způsoby charakterizace všech organismů a tedy i patogenních bakterií patří metody molekulární biologie. Prvním cílem předložené práce je stručně sumarizovat možné kontaminace potravin. Druhým cílem charakterizovat základní metody molekulární biologie a jejich modifikace využitelné v diagnostice patogenních bakterií vyskytujících se v potravinách. Dalším cílem je zařadit molekulárně biologickou diagnostiku do celkového kontextu biologie patogenních bakterií vyskytujících se v potravinách, jejich biochemických charakteristik a patogenita. U některých zvláště důležitých patogenních bakterií považuji za vhodné, zmínit se i o jejich epidemiologii, prevenci i léčbě. Konečným cílem předložené práce pak tedy je vytvořit komplexnější představu o důležitosti molekulárně biologických diagnostických metod v celkovém kontextu bezpečnosti potravin.

2. Kontaminace potravin obecně Bezpečnost potravin může být ohrožena ve všech fázích vzniku. První fází ohrožení je už sám chov hospodářských zvířat či pěstování rostlin. V rámci potravního řetězce se mohou do rostlin a hospodářských zvířat dostávat cizorodé látky, které mohou přetrvávat po celou dobu výroby potravin. Také některé patologické stavy hospodářsky důležitých organismů mohou být příčinou nebezpečnosti konečného produktu. Dalším zdrojem kontaminací finálních produktů je skladování surovin a následně vlastní výroba potravin. Riziko kontaminace může být ohroženo i skladováním konkrétní potraviny výrobci, prodejci i spotřebiteli. K poslední kontaminaci potravin může dojít i při jejich přípravě před konečnou konzumací zákazníkem. Možných kontaminací existuje tedy celá řada.

Lze je rozdělit dle základních kritérií na fyzikální, chemické a biologické.

2.1. Fyzikální kontaminace Za fyzikální kontaminace jsou považovány zemina, kovové předměty (šroubky, matičky, hřebíky, podložky, špendlíky, kancelářské svorky), plastové úlomky, kousky skla, dřeva, šperky, radionuklidy použité při ozařování potravin za účelem prodloužení doby údržnosti. S mechanickým znečištěním potravin se nepotýkáme až tak často, ale pokud se již někde objeví, bývá většinou značně kuriózní. Nejednou v médiích zazněla zpráva o náhodném nálezu nepatřičného předmětu ve výrobku. Bohužel někdy se setkáme s případem, kdy se snaží výrobce obohatit ne zcela legálním způsobem a nabízený produkt kontaminuje záměrně. Příkladem může být falšování koření anorganickými složkami (zemina) nejčastěji v mleté podobě (mletý kmín, mletý pepř). V poslední době se začíná rozšiřovat používání radionuklidů k ozařování potravin, zvlášť v takových případech, kde by jiná forma konzervace mohla vést k celkové degradaci potraviny (Komprda 2004).

2.2. Chemické kontaminace K chemickým kontaminacím patří konzervační látky, rezidua růstových stimulátorů, herbicidy, pesticidy, fungicidy a jiné látky: chlorované dibenzo-p-dioxiny, dibenzofurany, bifenyly a polycyklické aromatické uhlovodíky (Komprda 2004).

2.2.1. Konzervační látky Do této skupiny patří látky různé chemické povahy, které prodlužují údržnost potravin a chrání je proti zkáze způsobené činností mikroorganismů. Možnosti jejich použití stanovuje vyhláška 304/2004 Sb. o přídatných a pomocných látkách při výrobě potravin. V České republice jsou povoleny některé karboxylové kyseliny (benzoová, p−hydroxybenzoová,

sorbová) a estery nebo

soli

(Na+,

K+,

Ca2+) kyseliny

4−hydroxybenzoové, které mají inhibiční účinek na růst mikroorganismů. Nejúčinnější konzervační látky jsou kyselina benzoová a její soli (E 210─213), kyselina sorbová a její soli (E 200-203), parahydroxybenzoáty (PHB, E 214─219) a siřičitany (E220─E228) patří mezi aditiva, jejichž používání v potravinách je výrazně limitováno (příloha vyhlášky 304/2004 Sb, část 6). Z anorganických látek jsou to SO2 a v určitých případech i CO2. Stanovení lze provést redoxními titracemi, spektrofotometricky a separačními metodami.

2.2.2 Rezidua antibiotik Antibiotika jsou léky ničící nebo zpomalující růst bakterií. Antibiotika tvoří jednu třídu „antimikrobiálních léků“ (antimikrobiotik nebo též bakteriostatik) – větší skupiny, která též obsahuje antivirové, protiplísňové a antiparazitické léky. Jsou relativně neškodné pro hostitele, a proto mohou být použity pro léčbu infekcí. Existuje mnoho způsobů klasifikace antibiotik. Jedna z klasifikací je například podle jejich chemické struktury nebo podle mechanismu účinku. Z nejznámějších skupin antibiotik jsou to například aminoglykosidy, β-laktamová antibiotika (cefalosporiny a cefalomyciny, monocyklické β-laktamy, peniciliny), makrolidy, tetracykliny, chinilony, sulfonamidy. Jedním z vedlejších dopadů nevhodného užívání antibiotik je vznik antibiotické rezistence infikujících organismů, podobný vzniku pesticidové rezistence u hmyzu. Antibiotická rezistence se stala vážným problémem v rozvojových i vyspělých zemích

světa. V některých nemocničních zařízeních je míra antibiotické rezistence natolik vysoká, že nalezení vhodného antibiotika se stává značným problémem. Problém antibiotické rezistence narůstá, pokud jsou antibiotika použita na léčbu nemocí, u kterých nemají žádný účinek (nevhodně zvolená antibiotika na léčbu banální infekce bez předchozího mikrobiologického vyšetření nemocného), a když jsou široce používána na prevenci a ne na léčbu při výkrmu hospodářských zvířat. V chovu hospodářských zvířat se antibiotika používají ze dvou důvodů. Jednak na podporu růstu a efektivnosti krmení zvířat, tímto způsobem produkují více masa a mléka s menší spotřebou krmiva. Druhým důvodem je prevence a léčení chorob, stejně jako u lidí. Určit však, kdo nese větší zodpovědnost za rezistenci mikroorganismů vůči antibiotikům je velmi relativní. Veterinární lékaři argumentují, antibiotika do krmiv si mohou dovolit jen finančně silnější chovy, které velmi přesně ví, jaký je smysl jejich použití. Na druhé straně humánní lékaři hovoří o nutnosti nasazení okamžité léčby pacienta bez mikrobiologického vyšetření. Používání antibiotik ve veterinární sféře je regulováno vyhláškou 325/2003 Sb, přípustný obsah reziduí antibiotik v potravinách je stanoven vyhláškou 44/2004 Sb.

2.2.3. Pesticidy Pod názvem pesticidy rozumíme prostředky a přípravky, které jsou určeny k tlumení a hubení rostlinných a živočišných škůdců a k ochraně rostlinných kultur, stromů, keřů, skladových zásob, technických produktů, zvířat, člověka, bytů, domů a výrobních závodů. Cílem jejich používání je zamezení ztrát v zemědělství, potravinářství, průmyslové výrobě. Za velmi závažné je třeba považovat skutečnost, že u některých pesticidů je známa jejich schopnost vytvářet nežádoucí a mnohdy nebezpečná rezidua v půdě, rostlinách, živých organismech a jsou schopny prostupu do potravních řetězců a jejich kontaminace. Mnohé z pesticidů jsou rizikové i tím, že obsahují nežádoucí příměsi rizikových látek (například dioxinů, těžkých kovů) . Z těchto důvodů je nutné, aby při používání a aplikaci všech chemických látek byly respektovány platné právní normy, předpisy a vyhlášky tak, aby použití mělo svůj pozitivní přínos a aby jejich použití nebylo spojeno se vznikem jednorázových nebo systémových škod.

Pesticidy jsou vyráběny na mnoha bázích (močovina, organochlorové pesticidy, karbamáty, organofosfáty, organomerkuriáty, polychlorované bifenyly).

2.2.4. Herbicidy Herbicidy jsou látky využívané k potlačování růstu nebo přímému ničení plevelů. V České republice jsou registrovány v Seznamu registrovaných prostředků na ochranu rostlin. Většina herbicidů je podle platné legislativy (podle zákona č. 157/1998 Sb., ČR o chemických látkách a chemických přípravcích) a podle Nařízení vlády č. 114/1999 Sb., příloha č. 1) řazena mezi chemické látky, které se pro účely trestního zákona považují za jedy.

2.2.5. Fungicidy Jako fungicidy jsou označovány prostředky, které jsou určeny k řízenému boji proti parazitujícím houbám a u rostlin, produktů zemědělské a potravinářské výroby a produktů jiných průmyslových aktivit. Houby, zejména mikromycety (plísně a kvasinky) napadají byliny a dřeviny a působí na nich nezvratné škody, včetně narušení až zničení produktů, které se z nich získávají, zejména obilnin, ovoce a zeleniny. Kromě toho napadají dřevo a dřevěné konstrukce, kůže, kožené výrobky a další. Některé fungicidní prostředky se uplatňují i jako léčiva, a to jako lokální nebo celková antimykotika.

2.2.6. Dioxiny Dioxiny je obecný název pro skupinu toxických polychlorovaných organických heterocyklických sloučenin, odvozených od dibenzo(b,e)(1,4)dioxinu, obsahujícího šestičlenný 1,4-dioxanový cyklus. Většinou se mezi ně řadí i polychlorované deriváty dibenzofuranu. Dioxiny se v přírodě velmi pomalu rozkládají (podobně jako další halogenované organické sloučeniny) a jejich rozpustnost v tucích způsobuje, že se kumulují v tukových tkáních. Nejznámějším dioxinem je 2,3,7,8-tetrachlordibenzo-p-dioxin (TCDD), který vzniká nedokonalým spalováním chlorovaných organických látek, například dichlorbenzenu.

Ve velmi vysokých dávkách způsobují dioxiny trvalé poškození pokožky známé jako chlorakné. V nízkých dávkách je dioxinům připisována teratogenita (vývojová toxicita) a karcinogenita. Karcinogenita TCDD byla potvrzena v roce 2001, kdy byl dioxin překlasifikován ze skupiny „pravděpodobný karcinogen“ na „známý karcinogen“. Na rozdíl od většiny jiných toxických látek či karcinogenů není pro dioxin stanovena bezpečná dávka; předpokládá se, že je škodlivý v jakékoliv detekovatelné koncentraci. Některé zdroje dokonce udávají, že TCDD je nejsilnější známá karcinogenní látka.

2.2.7. Polychlorované bifenyly Polychlorované bifenyly (PCB, PCBs) je skupina látek vznikajících chlorací bifenylu. Zahrnuje celkem 209 kongenerů (příbuzných látek) s alespoň 4 navázanými atomy chlóru. Obecný vzorec je tedy C12H10-xClx, kde x ≥ 4. Z toxikologického hlediska jsou relevantní kongenery se 4-7 atomy chlóru a rovinným uspořádáním molekuly, celkem je jich 12. Mezi základní chemické vlastnosti patří to, že jsou chemicky stálé, tepelně odolné, přilnavé a nehořlavé. Polychlorované bifenyly se začaly masově používat ve 30. letech minulého století v USA a odtud se pomalu rozšířily do celého světa. Používaly se jako běžná aditiva v barvách, lacích, náplních do hydraulických zařízení či teplonosných médiích. V 60. letech se však začaly objevovat náznaky, že tyto látky nejsou tak neškodné, jak se myslelo. Ačkoliv se původně vůbec nepředpokládalo, že by někdy mohly proniknout do potravního řetězce, byly stále častěji diagnostikovány v tkáních organismů, zejména pak u predátorů na vrcholu řetězce, ale také v mléce a mase krav, koz a dalších podobných živočichů. Ukázalo se také, že u výše zmíněných 12 kongenerů existují významné negativní účinky na organismy. Podrobný toxikologický výzkum postupně odhalil, že zatímco akutní toxicita PCB je nízká, výrazně silnější je jejich kumulativní účinek. Za nejvážnější jsou považována karcinogenní rizika, zejména pokud jde o rakovinu slinivky břišní a rakovinu jater. Dále bylo prokázáno, že mají nepříznivý účinek na výkon imunitního systému, poškozují játra a snižují plodnost. Velmi nepříjemným se ukázala jejich perzistence v prostředí, značná odolnost vůči všem druhům rozkladu a velmi špatná vyloučitelnost z organismu. U savců se jako nejúčinnější jeví jejich vylučování mlékem, což rozhodně není optimální.

V případě člověka byl problematický zejména příjem skrze mléko, neboť PCB se běžně používaly v ochranných nátěrech sil, odkud se dostaly do siláže a po pozření dobytkem přecházely ve značné míře do mléka. Možný byl ale samozřejmě i příjem skrze maso kontaminovaných živočichů. Polychlorované bifenyly začaly být po výše uvedených zjištěních stahovány z výroby a prodeje. Na území České republiky byla jejich výroba zastavena v roce 1984, poslední legální použití výrobků obsahujících významné množství PCB bylo možné ještě v roce 1986.

2.3. Biologické kontaminace Za biologické kontaminanty jsou pokládány mykotoxiny, fytotoxiny, priony, viry a bakterie.

2.3.1. Mykotoxiny Mikroskopické houby (mikromycety, ¨plísně¨ jsou spíše technický pojem používaný v praxi pro mikromycety) tvoří viditelné vláknité povlaky. Jsou to heterotrofní organismy, tedy organismy vyžadující ke své výživě organické látky rostlinného nebo živočišného původu. Mikromycety žijí většinou saprofyticky, získávají živiny z těl odumřelých organismů, krmiv pro hospodářská zvířata či z potravinových surovin nebo potravin samotných. Do této skupiny patří většina mikromycet, které jsou schopny tvořit vysoce toxické látky - mykotoxiny (toxigenní mikromycety). Symbioticky žije jiná skupina mikromycety. Mykorhizovou symbiosou, soužitím mikroskopické houby a rostliny, představují velmi důležitý článek potravního řetězce. Třetím typem způsobu života je parazitismus mikroskopických hub na vyšších organismech. V této skupině se rovněž nacházejí některé toxigenní mikromycety (námel). Členění mikromycet není až tak výstižné, protože některé z nich mohou podle situace v průběhu života měnit způsob výživy. Tvorba mykotoxinů, produktů

sekundárního metabolismu toxigenních

mikromycet, závisí na celé řadě exogenních i endogenních faktorů a představuje tak z hlediska diagnostiky, ochrany a prevence velmi komplikovaný problém. Otravy mykotoxiny (mykotoxikózy) jsou známé již od antických dob. Nelze přehlédnout řadu zmínek ze středověku o vysokém počtu otrav námelovými alkaloidy s epidemickým charakterem v důsledku konzumace žita kontaminovaného houbou

Claviceps purpurea (paličkovice nachová, námel). Hlavními příznaky byla úmrtí v křečích, snížená plodnost, potraty, halucinace a maniakální deprese. Někteří badatelé se dokonce domnívají, že může existovat souvislost mezi organizací čarodějnických procesů ve středověku s výskytem otrav námelem doprovázeným halucinogenními příznaky. Žitný chléb, hlavní potravina většiny populace Evropy středověku, tak mohl hrát významnou roli v regulaci populace. Když v polovině 18. století klesl význam žita, které bylo nahrazeno pšenicí a brambory, začala také rychle růst velikost populace v Evropě. I když je v dnešní době diagnostikováno více než 300 mykotoxinů, zdá se, že se v praxi negativním způsobem uplatňuje pouze asi 20 z nich jako příčiny otrav člověka a zvířat. Některé mykotoxiny (např. aflatoxiny) významným způsobem kontaminují produkci krmiv a potravin v zemích s teplejším klimatem a dostávají se do Evropy importem. Jiné (např. ochratoxiny, trichotheceny, fumonisiny) mohou byt produkovány přímo v našich podmínkách. Vznik a výskyt mykotoxinů je výsledkem složitého komplexu interakcí mezi genomem toxinogenních mikromycet a zevním prostředím, včetně druhu substrátu, na kterém rostou, klimatických faktorů, metody sklizně a skladování, distribuce a zpracování. Holistický přístup k vlivům zevního prostředí na produkci mykotoxinů znázorňuje tabulka 1. Diagnostika přítomnosti mykotoxinů v krmivech a potravinách představuje značný technický problém. Distribuce mykotoxinů není v surovině většinou homogenní, což klade značné nároky na způsob odběru a velikost reprezentativního vzorku k analýze. Nákladné metody instrumentální analýzy (chromatografické metody) jsou v poslední době významným způsobem doplněny rychlými imunodiagnostickými metodami. I když perorální přívod mykotoxinů hraje nejdůležitější roli z hlediska expozice organismu, není možné zapomínat na inhalační cestu. Přívod mykotoxinů ve sporách je rovněž možný. Existuje také skupina těkavých látek produkovaných mikroskopickými houbami (plísňový prach), které mají vlastnosti mykotoxinů.

Tab. 1 Holistický přístup k interakcím ovlivňujících produkci mykotoxinů substrát teplo vlhkost CO2/O2 mechanické poškození poškození hmyzem intenzita infekce sporami kompetice s mikroflórou mikrobiální interakce čas


růst mikroskopické houby


PRODUKCE MYKOTOXINU

Zdravotní efekt přívodu mykotoxinů není zatím zcela známý. Zatímco akutní efekt po přívodu vysokých jednorázových či několika opakovaných dávek byl poměrně dobře experimentálně prozkoumán, o efektu chronické expozice nízkým dávkám víme jen omezené množství informací. Pozornost vzbuzují především ty mykotoxiny, u kterých byl prokázán karcinogenní efekt (aflatoxiny) nebo jsou podezřívány z tohoto efektu (ochratoxin A, aj.). Dekontaminace potravin a krmiv není jednoduchá levná záležitost. Substrát může být kontaminován i několika mykotoxiny současně. Běžně je známý jediný proces dekontaminací krmiva kontaminovaného aflatoxiny pomocí amoniaku. Tento postup však není oficiálně akceptován. V praxi se používá rovněž opatření, které má bránit absorpci mykotoxinů. Speciální sorbenty přidávané do krmiv brání vstřebávání některých toxických látek, dekontaminace je však vždy náhradní řešení, které nemá přednost před prevencí vzniku mykotoxinů (Zapletal et al. 2001).

2.3.2. Fytotoxiny Rostliny tvoří primární a sekundární produkty metabolismu rostlin, které se vylučují do vnitřních i povrchových sekrečních struktur rostlin. Slouží k ochraně rostliny, k impregnaci, při reprodukci atd. Toxicky účinné složky, které se vyskytují v rostlinách, jsou hlavně alkaloidy, glykosidy, saponiny, organické kyseliny, silice

a terpeny. V rostlinách jsou zastoupeny v různém poměru a množství, což také závisí od vnějších podmínek, jako je světlo, nadmořská výška, teplota, světelné záření a půda (Zapletal et al. 2001). 2.3.3. Priony Prion - subvirová infekční agens (někdy označovaný „infekční bílkovina“) je název pro vadnou formu tzv. prionové bílkoviny, vyskytující se v nervových buňkách savců. Platí-li tzv. prionová teorie, jsou priony původci celé řady nemocí centrálního nervového systému lidí i zvířat. Prionovou teorii formuloval profesor Stanley B. Prusiner v roce 1982. Ten také poprvé použil slovo prion (původně to měl být proin jakožto kombinace slov proteinaceous a infectious, nicméně prion zněl lépe). Prionovou teorii Prusinel formuloval v souvislosti s hledáním původce Creutzfeldt-Jakobovy choroby. Jím objevený prion představuje něco úplně nového. Až do roku 1982 se považovalo za absolutně platné, že infekční nemoci může způsobovat pouze infekční organismus, obsahující nukleovou kyselinu nesoucí genetickou informaci. Prion ovšem žádnou nukleovou kyselinu neobsahuje, je to bílkovina, která se „rozmnožuje“ tím, že mění podobné bílkoviny v organismu. Nervové buňky savců obsahují tzv. prionové bílkoviny (v angl. literatuře je častá zkratka PrP, případně PrPC pro zdravou buněčnou bílkovinu). Má se za to, že tyto prionové bílkoviny hrají významnou úlohu při odpočinku a spánku. Prion (PrPSC) představuje vadnou formu této normální bílkoviny, od které se odlišuje rozdílnou konformací (prostorovým uspořádáním). Důsledkem této změny konformace je mimořádná odolnost vůči různým fyzikálním vlivům, prakticky absolutní odolnost proti štěpným enzymům odklízejícím vadné bílkoviny a schopnost navazovat se na zdravé formy prionových bílkovin a konvertovat je na svoji vadnou formu. Následkem je, že se v buňce hromadí rostoucí chuchvalce propojených vadných molekul prionové bílkoviny, kterých se buňka nedokáže zbavit, posléze je zcela zaplněna a uhyne. Předchozí část teorie je obecně přijímána. Navazující část je sice přijímána většinou odborníků, nicméně ne absolutně. Ta předpokládá možnost přenosu prionových onemocnění potravou nejen mezi jedinci jednoho druhu (což je též obecně přijímáno – v případě nemoci kuru se to má za dostatečně podložené), ale i mezi jedinci různých druhů, zejména pak se zdůrazňuje přenos ovce (scrapie) – kráva (bovinní

spongiformní encefalopatie) a kráva (BSE) – člověk (nová varianta CJD). Zde mají někteří odborníci výhrady a nepovažují tuto část teorie za dostatečně prokázanou. K přenosům mezi druhy existuje několik předpokládaných obecností: - šance na přenos mezi druhy je přímo úměrná podobnosti prionových bílkovin obou druhů, - největší šance na přenos skýtá konzumace mozku či jiných vysoce inervovaných tkání, - masožravci jsou obecně odolnější proti přenosu než býložravci. Onemocnění připisovaná prionům jsou lidská, ke kterým patří kuru, nová varianta Creutzfeldt-Jakobovy choroby, Gerstmann-Straussler-Scheinkerova choroba a FFI, a zvířecí, k nimž jsou řazena bovinní spongiformní encefalopatie (BSE) (tzv. nemoc šílených krav), scrapie, přenosná encefalopatie norků, CWD a spongiformní encefalopatie koček.

2.3.4. Viry Virus (virus = latinsky jed) je struktura nacházející se na hranici mezi živým a neživým. Ty nejprimitivnější viry obsahují pouze svoji genetickou informaci ve formě DNA nebo RNA, které jsou uloženy v kapsidě, a několik málo proteinů tvořících virový obal. Složitější mohou navíc obsahovat 1-2 obalové membrány pocházející z napadené buňky (vnější je obvykle obohacena virovými proteiny sloužícími k rozpoznání hostitelské buňky a k usnadnění průniku dovnitř) a enzymy, které jim mají usnadnit invazi do buňky a expresi své DNA či RNA. Viry nejsou schopny samostatné existence bez hostitelské buňky, tedy přesněji nejsou schopny se bez hostitelské buňky reprodukovat. Po splnění této role dochází k destrukci této buňky a nové viry se šíří dál i mimo napadený organismus. Viry napadající bakterie se nazývají bakteriofágové, viry napadající sinice se nazývají cyanofágové. Některé viry napadají člověka a mohou způsobovat onemocnění. Některá z nich mohou být způsobena viry, které se přenášení i prostřednictví potravin, jako např. Norwalk virus, virus hepatidy A a enteroviry.

2.3.5. Bakterie Mikroorganismy a makroorganismy patří nerozlučně k sobě během celého fylogenetického vývoje. Dají se označit za velmi pravděpodobnou příčinu

vzniku

imunitního systému ve fylogenezi a významnou měrou ovlivňují vyzrávání imunitního

systému v postnatální ontogenezi. Bakterie a hostitel jsou živé organismy, které se navzájem ovlivňují. Vztahy mezi bakterií a makroorganismem je možné rozdělit do několika kategorií: fyziologické osídlení kůže a sliznic, náhodná krátkodobá kolonizace, nosičství a onemocnění. Soužití bakterií, které fyziologicky osidlují kůži a sliznice, s hostitelem je oboustranně výhodné. Fyziologická bakteriální flóra přispívá k rozvoji imunitního systému, omezuje možnost průniku patogenních mikrobů a hostitel využívá některých jejich metabolitů (vitamin K, a některé vitaminy skupiny B tvořené střevními bakteriemi). Bakterie fyziologické flóry jsou za normálního stavu nepatogenní. Mohou však někdy působit i těžká onemocnění, zejména u pacientů nejrůzněji oslabených, dostanou-li se z kůže a sliznic do krevního oběhu, do tkání nebo do serózních dutin (peritonitidy po perforaci střeva, ascendentní nebo hematogenní infekce močových cest, bakteriémie po extrakci zubů, která není závažná u zdravého člověka, ale při oslabení organismu může být příčinou např. endokarditidy). Proto jsou mnohé z těchto bakterií označovány jako potenciální nebo oportunní patogeny. Kůže a sliznice jsou náhodně a krátkodobě kolonizovány malým množstvím mikroorganismů pocházejících z lidí, zvířat a zevního prostředí. Fyziologické osídlení a náhodná kolonizace vede k promoření populace a ke vzniku značné odolnosti proti běžným patogenům. Rozvíjí se imunitní odpověď proti nejrůznějším mikrobiálním antigenům, která se díky četným křížovým reakcím mezi bakteriemi může uplatnit i v obraně proti mikrobům, se kterými se makroorganismus dosud nesetkal. O nosičství mluvíme v případě dlouhodobé kolonizace organismu bakteriemi, které nejsou součástí fyziologické flóry. Hostitel je proti těmto bakteriím značně odolný, ale nedokáže se jich úplně zbavit. Nosič nemá žádné potíže, ale může být zdrojem infekce pro oslabeného jedince v případě oslabení sebe samého může infekce propuknout i ve vlastním organismu. Velmi závažné je bacilonosičství Staphylococcus aureus na nosní sliznici nebo Salmonella Typhi ve žlučníku. Při infekčním onemocnění dochází ke konfliktu mezi mikrobem a hostitelem. Střetávají se obranné mechanismy makroorganismu s nástroji patogenity bakterie. Bakterie se množí a mohou pronikat do nejrůznějších částí těla hostitele. V jedné z dalších kapitol se budu zabývat podrobnějším popisem jednotlivých skupin bakterií, které se vyskytují jako nejčastější kontaminanty potravin u nás (Nečas et al. 2002).

3. Principy a aplikace genetických technik na detekci, identifikaci a typizování

patogenních

mikroorganismů

obsažených

v potravinách Standardní metody zahrnují především kultivaci na selekčních anebo diferenciačních agarových médiích, buď přímo nebo po předcházejícím zvýšení hustoty patogenních buněk, která se provádí předběžnou kultivací ve vhodném bujonu (obohacení kultury). Jednotlivé kolonie, které se vytvářejí na agarovém médiu jsou pak nejprve identifikovány na základě morfologických charakteristik. Na potvrzující biochemické anebo imunologické reakce a specifické testy na mikrobiální virulentní faktory je zapotřebí dva až pět dnů. Tato doba je často příliš dlouhá pro cílený zásah hygienických a zdravotních služeb. Z tohoto hlediska ohledu se ukazují jako výhodné metody využívané v molekulární biologii. Předností těchto postupů je porovnávání organismů na základě genetické informace a nikoli na prostřednictvím fenotypového projevu, na kterém jsou založeny téměř všechny dříve využívané metody (Rychlík a Pavlík 1997). Efektivnost metod molekulární biologie se dále zvyšuje s rozšiřováním znalostí o struktuře genomu bakterií. V tomto směru bylo dosaženo významného pokroku. Na začátku roku 2006 byl znám kompletní genom asi 300 bakteriálních druhů (Schumann 2006). Zavedení metod molekulární biologie a především využívání genových sond a technik založených na polymerasové řetězové reakci (PCR) umožnilo vytvořit a do praxe zavést testy, které dovolují rychle detekovat a určit bakteriální druhy, jejich specifické klony či další skupiny anebo i geny virulence bez potřeby vytvořit čisté kultury. Zavedení molekulárně biologických technik pro rutinní analýzu potravin je v současnosti jedním z hlavních polí výzkumné aktivity v oblasti kontroly bezpečnosti potravin (Hill a Jinneman 2000). Metody molekulární diagnostiky jsou zaměřeny všeobecně na vyhledávání totožnosti nebo rozdílů v sekvencích DNA a identifikaci polymorfismu v celkové genomové nebo plazmidové DNA nebo polymorfismu specifických genů. Protože řada sekvencí DNA, genů, ovlivňuje fenotypové znaky, mohou tyto metody nahradit jiné, výše uvedené diagnostické techniky. Cílem použití jednotlivých metod je identifikace nebo typizace vzorků, které jsou k dispozici a které mohou sloužit k taxonomickému určení,

vyhledání

zdroje

a

poskytnutí

informace

o

množství

patogenního

mikroorganismu. Metody založené na analýze nukleových kyselin mají na rozdíl od fenotypových metod 100% typovatelnost, protože všechny organismy tyto látky obsahují. Tyto metody jsou navíc rychlé a často nevyžadují předchozí kultivaci buněk. Metody molekulární diagnostiky nazývané také jako metody molekulární biologie mohou být přímé nebo nepřímé. Při využití přímých metod se stanovuje přímo sekvence variabilní oblasti DNA. Toto stanovení je však časově náročné a nebývá vhodné pro rutinní provádění. Z tohoto hlediska jsou výhodnější metody nepřímé, kterými se dají zobrazit profily DNA konkrétního organismu ve formě otisku DNA, resp. fingrprintu DNA. Otisky mohou být ve formě spekter restrikčních fragmentů nebo produktů polymerové řetězcové reakce rozdělených elektroforeticky, případně označené ještě specifickou hybridizační sondou. Nepřímé techniky se rozdělují na techniky založené na amplifikaci DNA a na techniky, při kterých amplifikace DNA neprobíhá. Mezi ně řadíme restrikční endonukleasovou analýzu (REA) a selektivní hybridizaci restrikčních fragmentů (SRFH) ke specifickým sondám. Speciální skupinu tvoří techniky, které využívají rozdílnou pohyblivost fragmentů DNA obsahující standardní a mutantní geny při elektroforéze umožňující

detekci

konfirmačních

polymorfismů

nukleových

kyselin

anebo

jednonukloetidových polymorfismů (SNP). Postupy spočívající na určení polymorfismu délky restrikčních fragmentů (RFLP) využívají rozdílů v restrikčních mapách jedinců téhož druh. Využívají se zde rozdíly, které jsou vyvolané různou délkou a počtem restrikčních fragmentů vznikajících při štěpení genomové DNA určitou restrikční endonukleasou. Tyto rozdíly jsou snadno detekovatelné gelovou elektroforézou, která může být doplněna využitím sond specifických pro polymorfní oblasti genomu. Selektivní hybridizace umožňuje snazší hodnocení výsledků analýzy RFLP (viz níže). Postupy, které spočívají na využívání na molekulárních sond, jsou založeny na hybridizaci nukleových kyselin. Jako hybridizace nukleových kyselin se označuje proces vytváření dvouřetězcových molekul za předpokladu,

že

se

jejich

sekvence

z jednořetězců DNA nebo RNA vyznačují

úplnou

nebo

částečnou

komplementaritou bází. Jestliže je úsek jednoho řetězce DNA vhodným způsobem označen (a nazývá se pak sondou), může být použit pro detekci komplementárního úseku DNA izolované z neznámého organismu. Dojde-li k hybridizaci sondy s neznámou denaturovanou DNA, předpokládá se, že vzorek, ze kterého byla tato DNA izolována, obsahoval organismus s genem, který charakterizuje daná sonda. Existuje

několik přístupů, jejichž citlivost kolísá od 104 do 106 kopií cílového genu resp. cílové sekvence. Práce založené na genetickém základě patogenity bakterií v potravinách vedly k vytvoření specifických sond nejen k rodů a druhům, ale i klonům a sérovarům. Při analýze prokaryotického genomu metodami selektivní hybridizace restrikčních fragmentů se využívají sondy připravené z náhodně vybraných sekvencí, sondy specifické pro esenciální geny nebo geny kódující faktory virulence u patogenů. Sondy odvozené od vícekopiových elementů a sondy připravené z genů pro 16S rRNA nebo 23S rRNA jsou užívané při tzv. ribotypizaci (Šmarda et al. 2005). Polymerasová řetězcová reakce (polymerase chain reaction – PCR) je postup sloužící k amplifikaci specifických úseků DNA. Princip PCR je založen na replikaci nukleových kyselin, která je základním molekulárním procesem všech živých organismů. Tímto způsobem dosažené mnohonásobné zvýšení počtu kopií cílové oblasti dovoluje obvykle velmi citlivou detekci (a možnou kvantifikaci) specifických sekvencí či genů. Po svém zavedení v roce 1985 byla tato technologie využita v mnoha oborech a tedy i pro detekci patogenů, které se vyskytují v potravinách (Jones a Bej 1994). Rychlý pokrok při využívání sond i PCR je do značné míry spojen s úspěchy v sekvenování

nukleových

kyselin,

které

umožnilo

vývoj

metod

syntézy

oligonukleotidů o známém pořadí nukleotidů. U patogenních mikroorganismů to bylo určení nukleotidových sekvencí četných genů virulence a taxonomických markerů. Jako primery mohou být často využity oligonukleotidy sloužící jako při hybridizaci sondy. Vhodnost využití sond i PCR záleží na konkrétní situaci. Metody založené na PCR poskytují vysokou citlivost a rychlost určení bakterií. Užití genových sond s následnou přímou kultivací nebo obohacování kultur může vést k důvěryhodnějším kvantitativním odhadům životaschopných patogenů ve vzorcích potravin. Obě dvě metody, používání genových sond i PCR, jsou principiálně jednoduché. Při zjišťování mikrobiálních kontaminací v potravinách se však setkáváme s určitými problémy, které souvisejí s přípravou vzorků pro analýzu. Jedná se především o uvolnění DNA z bakterií v potravinových matricích a odstranění inhibitorů amplifikace DNA, jež mohou být v potravinách přítomny.

3.1. Molekulární sondy Jako molekulární nebo také hybridizační sondy se nazývají jednořetězcové radioaktivně nebo chemicky značené nukleotidové sekvence DNA nebo RNA. Jsou

užívány pro detekci určitých sekvencí na zkoumané DNA pomocí hybridizace. Vazba podle pravidel komplementarity na cílovou sekvenci umožňuje pak tuto cílovou sekvenci identifikovat.

3.1.1. Hybridizace DNA Molekuly DNA existují obvykle ve formě dvoušroubovice, ve které jsou oba řetězce k sobě vázány vodíkovými můstky mezi adeninem a thyminem, guaninem a cytosinem. Řetězce mohu být odděleny – denaturovány nejčastěji zvýšením pH nebo teploty. Když je pH nebo teplota opět snížena, oba řetězce se opět spojí - renaturují. Protože řetězce, které znovu vytvářejí dvouřetězcovou strukturu pocházejí z různých zdrojů, nazývá se tato struktura jako hybridní. Je-li molekulární sonda stabilně připojena k cílové DNA, pak tato DNA nese komplementární informaci k sekvenci nukleotidů v sondě.

3.1.2. Hybridizační podmínky Nejdůležitějším faktorem specificity hybridizace je teplota, za níž probíhá. Když je teplota příliš nízká, tak bude sonda vytvářet dvojitou šroubovici s oblastmi, které nejsou přesně komplementární (tzv. nízká stringence). To ovšem vede k nesprávným závěrům. Při příliš vysoké teplotě i přesně komplementární řetězce nemusí setrvat v dvoušroubovici, a tak budou výsledky opět zavádějící. Běžně se zjišťuje vhodná hybridizační teplota empiricky. Existuje však řada algoritmů pro její odhad. Významnou úlohu hraje také koncentrace solí v hybridizačním roztoku. Všeobecně platí, že zvyšující se koncentrace snižuje přesnost. Pak je zapotřebí vyšší teplota, aby byla udržena obdobná přesnost komplementarity. Koncentrace sondy a cílové (zkoumané) nukleové kyseliny má vliv na dobu potřebnou pro průběh hybridizace. Při vyšších koncentracích proběhne reakce rychleji, ale, když jsou koncentrace příliš vysoké, dochází k samovolné hybridizaci sondy nebo cílové DNA, a tím se snižuje citlivost. Všeobecně platí, že reakce, při kterých se využívá syntetických oligonuklotidových sond, mohou probíhat rychleji než reakce, při kterých se využívají dlouhé sondy, protože se mohou využít vyšší koncentrace kratších sond, které mají i vyšší stupeň difúze v reakčním roztoku.

3.1.3. Způsoby hybridizace Hybridizaci je možné provádět několika způsoby (obr. 1). Minimální požadavky pro využití jsou, že (1) cílová DNA je v takovém stavu, aby mohly reakce proběhnout, a může být hybridizována a (2) hybridizovaný komplex sonda – cílová DNA může být identifikována.

Obr. 1 Možnosti využívání sond (podle Šmardy et al. 2005) Jednou z možností je použití pevného nosiče pro připojení buď cílové DNA nebo sondy, tak se vytvoří podmínky pro snadné odstranění nehybridizovaných komponentů před detekcí. K těmto postupům patří hybridizace kolonií (obr. 2), která zahrnuje přenos kolonií z agarového média na mebránu. Pak jsou buňky lyzovány a uvolněná DNA denaturována a fixována na tuto membránu. Sonda se hybridizuje s imobilizovanou cílovou DNA a volné, označené sondy jsou odstraněny odmytím. Kolonie, které obsahují cílovou DNA, se identifikují pomocí odpovídajících skvrn na membráně. Jako membrány se používají nitrocelulozové filtry, filtrační papír Whatman 541 a nylonové membrány. Podle použité membrány je pak určitým způsobem DNA připojena k jejímu povrchu – imobilizována (vysokou teplotou, sušením na vzduchu,

Obr. 2 Hybridizace kolonií pro vyhledání klonu obsahující specifický fragment DNA (Šmarda et al. 2005)

UV zářením). Pozornost se musí též věnovat odstranění případných nečistot z povrchu membrány před dalšími kroky, aby došlo ke snížení signálu pozadí zvláště u sond označených digoxigeninem. Hybridizace kolonií nemusí být dostatečně citlivá pro detekci patogenních mikroorganismů v potravinách, když je výskyt patogena příliš nízký na to, aby byl zjištěn pomocí přímého roztěru, když je přítomno velké množství jiné nepatogenní mikroflóry (obvykle více než 106 až 107 buněk na gram vzorku) nebo když se cílové geny nacházejí na plazmidech, které mohou být ztraceny během předcházejících kroků. Jinou metodou používající cílovou DNA imobilizovanou na pevném nosiči je tečková (kapková) hybridizace (dot plot) lyzovaných a denaturovaných buněk ze suspenze nebo amplifikovaného produktu PCR. Při využití Southernova přenosu jsou specifické fragmenty odděleny gelovou elektroforézou, denaturovány a fixovány na membránu (Southern blot). V některé způsoby hybridizace využívají toho, že je jeden druh sondy fixován na pevný povrch, jako např. dno titrační jamky, vychytává denaturované cílové DNA. Výrobky Gene-Track® pro detekci listerií nebo salmonel využívají detekční tyčinku potaženou vychytávací sondou komplementární ke specifické oblasti genu kódujícímu 16 rRNA z lyzované buněčné suspenze. Protože cílový produkt je přítomen v jedné buňce v mnoha kopiích, citlivost tohoto testu je větší, než je u testů specifických jen ke genům přítomných v buňce v jedné kopii. Tato zvýšená citlivost umožnila vývoj

kolorimetrického detekčního systému ekvivalentního k testům využívajících izotopy. Druhá

sonda,

reportérová

sonda,

značena

fluoresceinisothiokyanatem

(FTIC)

hybridizuje se zachycenou cílovou DNA a je detekována chromogenními metodami. Byly vyvinut i hybridizační postupy, kde jsou všechny složky v roztoku. Jeden z těchto postupů využívá dvou sond (každá nich má svoje označení), které se musí dostat do vzájemné blízkosti, aby mohly emitovat signál. Tato dvě označení sond budou v potřebném vzájemném postavení jen tehdy, když jsou obě sondy vázány na cílovou DNA. Hybridizační reakce může být tedy sledována v reálném čase, přičemž na pozorování nemají žádný vliv nenavázané sondy. Jiný postup, který už je nyní k dispozicí jako komerční kit (AccuProbe Listeria monocytogenes), využívá rRNA cílového organismu. rRNA je uvolněna z buněk, takže může vytvořit stabilní hybridizační

produkt

RNA

se

sondou

DNA

označenou

esterem

akridinia.

Nehybridizované sondy jsou selektivně deaktivovány diferenciální hydrolýzou. Přidání zásaditého roztoku hydroxidu vodíku umožňuje detekci a kvantifikaci světelné emise z esterů akridinia, které jsou chráněny vazbou k hybridní molekule DNA:RNA (Ninet et al. 1992).

3.1.4. Značení molekulárních sond Ze začátku se molekulární sondy pro nutné citlivosti označovaly obvykle izotopem fosforu

32

P. Detekce se pak prováděla pomocí autoradiografie nebo pomocí

Geiger-Müllerova přístroje. Využívání radioizotopu neumožňovalo široké zavedení těchto technik pro rutinní testování. Poté se začaly uplatňovat neisotopické sondy, které mají stabilitu po dlouhou dobu (1 až 2 roky). Mnoho neisotopických reportérových molekul je využíváno v komerčně dostupných kitech. Nevýhodou může být snižování citlivosti těchto sond způsobené přítomností různých látek přítomných v buňce. Neradioaktivní indikátorové systémy se mohu využívat pro přímou nebo nepřímou

detekci.

V systémech

využívajících

přímou

detekci

se

připravují

bifunkcionální konjugáty, ve kterých je oligo- nebo polynukleotidová sonda kovalentně vázána s molekulou vytvářející potřebný signál. Výhodou tohoto způsobu je, že pro detekci je zapotřebí pouze reakce, avšak reportérová molekula si musí udržet svoji aktivitu po celou dobu hybridizace. V nepřímých systémech se váže k sondě určitá modifikovaná skupina. Po provedení hybridizace se využije pro detekci hybridizované

sondy molekula, která rozpoznává modifikovanou skupinu a zároveň je kovalentně spojena s reportérovou molekulou, která generuje signál. V systémech, které využívají neradioaktivně značené sondy a které jsou uplatňované při detekci patogenů v potravinách a produktech reakci PCR, se nejčastěji používá biotin nebo digoxigenin. Pro přímou detekci se vyžívá také přímé navázání peroxidasy nebo alkalické fosfatasy k sondě. Výběr neradioaktivního označení závisí, zda je sondou dlouhý klonovaný fragment (100 – 1000 bp) nebo krátký oligonukleotid, zda se jako sonda využívá DNA nebo RNA a použitý hybridizační postup. Sondy se připravují různými metodami např. metodou prodlužování primerů s využitím náhodný primerů, metodou posunu jednořetězcového zlomu (nick translation), metodou koncového značení 3´-konců oligonukleotidů (za oligonukleotidové sondy se obvykle považují sondy o délce 50 bp nebo i méně), metodou koncového značení 5´-konců oligonukleotidů, metodou značení transkripcí in vitro, metodou značení DNA pomocí PCR, metodou přípravy peptidové nukleové kyseliny (PNA), metodou značení pomocí fotoaktivace anebo metodou jiných neenzymatických značení (srov. Hill a Jinneman 2000, Šmarda et al. 2005).

3.2. Základní principy polymerasové řetězové reakce (PCR) PCR je metodou pro amplifikaci určitého úseku DNA. Tento úsek je vymezen párem specifických oligonukleotidů, které zároveň slouží jako primer pro polymerasu, pomocí které probíhá replikace DNA (obr. 3). Templátová DNA se zahřátím denaturuje, po zchlazení se na uvolněné řetězce přichytí v příslušných místech primery (jsou v reakčním roztoku přítomny v koncentraci asi 109 vyšší než templát) a po té se syntetizuje druhý řetězec. Pro přesnost navázání primerů je kritická teplota reakční směsi. To rozhoduje o specifitě amplifikační reakce. Další, třetí teplota je obvykle potřebná pro vznik komplementárních úseků (prodlužování primeru). Ta musí být optimální pro funkci DNA polymerasy. Nově syntetizované řetězce DNA slouží jako templáty pro další replikaci, takže množství DNA se teoreticky v každém cyklu zvyšuje dvakrát. V průběhu druhého cyklu vznikají řetězce, které končí sekvencemi primeru. Počty molekul s těmito konci rostou v každém dalším cyklu, a tak se stávají převládajícím produktem (obr. 4).

Obr. 3 Počátek polymerasové řetězové reakce Na základě znalosti sekvence DNA, která bude amplifikována, jsou nasyntetizovány dva primery. Každý z nich je komplementární k jednomu konci požadované sekvence. Začíná se s dvouřetězcovou DNA. V prvním kroku se od sebe oba řetězce oddělí krátkým zvýšením teploty na 94°C. V druhém kroku se sníží teplota na 54°C. V tomto okamžiku na rozdělené řetězce nasedají oba druhy primerů. Na obrázku jsou označeny jako krátké červené a zelené značky. Ve třetím kroku se z těchto míst pomocí polymerasy syntetizují komplementární řetězce, které jsou na obrázku označeny červenými a zelenými proužky. Další cyklus je pak znovu zahájen oddělením dvojřetězců zvýšenou teplotou.

Tyto molekuly jsou detekovány a jejich množství kvantifikováno pomocí gelové elektroforézy, po níž následuje barvení etidiumbromidem, osvětlení UV zářením, kolorimetrickou reakcí nebo chemiluminiscencí. Vysoké specifiky se u PCR dosahuje proto, že zahrnuje hybridizaci, která využívá dvě sondy, a amplifikace se uskutečňuje po hybridizaci opakované třicetkrát až čtyřicetkrát. Pro zvýšení využitelnosti a usnadnění práce byl celý proces automatizován. Rozhodující pro to bylo využití termostabilní DNA polymerasy izolované

z termofilního mikroorganismu Thermus aquaticus (Taq DNA polymerace), která zůstává funkční i při teplotách, při kterých DNA denaturuje.

Obr. 4 Průběh polymerasové řetězové reakce Produktem tří cyklů je 16 jednoduchých řetězců DNA, z nichž 8 má požadovanou délku (na obrázku jsou očíslovány). Z těchto 8 řetězců budou v dalších cyklech vznikat pouze jejich přesné kopie (oba konce jsou ohraničeny primery). 6 řetězců má ohraničen pouze jeden konec, a proto z nich v dalších cyklech mohou vznikat buď jejich kopie, anebo požadované kratší řetězce, v závislosti na tom, který z primerů se k nim připojí. Zbývají dva původní dlouhé řetězce, z nichž vznikají řetězce s jedním ohraničením.

Všechny komponenty potřebné pro analýzy PCR jsou nyní dostupné komerčně tj. potřebné

pufry,

čtyři

deoxynukleotidy

(deoxyadenosintrifosfát

–

dATP,

deoxythymosintrifosfát – dTTP, deoxycytosinsintrifosfát – DTP, deoxyguanosintrifosfát – dGTP) a několik termostabilních DNA polymeras. Oligonukleotidové primery specifické pro vybranou cílovou sekvenci mohou být připraveny komerčně podle specifikace

zákazníka.

Kombinace

jednotlivých

komponentů

PCR

dovoluje

optimalizaci systému podle specifického zaměření. Už však existuje řada komerčně dostupných kitů. K dispozici jsou např. kit pro ampfikaci genových sekvencí specifických pro rod Salmonella z bohacených vzorků potravin jako tekuté nebo sušené mléko, kuřecí, krůtí, hovězí a vepřové maso (DuPot, Wilmngton, DE, USA). Kit je připraven tak, že obsahuje lyofilizované primery, polymerasu a nukleotidy v optimální koncentraci v reakčních zkumavkách. DNA z obohacených vzorků potravin je připravena pomocí lytického roztoku a přidána do uvedených zkumavek. Kontrolní vzorky obsahují DNA izolovanou z rodu Salmonella slouží pro detekci inhibitorů DNA. Amplifikovaný produkt je pak zviditelněn pomocí gelové elektroforézy (obr. 5). Nyní jsou dostupné obdobné kity pro detekci Escherichia coli O157 a druhy rodu Listeria např. L. monocytogenes.

Obr. 5

Agarozová gelová elektroforéza produktů PCR amplifikovaných z genomové DNA Salmonella spp. a jiných druhů bakterií. Byla použita sada primerů pro vnitřní oblast genu gatD, který kóduje galaktitol-1-fosfátdehydrogenasu /M označuje velikostní jednotky/ (Miyamoto et al. 1999)

3.2.1. Citlivost detekce Znalost citlivosti postupů určených k detekci a kvantifikaci mikroorganismů v potravinách je velmi důležitá. V tomto směru však ještě nebyly dosud zavedeny všeobecné standardy. K tomu je zapotřebí schválení Association of Official Analytical Chemists International nebo jeho ekvivalentu. Jeví se jako potřebné, aby citlivost byla vypočítávána jako počet bakteriálních buněk na 25 g vzorku. Nyní mnoho autorů uvádí citlivost v pikogramech DNA. Za účelem porovnávání by měly být tyto údaje přepočítány na počet mikroorganismů. Takovýto údaj má totiž význam bližší biologickém vyjádření. Jestliže většina bakterií má genom o velikosti genomu Escherichia coli (asi 5 fg), potom 1 pg DNA přestavuje asi 200 bakteriálních genomů, a 1 ng DNA zahrnuje 2 x 105 bakteriálních buněk (Hill a Jinneman 2000).

3.2.2. Přesnost detekce Při využívání metod založených na PCR nemusí být požadovaná vysoká přesnost. První určujícím krokem těchto postupů je to, zda má amplifikovaný produkt odpovídající délku. Při vývoji postupu se může genetická informace amplifikované sekvence verifikovat pomocí restrikčních endonukleas, další amplifikace pomocí odstupňované PCR (viz níže), hybridizace se sondou k oblasti uvnitř amplikonu nebo sekvenováním. Avšak v průběhu rutinního využívání testů se už další charakterizace amplifikované sekvence neprovádí. Pro klonování a nebo vytváření kolekcí sekvencí nukleotidů, sond či primerů, je však vysoká přesnost důležitější. Několik termostabilních enzymů má předpokládanou opravnou aktivitu (Pfu, Deet Vent, UITma) a snižuje množství chyb při replikaci. Přesnost replikace je ovlivněna několika faktory. Mezi ně patří inserce chybných nukleotidů, uplatnění 3´→ 5´ exonukleasy může vést k odstranění chyb a následně opravné prodloužení. U Taq polymerasy kolísá množství chyb od 1,1 x 10-4 až 2,1 x 10−5 (Lundberg et al. 1991). Delece N-konce tohoto enzymu snižuje množství chyb na asi 5,1 x 10-5. Tyto úrovně chyb jsou podstatně vyšší než se předpokládá pro replikaci in vivo. Proběhne-li 30 až 40 amplifikačních cyklů, může se akumulovat průkazně vysoké množství chyb. Jestliže se získají nejasné výsledky, doporučuje se, aby byly sekvence nukleotidů určeny z DNA, která byla amplifikována z několika odlišných vzorků odebraných ze základního materiálu. (Hill a Jinneman 2000).

3.2.3. Výběr primerů Už byly vyvinuty počítačové programy, které vyhledávají sekvence, které splňují požadovaná kriteria, ale konečný test vhodnosti primeru se stále určuje empiricky. Pro vývin vysoce specifických testů musí být sekvence primerů unikátní a musí být cílena k jediné oblasti (tab. 2). Předpokládané shody s jinými sekvencemi mohou být zjištěny z databází jako je GenBank nebo databáze, která je vedena Evropskou molekulárně biologickou laboratoří (EMBL). Ani tento přístup plně nezajišťuje, že oblast primeru je unikátní, ale poskytuje určitou jistotu, že daná sekvence primeru není obecná anebo že nemá takovou míru homologie s jinými Tab. 2

oblastmi, která by vedla až k její nespecifičnosti. Dalším velmi důležitým faktorem

je

denaturační

odhadovaná teplota

pro

komplex templátu a primeru a výběr vhodné teploty pro PCR. Opět

existují

příslušné

počítačové

programy,

pomohou

najít

s vhodnou

Tm

které

segmenty (denaturační)

nebo Td (disociační) teplotou. Tyto programy obvykle zjišťují případnou

vnitřní

komple-

mentaritu

primerů

(tvorbu

vlásenek) a komplementaritu mezi páry primerů, aby se snížila

tvorba

primerových

dimerů. Primery, které obsahují na konci více párů GC podle všeho vytvářejí stabilnější místa pro iniciaci polymerizace, avšak tří a více bází G a C za sebou na konci 3´ může způsobovat nespecifické připojování primerů. V úvahu by se měla též brát sekvence primerů, charakteristika aplifikované oblasti jako je její délka nebo místa pro působení restrikčních endonukleas.

3.2.4. Optimalizace reakčních podmínek Základní PCR je poměrně jednoduchá, avšak řada parametrů má výrazný vliv na její specificitu a efektivitu. Mezi ně patří koncentrace dvojmocných iontů v reakčním roztoku a jeho pH, sekvence primeru a jeho koncentrace, hybridizační přesnost ovlivněná teplotou, počtem cyklů replikace, trváním cyklů prodlužování a velikost amplifikovaných fragmentů. Teplota a koncentrace soli v roztoku ovlivňují hybridizační přesnost. Jestliže je teplota příliš nízká, je hybridizační přesnost snížena, primery se mohou připojovat na nespecifická místa, a tak jsou amplifikovány různé oblasti. Teplota je tak důležitá obzvláště v průběhu počátečních replikačních cyklů. V některých případech se pro minimalizaci chybného navazování primerů polymerasa odděluje od ostatních součástí reakční směsi pomocí vosku. Toto oddělení zamezuje prodlužování při nižší teplotě, protože vosk se rozpustí teprve při denaturaci. Teprve tehdy se polymerasa stává součástí reakční směsi. Další postup, který zamezuje nespecifickému navazování primerů (priming) využívá toho, že iniciální teplota je o něco vyšší, než je potřebné pro navazování primerů. Pak je teplota při každém dalším cyklu postupně snižována, dokud se nevytvoří produkt. Zahřívání před amplifikací může také zvýšit specifitu reakce. Udržování vyšší teploty snižuje též tvorbu primerových dimeru. To je důležité zejména proto, že koncentrace primerů by měla zůstat vysoká ve srovnání s koncentrací templátu. Předamplifikační zahřátí může tedy zlepšit vyšší přesnost navazování primerů v průběhu prvního cyklu elongace. Jestliže je amplifikována oblast DNA kratší, nižší denaturační teplota může zvýšit množství získaného produktu. Existují postupy pro výpočet optimálních, především počátečních, teplot PCR. I když algoritmy pro odhad počátečních teplot poskytují určité informace, empiricky získané výsledky mají pro výběr parametrů větší důležitost (srov. Hill a Jinneman 2000). PCR je také ovlivněno koncentrací dvoumocných iontů v reakční směsi. Pro každou kombinaci primerů by se měla optimalizovat koncentrace iontů hořčíku pro zvýšení přesnosti nasedání primerů a výtěžnost amplifikace. Pro většinu primerů je optimální koncentrace MgCl2 v rozmezí 1 až 6 mmol.l-1. Artefakty způsobené koncentrací dvojmocných iontů sahají od absence jakéhokoli produktu až po vytváření četných amplifikovaných sekvencí. Koncentrace templátu může mít také významný vliv. Jestliže je příliš vysoká, velké množství kopií o různé délce, které vznikají, vychytávají

prekursory, a tak není efektivně replikována cílová oblast. To vede k tomu, že vznikají chybné negativní výsledky nebo šmouha na gelu po provedení elektroforézy. Zvýšený počet cyklů může být také příčinou tvorby molekul o různé délce, a tím snižování množství specifických produktů.

3.2.5. Zamezení kontaminací Ukončené amplifikační reakce mohou obsahovat miliony kopií molekul, které mají komplementární primery na svých koncích. Protože jediná oblast templátové DNA může být zmnožena milionkrát, produkty PCR musí být považovány za něco jako infekční agens, která mohou „kontaminovat“ další reakce. Je tedy důležité zajistit, aby tato situace nenastala. Je proto vhodné oddělit místo, kde probíhá reakce, od místa, kde dochází k analýze amplifikovaného materiálu. Důležité je též pečlivé omývání veškerého zařízení. Vhodné je též užívat špičky pipet, které omezují tvorbu aerosolů (mají hroty s aerosolovou barierou). Opatrně se musí zacházet se všemi roztoky v každé fázi analýzy. Další možností je aplikace ultrafialového záření na pracovní místa. To spojuje oba řetězce DNA, a tak se zamezí její další replikaci. Jinou vhodnou metodou k zamezení přenášení amplifikovovaných produktů do dalších reakcí je inkorporace uracilu. Po aplikaci uracil-DNA-glykosylasy dojde ke štěpení DNA obsahující uracil a tím k terminaci reakce (Longo et al. 1990). Enzym je pak inaktivován zahřátím před amplifikací. Další metodou pro inaktivaci amplifikvoaných produktů a eliminaci přenosu kontaminací je spojování produktů vzniklých v průběhu PCR pomocí isopsoralenu, aplikace N-glykosylasy na produkty obsahující deoxyuridin a hydrolýza produktů PCR inkorporací primerů obsahujících 3´ ribosu. Všechny tyto metody jsou přibližně stejně účinné, přičemž inaktivují 104 - 109 kopií amplifikovaného produktu (Rys a Persing 1993).

3.3.Varianty a modifikace PCR Někdy je třeba amplifikovat templáty, kterých je jen velmi málo, detekovat sekvenční polymorfismy, provádět molekulární identifikaci nebo typizaci organismů či sledovat jemné změny sekvencí nukleových kyselin. K řešení těchto problémů byla vyvinuta široká škála různých variant PCR. Tyto varianty se liší použitím dalších enzymatických

reakcí

kromě

amplifikace

Taq

DNA-polymerasou,

použitím

specifických sekvencí primerů, přísností podmínek pro amplifikaci a způsoby detekce produktů PCR. Některé z těchto postupů nacházejí uplatnění při studiu DNA všech organismů. Některé jsou využívány více u eukaryontních jiné u prokaryntních organismů. Jsou i tak specializované postupy, že se dají využít pouze u jedné ze těchto dvou skupin. V následujícím textu je věnována pozornost především těm variantám PCR, které se využívají při sledování bakterií. Pro ucelenější představu o celé problematice jsou však stručně popsány i postupy, které se uplatňují převážně u eukaryont. Řada metodických postupů, zcela totožných nebo lišících se v detailech, byla vytvořena na různých pracovištích. To vedlo k vytvoření různých názvů pro tentýž postup. V tomto textu bylo využito názvu a jejich synonym (včetně mezinárodně přijímaných zkratek) tak, jak je uvádějí Šmarda et al. (2005).

3.3.1. Stanovení polymorfismu délky restrikčních fragmentů produktů PCR (PCR− −RFLP) Je to modifikace standardní PCR sloužící pro typizaci cílové sekvence, obvykle určitého genu, který obsahuje sekvenční polymorfismus. Tato sekvence dosahující až 5 kb se amplifikuje za přísných podmínek pomocí primerů, které se připojují ke koncovým konzervovaným oblastem. Výsledkem amplifikace jsou produkty o stejné délce, které se detekují elektroforézou v agarozovém nebo polyakrylovém gelu. Tyto produkty jsou štěpeny restrikční endonukleasou, a pak zase analyzovány elektroforézou v agarozovém nebo polyakrylovém gelu. Vzorky jsou typizovány restrikčními spektry fragmentů amplifikované DNA (Šmarda et al. 2005). Analýza PCR-RFLP se využívá při molekulární typizaci u prokaryotických genů pro 16S rRNA (obr. 6). Používají se univerzální primery, které jsou komplementární k sekvencím na koncích genu pro 16S rRNA. Dochází k amplifikaci celého genu, jehož velikost je asi 1 600 bp. Po aplikaci vhodné restrikční endonukleasy se získá spektrum několika (až 8) fragmentů. Jejich počet a velikost se liší podle bakteriálního druhu nebo kmene (Šmarda et al. 2005).

3.3.2. Mnohonásobná PCR (multiplex PCR) U této varianty PCR se do reakční směsi přidává několik párů primerů rozpoznávajících několik rozdílných cílových sekvencí. To umožňuje detekci několika genů současně v jedné

reakční směsi. Reakční podmínky pro současnou amplifikaci všech produktů je nutno empiricky optimalizovat. Hlavní výhodou této varianty jsou nižší cenové náklady než při samostatných amplifikacích, a proto se používá pro vyhledávání změn na dlouhých úsecích DNA, testování vzájemně nesouvisejících oblastí na DNA a zejména pro amplifikaci vnitřních kontrol současně se vzorky (Šmarda et al. 2005).

Obr. 6 Typizace genu pro 16S rRNA pomocí metody PCR-RFLP (Šmarda et al. 2005)

3.3.3. Odstupňovaná PCR neboli PCR využívající vnějších a vnitřních primerů (nested PCR) Tato metoda umožňuje detekovat i jedinou molekulu templátové DNA. Amplifikace se obvykle provádí ve dvou krocích. První amplifikační krok zahrnuje 15─30 cyklů s jedním párem tzv. vnějších primerů. Vznikající produkt se využije ve druhém amplifikačním kroku pomocí páru tzv. vnitřních primerů, které jsou

specifické pro vnitřní část sekvence amplifikované s párem vnějších primerů. Po 15-30 cyklech a ukončení reakce se produkt detekuje elektroforézou. Přenos amplifíkačních produktů z první reakce do druhé umožňuje naředění inhibitorů, které mohly být přítomny v původním vzorku, ale přináší s sebou i možnost kontaminace. První a druhý krok se provádí odděleně, ve dvou různých zkumavkách, ale byly vytvořeny i protokoly zahrnující různé přístupy pro provedení reakce v jedné zkumavce, kdy je obsah prvního amplifikačního kroku oddělen od obsahu druhého amplifikačního kroku silnou přepážkou např. z minerálního oleje, po první amplifikaci jsou reakční komponenty smíchány a obsah je amplifikován znovu. Výhodnější je navrhnout páry vnějších a vnitřních primerů tak, že se podstatně liší teplotou Tm. První amplifikace s párem vnějších primerů probíhá při málo přísných podmínkách (nízká teplota pro hybridizaci primerů) s 10-15 cykly. Vzniklá směs produktů jak vnitřních tak i vnějších primerů, tak jejich kombinace je následně podrobena druhé amplifikaci zahrnující 15−30 cyklů při přísných podmínkách (optimální teplota pro hybridizaci primerů) pro vnitřní primery, jejichž konce jsou často bohaté na báze G+C, a tak upřednostňují amplifikaci vnitřního produktu. Ten je pak detekován elektroforézou.

3.3.4. PCR kolonií Do připravené reakční směsi obsahující všechny potřebné složky se přenese část bakteriální kolonie. Zbytek bakteriální kolonie se uchová pro případnou další potřebu. Amplifíkace probíhá na začátku s nižší teplotou pro připojení primeru (např. 45°C) a pokračuje jejím postupným zvyšováním o 1 až 2°C v následujících cyklech až na optimální teplotu.

3.3.5. Obrácená neboli inverzní PCR (IPCR) Další variantou PCR je inverzní PCR. Ta umožňuje amplifikovat úseky DNA o neznámé sekvenci ohraničené na obou stranách úseky se známou sekvencí. Primery pro inverzní PCR jsou navrženy na koncích známé sekvence tak, že jejich 3'-konce směřují od sebe a mají mezi sebou restrikční místo (B) o délce 6 bp. Nejdříve je genomová DNA štěpena vhodnou restrikční endonukleasou (A) s rozpoznávacím místem o 4 bp tak, aby délka restrikčních fragmentů byla vhodná pro PCR. Poté se T4 DNA-ligasou provede ligace. Tím dojde je cirkularizaci restrikčních fragmentů.

Kružnicové DNA obsahující známou sekvenci se potom linearizují štěpením v restrikčním místě B. Tak vznikají fragmenty, v nichž se cílová sekvence nachází mezi zbytky původní známé sekvence na obou koncích každého fragmentu. Neznámá sekvence je pak amplifikována.

3.3.6. Modifikace konců DNA prostřednictvím 5'-konců primerů Primery pro PCR mohou být navrženy tak, že kromě sekvence požadované pro hybridizaci s cílovou DNA obsahují navíc další sekvenci adaptoru na svém 5'-konci (lepivý konec). Tato sekvence se neúčastní prvního hybridizačního kroku, kdy hybridizuje pouze 3'-konec primeru, ale následně se stává součástí amplifikovaného fragmentu DNA, kde poskytuje široké možnosti pro modifikaci konců DNA, které pak umožňují další možnosti využití.

3.3.7. Alelově specifická PCR (AS-PCR) Tato modifikace PCR se využívá pro detekci bodových mutací v genomech. Provádí se ve dvou nebo více paralelních reakcích. V prvním kroku je jeden primer komplementární ke standardní sekvenci a v dalším kroku k mutantní nebo polymorfní sekvenci. Druhý primer je v obou reakcích stejný. Předpokladem je, že k elongaci dochází jen v tom případě, když jsou primer a cílová sekvence plně komplementární. Při homozygotním stavu proběhne amplifikace jen v jedné z reakcí. Metoda byla popsána nezávisle pod různými označeními. Podle různých detailních přístupů se nazývá amplifikaci nedostupný mutační systém (ARMS), PCR−amplifikace specifických alel (PASA) či alelově specifická amplifikace (ASA). Při poněkud jiném postupu se nazývá kompetitivní připojení oligonukleotidů (COP). Pro snažší odlišení heterozygotního stavu v jediné reakci je používána varianta označovaná jako PCR-amplifikace více specifických ale (PAMSA) nebo také dvojitý ARMS. AS-PCR se používá pro rozlišení homozygotního a heterozygotního stavu v nejrůznějších klinických aplikacích.

3.3.8. Zpětná PCR (RT-PCR) RT-PCR slouží k amplifikaci molekul RNA. RNA nemůže být jako templát pro PCR, a proto se produkty tvoří pouze tehdy, jestliže je RNA nejdříve po izolaci převedena do cDNA retrovirovou zpětnou transkriptasou (např. zpětnou transkriptasou viru M-MuLV nebo AMV) a následně amplifikována pomocí PCR se dvěma specifickými primery standardním postupem. Nevýhodou zpětné transkriptasy je její termolabilita (ztrácí funkčnost už při teplotách nad 42°C), a proto je stringence zpětné transkripce RNA na cDNA relativně nízká. V některých případech není RNA do cDNA možný. Výhodou je snadná syntéza dlouhých produktů o délce až 14 kb. Současné době se však využívá v RT-PCR termostabilní Tth DNA-polymerasa, která

má

za

přítomnosti

iontů

dvojmocného

manganu

RNA-dependentní

DNA-polymerasovou aktivitu a která je tak schopná specificky převést sekvenci RNA do cDNA při teplotě 72°C. Stejný enzym se pak účastní PCR. Pro zahájení RT-PCR se využívá jako jeden z primerů oligo(dT)-primer, který rozeznává poly(A)-konec mRNA nebo náhodné hexanukleotidy v případě, že mRNA není polyadenylována. RT-PCR má celou řadu dalších modifikací sloužících k řešení specifických otázek týkajících se především exprese genů a diagnostiky jména RNA virů.

3.3.9. Rychlá amplifikace konců cDNA (RACE) K usnadnění klonování cDNA o úplné délce se pomocí RACE amplifikují kratší úseky od obou konců, přičemž před tím byla stanovena část sekvence cDNA pomocí jiných metod. Pomocí RACE je možno stanovit kompletní sekvenci cDNA v průběhu několika dnů.

3.3.10. Asymetrická PCR Produkt PCR může být sekvenován obdobně jako každá molekula DNA. Optimálním templátem pro Sangerovu metodu sekvenování jsou ssDNA, a proto byla pro jejich přípravu vyvinuta speciální technika známá pod názvem asymetrická PCR, při níž jsou tvořeny preferenčně ssDNA. To umožněno tím, že výchozí koncentrace jednoho primerů je stonásobně vyšší než koncentrace druhého primeru. Dvouřetězcové fragmenty DNA se tvoří až do okamžiku, kdy se primerů v nižší koncentraci spotřebuje. Druhý

primer pak dále syntetizuje pouze jeden z řetězců. I když se tento řetězec nižší rychlostí je množství získaného produktu postačující pro sekvenování. Asymetrická PCR může být prováděna i pouze s jedním primerem.

3.3.11. PCR s degenerovanými oligonukleotidovými primery (DOP-PCR) Tato metoda se používá pro uniformní náhodnou amplifikaci DNA. Takovýto postup může být vhodný, pokud je k dispozici jen malé množství vzorku DNA. Degenerované oligonukleotidové primery (DOP) mají definované sekvence na 5'- a 3'─koncích, které ohraničují náhodnou hexamerovou sekvenci. Tato hexamerová sekvence zahrnuje všechny možné kombinace přirozených nukleotidů: A, G, C a T. DOP se připojují při nízké stringenci k denaturované templátové DNA a hybridizují k příslušným vazebným místům primeru. Vzdálenost vazby primerů může být určována délkou definované sekvence na 3'-konci a přísností podmínek amplifikace. DOP tak skýtají univerzální metodu pro uniformní amplífikaci zejména DNA přítomné ve velmi nízké koncentraci nebo krátkých molekul DNA. V počátečních cyklech DOP-PCR probíhá připojení při nízké stringenci. Dalších cykly probíhají při vyšší stringenci (za vyšší připojovací teploty). Za těchto přísnějších podmínek se materiál vytvořený při prvních cyklech amplifikuje preferenčně, protože obsahuje kompletní primerovou sekvenci na obou koncích. Jinde DOP při přísnějších podmínkách neváže. Amplifikace DOP-PCR vede ke vzniku spektra různě dlouhých fragmentů DNA. Využití DOP-PCR zvyšuje účinnost navazujících postupů. Těch je celá řada (klonováni, značení, hybridizační reakce). U mikroorganismů se uplatňuje při přípravě fragmentů DNA frakcionovaných podle velikosti a zejména při analýze nebo klonování stopových množství DNA nebo DNA z nekultivovatelných druhů.

3.3.12. Degenerovaná PCR (D-PCR) Tato modifikace PCR se vyžívá pro získání sekvencí cDNA na základě omezených znalostí pořadí aminokyselin v dané bílkovině. Primery jsou odvozovány z pořadí aminokyselin úseku proteinu, což je zpravidla 6 až 9 kodonů. Získá se tak směs primerů s různým stupněm degenerace (kromě kodonů pro metionin a tryptofan). Důležitý je výběr optimální sekvence primerů, na jehož základě je syntetizována současně směs všech variant sekvence reprezentující všechny možné aminokyselinové

kombinace degenerované sekvence. D-PCR se úspěšně používá pro vyhledání sekvence DNA na základě sekvence aminokyselin stanovené u proteinu, vyhledání a klonování homologických genů, hledání a studium genových rodin s určitou strukturní podobností, fylogenetické a evoluční studie využívající srovnávání genů.

3.3.13. In situ PCR Vybrané sekvence DNA je možné pomocí PCR lokalizovat i uvnitř buněk, a tak korelovat její výskyt se specifickým typem buněk a jejich početním zastoupením mezi buňkami jinými, vyskytujícími se v tomtéž prostředí. Obdobně je tomu při hybridizaci in situ (ISH). In situ PCR má však daleko vyšší citlivost. Pomocí této metody je možné sledovat výskyt i jedinečných kopií genů. Principem in situ PCR je amplifikace specifické sekvence DNA v buňce, čímž se zvýší počet jejich kopií natolik, že jsou snadno detekovatelné buď pomocí ISH (označované též jako PCR-ISH, vnitrobuněčná PCR nebo PCR řízená ISH či nepřímá in situ PCR), přímou detekcí značených nukleotidů inkorporovaných do produktu PCR během amplifikace (přímá in situ PCR) nebo imunochemicky. Metodický postup zahrnuje fixaci buněk, tkání či pletiv, čímž je zachována jejich vnitřní a vnější struktura. Důležitým krokem je permeabilizace zaručující přístup všech komponentů PCR k vnitrobuněčným DNA. Při sledování mikroorganismů se uplatňují především buněčné suspenze. Fixované a permeabilizované buňky se resuspendují v reakční směsi pro PCR, která pak probíhá normálním způsobem. Membránové struktury buňky dostatečně brání difúzi vznikajících produktů. Po ukončení reakce se provádí jejich vizualizace (viz výše). Ve srovnání s klasickou PCR má in situ PCR značně nižší účinnost.

3.3.14. Amplifikace vnitřních přepisovaných mezerníků (ITS-PCR) PCR-ribotypizace Vnitřní přepisované mezerníky (ITS) jsou sekvence uvnitř transkripčních jednotek mezi geny pro funkční molekuly RNA (rRNA nebo tRNA) a jejich transkripty se v rámci posttranskripčních úprav vyštěpují za tvorby funkčních rRNA z pre-rRNA nebo tRNA z pre-tRNA.

Polymorfismus délky ITS nachází využití v detekci prokaryotických organismů. Vychází se z rozdílných vzdáleností mezi opakujícími se konzervovanými geny pro rRNA nebo tRNA u jednotlivých druhů. Geny eubaktérií pro funkční RNA obsahují sekvenční motivy, které jsou vysoce konzervativní. Proto mohou být navrženy univerzální genové primery ke sledování počtu polymorfismu délky přepisovaných mezerníků. Jednotlivé druhy se rozliší na základě různé velikosti a různého množství vzniklých PCR-produktů. V praxi se nejčastěji používá PCR vnitřních ríbozomálních mezerníků (RS-PCR), která vychází z vysoce polymorfní povahy mezerníkových sekvencí 16S-23S. RS-PCR může detekovat významný stupeň délkových a sekvenčních polymorfismů na úrovní rodu i druhu a je často používána pro detekci druhů i vnitrodruhových jednotek. Tento rychlý vysoce reprodukovatelný a spolehlivý postup se označuje rovněž jako PCR-ribotypizace.

3.3.15. Náhodná PCR (AP-PCR) neboli náhodná amplifikace polymorfní DNA (RAPD) AP-PCR, popsaná nezávisle také pod označeními DAF a MAAP, představuje rychlou a jednoduchou techniku pro fingrprintink DNA. Tato technika je vhodná pro rychlou srovnávací typizaci genomových DNA mikroorganismů a některých rostlin. Technika používá jeden nebo více krátkých primerů o délce 8-12 nukleotidů o libovolné sekvenci s neznámou homologií k cílové sekvenci na zkoumané DNA. Podmínky pro připojení primeru nesmí být příliš přísné. Pak dochází k nasedání primeru s vysokou pravděpodobností na více místech na obou řetězcích DNA. Obvykle se vyskytne několik míst od sebe nepříliš vzdálených, a tak umožňujících připojení primerů na protilehlých řetězcích směřujícími 3'-konci k sobě. Výsledkem je amplifikace mnoha fragmentů s různou délkou (max. 2 000 bp) a rozdílným molárním množstvím, v závislostí na izolátu, ze kterého DNA pocházela. Použitelnost primerů může být zhodnocena pouze empiricky. Informace o sekvenci sledované DNA není nezbytná. Rozlišování vzorků dobře koreluje s jinými genotypizačními technikami. Přes svou vysokou účinnost jsou při AP-PCR problémy s reprodukovatelností a s nedostatkem shodných pravidel pro interpretaci výsledků. Metoda se v praxi používá pro identifikační postupy a taxonomické studie. Při tzv. binární typizaci mikroorganismů se využívají produkty AP-PCR pro přípravu hybridizačních sond. Genomová DNA se podrobí hybridizaci se sérií sond,

které jsou připraveny z jedinečných amplifikačních produktů AP-PCR, které diferencují bakteriální kmeny. Zavedením zpětné tečkové hybridizace s imobilizovanými sondami byl postup binární typizace technicky zjednodušen a zrychlen. Proběhlá hybridizace se sondou je zaznamenána hodnotou 1, neproběhlá hybridizace s toutéž sondou hodnotou 0. Binární kód je převeden do desítkové soustavy, toto číslo vyjadřuje binární typ. Tento genotypizační systém poskytuje jednoznačné, číselné popisy vzorků.

3.3.16. Interrepetitivní PCR (REP-PCR) Interrepetitivní (repetitivní) PCR je typizační technika pro analýzu celého bakteriálního nebo eukaryotického genomu využívající přítomnosti repetitivních elementů v těchto genomech. Pro zahájení amplifikace se využívají známé repetitivní sekvence (vyskytují se v genomu ve více kopiích - repetice, IS elementy, transpozony, nepřepisované mezerníky). Při amplifikaci vzniká více produktů různé velikosti, jejichž tvorba vychází z rozdílného umístění repeticí a z rozdílné vzdálenosti, která je odděluje v jednotlivých genomech. Vzniká tak jedinečný fingrprint. I když jsou amplifikovány pouze malé části chromozomu, pro získáni fingrprintu je třeba kompletní chromozomová DNA, podobně jako u AP-PCR. Primery jsou navrhovány tak, aby se připojovaly přímo ke koncovým, konzervativním oblastem repeticí a 3'-konce primeru směřovaly směrem ven z repetitívniho elementu tak, aby se neamplifikovala samotná repetice. K amplifikaci dojde pouze tehdy, když se sekvence nacházejí v genomu v obrácené orientaci a ve vzdálenosti vhodné pro amplifikaci. Při návrhu univerzálních primerů použitelných pro více genomu je třeba navrhnout konsenzní sekvenci primeru a zvolit nižší teplotu pro jeho připojení. K

nejčastěji

používaným

repetitivním

elementům

používaným

při

interrepetitivní PCR u prokaryot pro účely genotypizace patří opakující se extragenové palindromové Rep-elementy Escherichia coli, enterobakteriální opakující se intergenové shodné sekvence (ERIC-sekvence), dlouhé roztroušené repetitivni elementy RepMP3 z Mycoplasma pneumoniae, mozaikové repetitivní BOX-elementy z Streptococcus pneumonie a tandemově opakované polynukleotidové sekvence (GTG)n popsané u enterobakterií. Podle typu repetitivní sekvence použité pro připojení příměrů se metoda specificky označuje označení (např. ERIC-PCR nebo BOX-PCR). Jako vylepšení metody interrepetitivní PCR je považována fluoroforem zdokonalená interrepetitivní PCR (FERP). Používá primerů značených na 5'-konci

fluorescenční látkou. Produkty PCR se rozdělují v nedenaturujícím polyakrylamidovém gelu. Další obměnou je automatická laserová fluorescenční analýza (ALFA), při které se rovněž používají 5'-koncově fluorescenčně značené PCR-primery. Produkty PCR jsou rozděleny v denaturujicím polyakrylamidovém gelu na automatizovaném sekvenátoru, což značně zlepšuje rozlišení a reprodukovatelnost.

3.3.17. Polymorfismus délky amplifikovaných fragmentů (AFLP) AFLP slouží k charakterizaci celkové genomové DNA. Poskytuje vysoké rozlišení a dobrou reprodukovatelnost. Označuje se rovněž jako amplifikace vzácných restrikčních míst (IRS-PCR) nebo selektivní amplifikace restrikčních fragmentů DNA podmíněná primerem (SRFA). Metoda zahrnuje čtyři základní kroky: rozštěpení extrémně malého množství genomové DNA jednou nebo dvěma restrikčními endonukleasami, z nichž jedna mívá zpravidla méně cílových míst; ligaci fragmentů genomové DNA s oligonukleotidovými adaptory, které jsou navrženy tak, aby nedocházelo k obnově restrikčního místa (ligace probíhá za přítomnosti restriktas, takže nedochází ke spojování restrikčních fragmentů); selektivní amplifikaci sady restrikčních fragmentů pomocí jednoho nebo dvou selektivních AFLP-primerů; gelovou elektroforézu amplífikovaných fragmentů v nedenaturujícím polyakrylamidovém gelu (obr. 7). Pomocí AFLP je možno vizualizovat sadu restrikčních fragmentů pomocí PCR bez znalosti jejich nukleotidové sekvence. Amplifikace těchto fragmentů je dosaženo použitím sekvencí adaptoru a zbytku restrikčního místa, které slouží jako cílová místa pro připojeni primerů. Je nutné, aby došlo k selektivnímu výběru pouze malé části z velkého počtu až desetitisíců fragmentů vytvořených štěpením genomové DNA. Jinak by bylo nemožno výsledný fíngrprint snadno vyhodnotit a reprodukovat. Toho se dosahuje tak, že primery pro AFLP bývají navrženy tak, že jsou delší o jednu až tři náhodně zvolené báze na 3'-konci směrem k neznámé sekvenci fragmentu bezprostředně sousedící s restrikčním místem. K amplifikaci pak dochází pouze v případě komplementárního párování tohoto modifikovaného 3'-konce primeru AFLP.

Obr. 7

Postup stanovení polymorfismu délky amplifikovaných fragmentů metodou AFLP (Šmarda et al. 2005)

Polymorfismus je založen na ztrátě nebo získání restrikčních míst a je analogický s polymorfismem RFLP. K zdokonalením metody vede použití fluorescenčního značení u jednoho z primerů a separace vzniklých produktů na automatickém sekvenátoru (fAFLP). AFLP je velmi účinnou typizační metodou pro DNA libovolného původu a stupně

komplexity,

využívanou

a fylogenetických studiích.

jak

v

diagnostice

tak

ve

taxonomických

Metodu je možné dále modifikovat tak, že se navrhne jeden z primerů specificky pro vazbu na střední část adaptovaných restrikčních fragmentů, což slouží pro vyhledávání sekvenčně specifických amplifikačních polymorfismů (SSAP). Podobně je možné jeden z primerů nahradit oligonukleotidem komplementárním k tandemové jednoduché repetitivní sekvenci např. (GT)72(AT)2 a provést selektivní amplifikaci mikrosatelitních polymorfních lokusů (SAMPL).

3.3.18. PCR kombinovaná s imunologickými metodami (imuno-PCR) Tento postup výrazně zvyšuje citlivost ve srovnání s metodou ELISA, která je však jeho součástí (obr. 8). Na antigen (např. specifická bílkovina ze sledované buňky) upevněný pomocí ELISA na dně titrační jamky se napojí biotinylovaná protilátka. K této protilátce je pak pomocí streptavidinového můstku připojena biotinylovaná reportérová sekvence DNA. Ta je pak odpojena a amplifikována PCR. Získané produkty svědčí o přítomnosti původního antigenu. Citlivost detekce se oproti ELISA zvyšuje až desetitisíckrát. Podařilo se detekovat i jen 580 molekul sledované bílkoviny (Sano et al. 1992).

Obr. 8 Schematické znázornění imuno-PCR

3.3.19. Amplifikační systémy založené na transkripci (TAS A 3S) U této modifikace dochází k amplifikaci za nepřítomnosti termofilní DNA-polymerasy. Transkripční amplifikační systém (TAS) využívá pro amplifikaci nukleových kyselin

transkripci in vitro a nikoli replikaci s Taq DNA-polymerasou. Používají varianty této metody označené jako 3SR (NASBA) a TMA. Metoda je vhodnější pro detekci molekul RNA než DNA. Strategií 3SR je kontinuální série zpětných transkripcí RNA následovaných transkripcí DNA. Každý cyklus 3SR se skládá ze syntézy molekuly DNA, která je komplementární k cílové nukleové kyselině (RNA nebo ssDNA) a transkripce nově syntetizované cDNA, která slouží jako intermediát a templát pro RNA-polymerasu in vitro. Přitažlivou vlastností tohoto postupu je jeho rychlá kinetika. Příkladem využití je diagnostika lidského papilomaviru, detekce rezistence k azidotymidinu u viru HIV-1 a detekce obtížně kultivovatelných bakterií (např. Chlamydia trachomatis a Mycobacterium tuberculosis).

3.3.20. Amplifikace DNA vytěsňováním řetězce (SDA) Také u této modifikace dochází k amplifikaci za nepřítomnosti termofilní DNApolymerasy.

Metoda

je

založena

na

schopnosti

DNA-polymerasy

bez

3'─ a 5'─exonukleasové aktivity iniciovat syntézu DNA v místě jednořetězcového zlomu uvnitř cílové molekuly a vytěsnit řetězec se zlomem během syntézy nového řetězce DNA. Takto vzniklé jednořetězce slouží jako substrát pro další reakci SDA a izotermní akumulaci dvou- a jednořetězcových kopií cílové molekuly. Základem metody SDA je vytvoření místně specifických jednořetězcových zlomů štěpením restrikční endonukleasou. Za normálních podmínek tak dochází ke štěpení obou řetězců, což není pro SDA vhodné. To lze vyloučit tím, že se při syntéze DNA použije jeden ze 4 dNTP, který je α-thio-substituovaný (např. 2'-deoxyadenosin-5'-α-thio-trifosfát), nově syntetizovaný řetězec DNA potom obsahuje modifikované nukleotidy. Restrikční endonukleasa v takto modifikovaném rozpoznávacím místě štěpí pouze jeden řetězec, a tak vzniká místně specifický jednořetězcový zlom. Reakce SDA je izotermní a simultální. Střídání teplot není nutné, protože řetězce DNA jsou denaturovány enzymaticky vytěsňováním řetězce DNA-polymerasou. Metoda byla původně vyvinuta pro detekci obtížně kultivovatelných mykobakterií, kde bylo po pětihodinové inkubaci získáno až 106násobné amplifikace původních 100 kopií cílové sekvence. Nevýhodou je vysoká finanční náročnost.

4. KONKRÉTNÍ MIKROBIÁLNÍ KONTAMINACE SLEDOVANÉ V POTRAVINÁŘSKÉ PRAXI Bakterie jsou nedílnou složkou prostředí. Ani potraviny nejsou nikdy úplně sterilní, vždy jsou v nich nějaké mikroorganismy, resp. bakterie přítomny. Některé bakterie, například koliformní, nejsou přímo pro člověka nebezpečné, ale způsobují kažení potravin a poukazují na špatnou hygienickou praxi. Proto je jejich množství v potravinách omezováno. Patogenní bakterie jsou pro konzumenty vysloveně škodlivé, protože vyvolávají řadu zdravotní poruch. Tato onemocnění postihují jednotlivce i celé skupiny obyvatelstva. Jsou nebezpečné mimo jiné i proto, že na první pohled často nic neprozradí jejich přítomnost. Potravina může mít velmi dobré vzhledové, senzorické i chuťové vlastnosti, a přesto může obsahovat vitální patogenní mikroorganismy nebo jejich klidová stadia, byť ve velmi nízkém počtu. V příhodných podmínkách pak dochází k jejich množení a po dosažení určitých mezních hodnot vyvolá stále zdánlivě kvalitní produkt zdravotní komplikace. V úvodu této práce jsem už uvedl, že na zajištění a zachování bezpečnosti potravin se podílí zemědělská produkce, zpracovatelé potravin, dovozci, distributoři, státní orgány, ale i spotřebitelé. To se samozřejmě týká i produkce potravin bez patogenních mikroorganismů. Zodpovědnost leží v první řadě na výrobci a na prodejci. Protože ne vždy jsou v tomto řetězci dodržovány hygienické předpisy, musí zasahovat stát prostřednictvím kontrolních orgánů, které sledují nejen bakteriální bezpečnost potravin během jejich výroby i prodeje. V České republice se detekcí, sledováním a hodnocením konkrétní mikrobiální kontaminace vyskytující se u živočišných produktů zabývá Státní veterinární správa. Konkrétní mikrobiální kontaminace vyskytující se u rostlinných produktů sleduje a hodnotí Státní zemědělská a potravinářská inspekce. Z údajů Státního veterinárního ústavu v Olomouci a Státní zemědělské a potravinářské inspekce Brno o výskytů patogenních bakterií v letech 2001-2005 na území naší republiky jsem vycházel při výběru bakterií, kterými se budu ve své práci zabývat (příloha 1 a 2). U živočišných

surovin a produktů

to jsou Listeria monocytogenes,

Campylobacter sp., Yersinia enerocolitica, Salmonella sp., beta hemolytické streptokoky, Clostridium botulinum, Shigella sp., Pseudomonas sp., sulfidredukující

klostridia,

Staphylococcus

aureus,

Clostridium

perfringens,

Bacillus

cereus,

Escherichia coli. V surovinách a potravinách rostlinného původu to jsou Salmonella sp., Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, Bacillus cereus, Clostridium perfringens, Campylobacter jejuni, Escherichia. coli O157 a Vibrio parahaemolyticus. Pro celistvý pohled na tuto problematiku se budu věnovat nejen detekci uvedených patogenních bakterií, ale i dalším aspektům. Údaje kapitoly 4 jsem čerpal z Lékařské mikrobiologie speciální (Votava et al. 2003) a základní údaje týkající uplatnění molekulárně biologických postupů při diagnostice patogenních bakterií v potravinářství z přehledné práce, kterou publikovali Hill a a Jinneman (2000). Další údaje jsem přebíral z originálních publikací týkajících se této problematiky.

4.1. Gramnegativní nefermentující bakterie Termín „gramnegativní nefermentující bakterie“ se víceméně z praktických důvodů používá pro označení v podstatě nesourodé skupiny velkého počtu rodů gramnegativních tyčinek, které spojuje jediná vlastnost, a to neschopnost fermentace glukózy. Řada zástupců ovšem může glukózu štěpit aerobně respiračním mechanismem. Využívají v drtivé většině jako akceptor elektronů kyslík. Pouze některé kmeny mohou předávat elektrony na dusíkaté substráty, což jim umožňuje růst i v mikroaerofilním nebo dokonce anaerobním prostředí. Patří k nim tyto čeledi:

4.1.1. Čeleď Pseudomonadaceae Čeleď

Pseudomonadaceae

zahrnuje

obvykle

mírně

zahnuté,

štíhlé

gramnegativní tyčinky. Jsou obvykle pohyblivé, oxidasapozitivní a biochemicky poměrně aktivní. Typická je pro řadu z nich produkce pigmentů a vydávání specifické vůně, respektive zápachu. Dále uvedený rod má význam pro kontaminace potravin v našich podmínkách.

4.1.1.1. Rod Pseudomonas

Pseudomonas aeruginosa

P. aeruginosa představuje jednoznačně nejčastěji izolovaný a klinicky nejvýznamnější druh celého rodu. Vyskytuje se hojně v různých vodách včetně odpadních, ve střevě obratlovců, na rostlinách a v půdě. Ve velkém množství může zamořovat nemocniční prostředí, kde s oblibou kontaminuje katétry, infuzní roztoky, dýchací přístroje a podobně. Náleží k obávaným původcům nosokomiálních nákaz, na nichž se podílí ve více než 10 % případů.

Kultivace Kultivace je nenáročná. Kolonie většiny kmenů mají typický vzhled (betahemolýza, perleťový až kovový lesk, pigmentace, zápach). P. aeruginosa může tvořit celou řadu pigmentů (většinou zelených, lat. aerugo - měděnka), z nich nejčastější jsou modrozelený pyocyanin (řec. pyon - hnis, kyaneos - modrý) a fluorescein - žlutozelený. Mladé kolonie vydávají vůni připomínající jasmínový či lipový květ nebo fialky, starší páchnou po amoniaku.

Biochemické vlastnosti Biochemická aktivita je celkem pestrá, štěpí řadu cukrů a vykazuje oxidasovou, katalasovou a ureasovou aktivitu. Biochemické určení je významné zejména u nepigmentovaných kmenů P. aeruginosa, které tvoří asi 5-20 % všech izolátů tohoto druhu.

Antigenní struktura Na základě tělových antigenů se rozlišuje zatím 17 sérotypů P. aeruginosa. Kromě somatických disponují pseudomonády též antigeny bičíkovými a fimbrilárními.

Patogenita a patogeneze Patogenita je dána strukturami vázanými na bakteriální buňku i tvorbou různých exolátek.

Z buněčných struktur se zde uplatňuje extracelulární polysacharid alginát. Hojně je vytvářen zejména mukózně rostoucími kmeny nalézanými často u pacientů s cystickou fibrózou plic. Lipopolysacharidový komplex buněčné stěny představuje soubor typově specifických antigenů indukujících tvorbu opsonizujících látek. Z látek produkovaných vně buňky mají pro patogenitu mikroba význam zejména proteolytické enzymy štěpící kolagen, fibrin a elastin a poškozující stěny kapilár. Výsledkem jejich působení je tak vznik hemorhagií a nekróz, dále inhibice fagocytózy a zábrana opsonizace kvůli narušení složek komplementu. Dalšími významnými exoprodukty P. aeruginosa jsou dva typy hemolyzinů. Jeden má charakter termostabilního glykolipidu s letálním účinkem pro myš a cytotoxicitu pro tkáňové kultury, druhý se chová jako fosfolipasa C. Jinými exolátkami produkovanými P. aeruginosa jsou cytotoxin narušující buněčné membrány, leukocidin a některé další substance. O schopnosti druhu zapříčinit onemocnění člověka nelze pochybovat. Týká se to téměř výhradně osob s porušenou imunitou, těžkým základním onemocněním (hemoblastózy, tumory, diabetes, autoimunitní choroby, cystická fibróza plic a jiné), popáleninami, pacientů pod imunosupresí (například po transplantacích) a lidí užívajících širokospektrá antibiotika. Mezi predisponující faktory přispívající k rozvoji infekce patří dlouhodobě zavedené cévky, tracheální kanyly, močové katétry a podobně. U zdravých jedinců může v prostředí silně kontaminovaném pseudomonádami dojít k jejich kolonizaci. Takto se mohou stát důležitým vektorem šíření nosokomiálních nákaz. P. aeruginosa může v podstatě způsobit infekci jakéhokoli orgánu či systému těla. K těm prognosticky nejhorším, a proto i k nejobávanějším, náleží insekty popálenin ( smrtnost těchto sepsí je kolem 60 %), sepse novorozenců, osteomyelitidy a devastující infekce oka ( v důsledku uplatnění proteolytických enzymů).

Prevence Jako prevence by připadalo v úvahu využití polyvalentních vakcín připravených z tělových antigenů.

Terapie U pseudomonádových infekcí bývá často svízelná. P. aeruginosa je totiž přímo mistrem ve schopnosti přejímat od jiných mikrobů geny kódující mnohočetnou rezistenci (vázané na plazmidy) k antibakteriálním látkám a předávat je dalším kmenům. Takto pak dochází k lavinovitému šíření polyrezistentních kmenů po klinikách. Obecně lze při terapii infekcí vyvolaných P. aeruginosa užít kombinace dvou látek (zvýšení účinku, oddělení rezistence, snížení případné toxicity). V současné době lze vybírat z pseudomonádových penicilinů (piperacilin a jeho chráněná varianta s tazobaktamem),

cefalosporinů

III.

a

IV.

generace,

protipseudomonádových

aminoglykosidů nebo fluorochinonů.

Diagnostika Přímý průkaz je snadný vzhledem ke kultivační nenáročnosti mikroba a charakteristickým znakům kolonií většiny kmenů. V případě nejasností je vhodná biochemická identifikace. Z epidemiologických důvodů se někdy provádí i sérotypizace a fagotypizace izolovaných kmenů. Pro detekci Pseudomonas sp. byla využity fluorescenční hybridizace in situ (FISH). S pomocí sondy zkonstruované podle sekvence genu kódujícího 16S rRNA se zdařilo označit jednotlivé buňky, a tak kvantifikovat jejich výskyt ve vzorcích mléka během 6 hodin. Výsledky byly potvrzeny dvěma dalšími metodami (vitálním barvením a klasickou kultivací), přičemž citlivost byla v podstatě stejná u všech aplikovaných metod (Kitaguchi et al. 2005). Při další optimalizaci uvedených barvicích metod se podařilo zkrátit dobu analýzy až na 3 hodiny (Kitaguchi et al. 2006). Časová výhodnost barvicích metod je nesporná. K této výhodě se řadí i další možnost určení velmi malých množství bakterií. V kombinaci se speciální cytofotometrickou metodou bylo zjištěno méně než 10 cfu ml-1 ve vzorcích mléka, tedy množství standardními metodami nedetekovatelné. Nutné bylo ovšem určité obohacení kultury, čímž se zvyšoval čas nutný pro dosažení konečných výsledků na 12 hod. (Yamaguchi et al. 2006). Zjištěná sekvence genu kódujícího 23S rRNA z tohoto mikroorganismu posloužila k syntéze dvou primerů označených jako PF (23 bází) a PR (20 bází). Po proběhnutí PCR byl získán produkt o velikosti 207 bází. Tento produkt je unikátní tím, že analýza pomocí tečkové (kapkové) hybridizace s využitím vnitřní specifické

sondy dovoluje určit nejen P. aeruginosa, ale i další druhy bakterií kontaminující hovězí maso (Venkitanarayanan et al. 1996). Překvapivě bylo zjištěno, že s primery, které jsou v literatuře uváděny jako specifické pro Enterobacteriaceae probíhá amplifikace i u Pseudomonadeceae. Při podrobných sekvenčních studiích byl pak ve vzorcích ze zpracovaného salátu zjištěn P. libaniensis, který je znám jako oportunní patogen. Zajímavé bylo, že vzorky odebrané přímo z pěstebních pozemků tuto bakterii neobsahovaly (Handschur et al. 2005). Pseudomonas sp. byl zaznamenán i pomocí PCR-DGGE (PCR-denaturating gradient gel electrophoresis) v rozsáhlé studii zabývající se výskytem bakteriálních kontaminací v chlazeném vepřovém mase (Li et al. 2006). Vedle Pseudomonas sp. bylo zároveň stejnou metodou ve zkoumaných vzorcích detekováno osm dalších bakteriálních druhů (Arthrobaeter sp., Enterococcus sp., Staphylococcus sp., Moraxella sp., Lactobacillus sp., Aeromonas sp., Acinetobacter sp., Brochothrix thermosphacta). Odběry vzorků v různých časech ukázaly změny v obsahu jednotlivých druhů (Li et al. 2006).

4.2. Gramnegativní mikroaerofilní tyčinky

4.2.1. Čeleď Campylobacteriaceae

4.2.1.1. Rod Campylobacter Rod Campylobacter zahrnuje mikroaerofilní a kapnofilní bakterie nalézající se v zažívacím traktu zvířat, ptáků i člověka.

Morfologie Kampylobatery jsou zakřivené, případně až spirálovité gramnegativní bakterie, poměrně čile se pohybující díky polárně situovanému bičíku. V praxi se užívá pro jejich tvar označení ˝ křídla ptáka˝.

Kultivace Úspěšný záchyt kampylobakterů vychází jednak ze zajištěného transportu materiálu (Amiesovo médium), jednak z užití speciálních půd při kultivaci. K těm nejvíce používaným patří Butzlerovo selektivní médium nebo Karmaliho agar. Tato půda vykazuje vyšší selektivitu než předchozí uvedená, což je obzvláště výhodné při selekci kampylobakterů ze smíšených kultur. Naočkované půdy je nutno inkubovat v prostředí do 5 % kyslíku, 10 % oxidu uhličitého a 85 % dusíku. Nezbytné je i přidání antibiotik potlačujících doprovodnou střevní mikroflóru (cefoperazon nebo vankomycin s kolistinem). Půdy obsahují i 3-10 % beraních nebo koňských erytrocytů. Inkubace probíhá 14-72 hodin při teplotě 42 °C (roste při ní dobře většina kampylobakterů). Vzhled kolonií je závislý na druhu mikroba, lze se tedy setkat s plochými a vypouklými koloniemi nebo s plazivým růstem po povrchu agaru. Všechny kampylobaktery mají pozitivní katalasovou i oxidasovou reakci. Nejdůležitější druh, C. jejuni, lze celkem snadno odlišit od ostatních díky schopnosti hydrolýzy hippurátu, rezistenci k cefalotinu a citlivosti k nalidixové kyselině.

Antigenní struktura Kampylobaktery

mají

v cytoplazmatické

membráně

zabudovaný

lipopolysacharidový a proteinový antigen. Rovněž bičík skýtá důležitý protein, využívaný

pro

typizaci

(umožňuje

rozlišit

přes

110

sérotypů).

Podle

lipopolysacharidového antigenu se rozeznává kolem 65 sérotypů. V běžné diagnostice se však těchto skutečností využívá jen zřídka.

Patogenita a patogeneze Příslušníky rodu lze najít v gatrointestinálním traktu ptáků, savců, u nichž mohou vyvolávat potraty nebo dokonce být příčinou neplodnosti. Kmeny schopné vyvolat akutní průjmovité onemocnění mohou produkovat cytotoxin nebo látky připomínající svým účinkem cholerový toxin. Jak již bylo uvedeno, nejdůležitějším lidským patogenem Campylobacter jejuni ssp. jejuni. Izoluje se celosvětově ze stolice 5 – 35 % osob, u kterých se projevily průjmy. K nákaze dochází požitím kontaminované potravy či vody. Dalšími druhy, které mohou u člověka vyvolat průjmovitá onemocnění jsou C. coli (častý u prasat), C. concisus (izolován často ze sulcus gingivalis), C. hyointestinalis (prasečí druh), C. upsalienalis (ve střevě psů a koček).

Po požití kontaminované vody či potravy se kampylobaktery množí v tenkém střevu a poté pronikají do slizničního epitelu střeva. Zde vyvolávají zánětlivou reakci projevující se přítomností krve ve stolici. Z klinických projevů se připojují bolesti břicha, průjem, cefalea a horečka. Ve většině případů, zejména pak u zdravých osob, odezní infekce do 5-7 dnů i bez antibiotické terapie. U menších dětí a oslabených osob může dojít ke generalizaci onemocnění, přestupu mikroba do krve a manifestaci septických příznaků. Tady nezbývá, než započít celkové podání antibiotik. Druhá skupina kampylobakterů vyvolává u člověka, i když velmi vzácně, rovnou spíše systémové infekce. Nejznámější je C. fetus spp. fetus, jinak původce potratů u hovězího dobytka a ovcí. Další jsou součásti normální mikroflóry dutiny ústní, kde se nalézají v sulci gingivales – C. sputorum, C. curcus, C. gracilis.

Terapie Za léky volby u generalizované infekce považují především moderní makrolidy (aziromycin, klarotromycin), aminoglykosidy nebo lze užít i tetracykliny (doxycyklin).

Diagnostika Přímý průkaz není díky existenci výše uvedených selektivních půd obtížný. Obvykle tedy kultivace doplněná mikroskopií z kolonií, oxidasovou reakcí a testem citlivosti, respektive rezistence k cefalotinu a kyselině nalidixové pro diagnostiku zcela postačí. Z metod přímého průkazu je též možné užít detekci antigenů přímo ve stolici, to je však spíše doména referenčních laboratoří. V úvahu připadá i průkaz metodou ELISA, pro rutinní laboratorní diagnostiku není dostatečně spolehlivý. Pro

detekci

oligonukleotidová

těchto

sonda

mikroorganismů

označená

alkalickou

existuje fosfatasou.

komerčně Ta

je

dostupná specifická

pro termotolerantní kampylobaktery. S její pomocí se podařilo prokázat přítomnost všech 71 zkoumaných kmenů C. jejuni a C. coli. Jiná komerčně dostupná sonda byla zkoušena na kontaminovaných kůžích kuřat a na trusu. Detekce byla možná až po kultivaci, při které bylo dosaženo alespoň 106 cfu ml-1. DNA, která byla extrahovaná z čistých kultur, byla využita jako templát pro soubor primerů flaA (flagellar antigen gene). Citlivost dosahovala čtyři buňky na reakci. Klesla však na 30 až 60 buněk na reakci při detekci vzorků odebraných z kontaminovaného prostředí.

Kampylobaktery byly zjišťovány i v čerstvém mléce a mlékárenských výrobcích. Wegmüller et al. (1993) připravili speciálně upravené vzorky (především odstranění lipidických složek centrifugací). Po lýze buněk pomocí proteinasy K byly využity primery ke genům flaA a flaB pro amplifikaci určité intercistronové oblasti. Aby byla zajištěna specifita, byla použita PCR se třemi primery (triple primer PCR) a provedena částečná odstupňovaná PCR (seminested PCR). Limit detekce ve vodě byl mezi 10 až 100 buňkami po 50 cyklech amplifikace při použití vzorku odebraných z přirozeného prostředí. Tentýž postup dovolil zjistit méně než 10 buněk ve 40 ml čerstvého mléka nebo 2 g měkkého sýra po proběhnutí 30 až 40 cyklů. Při sledování různých oblastí genu kódujícího 16S rRNA C. jejuni, C. coli a C. lari

byl

pozorován

amplikon

o

velikosti

426

bp.

Při

jeho

aplikaci

na kontaminované vzorky z kuřecích produktů bylo dosaženo detekčního limitu asi 12 cfu na reakci (odpovídajících 500 cfu ml-1 v obohacovacím mediu). Výsledky byly k dispozici během 48 hodin. Pro kampylobaktery byly vyvinuty specifické sondy tak, že byly zvoleny náhodné cílové sekvence pro reakci PCR ve spojení s tzv. sekvencí ERIC (enterobacterial repetitive intergeneric consensus sequence). U této skupin byla využita i technika isotermální amplifikace DNA NASBATM cílená opět na 16S rRNA. Byla prokázána specifita k C. jejuni, C. coli a C. lari. Citlivost byla asi 1000 kopií na reakci při zkoumání vzorků z kontaminované kůže kuřete a kontaminovaného hovězího masa. Po obohacení kultury se daly detekovat tři buňky C. jejuni v gramu vzorku, přičemž bylo přítomno dalších více jak 106 jiných gramnegativních bakterií.

Epidemiologie a prevence Vektorem

alimentární

kampylobateriózy

bývají

určité

potraviny,

jako

chladírenská kuřata, krůty a jiná drůbež, nepasterované mléko, kontaminovaná voda, ale i přímý kontakt s domácími zvířaty. Zvláště zrádná jsou v této souvislosti konzumace nedostatečně propečených kuřat, ať už doma nebo v automatech rychlého občerstvení. Proto se jako nejlepší prevence těchto infekcí osvědčuje dokonalá hygiena stravovacích zařízení a důkladné tepelné opracování pokrmů.

4.3 Gramnegativní fakultativně anaerobní tyčinky

4.3.1. Čeleď Enterobacteriaceae

Obecné vlastnosti enterobakterií Enterobakterie

-

čeleď

Enterobacteriaceae

jsou

z pohledu

klinické

mikrobiologie nejdůležitější čeledí gramnegativních tyčinek, a možná bakterií vůbec. Mají však velký význam i pro jiná mikrobiologická odvětví, neboť mnohé jsou vděčným modelovým objektem. Platí to zejména pro bakterii možná nejznámější – druh Escherichia coli (řecké enteron – střevo, nejpřirozenější životní prostředí většiny enterobakterií člověka a jiných obratlovců).

Morfologie Morfologicky jsou enterobakterie gramnegativní nesporulující tyčinky, dlouhé kolem 2 až 3 µm a tlusté 0,5 až 0,8 µm, které se málo liší navzájem a málo se také liší od jiných gramnegativních tyčinek, což snižuje význam morfologie v diagnostice. Za charakteristické lze snad považovat polární barvení některých z nich. Většina enterobakterií disponuje schopností pohybu. Nepohyblivé jsou klebsiely, shigely a Yersinia pestis, případně atypické kmeny jiných druhů.

Kultivace a citlivost na zevní vlivy Enterobakterie jsou fakultativně anaerobní mikroby. Rostou na většině běžných mikrobiologických půd, ale i těch, jejichž selektivita je dána složkami vyskytujícími se ve střevě (například žlučovými solemi). Dobře snášejí i změny teplot a do jisté míry i vyschnutí. Odolnost vůči zevním vlivům ovšem zdaleka není u všech enterobakterií stejná. I ty, které považujeme za „pravé střevní enterobakterie“, ovšem můžeme vykultivovat z vnějšího prostředí, kde je považujeme za indikátor jeho fekálního znečištění.

Biochemické vlastnosti Enterobakterie jsou vesměs katalasapozitivní, oxidasanegativní, biochemicky značně aktivní, přičemž převažuje fermentativní typ metabolismu. Tím je můžeme

odlišit od skupiny „nefermentujících tyčinek“. Ty nefermentují glukosu a většinou ani jiné cukry. Biochemické vlastnosti enterobakterií se liší i mezidruhově. Pozoruhodnou

vlastností

některých

enterobakterií

je

schopnost

vázat

molekulární dusík. Využívají ovšem této schopnosti jen v nouzi.

Antigenní struktura Enterobakterie a spolu nimi i některé příbuzné skupiny (Vibrionaceae) mají tři základní typy antigenů O, H a K. H-antigeny získaly své jméno z německého der Hauch, dech (povlak pohyblivých mikroorganismů na agaru připomínal dřívějším badatelům zadýchané sklo). Jsou to antigeny bičíkové a jsou tvořeny polymerizovanou bílkovinou - flagelinem. Najdeme je pouze u enterobakterií pohyblivých, vybavených bičíky. Pokud jsou bičíky přítomny, jsou zpravidla rozmístěny peritrichálně. Jednotlivé antigeny této skupiny se většinou označují malými písmeny. Pokud je definována tzv. druhá fáze označuje se čísly 1až 12. O-antigeny mají své jméno z německého ohne Hauch, bez dechu. Říká se jim též tělové antigeny a jsou to vlastně specifické části polysacharidového řetězce, který je součástí lipopolysacharidu vnější membrány, zatímco lipidická část – lipid A – je známý endotoxin enterobakterií. Jsou termostabilní, své antigenní vlastnosti si zachovávají i při vaření . Jednotlivé antigenní typy této skupiny se zpravidla značí čísly. Například O55, O111, O157 a podobně. Polysacharidové K-antigeny jsou kapsulární antigeny pouzdra. Jsou relativně málo významné pro diagnostiku , mohou se ovšem uplatnit jako faktory virulence. Za zmínku též stojí, že přítomnost pouzdra může více či méně maskovat ostatní typy antigenů. Polypeptidické K-antigeny (fibrilární antigeny) se pro větší zmatek označují stejným písmenem jako předchozí. Je to dáno tím, že fimbrie jsou v jistém slova smyslu také součástí pouzdra. Účastní se kolonizace sliznic. Uplatňují se například u některých kmenů Escherichia coli (K 88, K99).

Patogenita a patogeneze Enterobakterie jsou nerozlučně spjaty se střevem obratlovců. Mohou zde působit jako komenzálové a dělit se s námi o potravu, jako saprofyté spotřebovávat organické zbytky, ale také jako patogeny vyvolávat chorobné příznaky. Může se jednat o prostou

dysmikrobii, kdy porucha normálního fungování střeva je dána jen změnou poměru jednotlivých druhů a kmenů. Takové posuny jsou popisovány často. Může však také jít o nahrazení původních složek běžné mikroflóry novým elementem, přičemž může jít o druh s vyšší patogenitou, ale také o virulentnější kmen téhož druhu. Mnohé enterobakterie jsou občasným patogenem i mimo střevo. Je logické, že pokud se taková podnikavá enterobakterie vydá řitním otvorem na cestu ven, narazí při své pouti nejčastěji na urogenitální systém a nepřekvapí, že právě enterobakterie patří mezi nejčastější patogen tohoto systému. Infekci přitom usnadní dlouhodobě zavedený katetr, na kterém enterobakterie mohou tvořit biofilm. Infekce dalších částí těla (dýchací cesty, rány a pohybový aparát) je méně běžná, ačkoli nijak výjimečná. Je nutno upozornit, co se týče přítomnosti enterobakterií ve výtěrech z krku, bývá často spíše náhodný nález. Enterobakterie jsou zavlečeny s potravou a po čase opět zmizí. To ovšem neplatí u hospitalizovaných pacientů, zejména v těžkém stavu, u nichž enterobakterie horní cesty dýchací s oblibou kolonizují. Sepse způsobené enterobakteriemi jsou časté u novorozenců a kojenců, a pak zase u velmi starých osob – u těchto bývají nezřídka urosepse jako výsledek kolonizace močových cest a následné poruchy funkce ledvin. K nejzávažnějším klinickým stavům, které enterobakterie mohou způsobovat, patří meningitidy, rizikové především u novorozenců a kojenců.

Diagnostika V diagnostice enterobakterií má zásadní význam kultivace a biochemická identifikace. Oboje do jisté míry splývá, neboť mikrobiologové s oblibou používají selektivně diagnostických půd, které v sobě obsahují jeden či více biochemických testů (fermentace laktosy u půdy Endovy a MacConkeyeho, produkce sirovodíku u mnoha půd určených k diagnostice salmonel – příkladem jsou agary DC a XLD). V poslední době mají bohatší laboratoře k dispozici chromogenní agary, v nichž je chromogenní substance vázána na specifický substrát – mikroby, které substrát štěpí, přitom vpravují chromogen do buňky, takže pak rostou v barevných koloniích. K identifikaci podezřelých kolonií se používá různých biochemických testů, přičemž ty nejjednodušší představují vlastně jen kombinované diagnostické půdy. Složitější testy jsou zpravidla v plastových panelech a zahrnují i desítky diagnostických půd. Mnohé z biochemických testů jsou v poslední době automatizovány – buďto je automatická až interpretace výsledku (jednotlivé výsledky testů zadány do počítače

ručně) nebo i vlastní „čtení“ testu na principu spektrofotometru. Vždy je však nutno korigovat automat klinicko-mikrobiologickým pohledem. Součástí diagnostiky bývá zjišťování citlivosti na antibiotika. Podmínkou ovšem je, že příslušná enterobakterie je považována za patogen, a zpravidla také, že nepochází ze stolice. U rezistentních kmenů se testuje přítomnost širokospektrých beta-laktamas.

Epidemiologie Většina enterobakterií se přenáší cestou fekálně-orální. Rozdíly však existují. Někde (salmonelóza) jde především o přenos potravinami, jinde (úplavice) spíše o „nemoci špinavých rukou“, a u některých (E.coli) nelze vyloučit ani občasný vzdušný přenos. Řada infekcí je endogenního původu.

Terapie Antibiotika se používají z pravidla jen u mimostřevních infekcí. U průjmových onemocnění je totiž prokázáno, že antibiotická terapie zpravidla jen nepatrně zkrátí dobu trvání klinických příznaků, zato však zejména u salmonel podstatně prodlouží dobu vylučování bakterií stolicí. Příčinou tohoto jevu je skutečnost, že antibiotikum nepůsobí jen na předpokládaného patogena, ale také na běžnou mikroflóru střeva, takže vlastně vyřazuje z boje účinnou zbraň, kterou se tělo samo brání infekci. Když už zasáhnout, bývá lepší použít tzv. střevní antibiotika, tedy lokálně působící preparáty jako ftalylsulfathiazol nebo chloroxin (Endiaron). Z imunoterapeutických

postupů

se

léčebně

nejčastěji

využívají

různé

autovakcíny a „zásobní“ vakcíny, které nezřídka vedle antigenů enterobakterií obsahují i antigeny jiných mikrobů (pseudomonád či stafylokoků).

4.3.1.1. Rod Yersinia

Yersinia enterocolitica Jedná se o obligátně patogenní bakterie. Nejde však zpravidla o systémové infekce, ale jen o nákazy postihující zejména střevo.

Morfologie Morfologicky jde o gramnegativní tyčinky, pohyblivé jen při nižších teplotách kolem 25˚C.

Kultivace Kultivační náročnost odpovídá běžným enterobakteriím. Významná je schopnost množení při chladničkových teplotách, která lze využít diagnosticky. Přidáním určitých antibiotik do kultivační půdy můžeme dosáhnout částečné selektivity.

Diagnostika V přirozených podmínkách existuje mnoho sérotypů Y. enterocolitica, ale jen málo z nich vyvolává onemocnění u člověka. Pro patogenitu rodu Yersinia je nutná rodina plazmidů o velikosti 60 – 70 kbp, která je přítomna u mnoha z nich, ale může vymizet během jejich růstu nebo prodlouženého skladování. Pro virulenci je zapotřebí několik chromozomálních genů např. ty, které kódují invazní faktory – inv a ail (attachement invasion locus) nebo nebo yst, jež kóduje termostabilní enterotoxin v Y. enterocolitica. Některé sérovary Y. enterocolitica převažují v Evropě, jiné skupiny byly častěji zjištěny v Severní Americe, i když se situace stále mění. Byla zkonstruována sada primerů ke genu yst, s pomocí které je možné rozlišit dvě skupiny tohoto druhu. Izoláty séroskupiny O:3 z Evropy byly charakterizovány jediným produktem PCR o velikosti 200 bp, který přesně odpovídal velikosti předpokládané podle zjištěné sekvence nukleotidů. Když byly studovány klony séroskupiny O:8, které se často vykytují v Severní Americe, byly se stejnou sadou zjištěny 2 fragmenty o velikosti 1,6 kbp a 1,4 kpb. Možnost takovéhoto rozlišování může mít epidemiologický význam. Amplifikace pomocí

PCR

fragmentu

genu

ail

ukázala,

že všechny

ze 48 zkoumaných klonů a 5 klinických izolátů byly pozitivních. Genové sondy ke genu ail z Y. enterocolitica a genu inv z Y. pseudotuberculosis jsou druhově specifické. Pomocí poněkud komplikovaného postupu se podařilo rozlišit patogenní kmeny od nepatogenních. Postup spočíval v tom, že se vedle uvedených genových sond byla použita PCR se sadou primerů virF, které jsou specifické pro plazmidy virulence nalezené v kmenech obou druhů. Při

využití

genu

yadA

se

podařilo

identifikovat

šest

patogenních

séroskupin Y. enterocolitica s citlivostí 10 – 30 cfu.g-1 masa za přítomnosti milionkrát vyššího počtu jiných mikroorganismů. Při obohacení kultury v neselekčním mediu se citlivost zvýšila asi na 2 cfu.g-1 pokud nebyl počet ostatních mikroorganismů vyšší než 10 cfu.g-1.

Y. enterocolitica byla nalezena v krvi asymptotických donorů. Pro její přímou detekci byla metoda PCR zacílená na uvedený chromozomální gen ail a plazmidový virF. Senzitivita pak byla 500 cfu na 100 ml krve bez jakýchkoli předběžných úprav vzorků (Feng et al. 1992). Není vždy jasné, zda použít při sledování uvedených druhů genů na plazmidu nebo na bakteriálním chromozomu. Použití genů plazmidu má tu nevýhodu, že celý virulentní plazmid může být eliminován v průběhu laboratorní kultivace. Pro vyvolání onemocnění je však v některých případech nutná přítomnost obou typů genů virulence. Ztrátou jednoho se stává buňka avirulentní. Pro řešení tohoto problému je vhodná mnohonásobná PCR, kterou je možné detekovat přítomnost obou genů.

Epidemiologie Přenáší se fekálně orálně. Zdrojem infekce je nejčastěji vepřové maso (počet případů stoupá v zabijačkové sezóně). V léčbě se většinou uplatňují antibiotika, zejména fluorochinolony, cefalosporiny třetí generace a tetracykliny.

4.3.1.2. Rod Shigella Tento rod zahrnuje čtyři druhy S. dysenteriae, S. flexneri, S. boydii a S. sonnei. Co do odolnosti vůči zevním vlivům jsou shigely z enterobakterií nejchoulostivější.

Morfologie Shigely jsou co do morfologie typickými enterobakteriemi, na rozdíl od většiny ostatních jsou však nepohyblivé.

Biochemické vlastnosti Biochemicky jsou shigely málo aktivní. Těžko se odlišují od neaktivních či opožděně aktivních kmenů Escherichia coli – ostatně se zdá, že shigely jsou v jistém smyslu jakýmsi „patogenním dvojčetem“ escherichií. Na rozdíl od většiny kmenů escherichií jsou ale jsou ale shigely nepohyblivé, a při štěpení glukosy netvoří plyn.

Diagnostika V diagnostice se uplatňují kultivace, biochemický průkaz a antigenní analýza. Molekulárně biologické metody využívané u tohoto rodu jsou cíleny jak na geny virulence umístěné na plazmidu tak na bakteriálním chromozomu. Shigella spp.

vykazuje více jak 80% sekvenční podobnost k Escherichia coli. Shigella spp. a E. coli EIEC mají podobné plazmidy nesoucí geny virulence. Z tohoto důvodu se využívají sondy a metody PCR schopné detekce jak Shigella spp. tak enterovirulentní skupiny E. coli. Jedna z prvních hybridizačních sond, označena izotopem fosforu 32P, byla cílena k plazmidu virulence Shigella spp. a E. coli EIEC. Užití dvou sond bylo srovnáno s Serényiho testem k charakteristice 42 izolátů Shigella a 29 izolátům E. coli. Tři izoláty, které reagovaly na Serényiho test negativně, byly pozitivní při použití obou sond. To naznačuje, že pro virulenci jsou potřebné určité další faktory (Wood et al. 1986). Také sondy ke genu (ipa – invasion plastid antigen)) specificky detekují Shigella spp. a E. coli EIEC. Gen ipaH (element kódující antigen o velikosti 60 kDa vyskytující se v mnoha kopiích), který je lokalizován jak na plazmidu tak na chromozomu, byl využit také jako cílový pro zjišťování uvedených mikroorganismů. Při využití metody PCR byly použity jako cílové sekvence ial (amplikon o velikosti 1 038 bp lokalizovaný na plazmidu) a ipaH (amplikon lokalizovaný na plazmidu). Také geny kódující shiga toxin a příbuzné geny kódující toxiny podobné shiga toxinu se často využívají při detekci Shigella spp. a E. coli EHEC pomocí PCR. Při testování vzorků ze salátů se podařilo detekovat po obohacení kultury 104 buněk S. flexneri na gram vzorku. Společná detekce Shigella spp. a skupin E. coli může vyvolávat problémy. Často je třeba z epidemiologických důvodů vědět, o který konkrétní mikroorganismus se jedná. Proto byly hledány postupy, které by umožnily detekci, identifikaci a rozlišení E. coli EIEC od Shigella spp. S využitím genů iuc, ipaH a ial a kombinací metod mnohonásobné PCR a RLFP bylo možno rozlišit nejen Shigella spp. od E. coli EIEC, ale i jednotlivé druhy rodu Shigella (Kingombe et al. 2005).

Epidemiologie Úplavice se zřídka přenáší alimentárně, protože původce nemá schopnost se v potravinách příliš výrazně pomnožit. Přenáší se především špinavýma rukama. Dříve byly časté také epidemie z kontaminovaných vodních zdrojů, ty však s výjimkou špatně vedených letních táborům, díky účinné kontrole pitné vody u nás téměř vymizely. I proto je dnes úplavice mnohem vzácnější chorobou než salmonelóza. Dnes se však projevují epidemie v prostředí sociálně či psychicky postižených osob (ústavy sociální péče) a vedle nich případy zavlečené z oblastí, kde se úplavice vyskytuje častěji např.

středomořských zemí. Pokud má svůj infekce původ v potravinách,, jedná se především o saláty (Ollinger-Snyder a Matthews 1996). Výrazným rozdílem oproti salmonelóze je, že u shigelózy jde o čistě lidskou infekci bez zvířecích rezervoárů.

Terapie Jako u všech průjmových onemocnění je samozřejmě základem doplnění tekutin. Pouze v prvních dnech lze ovlivnit průběh úplavice antimikrobiální terapií. Podává se Endiaron.

4.3.1.3. Rod Escherichia Snad nejznámějším mikrobem je Escherichia coli. Tento mikrob, který představuje jakousi vlajkovou loď celé mikrobiologie je lidstvu znám pod názvem Bacterium coli už od počátků mikrobiologie. Escherichia coli slouží jako důležitý modelový organismus. Byla na ní prokázána bakteriální konjugace a replikace DNA, do jejího genomu byly vneseny geny pro nejrozmanitější látky, jako je lidský inzulín či interferon a mimo jiné geny kódující antigeny jiných mikrobů, což vede ke vniku rekombinantních vakcín. Escherichia coli se také používá k pěstování některých améb.

Morfologie Po stránce morfologické se Escherichia coli nijak neodlišuje od ostatních enterobakterií. Je pohyblivá a kultivovatelná na široké škále půd, přičemž za ideálních podmínek dosahuje její generační doba 20 minut. Na Endově agaru je nápadná purpurová barva kolonií a jejich okolí.

Biochemické vlastnosti Biochemicky je to průměrně aktivní enterobakterie. Štěpí glukosu a laktosu za tvorby plynu, tvoří indol, neštěpí močovinu. Problémem mohou být kmeny s opožděnou sacharolytickou aktivitou, které se chovají atypicky a které se mohou na půdách s laktosou jevit jako negativní.

Antigenní struktura Antigenní struktura odpovídá OHK systému.

Patogenita a patogeneze Escherichia coli je běžnou součástí střevní mikroflóry zdravých lidí a zvířat. Je komenzálem, často saprofytem a také symbiontem, neboť svým působením jednak znemožňuje průnik patogenů, díky produkci kolicinů, které jsou pro některé bakterie toxické. A též je i makroorganismu prospěšná přímo. Podílí se na tvorbě některých vitaminů, především K.

Patogenní působení ve střevě Kmeny EPEC (enteropatogenní, dyspeptická Escherichia coli) disponují faktory virulence, které ne zcela jasným způsobem vedou ke vzniku novorozeneckých průjmů. Nejznámější jsou antigenní typy O55, O111, O126. V patogenezi se obvykle uplatňuje adheze na střevní sliznici, proto se někdy také používá pojem EAEC (enteroadherentní Escherichia coli). Kmeny ETEC (enterotoxigenní Escherichia coli) nejsou přímo vázány na určité sérotypy. Produkují dva typy enterotoxinů – ST (tepelně stabilní) a LT (tepelně labilní). ETEC jsou nejčastější bakteriální příčinou průjmů v rozvojových zemích, ještě před shigelou. Projevují se nejvíc u těch, kteří se s nimi ještě nesetkali. Jsou příčinou cestovatelských průjmů. Tyto průjmy si prodělá většina cestovatelů z ekonomicky vyspělých zemí, když cestují do zemí rozvojových. Kmeny EIEC (enteroinvazivní Escherichia coli) disponují faktory invazivity, které umožňují invazi do střeva. Infekce těmito kmeny vede ke krvavým průjmům, které si ničím nezadají s průjmy shigelovými. Kmeny STEC (VTEC, EHEC) jsou nejzávažnější. Dnes se propaguje název STEC – shiga-like toxigenní Escherichia coli, neboť struktura toxinu i průběh infekce jsou velmi podobné situaci u některých shigel. Dříve byly tyto kmeny nazývány verotoxigenní (VTEC), protože na buněčné kultuře velmi úspěšně řádí. Pojem EHEC souvisí s jednou jejich vlastností. Vyvolávají krvácení ve střevě (enterohemoragické Escherichia coli). V každém případě bývají těžké průjmy s krvácením jen počátkem infekce. Zpravidla dojde k systematizaci infekce a vzniku hemolyticko-uremického syndromu. Tím se tato skupina poněkud vymyká definici „střevní působení“. Nejběžnějším sérotypem, patřícím mezi STEC, je O157:H7. Zdrojem infekce je hovězí dobytek, vehikulem většinou maso, například tepelně málo opracované hamburgery. Riziko zvyšuje nízká infekční dávka. Udává se, že k vyvolání infekce stačí pouhých

deset bakterií. Problematická je i léčba – antibiotická terapie vede k uvolnění toxinů z bakterie, a proto její použití nelze doporučit.

Působení mimo střevo Kmeny UPEC (uropatogenní Escherichia coli) jsou příčinou močových infekcí, neboť mají specifické faktory virulence (zejména adhesiny na epitelie močových cest), ale ne každý kmen Escherichia coli, který vyvolá močovou infekci je UPEC. U infekcí z ambulantního provozu tvoří tento mikrob 80 % izolátů, u nemocničních je to poněkud méně, neboť zde s escherichiemi soupeří i jiné enterobakterie typické při nozokomiálních infekcích, zejména klebsiely. Kmeny způsobující dýchací infekce, sepse, infekce ran a další závažné infekce včetně novorozeneckých meningitid nejsou jednoznačně definovány a pojmenovány jako předchozí. Týkají se zejména hospitalizovaných pacientů, u kterých normální obranné mechanismy často selhávají a mikroby se i bez specifických faktorů virulence mohou šířit po celém těle.

Diagnostika V laktosapozitivních koloniích, které na Endově půdě její typický kovový lesk, mohou růst i jiné enterobakterie, proto i typické kolonie z důležitých materiálů určujeme biochemicky. Zvláštním případem jsou nálezy Escherichia coli ze stolice novorozenců a kojenců, kdy je nutno pokračovat antigenní analýzou, většinou aglutinací na sklíčku, k vyloučení EPEC. Aglutinaci lze případně použít i při podezření na EIEC, ETEC a podobně. Klasickým testem v diagnostice byl pro EIEC Serényiho test, kdy se invazivita mikroba prokazovala na spojivkovém vaku morčete. V poslední době nabývá na významu diagnostika STEC, respektive nejběžnějšího sérotypu STEC-O157:H7. Tyto kmeny se vyznačují neschopností štěpit sorbitol, čehož využívá McConkeyho agar, ve kterém je laktosa nahrazena sorbitolem. Na této půdě se STEC prozradí bledými koloniemi. Pozitivitu je nutno konfirmovat sérologicky. Rychlejší a méně pracnou metodou, ovšem nákladnější, je přímý průkaz antigenu ve vzorku metodou ELISA. Kategorizace do čtyř skupin: ETEC, EPEC, EIEC a EHEC je založena na mechanismu virulence. Mnoho genetických elementů odpovědných právě za tuto virulenci bylo použito pro molekulárně biologickou detekci. Dosud zavedené metody jsou stále optimalizovány, aby se zvyšovala jejich citlivost a specifita. S využitím mnohonásobné PCR je možno zároveň detekovat a rozlišit různé patogenní klony i celkovou hustotu buněk E. coli. Po obohacení kultury bylo při jejím

využití u uměle kontaminovaného hovězího masa dosaženo citlivosti menší jak 102 až 103 buněk na 10 g vzorku (Let et al. 1996). Většinou se však aplikují metody, které detekují jednotlivé skupiny.

ETEC Termolabilní enterotoxin (LT) je imunologicky příbuzný toxinu cholery. Geny, které ho kódují (elt) jsou lokalizovány na plazmidu. Termostabilní enterotoxiny (ST) mají nízkou molekulovou hmotnost, nejsou antigenní, jsou však také lokalizovány na plazmidu. Jednotlivé geny mohou být identifikovány pomocí hybridizace kolonií. Kombinace oligonukletidových sond, se kterými je možno provést hybridizaci za totožných podmínek, umožňuje identifikaci více genů nebo i alel zároveň. Takovýchto sond různě značených existuje celá řada. Konkrétní postupy aplikované např. na vzorky stolice měly citlivost 106 až 108 cfu.g-1. Na identifikaci genů kódujících LT anebo ST jsou založeny i využívané metody PCR. Obohacení kultury před izolací DNA a amplifikací vedlo k citlivosti až 3 cfu z 25 g mletého masa. Při přímé amplifikaci bez předešlého obohacení kultury bylo detekováno 1000 cfu v gramu měkkého sýra. Další vyvinuté metody založené na PCR umožňují i identifikaci alel uvedených genů

EPEC Patogenita této skupiny je způsobena geny lokalizovanými též na plazmidu (55 až 70 MDa, EPEC adherence factor /EAF/ plazmid). Podařilo se vyvinout sondu ke konzervativnímu úseku tohoto plazmidu. Také se zdařilo PCR sekvence o velkosti 397 bp, která má velmi nízkou homologii k dosud známým sekvencím, jen s výjimkou Shigela sonnei.. Byly též vyvinuty sondy i metody PCR pro identifikaci chromozomální skupiny genů eae, které jsou potřebné pro připojení k hostiteli a jeho zničení.

EIEC Invazivní schopnosti těchto klonů jsou přisuzovány plazmidu o velikosti 120 až 140 MDa, který nese několik genů kódujících polypeptidy vnější membrány. K těmto genům bylo vyvinuto několik sond. Při využití PCR se pro její citlivost ukázala jako rozhodující příprava templátové DNA. Např. bylo zjištěna detekovatelnost 102 cfu na mililitr mléka při použití

proteinasy K, povaření a precipitací DNA etanolem. Citlivost se dále zvyšuje odstraněním inhibitorů PCR. Tak bylo dosaženo detekční úrovně až 103 buněk v 1 mililitru mléka, aniž musela být provedena obohacující kultivace (Keasler a Hill 1992).

EHEC Nejrozšířenější zjištěnou sérologickou skupinou EHEC způsobující onemocnění je sérologická skupina O157:H7. Z tohoto důvodu je tedy většina testu na určení EHEC specifická právě pro tuto skupinu, která je často charakterizována neschopností využívat sorbitol a tím, že jí chybí funkční beta-glukurodinasa (poslední době se objevila sdělení popisující kmeny, které však beta-glukurodinasovou aktivitu vykazují). Pro uvedený sérotyp byla identifikována specifická substituce v 92 nukleotidu genu uidA (gen pro beta-glukurodinasu). Tato substituce, která však nezpůsobuje vymizení aktivity tohoto enzymu, se stala vhodným prostředkem pro molekulárně biologickou detekci, specifickou právě pro E. coli O157:H7. Další možnost pro detekci většiny členů uvedené skupin přestavuje segment plazmidu o velikosti 3,4 kbp, který obsahuje genetickou informaci pro adhezi a má velikost 60 MDa. Pro detekci je možné využít i gen eae kódující invasin, který se pravděpodobně také podílí na virulenci. Gen eaeA ze skupiny O157 už byl klonován a sekvenován. Jeho sekvence o velikosti 2,2 kbp vykazuje 97% homologii s genem eae skupiny EPEC, ale podobnost na konci 3´ je jen 59%. Sekvence zcela specifické pro skupinu EHEC mají geny hlyA a hlyC. To umožnilo navrhnout celou řadu genových sond a metod PCR vhodných pro identifikaci skupiny EHEC. Jako další specifický gen byl detekován gen slt odpovědný za vytváření toxinu, který se podobá shiga toxinu (neboli verotoxinu). Zavedené metody využívající postupů navržených na základě výše uvedených zjištění dovolily sledování výskytu skupiny EHEC v potravinách. Např. sondy pro uvedený gen slt umožnily při sledování kontaminací ze vzorků hamburgerů dosáhnout limitu až 1,3 cfu O157:H7 na gram vzorku po obohacení kultury po dobu 16 až 24 hodin při teplotě 37°C a následném využití hybridizace kolonií nebo tečkovou hybridizací. Tečková hybridizace byla rychlejší (nebylo nutno čekat na vytvoření kolonií).

Po obohacení kultury byly sondy ke genům sltI a sltII využity pro sledování vzorků čerstvého masa, drůbeže a mořských produktů. Přítomnost uvedených genů, tj. kontaminace, byly zjištěny v 17 % testovaných vzorků. Při detekci této skupiny byla uplatněna mnohonásobná PCR (multiplex), protože patogenita EHEC je způsobena více geny, které tak bylo možno odhalit zároveň. Na citlivost všech modifikací detekce E. coli resp. skupiny EHEC mají značný vliv postupy předcházející vlastnímu vyhledávání přítomnosti genů resp. sekvencí charakteristických pro tuto skupinu. Např. detekční úrovně 103 a 104 cfu.g-1 bylo dosaženo, když byly bakterie odděleny centrifugací a promyty před extrakcí DNA. Při jiném postupu izolace DNA a využití mnohonásobné PCR, se podařilo detekovat až 1 cfu v gramu původního vzorku, kterým bylo hovězí maso. Při některých analýzách PCR se nepoužívají primery specifické pro určitou oblast.

Několik

skupin

degenerovaných

primerů

bylo

vybráno

na

základě

konzervativních oblastí genů sltI a sltII. Pak byly použity vnitřní oligonukleotidové sondy, které měly jen 30 % homologie, aby se rozlišily amplifikované produkty z obou genů. Pro toto rozlišení byly využity také metody RFLP. Pro detekci sérologické skupiny O157:H7 se používá též metoda MAMA (Mismatch Amplification Mutation Assay). Další možností pro rozlišení klonů E. coli představuje ribotypizace.

Epidemiologie Bakterie se přenáší fekálně orálně. Je přitom jasné, že řada mimostřevních infekcí je endogenního původu. Vzhledem k tomu, že je Escherichia coli poměrně odolná, je možný i přenos kontaktem. Vyskytuje se poměrně běžně v potravinách, proto také cestovatelé, kteří se v cizích zemích začnou živit místní stravou, jsou obvykle brzy infikováni místním kmenem ETEC, což se projeví cestovatelským průjmem.

4.3.1.4. Rod Salmonella V tomto rodu se uvádí dva druhy Salmonella enterica a S. bongori. Z epidemiologického hlediska má hlavní význam druh S. enterica, který je dále rozdělen do šesti poddruhů: S. enterica subsp. enterica, subsp. salamae, subsp. arizonae, subsp. diarizona, subsp. houtenae a subsp. indica. V dnešní době se více než systematického členění v praxi používá k označování salmonel názvu sérovaru, které znázorňuje Kauffmann-Whiteovo antigenní schéma

(tab. ). Dnes je užíváno komplexní označení, které zahrnuje název druhu, poddruhu a sérovaru. Např. Salmonella enterica subsp. enterica ser. Typhimurium. Komplexní taxonomické označení je značně složité pro běžné použití, proto se více používá jen zkrácené označení sérovaru. Jako např. Salmonella typhimurium nebo přesněji Salmonella Typhimurium nebo pouze Typhimurium. Většina salmonel patří k poddruhu jedna a jeho sérovary jsou označovány názvy.

Tab. 3 Kauffmann-Whiteovo antigenní schéma (Čížek 2004)

Salmonely je možné rozdělit dle hlediska epidemiologického, epizootologického a klinického významu do několika skupin:

Primárně zoopatogenní salmonely Zatím jsou u nás stále nejběžnějším původcem bakteriálních střevních nákaz, ale v těsném závěsu za nimi se nachází rod Campylobacter. Do této skupiny patří

salmonely patřící k sérovarům S. Dublin působící salmonelózu skotu. S. Abortusovis, S. Abortusequi, S. Abortusbovis, které vyvolávají aborty u příslušných druhů zvířat (ovce, kůň, skot). S. Pullorum je příčinou pullorové nákazy, též zvané bílé úplavice, kuřat a S. Gallinarum, tyfu dospělé drůbeže. S. Choleraesuis způsobuje u prasat enteritidy a latentní infekce střeva, septikémie. U selat se můžeme setkat se S. Typhisuis v podobě chronických enteritid.

Morfologie V podstatě se neliší od následujících skupin, mají poměrně velkou odolnost vůči vnějším vlivům. Při cíleném vyšetření na salmonely se standardně používá suchých tamponů bez transportního média. Nikoliv však při rutinním vyšetření trusu. A to v případě, kdy lze očekávat přítomnost méně odolných bakterií, např. kampylobakterů. Schopnost snášet sloučeniny selenu se využívá při kultivaci na selektivně pomnožovaní půdě – selenitovém bujónu. Teplota 60˚ je dostatečná k zahubení zárodků. Je ale stále nutné myslet na to, že teplota uprostřed potraviny je zpravidla mnohem nižší než teplota na povrchu či snad teplota vody, ve které se potravina vaří.

Biochemické vlastnosti Významnými reakcemi jsou štěpení mannitolu, využívání citrátu a produkce sirovodíku, která se projeví na selektivně diagnostických půdách XLD a MAL, kde salmonely rostou v bezbarvých koloniích s černým středem. Většinou jsou to pohyblivé bakterie.

Patogenita a patogeneze Většinou se setkáváme s klasickou střevní infekcí bez komplikací. Inkubační doba se pohybuje od 12 hodin do 5 dnů, nejčastěji 24-48 hodin. Typické jsou průjmy bez přítomnosti krve ve stolici. Někdy je přítomna horečka a vomitus. U mladých dětí, starců a imunitně oslabených osob hrozí salmonelová sepse, která bývá nezřídka smrtelná. Další komplikace spojené s infekcí jsou následující: metastatická infekce aterosklerotických plaků, kloubních protéz, osteomyelitis a hnisavá arthritis. Význam infekční dávky potvrzuje dlouholetá zkušenost epidemiologů z praxe, kteří řeší epidemické výskyty ve školních a závodních stravovacích zařízeních. Tam, kde je v kuchyních prostředí hygienicky čisté, dochází k epidemickému výskytu pouze nešťastnou náhodou, převažují bezpříznakoví nosiči. Protikladem tomu, kde je

nepořádek a pro salmonely není problém se pomnožit, tzn. infekční dávka je značně vysoká, se setkáváme s mnohem vyšším procentem klinicky se manifestujících případů. Pro infekci je nutná relativně vysoká infekční dávka, pohybující se v rozmezí 105 až 108 bakterií. Velkou roli hraje zdravotní stav makroorganismu. K infekci dochází tak, že se bakterie vážou na mikrovili sliznice střeva, zejména v jejunu, a to pomocí specifických adhesinů, které jsou lokalizovány povrchu bakterie. Adhesiny se váží na receptory obsahující mannosu. Následuje degenerace mikrovili, salmonely pronikají i do buněk a množí se v nich. Množí se také v makrogázích Peyerových plaků. Na rozdíl od shigel a některých escherichií se však nemnoží v cytoplazmě, ale setrvávají ve vakuolách. Proto je jejich množení ve srovnání s výše zmíněnými pomalejší. Část bakterií proniká do lokálních lymfatických uzlin.

Diagnostika Salmonela se často prozradí jako laktosanegativní kolonie na Endově agaru, bledé kolonie s černým středem na půdách XLD (xylosa-lysin-deoxycholát), případně typický vzhled na dalších deoxycholát-citrátový neboli DC-agar, Salmonella-Shigella označovaný jako SS-agar. Za vhodné se doporučuje předchozí pomnožení v selenitovém bujónu. Ke konečnému verdiktu je vhodné použít aglutinaci. Tím se zjistí přímo sérovar. Bohužel epidemiologům to příliš nepomůže, neboť naprostá většina (v roce 2001 96%) českých salmonel patřilo do sérovaru Typhimurium. Z dalších sérotypů se u nás vyskytují Infantis, Indiana a Montevideo. Ve výzkumných centrech se jako další metoda používá fagotypizace. Protože většina druhů tohoto rodu způsobuje onemocnění člověka, byla vyvinuta řada speciálních postupů pro jejich identifikaci. V jednom z prvních hybridizačních postupů byla využita sonda označená izotopem fosforu

32

P. Tato sonda byla použita

i v komerčně dostupném kitu (GeneTrak). Využití komerčního postupu dávalo výsledky srovnatelné se standardním kultivačními metodami při testování 1 600 vzorků odebraných z 23 různých typů potravin. Druhý komerčně dostupný kolorimetrický kit od téže firmy byl určen k vyhledávání genů kódujících rRNA, které se vyskytují v mnoha kopiích. Jeho citlivost byla srovnatelná s ostatními detekčními metodami a dala se ještě zvyšovat pomocí medií selektivních pro rod Salmonella. Některé kultivační bujony však mohly detekci ztěžovat nebo zcela znemožňovat (srov. Hill a Jinneman 2000).

Pro detekci Salmonella ssp. byly využity i jiné sondy s různým označením i další postupy. Např. využití tečkové hybridizace a hybridizace kolonií. Pro snížení nespecifického pozadí bylo nutné dodržet podmínky kultivace, aby kolonie byly dostatečně malé (Tsen et al. 1991). Jako cílové geny posloužily i geny virulence. Byly tak zkonstruovány sondy pro geny invA - invD, které řídí napadení střevního epitelu. Sem také patří synteticky oligonukleotid komplementární ke genu virulence (spvA), který se nachází na plazmidu a je specifický pro S. enteritidis (Hanes et al. 1995). Při testech PCR pro detekci Salmonella spp. byla využita celá řada cílových genů jako např. počátek replikace chromozomu (oriC), strukturální gen pro tenké agregační fibrily (agfA), gen pro bílkoviny vázající se k DNA (himA, hns), geny pro protein invasin (invA, invE), jeden gen biosyntetické dráhy antigenů (rfbS), inzertní sekvence 200 (IS200) a další (srov. Hill a Jinneman 2000). Velká pozornost byla věnována izolaci a přípravě templátové DNA. Nejlepších výsledků bylo dosaženo, když byla použita proteinasa K. Při optimalizaci se došlo až k detekčnímu limitu od 1 do 49 buněk na gram homogenizovaného vzorku (z ústřice). Pro izolaci a koncentraci konkrétních séroskupin (A – E) z kuřecího masa byly použity magnetické mikrokuličky s navázanými monoklonálními protilátkami. Získané buňky byly pak využity pro izolaci DNA (srov. Hill a Jinneman 2000). Pro detekci amplifikovaných produktů byla použita též řada postupů např. sondy k vnitřním sekvencím amplifikovaných produktu označené digoxigeninem, vychytávání produktů pomocí komplementárních oligonukleotidů kovalentně vázaných v titračních jamkách, označení primerů i dNTP digoxigennem nebo biotinem, chromogenní substráty pro peroxidasu a alkalickou fosfatasu a další. Při sledování výskytu Salmonella spp. byla použita i metoda náhodné amplifikace polymorfní DNA (RAPD). Jako primer byla použit oligonukleotid odvozený od genu kódujícího dulcitol-1-fosfátedehydrogenasu. Získané výsledky potvrdily vysokou specifičnosti pro rod Salmonella (druhy jiných rodů poskytovaly zcela jiné proužky po gelové elektroforéze). Minimální detekovatelný počet buněk byl při umělé inokulaci čerstvého hovězího masa 4.10-1 cfu na 25 g po 18 hodinovém obohacení kultury (Miyamoto et al. 1998). Tzv. analýza plazmidových profilů se využívá i pro typizaci kmenů S. enteritidis. Plazmidy bakterií mohou být značně rozdílné velikosti a mohou se vyskytovat v buňce

v jedné nebo i několika stech kopií. Na základě těchto rozdílů je možné porovnávat – typizovat jednotlivé bakteriální kmeny (Rychlík et al. 2000). Při sledování výskytu druhů rodu Salmonella ve 120 vzorcích běžně prodávaných sýrů se ukázala větší přesnost molekulárně biologických testů oproti klasické kultivaci. Při té nebyly zjištěny žádné pozitivní vzorky. Při využití mnohonásobné PCR, při níž probíhala amplifikace sekvencí z genů InvA and lap, byly objeveny tři pozitivní vzorky (Alcazar-Montanez et al. 2006)

Epidemiologie Salmonelóza je typickým příkladem fekálně-orální infekce, přičemž přenos ve většině případů vyžaduje jako vehikulum potravinu. Přenos z člověka na člověka se vyskytne relativně zřídka. Klasickým zdrojem infekce je drůbež, zejména vodní, která se zase nakazí od volně žijících ptáků, jako jsou např. racci nebo holubi. Na rozdíl od kampylobakteriózy se lidé nakazí především konzumací vajec než drůbežího masa. Vehikulem infekce nemusí být pouze v tomto ohledu velmi populární majonézy nebo zmrzlina, ale při sekundární kontaminaci pokrmu může být zdrojem lidská strava obecně. Vedle ptáků se jako vektor mohou uplatnit i plazi. Ku příkladu v roce 2001 se v Novém Městě na Moravě vyskytl případ salmonelózy tří novorozenců, dvou rodiček a jedné zdravotní sestry. Při následném šetření byla za zdroj infekce určena vodní želva chovaná jednou z postižených.

Terapie Antibiotická terapie se nedoporučuje. Může se totiž zkrátit doba klinických příznaků, ale na druhé straně tento krok vede pouze k prodloužení vylučování salmonel do okolí. U salmonelóz neexistuje pravé nosičství jako je tomu u tyfu, přesto však vylučování salmonel do okolí přetrvává běžně i několik týdnů až měsíců. Pozitivní osoba je pochopitelně značně omezena ( zákaz koupání na veřejných koupalištích, zákaz přípravy jídla pro druhé apod.), a proto máme logicky snahu zbavit se salmonel co nejrychleji. Jako vhodné se považuje konzumace potravin obsahující složky fyziologické střevní mikroflóry (probiotika), substráty na kterých se zmíněná flóra může pomnožovat (prebiotika) nebo kombinace obou složek (symbiotika). Tradičně volíme bílé jogurt a kysané zelí, svůj vzestup prožívají i preparáty s přidanou laktulózou. Terapie antibiotiky je indikována pouze v případech mimostřevního charakteru. Varovným signálem je ovšem podíl polyrezistentních kmenů v rámci sérovaru

Typhimurium. Především se jedná o kmen DT 104, rezistentní k ampicilinu a několika dalším antibiotikům.

Prevence Správná hygienická praxe nejen při výrobě potravin hraje v prevenci zásadní roli. Nutné je dbát na dodržování dostatečně vysokých teplot při přípravě potravin a naopak dostatečně nízkých při jejich skladování. Pro nakládání vajíček lze použít pro likvidaci salmonel například vodní sklo – křemičitan sodný.

Sérovary adaptované na více hostitelských druhů Tyto sérovary vyvolávají infekce u více druhů zvířat a jsou přenosné na člověka nejčastěji prostřednictvím kontaminovaných potravin. Salmonelózy jimi vyvolané, označujeme jako sekundární. Nejčastějšími zástupci jsou sérovary S. Typhimurium, S. Enteritidis, S. Agona, S. Infantis, S. Heidelberg, S. Derby a další.

Primárně antropogenní salmonely K této skupině náleží salmonely patřící k sérovarům Typhi, Paratyphi A, Paratyphi B a Paratyphi C. Jedná se o velmi závažné původce břišního tyfu, resp. paratyfů. Je nutné odlišovat od břišního tyfu tyfus skvrnitý, který způsobuje Rickettsia prowazekii z čeledi Rickettsiaceae. Morfologie, kultivační a biochemické vlastnosti této skupiny se neliší od primárně zoopatogenních salmonel, o kterých bylo pojednáno výše.

Antigenní struktura Antigenní struktura je tvořena O a H antigeny. S. Typhi je vybavena O-antigeny typů 9 a 12 a H-antigenem typu d. Zvláštní je pouzderný antigen Vi, který je pro tyfus velmi typický. Pozoruhodná je zkřížená reakce mezi antigeny tyfu a trichinel.

Patogenita a patogeneze Hlavní cestou vstupu salmonel do organismu je střevo, avšak zásadním rozdílem od zoopatogenních salmonel jsou nevýrazné střevní příznaky, pokud jsou vůbec zaznamenány. Po inkubační době, která trvá deset až čtrnáct dní, se objeví vysoké, septické teploty a bolesti hlavy. Z tohoto příznaku vychází český ekvivalent hlavnička. V době bakteriémie se vylučují i močí a je možné zachycení i zde. I diagnostického hlediska je však mnohem důležitější hemokultura. Teploty trvající jeden až dva týdny

obvykle doprovází růžové skvrny na kůži. Zmíněných deset až čtrnáct dní mezi penetrací střevní sliznicí a vznikem sepse se původci tyfu a paratyfu množí v mezenteriálních mízních uzlinách a čekají na vhodnou příležitost, aby přes ductus thoracicus vnikly do krevního řečiště. Následně dochází k bakteriémii. 2-5 % tyfových salmonel nachází útočiště ve žlučníku a žlučových cestách, což vede k dlouhodobému, dokonce i celoživotnímu bacilonosičství tyfu. Eradikace salmonel tyfu ze žlučníku a žlučových cest je velmi obtížná a často i nemožná. Vedle žlučníku se v době primární bakteriémie dostávají salmonely i do jater, sleziny, ledvin i kostní dřeně. Infikovaná žluč přináší salmonely do střeva opětovně. Rozvíjející se buněčná imunita vede zvláště v Peyerových placích k zánětlivé reakci, jejíž komplikací bývají intestinální hemorrhagie a perforace střeva. Mortalita neléčeného tyfu dosahuje 20 %. U paratyfu bývají příznaky mírnější, ale zato se častěji vyskytuje průjem.

Diagnostika V období bakteriemie je možné S. Typhi vypěstovat z krve a z moči, později z kostní dřeně. Stolice nemusí být ve všech případech pozitivní. Proto je důležitý i průkaz nepřímý. Používá se aglutinační Widalova reakce s různými tělovými i bičíkovými antigeny. Za pozitivní výsledek se považuje, pokud sérum reaguje i stokrát zředěné a pokud je pozitivní reakce jak s tělovým, tak s bičíkovým antigenem. Widalova reakce je značně nespolehlivá, ale stále v praxi velmi oblíbená.

Epidemiologie Břišní tyfus je typickou infekcí v zemích se špatnou hygienickou úrovní, zejména související s kontaminací vodních zdrojů pitné vody. V České republice se tyfus nešíří. V populaci se ale vyskytují staří bacilonosiči a mimo to dojde čas od času k zavlečení infekce ze zemí třetího světa. Zvýšeným místem výskytu na zeměkouli je jižní Asie. Bacilonosiči se musí podřídit zvláštním pravidlům epidemiologie. Tohoto jedince nesmíme podceňovat, protože se nejedou v nedaleké historii vyskytl případ jedince, který o svém problému nevěděl a nakazil spoustu lidí ve svém okolí.

Terapie Terapie je antibiotická. Většinou je účinná celá škála antibiotik jako fluorochinolony, kotrimoxazol nebo ampicilin. Komplikované případy jdou jednou

ze situací, kde ještě stále ke slovu může přijít chloramfenikol. Bacilonosiče je občas vhodné sanovat chirurgicky pomocí cholecystektomie.

4.3.2. Čeleď Vibrionaceae

Do čeledi Vibrionaceae patří rody Vibrio a Photobacterium. Čeleď byla navržena jako výhodné sloučení fermentujících bakterií, které mají polární bičíky a pozitivní oxidasovou reakci. Tato klasifikace umožnila jasné oddělení Vibrionaceae od úzce příbuzné čeledi Enterobacteriaceae, jejíž členové mají bičíky umístěné peritrichálně a negativní oxidasovou reakci. Čeleď Vibrionaceae je v prostředí široce rozšířena a obsahuje řadu klinicky významných organismů. Druhy této čeledi jsou v současnosti využívány mimo jiné k modelování změn klimatu a k epidemiologickým studiím spojeným s těmito změnami.

4.3.2.1. Rod Vibrio

Rod Vibrio zahrnuje více než 60 druhů a stále přibývají další. Dvanáct z nich je prokázanými humánními patogeny nebo bylo izolováno z klinického materiálu. Klinicky významné druhy rodu Vibrio sdílejí mnohé charakteristiky s čeledí Enterobacteriaceae. Vibria jsou široce rozšířena ve vodním prostředí teplejších oblastí a mohou způsobovat průjmy po požití kontaminované vody, infekce ran, uší (kontaktem poranění s kontaminovanou vodou) a septikémie.

Morfologie Zástupci rodu Vibrio jsou krátké, někdy přímé, většinou však zahnuté nesporulující gramnegativní tyčinky o průměru 0,5-0,8 µm. Jsou obvykle pohyblivé pomocí jednoho polárního bičíku.

Biochemické vlastnosti Všechny druhy kromě druhu Vibrio metschnikovii, jsou oxidasapozitivní, katalasapozitivní a všechny zkvašují glukosu, některé produkují plyn. Vibria jsou fakultativně anaerobní bakterie. Schopnost růstu zvláště některých druhů je výrazně

stimulována přídavkem 0,5-3% NaCl (jsou tedy halofilní). Vůči vyšším koncentracím NaCl jsou odolné. Jsou též alkalofilní, čehož se využívá v diagnostice. Optimální pH pro kultivaci zástupců tohoto rodu se pohybuje 6,5-9. V kyselém prostředí vibria rychle hynou. Vibria jsou velmi citlivá ke zvýšené teplotě a k desinfekčním prostředkům. Ideálními teplotami pro kultivaci je 20˚C, pro druhy patogenní pro člověka 30-37˚C.

Epidemiologie Ve vodách mohou vibria přežívat i několik let, a to bez ztráty virulence. Jsou přirozenými obyvateli brakických a slaných vod. Onemocnění u lidí jsou spojena s požitím kontaminované vody či s konzumací kontaminovaných korýšů a jiných plodů moře. Následkem kontaktu otevřené rány s vodou může dojít k infekci rány a případně k systémové infekci. Některá vibria jsou patogenní pro mořské živočichy, hlavně ryby.

Diagnostika Obecné testy pro počáteční identifikaci rodu Vibrio jsou kromě pozitivního testu na oxidasu dva – vibriostatický test a string-test. Vibriostatický test spočívá v citlivosti vibrií k vibriostatické sloučenině O/129 (2,4-diamino-6,7-diisopropylpteridin).

Tento

test

se používá k rozlišení

vibrií

od aeromonád a pseudomonád. String-test je velmi jednoduchý test k presumptivnímu určení vibrií a jejich rozlišení od aeromonád. Kolonie předpokládaného vibria se na sklíčku smíchá s 0,5% roztokem deoxycholátu sodného. Vibria lyzují a uvolňuje se jejich DNA. Při vytažení kličky z kapky směsi se mezi kapkou a kličkou vytvoří vlákno (angl. string). Aeromonády jsou v tomto testu negativní. Molekulárně biologická diagnostika byla zavedena hlavně pro druhy V. cholerae, V. parahaemolyticus a V. vulnificus, protože nejčastěji působí onemocnění. Většina známých sekvencí DNA přináleží virulentním faktorům těchto druhů. V epidemiologii byla též využita ribotypizace (Wachsmuth et al 1991). Pro specifickou detekci rodů i druhů byly jak sondy tak i primery pro reakce PCR použity různé sekvence genu kódujícího 16S rRNA. Pro detekci vibrií byl konstruován i syntetický oligonukleotid (Coelho et al. 1994). Podobně byly použity genové sondy i primery pro geny, které kódují cholerový enterotoxin (ctxA a ctxB), hlavní faktor virulence V. cholerae O1, i když jsou sekvenčně podobné s genem E. coli a genem Salmonella spp., které kódují tepelně labilní

enterotoxin. Jedna z oligonukleotidových sond specifická pro gen pro tepelně stabilní enterotoxin produkovanými některými V. cholera non-O1 ukázaly, že některé kmeny V. cholera O1 obsahují taktéž tento gen. Pokusně byly kontaminovány bakteriemi V. cholerae El Tor Ibana ústřice, krabi, krevety a salát. V odebraných vzorcích byla zvýšena hustota bakteriálních buněk po dobu 6 hodin. Poté byla provedena PCR, při níž se selektivně amplifikovaly vnitřní sekvence genu cholerového enterotoxinu.. Pak se podařilo detekovat V. cholerae s původní úrovní 1 cfu.g-1 ze vzorku ústřic a 1 cfu.g-1ze salátu (Koch et al. 1993). U V. vulnificus byla úspěšně využita sonda ke genu pro 16S rRNA k detekci a kvantifikaci tohoto mikroorganismu v tekutém prostředí a při hybridizaci kolonií. U stejného druhu se podařilo sekvenovat gen kódující cytolysin (hylA). Pomocí sondy, která byla na základě získané sekvence vytvořena, se podařilo detekovat 102 buněk v 1 ml mořské vody. Pro tentýž gen byly vybrány primery, které umožnily detekovat 102 buněk v 1 g vzorku z ústřic. Pro dosažení této citlivosti byla však kritická příprava templátové DNA. Pro detekci výše uvedeného druhu jsou vyvíjeny i další metody založené na mnohonásobné PCR a reverzně transkripční PCR v reálném čase (Harwood et al. 2004)

Vibrio parahemolyticus Jde o halofilní vibrio, které vyžaduje k růstu přídavek více jak 2 % NaCl. Vyskytuje se v mořské vodě, v sedimentech a v planktonu, je patogenem u mořských garnátů.

Epidemilogie V Japonsku jsou jím často kontaminovány polosušené sardinky shirasu, tradiční japonské jídlo.

Diagnostika V. parahaemolyticus roste na TCŽS-agaru v zelených koloniích. Štěpí ureu, produkuje termolabilní enterotoxin, toxický termostabilní hemolyzin (lyzuje lidské erytrocyty – Kanagawa fenomén) a tvoří i další toxiny.

Většina kmenů V. parahaemolyticus, které byly izolovány, neobsahuje geny pro hemolysin spojené s virulencí. Tedy vyhledávání těchto genů by mohlo umožnit identifikaci patogenních kmenů. Příbuzné hemolysiny však komplikují analýzu pomocí PCR. Byla však zkonstruována sonda pro gen kódující jeden z hemolysinů – TDH (thermostable direct hemolysin - tdh) specifická pro V. parahaemolyticus. Další sondy byly zkonstruovány pro gen tdh a gen podobný tomuto genu (trh). Jejich nevýhodou však bylo, že tyto sondy hybridizovaly i s některými kmeny V. follisae a V. mimicus. Pomocí amplifikace genu tdh se podařilo dosáhnout citlivosti 103 buněk ml-1 bujonu. Cílová sekvence neznáme funkce dovolila detekovat po obohacení kultury 9,3 cfu.g-1 v kontaminovaných ústřicích. V některých situacích je zapotřebí detekovat všechny tři uvedené druhy vibrií v tomtéž vzorku. Při správném výběru sad primerů pro geny kódující enterotoxin, termostabilní TDH a cytolysin se podařilo uskutečnit reakci PCR se všemi těmito primery a získané amplifikované produkty různé velikosti se daly rozlišit gelovou elektroforézou.

Patogenita a patogeneze U člověka vyvolává dva typy onemocnění – průjmová onemocnění a méně často pak onemocnění extraintestinální, např. infekce ran. Ke gastrointestinálním infekcím dochází

po

požití

nedostatečně

tepelně

upravených

ryb

či

plodů

moře.

V. parahaemolyticus způsobuje krátkodobé akutní krvavé průjmy.

4.3.3. Čeleď Staphylococcaceae

4.3.3.1. Rod Staphylococcus

Bakterie dnes označované jako stafylokoky, pozorovali jako první v roce 1880 Louis Pasteur a skotský chirurg a amatérský mikrobiolog Alexander Ogston. Ten v mikroskopickém preparátu hnisu z nohy jednoho mladíka barvitě popisoval „velké množství nádherných shluků, trsů a řetízků kulatých organismů, které se zřetelně a výrazně vyjímaly mezi hnisavými buňkami a jejich pozůstatky“. Lze celkem s jistotou předpokládat, že šlo o hnisavý proces vyvolaný Staphylococcus aureus.

Morfologie Stafylokoky jsou grampozitivní koky s průměrem zhruba 1 µm, uspořádané jednotlivě, v párech, v tetrádách, ve velmi krátkých řetízcích o nejvýše čtyřech buňkách a především v nepravidelných shlucích tvaru hroznu (řecky staphylé, hrozen). Jsou nepohyblivé a netvoří spory, s pouzdrem se také nesetkáme, snad výjimečně. Až na výjimky jsou fakultativně anaerobní, katalasapozitivní a kromě kmenů skupiny S. sciuri i oxidasanegativní. Rostou v přítomnosti 10 % NaCl, jsou citlivé k lysostafinu a furalidinu a rezistentní k bacitracinu a lysozymu.

Rozdělení V dnešní době můžeme rozlišit 47 druhů stafylokoků. Celkem 38 druhů z toho sedm druhů má dva a jeden tři poddruhy. Z toho přes polovinu (24 taxonů) lze vypěstovat z humánního klinického materiálu, zbytek se nalézá u zvířat a v potravinách. Těchto 47 druhů a poddruhů stafylokoků se v praxi tradičně dělí na dvě hlavní skupiny podle jejich schopnosti koagulovat plazmu, na stafylokoky koagulasapozitivní a koagulasanegativní.

Stafylokoky kagulasapozitivní V humánní patologii je jediný důležitý druh koagulující cytoplazmu, a to Staphylococcus aureus, zbývajících šest poddruhů koagulasapozitivních stafylokoků je zvířecího původu. U člověka z nich nalézáme jen např. při pokousání psem S. intermedius.

Staphylococcus aureus Existují dva poddruhy tohoto stafylokoka: Staphylococcus aureus subsp. aureus a Staphylococcus aureus subsp. anaerobius. Hlavním zájmem pro nás bude pouze první poddruh, protože druhý roste pouze anaerobně a u člověka se nevyskytuje. Někdy se S. aureus subsp. aureus označuje „zlatý stafylokok“ i když tento termín nemá vůbec žádnou taxonomickou platnost. Genom S. aureus obsahuje řadu profágů, transpozonů a inzerčních sekvencí. Pro S. aureus je typické, že přenos genů mezi kmeny se děje pomocí transdukce, tzn. uplatňují se při něm temperované bakteriofágy. Genetická regulace exprese determinant virulence spočívá v tom, že během exponenciální fáze růstu jsou exprimovány především povrchové proteiny stafylokoka, během stacionární fáze pak proteiny sekreční. Virulence je podmíněna různými faktory (tab. 4).

Tab. 4

Antigenní struktura Bunečná stěna stafylokoků obsahuje peptidoglykan, kyselinu teichoovou a protein A. Stafylokokový peptidoglykan murein má na všech zbytcích kyseliny N─acetyl-muramové tetrapeptidy, které jsou napříč pospojované pentaglycidovými můstky. Peptidoglykan účinkuje podobně jako endotoxin, podněcuje uvolňování cytokinů z makrofágů, aktivaci komplementu a shlukování krevních destiček. Hlavní determinantou S. aureus je polysacharid A, který se skládá hlavně z ribitolových podjednotek k. teichoové. Hlavní uplatnění nachází při adhezi na sliznice a rány, kde se k. teichoová váže na fibronektin.

Kultivace Stafylokoky dobře rostou na běžných půdách, v širokém rozmezí teplot 7-46˚C i pH 4,2-9,3. Pro jejich izolaci nejčastěji používáme krevní agar s 5 % ovčích erytrocytů a obyčejný thioglykolátový agar. Na neselektivních půdách jsou kolonie vždy pigmentované. Pigment bývá většinou smetanový, krémový, zlatožlutý až naoranžovělý. Kolem

kolonie

bývá

v různém

stupni

vyjádřena

beta-hemolýza.

K záchytu

z kontaminovaných vzorků je vhodné použít selektivní půdu s 10% NaCl, který potlačí gramnegativní mikroflóru.

Odolnost Stafylokoky patří mezi relativně rezistentní mikroby k zevnímu prostředí. Odolávají vyschnutí, především v hnisu, i zahřívání na teploty kolem 60˚C. O jejich schopnosti množit se v přítomnosti 10 % NaCl již bylo pojednáno. Z dezinfekčních prostředků jsou poměrně odolné vůči fenolu. Alkohol je spíše konzervuje než hubí. Vůči nenasyceným mastným kyselinám a bazickým barvivům jsou naopak citlivější než gramnegativní bakterie.

Patogenita a patogeneze Přibližně třetina lidí je bezpříznakovými nosiči S. aureus. Zlaté stafylokoky nalezneme nejčastěji v dutině nosní, na hrázi, v axilách a na vagíně. Vyvolávají řadu onemocnění (tab. 5). Onemocnění vyvolaná zlatými stafylokoky jsou nejčastěji hnisavá, případně s celkovými

toxickými

případy nebo

jde

o

otravy z potravin.

Ke

vzniku

stafylokokových infekcí predisponují zranění, nemocní a lidé trpící imunodeficiencí. Charakteristickým rysem stafylokokových stafylokokových infekcí se na vzniku příznaků podílí i pozdní přecitlivělost vůči stafylokokovým antigenům. Vzácně má stafylokokový hnisavý proces tendenci šířit se jako flegmóna.

Tab. 5

Epidemiologie a prevence Neexistuje snad úspěšnější lidský patogen než S. aureus. Přibližně u jedné třetiny lidí žije ve vztahu podobném komensalismu na kůži nebo na sliznicích a nevyvolává žádné potíže. Stačí však sebemenší porucha přirozené imunity a dá o sobě vědět velmi rychle. Pronikne do tkání a vyvolá onemocnění sahající od banálních kožních hnisavých infekcí po vážné záněty vnitřních orgánů až smrtelně končící sepse. Vedle pyogenních infekcí jsou závažným problémem zlatého stafylokoka otravy z potravin. Většina těchto stafylokokových alimentárních infekcí je působená vařenými potravinami s vysokým obsahem bílkovin a soli (Ollinger-Snyder a Matthews 1996). V dohledné době neočekáváme vývoj preventivně použitelnou vakcinu proti stafylokokovým infekcím. Stafylokoky jsou příliš úzce svázány s lidskou populací, než abychom je byli schopni odstranit. Zatím neumíme definovat jejich protekční antigeny. Stafylokokový anatoxin, obsahující formalizované toxiny alfa, beta a delta, má sice omezený terapeutický účinek u chronických procesů, usídlení ale neovlivní. Autovakcíny užívané k léčbě chronických furunkulóz mají spíše desenzibilizační účinek.

Diagnostika Mikroskopicky nelze odlišit S. aureus od ostatních stafylokoků, i když v preparátech z něj častěji než u jiných stafylokoků vidíme ojedinělé gramlabilní koky. Základem laboratorní diagnostiky je přímý průkaz. Základním materiálem je hnis, a to pokud možno tekutina, z níž se dá udělat mikroskopický preparát. Pro průkaz stafylokoků není třeba zvláštních opatření vzhledem k odběru a transportu. Jsou

to mikroby relativně odolné vůči vysychání a změnám teploty. Důležité je zamezení kontaminace okolní mikroflórou. Mikroskopický průkaz je typický, grampozitivní koky ve shlucích a četné leukocyty. Stafylokoky rostou na běžných médiích. Nejlépe se hodí krevní agar a thioglykolátový bujon. Vhodné je použít selektivní médium s 10 % NaCl. Sůl však může potlačit i stafylokoky, a proto je vhodné odečítání výsledků až za 48−72 hodin. S. aureus se určuje na základě koagulasového testu. Ke screeningu podezřelých kolonií se používá průkaz vázané koagulasy, clumping-faktoru. Z kolonie se připraví na sklíčku hustá suspenze v kapce destilované vody a přidá se kapka králičí krve nebo prasečí plazmy. Pokud dojde do 10 sekund k aglutinaci, test je pozitivní. V současnosti se používají diagnostika, která kromě clumping-faktoru detekují i přítomnost proteinu A a kapsulárních polysacharidů. Jsou založena vesměs na latexové aglutinaci, bývají citlivější a specifičtější než běžný sklíčkový test na vázanou koagulasu a vzhledem k jednoduchosti nahradily starší biochemické testy na průkaz hyaluronidasy. Při

využívání

molekulárně

biologické

diagnostiky

byly

na

základě

publikovaných sekvencí vytvořeny sondy i sada primerů, které mohou detekovat geny pro pět typů stafylokokových enterotoxinů (Johnson et al. 1991). Pro hybridizaci byla využita sonda k unikátní oblasti genu 16S rRNA S. aureus. Jiná sonda založená na celkové DNA a označená digoxigeninem byla navržena k detekci téhož organismu, která je schopna zjistit v mléce a masu i a přítomnosti jiných druhů stafylokoků. Kritickým krokem při uplatnění metody PCR je izolace DNA. Při použití lysozymu, lysostafinu a sarkosylu s čistých kultur bylo možno detekovat 100 buněk, přičemž produkty PCR byly sledovány pomocí gelové elektroforézy. Při lýze buněk pomocí zvýšené teploty byly získány pozitivní výsledky až při počtu nejméně 105 buněk. To ukazuje na relativní těžkosti při izolaci DNA z grampozitivních bakterií. U

stafylokoků,

které

produkují

enterotoxin,

byly

určeny

sekvence

odpovídajících gemů (entB a entC1). Na jejich základě byly navrženy primery pro odstupňovanou PCR. Primery pro gen entB umožnily detekci asi 105 cfu ml-1 v kontaminovaném mléce. Citlivost je závislá na přítomnosti možných inhibitorů PCR. Při využití vnějších a vnitřních primerů může být detekován až 1 fg purifikované DNA na reakci. To odpovídá přibližně 10 buňkám. Když byla použita jedna ze sad těchto primerů, byla citlivost asi 100 pg na reakci. Při použití primerů specifických pro geny kódující toxiny typu A, D nebo E byla dosažena citlivost asi 1 buňka na reakci pro

čistotu kulturu nebo 1−10 buněk v jednom gramu vzorku v kontaminovaných potravinách po obohacení kultury (Tsen a Chen 1992). Pomocí amplifikace vnitřních přepisovaných mezerníků (ITS-PCR) se podařilo rozlišit

31

klonů

stafylokoků

kagulasanegativních

a

2

klony

stafylokoků

kagulasapozitivní, které byly izolovány z mléčných produktů. Pro identifikaci byly použity vysoce polymorfní mezerníkové sekvence 16S-23S rRNA. Takto získané výsledky se shodovaly s výsledky získanými klasickými postupy. ITS-PCR se ukazuje jako velmi vhodná metoda pro zevruvnou analýzu stafylokokových izolátů na druhové i vnitrodruhové úrovni (Murru et al. 2005). Pro rychlé rozlišení klonů bylo u tohoto mikroorganismu použito polymorfismu délky restrikčních fragmentů u produktů PCR (PCR-RFLP). Tak se dařilo rozlišit klony nesoucí velmi blízké geny (dva kódující enterotoxin /seg a sei/ a tři kódující látku podobnou enterotoxinu /selm, seln a selo/ (Collery et al. 2007).

4.3.4. Čeleď Streptococcaceae

4.3.4.1. Rod Streptococcus

Do rodu Streptococcus (řecky streptos, řetěz) náleží fakultativně anaerobní grampozitivní katalasanegativní koky. Mezi streptokoky patří jak druhy obligátně patogenní, tak příslušníci normální mikroflóry sliznic zvířat a lidí.

Morfologie Streptokoky se řadí do dvojic až řetízků nejsou pohyblivé. Jejich kolonie jsou i na obohacených půdách někdy velmi drobné.

Kultivace Až na výjimky streptokoky nerostou při 10 ani při 45˚C, ani v přítomnosti 6,5 % NaCl nebo 40% žlučových solí, ani při pH vyšším než 9 a nehydrolyzují eskulin. Jsou citlivé na vankomycin a mnohé na krevním agaru hemolyzují.

Rozdělení Standardně se streptokoky dělí dle hemolýzy. Rozeznáváme hemolýzu beta, alfa a gama. Beta-hemolýza se projevuje odbarvením erytrocytů. Pokud dojde zároveň k projasnění půdy v okolí hemolytické kolonie, označujeme hemolýzu jako úplnou, pokud půda v zóně hemolýzy zůstává zakalená, nazýváme tuto hemolýzu neúplnou. V poslední době se vžívá dělit streptokoky jen na beta-hemolytické a non-betabetahemolytické.

Beta-hemolytické (pyogenní) streptokoky

Mezi

beta-hemolytické

(pyogenní)

streptokoky patří

především

druhy

S. pyogenes a S. agalactiae. Dále jsou pro člověka patogenní S. dysgalactiae ssp. equisimilis a druhy skupiny S. anginosus. S. equi ssp. zooepidemicus, S. canis, S. porcinus, S. iniae jsou primárně zvířecí druhy, ale mohou vyvolat onemocnění i u člověka. Pouze pro zvířata jsou patogenní S. equi spp. equi, S. phocae a S. didelphis.

Streptococcus pyogenes

S. pyogenes je spolu s pneumokokem jedním z nejpatogennějších druhů rodu Streptococcus. Působí především hnisavé infekce kůže a pharyngu, je však schopen vyvolat i vážná celková onemocnění. U disponovaných jedinců se po streptokokové nákaze někdy objeví tzv. pozdní následky (tab. 6).

Tab. 6

Morfologie Pravidelně kulaté až lehce ovoidní koky o průměru 0,6 až 1,0 µm, tedy mnohem menší než stafylokoky. Uspořádány jsou do dvojic až řetízků, dlouhé řetízky jsou přítomny v tekutých kultivačních půdách. Některé kmeny jsou vybaveny pouzdrem z kyseliny hyaluronové.

Biochemické vlastnosti Jako většina ostatních je i S. pyogenes fakultativní anaerob, katalasa i oxidasanegativní. Hlavním produktem jeho metabolismu je kyselina mléčná. Na rozdíl od enterokoků ho zahubí teplota 60˚C během 30 minut. Poměrně dobře ale snáší vyschnutí a lépe než stafylokoky odolává nízkým koncentracím krystalové violeti a solí thalia. Hlavní faktory virulence jsou uvedeny v tab. 7.

Tab.7

Kultivace S .pyogenes je kultivačně poměrně náročný, vyžaduje půdy obohacené sérem nebo krví, na obyčejném agaru a živném bujonu roste velmi špatně. V tekutých půdách tvoří sediment, půda nad ním může být zcela čirá. Přídavek glukosy (Todd-Hewitův bujon) sice podněcuje růst, ale půda s glukosou se může natolik okyselit, že ve starších kulturách mohou streptokoky uhnout. Kolonie S. pyogenes na krevním agaru jsou drobné, většinou lesklé, kolem 0,5 mm v průměru, bývají obklopeny dobře ohraničenou

zónou úplné beta-hemolýzy. Opouzdřené kmeny rostou v koloniích o něco větších, mukoidních. Hemolýza je výraznější při nižším pH a při nižší tenzi kyslíku, naopak ji potlačuje přítomnost redukujících cukrů v médiu.

Epidemiologie Infekce se všeobecně přenáší přímým kontaktem, kapénkami a vně kterých případech potravinami. Z těch hrají hlavní úlohu mléko, vajíčka a maso (Olliger-Snyder a Mathews 1996). Infekce začíná invazí bakterie do malé ranky a pak se šíří do pokožky a podpokožkových tkání. Zde se velmi rychle množí. Streptokokové klony skupiny A, způsobující nekrotizující fasciitis, pronikají až do svalové tkáně, kde se stávají ještě nebezpečnějšími, zvláště, když jsou přítomny další anaerobní bakterie. S. pyogenes není příliš rezistentní. Reaguje tedy citlivě na antibiotika.

Diagnostika Nejspolehlivější metodou, jak prokázat beta-hemolytické streptokoky v krku, je vyočkovat výtěr z mandlí a ze zadní stěny hltanu na standardní krevní agar, roztěr doplnit několika šikmými vpichy pro záchyt hemolýzy vyvolané oxygenlabilními hemolyziny, inkubovat při 37˚C, za 18 hodin odečíst a odečet opakovat za 48 hodin. K záchytu dalších možných původců angín je třeba doplnit roztěr stafylokokovou čarou a kultivovat za zvýšené tenze CO2. Využití molekulárně biologických technik k detekci S. pyognes je založeno především na vyhledávání genu emm, který kóduje jeho hlavní faktor virulence, protein M. Využívání těchto postupů vedlo k novým možnostem typizace u této bakterie (

Lamagni

et

al.

2005).

Většinu izolátů, které byly považovány za netypizovatelné pomocí

sérologikých metod, byl možno pomocí sekvence genu emm charakterizovat (Facklam et al. 1999). Pro detekci streptokoků skupiny A byly použita metoda imuno-PCR. Pro PCR byla použita reportérová sekvence o velikosti 1,3 kb. Minimální detekční limit byl tisíc buněk S. pyognes i za přítomnosti sta tisíc buněk E. coli (Liang et al. 2003)

4.4. Grampozitivní sporulující aerobní tyčinky

4.4.1. Čeleď Bacillaceae

4.4.1.1. Rod Bacillus Rod Bacillus, v přírodě velmi rozšířený, zahrnuje grampozitivní, aerobní tyčinky. Bakterie bývají poměrně velké, o průměru 0,5-1,2 µm a jejich délka přesahuje často 10 µm. Většinou bývají pohyblivé díky peritrichálně umístěným bičíkům. Důležitým znakem tohoto rodu je schopnost tvořit jednu endosporu, s průměrem obvykle menším, než je šířka bakteriální buňky. Sporulace probíhá pouze za přítomnosti kyslíku, protože pro sporulaci získává buňka energii především oxidací zásobních lipidů z cytoplazmy.

Bacillus cereus B. cereus je znám především jako původce enterotoxikóz a devastujících infekcí oka. V roce 1906 popsal Lubenau průjmové onemocnění z potravin způsobené rodem Bacillus. Roku 1950 byl B. cereus definitivně potvrzen jako příčina alimentárních enterotoxikóz a v roce 1971 byla prokázána jeho účast na vyvolání emetického syndromu ve Velké Británii.

Morfologie B. cereus je grampozitivní, neopouzdřená, pohyblivá tyčinka s peritrichálním umístěním bičíků. Jeho buňky jsou poměrně velké (1x3 až 10 µm) s centrálně umístěnými elipsoidními sporami, které nezduřují tyčinku.

Kultivace Kultivačně nenáročná fakultativně anaerobní bakterie, schopná růstu v širokém teplotním rozmezí 8-55˚C (optimum 28-35˚C) a při pH v rozmezí 4,9-9,3. Na běžných půdách tvoří velké (průměr 3-8 mm) „plstnaté“ kolonie s nepravidelnými okraji, na krevním agaru se zónou beta-hemolýzy. U selektivně diagnostických půd se využívá rezistence B. cereus k polymyxinu, který zároveň potlačuje růst kontaminant, neschopnost zkvašovat mannitol a produkce lecithinasy. PEMBA je často požívaná

půda s obsahem polymyxinu, vaječného žloutku, mannitolu, bromthymolové modři a agaru. Lecithinasa vede ke srážení žloutku a tvorbě precipitátu v okolí kolonie.

Epidemiologie Tento saprofyt je běžnou součástí střevní mikroflóry člověka. Jeho spory se hojně vyskytují v zevním prostředí, převážně v půdě a na rostlinách a často kontaminují potraviny. K otravám však dochází až po pomnožení B. cereus v potravině na koncentraci buněk kolem 107g-1 (u dětí stačí koncentrace 105 g-1).

Patogenita B. cereus je producentem celé řady toxinů a enzymů: fosfolipasy C a dvou hemolyzinů, oxygenlabilního cereolysinu a oxygenstsbilního hemolyzinu II. Za vznik enterotoxikóz jsou zodpovědné enterotoxiny: průjmový a emetický toxin. Toxiny vedou v buňkách střevního epitelu ke zvýšené tvorbě cAMP a cGMP, dochází ke ztrátě vody a rozvoji průjmu. Dráždění slizničních zakončení nervus vagus v žaludku vede k nevolnosti a zvracení. Tyto enterotoxiny účinkují též jako superantigeny. Enterotoxikóza vzniká požitím kontaminovaných potravin, ve kterých se B. cereus množí a produkuje enterotoxiny zodpovědné za klinické příznaky. Toxin průjmového syndromu je termolabilní protein, citlivý na proteolytické enzymy, jako trypsin a pepsin. Zvyšuje permeabilitu cév, má nekrotizační účinky a je letální pro myši. Jeho produkce vzrůstá během pozdní exponenciální fáze růstu v poměrně široké škále potravin, hlavně v masných výrobcích a omáčkách. Onemocnění je charakterizované především vodnatými průjmy a kolikami. Příznaky nastupují během 6-16 hodin od požití potravin a trvají 6-24 hodin. Emetický toxin je termostabilní polypeptid (stabilní při 126 ˚C po dobu 90 minut), odolný jak proteolytickým enzymům, tak k nízkému pH. Je produkován především v potravinách obsahujících škrob, např. v rýži a těstovinách. Po požití potraviny s obsahem toxinu se do 1-5 hodin objeví nausea a zvracení (průběh připomíná stafylokokovou enterotoxikózu), trvající často déle než 24 hodin. Jako oportunní patogen může B. cereus vzácně způsobit onemocnění u imunokompromitovaných osob, např. infekci ran, sepsi, endokarditis, meningitis, infekci gastrointestinálního traktu apod. Po poranění oka může vyvolat fulminantně probíhající endoftalmitidu a svými proteolytickými enzymy doslova rozpustit obsah oční koule. Následkem je nejen ztráta visu, ale i celého oka.

Diagnostika K vyšetření se zasílá především potravina podezřelá z vyvolání enterotoxikózy. Bakterii prokážeme kultivací při 37 ˚C po dobu 24 hodin na krevním agaru, případně použitím vhodných selektivních půd. Signifikantní je nález mikroba produkujícího toxin v množství větším než 105 g-1. Při mikroskopickém průkazu použijeme barvení intracelulárních lipidových granul. Průjmový toxin se prokazuje latexovou aglutinací, jak ve vzorcích klinického materiálu, tak u izolovaného bakteriálního kmene. Toxin je možno prokázat i jinými způsoby, například pomocí ELISA, testem akumulace tekutiny v podvázané kličce tenkého střeva králíka, případně pokusem na myších. U tohoto druhu byla zjištěna sekvence genu bceT kódujícího enterotoxin, sloužící pro detekci této bakterie pomocí PCR. Také gen kódující cereolysin AB, cytolytický protein, se podařilo vyhledat pomocí oligonukleotidových sond. V potravinářství však dosud nebylo tohoto postupu využito.

Terapie Vzhledem k tomu, že není možné zabránit kontaminaci potravin sporami této bakterie, je potřeba zabránit jejímu množení v potravinách (vhodné skladování potravin, vhodná úprava pokrmů, vyvarování se skladování již uvařené potraviny delší dobu, nepřipravovat potraviny dopředu a při skladování používat nižších teplot). Léčba enterotoxikóz je spíše symptomatická a spočívá především v rehydrataci. Pro léčbu invazivních onemocnění použijeme antibiotika. Obvykle se podávají linkosamidy, aminoglykosidy a polypeptidy, účinné i na další příslušníky tohoto rodu. Oko se snažíme zachránit okamžitým podáním klindamycinu s gentamycinem.

4.5. Fakultativně anaerobní tyčinky

4.5.1. Čeleď Listeriaceae

4.5.1.1. Rod Listeria

Listeria byla objevena v souvislosti s výzkumem epizoocií u dobytka, doprovázených výraznou monocytózou. Bakterie nese jméno po lordu Listerovi, který zavedl do chirurgie pravidla sepse a antisepse. První infekce člověka byla popsána roku 1929. Pro člověka má především význam Listeria monocytogenes, ostatní druhy (Listeria ivanovii, Listeria inocua, Listeria murrayi, Listeria grayi, Listeria seeligeri) mají význam pouze okrajový nebo žádný.

Morfologie Jedná se o krátké a rovné grampozitivní tyčinky, při nižších teplotách maximálně do 25 °C pohyblivé.

Kultivace Kultivačně je Listeria nenáročný kataláza pozitivní fakultativní anaerob. Zajímavá a diagnosticky využitelná je schopnost žít a množit se v některých extrémních podmínkách. Dobře snášejí například vysoké koncentrace NaCl a žlučových solí a také nízké teploty. Dlouhodobá kultivace při chladničkové teplotě se pro svou selektivitu používá při analýze vysoce kontaminovaných vzorků.

Antigenní struktura Jedná se o grampozitivní bakterie, ale i zde se používá podobného názvosloví jako u enterobakterií – O-antigeny (tělové) a H-antigeny (bičíkové).

Patogenita a patogeneze Listerióza je onemocněním, které může probíhat bezpříznakově u oslabených jedinců (novorozenci, poruchy imunity, AIDS ) však může mít závažné následky. Nejzávažnější jsou infekce novorozenců. Zde může jít i časnou infekci, získanou v děloze (granulomatosní pneumonie, případně se sepsí, neboli granulomatosis

infantiseptica) či později nastupující infekci, získanou při porodu nebo těsně po něm (většinou meningitidy a sepse). U dospělých jde podle cesty přenosu o respirační onemocnění, případně o infekce ran, sepse, močové infekce, někdy také meningitidy. Při přímé expozici může být postiženo oko. Fokální infekce (např. intraabdominální absces) jsou známé, ale méně časté. Inkubační doba je jeden až čtyři týdny. Formy nákazy mohou být různé, od latentních až po septické. Branou infekce je zpravidla trávicí trakt. Listerie pronikají do epitelií střeva nebo jsou absorbovány Peyerskými plaky. Infekce se pak může šířit z buňky na buňku, případně do krevního řečiště s následnou generalizací. V patogenezi je významné intracelulární přežívání listerií.

Diagnostika Kolonie jsou drobné, šedavé, někdy s náznakem beta-hemolýzy, podobné koloniím

enterokoků.

Diferenciální

diagnostika

spočívá

v katalasovém

testu

a v kultivaci na žluč-eskulinové půdě. V poslední době se diagnostika listerií opírá o chromogenní půdy, na nichž jednotlivé druhy rostou v typicky zbarvených koloniích. Ze šesti druhů, které zahrnuje tento rod, je pouze L. monocytoges důležitým patogenem vyskytujícím se v potravinách. Dosud byly vyvinuty četné molekulárně biologické metody zabývající se detekcí druhu rodu Listeria a speciálně pro druh L. monocytoges vzhledem k jeho důležitosti. Byl např. klonován fragment předpokládaného genu kódující hemolysin a byl využit jako sonda pro hybridizaci kolonií při zjišťování počtu buněk v přirozeně kontaminovaných mléčných výrobcích. Oligonukleotid taktéž odvozený ze sekvence uvedeného genu byl využit pro detekci L. monocytoges při sledování umělé kontaminace čerstvého mléka a měkkých sýrů. Uvedený fragment DNA byl později určen jako část sekvence označené jako gen msp. Tento gen kóduje sekretovaný protein o velikosti asi 60 kDa. Gen mspI, který se také označuje jako iap (invasion-associated protein), je konzervovaný u všech klonů L. monocytoges. Jestliže se použijí přesně specifikované podmínky, je pak test specifický pro tento druh. Uvedený fragment byl též označen digoxigeninem a použit pro hybridizaci kolonií. Další genová sonda byla vyvinutá na základě genu pro listeriolysin O. Pro její specifitu je opět nutné přesně dodržovat hybridizační podmínky. Jiná oligonukleotidová sonda byla využita při hybridizaci kolonií ze vzorků z hovězího masa. Efektivnost

sondy závisela na schopnosti kultivačního media potlačovat růst ostatních mikroorganismů při obohacování kultury a na přesném dodržování hybridizačních podmínek. Označení této sondy peroxidasou vedlo k nižší citlivosti, než když byla sonda označena radioaktivně. Při srovnání oligonukleotidových sond ke genu kódujícímu listeriolysin O a genům iap v měkkém sýru, přičemž byly sondy označeny peroxidasou nebo digoxigeninem, se ukázalo, že výsledky ruší vysoké pozadí. Částečné zlepšení systému využívajícího značení digoxigeninem bylo dosaženo odstraněním zbytků buněk z otisků kolonií prostým očištěním měkkým papírem navlhčeným roztokem 5xSSC (komerční „prepare prehybridization solution“). První komerčně dostupná sonda společnosti GeneTrak pro Listeria spp. byla značená izotopem fosforu

32

P. Test založený na využití této sondy dával srovnatelné

výsledky s kultivačním metodami doporučenými US Food and Drug Administration. Když však byly obě metody použity na vzorky přirozeně kontaminovaných plodů moře, byl test se sondou méně citlivý. Nyní je k dispozici kolorimetrická verze tohoto testu. Při porovnání s kultivačními postupy u 250 vzorků přirozeně kontaminovaného sýra a izolátů z prostředí bylo zjištěno 5,9 % chybně určených negativních vzorků (Url et al. 1993). To mohlo být způsobeno tím, že počty buněk Listeria nedosahovaly minimálního detekčního limitu nutného pro hybridizaci (106 buněk ml-1). Při využití druhého komerčně dostupného testu určeného k detekci L. monocytogenes (AccuProbe) je minimální detekční úroveň 105 cfu v 50 ml. Minimální detekční úroveň je závislá na typu obohacovacího media, jehož využití je potřebné. Testy 44 izolátů vedly k jejich správnému určení a zcela korelovaly s tečkovou hybridizací. Pro druhy rodu Listeria je specifický mezerník genů, které kódují jednotky 16S a 23S rRNA. S jeho využitím bylo dosaženo detekčního minima 5 x 102 buněk ml-1 uměle kontaminovaných homogenátů masa bez nutnosti kulturu předběžně obohacovat. Hybridní molekuly rRNA s biotinylovanou sondou rDNA byly z roztoku vychytávány pomocí monoklonálních protilátek proti heteroduplexní dvouřetězcové RNA/DNA. Byly vyvinuty testy PCR, které jsou schopné detekovat jeden nebo více genů specifických pro L. monocytogenes nebo pro všechny druhy rodu Listeria. Jak již bylo zmíněno výše, nejčastěji využívaným je gen hylA, kódující listeriolysin O. Jeho sekvence byla využita i při mnohonásobné PCR. Jako cílové se používají i další geny virulence specifické pro L. monocytogenes jako např. gen iap, gen Dth-18, prfA a prfB a geny kódující hemolysin. Byly použity i další geny tohoto druhu, které nemají vztah

k virulenci (Rossen et al. 1991, Chen et al. 1993, Johnson a Lattuada 1993). Také gen kódující podjednotku 16S rRNA byl použit jako cílový při detekci druhů celého rodu nebo speciálně pro L. monocytogenes. Jako mezinárodní standard pro tento druh byl v současnosti doporučen gen prfA (Rossmanith et al. 2006). Citlivost testů se může zvyšovat v závislosti na optimalizaci jednotlivých kroků PCR. Osvědčilo se především zkrácení časů jednolitých kroků a zvýšení počtu cyklů. Podařilo se detekovat 4 až 40 cfu.g-1 ve zředěných vzorcích potravin bez nutnosti provádět obohacování kultury. Citlivost se dále zlepšila při využití speciálnějších postupu jako je odstupňovaná PCR. Při použití ligázové řetězové reakce je možné odlišit L. monocytogenes a ostatní druhy rodu Listeria na základě rozdílu v jediném páru bází v oblasti V9 genu pro 16S rRNA (Wiedmann et al. 1992). Několik genů virulence L. monocytogenes včetně genu hly, je spojeno se třemi vývojovými větvemi tohoto druhu. Protože schopnost vyvolávat choroby může mít vazbu i na tyto vývojové větve, mohlo by být jejich rychlé rozlišení výhodné při zvažování patogenity. V tomto směru se osvědčilo využití metody MAMA /Mismatch Amplification Mutation Essay/ (Jinneman a Hill 2001). Pro detekci L. monocytogenes se stále častěji využívá reverzně transkripční PCR v reálném čase (RT-PCR v reálném čase - Real-time PCR). Jsou k tomu už k dispozici různé komerční metody (Jantzen et al. 2006). Tento postup spojený s určitým obohacením kultury a využitím referenčního genu prfA umožnil detekovat u uměle kontaminovaných vzorku 7,5 cfu v 25 ml čerstvého mléka, 9 cfu v 15 g lososího masa, 1 cfu v 15 g paštiky a plísňového sýra (Rossmanith et al. 2006)

Epidemiologie Listerie nalezneme u nejrůznějších zvířat, ptáků a ryb, ale také zcela volně ve vnějším prostředí. Jsou ubikvitární. V případě infekce člověka se nicméně jedná zpravidla a alimentární infekci, případně o profesionální expozici při práci se zvířaty. Vektorem nákazy mohou být sýry (protože nevadí ani obsažená sůl, ani nízká teplota při zrání), ale i nejrůznější další potraviny, často to bývají hotová jídla, udržovaná v chladničce před konzumaci.

Terapie V léčbě listeriózy se osvědčují fluorované chinolony a azithromycin. V obou případech je velkou výhodou vynikající průnik do buňky. Lékem volby avšak přesto zůstává

ampicilin,

jen

asi

nemá

význam

dříve

doporučovaná

kombinace

s aminoglykosidy, in vitro je prokazován synergismus, průnik do buňky je však špatný. Specifická prevence neexistuje. Gravidním ženám lze doporučit vyhýbat se rizikovým potravinám. Zkoušejí se různé způsoby ošetřování potravin, úspěšné bylo například gama-záření.

4.6. Grampozitivní sporulující tyčinky

4.6.1. Čeleď Clostridiaceae

4.6.1.1. Rod Clostridium

Zahrnuje sporulující bakterie rostoucí za anaerobních podmínek. Díky tvorbě enzymů (superoxiddismutasa, peroxidasa, katalasa), které neutralizují kyslíkové a peroxidové radikály, jsou některé druhy schopny tolerovat v prostředí malá množství kyslíku. Účinnost těchto enzymů však není příliš velká, a proto i těmto druhům lépe pro růst a klíčení spor prostředí anaerobní. Bakterie tohoto rodu se vyskytuji obvykle jako saprofyté a účastní se v hnilobných procesech. K jejich hojnému rozšíření v přírodě přispívá schopnost tvořit vysoce rezistentní spory, které jsou značně odolné vůči nepříznivým podmínkám zevního prostředí, jako je teplota a záření. vyschnutí a různé chemické látky. Spory bývají přítomny v půdě, vodě, v prachu a mohou kontaminovat potraviny.

Morfologie Vegetativní formy mají tvar velkých, robustních tyčinek, většinou širších než 0,5 µm. Jsou grampozitivní, ale časem mohou tuto vlastnost ztrácet. Většinou jsou díky peritrichálně uloženým bičíkům pohyblivé. Charakteristická je tvorba oválných či kulatých endospor vyklenujících buňku. Umístění spor ve sporangiu je pro různé druhy typické.

Patogenita Jen pár druhů je schopno vyvolat onemocnění člověka či zvířat. Nejčastěji to jsou enterotoxikózy, neurotoxikózy, sepse a nekrotizující infekce měkkých tkání, které často komplikuje intoxikace bakteriálními toxiny a metabolickými produkty.

Clostridium botulinum

Označení Clostridium botulinum zahrnuje poměrně heterogenní skupinu bakterií. Společným znakem těchto bakterií je tvorba toxinu se shodným biologickým účinkem, ale různou antigenní strukturou, podle které se dělí na antigenní typy A-G. Tento neurotoxin je považován za vůbec nejsilnější známý bakteriální toxin. Je příčinou botulismu neboli otravy klobásovým jedem - botulotoxin, odtud pramení název tohoto klostridia (lat. botulus, klobása). Produkce botulotoxinu byla také prokázána u jiných druhů klostridií. a to u Clostridium butyricum (neurotoxin typu E) a Clostridium baratii (neurotoxin typu F). I. skupina: proteolytické mesofilní kmeny tvořící toxiny typu A, B, F. Hojně rozšířené v půdě, na rostlinách a ve střevním traktu savců II. skupina: sacharolytické psychrofilní kmeny produkující toxiny typu B, E, F, nejčastěji se vyskytují ve vodách a u vodních zvířat III. skupina: kmeny produkující toxin typu C a D a Clostridium novyi typ A IV. skupina: proteolytické kmeny produkující botulotoxin typu G a Clostridium subterminale

Epidemiologie C. botulinum je komenzálem střevního ústrojí zvířat, včetně ryb. Jeho spory se vyskytují v půdě, prachu, ve vodě a mohou kontaminovat potraviny. Kolonizace střeva dospělého člověka je méně obvyklá, u kojenců kolonizace střeva muže vést k závažné intoxikaci. Kmeny C. botulinum, produkující toxin typu A, kontaminují především ovoce a zeleninu. Těžiště jejich výskytu je na západě USA a v Číně. Naproti tomu typ B, vyskytující se převážně v masových výrobcích, převládá ve střední Evropě. Kmeny s produkcí botulotoxinu E jsou nejčastěji příčinou otrav rybím masem a potravinami

z vodních živočichů. V naší zemi se naštěstí vyskytuje botulismus poměrně zřídka, obvykle dva až tři případy ročně. Příčinou otravy jsou potraviny kontaminované sporami Cl. botulinum. především nedostatečně sterilované masové a zeleninové konzervy domácí výrob, ve kterých se vytvoří vhodné podmínky pro vyklíčení spor a produkci toxinu. Chladničková teplota a nižší pH tvorbu toxinu omezují, nemusí ji však zcela zastavit. Zdravotní závadnost potravin lze někdy odhalit, zvláště pokud byly natráveny proteolytickými kmeny. Neproteolytické kmeny však často vzhled ani další vlastnosti potraviny nemění.

Diagnostika Je založena na klinickém obrazu (neurologické příznaky, elektromyografícké záznamy), anamnéze a laboratorním průkazu botulotoxinu ve zbytcích potravin, ve zvratcích, v krvi a střevním obsahu postiženého, nejčastěji neutralizačním pokusem na bílých myších. V pozitivním případě hynou myši nechráněné sérem do 24 hodin chabými obrnami. Izolace kmene, který neprodukuje toxin, ke stanovení diagnózy nestačí. Protože neurotoxiny vznikající činností této bakterie mohou působit četná občas i smrtelná paralytická onemocnění, je jejich rychlá detekce a identifikace v potravinách obzvláště důležitá. Účinek C. botulinum je způsoben požitím toxinu, který bakterie už vytvořila dříve. Tedy živé buňky nebo spory C. botulinum ani nemusí být v potravině přítomny, ale toxin tam být může. Protože PCR může být použita pro amplifikaci DNA živých mikroorganismů, které nelze kultivovat, i neživých, může být s výhodou využita pro zjištění, zda byla potravina kontaminována C. botulinum nesoucím určitý gen kódující toxin. Většina detekčních metod na C. botulinum je založena právě na detekci sekvencí genů zodpovědných za produkci neurotoxinů. Szabo et al. (1992) využili dříve zjištěné pořadí aminokyselin neurotoxinu typu B k vytvoření primerů. Citlivost detekce pak byla 10 pg DNA tj. asi 2 x 103 buněk, jestliže byly produkty PCR analyzovány gelovou elektroforézou. Publikované sekvence genu pro neurotoxin typu A umožnily výběr primerů na detekci oblasti o velikosti 1,3 kbp. Pak byl proveden pokus, ve kterém byly konzervované výrobky naočkovány 100 životaschopnými sporami na gram. Ukázalo se, že většina vzorků dává pozitivní výsledky už po 1 dnu inkubace. U některých však

musela inkubace probíhat až 15 dnů. Tyto rozdíly se vysvětlují tím, že spory klíčily v různých produktech rozdílně. To mělo vliv na množství bakterií ve vegetativním stadiu ve vzorku, a tak na množství získatelné DNA. Sekvence genů kódujících toxiny typu B, C, D, E a G mají asi 50% podobnost se sekvencí genu pro toxin typu A. Byly vytvořeny a použity zvláštní sady primerů pro detekci genů kódujících toxiny typu A, B, C, D a E, přičemž bylo dosaženo citlivosti asi 10 fg isolované DNA, což představuje asi 3 buňky. Jiné sady primerů byly testovány pro detekci genů pro produkci toxinů A, B a E. Vyvinut byl i systém pro detekci genu kódujícího toxin typu F. Dále byly použity degenerované primery pro amplifikaci oblasti o velikosti 1,1 kbp genů kódujících toxiny A, B, E, F a G z C. botulinum, C. barati a C. butyricum. Jiný degenerovaný pár primerů byl použit pro amplifikaci oblasti o velikosti 260 bp genů kódujících toxiny typu A, B, E, F a G. V tomto případě byla citlivost 1 vegetativní buňka na reakci pro typy toxinů A a B a 10 buněk pro typ E. Při aplikaci tohoto postupu na vzorky (čerstvé a vařené hovězí, vepřové maso a čerstvé ryby) inokulované 10 vegetativními buňkami C. botulinum na 1 gram vzorku se objevily pozitivní výsledky po osmnáctihodinové kultivaci (Fach et al. 1995)

Clostridium perfringens C. perfringens je nejčastějším původcem plynaté sněti. Jeho schopnost vyvolat těžké nekrotizující infekce měkkých tkání odhalili a popsali už v roce 1898 Veillon a Zuber. Vyskytuje se jako součást normální střevní mikroflóry u zvířat i člověka, zde obvykle v množství 106-108.g-1. Spory lze snadno nalézt i jinde v prostředí, např. v půdě, a mohou snadno kontaminovat potraviny, zvláště maso. Toxiny této bakterie mohou také vyvolat toxikózy trávicího traktu.

Toxiny a patogeneze C. perfringens je producentem celé řady toxických enzymů a na základě spektra tvořených toxinů lze jednotlivé kmeny rozdělit do pěti toxických typů (tab. 8). Diagnostika Epidemiologická anamnéza, klinické příznaky a mikrobiologické vyšetření jsou základem diagnostiky chorob vyvolaných těmito klostridii. U infekcí měkkých tkání odebíráme excizi z rány, exsudát, případně poškozenou tkáň. U střevních postižení je to stolice postiženého a u enterotoxikóz i vzorek podezřelé potraviny.

Tab. 8 Toxické typy Clostridium perfringens Typ

Toxin

C.

Alfa

Beta

Ypsilo

lota

Enteroto

A B

+ +

+

+

-

+

C D E

+ + +

+ -

+ -

+

+ +

Pro molekulárně biologickou diagnostiku bylo využito molekulárních sond. Sonda ke genu, který kóduje enterotoxin, označená digoxigeninem byla využita při hybridizaci kolonií nakultivovaných z hovězího masa. Tímto způsobem bylo možno zjistit méně jak 10 cfu.-1 (Baez a Juneja 1995). Pro přesnou detekci tohoto druhu byla využita PCR-ribotypizace s využitím 16S rDNA. Na základě dostupných databází byly vytvořeny příslušné primery. Získaný produkt o velikosti 279 bp se ukázal jako vysoce specifický právě pro C. perfringens, Testy PCR provedené se stejnými primerů se různými klony C. perfringens, které byly k dispozici, byly vždy pozitivní, zatímco ostatní zkoumané druhy bakterií včetně 11 jiných druhů rodu Clostridium a 38 druhů dalších rodů bylo negativní. V čisté kultuře bylo pomocí tohoto postupu detekovat přítomnost pouhých dvou buněk. Testy provedené se 100 g kuřecího masa uměle inokulovanými 20, 200 a 2000 buňkami byly ve všech případech pozitivní. Nutné ovšem bylo jisté obohacení kultury (Wang et al. 1994). Výhodnost PCR ribotypizace oproti analýze RFLP se ukázala i při sledování hromadného

onemocnění,

které

bylo

způsobeno

požitím

hovězího

srdce

kontaminovaného C. perfringens. Pomocí tohoto postupu se podařilo rozlišit přesně rozlišit vysoce patogenní klony, a nalézt jejich původ (Schalch et al. 2003). Byla též zjištěna sekvence genu kódujícího enterotoxin a byly k ní syntetizovány primery. S úspěchem se je podařilo testovat. Podařilo se také identifikovat klony produkují enterotoxiny za pomoci amplifikace oblastí z genu pro α-toxin a genů pro enterotoxiny. Tyto práce ukázaly, že při analýze vzorků z hovězího masa nekonzervovaného nebo ošetřeného ozářením je třeba jisté opatrnosti. Metod PCR dávala částečně rozdílné pozitivní výsledky ve srovnání s kultivačními postupy. Důvodem pravděpodobně bylo to, že i nedělící se buňky obsahují DNA potřebnou pro proběhnutí reakce.

Pomocí polymorfismu délky restrikčních fragmentů u produktů PCR (PCRRFLP) byly zjištěny jasné rozdíly mezi C. perfringens a C. botulinum a mezi klony C. botulinum produkujícími neurotoxiny typu C a G.

5. ZÁVĚR Z přehledu, který jsem uvedl je zřejmé, že techniky molekulární biologie našly v průběhu 90. let minulého století a začátkem století tohoto místo v detekci kontaminací patogenními bakteriemi v potravinách. Postupně získávaly na důležitosti, protože se ukázaly jako vhodným doplňkem, či dokonce alternativou dříve zavedených diagnostických postupů. Výhodou molekulárně biologických metod je především možnost zkrácení intervalu mezi izolací a identifikací daného patogenního organismu. Další předností může být jednoznačnost získaných výsledků, které není nutno verifikovat dalšími postupy. Zavádění moderních postupů není však ještě zdaleka ukončeno. Jednou z příčin je složitost matricí složek potravin, které zatím mohou zkreslovat získaná data nebo i znemožňovat dosáhnout důvěryhodných výsledků. Další příčinou je to, že se metodická oblast molekulární biologie se stále bouřlivě rozvijí. Tento vývoj se proto musí logicky odrážet i v hledání nových metodických postupů při detekci patogenních mikroorganismů v potravinách. Jak naznačují práce z poslední doby, další vývoj bude zřejmě pokračovat směrem

k miniaturizaci

přístrojové

techniky

-

k biosenzorům.

To

umožní

diagnostikovat patogenní bakterie přímo v terénu, při výrobě i distribuci potravin. Se zaváděním nových diagnostických přístupů se však nesníží význam žádné z detekčních metod již dříve zavedených. Vždy bude nutné pečlivě zvažovat, který postup nejlépe zajistí spolehlivé výsledky.

6. SEZNAM LITERATURY

ALCAZAR-MONTANEZ, C. D., RUBIO-LOZANO, M. S. NUNEZ-ESPINOSA, F., ALONSO-MORALES, R. A. Detection of Salmonella spp. and Listeria monocytogenes in fresh and semi-cured cheeses that are sold on the street markets in Mexico City, Veterinaria-Mexico, 2006, vol. 37, vol. 417─429. BAEZ, L. A., JUNEJA, V. K. Nonradioactive colony hybridization assay for detection and enumeration of enterotoxigenic Clostridium perfringens in raw beef. Appl. Environm. Microbiol., 1995, vol. 61, p. 807-810. BEAN, N. H., GRIFFIN, P. M., GOLDING, J. S., IVEY, C. B. Foodborn disease outbreakc: 5 year summary, 1983-1987. Morbid. Mortal. Wkly. Rep., 1990, vol. 39, p. 15-57. CHEN, J., BOSCH, R., LUCHANSKY, J. B. Isolation and characterization of Listeria monocytogenes-specific nucleotid sequence. Appl. Environ. Microbiol., 1993, vol. 59, p. 4367-4370. ČÍŽEK, A. Praktika z veterinární bakteriologie a mykologie. Dotisk přeprac. vydání z r. 2004, 2006, Veterinární a farmaceutická univerzita Brno. Codex

Alimentarius,

on

line,

http://www.mze.cz/

Index.aspx?ch

=75&typ=1&val=37202&ids=0 (cit 3.11.2006). COELHO, A., MONEN, H., VINCENTE, A. C., SALLES, C. A. An analysis of the v1 and v2 regions of Vibrio cholerae and Vibrio mimicus 16S rRNA, Res. Microbiol., 1994, vol. 145, p. 151-156. COLLERY, M. M. SMYTH, C. J. Rapid differentiation of Staphylococcus aureus isolates harbouring egc loci with pseudogenes psi ent1 and psi ent2 and the selu or selu(v) gene using PCR-RFLP, J. Med. Microbiol. 2007, vol. 56, p. 208-216. FACH, P., GILBERT, M., GRIFFAIS, R., GUILLOU, J. P.,POPOFF, M. R. PCR and gene probe identification of botulinum neurotoxin A-, B-, E-, F-, and G-producing Clostridium spp. and evaluation in food symplex. Appl. Environm. Microbiol., 1995, vol. 61, p. 389–392. FACKLAM, R., BEALL, B., EFSTRATIOU, A., FISCHETTI, V., JOHNSON, D., KAPLAN, E. KRIZ, P., LOVGREN, M., MARTIN, D., SCHWARTZ, B.,

TOTOLIAN, A., BESSEN, D., HOLLINGSHEAD, S., RUBIN, F., SCOTT, J., TYRRELL, G. emm typing and validation of provisional M types for group A streptococci. Emerg. Infect. Dis., 1999; vol. 5, p. 247-253. FALDYNOVA,

M.,

PRAVCOVA,

M.,

SISAK,

F.,

HAVLICKOVA,

H.,

KOLACKOVA, I., CIZEK, A., KARPISKOVA, R., RYCHLIK, I. Evolution of Antibiotic Resistance in Salmonella enterica Serovar Typhimurium Strains Isolated in the Czech Republic between 1984 and 2002, Antimicrobial Agents Chemotherapy, 2003, vol. 47, p. 2002–2005. FENG, P., KEASLER, S. P., HILL, W. E. Direct identification of Yersinia enterocolitica, Transfusion, 1992, vol. 32, p. 850-854. HANDSCHUR, M., PONAD, G., GALLIST, B. LUBITZ, W., HALSBERGER, A. G. Culture free DGGE and cloning based monitoring of changes in bacterial communities of salad due to processing, Food chem. toxicol., 2005, vol. 43, p. 1595−1605. HANES, D. E. KOCH, W. H., MILIOTIS, D. M., LAMEL, K. A. DNA probe for detecting Salmonella enteritidis in food. Mol. Cell. Probes, 1995, vol. 9, p. 9-18. HARWOOD, V. J., GANDHI, J. P., WRIGHT, A. C. Methods for isolation and confirmation of Vibrio vulnificus from oysters and environmental sources: a review, J. Microbiol. Methods., 2004, vol. 59, p. 301-316. HILL W. E., JINNEMAN, K.C.: Principles and Applications of genetic techniques for detection,

identification,

and

subtyping

of

food-associated

pathogenic

microorganisms. In LUND, B. M., BAIRD-PARKER, T. C., GOULD, G. W. Microbiological Safety and Quality of Food, vol. 2, 2000, Springer – Verlag, Berlin. JANTZEN, M. M., NAVAS, J., CORUJO, A., MORENO, R, LOPEZ, V., MARTINEZ-SUAREZ, J. V. Specific detection of Listeria monocytogenes in foods using commercial methods: from chromogenic media to real-time PCR, Span. J. Agr. Res., 2006, vol. 4, p 235-247. JINNEMAN, K. C., HILL, W. E. Listeria monocytogenes lineage group classification by MAMA-PCR of the listeriolysin gene, Curr. Microbiol., 2001, vol. 43, p. 129133.

JOHNSON, W. M., TYLER, S. D., EWAN, E. P., ASHTON, F. E., POLLARD, D. R., ROZEE, K. R. Detection of genes for enterotoxins, exfoliate toxins, and toxic shock syndrome toxin-1 in Staphylococcus aureus by the polymerase chain reaction, J. Clin Microbiol., 1991, vol. 29, p. 426-430. JONES, D. D., BEJ, A. K. Detection of foodborn microbial pathogens using polymerase chain reaction methods. In GRIFFIN, H. G., GRIFFIN A. M. PCR technology current innovations, 1994, CRS Press, Inc., Boca Raton, Fl. JOHNSON, J. L., LATTUADA, C. P. Comparison of nucleic acid hybridization assays and biochemical tests for the confirmation of Listeria monocytogenes. J. Food Prot., 1993, vol. 56, p. 834-840. KITAGUCHI, A., YAMAGUCHI, N., NASU, M. Enumeration of respiring Pseudomonas spp. in milk within 6 hours by fluorescence in situ hybridization following formazan reduction, Appl. Environm. Microbiol, 2005, vol. 71, p. 2748−2752. KITAGUCHI, A., YAMAGUCHI, N., NASU, M. Simultaneous enumeration of viable Enterobacteriaceae and Pseudomonas spp. within three hours by multicolor fluorescence in situ hybridization with vital staining, J. Microbiol. Methods, 2006, vol. 65, p. 623-627. KEASLER, S. P., HILL, W. E. P. Polymerase chain reaction identification of enteroinvasive Escherichia coli seeded into raw milk. J. Food Prot., 1992, vol. 55, p. 382-384. KINGOMBE, C. I., CERQUEIRA-CAMPOS, M.-L., FARBER, J. M. Molecular strategies

for

the

detection,

identification,

and

differentiation

between

enteroinvasive Escherichia coli and Shigella spp., J. Food Prot., 2005, vol. 68, p 239-245. KOCH, W. H., PAYNE, W. L., WENTZ, B. A., CEBULA, T. A. Rapid polymerase chain-reaction method for detection of Vibrio-cholerae in foods, Appl. Environm. Microbiol., 1993, vol. 59, p. 556-560. KOMPRDA T. Obecná hygiena potravin, 2004, Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně.

LAMAGNI, T., EFSTRATIOU, A., VUOPIO-VARKILA, J., JASIR, A., SCHALÉN, C. The epidemiology of severe Streptococcus pyogenes associated disease in Europe. Euro Surveill 2005, vol. 10, p. 179-184. LETT, P.W., SOUTHWORTH, J.P., JONES, D.D., BEJ, A.K. Detection of pathogenic Escherichii koliin ground beef using multiplex PCR. Food est. Anal., 1996, vol. 1, p. 34-38. LI, M. Y., ZHOU, G.H., XU, X. L., LI, C. B., ZHU, W. Y. Changes of bacterial diversity and main flora in chilled pork during storage using PCR-DGGE, Food Microbiol., 2006, vol. 23, p. 607-611. LIANG, H. N., CORDOVA SE, KIEFT TL, ROGELJ S. A highly sensitive immunoPCR assay for detecting Group A Streptococcus, J. Immunol. Methods, 2003, vol. 279, p. 101-110. LONGO, M. C., BERNINGER, M. S., HALLEY, J. L. Use of uracil DNA glycolase to control carry-over contamination in polymerase chain reaction. Gene, 1990, vol. 93, p. 125─128. LUNDBERG, K. S., SHOEMAKER, D. D., ADAMS, M. W., SHORT, J. M., SORGE J.A., MATHUR, E.J. High fidelity amplification usinh a thermostabile DNA polymerase isolated from Pyrococcus furiosus, Gene, 1991, vol. 108, p. 1-6. MIYAMOTO, T., TIAN, H. Z., OKABE, T., TREVANICH, S., ASOH, K., TOMODA, S., HONJOH, K. I., HATANO, S. Application of random amplified polymorphic DNA analysis for detection of Salmonella spp. in foods, J. Food Prot., 1998, vol. 61, p. 785-791. MIYAMOTO, T., TREVANICH, S. HONJOH, K., HATANO. S. Rapid detection of Salmonella spp. by PCR amplification of Salmonella specific region in gat D gene, Jpn. J. Food Microbiol., 1999, vol. 16, p. 99-109. MURRU, N., KODJO, A., VILLARD, L., FRATINO, L. PERRELLI, G., TOZZI, M., CORTESI, M. L. Identification of coagulase negative staphylococci isolated from dairy products using molecular methods, Rev. Med. Vet., 2005, 156, p. 455-459. Nařízení vlády ČR č. 114/1999 Sb., příloha č. 1. NEČAS E. et. al. Obecná patologická fyziologie, 2002, Univerzita Karlova v Praze nakladatelství Karolinum.

NINET, B., BANNERMAN, E., BILLE, J. Assesmentthe Accuprobe kit for Listeria monocytogenes cultures identification reagent kit for rapid colony confirmation and its application invarious enrichment broth. Appl. Environ. Microbiol., 1992, vol. 58, p. 4055─4059. OLLINGER-SNYDER, P., MATTHEWS, M. E. Food safety: review and implications for dietitians and dietetic technicians, J Am Diet Assoc. 1996, vol. 96, p. 163-168. ROSSEN, L., HOLMSTROM, K., OLSEN, J. E., RASMUSSEN, O. F. A rapid polymerase chain reaction (PCR)-based assay for the identification of Listeria monocytogenes in food samples. Int. J. Food Microbiol., 1991, vol. 14, p. 145-152. ROSSMANITH, P., KRASSNIG, M., WAGNER, M., HEIN, I. Detection of Listeria monocytogenes in food using a combined enrichment/real-time PCR method targeting the prfA gene, Res. Microbiol., 2006, vol. 157, p. 763-771. RYCHLÍK, I., PAVLÍK I. Využití metod molekulární genetiky při identifikaci a diferenciaci bakteriální druhů a kmenů. Vet. Med. – Czech, 1997, roč. 42, s. 111−123. RYCHLIK I, SVESTKOVA A, KARPISKOVA R. Subdivision of Salmonella enterica serovar Enteritidis phage types PT14b and PT21 by plasmid profiling. Vet. Microbiol., 2000, vol. 74, p. 217-25. RYS, P. N., PERSING, D. H. Preventing false positives: quantitative evaluation of three protocols for inactivation of polymerase chain reaction amplification products. J. Clin. Microbiol. 1993, vol. 31, p. 2356-2360. SANO, T., SMITH, C. L., CANTOR, C.R. Immuno-PCR: very sensitive antigen detection by means of specific antibody–DNA conjugates. Science, 1992, vol. 258, no. 5079, pp. 120–122. SCHALCH, B., BADER, L., SCHAU H. P., BERGMANN, R., ROMETSCH, A., MAVDL, G., KESSLER, S. Molecular typing of Clostridium perfringens from a food-borne desease outbreak in a nursing home: ribotyping versus pulse field gel electrophoresis. J. Clin. Microbiol., 2003, vol. 41, p. 892-895. SCHUMANN, W. Dynamics of the bacterial chromosome. structure and function. 2006 Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. Kvas , Weinheim. Seznam registrovaných prostředků na ochranu rostlin v ČR.

SZABO, E. A., PEMBERTON, J. M., DESMARCHELIER, P. M. Specific detection of Clostridium botulinum type B by using the polymerase chain reaction, Appl. Environ. Microbiol. 1992, vol. 58, p. 418-420. ŠMARDA, J., DOŠKAŘ, J., PANTŮČEK, R., RŮŽIČKOVÁ, V., KOPTÍKOVÁ, J. Metody molekulární biologie, 1. vyd., 2005, Masarykova univerzita v Brně. TSEN, H. Y., CHEN, T. R. Use of polymerase chain reaction for specific detection of type A, D and E enterotoigenic Staphylococcus aureus in foods, Appl. Microbiol. Biotechol., 1992, vol. 37, p. 685-690.

TSEN, H. Y., WANG, S. J., GREEN, S. S. Salmonella detection in meat and fish by membrane hybridization with chromogenic/phosphatase/biotin DNA probe, J. Food Sci. 1991, vol. 56, p. 1519─1523. URL, B., HEITZER, A., BRANDL, E. Determination of Listeria in dairy and environmental samples: Comparison of a cultural method and a colorimetric nucleic acid hybridization assay. J. Food. Prot., 1993, vol. 56, p. 581-584. VENKITANARAYANAN, K. S., KHAN, M. I., FAUSTMAN, C. Detection of meat spoilage bacteria by using the polymerase chain reaction, J. Food Prot., 1996, vol. 59, p. 845-848. VOTAVA, M. et. al., Lékařská mikrobiologie speciální, 1. vyd., 2003, Neptun, Brno. Vyhláška 325/2003 Sb. Vyhláška 44/2004 Sb. Vyhláška 304/2004.Sb. WACHSMUTH, I. K., BOPP, C. ., FIELDS, P. I., CARRILO, C. Differences between toxigenic Vibrio cholerae O1 from South America and US gulf coast, Lancet, 1991, vol. 337, p. 1097-1098. WANG, R-F., CAO, W-W., FRANKLI, W., CAMPBELL, W., CERNIGLIA, C. E. A 16S r|DNA-based PCR metod for rapid and specific detection of Clostridium perfrigens in food. Mol. Cell. Prob., 1994, vol. 8, p. 131-138. WEGMÜLLER, M., LÜTHY, J., ADRIAN, U. Direct polymerase chain reaction detection of Campylobacter jejuji and Campylobacter coli in raw milk and dairy products. Appl. Environ. Microbiol., 1993, vol. 59, p. 2161-2165.

White paper on food safety, on line http://europa.eu/ documents/ comm/ white_papers/index_cs.htm#2006 (cit. 3.11:2006). WIEDMANN, M., CZAJKA, J., BARANY, F., BATT, C. A. Discrimination of Listeria monocytogenes from other Listeria by ligase chain reaction, Appl. Environ. Microbiol., 1992, vol. 58, p. 3443-3447. WOOD, P. K., MORRIS, J. G., SMALL, P. L. C., SETHABUTR, O., TOLEDO, M. R. F., TRABULSI, L., KAPER, J. B. Comparison of DNA probes and the Sereny test for indentification of invasive Shigella and Escherichia coli

strains. J. Clin.

Microbiol., 1986, vol. 24, p. 498-500. YAMAGUCHI, N., OHBA, H., NASU, M. Simple detection of small amounts of Pseudomonas cells in milk by using a microfluidic device, Lett. Appl. Microbiol. vol. 43, p. 631-636. Zákon č. 157/1998 Sb. ZAPLETAL, O., RUPRICH, .J., DVOŘÁKOVÁ, D., NEPEJCHALOVÁ, D., VRÁNOVÁ, E. Speciální veterinární toxikolologie, 1. vyd. Brno, 2001, Veterinární a farmaceutická univerzita Brno.

7. Seznam obrázků, tabulek a příloh Seznam obrázků Obr. 1 Možnosti využívání sond…………………………………………...…………29 Obr. 2 Hybridizace kolonií…………………………………………………...………30 Obr. 3 Počátek polymerasové řetězové reakce………………………….....................33 Obr. 4 Průběh polymerasové řetězové reakce…………………………………...……34 Obr. 5 Agarozová gelová elektroforéza produktů PCR…………………………..…..35 Obr. 6 Typizace genu pro 16S rRNA pomocí metody PCR-RLFP…….………….....41 Obr. 7 Postup stanovení polymorfismu délky amplifikovaných fragmentů metodou AFLP……...........................................................................................................50 Obr. 8 Schematické znázornění imuno-PCR………………………………...…….…51

Seznam tabulek Tab. 1 Holistický přístup k interakcím ovlivňujících produkci mykotoxinů…………..20 Tab. 2 Příklady primerů………………………………………………………………..37 Tab. 3 Kauffmann-Whiteovo antigenní schéma……………………………….………75 Tab. 4 Faktory virulence Staphylococcus aureus…………………………………...…87 Tab. 5 Onemocnění vyvolávaná Staphylococcus aureus………………………………89 Tab. 6 Onemocnění vyvolávaná Streptococcus pyogenes……………………………..92 Tab. 7 Faktory virulence Streptococcus pyogenes…………………………………….93 Tab. 8 Toxické typy Clostridium perfringens…………………………...……………106

Seznam příloh 1. Potraviny a suroviny živočišného původu – mikrobiologické nálezy – období 2001-05 2. Izolace bakteriálních původců onemocnění z potravin v letech 2003 - 2005 SZPI

Příloha 1

Potraviny a suroviny živočišného původu mikrobiologické nálezy – období 2001 – 05

Příloha 2

Izolace bakteriálních původců onemocnění z potravin v letech 2003 - 2005 SZPI