II
MENDELOVA ZEMĚDĚLSKÁ A LESNICKÁ UNIVERZITA V BRNĚ Agronomická fakulta Ústav morfologie, fyziologie a genetiky zvířat
KMENOVÉ BUŇKY Bakalářská práce
Brno 2006
Vedoucí bakalářské práce:
Vypracoval:
prof. Ing. Josef Dvořák, CSc
Jan Smetana
III
SOUHRN Ve své bakalářské práci jsem se snažil shrnout základní poznatky o kmenových buňkách, a problémech a možnostech jejich potenciálního využití v medicínské praxi. Do dnešní doby byly zatím popsány dva základní typy kmenových buněk. Prvním typem jsou kmenové buňky dospělých tkání, které se dnes již běžně medicínsky využívají (např. při transplantaci kostní dřeně). Druhým typem jsou embryonální kmenové buňky, které se dostaly do podvědomí širší veřejnosti teprve v nedávno. Tito kmenové buňky mají schopnost vyvinout se v buňky jakékoliv lidské tkáně, protože mohou nahradit buňky poškozené nebo zničené během průběhu nemoci a které si imunitní systém neumí sám vytvořit (např. neurony, buňky srdeční svaloviny). Problémem při jejich výzkumu je však jejich zisk, který je (hlavně v případě lidských embryonálních kmenových buněk) ve většině vyspělých zemí, jako například USA nebo Itálie, tvrdě omezován legislativou, což může mít za následek velké zpoždění ve vývoji a tvorbě léku na tak závažných chorob jako je Parkinsonova nebo Alzheimerova choroba, cukrovka, infarkt myokardu, mrtvice nebo popáleniny.
IV
SUMMARY The aim of this paper is to resume basic information about problems and possibilities of utilization of stem cells in medical treatment. Until now there were described two kinds of stem cells. We have better knowledge about stem cells from matured tissues (MAPC), which are nowadays commonly used in medical treatment (f.e. transplantation of the bone core). Another kind of stem cells is embryonic stem cells (ESC). The ESCs have ability to develop itself in every kind of tissue’s cells. Therefore ESC can substitute cells, which were damaged or destroyed during disease, and which the immune system itself cannot create (f.e. neurons). The greatest problem for ESCs research is obtaining, because only source of human ECS is an embryo at the age of 6 days, which is after extraction destroyed. This fact has led (especially in case of human ESC) in many advanced countries such as USA or Italy to hard legislative restrictions for research and using ESCs, which can lead to big delay for development and creation of cure for such serious diseases such as Parkinson's, Alzheimer's, diabetes, heart disease, stroke or burns.
V
Poděkování Rád bych poděkoval vedoucímu mé bakalářské práce prof. Ing. Josefu Dvořákovi za cenné podněty a připomínky při procesu tvorby této práce a dále Dr. Tomáši Urbanovi a Mgr. Karlu Bílkovi za poskytnuté rady a informace k formální úpravě.
VI
Prohlášení Prohlašuji, že jsem bakalářskou práci na téma KMENOVÉ BUŇKY vypracoval samostatně a použil jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém soupisu literatury. Souhlasím, aby práce byla uložena v knihovně Mendelovy zemědělské a lesnické univerzity v Brně a zpřístupněna ke studijním účelům.
V Brně, dne 10.05. 2006
Jan Smetana
VII
OBSAH Strana 1. ÚVOD .………………………………………………………………………….......
8
1.1. Obecná charakteristika kmenových buněk ……………........................
8
2. KMENOVÉ BUNŇKY Z DOSPĚLÝCH TKÁNÍ ..............................................
9
2.1. Typy MAPC ............................................................................................. 10 2.1.1. Mezenchymatické MAPC ......................................................................... 10 2.1.2. MAPC z tukové tkáně .............................................................................. 10
2.2. Rizika využití MAPC................................................................................ 12 2.2.1. Nádorové riziko ........................................................................................ 12 2.2.2.
Mutace MAPC jako zdroje nádoru .......................................................... 13
2.3. Placentární kmenové buňky.................................................................. 14 3. EMBRYONÁLNÍ KMENOVÉ BUŇKY............................................................ 15 3.1. Charakteristika ESC............................................................................... 15 3.2. Zisk ESC ................................................................................................. 15 3.2.1. IVF kliniky – kliniky asistované reprodukce .............................................. 16 3.2.2. Laboratorní kultivace ESC........................................................................ 16 3.2.3. Charakterizace ESC................................................................................. 17
3.2.3.1.
Pozorování během subkulturace ............................................... 17
3.2.3.2.
Test na specifické povrchové markery .................................... 17
3.2.3.3.
Chromosomální vyšetření .......................................................... 17
3.2.3.4.
Testy pluripotence ........................................................................ 17
3.3. Možnosti terapeutického využití ESC .................................................... 18 3.3.1. Genová terapie ........................................................................................ 18
3.3.1.1.
Metoda přímého transportu ...................................................... 18
3.3.1.2.
Přenos ESC s pozměněnou informací ..................................... 18
3.3.1.3.
Terapeutické klonování ............................................................. 19
3.3.1.4.
Tvorba stembridů ...................................................................... 20
3.4. Omezení pro terapeutické využívání ESC ........................................... 21 3.4.1. Etické aspekty využití terapeutického klonování ..................................... 21 3.4.2. Komerční využití ESC ............................................................................. 21 3.4.3. Legislativní omezení pro využívání ESC ................................................. 22
4. ZÁVĚR ........................................................................................................... 24 5. SEZNAM LITERATURY ................................................................................ 26 6. PŘÍLOHY........................................................................................................ 28
VIII
SEZNAM OBRÁZKŮ Obr. 1. Osteoblasty vytvořené mezenchymálními MAPC (2005, www.osel.cz) Obr. 2. Adipocyt vytvořený z kmenové buňky tukové tkáně (2005, www.osel.cz) Obr. 3. Tuková tkáň nakultivovaná z MAPC na hydrogelu (2005 www.osel.cz) Obr. 4. Mikroskopicky pozorované lidské ESC (Russo E., 2005, http://biology.plosjournals.org) Obr. 5. Speciální ampule pro skladovaní linií ESC v UK Stem Cell Bank v Anglii (P. Macdiarmid, 2005, www.msnbc.msn.com)
SEZNAM PŘÍLOH Příloha 1. Proces tvorby a zisku ESC (2006, http://europa.eu.int.) Příloha 2. Blastocysta s zřetelně diferencovaným embryoblastem (J. Conigham,2001, www.stemcells.nih.gov)
Příloha 3. Kultivační misky s živným roztokem obsahujícím ESC (2005, www.exploratorium.edu)
Příloha 4. Linie ESC. Jádra ESC jsou zbarvena zeleně, povrch buněk červeně (Ren-He Xu, 2005, www.news.wisc.edu)
Příloha 5. Speciální mikropipeta, kterou je do ovocytu vpraveno jádro somatické buňky (2006, http://en.wikipedia.org)
Příloha 6. Mapa zobrazující legislativní prostředí pro terapeutické využití ESC (W. Hoffman, 2005, www.sciencenews.org)
IX
1. ÚVOD Souběžně s technologickým vývojem a došlo za uplynulých dvacet let k prudkému rozvoji biotechnologií, v nichž se jako nejprogresivnější jeví genomika, která podle mého názoru dává do budoucna největší možnosti pro využití v medicíně. Za dva stěžení okruhy zájmu považuji projekt HUGO a interpretaci lidského genomu a dále možnosti genové či buněčné terapie, to znamená léčbu, kdy je do těla pacienta vpraveny buňky s geny produkujícími specifické protilátky. Zatím největším úspěchem v této oblasti je možnost využití speciálního typu buněk, známého jako kmenové buňky. Zatímco projektu oskevenování lidského genomu plnou podporu jak laické veřejnosti, tak odborníků i státních institucí, o možnosti terapeutického využívání kmenových buněk se zatím vedou spory jak na veřejnosti, tak i ve vládních institucích i těch nejvyspělejších států. Důvod, proč podle mě nejnadějnějšímu způsobu léčby nemocí jako je cukrovka, Alzheimerova choroba, infarkt myokardu či leukémie není věnována plná podpora a maximální pozornost, je vcelku jednoduchý. Špatně informovaná veřejnost se bojí pojmů jako klonování, genová terapie a společně s náboženskými institucemi, které odsuzují potraty a vědecká využití nepoužitelných embryí uložených na klinikách asistované reprodukce tlačí na legislativní orgány, aby drasticky omezily nebo úplně zakázaly používání kmenových buněk, která tak z obavy, aby neztratili přízeň voličů, často činí a tak často znemožňují seriózní vědecký výzkum. Ve své bakalářské práci jsem se snažil shrnout základní fakt o výzkumu kmenových buněk a vývoji metod pro jejich použití a zároveň porovnat dnes často kladené etické otázky a odpovědi či stanoviska na ně reagující a formy řešení legislativních opatření týkajících se tohoto tématu v nejvyspělejších státech světa tak, aby bylo možno si udělat o této složité problematice alespoň základní představu. 1.1 OBECNÁ CHARAKTERISTIKA KMENOVÝCH BUNĚK Kmenové buňky by se daly označit za základní stavební kameny vícebuněčných organismů. Mají řadu specifických vlastností, díky nimž jsou v těle jedinečné a prakticky nenahraditelné. Provázejí organismus po celý jeho život nacházejí se ve všech jeho tkáních. Podle umístění je můžeme rozdělit na embryonální kmenové buňky, které tvoří embryo v raném stádiu oplození, a kmenové buňky z dospělých tkání, které jsou lokalizovány ve všech tkáních těla, kde působí jako prekurzory ostatních typů buněk, na které se v případě potřeby diferencují. Dále je možno kmenovém buňky dělit podle schopnosti diferenciace na pluripotentní, což znamená, že se mohou diferencovat v jakýkoliv typ buňky v těle. Touto vlastností jako jediné disponují embryonální kmenové buňky. Jako multipotentní označujeme kmenové buňky z dospělých
X tkání, které se mohou diferencovat pouze v určitý typ tkáňově specifických buněk. Z hlediska
možností terapeutického využití se jeví jako mnohem perspektivnější embryonální kmenové buňky, ale díky mnoha omezením se značná část vědeckých institucí zaměřuje spíše na kmenové buňky z dospělých tkání, protože na jejich výzkum a použití nesou vázána žádná omezení (1,2). 2. KMENOVÉ BUŇKY Z DOSPĚLÝCH TKÁNÍ Kmenové buňky z dospělých tkání (nebo embryí z pozdějších fází vývoje), zvané též somatické nebo běžně označované jako MAPC (multipotent adult progenitor stem cells – multipotentní progenitorové buňky) tvoří prekurzory buněk ve všech dospělých tkáních. Jejich účelem je tedy nahrazovat poškozené nebo zničená buňky vlastní poškozené tkáně. Je zajímavé, že tyto buňky přednostně vyhledávají místa, kde je tkáň poškozená a chovají se tak trochu jako sanitka. Když je vědci vstříknou např. do krve myši s uměle navozeným infarktem, buňky se neomylně dostaví na poraněné místo a po určité době je najdeme ve zhojeném srdci (2). Až donedávna panoval názor, že MAPC mají úzkou tkáňovou specifitu. Avšak v poslední době se objevuje stále více studií, které jasně dokazují, že tomu tak není a že i u MAPC byla prokázán jistý stupeň pluripotence, i když ne takový jako u embryonálních kmenových buněk. Podle Catherine Verfaillieové z University of Minnesota, která je jako první v roce 1988 popsala a stále se věnuje jejich výzkumu, existuje dokonce možnost, že těmto buňkám není uzavřena žádná z vývojových drah a mohou se proto proměnit na kterýkoli ze zhruba 240 až 250 typů buněk přítomných v těle dospělého savce. Zatím však byla tato teorie potvrzena pouze u embryonálních kmenových buněk a tak se metodou pokusu a omylu stále ověřují diferenciační schopnosti MAPC (2,4,5). V experimentech se prokázalo, že po transplantaci kostní dřeně nebo obohacených hematopoetických kmenových buněk bylo možno prokázat v postižené tkáni také myoblasty kosterního svalstva nebo myokardu, endotelu, dále buňky střeva, žlučových cest a jater, kůže nebo neuroektodermu. Jiné experimenty pak prokázaly, že kmenové buňky nervové nebo svalové tkáně se mohou diferencovat na buňky hematopoetické. V experimentu bylo prokázáno, že MAPC vyžadují pro uplatnění své plasticity (tj. multipotence v diferenciaci a množení) prostředí embryonálních kmenových buněk (tedy prostředí blastocysty) s expresí jejich genetických markerů: Oct-4, Rex-1, SSEA-1 (1,2).
XI
2.1 Typy MAPC 2.1.1 Mezenchymatické MAPC Mezenchymatické MAPC, označované také jako MSC (Mesenchymal Stem Cells – mezenchymální kmenové buňky) t,j. kmenové buňky z kostní dřeně již delší dobu využívají a výsledky jejich použití jsou dobře popsány. Léčí se tak leukémie, ale i dědičné poruchy krvetvorby k nimž patří například vrozená nedostatečnost imunitního systému postihující tzv. bublinové děti odkázané celoživotně na pobyt ve sterilním prostředí. Medicína udělala v transplantacích kostní dřeně obrovský pokrok. Přesto se potýká s nejedním vážným problémem. Naráží například na zoufalý nedostatek vhodných dárců kostní dřeně. Pro mnohé pacienty není dárce k dispozici a při transplantaci kostní dřeně z dárce s odlišnými buněčnými charakteristikami hrozí vážné komplikace. Část řešení tohoto problému jistě spočívá v zapojení více lidí do registru dárců kostní dřeně. Jejich ochotu darovat kostní dřeň by měly posílit i nové způsoby získávání krvetvorných buněk, při nichž lékaři nemusejí dárci odebírat dřeň přímo z kostí. Dárce dostane léky, které povzbudí jeho krvetvorbu tak, aby se krvetvorné buňky
Obr.1. Osteoblasty vytvořené
potřebné pro transplantaci uvolňovaly z dřeně do krve.
mezenchymálními MAPC
Krev je mu pak odebrána podobně jako pro potřeby krevní transfuze a izolované krvetvorné buňky jsou přeneseny do těla pacienta. Na první pohled se zdá nejlepší použít pro buněčnou terapii pacientovy vlastní mezenchymatické kmenové buňky. S přijetím takových buněk by neměl mít pacient problém. Jeho imunitní systém by je rozpoznal jako buňky vlastního těla a ochotně by je přijal (2,13,19). 2.1.2 MAPC z tukové tkáně Tukovým MAPC věnována značná pozornost v USA, kde jsou legislativou drasticky omezeny možnosti dotací na výzkum embryonálních kmenových buněk. Skoro všechny výzkumy se tedy provádí v soukromích laboratořích a tak se nelze divit, že směry výzkumu se od obecného trendu značně liší.
Obr.2. Adipocyt vytvořený z
Typickým příkladem komerčního využití MAPC může být
kmenové buňky tukové tkáně
například experiment dr. Jeremyho Maa z Illinoiské university v Chicagu, který tukové MAPC použil k tomu aby se rozrostly a změnily v novou tukovou tkáň, kterou nechal vyrůst
XII na biologickém „lešení“. Díky této podpůrné kostře,vyrobené z biologicky snášenlivého
materiálu, se buňky množily do předem zvolených tvarů. Útvar vzniklý z takto vypěstované tukové tkáně již Mao stihl odzkoušet na myším modelu. Posloužily mu k tomu oblíbené myši s nabouraným imunitním aparátem Takové myši nejsou schopny reagovat na cizorodý materiál, a neodhojují xenotransplantáty (tkáně jiného živočišného druhu). Tak mohl Mao odzkoušet, jak se jím vykultivované útvary z lidských buněk budou chovat po přenesení do živého organismu. Nedálo se nic mimořádného a implantáty si držely velikost i tvar. Soudí se, že implantáty narostlé z kmenových buněk budou moci poskytnout bezpečnou alternativu silikonových implantátů. Ty, jak známo, po nějaké době zmenší svojí velikost o 40 – 60%. Je to tím, že neudrží svůj původní tvar a takzvaně se „roztečou“. Nemusí se ale jednat jen o prsní implantáty. Použití by mělo být široké, už proto, že chirurgické rekonstrukce úspěšně používají tukovou tkáň již dlouho. Nyní bude možno takové rekonstrukce provádět i u pacientů u kterých, jak se říká, není kde brát. Největší výhodou nové metody by měly být estetické výsledky takové léčby. Kosmeticky vzato, většinou se jedná o vysprávky „propadlin“, které vznikly jako následek úrazu, nebo jsou připomínkou chirurgické léčby rakoviny prsu. V těchto případech se již výplň vlastní tukovou tkání provádí. Zavedením nové metody by ale měly být výsledky nesrovnatelně lepší, protože se do dolíků již nebude „cpát“ tuková tkáň bez ladu a skladu, a jen podle zkušeností toho kterého operatéra. Kultivace tukové tkáně umožní, že na potřebné místo se bude vkládat vycpávka narostlá do předem zvolených tvarů . Buňky se budou kultivovat na „lešení“ z hydrogelu (biodegradovatelný polymer) a
Obr.3. Tuková tkáň nakultivovaná
výsledný tvar bude možno zhotovit s milimetrovou
z MAPC na hydrogelu.
přesností. Aby z nich ale tuková tkáň vznikala, musí se buňkám navodit podmínky, jako to dělá lidské tělo. Mao, který o výsledcích svého pokusu referoval na konferenci pořádané ve Washingtonu dubnu 2005 Americkou asociací pro pokrok ve vědě, ale nesdělil, jak to přesně dělá. Dá se ale předpokládat, že k ovlivnění MAPC, aby rostly "správným směrem", používá speciální tkáňové faktory (2,3). Podobným způsobem si financuje svůj výzkum i Maův kolega, chirurg M. Hedrick z Kalifornské univerzity v Los Angeles, který po objevení MAPC v tukové tkáni založil firmu StemSource. Ta nabízí pacientům při liposukci, že z jejich tuku izoluje kmenové buňky, uchová je po dobu pěti let, a když pak bude zapotřebí, vyrobí z nich náhradní tkáně
XIII pro transplantaci (náhradu poškozené tkáně tkání novou, leč tělu nemocného vlastní, tudíž
imunologicky snášenou). Stojí to 1500 dolarů navíc k platbě za liposukci. Za 1500 dolarů to těm, kteří už investovali do liposukce, asi stojí, i když možnost takové výroby náhradních tkání je zatím velice nejistá (4). 2.2
Rizika využití MAPC
Rubem schopností MAPC je možnost proměny v nekonečně se množící nádor. Během života dárce byly MAPC vystaveny různým nepříznivým vlivům (např. rentgenové záření nebo chemické mutageny) a proto příležitostí ke vzniku drobných poškození může být dost na to, aby se při dělení MAPC mohli projevit ve formě různých mutací a způsobily, že se začnou dělit nekontrolovatelně a vytvoří zhoubný nádor. Navíc aktivní enzym telomeráza, který napravuje konce chromozomů zkracované při každém dělení a tím vytváří kontrolní mechanizmus dělení buněk, byl detekován jen v některých dospělých kmenových buňkách. 2.2.1 Nádorové riziko Zdaleka ne všechny buňky nádoru mají zhoubnou vlastnost vytvářet nové nádorové buňky. Např. z bílých krvinek v krvi pacienta postiženého leukemií se dokáže dále množit jen jedna ze sta. Ale ne všechny tyto buňky jsou s to vyvolat leukemii. Při pokusech na myších, kterým byla zničena jejich vlastní kostní dřeň a nahradila ji kostní dřeň pacientů s leukemií, se ukázalo, že jen každá miliontá krvetvorná buňka má onu vražednou schopnost. Detailnější pohled ukázal, že buňky stojící u vzniku leukemie postrádají vlastnosti bílých krvinek a v mnoha směrech se podobají základním krvetvorným buňkám, z nichž vznikají všechny možné krevní buňky. Lékaři dobře vědí, že není leukemie jako leukemie a že se tato choroba vyskytuje v mnoha typech a variantách. Ať si ale vybrali pacienta s jakoukoli leukemií, zjistili, že za množení rozličných typů krvinek zodpovídají vždy buňky se zcela "uniformní vizáží". Pokaždé to byla vizáž krvetvorných kmenových buněk. U zrodu leukemie tedy pravděpodobně vždy stojí jedny a ty samé buňky, jež pak poškození dalších genů vysílají na životní dráhu krvinek typických pro rozličné typy leukemie. Na této dráze mohou být buňky postiženy dalšími mutacemi a to jejich kariéru rakovinné buňky ještě dále podpoří. Jednotlivé buňky z "pevných" nádorů se dají v laboratoři izolovat s podstatně většími obtížemi, než jaké provázejí odběr leukemických buněk z krve. I proto je dost komplikované zjišťovat, jaké buňky u zrodu těchto nádorů stojí. Některé studie ale naznačují, že i nádory prsu obsahují kmenové buňky. Stále ještě nelze tvrdit, že nádorové buňky jsou "zvlčilé" kmenové buňky, ale je více než jasné, že k vytvoření nádoru musí mít buňky řadu vlastností typických právě pro buňky kmenové. Také nádory mozku zřejmě vznikají z nervových buněk, jež mají za úkol
XIV vytvářet nové nervové buňky. Biolog Louis Parada z University of Texas vytvořil dvěma
přesně cílenými zásahy do dědičné informace myši, které jsou velmi náchylné k nádorovým onemocněním. Parada zjistil, že ať už se nádor nakonec vytvoří v mozku kdekoli, počátky jeho tvorby lze vystopovat do dvou oblastí postranních mozkových komor a hipokampu. Parada nevěří, že se jen pouhou shodou okolností právě v těchto dvou částech mozku nacházejí nervové kmenové buňky (12,13,20). Pátrání po kmenových buňkách v nádorech je v samých počátcích, ale už teď přináší první prakticky využitelné poznatky. Ukazuje se například, že nebezpečnost nádoru stoupá s podílem rakovinných buněk vykazujících charakteristiky kmenových buněk. Například extrémně agresivní a rychle rostoucí nádor prsu může obsahovat plnou čtvrtinu kmenových buněk. I proto je s tímto typem rakoviny zřejmě tak těžké bojovat. 2.2.2 Mutace MAPC jako zdroje nádoru Také genetici přinášejí neklamné důkazy o tom, že nádorové a kmenové buňky mají spoustu společného. Například pro obnovu tkání a orgánů musí být v kmenových buňkách uveden do chodu gen nesoucí označení Wnt. O tomto genu je známo, že jeho poškození je s to vyvolat u mnoha typů buněk nádorové bujení. Bílkovina, která se podle instrukce genu Wnt v buňkách vyrábí, působí na cílové buňky tak, že se váže na jejich povrchu na speciální vazebné místo. Vazba proteinu Wnt na povrch buňky spouští v jejím nitru celou kaskádu procesů, kromě jiného i "zapínání" a "vypínání" dalších genů. V kmenových buňkách zodpovědných za obnovu střevní sliznice aktivuje protein Wnt 120 genů a 115 jich naopak vypíná. Jakmile se z kmenové buňky vytvoří specializovaná buňka sliznice, role proteinu Wnt končí a 120 původně aktivních 120 genů přestane exprimovat , zatímco genetická informace 115 neaktivních genů se začíná exprimovat. Z hlediska onkologů je nesmírně důležité, že se pod tvrdým diktátem proteinu Wnt se nacházejí i buňky nádoru tlustého střeva, jež proto v mnoha směrech připomínají rejstříkem svých nitrobuněčných aktivit kmenové buňky zajišťující obnovu střevní sliznice. Najdeme v nich stejných 120 probuzených genů jako v kmenových buňkách a právě tak i stejných 115 neaktivních genů. Mutace vyvolávající nádorové bujení buněk tlustého střeva zřejmě působí na kmenové buňky střeva tak, že nedovedou ukončit aktivity typické pro kmenové buňky. Jedním z důsledků těchto aktivit je i intenzivní množení buněk, při němž dochází k dalším poškozením genů. Buňka tak stále jistěji sklouzává na šikmou plochu, z níž není návratu a jež končí vznikem nádoru.
Důkazů o tom, že některé typy nádorů vznikají mutacemi somatických kmenových buněk, jež jsou v našem těle předurčeny k tomu, aby nahrazovaly opotřebené a poškozené buňky,
XV neustále přibývá. V mnoha orgánech, kde se specializované buňky rychle obměňují (např. v
pokožce nebo ve střevě), jsou kmenové buňky jedny z mála (ne-li jediné), které tu žijí dost dlouho na to, aby se z nich mohly sérií genetických poškození vytvořit nádorové buňky. Tento fakt by měly zohlednit i léčebné postupy pro ničení nádorů. Mnohé jsou založeny na ničení rychle se dělících buněk. Kmenové buňky ale mají poněkud překvapivou schopnost dělit se jen za určitých podmínek. Většinu času "jen tak pospávají" a z "dřímot" je probouzí teprve naléhavá poptávka po nových specializovaných buňkách. Stejně se zřejmě budou chovat i kmenové buňky předurčené nějakou mutací k osudu buňky nádoru. Léčba cílená na rychle se množící buňky sice může postihnout specializovanější buňky nádoru, ale mine spokojeně odpočívající kmenové nádorové buňky. Po ústupu nádoru pak mohou tyto kmenové buňky opět procitnout a nádor obnovit. Odvrácená "rakovinná" tvář kmenových buněk je tak mementem pro buněčné terapie využívající MAPC, které na tento typ buněk hodně vsázejí. John Dick poukazuje na fakt, že pro potřeby buněčné terapie je zapotřebí somatické kmenové buňky donutit k intenzivnímu množení, aby lékaři získali dostatečnou masu buněk pro vlastní léčebný zákrok. Při tomto "násilném" množení mohou v buňkách probíhat procesy, které kmenové buňky nasměrují k nádorovému bujení (1,2,5). 2.3
Placentární kmenové buňky
S možnostmi využití placentárních kmenových buněk přišel tým japonských vědců vedených profesorem Yumi Fukuchim z University of Tokyo. Ve snaze co omezit v co nejvyšší míře riziko mutací u MAPC, zaměřil se jeho tým na hledání co nejméně „opotřebovaných“ somatických kmenových buněk. Výzkum byl korunován úspěchem, když prokázali přítomnost kmenových buněk v placentě. Placenta je dostupný, vlastně odpadní materiál, a co je nejdůležitější, její kmenové buňky jsou velmi mladé a díky tomu je riziko mutací minimální. Japonskému týmu se podařilo nasbírat téměř šedesát placent po normálním porodu normálních chlapečků. Izolovali a napěstovali z nich buňky, které vzhledově připomínaly obyčejné fibroblasty. Pomocí detekce Y chromozomu si ověřili, že mají buňky plodu, ne matky. Fluorescenčními barvami si označili šest různých druhů molekul na povrchu buněk a pomocí metody PCR změřili úroveň aktivace 21 různých genů. Získané údaje u těchto buněk porovnávali údaji, které jsou známé pro kmenové buňky kostní dřeně, embryonální kmenové buňky a buňky z pupečníkové krve. Metodami ověřenými u kmenových buněk jiných tkání se jim podařilo přimět placentální buňky k nastoupení cesty diferenciace směrem ke kostním buňkám (osteoblastům) a tukovým buňkám (adipocytům).
XVI Vyrovnali se i s nejčastější námitkou proti podobným studiím. Placenta totiž obsahuje velké
množství různých buněčných typů a popisovat jednu typickou buňku na základě analýzy celé buněčné populace je ošidné. To, že se po přidání specifických faktorů v kultivační misce objeví osteoblasty, může mít na svědomí pouze malá část celkové populace. Ve vhodných podmínkách tyto buňky převáží a přerostou majoritní typ buněk. Aby japonský tým dokázal odpovědět, potřeboval získat charakteristiku jediné buňky a ověřit u ní vše, co zjistil na celé buněčné populaci. Jediná buňka je ale pro experimenty příliš málo. Výzkumníci proto naředili buňky tak, že v každé kultivační misce zbylo po jediné buňce. Za několik dní kultivace pak mohli z jamek sklidit skupinky buněk (klony), které všechny pocházely z jediné původní a měly by tedy mít stejné vlastnosti. U klonů se potvrdilo, že jejich znaky odpovídají charakteru celé populace a umí „udělat“ kostní i tukové buňky. Do budoucna předpokládá prof. Fuchumi touto metodou zkusit vytvořit i neurony či hepatocyty. V současné době se v Japonsku zabývají rozsáhlými kontrolními studiemi, které by umožnily využití této metody v klinické praxi (5,6). 3. EMBRYONÁLNÍ KMENOVÉ BUŇKY 3.1 Charakteristika ESC Embryonální kmenové buňky neboli ESC (embryonic stem cells) jsou esenciální stavebním kameny vícebuněčných organismů. Jejich nejdůležitějšími vlastnostmi je téměř neomezené samoobnovování v nediferencované formě a velmi široká diferenciační schopnost – pluripotence. Pluripotentní kmenové buňky blastocysty lidského zárodku nebo z embryonálních
Obr. 4. Mikroskopicky pozorované lidské ESC
gonád se mohou diferencovat na všechny typy somatických buněk člověka. 3.2 Zisk ESC Poprvé byly lidské ESC úspěšně izolovány a kultivovány v roce prosinci 1998, kdy tým biologů vedený Jamesem Thompsonem z University Of Madison získal 14 blastocyst z kliniky asistované reprodukce a založil pět nezávislých linií ESC (1,2,11) . Jak již napovídá jejich název, ESC jsou získávána z embryí, která pochází z vajíček partenogenicky oplodněných in vitro (Př. 1).
XVII 3.2.1 IVF kliniky – kliniky asistované reprodukce
Vajíčka jsou získávána na IVF klinikách (in vitro fertilization – klinika asistovaná reprodukce), kde jsou byla zamražena poté, kdy byly odebrány pro potřeby umělého oplodnění. Při jednom odběru se pacientce odebere 4 – 5 vajíček, která jsou postupně oplodňována. Jestliže je vajíčko úspěšně oplodněno hned při prvním pokusu, zbytou tedy 4 vajíčka. Jejich další osud závisí na pacientce. Mohou být zničena, nebo zamražena pro dalším použití. Pro výzkumné účely mohou však být použita pouze ze souhlasem pacientky. Dalším, stále častějším způsobem (v zemích, kde to zákon umožňuje) je dárcovství embryí. Vajíčka, která jsou určena pro výzkum ESC, jsou partenogeneticky oplodněna. Partenogeneticky oplozené vajíčko, tzn. bez účasti spermií je k dělení přinuceno použitím speciálního enzymu PLC-zeta, který je extrahován z akrozomu spermie. Embrya vzniklá touto novou metodou neobsahují žádné chromozomy, které by měly dědičné informace po otci. Jsou vybavena pouze dvěma sadami chromozomů po matce, a tak se nemohou vyvíjet jako plod. Embrya, ze kterých jsou ESC získávána, jsou většinou 4 až 5 dní stará a v této době tvoří mikroskopický útvar zvaný blastocysta (9,10). Blastocytu (Př. 2) tvoří dvě vrstvy. Trofoblast je vrstva epiteliálně uspořádaných buněk na povrchu blastocysty. Embryoblast vytváří vnitřní dutinu blastocysty a tvoří jej shluk zhruba 30 - 35 embryonálních kmenových buněk. Z blastocysty jsou ESC odebrány pro další kultivaci v laboratořích. Embryo je po odebráním ESC zničeno (10,11). 3.2.2
Laboratorní kultivace ESC
Rostoucí buňky v laboratoři jsou označovány jako buněčná kultura. ESC jsou izolovány přenesením embryoblastu na laboratorní kultivační misku, která obsahuje živný roztok označovaný jako kultivační médium. Buňky se dělí rostou na podložce misky. Dno kultivační misky je většinou pokrytou vrstvou myších embryonálních kožních buněk, které byly upraveny tak, aby se nemohou dělit. Tato vrstva se označuje jako živná vrstva, která spojuje embryoblast se dnem kultivační misky a také dodává živiny do kultivačního média. Z obav před možným přenášením virů z myších buněk na lidské se nyní již používají techniky kultivace, které umožňují kultivovat lidské ESC bez myších zárodečných buněk. Po pár dnech buňky embryoblastu proliferují a začnou se shlukovat na kultivační misce. V tomto stádiu jsou vyjmuty a umístěny na nové kultivační misky (Př. 3). Tento proces přemisťování, opakující se mnohokrát po dobu asi 6 měsíců, se nazývá subkulturace a každý cyklus subkulturace pasáž. Tímto způsobem se z původních 30 – 35 buněk embryoblastu vytvoří miliony ESC. Tento produkt bývá označován jako linie embryonálních kmenových buněk.
XVIII (Př. 4). Tyto linie mohou být dále uskladněny a použity k dalšímu kultivování nebo
experimentům . 3.2.3
Charakterizace ESC
Procesem charakterizace se rozumí testování ESC během vytváření linií. Cílem charakterizace je ujistit se, zda si ESC zachovali své nejdůležitější vlastnosti. V současnosti zatím nejsou stanoveny standardní postupy charakterizace, jelikož mnoho testů, které se zatím používají, nemohou být brána jako stoprocentně průkazné. Přesto laboratoře zabývající se kultivací ESC používají několik typů základních testů.
Obr.5. Speciální ampule pro skladovaní linií ESC v UK Stem Cell Bank v Anglii
3.2.3.1 Pozorování během subkulturace Během procesu subkulturace jsou dělící se ESC mikroskopicky pozorovány a porovnávány. Zkoumá se, zda jsou buňky zdravé a zda zůstávají nediferencované. Tak se ověří, zda se i v delším časovém intervalu dokáží obnovovat. Testuje se také, zda se ESC dokážou dělit po zamražení a roztání, nebo přemístění. 3.2.3.2 Test na specifické povrchové markery Použitím speciálních technik se ověřuje přítomnost specifických povrchových markerů. Tvoří je proteiny, které jsou specifické pro určitý typ buněk. Tyto proteiny jsou značeny fluorescenčními barvami a poté pozorovány. Typickým příkladem takového markeru je protein Oct-4, který je typické právě pouze u buněk bez specifické diference. Tento protein působí jako transkripční faktor, což znamená, že reguluje „zapínání a vypínání“ ve správný okamžik. Tato funkce velmi důležitá při procesu buněčné diferenciace a vývoje embrya. 3.2.3.3 Chromosomální vyšetření Chromosomy jsou mikroskopicky zkoumány. Takto se ověří, zda chromosomy nebyly během dělení poškozeny a zda odpovídá jejich počet. 3.2.3.4 Testy pluripotence Ověřuje se, zda ESC neztratily pluripotenční schopnost. ESC se nechávají spontánně diferencovat v buněčné kultuře, nebo mohou být upraveny tak, že se formují na specifický buněčný typ, nebo mohou být injekčně vpraveny do laboratorní myši s potlačenou imunitní
XIX reakcí, která se poté vyšetří na přítomnost benigního nádoru – teratomu. Teratomy většinou
obsahují mnoho druhů diferencovaných nebo částečně diferencovaných buněk typů buněk. Tak se prokáže, že ESC se mhou diferencovat na mnoho typů buněk (17,18,20). 3.3
Možnosti terapeutického využití ESC
Díky svým vlastnostem mají lidské ESC neuvěřitelně široko škálu využití. Zatím nejblíže je možnost využití v regenerativní medicíně, kde jsou linie ESC upraveny technologií terapeutického klonování. Zatím pouze teoreticky se uvažuje o možnostech vytváření celých orgánů z ESC. 3.3.1
Genová terapie
Genová terapie je relativně nová, stále se rozvíjející metoda léčby. Zatímco běžná medicína založena na působení léku, který byl vytvořen mimo tělo pacienta, genová terapie jen zaměřena jiným a mnohem perspektivnějším směrem. Jejím cílem je vytvořit vlastní pacientovy specifické buňky, které produkují a přenos na specifické místo léčebnou látku. Instrukce pro tvorbu a přenos takové látky jsou obsaženy v genetické informaci, která byla do buňky vložena uměle – tzv. transgenezí. Genová terapie využívá díky genovému inženýrství možnosti vložit nebo eliminovat specifický gen použitím technik molekulární biologie tak, aby bylo možno přenášet kopii původního genu, která je specificky změněna nebo doplněna a jejíž výsledkem je poté nová funkce genu nebo regulace aktivity jiných genů. Genová terapie využívá dvě základní strategie. První je založena na přímé aplikaci transegenního genu do těla pacienta, druhá využívá možností ESC (13,17). 3.3.1.1 Metoda přímého transportu Transgenní gen většinou nese geneticky modifikovaný virus, který „infikuje“ typy buněk, které napadá v přirozené formě. V těchto buňkách se poté gen exprimuje. Nevýhodou této metody je, že se nedá ověřit výsledek dříve než v těle pacienta a také zde stále byť malá, ale stále možná existence různých mutací viru. 3.3.1.2 Přenos ESC s pozměněnou informací Hlavní výhodou využití ESC je možnost kontroly exprimace genu ještě před aplikací pacientovi. Využitím metod genového inženýrství jsou upraveny hlavní histokompaktibilní proteiny (MHC - major histocompatibility proteins) na membránách ESC tak, aby je pacientův imunitní systém přijal. Dalším krokem je mikromanipulační úprava. Jádro ESC je nahrazeno jádrem buňky pacienta a začne se dále kultivovat tak, jak bylo popsáno výše. Tím
XX se vytvoří specifická linie ESC. ESC jsou poté specificky aplikovány do postižené tkáně
pacienta, kde se poté využito jejich schopnosti rychlého dělení a specifikace na určitý buněčný typ. Např. prof. Zwakovi na University of Wisconsin se při experimentu podařilo vyřadit gen , který se významně podílí rozvoji Lesh-Nyhanova syndromu. Genetici by podle Zwaky nemocnému odejmuli tkáň, získali by menové buňky a z nich by odstranili geny, které nějak souvisejí s geneticky podmíněnými nemocemi. Z těchto kmenových buněk by za přispění prostředků podporujících růst získali náhradní tkáň a přenesli ji na pacienta (12). 3.3.1.3 Terapeutické klonování Terapeutické klonování se jeví zatím jako nejefektivnější postup léčby genovou terapií, protože ESC jsou vytvořeny přímo “na míru“ konkrétnímu pacientovi. Princip je jednoduchý, praktická realizace značně složitá. Pacientovi jsou odebrány buňky poškozené tkáně, ze kterých jsou vyjmuta jádra. Jádro somatické buňky je pak umístěno neoplozeného vajíčka – ovocytu a poté partenogeneticky oplodněno. Vzniká tak embryo, ze kterého jsou potom výše popsaným způsobem nakultivovány ESC a implantovány pacientovy. Jelikož ESC obsahují jádra identická s původním jádrem somatické buňky, nehrozí ze strany pacientova imunitního systému reejekce. Hlavním problémy této metody jsou mikromanipulace a už sám název postupu, vůči kterému se zvedla obrovská vlna odporu a tak vědci pracující v této oblasti dávají při styku s veřejností přednos označení “přenos jader somatických buněk“ neboli SCNT (=somatic cell nuclear transfer). Mikromanipulace je technika, při které je pomocí speciálního přístroje (mikromanipulátoru) vpravena jediná spermie přímo do cytoplazmy vajíčka. V případě terapeutického klonování se místo spermie takto přenáší jádro somatické buňky do neoplozeného vajíčka, kterému bylo jeho vlastní jádro předtím odstraněno (Př. 5). Dalším problémem je zisk takto upraveného embrya, protože v mnoha vyspělých zemích je tato metoda zakázána (viz. dále). Zatím nejvíce, alespoň podle publikovaných výsledků, se tato metoda rozvíjí v Jižní Koreji a v Anglii (19,20). Tým jihokorejských a amerických vědců vedený Woo Suk Hwangem z university v Soulu odebral tělní buňky a vajíčka dobrovolnici, která podepsala souhlasné prohlášení s celou procedurou, a pak provedli „normální“ klonování. Vajíčko zbavili jeho vlastní jaderné dědičné informace a místo ní vpravili do „vykuchaného“ vajíčka jádro z tělní buňky. Vznikl zárodek, který se vyvíjel až do stádia blastocyty. Poté odebrali korejští vědci ESC a
XXI kultivovali je. Woo Suk Hwang schopnost proměny embryonálních kmenových buněk
prověřil hned dvěma způsoby. Zaprvé nutil buňky v laboratořích do proměn nejrůznějších typů a povedlo se mu přitom“přeškolit“ buňky do širokého spektra rolí. Zadruhé vpravil takto získané lidské embryonální kmenové buňky do embrya myši a sledoval, kam všude se buňky při vývoji organismu myši z tohoto zárodku dostávají a na jaké typy buněk se mění. Z výsledků experimentu vyplývá, že Woo Suk Hwang získal terapeutickým klonováním skutečně plnohodnotné lidské embryonální kmenové buňky, z kterých by mohl pro dobrovolnou dárkyni buněk a vajíčka vypěstovat typ buněk potřebný pro léčbu. (10,13). 3.3.1.4 Tvorba stembridů Z důvodu zákazu terapeutického klonování v USA hledají američtí vědci jiné cesty, jak získat ESC. V laboratořích University Of Chicago výzkumný tým pod vedením prof. Verlinského vymyslel postup, jak by šlo získat embryonální kmenové buňky pro konkrétní pacienty, aniž by se museli uchylovat ke klonování. Badatelé vzali embryonální kmenové buňky odebrané z embryí už v minulosti, takže se na ně nevztahuje pozdější legislativní omezení. Z těchto buněk odstranili jádra v centrifuze. To se obvykle dělá tak, že se buňka přilepí k podložce, ta se prudce otáčí, takže těžší jádro "vylétne" z buněčného obalu. Zbylé "obaly" pak Verlinskij spojil s běžnými lidskými buňkami. Detailní popis Verlinskij zatím tají, koneckonců nejde "pouze" o Nobelovu cenu, ale už i o přístup k mnohamiliardovému terapeutickému trhu. Metodu si patentoval, ale tvrdí, že nechce jiným bránit ve stejných pokusech. "Neudělal jsem to proto, abych po vás chtěl nějaké peníze, ale aby nikdo jiný nemohl chtít peníze po mně," řekl na odborné konferenci v Londýně. Nicméně, jak prozrazuje, svým postupem získal buňky, které nazval "stembridy". V nich je jádro z dospělé buňky obklopeno "obalem" (cytoplasmou) z kmenové buňky. Verlinskij tvrdí, že cytoplasma z kmenové buňky svým vlivem "přeprogramuje" vložené jádro (obsahující DNA potenciálního pacienta), takže stembridy pak budou mít stejné léčebné vlastnosti jako embryonální kmenové buňky. A pacientův imunitní systém je neodmítne. Aby dokázal, že opravdu vznikají buňky pro pacienty, spojil mužské dospělé buňky s ženskými embryonálními buňkami. Výsledné stembridy byly mužské, oznámil Verlinskij v Londýně. A opravdu vykazovaly vlastnosti kmenových buněk, včetně toho, že se dokázaly přetvářet na nervové buňky a buňky srdeční tkáně. V této chvíli musí tento postup ověřit další vědci. Pokud se potvrdí, že Verlinského metoda funguje, budou mít lékaři k dispozici poměrně jednoduchý postup, jak získat léčebné buňky vhodné přesně pro konkrétního pacienta, aniž by je museli klonovat. Také odpůrci výzkumu na lidských zárodcích by teoreticky mohli ubrat na
XXII kritice. Pokud je tedy uchlácholí fakt, že Verlinskij používá jen buňky z embryí, která byla
zničena už před několika lety, ale nepracuje s žádnými novými lidskými zárodky (21). 3.4 3.4.1
Omezení pro terapeutické využívání ESC Etické aspekty využití terapeutického klonování
Otázka etiky výzkumu ESC přichází zejména od představitelů křesťanských církví. Zejména katolická církev v čele s papežem se brání jakémukoliv použití ESC. Představa využití lidských embryí jako zdroje ESC spojená s možností terapeutického klonování evokuje u veřejnosti představu o klonování lidí a znovuobrození nacistické eugeniky na už jen hypotetická možnost je vnímána velmi negativně. Od odpůrců potratů přichází další námitky. Potrat za účelem zisku ESC je možná neetický, ale na druhou stranu na klinikách asistované reprodukce je zmraženo velké množství nadbytečných nebo poškozených, které musí být tak jako tak zničeny, takže není důvod je nevyužít. Navíc jsou to embrya často poškozená, takže šanci na život jedince určitě nemají a dají se oplodnit partenogeneticky. Dalším často diskutovaným tématem je možnost klonování lidí. Je faktem, že pokud je embryo s upravenými ESC implantováno do dělohy, může se z něj vyvinout klonované dítě. V klinické praxi je tato varianta bezpředmětná, protože po extrahování ES buněk embryo zaniká. Málokdo se také pozastavuje nad tím, jak složitá je otázka klonování, navíc organismu tak složitého jako je člověk. Oficiálně zatím žádný člověk naklonován nebyl a i kdyby se tak stalo, zatím nikdo neví, jak by takový experiment mohl mít výsledek. Podle vyjádření naší přední odbornice, ředitelky Ústavu experimentální medicíny AV ČR v Praze, profesorky Evy Sykové, je docela možné, že by takoví jedinci nebyli životaschopní anebo by se narodili jako méněcenní, časně umírající lidé s mnoha vrozenými vadami (8,10). 3.4.2
Komerční využití ESC
Otázky komerčního využití objevů základního výzkumu ESC jsou zpravidla nejaktuálnější v USA. Avšak tento problém je třeba řešit i v Evropě. Patentový úřad EU (European Patent Office, EPO) koncem roku vydal 2000 patent na přípravu ESC metodou genového inženýrství, o který požádala universita v britském Edinbourghu, spolupracující s australskou firmou Stem Cell Sciences v Melbourne. Schválení patentu vyvolalo mimořádně silnou kritiku ze strany politiků, médií i některých občanských organizací (Greenpeace aj.). 22.02. 2003 Greenpeace uspořádala demonstraci před budovou EPO v Mnichově, při které došlo na házení cihel a kamení na hlavní vchod do budovy. Německá vláda oznámila, že chystá formální protest proti rozhodnutí EPO. Mluvčí EPO vzápětí přiznal chybu a omluvil se.
XXIII Podstatou sporu je, že patent uvádí „živočišné buňky“, což ve vědecké terminologii
samozřejmě zahrnuje i lidské. S těmi je ale práce ve většině zemí omezena nebo zcela zakázána, takže patent odporuje zákonu – což není možné. EPO ale své vlastní rozhodnutí nemůže zrušit. Na druhé straně, rozhodnutí o udělení patentu je 9 měsíců otevřeno připomínkám. Ty pak EPO projedná a své stanovisko případně změní: při očekávaném odporu vlastníka patentu by to ovšem mohl být proces na léta. V USA není od roku 1994 dovoleno financovat výzkum lidských embryí z federálních zdrojů. Všichni vědci, kteří provádějí výzkum v tomto oboru, si proto musí hledat soukromé sponzory. Tento stav ale považují badatelé za nevyhovující - a žádají tudíž zákonodárce, aby jim prosadili záruku státních dotací. Demokratický senátor Tom Harkin, který je jedním z hlavních aktérů rozpravy, je ale přesvědčen, že kmenové buňky nejsou životaschopnými organismy a že platný zákaz z roku 1994 o nemožnosti placení výzkumu embryí z veřejných financí se na ně nevztahuje. Nositel Nobelovy ceny za chemii Paul Berg jeho názor podpořil. Po těchto diskusích uveřejnil americký Národní zdravotní ústav směrnice, které sice dovolují využití vládních financí na podporu výzkumu kmenových buněk, ale zároveň ve své současné podobě zakazují federálně dotovaným badatelům zakládat nové linie těchto buněk. Toto omezení tedy ukládá, že buněčné linie mohou být získávány jen ze soukromě financovaných nebo komerčních zdrojů, které se řídí protokoly ustanovenými zdravotními směrnicemi. Umožnit jednotlivým, státem financovaným badatelům, aby získávali kmenové buňky v různých podmínkách v jejich laboratořích je nejlepší cestou k určení toho, jaké podmínky jsou rozhodující pro tvorbu buněk pro konkrétní léčebné účely. Získávány, uskladňovány a uchovávány tak, aby jejich účinek pro dané lékařské využití byl co nejvyšší, budou nejspíše ty zárodečné kmenové buňky, které badatel připravuje ve své vlastní laboratoři. Buňky získané z komerčních zdrojů mohou být naopak neznámého genetického původu a nemusejí proto vyhovovat pro důležité studijní účely (10,14,15). 3.4.3
Legislativní omezení pro využívání ESC
Etické i ekonomické problémy, které panují ohledně terapeutického využívaní ESC, se prostřednictvím veřejného mínění (= voličů) promítají do legislativy. Situace se podle jednotlivých zemí liší, ale ve většině případů je terapeutické klonování a využívaní embryí pro zisk ESC vnímán velmi negativně a tak výzkum musí překonávat řadu omezení (Př. 7). Současnému stavu navíc nepomáhá, že postoj k výzkumu ESC je častou politickou zbraní a tak jsou často zákony přijímány bez účasti vědců a na přání laické a špatně informované veřejnosti, která většinou místo seriózních vědeckých výsledků dává přednost zkresleným zprávám v masmédiích anebo se ztotožňuje s postojem náboženských institucí, jejichž
XXIV zastaralé dogmatické postoje mohou napáchat velkou škodu v zemích, kde je většina
veřejnosti věřící. Například na nátlak papeže a tím celé katolické veřejnosti schválil italský parlament v roce 2004 zákon který prakticky znemožňuje asistovanou reprodukci - zmrazování embryí a také jakýkoli výzkum kmenových embryonálních buněk. Tak byl vytvořen precedens, který může být často opakován a tak může úplně paralyzovat solidní vědecký výzkum. Podobná opatření jako v Itálii platí i v Irsku a Polsku. V USA je klonování lidí nezákonné. Přístup k vytváření embryonálních kmenových buněk pro účely výzkumu se však liší podle jednotlivých států. Například je povoleno v Kalifornii a v New Jersey. V dalších jedenácti amerických státech se snaží přijmout zákony, které by výzkum ES buněk povolovaly. Prezident Bush ovšem pod vlivem svého náboženského přesvědčení odmítl financování výzkumu kmenových embryonálních buněk a zakázal vytváření linií ESC. Drží se předsvědčení , že bude vetovat jakýkoliv zákon, který by umožnil platit z federálních peněz odebírání buněk z lidských embryí. "Je to výzkum, který ničí život," vysvětlil. Prezidentu Bushovi i dalším odpůrcům vadí, že při odběru lidských kmenových buněk se zárodek zničí. Jeho zničení považují za zabití člověka. A pokud by se takové embryo mělo dokonce vytvořit klonováním, je to po ně dvojnásob nepřípustné (8,14,15). Ve Francii je klonování lidských embryí je zakázáno, ale povoluje se výzkum embryí získaných z potratů. I v Německu je vytváření embryí pro získávání kmenových buněk zákonem zakázáno. Pro výzkum jsou však povoleny dovozy embryonálních buněk z jiných zemí. Jsou přísně kontrolovány. Ve Švédsku je zákonem povolen výzkum na embryích, která se nevytvářejí v laboratořích, ale zbývají z potratů. V současné době má Švédsko nejvíce ESC linií buněk - čtyřiadvacet. (8,14). Velké Británie je první zemí, která v lednu 2001 legalizovala klonování lidských embryí pro získávání kmenových buněk. Podmínkou je, že blastocysty musí být zničeny dřív, než dospějí do věku 14 dní. Přitom klonování lidí je podobně jako ve většině evropských zemí zákonem zakázáno V roce 2003 byla také oficiálně založena první britská a také první evropská banka kmenových buněk - UK Stem Cell Bank. Vytvářejí se v ní a skladují různé linie kmenových buněk. Dělá zatím první krůčky, ale až bude dokončena, budou v ní všechny linie lidských kmenových buněk k použití pro celý svět. Plánuje se internetové propojení banky s nemocnicemi i s vědeckými laboratořemi po celém světě.
XXV Podobné legislativní prostředí, je panuje v Anglii, platí také v Japonsku či Belgii a jedině díky
podobným liberálním zákonům je pravděpodobně nejdále ve výzkumu ESC Jižní Korea (8,14,15). V ČR byl nyní schválen zákon, který bude oblast zkoumání lidských embryonálních kmenových buněk regulovat. V červenci 2005 jej schválil parlament a nyní čeká na projednání ve vládě. Vládní návrh zákona říká, že čeští vědci smějí vytvářet tyto buňky z embryí, jež vznikla při léčbě neplodnosti a pro něž se nenašlo uplatnění. Takových embryí jsou k dispozici tisíce. V ČR již také platí zákon, kdy po deseti letech jsou přebytečná embrya zničena.Vědcům, kteří se proti tomuto zákonu prohřeší, hrozí pokuta až dva miliony korun, zákaz činnosti, nebo osm let vězení (14,16). 4. ZÁVĚR O významu kmenových buněk dnes již nikdo nepochybuje. Také možnosti využití se díky rozvoji nových technologií se stále rozšiřuje oblast, v které mohou být terapeuticky využity jejich unikátní vlastnosti. Výzkum se však stále musí potýkat s řadou omezení nebo nedostatkem financí. Využívání MAPC je dnes již běžné, ale stále častěji se objevují studie, které možnosti využití MAPC značně omezují a stále je daleko více oblastí, kde se MAPC využít zatím použít nedají. Možnost využití placentárních kmenových buněk je dnes intenzivně zkoumána a dává dobré výsledky, ale pořád to jsou již buňky, které zdaleka nemají takové vlastnosti jako ESC. Jejich výzkum se podporuje hlavně proto, že jsou pro z etického hlediska zcela bezproblémové (placenta je pouze “odpad“z embrya) a mají „ podobné vlastnosti jako embryonální kmenové buňky“ (6,15). Pro laickou veřejnost a zástupce náboženských institucí tyhle dva argumenty stačí, aby zcela odsuzovali využití ESC a použití terapeutického klonování. Prostě lidská embrya se přitom neničí a nic se neklonuje. O tom, jaká je však praktická možnost využití, se však nikde nemluví a pravý stav věcí znají pouze zainteresovaní vědci. Každému, kdo se o problematiku kmenových buněk jen trochu zajímá, je jasné, že ESC jsou zdaleka nejlepší pro využití v regenerativní medicíně. Technologií terapeutického klonování je možné dnes vytvořit naprosto individualizované ESC pro konkrétního pacienta,který trpí jednou z mnoha chorob, které může aplikace ESC řešit. Kromě Alzheimerovy choroby nebo leukémie je teoreticky možno ESC využít při léčbě Parkinsonovy choroby, diabetu, infarktu myokardu, poškození míchy nebo těžkých popáleninách. Proto je třeba co nejdříve vyřešit etické otázky a upravit legislativní prostředí tak, aby bylo možno věnovat se výzkumu ESC
XXVI bez ohledu na veřejné mínění nebo dogmatického pohledu představitelů církve. Navíc mě
osobně často řešená otázka zabíjení člověka (tím se myslí embryo) připadá zcela zbytečná, protože ve skoro všech zemích, snad a kromě Itálie a Polska, kde je zakázán výzkum ESC, jsou povoleny potraty, takže je pro mě z etického hlediska těžko pochopitelný rozdíl mezi embryem starým 6 nebo 60 dní. Souhlasím proto s názorem prof. Syvkové, podle které by s mělo s embryi, která leží bez ladu a skladu zamražená na IVF klinikách, zacházet podobným způsobem jako při dárcovství orgánu. Navíc darovat vajíčka pro terapeutické účely by mohla žena, která již potomky mít nemůže. Názory nesouhlasící menšiny je však třeba respektovat a je nutné postupovat podle zákonem schválených etických norem. Lze pochopit, že pro někoho je pocitově těžko stravitelná představa embrya ve zkumavce, které vzniklo jen proto, aby z něj lékaři získali kmenové buňky. Podobně bylo před pár desetiletími nepříjemné vědomí, že lékaři vyříznou mrtvému člověku srdce, voperují je někomu jinému a zachrání ho před smrtí. Dnes veřejnost považuje transplantace za úspěch lékařské vědy. Asi existují lidé, kteří se s nimi nesmířili. Kdo tedy raději umře, než aby měl v těle cizí orgán, může transplantaci odmítnout. Nesmí však zakazovat jiným, aby se takto léčili. A totéž by mělo platit i pro terapeutické klonování lidských embryí pro zisk ESC. Kdo ví, že nikdy, ani v těžké nemoci, nebude chtít vytvořit ze své buňky klonované embryo a podstoupit léčbu, může si být jist, že jej k tomu lékaři nutit nebudou. Zakazovat použití embryonálních kmenových buněk jiným je však podle mě bezohledné a kruté, stejně jako by byl krutý zákaz transplantací. Proto si myslím, že většina lidí nakonec přijme výsledky sporného výzkumu i s jeho etickými problémy, jestliže získají recept na léčení vážných chorob nebo šanci na obnovení postižených orgánů. Košile strachu z nemoci a smrti je podle mě většině lidí bližší než kabát etiky (10,13,15,16).
XXVII
5. SEZNAM LITERATURY (1)
ZDRAVCENTRA. Kmenové buňky [online]. 2003, [cit. 2006-02-13].
(2)
PETR, Jaroslav. Lidské zárodky dokážou léčit [online]. [cit. 2006-02-13].
(3)
PAZDERA, Josef. Kmenové buňky se mění v prsní implantáty [online]. 20.04. 2005, [cit. 2006-02-14].
(4)
SCHREIBER, Vratislav. Kmenové buňky z liposukce dvě mouchy jednou ranou? [online]. 13.10. 2005 [cit. 2006-02-14].
(5)
FUKUCHI, Yumi. Human Placenta-Derived Cells Have Mesenchymal Stem/ Progenitor Cell Potential. [online]. 28.04.2004 [cit. 2006-02-14].
(6)
DVOŘÁKOVÁ, Jana. Kmenové buňky z placenty [online]. 24.10. 2004 [cit. 2006-02-15].
(7)
PETR, Jaroslav. Embryonální kmenové buňky trápí mutace [online]. 06.09. 2005 [cit. 2006-02-16]. < http://www.osel.cz/index.php?obsah=6&clanek=1437>
(8)
Zázrak zvaný kmenové buňky [online]. 08.06. 2004 [cit. 2006-02-16].
(9)
Nová metoda dělení vajíček: příslib výzkumu kmenových buněk [online]. 2.12. 2004 [cit. 2006-02-16].
(10)
SYVKOVÁ, Eva. Kmenové buňky, morálka a věda [online]. 2005 [cit. 2006-02-16].
(11)
LAŠTŮVKA Z. a kol. Zoologie pro zemědělce a lesníky. 3. vyd. Brno: Konvoj 2004.264 stran. ISBN 80-7302-065-3
(12)
ČTK. Vůbec poprvé vědec pozměnil lidské embryonální kmenové buňky [online]. 13.02. 2003 [cit. 2006-02-16].
(13)
PETR, Jaroslav. Našlápnuto k terapeutickému klonování [online]. 12.02. 2004 [cit. 2006-02-17].
XXVIII
(14)
Embryonální kmenové buňky – žhavá aktualita výzkumu, politiky a obchodu [online]. 27.03. 2000 [cit. 2006-02-17].
(15)
BERG, Paul. Podpora výzkumu lidských zárodečných kmenových buněk [online]. prosinec 2001 [cit. 2006-02-17].
(16)
PETR, Jaroslav. Výzkum buněk: je libo zákon, či právní vakuum? [online]. 22.07.2005 [cit.2006-02-17].
(17)
NATIONAL INSTITUTE OF HEALTH. Stem Cells Basic [online]. 12.08. 2005 [cit. 2006-03-07].
(18)
UNIVERSITY OF WISCONSIN. Embryonic Stem Cells [online]. 2003 [cit. 2006-03-06]
(19)
NATIONAL GEOGRAPHIC – ČR. Zaostřeno: kmenové buňky [online]. 2004 [cit. 2006-03-22]
(20)
Basic about stem cells [online]. 2006 [cit. 2006-03-22]
(21)
NEW SCIENTIST MAGAZINE. Double triumph in stem cell quest [online]. 25.05. 2005 [cit. 2006-04-15].
(22)
NATIONAL INSTITUTES OF HEALTH. Stem Cell Basics [online] 12.08. 2005 [cit.2006-04-18]
XXIX
6. PŘÍLOHY Příloha 1. Proces tvorby a zisku ESC
XXX
Příloha 2. Blastocysta s zřetelně diferencovaným embryoblastem
Příloha 3. Kultivační misky s živným roztokem obsahujícím ESC
XXXI Příloha 4. Linie ESC. Jádra ESC jsou zbarvena zeleně, povrch buněk červeně
Příloha 5. Podstata SCNT – mikromanipulační vpravení jádra somatické buňky do ovocytu
XXXII Příloha 6. Mapa zobrazující legislativní prostředí pro terapeutické využití ESC Země zobrazené tmavě hnědou barvou představují země, kde je povoleno terapeutické klonovaní pro zisk ESC. Světle hnědá barva ukazuje země, kde je zisk ESC povolen pouze z darovaných embryí z IVF klinik a kde je terapeutické klonování zakázáno. Ve žlutě zbarvených zemích je výzkum ESC zakázán nebo nemají zatím nemají legislativní ustanovení pro použití ESC
