Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav výživy zvířat a pícninářství
Vliv minerálních látek (chróm, selen) na kvalitu ejakulátů a antioxidační status plemenných kanců
Vedoucí práce:
Vypracoval:
Prof. Ing. Ladislav Zeman, CSc.
Ing. Pavel Horký
Brno 2012
1
PROHLÁŠENÍ: Prohlašuji, že jsem disertační práci na téma: Vliv minerálních látek (chróm, selen) na kvalitu ejakulátu a antioxidační status plemenných kanců vypracoval samostatně a použil jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém seznamu literatury. Disertační práce je školním dílem a může být použita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího disertační práce a děkana AF MENDELU v Brně.
dne………………………………………. podpis doktoranda……………………….
2
Dovoluji si touto cestou poděkovat vedoucímu disertační práce prof. Ing. Ladislavu Zemanovi, CSc. za odborné vedení a cenné připomínky při zpracování této práce. Díky rovněž patří mé rodině, přítelkyni a všem, kteří mi byli oporou při studiu. Dále chci poděkovat interní grantové agentuře (IGA) Mendelovy univerzity v Brně, bez jejíž finanční podpory, by tato práce nemohla vzniknout. TP IGA AF MENDELU v Brně 2/2011 – Vliv krmných aditiv pro hospodářská zvířata na jejich užitkovost a kvalitu potravinářských produktů / The Effect of Livestock Feed Additives on their Efficiency Parameters and Animal Products Quality TP IGA AF MENDELU v Brně 3/2012 Efektivní využívání surovin a ochrana životního prostředí při výrobě krmiv ve výživě zvířat / Effectivity in Base Material Utilization and Environment Preservation Throught Animal Feed Production and Nutrition Systems.
3
Anotace: HORKÝ, P.: Vliv minerálních látek (chróm, selen) na kvalitu ejakulátu a antioxidační status plemenných prasat. Disertační práce, MENDELU v Brně, 2012, 94 s. Cílem disertační práce bylo zkoumat faktory minerální výživy ovlivňující kvalitu ejakulátu u kanců. Práce zahrnuje dva experimenty, které hodnotí vliv přídavku minerálních látek (chrómu a selenu) na kvalitu vyprodukovaného ejakulátu u plemenných kanců. Dále byl hodnocen vliv chrómu na hladinu glukózy a inzulínu v krvi zvířat a efekt selenu na antioxidační status (tvorba volných radikálů, aktivita glutathion peroxidázy) ejakulátu kanců. Oba experimenty byly provedeny na inseminační stanici kanců ve Velkém Meziříčí. Do sledování bylo zahrnuto 75 kanců v prvním (chróm) a 78 kanců ve druhém (selen) experimentu. V pokusech byla využita plemena Duroc (1. experiment n = 43, 2. experiment n = 46), Bílé ušlechtilé (1. a 2. experiment n = 6), Landrase (1. a 2. experiment n = 11), otcovská plemena SL 38 (Pn x DU, 1. a 2. experiment n = 11) a SL 48 (LW x Pn, 1. a 2. experiment n = 4). Přídavek chrómu neměl předpokládaný příznivý vliv na kvalitu ejakulátu u plemenných kanců, jak tomu dokládají některé studie. Naopak zvířata, kterým byl do krmné směsi přidán chróm v dávce 181,8 µg Cr/kg KS měla průkazně nižší (P < 0,01) celkový počet vyprodukovaných spermií. Dále přídavek chrómu v tomto množství signifikantně snížil koncentraci glukózy (P < 0,01) v porovnání se skupinou zvířat bez přídavku chrómu do krmné dávky. Ve druhém experimentu (jehož poslední část spadala do letních měsíců, kdy docházelo k teplotnímu stresu) byl sledován vliv přídavku selenu v různých dávkách a formách na kvalitu a antioxidační status ejakulátu kanců. Přídavek selenu v dávce 0,3 mg/KS v anorganické formě průkazně snížil celkový počet vyprodukovaných spermií (P < 0,01) a koncentraci spermií (P < 0,01). U plemeníků, kterým byl navýšen selen o 0,6 mg/kg KS v anorganické formě, byl na konci experimentu naměřen průkazně vyšší objem ejakulátu (P < 0,01). Při hodnocení antioxidačního statusu semene kanců, bylo z každé skupiny vybráno sedm zvířat plemene Duroc. U experimentálních zvířat s přídavkem 0,3 mg Se/kg KS (anorganická forma) byla na konci pokusného sledování zjištěna signifikantně vyšší produkce volných radikálů (P < 0,001). Skupina kanců dotovaná selenem v dávce 0,6 mg/kg KS (organická forma) měla v poslední fázi sledování statisticky průkazně zvýšenou aktivitu glutathion peroxidázy (P < 0,001) a koncentraci selenu (P < 0,05) v ejakulátu.
4
Na základě provedených experimentů lze doporučit dávkování selenu v organické i anorganické formě v dávce 0,6 mg/kg KS, naopak zkrmování organického chrómu nelze ve výživě plemenných kanců doporučit.
Klíčová slova: selen, chróm, kvalita ejakulátu, antioxidační status, kanci
5
ANNOTATION:
Horký P.: Effect of minerals (chromium, selenium) on semen quality and antioxidant status of breeding pigs. Dissertation thesis, MENDELU in Brno, 2012, 94 p. The aim of this study was to investigate factors of mineral nutrition influencing semen quality in boars. Current studies includes two experiments that evaluate the impact of added minerals (chromium and selenium) the semen quality produced in breeding boars. It was also evaluated chromium effect on the surface glucose and insulin in the animal blood and selenium effect on antioxidant status (free radicals production and glutathione peroxidase activity) of boar semen. Both experiments were carried out on the boar insemination station in Velké Meziříčí. 75 boars in the first (chromium) and 78 boars in the second experiment (selenium) were included in the observation. Duroc breeds (1st experiment n = 43, 2nd experiment n = 46), White Large (1st and 2nd experiment n = 6), Landrase (1st and 2nd experiment n = 11), paternal breeds SL 38 (Pn x DU, 1st and 2nd experiment n = 11) and SL 48 (LW x Pn, 1st and 2nd experiment n = 4) were used for experiments. The chromium addition did not prove expected beneficial effect on semen quality in breeding boars, as it is evidenced by some studies. On the contrary, the animals to which were added chromium at a dose of 181.8 mg Cr / kg in feed mixture showed significantly lower (P <0.01) the total number of sperm produced. Furthermore, this amount of chromium addition decreased significantly glucose concentration (P <0.01) compared to the animal group without the chromium addition in the feed dose. The effect of selenium addition at various doses and forms on the quality and antioxidant status of boar semen was observed in the second experiment (the last part of summer months, when there was a thermal stress). The selenium addition at a dose of 0.3 mg feed mixture in inorganic form reduced significantly the total number of sperm produced (P <0.01) and sperm concentration (P <0.01). For breeding boars, which were increased by 0.6 mg selenium/kg feed mixture in inorganic form, the semen volume (P <0.01) was significantly higher measured at the end of the experiment. 7 Duroc breeds were selected for evaluation of the antioxidant status of boar semen from each group. Significantly higher production of free radicals (P <0.001) was observed in the treated animals with the addition of 0.3 mg Se/kg feed mixture (inorganic form) at the end of the experimental observation. Boar group was doped with selenium at a dose of 0.6 mg / kg feed mixture (organic form) at the last stage of observation increased significantly glutathione peroxidase activity (P <0.001) and selenium concentration (P <0.05) in the ejaculate. The
6
dosage of selenium in organic and inorganic form at a dose of 0.6 mg / kg feed mixture can be recommended on the basis of performed experiments. On the contrary, feeding organic chromium in the diet can not be recommended for breeding boars.
Keywords: selenium, chromium, semen quality, antioxidant status, boars
7
OBSAH 1
ÚVOD............................................................................................................................9
2
LITERÁRNÍ PŘEHLED............................................................................................10 2.1 PRODUKCE VEPŘOVÉHO MASA VE SVĚTĚ .................................................................10 2.2 VÝZNAM MINERÁLNÍCH PRVKŮ ..............................................................................10 2.3 POTŘEBY MINERÁLNÍCH PRVKŮ ..............................................................................15 2.4 ZDROJE MINERÁLNÍCH LÁTEK .................................................................................16 2.4.1 Organické zdroje minerálních látek...................................................................17 2.4.2 Anorganické zdroje minerálních látek ...............................................................21 2.5 CHRÓM ..................................................................................................................21 2.6 SELEN....................................................................................................................26 2.6.1 Vliv na reprodukci.............................................................................................30 2.7 ZÁKLADNÍ LABORATORNÍ HODNOTY EJAKULÁTU PLEMENNÝCH KANCŮ ...................31 2.7.1 Motilita .............................................................................................................31 2.7.2 Koncentrace ......................................................................................................32 2.7.3 Procento patologických spermií ........................................................................32 2.7.4 Objem ejakulátu ................................................................................................33 2.8 VYBRANÉ KREVNÍ PARAMETRY ..............................................................................33 2.8.1 Glukóza.............................................................................................................33 2.8.2 Inzulín...............................................................................................................33 2.9 REAKTIVNÍ FORMY KYSLÍKU – REACTIVE OXYGEN SPECIES (ROS)..........................34 2.10 ANTIOXIDANTY......................................................................................................36 2.10.1 Superoxiddismutáza (SOD)...........................................................................37 2.10.2 Glutathion peroxidáza (GSH-Px)...................................................................37
3
CÍL PRÁCE ................................................................................................................39
4
MATERIÁL A METODIKA......................................................................................40 4.1 EXPERIMENT Č. 1 – CHRÓM.....................................................................................40 4.1.1 Principy stanovení laboratorních hodnot ejakulátu ...........................................42 4.2 EXPERIMENT Č. 2 – SELEN ......................................................................................43 4.2.1 Druhá část experimentu č. 2 – selen ..................................................................44
5
VÝSLEDKY................................................................................................................48 5.1 EXPERIMENT Č. 1 – CHRÓM.....................................................................................48 5.2 EXPERIMENT Č. 2 – SELEN ......................................................................................49 5.2.1 Druhá část experimentu č. 2 – selen ..................................................................51
6
DISKUZE....................................................................................................................53 6.1 EXPERIMENT Č. 1 – CHRÓM.....................................................................................53 6.2 EXPERIMENT Č. 2 – SELEN ......................................................................................55 6.2.1 Druhá část experimentu č. 2 – selen ..................................................................59
7
ZÁVĚR........................................................................................................................62
8
LITERATURA: ..........................................................................................................64
9
PŘÍLOHY ...................................................................................................................81
8
1
ÚVOD Minerální látky jsou sloučeniny, které organismus zvířete nepotřebuje ve velkém
množství, ale jsou nezbytné pro správný průběh primárních fyziologických pochodů. Jedná se o látky, které mají vztah k těmto základním funkcím strukturální, fyziologické, katalytické a regulační. Mají vztah k celé škále pro chovatele důležitých vlastností jako je reprodukce, celkový zdravotní stav, produkce a s tím spojený ekonomický zisk. U dnešního genotypu prasat, který je na vysoké úrovni musíme umět zajistit i adekvátní výživu, abychom dosáhli optimální produkce a vyhnuli se zdravotním problémům. Pro chovatele prasnic a kanců jsou nejdůležitější reprodukční ukazatele, které rozhodují o ekonomické rentabilitě celého chovu, ať už se jedná o počet narozených selat ve vrhu či počet vyrobených inseminačních dávek. Jedny z nejdůležitějších mikroprvků z pohledu výživy chovných prasat s ohledem na reprodukční ukazatele jsou selen, mangan a zinek. V posledních letech se dostává do popředí zájmu odborné veřejnosti i chróm. V dnešní době se zajišťuje správná vyváženost mikroprvků v krmných směsích pomocí minerálních premixů. Na trhu se objevují zdroje minerálních látek, v anorganické a organické formě tzv. cheláty. Obecně je známo, že organické zdroje mikroprvků dokáže zvíře lépe využívat než jejich anorganické protějšky a umí s nimi i lépe hospodařit. Tato skutečnost má za následek lepší zásobení tkání minerálními látkami při nižších dávkách těchto sloučenin a nižším zatížení životního prostředí. Na druhé straně je nutné brát v potaz vyšší cenu organicky vázaných minerálií a také je správně zařazovat do krmných směsí tak, aby tento zásah byl pro chovatele ekonomicky výhodný. Jako nevýhodu chalátů lze chápat i to, že jsou poměrně snadno falšovatelé. Mělo by být v zájmu široké odborné veřejnosti zjistit jaké zdroje minerálních látek je nejvhodnější podávat plemenným zvířatům, abychom dosáhli optimální reprodukční parametry a chov byl tak konkurenceschopný.
9
2
LITERÁRNÍ PŘEHLED
2.1
Produkce vepřového masa ve světě Vepřové maso je nejdůležitějším zdrojem bílkovin pro lidskou populaci. Během
posledních 30-ti let došlo k požadovanému zvýšení produkce vepřového masa a chovy prasat prošly rozsáhlou industrializací. Během této doby došlo ke zlepšení genetiky, výživy, managementu, ustájení a zdravotní péče. Soubor těchto vyjmenovaných vlivů měl za následek zvýšení produkce (více odstavených selat na prasnici za rok, lepší využitelnost živin, vyšší přírůstky, nižší konverzi krmiva, snížení doby výkrmu atd.). Vývoj krmných dávek a krmných strategií prošel za poslední roky velkou modernizací a stále se pracuje na jeho vylepšování. Hlavní důvody jsou ty, že dnes jsou k dispozici moderní genotypy prasat, které mají specifické požadavky na energii, proteiny, aminokyseliny, ale také na makro a mikro živiny včetně vitamínů a minerálních látek (CLOSE, SURAY, TAYLOR-PICKARD, 2008). Nejvyšší celosvětovou produkci mezi všemi druhy mas zaujímá vepřové maso. V roce 2007 byla jeho spotřeba 110,7 mil. t-1, z toho 21,4 mil.t -1 v Evropské unii. Nejvyšší produkci si drží dlouhodobě Čína s 50,0 mil. t
-1
(ROPPA, 2007, cit. CLOSE, SURAY, TAYLOR-
PICKARD, 2008). BLAIR (2007) dodává, že v současné době se zvyšuje produkce masa v ekologických chovech. Takto vyrobené vepřové maso získává u spotřebitelů na své oblibě.
2.2
Význam minerálních prvků Minerální prvky jsou skupina anorganických prvků odlišných od aminokyselin
sacharidů a tuků. Jejich potřeba se pohybuje v malém množství (g, mg, mikrogramy). Doplnění prvků, nebo iontů je nutné pro normální funkci růstových a reprodukčních procesů u všech zvířat (UNDERWOOD a SUTTLE, 1999). V roce 1874 Forster zjistil, že minerální látky obsažené v popelu po zpopelnění tkání jsou potřebné pro život zvířat. Toto zjištění vedlo k zavedení dietetické esenciality minerálních prvků, neboť uvedené prvky je nezbytné dodávat vedle uhlíku, vodíku, kyslíku a síry, které se získávají prostřednictvím vody, sacharidů, tuků a bílkovin (KVASNIČKOVÁ, 1998). Minerální látky jsou významnými stavebními kameny živočišného těla a mají velký význam ve funkci regulátorů metabolických pochodů (KUDRNA, 1998). Jako stopové prvky jsou obecně akceptovány železo, mangan, měď, zinek, molybden, kobalt, selen, jod, fluor, nikl, chróm, cín a vanad (JELÍNEK a kol., 2003).
10
V organismu prasat se minerální látky podílejí na mnoha významných dějích. Využití minerálií u prasat závisí na:
příjmu minerálií – využití klesá jestliže příjem významně převyšuje potřebu
potřebě minerálií – využití se zvyšuje, když je potřeba vyšší. Využití je vyšší u mladších prasat, u dospělých zvířat se zvyšuje ke konci březosti a v laktaci
chemických vazbách a fyzikální struktuře ve zdroji
interakcích – existuje velký počet antagonistických a synergických vztahů mezi minerálními látkami (ZINTZENA, 1975, cit. ŠIMEČEK, ZEMAN, HEGER, 1993).
Minerální látky existují v buňkách a tkáních živočichů v nejrůznějších formách a kombinacích i v charakteristických koncentracích typických pro určitý prvek a tkáň. Jednotlivé minerální prvky nepůsobí v organismu samostatně, ale vždy ve vzájemných souvislostech. Pro fyziologickou funkci a strukturální integritu tkání musí být zachována optimální koncentrace a poměr minerálních látek (JELÍNEK a kol., 2003). Objasňování esenciální povahy minerálních prvků pro organismus se rychle mění. Esenciální prvek je prvek, který je potřebný pro adekvátní růst, reprodukci a zdraví během života, kdy všechny ostatní nutriční faktory jsou optimální (MULLAN, 2007) Stanovení aktuální potřeby minerálních prvků u plemenných prasat je velice obtížné, mnoho zjištění je založených na minimální úrovni, která zajišťuje prevenci před příznaky deficitu. Role minerálních prvků v reprodukci je často podceňována, každá část reprodukčního cyklu by měla být zohledněna i z hlediska minerální výživy (CLOSE a COLE, 2003). Jak doplňují MAHAN a NEWTON (1995 cit. PETERS a MAHAN 2008) u prasnic klesá celkové množství minerálních látek v těle po třetím reprodukčním cyklu. Tento jev může mít za následek zhoršenou reprodukční výkonnost. Adekvátní minerální příjem v tomto období je nezbytný pro správné udržení hormonální sekrece enzymatické aktivity a ukládání minerálních látek do kostí. QUESNEL a kol. (2008) ve svém experimentu sledovali u prasnic, s doplňkem selenu průkazně vyšší obsah tohoto prvku v kolostru, mléce a krevní plazmě. Seleta od těchto prasnic měla vyšší intenzitu růstu v porovnání se selaty od prasnic, kterým nebyl selen v krmné dávce navýšen. Avšak, mezi experimentálními skupinami nebyl průkazný rozdíl v množství imunoglobulínů v kolostru a mléce. SIVERTSEN a kol. (2007) dodávají, že přídavek selenu do diety selat může zlepšit jejich budoucí vývoj a zlepšit přírůstky ve výkrmu.
11
Minerální látky jsou důležitou součástí diety, mají mnoho rozdílných fyziologických rolí uvnitř těla zvířat, od regulačních funkcí po strukturální. Intenzifikace chovu prasat vedla k suplemntování diet minerálními látkami a zároveň musely být uvedeny limity z obavy nadměrného vylučování těchto sloučenin do půdy a následně i rostlinných produktů. Minerální látky jsou nedílnou součástí i reprodukčního procesu, mikroprvky podporují řadu aktivit včetně udržení buněčného množení, jsou důležité jak pro různé druhy sekrece, tak i pro celkovou imunizaci organismu (CLOSE a COLE, 2003). OPLETAL, SKŘIVANOVÁ, (2010) dodávají, že k ovlivnění sexuality (resp. vývoje gonád) jsou používány právě stopové prvky. Ačkoli se vyskytují ve tkáních ve velmi nízké koncentraci (10-6-10-9 mg. kg-1), mají v organismu mimořádný význam v řadě katalytických a enzymatických, aktivačních a regulačních procesů. Jsou pro život nezbytné a nemohou být nahrazeny jinými látkami, nebo sloučeninami. V současných podmínkách chovu dochází k poruchám metabolismu a karenci mikroelementů nezbytných pro fyziologickou činnost organismu, což má negativní vliv na zajišťování dobrého zdravotního stavu, produkce i reprodukce zvířat. Karence mikroelementů jsou zjišťovány u zvířat především jako subklinické poruchy s negativním působením na konverzi krmiva, růst, reprodukci a produkci. Minerální látky jsou v organismu zastoupeny v množství 3 – 5 % tělní hmoty. Mají významný vliv na normální průběh metabolických procesů a tím i na užitkovost a zdraví zvířat, jejich dlouhověkost, reprodukci atd. Podle stupně potřeby můžeme minerální látky rozdělit na:
Nepostradatelné
Postradatelné
Toxické
Toto rozdělení má ovšem jen relativní platnost. Nepostradatelnost prvku je z pravidla určena:
Přítomností v živočišném organismu v normálním metabolickém stavu
Stabilitou zastoupení v organismu
Morfologickými změnami tkání při vyvolání deficitu prvku v dietě
Dosažením normality metabolického stavu zvířete při aplikaci prvku (ZEMAN a kol, 2006)
WILSON, ROZEBOOM a CRENSHAW (2004) doplňují, že minerální látky se vyznačují také těmito znaky:
Jsou strukturální komponenty těla, např. svalové tkáně a kostí
Jsou obsaženy v tělesných tekutinách
12
Jsou komponenty, nebo aktivátory enzymů, koenzymů a hormonálních mechanismů
Potřeba stopových prvků pro živé organismy je druhově odlišná a jsou v organismu nezastupitelné. Podílejí se na řadě jak trávících, tak biosyntetických procesů. Mikrobiogení prvky vystupují v roli aktivátorů mnoha enzymů a hormonů a tím několikanásobně zvyšují jejich metabolickou účinnost. Nízké zastoupení v krmné dávce a jejich nízká využitelnost je základní příčinou vzniku sekundárních deficiencí minerálních prvků. Biologická využitelnost stopových prvků závisí na mnoha faktorech, chemické a fyzikální formě prvku, velikosti částic krmiva, jeho struktuře a vybilancování dávky na organické a minerální živiny (OPLETAL, SKŘIVANOVÁ, 2010). Podle JELÍNKA a kol. (2003) biologická významnost jednotlivých minerálních látek je veliká a každá porucha metabolismu či změna koncentrace v biologických tekutinách i tkáních ovlivňuje řadu fyziologických a zejména biochemických procesů a tím metabolismus organismu jako celek. Prasata produkují nejvíce svalové hmoty, pokud jejich dieta obsahuje optimální množství esenciálních živin. Někdy prasata konzumují diety, které obsahují nedostatečné, nebo nadměrné množství jedné, či více živin. Následky této krmné dávky jsou od mírných, (slabé, nepozorované snížení přírůstku a konverze krmiva) až po velmi výrazné symptomy, v krajním případě i náhlé úhyny (STRAW, 2003). Podle ZEMANA (2004) obecně platí v českých podmínkách, že často chybí v krmných dávkách prasat vápník a fosfor. Z dalších minerálních látek se v posledních letech projevil nedostatek selenu a zinku, se kterým je někdy spojen nedostatek manganu (to závisí na obsahu těchto mikroprvků v základních krmivech pro prasata – tedy v obilovinách). I když ostatní prvky jsou také velmi důležité pro správný vývin organismu prasat, je jejich zajišťování do krmných dávek mnohem jednodušší a také levnější (např. sůl, krmný vápenec aj.). Nedostatek dalších minerálií se objevuje velmi zřídka, pokud jsou prasat krmená kompletní směsí. Mnohem častěji se deficit objevuje při nesprávné činnosti zootechnikakrmiváře, který ve snaze “zlepšit“ úroveň výživy prasat se snaží obohatit krmnou dávku jednostranným přídavkem jednoho minerálního zdroje (např. vápenec) čímž poruší vyváženost mezi minerálními látkami. S tímto tvrzením se ztotožňuje i SURAI (2002) a dodává, že za fyziologického stavu jsou všechny minerální látky v organismu v dynamické rovnováze, která je řízena homeostatickými mechanismy. Základním předpokladem udržení dynamické rovnováhy minerálních látek v tkáních a biologických tekutinách, je adekvátní přísun krmivy a jejich utilizace. Jak nedostatečný, tak i nadměrný příjem jednotlivých minerálních látek působí na organismus nepříznivě.
13
Zdroji minerálních látek pro zvířata jsou: mateřské mléko, krmiva, voda a limitované doplňky z prostředí. Minerální látky se mohou syntetizovat v tkáních, nebo střevní mikrobiální populaci zvířat, nedostatečnost v příjmu minerálií během dlouhého období vyúsťuje obvykle v projevy chorob z nedostatku. U monogastrů výskyt deficiencí a imbalancí minerální výživy redukuje produkci a negativně ovlivňuje reprodukci. Adice vyšší, než je potřeba, se u monogastrů projevuje metabolickou imbalanci, výskytem toxických symptomů, které snižují produkční schopnosti zvířat a může být v extrémních případech i příčinou úhynu zvířete (LASOTA, BLACZSZIK, SEREMAK, 2004). Řada prvků je přítomna v tkáních monogastrů a má různé metabolické funkce, ale ne u všech jsou známy potřeby. Potenciální deficit v krmných dávkách u jedné či více minerálních látek může zvyšovat potřebu jednotlivých prvků. Jistou roli zde sehrají i zoohygienické podmínky daného chovu (ŠIMEK, 2007). V krmivech pro hospodářská zvířata jsou stopové prvky běžně opomíjeným zdrojem živin. Jejich fyziologické působení bývá velmi často podceňováno a jejich přítomnost v krmivech v dostatečném množství je považována za naprostou samozřejmost. Pro udržení tělesných funkcí, zajištění optimálního růstu, reprodukce a pro dobrou imunitní reakci organismu jsou však stopové prvky zcela nezbytné, což tedy znamená, že hrají důležitou roli při určování zdravotního stavu zvířat. Případný nedostatek těchto prvků může mít také značný vliv na pokles užitkovosti (MILLER, JARVIS, McBEAN, 2007) Intenzivní chov zvířat je více závislý na saturaci minerálních látek. Krmiva pro monogastry obsahují minerálie a existuje řada faktorů ovlivňující jejich obsah a využití pro organismus. Nedostatková množství minerálních látek v krmných dávkách je nezbytně nutné dodat formou premixů. Za pomocí výpočetní techniky lze nyní individuálně, nebo skupinově přepočítat deficit v potřebě mikro a makroprvků. V případě nedostatku je dodat doplňkovou, dobře vyváženou formou (ŠIMEK, 2007). O důležitosti minerálních látek v krmné dávce hospodářských zvířat svědčí skutečnost, že často i zdánlivé nepatrné poruchy rovnováhy těchto látek způsobují pokles užitkovosti, zdravotní poruchy a konečně i smrt zvířete. Ačkoliv živý organismus je do značné míry chráněn
před
takovými
poruchami
různými
regulačními
systémy,
(především
neurohormonálním) je správná souhra pochodů v metabolismu minerálií pro organismus nezbytná. Minerální látky mají velký význam ve funkci regulátoru metabolických pochodů, především pro výraznou funkční pohotovost, která jim umožňuje plnit úlohu právě v té části organismu, kde je jejich potřeba v daném okamžiku nejnaléhavější. Nedostatek minerálních 14
látek v krmné dávce zvířat se nemusí projevit zřetelnými klinickými příznaky onemocnění, nýbrž často probíhá za příznaků subklinických. Z uvedeného je zřejmé, že je třeba objasnit skutečnou potřebu minerálních látek u jednotlivých druhů a kategorií zvířat, s přihlédnutím ke všem vlivům v současných moderních chovech (UNDERWOOD a SUTLE, 1999). V těle slouží minerální látky jako katalyzátory v procesu látkové výměny, k vyrovnání osmotického tlaku buněk, nebo jako regulátory při procesech trávení. Aby minerální prvky plnily svoji funkci, musí být v určitém stálém poměru, neboť množství a funkce jednoho prvku podmiňuje funkci prvku druhého. Nejen nedostatek, ale i nadbytek, nebo nesprávný poměr mohou celkově i částečně škodit živočišnému organismu. Druhy krmných plodin a jejich jednotlivé části se podstatně liší v obsahu minerálních látek. Zvláště rozdílná je koncentrace a vzájemný poměr makro a mikroprvků ve vegetativních a generativních částech krmných plodin. Obsah minerálních látek v půdě, půdní reakce, klimatické podmínky, způsob a intenzita hnojení a celková intenzita rostlinné výroby ovlivňují významně koncentraci a poměr minerálních látek v krmných plodinách. Variabilita obsahu makro a mikroprvků je vyšší v generativních částech krmných rostlin (KUDRNA, 1998).
2.3
Potřeby minerálních prvků Definovat potřeby stopových prvků stejným způsobem jako potřebu energie,
dusíkatých látek, nebo aminokyselin zcela nelze. Tato záležitost je poměrně komplikovaná. Potřebu minerálních prvků lze stanovit jen s obtížemi a většina odhadů vychází z té minimální hladiny, která je potřebná pro překonání příznaků deficience a ne pro stimulaci užitkovosti, či pro zvýšení imunity zvířat. Většina důležitých pokusů zaměřených na studium potřeby minerálních látek se uskutečnila v šedesátých letech minulého století, což znamená, že získané výsledky nelze pro dnešní zvířata považovat za relevantní. Rozdíly potřeby živin vyplívají z různých užitkových cílů a rozdílů ve fyziologickém stavu zvířat. Existuje jen velmi malé množství informací o potřebě minerálních látek u prasat se současným genotypem, uvádí se, že u moderních rychle rostoucích hybridních linií prasat je potřeba minerálních látek zhruba dvakrát tak vysoká než potřeba u pomaleji rostoucích zvířat, která byla na farmách chovaná před dvaceti či třiceti lety (MILLER, JARVIS, McBEAN, 2007). Doba, která uplyne, než se projeví nedostatky deficitu, je velmi rozdílná. Trvá např. čtyři až šest měsíců. V dnešních moderních chovech nemusí být dostačující ani množství fosforu, vitamínu E, cholinu, biotinu a chrómu v krmné dávce. Nutriční potřeby prasat jsou uvedeny v literatuře NRC 1998. Na snížení výskytu deficitu živin můžeme tyto, nebo 15
podobné tabulky využít při sestavování krmných dávek pro prasata. Mimo potřeby živin dle normy NRC 1998, musíme k tabulkovým údajům zohlednit hodnoty prahu bezpečnosti (STRAW,2003). Organismus má velkou schopnost regulace homeostázy minerálních látek, bez ohledu na široké kolísání obsahu makro a mikroelementů v krmivech, zůstává minerální složení tkání poměrně stálé. Tyto regulační mechanismy jsou však omezené, to znamená, že poruchy minerálního metabolismu se při intenzivním využívání zvířat mohou stát vážným limitujícím činidlem tvorby produkce (MILLER, JARVIS, McBEAN, 2007). Potřeba minerálních látek zahrnuje množství prvku potřebného pro funkci bazálního metabolismu (KUDRNA, 1998). U jednotlivých kategorií prasat se nejčastěji vyskytují karence následujících mikroelementů:
selata - železo, zinek, selen
prasata ve výkrmu - zinek, selen
prasnice - zinek, měď
kanci - selen, zinek
Za nejdůležitější pro kance pokládáme zinek a selen. Pravidelná suplementace těmito stopovými prvky je pro chovná zvířata velmi důležitá: superoxiddismutáza (SOD) a glutathion peroxidáza (GSH-Px) jejichž hladina je závislá na přísunu těchto dvou minerálních látek, hraje v extracelulární lokalizaci (v semenné plazmě) jednu z rozhodujících rolí při ovlivňování oxidačního stresu ve spermatoziích (OPLETAL, SKŘIVANOVÁ, 2010).
2.4
Zdroje minerálních látek Pro praktické pochopení významu a každodenní nutnosti doplnění krmných dávek
deficitními minerálními látkami a vitamíny je nutné si uvědomit, že zvláště minerální prvky mají ve srovnání s bílkovinami a energií několikanásobně delší interval působení v látkové výměně v organismu chovaného zvířete. Cílená a racionální minerální výživa, zohledňující řadu nových výzkumných poznatků a praktických zkušeností, výrazně pozvedne celkovou úroveň chovu zvířat, zdraví, produkci, reprodukci a samozřejmě příznivě ovlivňuje tvorbu zisku, který je pro farmáře rozhodujícím ekonomickým ukazatelem (SURAI, 2002). Krmné dávky pro chovná hospodářská zvířata je nutné vždy saturovat doplňkovými zdroji makro a mikroprvků v závislosti na aktuálním obsahu v krmné dávce, potřebě pro
16
konkrétní druh zvířete a reprodukčním stavu (KUDRNA, 1998). Do krmiva jsou přidávány ve formě různých solí, nebo komplexních sloučenin (OPLETAL, SKŘIVANOVÁ, 2010). Potřeba stopových prvků závisí i na druhu zvířat, způsobu chovu, typu krmné dávky, na úrovni produkce, stupni gravidity, na zdravotním stavu a v neposlední řadě i na genetické dispozici. V některých státech jsou oblasti chudé na stopové prvky. Proto se stopové prvky musí zvířatům přidávat do krmných dávek ve formě doplňků a premixů. Výpočty pro optimální zásobování zvířat stopovými prvky jsou limitované informacemi o jejich využitelnosti, endogenních ztrátách, ale hlavně výsledky odborných vyšetření specifických pro určitou oblast (MILLER, JARVIS, McBEAN, 2007).
2.4.1 Organické zdroje minerálních látek Výživa moderních genotypů prasat klade především důraz na potřebu energie a aminokyselin v krmných směsích. U minerálních látek existují rozdíly v tělesných rezervách u prasat diferencovaně podle živé hmotnosti. Jednou z cest, jak intenzivně rostoucím prasatům zajistit potřebné množství využitelných stopových prvků, je obcházení přirozené bariéry zažívacího traktu podáváním stopových prvků ve formách chalátů nebo proteinátů (CLOSE, 2008). V souvislosti s ekologizací v zemědělství se začalo s výrobou minerálních sloučenin s vysokou využitelností a tedy i s malým vylučováním nevyužitelné části do vnějšího prostředí. Čelní místo mezi takovými výrobky zaujímají chaláty (proteináty). Jsou to sloučeniny některých kovů s protoporfyny. Jedná se o dvojmocné železo, trojmocné železo, hořčík, zinek, nikl, kobalt, měď a chróm. Tyto zdroje minerálních prvků mají velmi vysokou biovyužitelnost, což je kvantitativní měřítko využití živin v definovaných podmínkách k podpoře normálních struktur a fyziologických procesů organismu (ZEMAN, 2004). BLAIR (2007) dodává, že existují oprávněné obavy možnosti průniku neabsorbovaných anorganických prvků z exkrementů zvířat do půdy a možnost kontaminace spodních i povrchových vod. Proto by aplikované množství anorganické formy prvku nemělo překračovat bezpečnou hranici. Minerální látky přijaté rostlinami a mikroorganismy pocházejí převážně z anorganické formy. V rostlinných buňkách jsou tyto prvky převáděny na organické sloučeniny (transportní nosič). U zvířat jsou to především sacharidy, aminokyseliny a kyselina mléčná. Je podstatné, že každý článek potravního řetězce dává přednost jiné specifické sloučenině. Katalytická
17
aktivita prvků, převážně kovů, je známá. Stupeň a intenzita této katalytické aktivity minerálních látek se znásobuje vytvářením aktivních komplexů – bioplexů s organickými sloučeninami (ŠIMEK, 2001). Podle CREECHTY (2004) jsou povolené organické vazby aminokyselin, nebo kyseliny glycinové. V prvním případě pochází anion z hydrolyzovaného proteinu, v druhém případě ze syntetického glycinu. Se selenem není možná žádná chelátová forma. Selen je v organické vazbě k dispozici pouze z kvasnic. Z minerálních látek jsou nejvhodnější k výrobě chelátových sloučenin dvojmocné železo, mangan, zinek, měď a kobalt. Většinou se jedná o dipeptidy, které po přidání kovových iontů mění svou elektronovou konfiguraci a tím napomáhají hydrolýze a uvolňování kovových iontů v organismu. Na základě výsledků pokusů prováděných v posledních letech je možné shrnout jejich význam pro prasata: Zlepšují reprodukční schopnost prasnic (redukují embryonální úmrtnost zlepšením nitroděložního prostředí, snížení výskytu cyst na vaječnících, zlepšení projevu říje aj. Snižují ukládání tuku u prasat Zlepšují kvalitu špárků a štětin Podporují zlepšení imunitního systému Zlepšují kvalitu semene u kanců Zlepšují kvalitu mléka u prasnic (ZEMAN, 2004) Pro aplikaci do krmných dávek zvířat jsou vyvíjeny nové produkty krmivářských biotechnologií, zdroje makro a mikroprvků v organicky vázaných formách. Tyto zdroje představují nutriční faktory, které mohou příznivě ovlivnit využití živin, (stravitelnost, retenci, bilanci) zlepšit kvalitu a kvantitu produkce. Tím, že jejich využitelnost pro organismus je vyšší než u anorganických solí prvků, je také jejich vylučování z těla nižší. Snižuje se tak riziko zvýšené kontaminace životního prostředí. Minerální látky vázané na organickou transportní složku – chaláty, ovlivňují příznivě stravitelnost živin. Exaktní údaje o vlivu těchto nových forem zdrojů minerálních látek však nejsou doposud všechny k dispozici (KIM a MAHAN 2001). Cílem výživářů je zajistit, aby příjem jednotlivých prvků byl bezpečný a adekvátní. Při koncentracích prvků mezi bezpečnou a toxickou hladinou může existovat farmakologický účinek (KVASNIČKOVÁ, 1998). Je prokázáno, že navázání kovu na chelát, více či méně ovlivní všechny procesy metabolismu. Například komplex zinku (Zn) s glycinem zvyšuje intenzitu metabolismu bílkovin, energie, mědi a kobaltu (KUDRNA, 1998). ŠIMEK (2001) dodávají, že bioplexy
18
zinku, manganu a mědi mají vliv na zvýšení plodnosti. V posledních letech byl prokázán pozitivní vliv bioplexu chrómu na reprodukční ukazatele. FRYDRYCH (2007) popisuje, jak je to se současnou situací s chaláty. V posledních letech jsme svědky usilovné snahy mnoha producentů rozšířit ve výživě zvířat používání organických zdrojů mikroprvků, o nichž se běžně hovoří jako o chalátech. Zatímco počátkem devadesátých let bylo uveřejněno pouze sedm sdělení zabývající se nutričním využitím chalátů, v současné době se jedná o desítky, možná i stovky publikací. Účinným pomocníkem odběratele při posuzování kvality různých organických zdrojů mikroprvků by byla metoda in vitro, vykazuje určitou korelaci mezi chemickou vlastností sloučeniny a její biologickou využitelností. Potřebu takové metody si uvědomili někteří významní výrobci, také některá univerzitní pracoviště poskytují v této oblasti poradenství. Bohužel, problém zatím není uspokojivě vyřešen, a proto se odběratel musí nadále spoléhat především na informace výrobce, nebo distributora a na jeho odbornou pověst. Zpětnou kontrolou pro něj mohou být pouze reference konečného uživatele. Organické formy Zn a Mn jsou nazývány cheláty, nebo proteináty. Proteináty jsou získávány pomocí hydrolýzy proteinového zdroje, čímž vznikne hydrolyzát, který obsahuje směs aminokyselin a peptidů s různě dlouhými řetězci. Reakcí síranu kovu s tímto hydrolyzátem pak dochází k tvorbě komplexů, které obsahují chelátové ionty kovu (SCHLEGEL, JONDREVILLE, 2010) Podle ZEMANA (2006) praktická aplikace organické formy stopových prvků je opodstatněna především v lepší využitelnosti daných mikroelementů. Efektem je nižší dávkování v porovnání s adekvátním dávkováním těchto prvků v anorganické formě. Jsou nejčastěji aplikovány u zvířat s vysokou produkcí, u mláďat, nemocných zvířat a zvířat s vysokou sportovní zátěží. Snižování obsahu stopových prvků ve výkalech přispívá ke zlepšování životního prostředí a k eliminaci reziduální zátěže potravinového řetězce. Minerální látky mangan, zinek, měď, selen a chrom v organické formě (vazba na organickou matrici – aminokyseliny, peptidy, kvasinky) mají významný vliv na produkci, reprodukci, zdraví a ekonomiku chovu všech druhů a kategorií zvířat (GREGER a BAIER 2000, cit. NRC 2005). FRYDRYCH (2007) dále uvádí, že zdaleka ne všechny sloučeniny vyskytující se na trhu odpovídají však svým charakterem chelátům. Chemický proces, při kterém vzniká organický zdroj mikroprvků se označuje jako kompletace. Výsledný produkt kompletace obsahuje přechodný kov (Fe, Zn, Cu, Mn, Co) a organický nosič – ligand. Přechodné kovy vykazují chemické vlastnosti kovů (snadno uvolňují elektrony). V roztoku se kationy 19
přechodových kovů nevyskytují v podobě holého iontu, ale obklopují se (koordinují) s množstvím molekul bohatých na elektrony, nebo množství iontů, aby minimalizovaly nadbytek pozitivních nábojů. V čistě volném prostředí jsou obklopeny molekulami vody. V jiných médiích se spojují s přirozenými ligandy, kterými mohou být např. aminokyseliny, ketokyseliny, hydroxykyseliny, porfyrity, nebo také peptidy a polysacharidy. Síla vazby mezi mikroprvkem a ligandem se mění v závislosti na prvku jako takovém, na výši kladného náboje prvku na ligandu, který poutá prvek, na počtu spojení ligandu a prvku v rámci celé sloučeniny a na pH prostředí. Všechny tyto faktory se podílí na různorodosti organických zdrojů minerálních látek, kterou dokumentuje skutečností, že jeden prvek může s jednou aminokyselinou jako ligandem vytvořit 5 – 18 různých struktur. Stabilní elektricky neutrální cheláty ochraňují stopové prvky od chemických reakcí během trávení. Tato ochrana udržuje rozpustnost látek po celou dobu průchodu trávicím traktem, až do jejich resorpce (KLECKER a ZEMAN 1998, cit. ŠIMEK 2001). MARTIN a SCRIBENTE (2000 cit., FRYDRYCH 2007) upřesňují, že zkrmované organického zdroje minerálních látek jsou však součástí střevního obsahu, jehož pH se v různých úsecích trávícího traktu výrazně mění od kyselého v žaludku po zásadité ve střevě. Vzhledem k tomu, že pH ovlivňuje stabilitu sloučenin, které rozhoduje o jejich biologické využitelnosti, měla by vazba mezi ligandem a kovem zůstat zachována při širokém rozmezí pH (2-8). Nestabilní sloučeniny totiž mohou v trávícím traktu disociovat a uvolněné ionty kovu mohou reagovat s dalšími dostupnými ligandy s vyšší stabilitou. Stabilní elektricky neutrální chaláty ochraňují stopové prvky od chemických reakcí během trávení. Tato ochrana udržuje rozpustnost látek po celou dobu průchodu trávícím traktem, až do jejich resorpce. V tenkém střevě může docházet k absorpci chelátů spíše přes peptidy a aminokyseliny. Tento mechanismus pak umožňuje, že při stejném mechanismu příjmu minerálních prvků nedochází mezi nimi ke vzájemnému ovlivňování – interakci. Proto je pak jejich biologická dostupnost vyšší, v organismu jsou snadněji transponovány a jejich absorpce ve střevech se zlepšuje (KLECKER a ZEMAN, 1998, cit. ŠIMEK 2001). Jak uvádí ZEMAN (2004) většiny výsledků bylo dosaženo v experimentálních sledování a bude zřejmě ještě nutné najít způsob, jak těchto výsledků dosáhnout v praktických podmínkách. Tato oblast se však stala v posledních letech velmi módní a lze očekávat příliv finančních prostředků a pokrok v poznání za jakých okolností chaláty poskytují efektivní výsledky.
20
2.4.2 Anorganické zdroje minerálních látek Tyto zdroje jsou problematicky využitelné, neboť v kyselém prostředí žaludku dochází ke změnám jejich chemické struktury a ve střevech je využitelná jen malá část. V anorganických solích jsou stopové prvky ionizovány žaludeční šťávou na anionty a kationty. Zhruba 80 % z nich je znovu smícháno ve střevě s anionty různé povahy, formují se v nerozpustné sloučeniny (fytáty, fosfáty, oxaláty atd.) a jsou vyloučeny ve výkalech, zatímco zbývající část podléhá několika faktorům, které mají vliv na jejich vstřebávání. Proto je za normálních podmínek organismem kompletně využito pouze 3 až 15 % stopových prvků přijatých v anorganické formě. Anorganické minerální soli jsou tedy závislé na změně pH a také na přítomnosti transportních proteinů, které přepravují prvky proti koncentračnímu spádu (ASHMEAD a kol., 1985, cit. WAGNER a kol., 2011). Anorganické zdroje stopových prvků, zejména oxidové, síranové, chloridové a uhličitanové formy minerálních iontů, bývají primárními zdroji dietních minerálních doplňků. Oxidové formy iontů jsou považovány za méně biologicky dostupné, než-li síranové a chelátové, přičemž studie nejsou zcela průkazné v tom, zda síranové či chelátové formy poskytují prospěch organismu v jejich dostupnosti a využití (BAKER a AMMERMAN 1995, cit. WAGNER a kol., 2011). Dlouhodobé používání anorganických minerálních látek v chovech prasat a drůbeže mělo za následek zvýšenou akumulaci zinku a mědi v půdním i vodním prostředí. V těchto oblastech byl zaznamenán výrazný pokles produkce zemědělských komodit. Zvířata v takto zasažených destinacích přijímala doplňky minerálních látek v anorganických formách. Běžně jsou v praxi používány vyšší dávky minerálních látek, než uvádí norma NRC 1998 (TUCKER 1997, cit. CREECH, 2004). KIM a MAHAN (2003) tvrdí, že některé stopové prvky mohou v anorganické podobě působit toxicky. Jako příklad uvádí seleničitan sodný (zdroj selenu), který působil ve vyšších dávkách v porovnání s organickou formou cytotoxicky. Na druhou stranu u zvířat s anorganickou formu selenu byla naměřena vyšší hladina glutathion peroxidázy.
2.5
Chróm Esencialitu chrómu u savců jako první zjistili SCHWARZ a MERTZ (1959 cit.,
UNDEWOOD a SUTTLE 1999), kdy doplnění trojmocného chrómu do krmných dávek mělo za následek zlepšení glukózové tolerance u laboratorních potkanů. Jedná se o tak zvaný glukózo toleranční faktor, který zvyšuje citlivost buněk na inzulín. Chróm je považován za
21
esenciální prvek ve výživě člověka. V současné době je však jeho používání v některých zemích Evropské unie legislativně omezeno (PECHOVÁ a PAVLATA, 2007; NRC 1998, cit. POND a MERSMANN, 2001). Zájem o tento prvek se u chovatelů prasat zvýšil poté, co bylo prokázáno, že přídavky tohoto mikroprvku do krmné dávky zvyšují podíl svalové hmoty. Nejvíce experimentů bylo do současné doby prováděno s chrómem picolinát a organickým chrómem, který je vázaný v kvasnicích. Tyto dvě formy chrómu se ukázaly pro organismus jako nejlépe dostupné (LINDEMANN, 1999; LINDEMANN a kol., 1995). SCHWARZ a MERTZ (1959 cit. LEWIS a SOUTHERN 2001) uvádí, že chrom je základní složkou faktoru glukózové tolerance (GTF). CHAIR a kol., (1997) doplňuje, že GTF zvyšuje citlivost tkání na inzulín a využití glukózy. V pozdějších studiích, které prováděl STEELE a kol. (1977 cit. LEWIS a SOUTHERN, 2001) bylo zjištěno, že chrom zesiluje působení inzulínu nejen u laboratorních potkanů, ale i u prasat. Optimální funkce inzulínu pak umožňuje transport glukózy do buněk a lepší využití glukózy. S tímto souvisí i ovlivnění metabolismu bílkovin a lipidů. Toto tvrzení podporují i HORKÝ, JANČÍKOVÁ a ZEMAN (2012), MERTZ a kol., (1974 cit. McDOWELL 2003) a dodávají, že mezi chrómem a inzulínem vzniká interakce, tento komplex usnadňuje navázání inzulínu na receptory buněčných membrán a přenesení glukózy do tkání. Chróm také snižuje koncentraci cholesterolu a triacylglycerolů v krevní plazmě (LINDEMANN, 1999; WRIGHT, 1994; AMOIKON a kol. 1995). Doplňování chrómu (jako chrómu picolinát) mělo podle EVOCKCLOVERE a kol. (1993) za následek nižší hladinu sérového inzulínu a koncentraci glukózy u rostoucích prasat (30 až 60 kg). Jiné studie sledující koncentraci glukózy v krvi naznačují, že ani po přídavku chrómu nedošlo k žádnému prokazatelnému ovlivnění hladiny tohoto krevního cukru (PAGE a kol., 1993). Poslední výzkum ukázal, že přidání chrómu picolinát může zvýšit velikost vrhu u prasnic (NRC, 1997, cit. LEWIS a SOUTHERN, 2001). Toto tvrzení podporuje i LINDEMANN a kol. (1995 cit. LEWIS a SOUTHERN, 2001) jež přidávali prasnicím 200 µg/kg KS chrómu picolinát. Tuto dávku krmili celou březost. Pokusná skupina měla vyšší počet narozených selat a vyšší hmotností selat ve věku 21 dní v porovnání se skoupinou prasnic, kterým nebyl chróm do krmné dávky přidáván. CHAIR a kol. (1997) tvrdí, že pokud přidáváme chróm do krmných dávek prasat již od ranného věku, můžeme v pozdějším období u těchto zvířat očekávat pevnější kostru, nižší procento tuku a vyšší reprodukční výkon. Trojmocný chróm navázaný na dvě molekuly kyseliny nikotinové, byl původně izolován z pivovarských kvasnic. V živočišném organismu, není doposud známá identicky aktivní látka, která by měla stejné biologické účinky na zesílení účinnosti inzulínu jako trojmocný chróm. Poslední výzkumy naznačují, že chróm by mohl hrát významnou roli i 22
v syntéze nukleových kyselin a metabolismu cholesterolu (OFFENBACHE 1997, cit. LEWIS a SOUTHERN 2001). Snížení hladiny cholesterolu po aplikaci chrómu do krmné dávky prasat zaznamenal ve svém experimentu i BOLEMAN a kol. (1995 cit. UNDERWOOD a SUTTLE 1999). Jak uvádí UUSITUPA a kol., (1992); GUERTIN, JAKOBS a AVAKIAN (2005) může přidávání chrómu do diety snížit nejen celkové množství cholesterolu v krvi, ale i hladinu lipoproteinu LDL a naopak zvýšit obsah HDL. KAMEN (2000) a CEFALU a kol. (2004) tuto informaci potvrzují a dodávají, že přídavek chrómu může snížit i obsah triglyceridů v krevním řečišti i v lidské populaci. Dle výzkumů, které prováděl STOECKER, (1996 cit. McDOWELL 2003) přidávání chrómu do diety má za následek zlepšení růstu zvířat, imunitní odezvy, efektivnější využití lipidů a interakce mezi nukleovými kyselinami. Průkazné zvýšení růstu bylo zaznamenáno u laboratorních potkanů, člověka a prasat. Vstřebávání a vylučování chrómu nebylo doposud u prasat studováno. Nicméně studie prováděné na potkanech a lidech ukazují, že chrom se vyznačuje nízkou využitelností. Absorpce chrómu z přirozené potravy činí u člověka v průměru 1,1 až 2,3 %. Absorbovaný chrom je vylučován především močí. Určité typy zátěže na organismus (stres, laktace, fyzická zátěž) prokázaly u lidí zvýšené ztráty chrómu močí ANDERSEN (1994 cit. LEWIS a SOUTHERN 2001). Absorpci chrómu zvyšují aminokyseliny a kyselina askorbová (KVASNIČKOVÁ, 1998; MOORADIAN A MORLEY, 1987). Nejúčinnější formou chrómu, která se v dnešní době používá, je chróm picolinát, který je účinnější než například chróm nikotinát. Tyto poznatky potvrzuje i JELÍNEK a kol. (2003) a dodávají, že nejlepší biologické vlastnosti má chróm organicky vázaný na aminokyseliny. Jeho resorpce a utilizace v organismu je velmi dobrá. Obsah chrómu v surovinách, které se používají pro výrobu krmných směsí pro prasata je relativně nízký. Doplňování 200 µg Cr/kg KS do krmných dávek prasat má za následek snížení konverze krmiva a procenta tuku v těle. Po přídavku chrómu se zvýšilo i procento svaloviny a plodnost u plemenných prasat. Chróm podle několika autorů zvyšuje produkci somatotropního hormonu (PAGE a kol., 1993; LINDEMANN a kol., 1995; AMOIKON a kol. 1995, cit. POND a MERSMANN, 2001). Obiloviny jsou na chróm relativně chudé, naproti tomu luštěniny obsahují tohoto stopového prvku dostatek (OLSEN a kol. 1996, cit. UNDERWOOD a SUTTLE 1999). Zájem o suplementaci chrómu v dietách prasat (jako chróm picolinát) se zvýšil poté, co bylo prokázáno, že došlo ke zvýšení svalové tkáně. V experimentech, které prováděl PAGE a kol. (1993), LINDEMANN a kol. (1995) došlo po přídavku 100 µg Cr/kg KS (chróm picolinát) ke snížení výšky hřbetního sádla a zvýšení zmasilosti u vykrmovaných prasat. Do popředí zájmu výzkumníků se dostaly dvě biologicky 23
aktivní formy chrómu, organický chróm z kvasnic a chróm picolinát. Mezi zvířata, jaká by mohla reagovat na doplňování chrómu do krmných dávek můžeme zařadit ta, která jsou spojena s rychlým růstem, pokročilým věkem, reprodukční vytížeností, stresem (přeprava, nemoc atd.) a dietetickými nedostatky. V pokusech prováděných ve výkrmu prasat se dospělo k závěrům, že jedinci suplementováni chrómem picolinát, ukládali ve svém těle méně tuku a více svalové hmoty (LINDEMANN, 1999). KIM, LINDEMAN a CROMWELL (2010) došli k závěru, že přídavek vysokých dávek chrómu (1000 a 2000 µg/kg KS) do diety s vyšším obsahem tuku (> 30 %) měl za následek průkazně vyšší přírůstek a nižší konverzi krmiva (P < 0,05) v porovnání se skupinou zvířat, které nebyl chróm v krmné dávce navýšen. Chróm se vyskytuje v tkáních ve velmi nízkých koncentracích (menší než 1 mg/kg). Po suplementaci chrómu do diety prasat v dávce 200 g/kg KS se zvýšila koncentrace tohoto prvku v ledvinách a játrech, ovšem hladina chrómu v srdci a svalech zůstala nezměněna (ANDERSON a kol. 1997, cit. LEWIS a SOUTHERN 2001; MERTZ, 1975; WRIGHT, 1994). Podle WILSONA, ROZEBOOMA a CRENSHAWA (2004) doplňování chrómu do krmných dávek kanců, může mít pozitivní vliv na překonávání stresových situací. Jak uvádí CLOSE a COLE (2003) v testech prováděných v mužské části lidské populace došlo ke zvýšení koncentrace spermií a celkové zlepšení reprodukčních ukazatelů ejakulátu. Tyto poznatky lze aplikovat i v zemědělské praxi v chovu plemenných kanců. Dle JELÍNKA a kol. (2003) potřeba chrómu je velmi nízká, zvyšuje se při stresových zátěžích a fyzické námaze. S výrazným nedostatkem chrómu, který by vyvolal klinické příznaky onemocnění se běžně v praxi nesetkáváme. Dlouhodobý nedostatek chrómu omezuje růst zvířat, snižuje konverzi krmiva a zhorčuje imunitu. Zvýšený dlouhodobý příjem šestimocného chrómu působí toxicky. Exkrece chrómu se uskutečňuje prostřednictvím ledvin. Neresorbovaný chróm se vylučuje výkaly společně s malým množstvím chrómu, který se vylučuje do střeva žlučí. Podle STAW a kol. (2003) se nedostatek chrómu u prasat může projevit zejména sníženou početností vrhu a celkovou mírou plodnosti. OFFENBACHAR a kol. (1997, cit. LEWIS a SOUTHERN 2001) poukazují na skutečnost, že s klinickými nedostatky chrómu se v praxi setkáme jen zřídka. Předpokládá se, že základní krmná dávka obsahuje dostatek tohoto esenciálního mikroprvku. Podle těchto autorů nedostatek chrómu v krmné dávce může doprovázet i náhlé snížení živé hmotnosti zvířat. Využitelnost chrómu z různých zdrojů výrazně kolísá. Podle AMOIKONA (1995, cit. NRC 2005) je pozorována zvýšena dostupnost tohoto prvku u prasat ve formě chrómu picolinát. Jak uvádí ANDERSON (1987 cit. NRC 1998), anorganické formy chrómu mají 24
velice nízkou absorpci z trávícího traktu. Množství chrómu využitelné z anorganických zdrojů se pohybuje od 0,4 do 3 %. Organické formy chrómu se vyznačují lepší využitelností než anorganické zdroje. Studie prováděná CLANCYM a kol., (1994, cit. NRC 1998) připisuje chrómu ve formě chróm picolinát u lidí poměrně nízkou využitelnost 0,7 až 1,7 %. Naproti tomu GARGAS a kol., (1994, cit., NRC 1998) uvádí využitelnost chrómu ze stejného zdroje v intervalu 1,5 až 5,2 %. WARD a kol. (1995, cit. NRC 1998) sledovali využitelnost chrómu z různých forem (chlorid, acetát, nikotinát, picolinát a nikotinát-glycin-cystein-glutamát). Do krmné dávky prasat byl dodáván chróm z těchto různých forem v dávce 200 µg/kg KS. U sledovaných parametrů (obsah chrómu v séru, aktivita vybraných hormonů) nenašli významné rozdíly mezi různými zdroji chrómu. Podle STARICHA a BLINCOEHO, (1993, cit. UNDERWOOD a SUTTLE, 1999) je do dnešní doby známo velmi málo informací o využitelnosti chrómu u hospodářských zvířat. Podle mínění těchto výzkumníků je využitelnost organických zdrojů chrómu 20 – 30 krát vyšší ve srovnání s anorganickými protějšky. Toto zjištění potvrzují i EVANS a BROWMAN, (1992, cit. McDOWELL 2003) a dodávají, že využitelnost organicky vázaného chrómu může být až 50 krát vyšší oproti anorganické formě. CHAIR a kol. (1997) doplňují, že organické formy chrómu (chróm picolinát, chróm nikotinát a chróm z kvasnic) jsou mnohem lépe vstřebatelné než chróm v anorganické formě jako chlorid chrómu (CrCl3). Šestimocný chróm je v přírodě považován za jednu z nejkarcinogennějších látek. Je spojený s rakovinou plic a kůže (OFFENBACHER a kol. 1997, cit. LEWIS a SOUTHERN 2001). Šestimocný chróm se může podílet na cytotoxicitě spermií (CHEN a kol., 2012). Naproti tomu trojmocný chróm se vyskytuje přirozeně v krmivech. Tato forma chrómu nevykazuje žádné známky toxicity. Nejvyšší hodnoty dávek chrómu pro zvířata byly stanoveny podle NRC (1980, cit. LEWIS a SOUTHERN 2001) na 1000 µg Cr/kg KS u chloridu a na 3000 µg Cr/kg KS ve formě oxidu. Žádné příznaky toxicity se neprojevily u potkanů krmených dávkou 1000 µg Cr/kg KS ve formě chloridu, nebo jako chróm picolinát po dobu 20 týdnů (ANDERSON a kol. 1997, cit. LEWIS a SOUTHERN, 2001). V pokusech prováděných in vitro bylo zjištěno, že chróm ve formě (picolinátu, nikotinátu a chloridu) nepoškozuje chromozomy a nemá ani žádné jiné projevy toxicity (NRC 1997, cit. NRC 1998).
25
2.6
Selen Selen byl objeven a pojmenován švédským chemikem J.J. Berzeliusem v roce 1818
(REILLY, 2006). Na selen se pohlíželo mnoho let jako na látku působící u hospodářských zvířat toxicky (SCHWARZ a FOLTZ 1957, cit. UNDERWOOD a SUTTLE 1999). Masivní výzkum selenu začal po objevení enzymu glutathion peroxidázy, která obsahuje právě tento mikroprvek. Selen byl také objeven v několika bakteriích a dalších enzymech (KIM a MAHAN, 2003; KOLLER, 1984, SMITH 1979). Selen byl první identifikovanou látkou v pícninách, která má na organismus zvířat toxické účinky. U postižených zvířat bylo pozorováno vypadávání srsti a praskání kopytního pouzdra (McDOWELL, 2003). OHLENDORF (1986, cit. MAHAN a PARRETT 1996) uvádí jeden příklad za všechny. Ve třicátých letech minulého století byly ve státě Kalifornia sledovány u vodního ptactva vážné poruchy reprodukce doprovázeny úhyny. Za příčinu těchto problémů byla označena vysoká koncentrace selenu ve vodě. Až v roce 1957 byla objevena esencialita selenu (SCHWARZ a FOLTZ 1957, cit. UNDERWOOD a SUTTLE 1999). V roce 1987 schválila agentura pro krmiva a léčiva (FDA) zařazení anorganického selenu do krmných směsí pro hospodářská zvířata v dávce 0,3 mg/kg KS (OHLENDORF 1986, cit. MAHAN a PARRETT 1996). Selen se vyskytuje ve všech buňkách a tělních tkáních. Obsah selenu v organismu je závislý na množství tohoto prvku v krmné dávce hospodářských zvířat. Rozdělení selenu v organismu prasat je následující: 50 – 52 % ve svalovině, 14 – 15 % v kůži, srsti, a špárcích, 10 % v kostech (ZEMAN, 2004). JELÍNEK a kol. (2003) doplňují, že nejvyšší koncentrace selenu v těle zvířat se vyskytuje v kosterní svalovině, relativně nízká je v nervové tkáni a plicích, nejnižší koncentraci najdeme v tukové tkáni. TAKADA a kol. (2005) zjistili při sledování koncentrace selenu u březích prasnic, že od poloviny březosti klesá (téměř o 50%) koncentrace tohoto prvku v krvi zvířat. Selen hraje významnou roli ve správném sledu fyziologických funkcí zejména u vysokoužitkových zvířat. Selen se nachází v tkáních v mnohem menších koncentracích než většina ostatních esenciálních prvků. V pokusech, které sledovaly nekrózy jater u laboratorních potkanů při použití diet s odlišným obsahem selenu bylo zjištěno, že po přídavku selenu se zlepšily jaterní testy v porovnání s pokusnými zvířaty, která měla podhodnocený příjem selenu v porovnání s normou (SCHWARZ a FOLTZ 1957, cit. UNDERWOOD a SUTTLE 1999). Jak uvádí THOMPSON a SCOTT, (1969, cit. UNDERWOOD a SUTTLE 1999) v oblastech deficitních na selen, byly zaznamenávány u hospodářských zvířat zdravotní problémy, retardace růstu a zhoršení reprodukční schopnosti,
26
tato skutečnost byla objevena v mnoha zemích světa. Selen je úzce spojen s vitamínem E. Tento prospěšný vztah mikroprvku a vitamínu je předmětem dalšího výzkumu. Dle ROSENFELDA a BEATHA (1964, cit. KIM a MAHAN 2003) je obecně koncentrace selenu ve vodě, půdě a vzduchu na nízké úrovni (< 1 µg/g). V některých oblastech např. vanadouranových půdách může obsah selenu dosahovat až 2,6 mg/g. Koncentrace selenu v půdě je dle DAVISE a kol. (2000); LAKILA a kol. (1972, cit. NRC 2005) závislá na matečné hornině, provzdušnění, množství humusu, celkovém obsahu železa a pH. V půdách s vysokým provzdušněním a vyšším pH se selen vyskytuje ve formě selenátu, který je rostlinami dobře utilizován. V některých oblastech, kde je obsah selenu v ornici 10 – 15 mg/kg se v plodinách pěstovaných na těchto půdách nevyskytuje selen ve formě toxického seleničitanu železnatého. Tento jev je zapříčiněn nižší hladinou pH (4,5 – 6,5) za přítomnosti hydroxidu železitého. V experimentu, který provedl KURZA a kol. (2010) v oblastech západočeského a jihočeského regionu zjistil, že u vysoké srnčí zvěře a divokých kanců se pohybuje obsah selenu v mase na velmi nízké úrovni. Průměrný obsah selenu u srnčí zvěře byl 36,9 ± 16,6 μg Se/kg a u divokých prasat 27,6 ± 19,8 μg Se/kg. Dle výsledků těchto autorů je patrné, že půdy obecně v České republice jsou na selen velice chudé. V experimentu, ve kterém přidávali SVOBODA a kol. (2010) do krmné dávky vykrmovaných prasat 0,3 mg Se/kg KS zjistili koncentraci selenu v mase 120 μg Se/kg. POLÁKOVÁ (2010) provedla podrobné vyhodnocení obsahu selenu v půdách různých oblastí České republiky. Z jejich závěrů je patrné, že průměrný obsah tohoto esenciálního prvku je na velice nízké úrovni. Jako určité řešení doporučuje doplňování selenu do diety jak hospodářských zvířat, tak i člověka. ROTRUCK a kol. (1973, cit. UNDERRWOOD a SUTTLE 1999) došli k objevu závislosti mezi gluthathion peroxidásou (GSH-Px) a selenoproteinem. Prokázali, že příjem selenu v dietě má přímou návaznost na aktivitu GSH-Px v tkáních. Jak dodává BENGTSSON a kol. (1978, cit. NRC 1998) GSH-Px napomáhá k ochraně organismus před oxidačním stresem. Chrání celulární i subcelulární membrány proti peroxidovému poškození. Společný efekt selenu a vitamínu E vychází ze společného antioxidačního potenciálu. Vysoké hladiny vitaminu E samy o sobě nedovedou plně eliminovat volné kyslíkaté radikály, k tomuto účelu je třeba doplňovat i selen. JELÍNEK a kol. (2003) k této problematice dodávají, že zatímco vitamín E chrání buněčnou membránu, selen prostřednictvím glutation peroxidázy (GSH-Px) společně s dalšími selenoproteiny zajišťuje ochranu cytoplazmy buněk. Podle ALTHOUSE a kol., (2000) se deficit selenu podílí na anémii. Nízká hladina GSH-Px v krevní plazmě může mít za následek poškození erytrocytů. ZEMAN (2004) popisuje, že při nedostatku selenu se 27
projeví svalová dystrofie u selat. LOUDENSLAGER a kol. (1986, cit. POND a MERSMANN 2001) dodávají, že deficit selenu kromě dystrofie způsobuje zhoršení klinických vyšetření jater, poškození srdeční tkáně, sníženou koncentraci GSH-Px v krevní plazmě i v tkáních. Nízká hladina selenu může vést u novorozených selat k toxicitě železa. Inbalance mezi reaktivními formami kyslíku a celkovou antioxidační kapacitou způsobuje u samců infertilitu (SHARMA a kol., 1999). Selen má podle ARTHURA (1994, cit. NRC 1998) prokázaný vliv na funkci štítné žlázy. U iodothyroninu-5-deiodinasa byl identifikován selenoprotein, který má návaznost na správnou funkci štítné žlázy. SULEI a kol. (1991, cit. McDOWELL 2003) upřesňují, že selen napomáhá k převedení tyroxinu na aktivní formu hormon štítné žlázy. Mimo jiné podle PEPLOWSKI a kol. (1980, cit. POND a MERSMANN 2001) má selen pozitivní vliv na imunizaci organismu, lepší využitelnost dusíku a tím spojenou vyšší intenzitu růstu u mladých prasat. U vepřového masa, které je velmi náchylné na lipidovou oxidaci se osvědčil přídavek selenu do diety vykrmovaných vepřů. Výsledkem byl nižší odtok šťáv a lepší uchovatelnost masa (DAUN a kol., 2001). Podle posledních výsledků, může selen zmírnit i toxické rizika kadmia na živočišný organismus (OGNJANOVIČ a kol., 2008). Selen se nachází v rostlinách ve všech částech v podobě aminokyselin obsahujících selen a částečně v podobě selenových iontů. Obsah selenu v rostlinách je přímo závislý na obsahu selenu v půdě. Selen může být do diet doplňován ve formě anorganických solí, typický je seleničitan sodný, nebo jako organická forma např. selenem obohacené kvasnice, selenocystein a selenomethionin (MAHMOUD a EDENS 2007, cit. WANG a kol. 2011). Selen má obdobné chemické vlastnosti jako síra. Z těchto důvodů je vázán v sirných aminokyselinách (KIM a MAHAN, 2003). Selenem obohacené kvasnice obsahuj přibližně 40´% selenomethioninu a 15 % selenocysteinu (KELLY a POWER 1995, cit. MAHAN, CLIME, RICHERT 1999). V nedávné době proběhly experimenty i s tzv. nano-selenem, který vykazuje nižší toxicitu, než seleničitan sodný s nímž má srovnatelné účinky (ZHANG a kol., 2001). Podle BEDWAL a BAHUGUN (1994); UNDEWOOD a SUUTTLE (1999) je koncentrace selenu v pícninách obecně velmi nízká pohybuje se v rozmezí 0,02 - 0,05 mg/kg sušiny. U obilovin je obsah selenu závislý na lokalitě, kde se plodiny pěstují v průměru se pohybují na nízké hladině okolo 0,006 mg/kg sušiny. U luštěnin je průměrný obsah selenu 0,02 mg/kg sušiny. OLSON a kol. (1970, cit. MAHAN, CLIME, RICHERT 1999) dodávají, že ve pšenici, která tvoří v mnoha případech základní komponentu krmné dávky prasat je selenomethionin hlavním zdrojem selenu z této obiloviny. Prasata dokáží využít selenomethionin a methionin shodně.
28
Využitelnost selenu z rostlinných produktů je více než 60 % a u živočišných zdrojů je využitelnost nižší pohybuje se pod 25 % (MAHAN a BAKER 1991, cit. POND a MERSMANN 2001). Selen v rostlinách je primárním zdrojem toho prvku jak pro člověka, tak i pro zvířata (NRC 1983, cit. NRC 2005; SEGOVIA, 2008). Organické formy selenu methylselenocystein a selenocysteinmethionin jsou dominantní sloučeniny, které se nachází v rostlinách a slouží jako hlavní zdroj selenu (DAVIS a kol. 1994, cit. NRC 2005). Mezi další zdroje selenu patří seleničitan sodný a kvasnice obohacené selenem. Zdá se, že organicky vázaný selen v kavasničné hmotě selen má lepší biologickou využitelnost, ve srovnání s anorganickými sloučeninami (MAHAN, 2000; SMITH, 1979). BELL a COWEYHO (1989, cit.
NRC
2005)
sestavili
využitelnost
selenu
takto
(od
nejvyšší po
nejnižší)
selenomethionin>seleničitan>selenocystein. McDOWELL (2003, cit. NRC 2005) tvrdí, že selen je zvířaty využíván lépe při perorálním podání v porovnání s injekční aplikací. MAHAN a kol. (1999, cit. WANG a kol. 2011) dodávají, že mimo lepší využitelnosti organických forem selenu mají tyto sloučeniny i vyšší antioxidační potenciál, než anorganické zdroje. PASSWATER (1999) popisuje zajímavou skutečnost, jak může vitamín C ovlivnit využitelnosti selenu. Vitamin C zvyšuje intestinální (střevní) absorpci organických forem selenu např. kvasnice s vysokým obsahem selenu (jako selenomethionin). Avšak vitamin C účinkuje opačně na anorganické zdroje selenu, jako jsou selenity a selenáty, protože v kontaktu s nimi přeměňuje tyto anorganické formy na inertní metalický selen, který organismus nedokáže využít. Vitamin C rovněž zvyšuje začlenění selenu do glutathion peroxidázy. KIM a MAHAN (2003) popisují dvě různé cesty exkrece selenu u prasat. Zvířata, která přijímají selen z anorganických zdrojů vylučují selen především močí. Naopak prasata, kde jejich krmná dávka obsahuje selen v organické formě vylučují tento prvek převážně výkaly. První zmínky spojené s toxicitou selenu u zvířat, popsal na svých cestách do západní Číny již Marco Polo v roce 1295. Pozoroval u svých koní léze na kopytech, špatnou kvalitu a vypadávání žíní. Právě v těchto oblastech se nachází půdy s vysokým obsahem selenu. V těchto částech země jsou příznivé podmínky pro uvolňování selenu z matečné horniny. V tzv. selenových oblastech může obsah selenu v půdě činit až 500 µg/kg, v porovnání se zeměmi EU je tato koncentrace až 6-krát vyšší (ROSENFELD a BEATH 1964, cit. KIM a MAHAN 2003). Toxicita selenu se podle NRC (1998); NRC (2005); KIM a MAHAN, (1999, cit. CLOSE a COLE 2003) u prasat pohybuje nad uznanou hranicí 5 mg/kg KS. Tato limitní hodnota byla stanovena na základě dlouhodobého sledování v několika opakování v různých podmínkách a experimentech. Anorganické formy selenu mohou být více toxické již při 29
nižších dávkách v porovnání se selenem, který je vázán v organické podobě. Podle NRC (1998, cit. POND a MESMANN 2001) se toxicita selenu projevuje poruchami růstu, anorexií, vypadáváním štětin, drsnou kůží, anemií, ztučněním jater a poškozením špárků. Dle GOEHRINGA a kol. (1984, cit. KIM a MAHAN 2003) je nejlepším indikátorem chronické otravy selenem snížený růst zvířat. Tito autoři nezjistili při dávce 8 mg Se/kg KS žádný negativní dopad na zdraví prasat. Až při vyšším dávkování (12 mg Se/kg KS) pozorovali léze na rohovině špárků. WAHLSTROM a kol. (1984, cit. KIM a MAHAN 2003) při dávkách 8 mg Se/kg KS popsali kornatění kožních derivátů u rostoucích prasat. Vysoká dávka selenu (10 mg/kg KS) během březosti má dle WAHLSTROM a OLSON (1959, cit. KIM a MAHAN 2003) negativní dopad i na reprodukční ukazatele prasnic (zejména velikost vrhu a hmotnost selat při narození). KIM a MAHAN (2001) použili různé hladiny selenu od 0,3 do 10 mg/kg KS v organické a anorganické formě. U obou forem zjistili toxicitu mezi 7 až 10 mg Se/kg KS. GOEHRING a kol. (1984, cit. NRC 2005) podávali prasnicím selen v dávkách 0, 4, 8, 12, 16 a 20 mg/kg KS. Zjistili lineární růst v závislosti na koncentraci selenu v dietě na ukládání selenu v kožních derivátech a krvi. Již u hladiny 4 mg Se/kg KS pozorovali snížený příjem krmiva. ADEBUKOLA a kol. (2011) zjistili, že vysoké dávky selenu mohou působit negativně i na kvalitu ejakulátu. Ve svém experimentu podávali potkanům do krmné dávky vysokou dávku selenu (120 mg/kg KS). Při hodnocení laboratorních hodnot zjistili signifikantní pokles celkového počtu spermií ve varlatech potkanů, nižší motilitu a celkové zvýšení abnormálních a defektních spermií v porovnání se skupinou zvířat s příjmem 0,25 mg Se/kg KS. V Evropské Unii je pro prasata povolena maximální dávka selenu 0,5 mg/kg KS (KOLODZIEJ a kol. 2005).
2.6.1 Vliv na reprodukci Selen a vitamín E působí jako dva důležité antioxidanty u kanců na semennou plazmu i samotné spermie. Ovlivňují vývoj spermatozoí a motilitu spermií. Selen rovněž podporuje oplodnění ovocytů u prasnic (CLOSE a COLE, 2003). Část selenu v ejakulátu je ve spermiích, ovšem více než 85 % se nachází v semenné plazmě. Selen je ve spermiích akumulován ve střední části krčku. Nedostatek selenu má za následek snížení koncentrace a motility spermií (WU a kol., 1979; PASSWATER, 1999). JELÍNEK a kol., (2003) tyto informace ještě rozšiřují a dodávají, že selen působí příznivě nejen na reprodukční potenciál samic, ale i samců. Ovlivňuje morfologickou strukturu, metabolismus spermií i tvorbu testosteronu. Selen je součástí tzv. selenoproteinu spermie – umožňuje správnou 30
morfologickou strukturu spermie a ovlivňuje její energetický metabolismus a pohyblivost. COLE a CLOSE (2003) za účelem zlepšení reprodukčních ukazatelů u plemenných kanců doporučují dávku 0,3 mg Se/kg KS. Naproti tomu NRC (1998, cit. POND a MESMANN 2001) uvádí dávku až 0,5 mg Se/kg KS. Podle MARIN-GUZMAN a kol., (1997) nízké dávky selenu v dietě kanců (0,06 mg Se/kg KS) mají za následek nízkou motilitu spermií, vysoký počet abnormálních spermií a s tím spojené nižší procento zabřeznutých prasnic. MARINGUZMAN a kol. (1997) ve svém pokusném sledování zjistili, že po přídavku 0,5 mg Se/kg KS došlo ke zvýšení procenta zabřeznutých prasnic o 25 % v porovnání se skupinou, které nebyl selen do krmné dávky přidán. O tři roky později obdobný kolektiv autorů MARINGUZMAN a kol. (2000) zjistili, že přídavek selenu v dávce 0,5 mg/kg KS průkazně zvýšil počet Serteliho buněk, spermatid a spermatocitů v porovnání s kontrolní skupinou kanců bez přídavku selenu do diety.
2.7
Základní laboratorní hodnoty ejakulátu plemenných kanců Sperma je tvořeno spermiemi a semennou plazmou. Semenná plazma tvoří u kance 95
– 97 % celkového objemu (JELÍNEK a kol., 2003). Lipidy tvoří důležitou složku ejakulátu. Nachází se především v membránách spermií a slouží jako prekurzor složitých biologických reakcí, které jsou důležité pro kapacitaci spermií. Hlavní podíl (45 – 55 %) lipidů tvoří především nenasycené mastné kyseliny tzv. PUFA (SURAI, 2006). Plodnost u kanců je odhadována buď na základě pozorování pohlavního chování, nebo jsou prováděny různé testy kvality spermatu, jako například odhad aktivity a pohyblivosti spermií, metabolické testy, morfologická hodnocení, testy penetrace apod. (SMITAL, 2008).
2.7.1 Motilita Pohyblivost spermií je esenciální pro oplodnění vajíček, a proto je velmi důležitým ukazatelem při analýze spermatu. Motilita spermií je důležitým selekčním kritériem. V rámci posuzování motility se hodnotí procento pohyblivých spermií i jejich forma pohybu. Pro použitelnost semene je důležitý procentuální podíl spermií, které se pohybují přímočaře vpřed za hlavičkou (KOZUMPLÍK a KUDLÁČ, 1980). Pouze ejakulát, který má motilitu 70 % by měl být používán pro další zpracování. Tato skutečnost má svůj význam z toho důvodu, že motilita klesá (v závislosti na podmínkách)
31
v průběhu skladování (ALTHOUSE, 1997). Hodnota pohybu spermií je závislá také na věku kance a s narůstajícím věkem motilita spermií klesá (LASOTA a kol., 2004; FOOTE, 1978).
2.7.2 Koncentrace Počet spermií hraje důležitou roli v oplodnění a je závislý na výchozí kvalitě spermatu a jeho ošetření. Z komerčního hlediska je cílem udržet spermie v životaschopném stavu po dostatečně dlouhou dobu a maximalizovat jejich počet v dávce (SMITAL, 2001). Přesné stanovení spermií v ejakulátu kance, je nutné k určení stupně ředění, a tím i využití ejakulátu. Množství spermií je ovlivněno především plemennou příslušností a pohybuje se nejčastěji v intervalu 200 – 300 tisíc spermií na 1 mm3 (KOZUMPLÍK a KUDLÁČ, 1980). Koncentrace spermií je během života kance poměrně stálá, nejvíce jí ovlivňuje výživa a klimatické podmínky (AUDET a kol., 2009; LASOTA a kol., 2004)
2.7.3 Procento patologických spermií Nebezpečný
z hlediska
ohrožení
plodnosti
je
vysoký
výskyt
spermií
s protoplazmatickou kapkou, někdy se může v semeni kanců vyskytovat 80 – 90 % takto defektních spermií. Za patologické spermie se považují i ty, které mají svlečený či defektní akrozóm (persistující proakrozomální granulum). Všechny tyto uvedené defektní formy se běžně vyskytují v populacích plemenných kanců (LOUDA, 1980). SMITAL (2008) dodává, že cytoplazmatická kapka, má svůj původ ve varleti, celkový počet takovýchto spermií by neměl přesáhnout 15 %. To potvrzují i nalezené negativní korelace mezi procentem spermií s cytoplazmatickou kapkou, mírou zabřeznutí a počtem narozených selat. Morfologické změny spermií lze rozdělit podle příčiny jejich vzniku na primární a sekundární. Primární změny jsou takové, které vznikají v průběhu procesu spermiogeneze, zatímco za sekundární jsou považovány takové útvary, které vznikají již na zformované spermii, tedy v průběhu pasáže spermií vývodnými pohlavními cestami, nebo během zpracování spermatu po jeho získání. Dle LASOTY a kol. (2004) je počet patologických spermií u kance během života poměrně neměnný.
32
2.7.4 Objem ejakulátu Objem ejakulátu u plemenných kanců kolísá ve značně širokých hranicích (80 – 900 ml). Nejčastěji se však pohybuje kolem 250 – 300 ml (KOZUMPLÍK a KUDLÁČ, 1980). Dle LASOTY a kol. (2004) a KUMARA a kol. (2006) roste objem ejakulátu společně s věkem kance. Přičemž nejvyšší objem spermatu kanec poskytuje při věku nad 40 měsíců.
2.8
Vybrané krevní parametry
2.8.1 Glukóza Glukóza je hlavní produkt trávení sacharidů, tento jednoduchý cukr přítomný v krvi a živočišných tkáních, slouží jako primární zdroj okamžité buněčné energie (KAMEN, 2000). Metabolismus glukózy zahrnuje složité biochemické procesy. Nejvýznamnější přeměna glukózy probíhá v metabolicky aktivních tkáních – játra, trávící soustava, mléčná žláza a nervové buňky. Glukóza je základní součástí při syntéze glycidů, glykoproteidů, glykolipidů, nukleových kyselin, aminokyselin a tuků. V organismu se glukóza využívá k syntéze glykogenu v játrech a ve svalech. Tento jev přeměny glukózy na glykogen probíhá kontinuálně. Při syntéze glykogenu ve svalech je hlavním zdrojem glukóza v krvi. Poločas rozpadu glukózy v krevní plazmě je 20 – 90 minut, což svědčí o tom, že glukóza je permanentně utilizovaná v tkáních a resorbovaná z jater a střev. Nejvíce glukózy spotřebuje centrální nervová soustava, trávící soustava a ledviny (JELÍNEK a kol., 2003).
2.8.2 Inzulín Je hormon vylučovaný pankreatem pomocí buněk typu B, většina tkání jej nezbytně potřebuje pro vstřebávání glukózy. Je-li glukóza vstřebávána do krve způsobuje vylučování inzulínu. Ten má za úkol urychlit, ukládání a využití tohoto monosacharidu prakticky ve všech tělních tkáních, především však v játrech a svalové hmotě (KAMEN, 2000). Tkáně se liší svojí citlivostí na inzulín. Zatímco játra, svaly, tuková tkáň a leukocyty jsou na inzulín velmi senzitivní, mozek, ledviny, střeva a erytrocyty mají nižší citlivost. Hlavním mechanismem účinku inzulínu je umožnit transport glukózy přes buněčné membrány. V živočišných tkáních inzulín podporuje aktivní difůzi, což má za následek lepší vstřebávání glukózy do buněk. Inzulín obecně podporuje ukládání tuků a syntézu proteinů. Výsledkem 33
aktivity inzulínu je snížení hladiny krevní glukózy (REECE, 1998). JÁNSKÝ a NOVOTNÝ (1981) dodávají, že inzulín aktivuje syntézu bílkovin na ribozomech tím, že zvyšuje aktivní membránový přenos aminokyselin do buněk (především svalových). JELÍNEK a kol. (2003), popisují problémy, které vzniknou při vyvolání chorobných příznaků běžně známé pod označením cukrovka (diabetes mellitus). Rozlišují se dva základní typy diabetu – diabetes mellitus I. Typu, který vzniká poškozením B-buněk, jež pak produkují nedostatečné množství inzulínu, nebo diabetes mellitus II. typu (na inzulínu nezávislý). Pro diabetes II. typu je příznačný
nedostatečný
počet
receptorů
pro
inzulín.
Nedostatek
inzulínu
vede
k hyperglykemii, glukóza je buňkami nedostatečně využívána a jako prahovou látku ji organismus vylučuje močí. Vedle člověka je diabetes mellitus bezpečně prokázán mimo jiné i u prasete. Podle KEMEN (2000) aplikace chrómu vede při onemocnění diabetem mellitus II. typu k zesílení účinnosti inzulínu pomocí glukózotolerančního faktoru.
2.9
Reaktivní formy kyslíku – Reactive Oxygen Species (ROS) V posledních letech bylo získáno mnoho dokladů o tom, že v organismu běžně vzniká
řada reaktivních forem kyslíku a reaktivních forem dusíku, tyto látky mají značný fyziologický i patogenetický význam. Staly se proto předmětem intenzivního výzkumu. Jde o látky, které pohotově reagují s různými biologickými strukturami – mastnými kyselinami, lipidy, aminokyselinami, proteiny, nukleovými kyselinami, s řadou nízkomolekulárních metabolitů, koenzymů a jiných součástí živé hmoty organismu. Za určitých okolností však působí jako toxické látky, schopny organismus poškodit a dokonce ho i usmrtit (ŠTÍPEK, 2000). Reaktivní formy kyslíku nejsou atomy, molekuly či ionty schopné samostatné existence. Mají ve svém elektronovém obalu jeden nepárový elektron, eventuelně více nepárových elektronů. Snaží se proto získat další elektron a doplnit si elektronový pár do stabilní konfigurace. Z toho pramení jejich vysoká reaktivita a omezená doba existence (RACEK a HOLEČEK, 1999). Volné radikály „vytrhnou“ elektron z jakéhokoliv atomu, nebo molekuly, na kterou narazí (tuky, bílkoviny, DNA – dochází k poškození dusíkatých bází a k následným mutacím). Proces, při kterém vznikají karcinogenní aldehydy (např. malondialdehyd, 4-hydroxynonenal), hydroperoxidy a lipofusciny se nazývá peroxidace. Tímto ovšem volný radikál předá svoji nebezpečnost dál – vzniká řetězová reakce. Můžeme použít tvrzení, že volné radikály plodí další volné radikály (KAUSHIK, SINGH, SHASHI, 2003). Tyto reaktivní částice jsou schopny buď přijímat elektron (redukovat se a doplnit stav na párový) nebo naopak volný nepárový elektron poskytnout (samy sebe oxidovat). Anion, který příjme proton se
34
stává rovněž reaktivním. Tento radikál je specifický tím, že vykazuje zřetelnou lipofilii, a tedy působí toxicky (destruktivně) právě v oblasti plazmatických membrán (MOUREK a kol., 2009).
Radikály mohou vznikat dvěma typy reakcí: 1. homologickým štěpením kovalentní vazby v molekule za vzniku fragmentu, z kterého si každý volný radikál ponechá jeden nespárovaný elektron, 2. ztrátou, nebo adicí jednoho elektronu (LEŠNÍK a kol., 2003; BOMZON a LJUBUNCIC, 2001) Existuje stále více důkazů, že ROS jsou zapojeny do oxidačního poškození spermií což v mnoha případech vede k samčí neplodnosti. Tyto ROS mohou vznikat z defektních spermií a leukocytů. Jednu z hlavních rolí v boji proti volným radikálům přebírá enzym glutathion peroxidáza (AITKEN, 1994; KOVALSKY a kol. 1992; AITKEN a WEST, 1992, cit. OLDERIED a kol., 1998; HENDING a kol., 1999). SAEZ a kol., (1998) ve své práci uvádí, že ROS jsou jednou z hlavních příčin infertility. Výsledky těchto autorů ukázaly, že přibližně 40 % mužů, kteří trpěli neplodností, měly vysokou produkci volných radikálů v ejakulátu. Dodávají, že spermatozoa jsou velmi citlivá na poškození oxidačním stresem. Volné radikály hrají v organismu podle FANG, YANG a WU (2002) mnoho důležitých rolí. Radikál dusíku je jednou z nejrozšířenějších signálních molekul na buněčné úrovni. ROS mají zásadní význam pro regulaci kontrakcí hladké svaloviny, proliferace cév, shlukování krevních destiček, udržení cévního tonusu a účastní se i při genové transkripci. Dle GRIVEAU a kol. (1995, cit. SAEZ a kol. 1998) spermie potřebují ke své kapacitaci malé množství superoxidového anionu. PAPAS (1999); FANG, WANG a WU (2002); BOMZOM a LJUBUNCIC (2001) popisují nejčastěji se vyskytující volné radikály v organismu takto:
Hydroxilový radikál: jedná se o nejreaktivnější radikál kyslíku, vzniká z vody a peroxidu vodíku. Poločas jeho rozpadu trvá 10-9 sekundy (při 37oC), působí proto především v místě svého vzniku.
Superoxidový radikál: vzniká z kyslíku po připojení elektronu, jedná se o nejjednodušší peroxidový radikál s poločasem rozpadu 10-6 sekundy.
Radikály oxidů dusíku: produkují je endotelové cévní buňky, které tvoří výstelku krevních cév, fagocyty, které jsou součástí imunitního systému a některé mozkové buňky. Radikály dusíku mohou být převedeny na nereaktivní formy např. peroxid vodíku. Ačkoliv molekulární kyslík je naprosto nezbytný pro aerobní způsob života může být
za určitých podmínek toxický, tento jev je označován jako kyslíkový paradox (GOLBERD 2000, cit. FANG, YANG a WU 2002). 35
2.10
Antioxidanty Organismy vyvinuly specifické ochranné mechanismy, které jim pomohly přežít
zvýšenou koncentraci kyslíku v atmosféře. Výsledkem jsou tisíce přirozených antioxidačních reakcí pro eliminaci volných radikálů. Většina antioxidantů je dodávána přirozeně v krmivu, (vyskytují se přirozeně v základních krmných surovinách), nebo jsou do diety přidávány ve formě doplňků. Nedostatek (a v některých případech i přemíra) těchto elementů způsobí oxidační stres a poškození funkčnosti buněk (TUCKER a kol., 2011). Podle SUARAI (2002) tvoří superoxiddismutáza a glutathion peroxidáza první úroveň antioxidační obrany proti volným radikálům. Antioxidanty můžeme také dělit na přirozené (antioxidanty jsou produkovány organismem, nebo přijímány potravou) a umělé, které jsou uměle přidávány do krmiva. Dále se přirozené oxidanty dělí na hydrofilní, které účinkují pouze extracelulárně a lipofilní, které se dokáží rozpustit v tucích díky čemuž pronikají buněčnými membránami a účinkují intracelulárně (vyšší účinek, ale se zpožděním). Dále rozlišujeme amfofilní skupinu antioxidantů, která kombinuje obě předcházející schopnosti (KAUSHIK, SINGH, SHASHI, 2003). Antioxidanty působí při potlačování nadměrného množství volných radikálů synergicky. Nelze proto jednoznačně říci, který antioxidant je nejlepší (FANG, YANG, WU, 2002). Antioxidanty se navzájem doplňují, pro příklad můžeme uvést vitamín C, který může regenerovat poškozený vitamín E. Při ochraně buňky spolu synergicky spolupracují selen (působí v cytoplazmě buněk) a vitamín E, který se nachází v buněčné membráně a tak chrání tuto část buňky před působením volných radikálů (MACHLIN a BENDICH, 1987). V ejakulátu semenná plazma představuje hlavní bariéru proti volným radikálům. Obsahuje celou řadu antioxidantů. Mezi hlavní lze zařadit molekulární antioxidanty jako je například vitamin C, taurin, hypotaurin a enzymatické, kde největší význam mají superoxid dismutáza, glutathion peroxidáza, kataláza a reduktáza (SMITH a kol. 1996, cit. SAEZ 1998). Je obtížné říci kolik daného antioxidantu organismus potřebuje. Požadavky organismu na přísun antioxidantů jsou zcela individuální. Závisí především na fyzické aktivitě, zdravotním stavu a na vnějších vlivech, kdy vznikají stresové situace (SIES, 1997). Dle MOURKA a kol. (2009) se antioxidační systém během života značně vyvíjí. V pokusech prováděných na laboratorních potkanech zjistili u dospělých jedinců nižší míru peroxidace lipidů v porovnáni s mláďaty. Antioxidační ochrana organismu v raných etapách vývoje zcela chybí, nebo nemá dostatečnou kapacitu. Kataláza během postnatálního vývoje zvýší svoji aktivitu přibližně 6 krát, aktivita glutathionperoxidázy a superoxiddismutázy přibližně 2
36
krát. Dále tento kolektiv autorů dodává, že samičí populace produkuje průkazně menší množství volných radikálů.
2.10.1 Superoxiddismutáza (SOD) Objev superoxiddismutázy, byl mezníkem při studiu biologického významu superoxidu i jiných volných radikálů. Superoxiddismutáza je obsažena v každé buňce (ŠTÍPEK, 2000). Dle RACKA a HOLEČKA (1999) vzniká v organismu superoxid, který je nejčastěji se vyskytující volným radikálem v těle. Tato sloučenina sama o sobě nenese velkou míru rizika. Nebezpečí superoxidu tkví v tom, že z něj mohou vznikat mnohem škodlivější reaktivní formy kyslíku. Proto se organismus zaměřil na prevenci s cílem odstranit přebytečný superoxid. Enzym SOD urychluje dismutaci superoxidu o čtyři řády. Jak uvádí SURAI (2002) existují tři různé formy tohoto enzymu, rozdělují se dle centrálního atomu kovu, který obsahují.
Cu, Zn-SOD: skládá se ze dvou identických podjednotek, v každé je jeden atom mědi a jeden atom zinku (ŠTÍPEK, 2000). Podle HARRISE (1999, cit. SURAI 2002) se tato forma nachází v cytoplazmě a mezimembránovém prostoru mitochondrií. Přenos elektronu z jedné molekuly na druhou obstarává atom mědi. Zinek má stabilizační funkci katalýzy se neúčastní (ŠTÍPEK, 2000). V pokusech, které provedl PEEKER a kol. (1997, cit. SURAI 2002) zjistil, že aktivita SOD má v ejakulátu mužů 20 krát vyšší koncentraci v porovnání s krevní plazmou, přičemž převládá Cu, Zn – SOD.
Mn – SOD: jedná se o hlavní formu, která se nachází v mitochondriální matrix. Tato forma se považuje jako zásadní pro přežití aerobních organismů. Zajišťuje buněčnou rezistenci vůči volným radikálům (FRIDOWICH 1995, cit. SURAI 2002).
Fe – SOD: byla identifikována v různých bakteriích, ale nabyla nalezen v živočišných tkáních (MICHALSKI 1992, cit. SURAI 2002).
2.10.2 Glutathion peroxidáza (GSH-Px) Glutathion peroxidáza byla objevena Millisem v roce 1957. O šestnáct let později bylo jasné, že se jedná o selenoenzym, který obsahuje atom selenu. Tento enzym se může nacházet v celé řadě tkání a orgánů (játra, ledviny, placenta, hypofýza, srdce, blastocysta, epidermis atd.) u všech hospodářských zvířat. Hlavní role GSH-Px spočívá v redukci peroxidu vodíku
37
na vodu a odpovídající alkoholy, což je preventivní krok pro produkci oxidativních forem kyslíku (SUNDE, 1993; KOHRLE a kol. 2000, cit. SURAI 2002). Intracelulární hydroperoxidy jsou odstraňovány dvěma glutathion peroxidázami:
Cytosolová GSH-Px: rozkládá několik druhů hydroperoxidů mastných kyselin. Je velice aktivní v dismutaci peroxidu vodíku, a tak v buňkách spolupracuje s katalázou při jeho odstraňování (např. v erytrocytech).
Fosfolipidhydroperoxid GSH-Px: dokáže redukovat fosfolipidové hydroperoxidy na neškodné hydroxideriváty přímo v membránách. Kromě dvou výše uvedených izomerů byly u člověka popsány ještě další dvě GSH-Px
– gastrointestinální a plazmatická, jejich úloha není ovšem v současné době zcela objasněna (SOMMERBURG a kol., 2002; SURAI, 2002; ŠTÍPEK, 2000; LAWRENCE, 1978). GSH-Px byla identifikována i v jádrech spermií, její aktivita je nejvyšší při dosažení puberty, je nepostradatelná při vývoji a zrání spermatozoi. U potkanů s deficitem selenu v krmné dávce klesla hladina GSH-Px ve spermiích o jednu třetinu v porovnání se skupinou zvířat, která měla normovaný příjem selenu v dietě (BEHNE a KYRIAKOPOULOS, 2001). Glutathion peroxidáza se spolu s dalšími antioxidanty podílí na ochraně cytoplazmy buněk. Všechny izoenzymy GSH-Px (cytosolová, fosfolipidová, gastrointestinální a plazmatická) se vyznačují antioxidační aktivitou (ŠTÍPEK, 2000). Nedávno byla identifikovaná specifická jaderná forma GSH-Px, která byla objevena ve varlatech potkanů (jádra spermatid), jednalo se rovněž o selenoprotein, který zahrnoval přibližně 80 % celkového selenu vyskytující se ve varlatech. Nedostatek GSH-Px se projeví poškozením buněčných membrán, které nejsou chráněny před lipoperoxidací, což má za následek mírnou, až středně těžkou hemolytickou anémii (ŠTÍPEK, 2000). K významnému snížení aktivity GSH-Px dochází i při nedostatečném příjmu selenu (RACEK a HOLEČEK, 1999). Nedostatek selenu v dietě může snížit aktivitu GSH-Px až o 90 % (XIA, HILL, BURK, 1985). ŠTÍPEK (2000); KIM a MAHAN (2003) k tomuto dodávají, že GSH-Px se přímo nepodává, její aktivita závisí na koncentraci selenu v dietě. Podání tohoto prvku je účinnější a snadnější. Tato suplementace selenem zvyšuje aktivitu GSH-Px. S nízkou aktivitou GSH-Px jsou spojeny kardiovaskulární onemocnění, anémie a poruchy imunitních funkcí. MERIN-GUZMAN a kol. (1997) tvrdí, že po přidání selenu do krmné dávky kanců vzroste aktivita GSH-Px v ejakulátu, což má za následek zvýšení celkové integrity spermií. Aktivita GSH-Px v ejakulátu byla nalezena u celé řady živočichů včetně kance a člověka (LASOTA a kol., 2004).
38
3 CÍL PRÁCE Cílem práce bylo ověřit ve faktoriálním krmném pokusu minerální výživu u plemenných kanců a to buď přídavkem chrómu (picolinát), nebo selenu (anorganická, nebo organická forma) na kvalitu (objem spermatu, celkový počet vyprodukovaných spermií, motilitu, koncentraci spermií a procento patologických spermií) a antioxidační status ejakulátu. Na základě experimentů, které byly provedeny u jiných druhů zvířat jsme se rozhodli ověřit hypotézu, že:
přídavek chrómu zlepší laboratorní hodnoty ejakulátu plemenných kanců
přídavek organicky vázaného selenu bude mít příznivější vliv na kvalitu ejakulátu plemenných kanců
doplnění chrómu do krmné dávky kanců bude mít za následek vyšší využití glukózy (dojde ke snížení hladiny glukózy a inzulínu v krvi kanců)
přídavek organicky vázaného selenu bude mít pozitivní vliv na antioxidační status ejakulátu kanců (tvorbu volných radikálů (free radicals), aktivitu GSH-Px) v porovnání s anorganickým zdrojem selenu
zda doplněk selenu v organické formě zvýší obsah tohoto prvku v ejakulátu v porovnání s anorganickým zdrojem tohoto prvku
39
4
MATERIÁL A METODIKA Byly provedeny dva experimenty, ve kterých byl sledován vliv přídavku minerálních
látek (chrómu – experiment č. 1 a selenu – experiment č. 2) na kvalitu ejakulátu plemenných kanců. 4.1 Experiment č. 1 – chróm Vliv přídavku chrómu (picolinate) na hladinu krevní glukózy, aktivitu inzulínu a změny laboratorního hodnocení ejakulátu plemenných kanců Vlastní pokus byl proveden na inseminační stanici kanců (ISK) ve Velkém Meziříčí. Do experimentu bylo zařazeno 75 kanců, kteří byli rozděleni do dvou vyrovnaných skupin dle věku a plemenné příslušnosti. Pro sledování bylo využito kanců plemene Duroc (43 kanců), Bílé ušlechtilé (6 kanců), Landrase (11 kanců), otcovská plemena SL 38 (Pn x DU) – (11 kanců) a SL 48 (LW x Pn) – (4 kanci). Pokusná zvířata byla ustájena individuálně (2,5 x 2,5 m) a měla ad-libitní přístup k vodě (viz. obr. 1). Všem zvířatům bylo zkrmováno 3,3 kg základní krmné směsi (tab. 1 a 2) obsahující 62 µg Cr/kg krmné směsi (KS). Obsah MEp byl 12,6 MJ/kg KS. Celkový příjem Cr u kanců skupiny kontrolní (n = 19) tedy činil 205 µg/den, což odpovídá pouze 31 % z doporučeného denního zásobení. Kancům (n = 19) první pokusné skupiny (Cr1) byl navíc perorálně aplikován organicky vázaný chróm v dávce 60,6 µg/kg KS. Kancům druhé (n = 18) experimentální skupiny (Cr2) byl chróm navýšen o 121,2 µg/kg KS. Poslední skupině (n = 19) kanců (Cr3) byl přidán chróm v množství 181,8 µg/kg KS. Chróm byl dávkován ve formě tablet, jako chróm picolinát. Tyto tablety byly podávány vždy při ranním krmení. Pro projev spermatogeneze (cca 42 dní) byla stanovena délka pokusného sledování na 14 týdnů. Pokusné sledování bylo započato v polovině prosince 2010 a ukončeno v polovině března 2011. Experiment byl rozdělen na čtyři sledovaná období. První období trvalo 18 dní, druhé 31 dní, třetí 28 dní a čtvrté 18 dní. Ejakulát byl od kanců získáván pomocí odběru do ruky, při skoku na fantom (viz. obr. 2). Kancům bylo semeno odebíráno dle aktuální potřeby produkce inseminačních dávek s ohledem na jejich zdravotní stav a věk kance, minimálně však 3x za měsíc. Zdravotní stav byl sledován veterinárním lékařem. Získané výsledky byly statisticky vyhodnoceny programem Statistika a rozdíly mezi průměry byly hodnoceny dle Studentova párového t – testu (SNEDECOR a COCHRAN, 1989).
40
Analýza krve Vzorky krve pro potřebné analýzy byly odebrány 43. den pokusu od šesti kanců z každé skupiny. Odběry byly provedeny veterinárním lékařem (MVDr. Josef Sedmík) 2 hodiny po ranním nakrmení, kanci nebyli před odběrem fyzicky zatěžováni ani stresováni. Krev byla odebírána z přední duté žíly do plastových vzorkovnic (viz. obr. 4) Vzorky krve byly ihned po odběru umístěny do chladícího přepravního boxu a nejpozději do 2 hodin analyzovány.
Stanovení glukózy Pro stanovení glukózy bylo do plastových kyvet odpipetováno 200 µl reagencie, (Sigma – Aldrich, Germany, http://www.sigmaaldrich.com/germany/Deutsche-Standorte.html) a následně bylo přidáno 10 µl vzorku krve. Absorbance byla měřena 10 minut při γ = 505 nm. Pro výpočet bylo použito hodnoty absorbance samotné reagencie a hodnoty absorbance po 10 minutové inkubaci se vzorkem. Hodnoty byly od sebe odečteny a výsledek přepočítán dle kalibrační křivky na obsah glukózy.
Stanovení inzulínu Pro stanovení aktivity inzulínu byla použita imunoenzymometrická metoda EIMA (Marcodia, Uppsala Sweden, 2012; http://www.mercodia.se/contact/partners/sweden.html). Měření bylo provedeno pomocí automatického analyzátoru AIA 600 II určeného k měření imunochemických parametrů v biologických tekutinách. K analýze inzulínu bylo použito 50 µl analyzované krevní plazmy kanců smíchané s 100 µl diluentu (ředícího roztoku). Vzorky byly inkubovány při 37 ºC. Následně byl vzorek promyt wash roztokem a po přídavku substrátu 4-methylumbelliferyl fosfátu (4MUP) do testovacího kelímku byla změřena fluorescenční intenzita inzulínu. Koncentrace se počítá podle provedené kalibrační křivky.
41
4.1.1 Principy stanovení laboratorních hodnot ejakulátu Stanovení objemu ejakulátu Objem ejakulátu byl stanoven pomocí odměrného válce.
Stanovení koncentrace spermií v ejakulátu Koncentrace spermií v ejakulátu se vyjadřovala jako počet spermií v 1 mm3. Koncentrace se
určovala
fotometricky
pomocí
Spekolu
11
(Carl
Zeiss,
Jena,
http://www.modernmicroscopy.com/main.asp?article=93&print=true&pix=true).
2009, Měření
probíhalo při vlnové délce v rozmezí 340 - 850 nm. Dávkovačem pro malé množství tekutiny se nabrala do tenkostěnné zkumavky 9 ml 1M HCl, pomocí varipipety se přidalo 0,25 ml vzorku z rozmíchaného nativního ejakulátu a následně se vzorek promíchal. Zkumavka se zasunula do nástavce Spekolu 11 a odečetla se naměřená hodnota. Podle kalibrační tabulky se stanovila koncentrace spermatu.
Stanovení procenta patologických spermií v ejakulátu Procento patologických spermii bylo stanoveno z prvního odběru v měsíci. Postup při přípravě roztěru: kapka semene se nanesla pomocí skleněné tyčinky na podložní sklíčko, v úhlu 45 stupňů se ke kapce přiblížilo zabroušené roztěrové sklíčko tak, aby se kapka po dotyku se sklíčkem rozprostřela po hraně sklíčka a tahem se provedl roztěr v tenké vrstvě. Morfologické posouzení (vyhodnocení abnormálních spermií na připraveném spermiogramu v několika zorných polích – počítaly se jednotlivě všechny abnormální spermie), barvení a vyhodnocení spermiogramu prováděl obvodní veterinární lékař (MVDr. Josef Sedmík).
Stanovení motility Stanovení motility bylo provedeno do 15 minut po odběru kance, mikroskopicky z šetrně promíchaného spermatu. Semeno bylo nabráno skleněnou tyčinkou, kapka semene se nanesla na předehřáté podložní sklíčko (cca 42 oC) a překryla krycím sklíčkem. Sklíčka byla předehřívána na předehřívajícím stolku, mikroskop měl rovněž předehřívanou destičku (viz. obr. 3). Mikroskopicky bylo určeno mikroskopicky subjektivním odhadem procento spermií s přímočarým pohybem vpřed za hlavičkou, při tělesné teplotě vzorku a při zvětšení 1 : 40. Míra pohyblivosti se určovala v několika zorných polích.
42
4.2 Experiment č. 2 – selen Vliv různých forem (organická, anorganická) a hladin selenu na laboratorní hodnoty ejakulátu plemenných kanců
Vlastní pokus byl proveden na inseminační stanici kanců (ISK) ve Velkém Meziříčí. Do experimentu bylo zařazeno 78 kanců, kteří byli rozděleni do čtyř vyrovnaných skupin dle věku a plemenné příslušnosti. Věk kanců se pohyboval od 1 roku do 3 let. Pro sledování bylo využito kanců plemene Duroc (46 kanců), Bílé ušlechtilé (6 kanců), Landrase (11 kanců), otcovská plemena SL 38 (Pn x DU) – (11 kanců) a SL 48 (LW x Pn) – (4 kanci). Pokusná zvířata byla ustájena individuálně (2,5 x 2,5 m) a měla ad-libitní přístup k vodě (viz. obr. 1). Všem zvířatům bylo zkrmováno 3,3 kg základní krmné směsi (tab. 1 a 2) obsahující 0,02 mg Se/kg krmné směsi (KS). Obsah MEp byl 12,6 MJ/kg KS. Do experimentu byly zahrnuty čtyři skupiny zvířat. První skupině (Se1) kanců (n = 18) bylo zkrmováno 0,3 mg Se/kg KS v organické formě. Druhá skupina (Se2) zvířat (n = 20) byla krmena 0,3 mg Se/kg KS v anorganické formě. Třetí skupině (Se3) kanců (n = 21) byl podáván selen v dávce 0,6 mg Se/kg KS v organické formě. Poslední čtvrté skupině (Se4) pokusných zvířat (n = 19) bylo zkrmováno 0,6 mg Se/kg KS v anorganické formě. Jako anorganický zdroj selenu byl zkrmován seleničitan sodný. Pro doplnění selenu v organické formě jsme použili kvasnice obohacené selenem (Sel-Plex – Alltech, 2000 mg Se/kg). Pro správný průběh spermatogeneze (cca 42 dní) byla stanovena délka pokusného sledování na 20 týdnů. Pokusné sledování bylo započato v polovině dubna 2011 a ukončeno na konci srpna 2011. Experiment byl rozdělen na pět sledovaných období. První období trvalo 19 dní, druhé 31 dní, třetí 30 dní, čtvrté 31 dní a páté 31 dní. Kancům bylo semeno odebíráno dle aktuální potřeby produkce inseminačních dávek s ohledem na jejich zdravotní stav a věk kance, minimálně však 3x za měsíc. Ejakulát byl od kanců získáván pomocí odběru do ruky, při skoku na fantom (viz. obr. 2) Zdravotní stav byl sledován veterinárním lékařem. Makroskopické a mikroskopické hodnocení ejakulátu (objem ejakulátu, motilita spermií, koncentrace a procento patologických spermií) bylo prováděno dle stejné metodiky jako v experimentu č. 1. Pro sledování vývoje teploty prostředí byl použit přístroj Dataloger, který byl umístěn v centrální části stáje ve výšce 1,5 m nad zemí. Teplota byla zaznamenávána v hodinových intervalech.
43
Získané výsledky byly statisticky vyhodnoceny programem Statistika a rozdíly mezi průměry byly hodnoceny dle Studentova párového t – testu (SNEDECOR a COCHRAN, 1989).
Princip výroby organického selenu (Sel-Plex) Organický selen byl vyroben na kvasinkové kultuře. Na živném médiu (řepná melasa) se nechal za přístupu kyslíku pomnožit kmen kvasinek, který byl tolerantní k vysokým dávkám selenu. V první fázi fermentačního procesu byla přidávána v premixu síra, jako základní zdroj pro tvorbu sirných aminokyselin (methionin a cystein). Ve druhé fázi fermentace bylo médium odsířeno a místo síry byl přidáván selen v anorganické formě (seleničitan sodný). Z tohoto anorganického zdroje se uvolnil selen, který byl následně zabudován do sirných aminokyselin na místo síry, čímž vznikl
selenomethionin a selenocystein spolu s dalšími selenovými
peptidovými řetězci. Obsah selenu byl 2000 mg/kg kvasinkové kultury. Takto vyrobený organický selen se zamíchal po analýze do nosiče a následně se aplikoval do krmných dávek kanců. 4.2.1 Druhá část experimentu č. 2 – selen Vliv organické a anorganické formy selenu na antioxidační status ejakulátu plemenných kanců
Vlastní pokus byl proveden na inseminační stanici kanců (ISK) ve Velkém Meziříčí. Do experimentu bylo zařazeno 28 kanců plemene Duroc, kteří byli rozděleni do čtyř vyrovnaných skupin (dle věku a plemenné příslušnosti.). Věkový interval kanců se pohyboval od 1 do 3 let. Pokusná zvířata byla ustájena individuálně (2,5 x 2,5 m) a měla ad-libitní přístup k vodě (viz. obr. 1). Všem zvířatům bylo zkrmováno 3,3 kg základní krmné směsi (Tab. 1 a 2) obsahující 0,02 mg Se/kg krmné směsi (KS). Obsah MEp byl 12,6 MJ/kg KS. Do experimentu byly zahrnuty čtyři skupiny zvířat. První skupině (Se1) kanců (n = 7) bylo zkrmováno 0,3 mg Se/kg KS v organické formě. Druhá skupina (Se2) zvířat (n = 7) byla krmena 0,3 mg Se/kg KS v anorganické formě. Třetí skupině (Se3) kanců (n = 7) byl podáván selen v dávce 0,6 mg Se/kg KS v organické formě. Poslední čtvrté skupině (Se4) pokusných zvířat (n = 7) bylo zkrmováno 0,6 mg Se/kg KS v anorganické formě. Jako anorganický zdroj selenu byl
44
zkrmován seleničitan sodný. Pro doplnění selenu v organické formě jsme použili kvasnice obohacené selenem (Sel-Plex – Alltech’s, 2000 mg Se/kg). Délka pokusného sledování byla stanovena na 20 týdnů. Po tuto dobu byly od kanců pokusných skupin shromažďovány vzorky ejakulátu (vždy v pravidelných sedmi týdenních intervalech). První kontrolní odběr byl proveden, před zahájením experimentu. Ihned po odběru bylo nativní semeno zamraženo a patřičným analýzám bylo podrobeno 2 týden po odběru. Odběr semene byl prováděn ručně pomocí fantomu (viz. obr. 2) Pokusné období bylo započato v polovině dubna 2011 a ukončeno na konci srpna 2011. Výsledky byly zpracovány pomocí programu statistika dle studentova párového t-testu (SNEDECOR a COCHRAN, 1989).
Příprava vzorku Nejprve bylo odpipetováno 0,5 ml nativního rozmraženého semene. K tomuto množství bylo přidáno 2 ml tekutého dusíku a 0,5 ml fosfátového pufru. Následně byl vzorek homogenizován na ULTRA-TURRAX T8 homogenizer (IKA, Konigswinter, Germany, 2012, http://www.ika.com/) při 3000 rpm, po dobu 2 minut. Po ukončení homogenizace byl přidán 1 ml fosfátového pufru a takto upravený vzorek byl homogenizován na vortexu Vortex-2 Genie (Scientific Industries, New York, NY, USA) po dobu 15-ti minut, při 2000 rpm. Následně byl
vzorek centrifugován na Universal 32 R centrifuge (Hettich-Zentrifugen GmbH, Tuttlingen, Germany) po dobu 20-ti minut při 16 000 otáčkách, při 4 °C. Poté bylo odpipetováno 1,5 ml
supernatantu, který byl podroben analýze.
Popis přístroje BS-400 Pro stanovení, antioxidační aktivity a glutathione peroxidasy byl použit automatický spektrofotometr BS – 400 (Mindray, China), který se skládá z kyvetového prostoru (temperovaný na 37 ± 0.1 °C), reagenčního prostoru s karuselem pro reagencie a přípravu vzorků (temperovaný na 4 ± 1 °C) a optického detektoru. Zdrojem světla byla halogenowolframová žárovka. Přenos vzorků a reagencí zabezpečuje robotické rameno s dávkovací jehlou. Obsah kyvet byl promíchán automatickým míchadlem ihned po přidání činidla, nebo vzorku o objemu 2 – 45 µl. Kontaminace byla minimalizována díky proplachování jak dávkovací jehly, tak míchadla MilliQ vodou. Pro detekci bylo možné využít vlnových délek: 340, 380, 412, 450, 505, 546, 570, 605, 660, 700, 740, 800 nm. Zařízení bylo plně kontrolováno softwarem BS400 (Mindray, China)
45
Stanovení antioxidační aktivity Výsledek antioxidační aktivity byl vyjádřen jako ekvivalent troloxu. Ejakulát měl celkově takový antioxidační potenciál jako x koncentrace troloxu. Jednotky jsou v mmol/l.
Stanovení antioxidační aktivity pomocí metody Free Radicals: U této metody bylo využíváno schopnosti chlorofylinu (sodno-mědnatá sůl chlorofylu) přijímat a odevzdávat elektrony za současné stabilní změny absorpčního maxima. Tento děj byl podmíněn alkalickým prostředím a přídavkem katalyzátoru. Metodika stanovení byla přebrána z publikace SOCHOR a kol. (2010). Pro stanovení antioxidační aktivity byl použit automatický spektrofotometr BS – 400 (Mindray, China). Do plastových kyvet bylo pipetováno 150 µl reagencie R1 (0,1 M HCl, extrakt chlorofylinu, reakční pufr, katalyzátor) a následně bylo přidáno 6 µl vzorku. Absorbance byla měřena 12 minut při λ = 450 nm. Dle kalibrační křivky byla absorbance přepočítána na ekvivalentní obsah troloxu (mmol/l).
Stanovení Glutathion peroxidázy (GSH-Px)
Ke stanovení glutathion peroxidázy byla použita nepřímá metoda stanovení aktivity GSHPx založena na oxidaci redukovaného glutathionu (GSH) na oxidovaný glutathion (GSSG) katalyzovaný GSH-Px. Tato reakce byla spojena s glutathion recyklující reakcí, při níž byl GSSG redukován na GSH pomocí NADPH a glutathion reduktázy (GR).
GSH-Px R-OOH + 2GSH → R-OH +GSSG + H2O GR GSSG + NADPH + H+ → 2GSH + NADP+
Ke stanovení aktivity glutathion peroxidázy byl použit kit CGP1 (Sigma Aldrich, USA). Měření se provádělo v plastové kyvetě na automatickém analyzátoru BS 400 (Mindray, Čína). Do kyvety bylo nejdříve pipetováno 260 µl reagence R1 (0,3 mM NADPH v GPx pufru) a činidlo se inkubovalo při 37 °C 108 sekund. Poté bylo pipetováno 10 µl vzorku a v 378 sekundách byla reakce spuštěna přidáním 30 µl reagence R2 (3 mM tert-butyl hydroperoxid). Vzorek byl inkubován 18 sekund, poté byla absorbance měřena při λ = 340 nm a měřila se reakční kinetika po dobu 126 sekund. Přístroj vypočítal průměrný pokles absorbance za
46
minutu (ΔA) a podle kalibrační rovnice aktivitu GSH-Px u měřených vzorků. Metodika stanovení byla přebrána z publikace SOCHOR a kol. (2010).
Stanovení koncentrace selenu v ejakulátu: Pro stanovení koncentrace selenu v ejakulátu kanců bylo použito metody atomové absorpční spektrometrie (AAS) s generací hybridů po rozkladu vzorku v kyselině dusičné a mikrovlnném rozkladném systému.
4.5. Stanovení obsahu selenu a chrómu v krmné směsi Obsah jednotlivých prvků v experimentech č. 1 a 2 ve vzorcích krmné směsi byl stanoven metodou atomové absorpční spektrometrie. Navážka 0,5 g homogenního vzorku byla mineralizována ve směsi koncentrované kyseliny dusičné a peroxidu vodíku v mikrovlnném systému
ETHOS
1
(MILESTONE,
Itálie,
2012,
http://www.milestonesrl.com/analytical/Products/). Po dekompozici vzorku byl roztok doplněn demineralizovanou vodou na objem 25 ml. Koncentrace prvků v takto připravených roztocích byla stanovena na atomovém absorpčním spektrometru s kontinuálním zdrojem záření s vysokým rozlišením ContrAA 700 (ANALYTIK JENA, Německo, 2012, http://www.analytikjena.de/). Použité vlnové délky: Se 196,026 nm, Cr 357,868 nm.
47
5 VÝSLEDKY Během provedených pokusů jsme nezaznamenali žádné zdravotní problémy u pokusných zvířat 5.1 Experiment č. 1 – chróm Vliv přídavku chrómu (picolinate) na hladinu krevní glukózy, aktivitu inzulínu a změny laboratorního hodnocení ejakulátu plemenných kanců
V průběhu experimentu byl posouzen vliv přídavku chrómu na hladinu glukózy a aktivitu inzulínu v krvi plemenných kanců. Průměrný stav sledovaných parametrů jejich směrodatné odchylky i statistické závislosti zachycuje graf 1 a 2. Průměrná hodnota krevní glukózy u kanců skupiny Cr3 byla statisticky průkazně nižší (P < 0,01) než-li u kanců kontrolní skupiny (rozdíl mezi skupinami představoval 28,9 %). Rovněž i v porovnání mezi skupinami zvířat Cr3 a Cr1 byla nalezena průkazně nižší hladina krevní glukózy (P < 0,01) rozdíl činil 36,3 %. V aktivitě inzulínu nebyl mezi skupinami nalezen průkazný rozdíl. Nejnižší hladinu inzulínu měla skupina kanců Cr2. Ostatní skupiny experimentálních zvířat měly koncentraci inzulínu prakticky na stejné úrovni. Během pokusného sledování byla také shromažďována data z laboratorního hodnocení ejakulátu kanců. Průměrný stav sledovaných parametrů jejich směrodatné odchylky i statistické závislosti zachycují tabulky 3 a 4. Hodnoty u motility spermií byly po celou dobu trvání experimentu prakticky nezměněny pohybovaly se v intervalu 67,2 – 71,7 %. Objem ejakulátu se u všech skupin kanců mimo skupinu zvířat Cr1 snižoval, nejmarkantnější snížení bylo pozorováno u skupiny kanců Cr3 o 12,8 %. Koncentrace spermií měla u všech skupin kanců ve druhé a čtvrté periodě vzrůstající charakter. Nejvyšší nárůst činil 14,5 % u kontrolní skupiny ve druhé periodě. Po tomto období byl pozorován u všech pokusných skupin pokles koncentrace spermií. Nejmarkantnější snížení bylo sledováno u skupin kanců Cr2 a Cr3 (s nejvyšším příjmem chrómu v krmné dávce) 7,6 % resp. 7,5 %. Naopak nejnižší pokles koncentrace spermií měla kontrolní skupina kanců (4,9 %). Při hodnocení procenta patologických spermií došlo u kontrolní a Cr1 skupiny zvířat k lineárnímu růstu, kdy na konci čtvrté periody tento nárůst činil 25,3 % resp. 20,6 %. U kanců Cr2 byl nárůst ve čtvrté periodě 66,7 % (P < 0,05) v porovnání s první částí experimentu. Zvířata skupiny Cr4 neměla výrazné diference u procenta patologických
48
spermií. Při hodnocení celkového počtu vyprodukovaných spermií na jeden odběr kontrolní skupina kanců měla sníženou produkci ve čtvrté periodě o 15,7 % v porovnání se prvním obdobím. Kanci skupiny Cr1 měli celkový počet vyprodukovaných spermií nezměněn. Zvířata Cr2 pokusné skupiny na konci experimentu měla celkový pokles celkového počtu vyprodukovaných spermií o 17,1 % v porovnání s první periodou. U kanců skupiny Cr3 s nejvyšším doplňkem chrómu byl naměřen v poslední čtvrté části experimentálního sledování pokles o 21,8 % (P < 0,01) ve srovnání s hodnotami v prvním období.
5.2 Experiment č. 2 – selen Vliv různých forem (organická, anorganická) a hladin selenu na laboratorní hodnoty ejakulátu plemenných kanců V průběhu experimentu byl posouzen vliv přídavku různých hladin a forem selenu (organická a anorganická) na změny laboratorních hodnot ejakulátu plemenných kanců. Během pokusného sledování byla shromažďována data z laboratorních rozborů semene plemeníků. Průměrný stav sledovaných parametrů jejich statistické odchylky i statistické závislosti zachycují tabulky 5 a 6. Z uvedených tabulek je patrné, že u motility spermií nebyla nalezena u žádné ze sledovaných skupin zvířat statistická průkaznost. U koncentrace spermií byl u skupiny kanců Se1 (organická forma selenu – 0,3 mg/kg KS) pozorován mírný pokles na konci pátého pokusného období o 7,7 %. U Experimentální skupiny zvířat Se2 (anorganická forma selenu – 0,3 mg/kg KS) došlo k postupnému snižování koncentrace spermií od třetího období, až o 15,2 % (P < 0,01) na konci páté periody. Skupina kanců Se3 (organická forma selenu – 0,6 mg/kg KS) za celé experimentální období nezaznamenala výrazných změn v koncentraci spermií na konci závěrečného pokusného sledování činil pokles pouze 3,2 %. U poslední čtvrté skupiny experimentálních zvířat Se4 (anorganická forma selenu – 0,6 mg/kg KS) docházelo k postupnému snižování koncentrace spermií v ejakulátu, kdy ve čtvrtém období činil tento pokles 11,9 % (P < 0,05) a v pátém období 10,8 % což je hodnota, která se průkazně nelišila od výchozího stavu. Se snižující se koncentrací spermií došlo zároveň ke zvýšení objem ejakulátu, ve čtvrtém období bylo naměřeno navýšení o 13,8 % (P < 0,05) a v pátém o 15,9 % (P < 0,01). Celkový počet vyprodukovaných spermií proto zůstal nezměněn.
49
Objem ejakulátu u skupiny kanců Se1 nedoznal výrazných změn, na konci experimentálního sledování činil nárůst pouze 6,3 %. Druhá skupina kanců Se2 rovněž nedosáhla žádných průkazných změn, objem ejakulátu se u těchto zvířat pohyboval prakticky na totožné hladině po celou dobu trvání experimentu. Ani u skupiny zvířat Se3 nebyl zaznamenán průkazný rozdíl v posledním období byl nárůst 5,1 %. Celkový počet spermií u skupiny kanců Se1 poklesl o 5,6 %. U skupiny zvířat Se2 bylo pozorováno postupné snižování celkového počtu spermií, které v pátém období činilo 18,5 % (P < 0,01). Skupiny kanců Se3 a Se4 měly po celou dobu experimentu celkový počet vyprodukovaných spermií nejvyrovnanější bez průkazných rozdílů. Posledním hodnoceným ukazatelem kvality ejakulátu bylo procento patologických spermií. U první skupiny kanců Se1 byl v průběhu pokusného sledování pozorován vzrůstající trend, na konci experimentu došlo k celkovému nárůstu o 26,4 %. U kanců skupiny Se2 nebylo nalezeno průkazného rozdílu u procenta patologických spermií. U kanců skupiny Se3 byl pozorován od třetího období nárůst o 20,4 % ve čtvrtém o 36,6 % (P < 0,05) a v posledním o 24,4 %. Poslední skupina zvířat Se4 rovněž měla zvyšující se vývoj procenta patologických spermií, který byl nejmarkantnější ve čtvrtém a v pátém období, ovšem bez statistické průkaznosti. V průběhu experimentálního sledování byla hodnocena teplota prostředí. Nejvyšších teplot bylo dosaženo v průběhu pátého období (srpen), kdy se teplota během posledních 14 dnů trvání pokusného sledování pohybovala mezi 15 – 19 hodinou v rozmezí 25 - 30 oC. Největší změny v závislosti na vývoji teploty byly pozorovány u celkového počtu vyprodukovaných spermií. Z našeho pokusného sledování je patrné, že s rostoucí teplotou klesal počet vyprodukovaných spermií u skupin kanců Se1 a Se2. Naopak skupiny kanců Se3 a Se4 měly po celou dobu experimentu minimální změny tohoto důležitého ukazatele kvality ejakulátu. Průměrný vývoj teploty v jednotlivých období a průměrné hodnoty celkového počtu vyprodukovaných spermií na jeden odběr u experimentálních skupin kanců zachycuje graf č. 3.
50
5.2.1 Druhá část experimentu č. 2 – selen Vliv organické a anorganické formy selenu na antioxidační status ejakulátu plemenných kanců
V průběhu experimentu byl zhodnocen přídavek různých hladin a forem selenu (organická a anorganická) na antioxidační status ejakulátu plemenných kanců. U sledované hodnoty free radicals (FR) nebylo u skupiny zvířat Se1 (organická forma selenu - 0,3 mg Se/kg KS) nalezeno mezi odběry průkazného rozdílu, nejnižší aktivitu FR měli kanci této skupiny v druhém odběru, kdy pokles činil 26,7 %. Poté výskyt FR vzrostl téměř na stejnou hladinu jako u kontrolního odběru. U druhé pokusné skupiny kanců Se2 (anorganická forma selenu - 0,3 mg Se/kg KS) došlo ke zvýšení FR ve druhém odběru o 57,5 %. Třetí měření dosáhlo navýšení FR o 82,2 % (P < 0,05). U posledního čtvrtého měření bylo zaznamenáno zvýšení FR dokonce o 91,4 % (P < 0,01). Výsledky skupiny kanců Se3 (organická forma selenu - 0,6 mg Se/kg KS) naopak vypovídají o postupném snižování FR, kdy nejvyšší pokles byl naměřen u čtvrtého odběru. Celkové snížení FR od počátku experimentu bylo u této skupiny zvířat o 15,9 %. Pro poslední skupinu kanců Se4 (anorganická forma selenu – 0,6 mg Se/kg KS), nebylo zaznamenáno významných změn v hodnotách FR. Na konci pokusného pozorování u této skupiny kanců byla hodnota FR o 11,5 % vyšší, než na začátku experimentu. Nedílnou součástí antioxidačního systému, s přímou návazností na metabolizmus selenu, je enzym glutathion peroxidáza (GSH-Px), jehož stanovení bylo předmětem zájmu našeho sledování. U skupiny kanců Se1 nebyly pozorovány, žádné významné rozdíly v aktivitě GSH-Px. Na konci experimentu došlo k nepatrnému zvýšené o 2,3 %. Rovněž i druhá experimentální skupina zvířat Se2 nezaznamenala žádných průkazných změn. Při čtvrtém odběru byla aktivita GSH-Px pouze o 1,6 % vyšší, než před zahájením experimentálního sledování. Glutathion peroxidáza v ejakulátu kanců skupiny Se3 se během druhého a třetího měření zvýšila pouze nepatrně (o 2,4 %). Avšak, při analýze čtvrtého odběru ejakulátu, tento nárůst činil již 6,3 % (P < 0,001). U poslední skupiny zvířat Se4 docházelo k pozvolnému zvyšování koncentrace GSH-Px (o 2,6 % na konci experimentu), avšak bez statistické průkaznosti. Při hodnocení koncentrace selenu v ejakulátu skupina kanců Se1 nedoznala ve druhém období významných změn. U třetího a čtvrtého odběru došlo k poklesu obsahu selenu až o 37,6 %. U druhé skupiny zvířat Se2 nebylo nalezeno v koncentraci selenu žádného průkazného rozdílu. Ve druhém období došlo k nárůstu o 23,7 % a poté se hodnoty třetího a čtvrtého
51
odběru pohybovaly na stejné hladině jako na začátku experimentálního sledování. U skupiny kanců Se3 byl obsahu selenu v ejakulátu při druhém odběru vyšší o 61,0 %. Při třetím měření tento nárůst činil již 69,7 % (P < 0,05). Stejný trend pokračoval i při čtvrté analýze semene, kdy nárůst hladiny selenu v porovnání s prvním odběrem dosáhl 71,9 % (P < 0,05). Poslední skupina pokusných zvířat nezaznamenala významných změn v koncentraci selenu. Byl nalezen nesignifikantní nárůst na konci experimentu o 25,4 %. %. Porovnávali jsme F – testem všechny kombinace vzájemného ovlivnění ejakulátu přídavkem selenu (0,3 vs. 0,6 mg/kg KS). Zjistili jsme pouze průkazné zvýšení hladin selenu v ejakulátu o 75,7 µg/l (P < 0,01). Celkový počet vyprodukovaných spermií (u kanců plemene Duroc zahrnutých do tohoto sledování) poklesl u první skupiny kanců Se1 na konci experimentu o 15,7 %. Pokusná zvířata skupiny Se2 měla na konci experimentu signifikantně nižší produkci spermií o 17,0 % (P < 0,001) v porovnání s prvním odběrem. Kanci skupin Se3 a Se4 měli po celou dobu trvání pokusného sledování vyrovnané hodnoty celkového počtu vyprodukovaných spermií na jeden odběr. Výsledky všech sledovaných ukazatelů jsou zřetelné z tabulky 7. Z grafu č. 4 je patrné, že se vzrůstajícím množství FR u skupiny kanců Se2 klesá celkový počet vyprodukovaných spermií na jeden odběr. Tento trend byl bez statistické průkaznosti.
52
6 DISKUZE 6.1
Experiment č. 1 – chróm
Vliv přídavku chrómu (picolinate) na hladinu krevní glukózy, aktivitu inzulínu a změny laboratorního hodnocení ejakulátu plemenných kanců Ve studii ROGINSKEHO a MERTZE (1969) bylo prokázáno, že chróm má vliv na metabolismus sacharidů a hormon inzulín. Inzulín působí tak, že se připojí k specifickým receptorům na povrchu buněk a chróm může buď zvýšit počet inzulínových receptorů, nebo zvýší afinitu inzulínových receptorů, popřípadě dojde ke kombinaci obou mechanismů (ANDERSON 1997, cit. PAGE a kol. 1993). EVANS a BROWMAN (1992) uvádějí, že chróm picolinát zvýšil rychlost internalizace inzulínu do potkaního kosterního svalstva a zvýšil absorpci glukózy. Toto zvýšení by mělo být v souladu s pozorovaným snížením koncentrace inzulínu v krvi. Přičemž PAGE a kol. (1993) uvádějí, že v jejich studii nebyla sérová koncentrace inzulínu ovlivněna chrómem, k podobnému závěru došli i AMOIKON a kol. (1995). Ani v naší studii nedošlo ke změně aktivity inzulínu u kanců přijímajících chróm, pokusné skupiny vykázaly obdobnou hodnotu jako kanci skupiny kontrolní. LINDEMANN a kol. (2008) pozorovali u prasniček průkazné snížení (P < 0,05) hladiny glukózy v krvi po přídavku 5000 µg Cr/den (jako chróm picolinát) v porovnání se prasničkami bez přídavku chrómu. Dále porovnávali i ostatní zdroje chrómu (chróm propionát, tripicolinát, methionin, a chróm vázaný v kvasnicích), které ovšem nedosahovali takové účinnosti, jako chróm picolinát a průkazně neovlivnili hladinu krevní glukózy prasat. Hladina glukózy v krvi se nám ovšem podařila ovlivnit u skupiny kanců již po přídavku 181 g/kg KS. U lidí konzumujících normální stravu vedl nedostatek chrómu ke zvýšení hladiny glukózy a inzulínu v krvi (MERTZ, 1998; JEEJEEBHOY a kol., 1977). Podle studie BALKA a kol. (2007) přídavek chrómu snížil hladinu glukózy o 1 mmol/l u skupiny lidí postižených diabetem II. typu. U lidí, kteří diabetes neměli, nebyl po příjmu chrómu pozorován žádný efekt na koncentraci glukózy v krvi. Tyto závěry potvrzuje i ANDERSON (1998), který doplňuje, že doporučená dávka u člověka postiženého diabetem II typu je 200 µg/den. LUKASKI (1999) ve své publikaci uvádí, že u lidí s vysokou hladinou glukózy v krvi, nastal po přídavku trojmocného chrómu v dávce 250 µg/den po dobu dvou týdnů pokles krevního cukru na fyziologickou hranici.
53
Z přehledu řady studií, který vytvořil ANDERSON (1998) také vyplývá, že přídavek chrómu zlepšoval glukózovou toleranci a snižoval plasmatickou koncentraci glukózy i u lidí netrpících cukrovkou. V našem experimentu vedl přídavek chrómu k průkaznému snížení hladiny glukózy v krevní plazmě kanců. DSEHMUKH a kol. (2009) hodnotili motilitu, koncentraci spermií a morfologické změny na pohlavních orgánech po přídavku trojmocného chrómu v dávkách 0, 4, 15 a 60 g/kg KS do diety potkanů. Jak tito autoři uvádí, za celé pokusné období nebyly pozorovány žádné změny v kvalitě ejakulátu, které by bylo možné přisoudit zvýšené dávce chrómu. Nejlepších výsledků bylo dosaženo jak u motility, tak koncentrace spermií při dávce 4 g/kg KS chrómu, tyto výsledky ovšem nebyly statisticky průkazné. V obdobném experimentu ANDERSON a POLANSKI (1981) zjistili u potkanů při podávání diety, která obsahoval méně než 100 g/kg KS chrómu celkové snížení počtu spermií. Dále se snížila o 25 % úspěšnost oplodnění v porovnání se skupinou, které byl doplněn chróm do krmné dávky. O negativních dopadech nedostatku chrómu na plodnost a počet spermií u laboratorních potkanů hovoří také ANDERSON (1988). GALL a kol. (2003) testovali přídavek chrómu picolinát na 153 kancích rozdělených do dvou skupin. Kanci přijímali 2,27 kg krmné směsi a byli obdobně jako v našem sledování doplňováni 200 g Cr/kg KS. Kanci byli odebíráni v průměru třikrát týdně a experiment trval 135 dnů. Tento tým výzkumníků rovněž došel k závěru, že doplňování chrómu do krmných dávek kanců nemá zásadní vliv na kvalitu ejakulátu plemenných kanců. CLOSE a COLE (2003) uvádí ve své publikaci, že je vhodné přidávat kancům v reprodukci do krmné dávky chróm pro zlepšení reprodukčních ukazatelů. Podle těchto autorů dodávání chrómu zvýšilo koncentraci spermií a celkovou plodnost u samců laboratorních potkanů. Dále dodávají, že přídavek chrómu v dávce 200 g/kg KS má pozitivní vliv na celkový reprodukční potenciál plemenných kanců. V našem sledování se tato skutečnost při podávání dávky chrómu, kterou doporučují tito autoři (183,2 g/kg KS vč. nativních zdrojů – skupina kanců Cr2) nepotvrdila. Zaznamenali jsme spíše opačný trend vývoje, pokles celkového množství vyprodukovaných spermií činil 17,1 %. S dalším navýšením dávky chrómu (243,8 g/kg KS vč. nativních zdrojů – skupina kanců Cr3) byla celková produkce spermií nižší o 21,8 % (P < 0,01). Podle WIILSONA a kol. (2004) může mít doplňování chrómu do krmných dávek kanců, pozitivní vliv na překonávání stresových situací a zlepšení reprodukčních ukazatelů.
54
6.2 Experiment č. 2 – selen Vliv různých forem (organická, anorganická) a hladin selenu na laboratorní hodnoty ejakulátu plemenných kanců
MARIN-GUZMAN a kol. (1997) prováděli experiment po dobu 16 týdnů na 192 dospělých křížencích kanců ([Landrace x Yourkshire] x Duroc) rozdělených do dvou skupin. První skupina zvířat sloužila jako kontrolní bez přídavku selenu a druhé experimentální skupině byl dodáván do krmné dávky selen v množství 0,5 mg/kg KS v organické formě (kvasnice obohacené selenem). Tito autoři zaznamenali nárůst v objemu ejakulátu o 25,7 % (P < 0,05), koncentraci spermií o 14,7 %, motilitě o 31,3 % (P < 0,01) v porovnání s kontrolní skupinou kanců. O tři roky později provedli rovněž MARIN-GUZMAN a kol. (2000) podobný experiment, kdy porovnávali skupinu s doplňkem 0,5 mg Se/kg KS (v organické formě) s kontrolní skupinou kanců bez přídavku selenu. Selen byl zkrmován již od 28. dne věku zvířat. Jejich cílem bylo zjistit, jak se projeví tento krmný zásah na spermatogenezi v jednotlivých úsecích života kanců. V průběhu pokusného sledováni byli kanci usmrcováni a jejich reprodukční orgány podrobeny patřičným analýzám. U kanců s přídavkem selenu do diety se průkazně zvýšila v 9. měsíci (P < 0,05) a 18. měsíci (P < 0,01) koncentrace spermií. V 5. a 6. měsíci života kanců nebyl průkazný rozdíl mezi skupinami. Také KOLODZIEJ a kol. (2005) rovněž došli k závěrům, že přídavek 0,5 mg Se/kg KS (v organické formě) průkazně zvýšil celkový počet vyprodukovaných spermií o 29,7 % (P < 0,05) a snížil procento patologických spermií o 46,7 % (P < 0,05) v porovnání s kontrolní skupinou, která měla v krmné dávce obsažen selen pouze z nativních zdrojů (0,2 mg/kg KS). GROENEWEGEN a kol. (2006) po přídavku organicky vázaného selenu v dávce 0,5 mg/kg KS zjistili zvýšení koncentrace spermií o 11,1 % ve spojitosti s vyšší produkcí inseminačních dávek (o 9,7 %). V motilitě a objemu ejakulátu tento kolektiv autorů nenalezl průkazných rozdílů. Jelikož v našem sledování nebyla zařazena skupina kanců bez přídavku selenu a během experimentu byla zvířata vystavena teplotnímu stresu, nebyly rozdíly v motilitě a koncentraci spermií tak výrazné. Obdobný experiment jako v našem případě prováděli LÓPEZ a kol. (2010). Skupině kanců A přidávali do krmné dávky 0,4 mg Se/kg KS (anorganická forma). Skupina kanců B byla doplňována selenem v dávce 0,4 mg Se/kg KS (organická forma). Skupina zvířat B měla průkazně vyšší koncentraci spermií (P < 0,05) v porovnání se skupinou A. Nám se tento výsledek nepodařilo potvrdit, u obou skupin zvířat 55
s přídavkem organické formy selenu jsme nepozorovali žádné zvýšení koncentrace spermií. Při hodnocení pohyblivosti spermií tento kolektiv autorů zjistil nižší motilitu spermií o kanců skupiny B, avšak bez statistické průkaznosti. Z našeho sledování, nejsou tyto závěry zcela zřejmé, u skupiny kanců Se1 jsme pozorovali zvýšení motility spermií o 2,0 % naopak kanci skupiny Se3 měli nižší motilitu o 5,2 % bez statistické průkaznosti. JACYNO a kol. (2005) třem skupinám kanců přidávali selen v dávkách 0,2 mg/kg KS v anorganické formě (I. skupina) dále 0,2 a 0,4 mg Se/kg KS v organické formě (II. a III. skupina). Při hodnocení objemu ejakulátu pozorovali nárůst (P < 0,01) u obou skupin s přídavkem organické formy selenu. V našem experimentu rovněž došlo ke zvýšení objemu ejakulátu (P < 0,01), ovšem u skupiny kanců přijímajících selen v anorganické formě (0,6 mg/kg KS). Dále tento kolektiv autorů
nezaznamenal
rozdíly
v motilitě
spermií,
jejich
zjištěné
hodnoty
mezi
experimentálními skupinami (72,1 – 73,3 %) se přibližují i našim výsledkům, kdy motilita mezi skupinami byla v rozmezí 68,6 – 73,7 %. Dále jejich výsledky naznačují zvýšení koncentrace spermií a snížení procenta patologických spermií u II. (P < 0,01) a III. (P < 0,05) skupiny kanců v porovnání s I. skupinou. Rovněž i FERNANDEZ a kol. (2008) po 13 týdenním experimentálním sledování došli k závěru, že přídavek organického selenu v dávce 0,5 mg/kg KS průkazně zvýšil motilitu a koncentraci spermií v porovnání se skupinou kanců, která přijímala pouze 0,025 mg Se/kg KS z nativních zdrojů. Po ukončení jejich experimentu byli z každé skupiny dva kanci vykastrováni a jejich varlata podrobeny mikroskopické analýze. Skupina zvířat s doplňkem selenu do diety měla vyvinutější semenné kanálky než skupina kanců bez doplňku selenu. SPEIGHT a kol. (2012) přidávali do diety kanců normovanou dávku (0,3 mg/kg KS) v organické a anorganické formě. Koncentrace spermií a celkový počet vyprodukovaných spermií byli průkazně vyšší (P < 0,05) o 32,2 % resp. o 26,3 % u skupiny s příjmem organické formy selenu. Objem ejakulátu ani motilita spermií nabyla u žádné z experimentálních skupin kanců signifikantně změněna. Podobný experiment prováděli na 10 kancích rozdělených do 2 pokusných skupin i THONGCHALAM, RUKKWAMSUK a CHOMCHAI (2012), do základní krmné dávky (s obsahem 0,15 mg Se/kg KS) přidávali první skupině zvířat 0,3 mg Se/kg KS v organické formě. Druhé skupině kanců doplňovali 0,3 mg Se/kg KS pomocí anorganického zdroje. Po 84 dnech trvání experimentu nenalezli mezi oběma skupinami kanců žádné průkazné rozdíly v ukazatelích kvality ejakulátu (motilita, koncentrace a přežitelnost spermií). V našem sledování jsme ovšem u skupiny s přídavkem selenu v dávce 0,3 mg/kg KS (v anorganické formě) pozorovali průkazně nižší množství vyprodukovaných spermií s porovnání s kanci kteří přijímali stejnou dávku v organické formě. SEGERSON, GETZ a JOHANSON (1981) po injekční aplikaci 56
(0,33 mg Se/kg živé hmotnosti v 14-ti denních intervalech) seleničitanu sodného nepozorovali u plemenných kanců žádné rozdíly v objemu ejakulátu, koncentraci a motilitě spermií v porovnání s kontrolní skupinou kanců, bez doplňku selenu. K prakticky totožným závěrům došli i BARTLE, SENGER a HILLERS (1980), kteří rovněž po injekční aplikaci selenu u býků nepozorovali průkazné změny laboratorních hodnot ejakulátu. ECHEVERRÍA-ALONZO a kol. (2009) porovnávali vliv selenu na omezení dopadů teplotního stresu u kanců, přičemž zjistili, že v letním období poklesl objem ejakulátu (P < 0,05) u skupiny s přídavkem 0,5 mg Se/kg KS, ovšem zvýšila se koncentrace a motilita spermií (bez statistické průkaznosti), v porovnání se skupinou bez přídavku selenu. Tento kolektiv autorů pracoval se skupinou kanců bez přídavku selenu, z tohoto důvodu pozorovali zvýšení jak koncentrace spermií, tak i motility. JACYNO a KAWECKA (2002) sledovali, jak se projeví přídavek 0,2 mg Se/kg v anorganické formě (kontrolní skupina) a organické formě (experimentální skupina) k základní dietě kanců v letních (červen - září) a zimních měsících (leden - duben). S těmito autory se zcela neshodujeme v závěrech, že objem ejakulátu a celkový počet vyprodukovaných spermií se průkazně nelišil u žádné ze skupin. V našem sledování u skupiny zvířat Se4 byl průkazně vyšší objem ejakulátu (P < 0,01) v páté periodě. V případě koncentrace spermií v letním období zaznamenali tito autoři u kontrolní skupiny nižší hodnotu o 12,1 % v porovnání s experimentálními zvířaty. V zimních měsících byla již koncentrace u kanců experimentální skupiny průkazně vyšší o 26,1 % (P < 0,05). V letních měsících se procento patologických spermií významně nelišilo, v zimním období byla tato hodnota průkazně vyšší (P < 0,01) u kontrolní skupiny kanců. Náš experiment spadal rovněž do teplých letních měsíců, proto se námi naměřené výsledky koncentrace spermií shodují s výsledky těchto autorů, kteří svoje experimentální sledování prováděli v období červen – září. Z našich výsledků je zřejmé, že již průměrná denní teplota 22 oC působí negativně na kvalitu vyprodukovaného kančího ejakulátu. Otázkou zmírnění teplotního stresu pomocí selenu se zabýval i EBEIT (2009), vystavoval samce krůt teplotnímu stresu (33 - 36 oC). Zjistil, že se vzrůstající dávkou organického selenu v dietě, lze eliminovat jisté dopady teplotního stresu. Skupiny krůt, které přijímali ve své dietě selen v organické formě, měly obdobně jako v našem sledování vyšší koncentraci spermií v porovnání se skupinou zvířat s nižším, nebo nulovým přídavkem selenu do diety. Dále tento autor tvrdí, že organická forma selenu ve vyšších dávkách zlepšuje i motilitu spermií, tato skutečnost se nám nepodařila potvrdit. MÁCHAL a kol. (2007) sledovali vývoj kvalitativních a kvantitativních hodnot ejakulátu kanců v období od února do června. První tři měsíce hodnocení nebyly průkazné žádné změny v hodnotách ejakulátu. V posledním měsíci (červen), při zvýšených teplotách 57
(obdobně jako v našem sledování) pozorovali pokles koncentrace spermií. Motilita spermií a objem ejakulátu nebyly ovlivněny. SMITAL (2008) hodnotil kvalitativní a kvantitativní ukazatele ejakulátu u 2712 kanců v různých ročních obdobích. Došel k závěru, že v letním období prudce klesá kvalita produkovaného semene, naopak v podzimních a zimních měsících jsou laboratorní hodnoty ejakulátu (procento abnormálních spermií, koncentrace, motilita a přežitelnost spermií) příznivé. WATTERMANN a BAZER (1985) tvrdí, že zvýšená teplota snižuje kvalitu ejakulátu a inhibuje biosyntézu androgenů a spermatid již na počátku vývoje. WATTERMANN, WELLS a JOHNSON (1972) a WATTERMANN a kol. (1976) vystavovali kance teplotě 31 oC 24 hodin denně po dobu 11-ti týdnů. Kanci vystaveni teplotnímu stresu měli nižší motilitu a koncentraci spermií (P < 0,01) v porovnání s kontrolní skupinou kanců, na které působila teplota po celý den 20 oC. Objem ejakulátu zůstal nezměněn. WATTERMANN a DESJARDINS (1979) podrobovali kance stejnému teplotnímu stresu, jako předchozí autoři. Zkoumali, jak vysoká teplota ovlivňuje tvorbu pohlavních hormonů. Z jejich výsledků vyplývá, že teplotní stres u kanců snižuje hladinu testosteronu a luteinizačního hormonu (P < 0,05) a o více než 50 % koncentraci spermií. Badatelé NAKAYAMA, HIDAKA a ASHIZAVA (1991), zjistili u kanců vystavených teplotám mezi 30 – 35 oC sníženou produkci testosteronu o 35 %. Zároveň byl pozorován průkazný nárůst abnormálních spermií v porovnání s obdobím před začátkem pokusného sledování. KUNAVONGRIT a kol. (2005) ve své studii přičítají nízké kvalitě ejakulátu v letních měsících mimo jiné i snížený příjem krmiva. Námi naměřené výsledky ukazují, že již krátkodobé výkyvy teploty (okolo 30
o
C) dokáží průkazně snížit celkový počet
vyprodukovaných spermií u skupiny kanců, kteří přijímali anorganickou formu selenu v dávce 0,3 mg/kg KS. Naše hypotéza se potvrdila pouze z části, předpokládali jsme, že organický zdroj selenu ve vyšší dávce bude mít vliv na vyšší kvalitu vyprodukovaného ejakulátu (v období tepelného stresu), dospěli jsme ovšem k závěru, že u skupin kanců, kterým byl dávkován selen v dávce 0,6 mg/kg KS v organické i anorganické formě se neprojevily negativní dopady tepelného stresu. Celkový počet vyprodukovaných spermií, který má zásadní vliv na produkci inseminačních dávek byl po celou dobu bez významných diferencí. Z výsledků, které publikovali HAWKES a TUREK (2001) je patrné, že dospěli k poněkud odlišným výsledkům v hodnocení motility spermií u mužů po přídavku selenu, v porovnání s našimi výsledky. Motilita se u mužů s doplňkem selenu v jejich sledování snížila o 32 % a koncentrace o 78%. Kontrolní skupina bez přídavku selenu zaznamenala pokles motility a koncentrace spermií o 17 % resp. o 32 %. Objem ejakulátu byl u obou skupin podobný. 58
Zároveň ovšem tito autoři dodávají, že výsledné hodnoty mohly být ovlivněny celou řadou vnějších vlivů, které se nedají v lidské populaci zcela eliminovat. Později HAWKES, ALKAN a WONG (2009) provedli tento experiment ještě v jednom opakování s vyšší dávkou selenu 0,3 mg/den (organická forma). Pozorovali sice vyšší koncentraci selenu v seminální a krevní plazmě, ale ukazatele kvality spermatu (motilita, koncentrace spermií a objem ejakulátu) zůstali beze změn. SHI a kol. (2009) a (2010) provedli dva obdobné experimenty na plemenných kozlech. Hodnotili objemu ejakulátu, koncentraci, motilitu a přežitelnost spermií. Zjistili, že všechny tyto kvalitativní a kvantitativní hodnoty ejakulátu lineárně rostly (P < 0,001) v závislosti na koncentraci selenu (organická forma) v krmné dávce. V našem experimentálním sledování jsme pozorovali lepší parametry kvality ejakulátu u skupin s příjmem anorganicky i organicky vázaného selenu. Dávka selenu ovšem byla nad hranici, kterou udává norma pro plemenné kance pro tento prvek. Zároveň nebyl pozorován, žádný lineární růst ukazatelů kvality ejakulátu, jak tomu udávají SHI a kol. (2009) a (2010).
6.2.1 Druhá část experimentu č. 2 – selen Vliv organické a anorganické formy selenu na antioxidační status ejakulátu plemenných kanců
MARIN-GUZMAN a kol. (1997) přidávali do diety pokusné skupiny kanců 0,5 mg Se/kg KS v organické formě. Kontrolní skupině zvířat nebyl selen v krmné dávce navýšen. Tento kolektiv autorů dospěl k obdobným výsledkům jako v našem experimentálním sledování. V případě kanců pokusné skupiny aktivita GSH-Px v ejakulátu vzrostla o 114,0 % (P < 0,01), u seminální plazmy o 306,5 % (P < 0,01) a spermie vykázaly o 68,7 % vyšší aktivitu v porovnání s kontrolní skupinu kanců. Obdobný trend zaznamenali tito autoři i u koncentrace selenu. V celkovém ejakulátu byla koncentrace selenu u pokusného souboru zvířat více než čtyřikrát vyšší (P < 0,01). Při hodnocení seminální plazmy a spermií naměřili více než dvakrát větší koncentraci selenu (P < 0,01) než u kanců bez přídavku tohoto prvku v dietě. Dle výsledků těchto autorů se množství GSH-Px u kanců v seminální plazmě zvyšuje s věkem zvířat. V našem sledování jsme dospěli k obdobným výsledkům, jako tito autoři. Jelikož v rámci našeho experimentu chyběla skupina bez přídavku selenu, nebyl nárůst GSH-Px tak výrazný ve srovnání s předchozími autory. Nejvyšší aktivita GSH-Px a koncentraci selenu byla zjištěna u kanců, kterým byl doplněn selen v organické formě v dávce 0,6 mg/ kg KS.
59
V experimentu, ve kterém byl sledován přídavek selenu v organické formě u 40 mladých kanců syntetické linie 990 po dobu 110 dnů dospěli KOLODZIEJ a kol. (2005) k poněkud rozdílným výsledkům. Aktivita GSH-Px v semenné plazmě se zvýšila (P < 0,05) u kontrolní skupiny kanců, která přijímala 0,2 mg Se/kg KS v porovnání se skupinou pokusnou jejíž příjem selenu činil 0,5 mg kg/KS. Celkový nárůst aktivity GSH-Px u kontrolní skupiny byl 24,3 %. Koncentrace selenu v semenné plazmě byla vyšší o 18,6 % u skupiny zvířat, která přijímala 0,5 mg Se/kg KS. Kontrolní ani pokusná skupina nevykázala signifikantního rozdílu v aktivitě GSH-Px ani v koncentraci selenu v krevní plazmě. Obdobné experimentální sledování prováděli i FERNANDEZ a kol. (2008), kteří do krmné dávky tří skupin kanců, přidávali 0; 0,3 a 0,5 mg Se/kg KS v organické formě. Při hodnocení aktivity GSH-Px nalezli lineární růst v závislosti na množství selenu dodávaného do krmné dávky. Při hodnocení výskytu volných radikálů metodou MDA nenalezli mezi skupinami průkazného rozdílu. EBEIT (2009) tvrdí, že přídavek organického selenu do krmené dávky kohoutů v dávce 0,3 mg kg/KS zredukoval počet volných radikálů a snížil peroxidaci lipidů. Tento autor přičítá snížení oxidačního stresu více než dvojnásobné aktivitě GSH-Px u skupiny s doplňkem 0,3 mg Se/kg KS v porovnání se skupinou zvířat bez doplňku tohoto stopového prvku. NAVARO a kol. (1998) ve svém pokusném sledování zjistili, že společný deficit selenu a vitamínu E v krmné dávce laboratorních potkanů měl za následek průkazné zvýšení produkce volných radikálů a s tím spojenou vyšší peroxidaci lipidů v krevní plazmě, ledvinách a játrech. V našem sledování se podařilo prokázat nejvyšší nárůst volných radikálů (P < 0,01) u skupiny, které byl podán selen v anorganické formě v dávce 0,3 mg/kg KS. Naopak k poklesu výskytu reaktivních forem kyslíku došlo u skupiny kanců doplňovaných organickou formou selenu v dávce 0,6 mg/kg KS. JELEZARSKY a kol. (2008) zjistili při měření aktivity GSH-Px v ejakulátu kanců, že nejvyšší hladina tohoto enzymu se nachází v seminární plazmě, je více než třikrát vyšší v porovnání se spermatozoii. Toto zjištění potvrzují i LASOTA a kol. (2004), kteří ovšem zjistili přibližně jeden a půlkrát vyšší aktivitu GSH-Px v seminální plazmě než ve spermatozoiích. SVOBODA a kol. (2010) porovnávali tři různé zdroje selenu u rostoucích prasat (bakterie obohacená selenem E. faecium, kvasnice obohacené selenem a seleničitan sodný) v dávce 0,3 mg/kg KS. Koncentrace selenu ve svalovině prasat, která byla krmena selenem obohacenou baktérií E. feacium, byla srovnatelná se seleničitanem sodným, ale byla nižší (P < 0,05) ve srovnání se selenem obohacenými kvasnicemi. Koncentrace selenu a aktivita GSH-Px v krevním séru jednotlivých skupin prasat byly obdobné. V několika experimentech, které prováděl MAHAN a kol. (1977, 1996, 2000, 2004) zjistil, že přídavek selenu v organické formě (kvasnice obohacené selenem) průkazně zvýšil obsah tohoto prvku v tkáních, krevní plazmě a mléku 60
vykrmovaných prasat a prasnic v porovnání s anorganickým zdrojem selenu (seleničitan sodný). Ke zcela opačným závěrům došli THONGCHALAM, RUKKWAMSUK a CHOMCHAI (2012) po přídavku 0,3 mg Se/kg/ KS v organické a anorganické formě, nezjistili žádné průkazné rozdíly mezi dvěma skupinami kanců v obsahu selenu v krvi. Obdobně i v našem sledování jsme nepozorovali u skupin s přídavkem 0,3 mg Se/kg KS v organické a anorganické formě (skupina kanců Se1 a Se2) žádné průkazné diference mezi experimentálními skupinami zvířat. Průkazné rozdíly byly naměřeny až při dávkování 0,6 mg Se/kg KS v organické formě. Podle autorů RADOMILA a kol. (2011); AWDA a kol. (2009); ROCA a kol. (2005); SANOCA a KURPISZ (2004) vede zvýšená tvorba free radicals (FR) k poškození spermatozoí a celkovému snížení produkce spermií. V experimentu, který provedli AGARWAL a kol. (2012) pozoroval u kanců vystavených teplotnímu stresu (nad 25 oC) vyšší tvorbu FR (zejména hydroxylového radikálu). V našem experimentálním sledování rovněž skupina kanců Se2 s nejvyšší produkcí FR měla signifikantně nižší (P < 0,001) počet vyprodukovaných spermií. Mezi autory, kteří studovali aktivitu GSH-Px v ejakulátu jiných hospodářských zvířat patřili SHI a kol. (2009). Došli k závěru, že kozlům, kterým byl podáván selen v dávce 0,3 mg/kg KS v organické formě vzrostla aktivita GSH-Px (P < 0,05) v porovnání s kontrolní skupinou, která přijímala ve své dietě pouze 0,06 mg Se/kg KS. Stejně tak i WANG a kol. (2011) porovnávali různé formy selenu, hodnotili parametry v krevním séru kuřat. Zjistili, že došlo ke zvýšení GSH-Px (P < 0,05) a koncentrace selenu (P < 0,05) u skupiny dotované organickou i anorganickou formou selenu v porovnání se skupinou, které nebyl do krmné dávky selen přidáván. BARTLE a kol. (1980) aplikovali plemenným býkům injekčně různé dávky selenu (jako seleničitan sodný). U skupiny, které byl podáván intramuskulárně seleničitan sodný došlo ke zvýšení aktivity GSH-Px (P < 0,05) stejně jako koncentrace selenu (P < 0,05) v semenné plazmě býků. Obdobný experiment prováděli i SMITH a kol. (1979), kdy tito autoři ovšem po injekční aplikaci seleničitanu sodného nenalezli průkazných změn v koncentraci GSH-Px v ejakulátu býků. SLAVÍK a kol., (2008) srovnávali koncentrace selenu v krevní plazmě jalovic před a po šesti měsíční aplikaci doplňku tohoto stopového prvku v různých formách. Tito autoři zjistili, že skupina zvířat s přídavkem organické formy – kvasničný selen (P < 0,01) i anorganické formy – seleničitan sodný (P < 0,05) navýšila hladinu tohoto mikroprvku v krevní plazmě. U skupiny zvířat bez přídavku selenu nebyl na konci experimentu prokázán signifikantní rozdíl v jeho obsahu v krevní plazmě.
61
7 ZÁVĚR V našich experimentech byl zkoumán vliv různých hladin a forem minerálních látek (chróm, selen) na laboratorní hodnoty ejakulátu plemenných kanců, dále jsme sledovali ovlivnění antioxidačního statusu semene, hladiny glukózy a inzulínu v krvi kanců. V prvním experimentu byl na čtyřech skupinách kanců testován vliv přídavku různých hladin organického chrómu (picolinát), na kvalitu ejakulátu plemenných kanců, dále byla sledována koncentrace glůkózy a inzulínu v krvi těchto zvířat. Z dosažených výsledků je patrné, že přídavek chrómu (picolinát) neměl v našem sledování pozitivní vliv na kvalitu ejakulátu kanců. Při doplnění chrómu v dávce 181,8 µg Cr/kg KS, jsme zjistili průkazný pokles (P < 0,01) celkového počtu vyprodukovaných spermií na jeden odběr. Součástí prvního pokusu bylo i hodnocení hladiny glukózy a inzulínu v krvi plemenných zvířat. V této části pokusného sledování se potvrdila naše hypotéza, že zvířata s doplňkem chrómu budou mít nižší hladinu glukózy. Průměrná hodnota glukózy u zvířat s doplňkem 181,8 µg Cr/kg KS byla statisticky průkazně nižší (P < 0,01) než-li u kanců, kterým nebyl chróm pikolinát do krmné dávky doplněn (kontrolní skupina). Vlivem doplňku 181,8 µg Cr/kg KS a 60,6 µg Cr/kg KS byla nalezena průkazně nižší hladina glukózy (P < 0,01). V zjištěných hodnotách inzulínu nebyl zjištěn signifikantní rozdíl mezi experimentálními skupinami kanců. Ve druhém faktorovém krmném pokusu byly čtyřem skupinám kanců zkrmovány dvě hladiny (0,3 a 0,6 mg/kg KS) a formy (anorganická a organická) selenu. Sledována byla kvalita a antioxidační status (tvorba volných radikálů a aktivita glutathion peroxidázy) vyprodukovaného ejakulátu. Kanci, kteří přijímali selen v anorganické formě v dávce 0,3 mg/kg KS měli signifikantně sníženou produkci spermií (P < 0,01). Vyšší příjem selenu nevedl k předpokládanému zvýšení motility spermií. Během trvání druhého experimentu s doplňkem selenu byla provedena analýza kančího ejakulátu na antioxidační status. Na začátku experimentu jsme očekávali, že přídavek organicky vázaného selenu ve vyšší dávce zvýší antioxidační status a koncentraci selenu v ejakulátu. Skupina kanců s přídavkem selenu v dávce 0,6 mg/kg KS (v organické formě) měla průkazně vyšší obsah selenu v ejakulátu (P < 0,05) ve druhém a čtvrtém odběru. U této skupiny zvířat jsme zaznamenali signifikantně vyšší (P < 0,001) koncentrace GSH-Px na konci pokusného sledování. Skupina zvířat, které byl během experimentu navýšen selen v anorganické formě o 0,3 mg kg/KS měla ve třetím (P < 0,05) a čtvrtém (P < 0,01) odběru průkazně vyšší množství volných radikálů. Zároveň u této skupiny kanců došlo k poklesu
62
celkového počtu vyprodukovaných spermií (P < 0,001). Prokázali jsme vzájemný vztah, mezi množstvím vytvořených volných radikálů a celkovým počtem vyprodukovaných spermií na jeden odběr.
63
8 LITERATURA: ADEBUKOLA, C. A.: Selenium provides protection to the liver but not the reproductive organs in an atrazine-model of experimental toxicity. Experimental and Toxicologic Pathology. 2011, č. 3, s. 201-207. ISSN: 0940-2993 AGARWAL, S.: Effect of ZnS Nanofiller and Temperature on Mechanical Properties of Poly(methyl methacrylate). Journal of Applied Polymer Science. 2012, č. 4, s. 2431-2438. ISSN: 0021-8995 ALTHOUSE, B.; WILSON, M. E.; GALL, T.; MOSER, R. L.: Effects of supplemental dietary zinc on boar sperm production and testis size. In 14th International Congress on Animal Reproduction. Stockholm, Sweden: [s.n.], 2000. s. 264. ALTHOUSE, G. C.: Swine Veterinary Groups [online]. 1997 [cit. 2011-01-16]. Optimizing Productivity
of
the
a
Boar.
Dostupné
z
WWW:
.
AMOIKON, E. K.: Effect of chromium tripicolinate on growth, glucose-tolerance, insulin sensitivity, plasma metabolites, and growth-hormone in pigs. Journal of Animal Science. 1995, 73: 1123–1130. ISSN: 0021-8812
ANDERSON, R. A.: Nutritional factors influencing the glucose/insulin system: Chromium. Journal of American College Nutrition. 1997, 16: 404–410. ISSN: 0731-5724
ANDERSON, R. A.: Chromium, glucose intolerance and diabetes. Journal of American College Nutrition. 1998, 17: 548–555. ISSN: 0731-5724
ANDERSON, R. A., POLANSKY, M. M.: Dietary chromium deficiency. Effect on sperm count and fertility in rats. Biological Trace Element Research. 1981, 3: 1-5. ISSN: 01634984. AUDET, I.: Effects of dietary vitamin supplementation and semen collection frequency on reproductive performance and semen quality in boars. Journal of Animal Science. 2009, 87: 1960–1970. ISSN: 0021-8812
64
AWDA, B. J., MACKENZIE-BELL, M. a BUHR, M.: Reactive Oxygen Species and Boar Sperm Function. Biology of Reproduction. 2009, roč. 81, č. 3, s. 553-561. ISSN: 0006-3363 BALK, E. M.; TATSIONI, A.; LICHTENSTEJN, A. H.; LAU, J.; PITTAS, A. G.: Effect of Chromium Supplementation on Glucose Metabolism and Lipids. Diabetes Care. 2007, 30: 2154–2163. ISSN: 0149-5992 BARTLE, J. L.; SENGER, P. L.; HILLERS, J. K.: Influence of Injected Selenium in Dairy Bulls on Blood and Semen Selenium, Glutathione Peroxidase and Seminal Quality. Biology of Reproduction. 1980, 23, s. 1007-1013. ISSN: 0006-3363 BEDWAL, R. S.; BAHUGUNA, A.: Zinc, copper and selenium in reproduction. Cellular and Molecular Life Sciences. 1994, 7, s. 626-640. ISSN: 1420-682X BEHNE, D. a KIRIAKOPOULOS, A.: Mammalian selenium-containing proteins. Annual Review of Nutrition. 2001, č. 21, s. 453-473. ISSN: 0199-9885
BLAIR, R.: Nutrition amd Feeding of Organic pigs. London: Cromwell Press, 2007. 318 s. ISBN: 978-1-84593-191-9. BOMZON, A. a LJUBUNCIC, P.: Oxidative stress and vascular smooth muscle cell function in liver disease. Pharmacoligy and Therapeutics. 2001(89), s. 295-308. ISSN: 0163-7258 CEFALU, W. T.; HU, F. B.: Role of Chromium in Human Health and in Diabetes. Diabetes care. 2004, 27: 2741–2751. ISSN: 0149-5992
CLOSE, W. H.: Trace minerals in pig nutrition : The big three issues from weaning to slaughte: production, health and environment. PIG PROGRESS. 2008, 9, s. 22-24. ISSN: 0169-4405 CLOSE, W. H.; COLE, D. J. A.: Nutrition of Sows and Boars. Vyd. 1. Nottingham : Nottingham University Press, 2003. 377 s. ISBN: 978-1-897676-530 CLOSE, W. H. SURAY, P .F.; TAILOR-PICKARD, J. A.: Current advances in selenium research and application. 1. Netherlands : Wageningen Academic Publishers, 2008. s. 263313. ISBN: 978-90-8686-073-9
65
CREECH, B. L., SPEARS, J. W.; FLOWERS, W. L.; HILL, G. M.; LIOYD, K. E.; ARMSTRONG, T. A.; ENGLE, T. E.: Effect of dietary trace mineral concentration and source (inorganic vs. chelated) on performance, mineral status, and fecal mineral excretion in pigs from weaning through finishing. Journal of Animal Science. 2004, 82, 2140-2147. ISSN: 0021-8812 DAUN, C.; JOHANSON, M; ONNING, M.; AKESSON, B.: Glutathione peroxidase activity, tissues and soluble selenium content in beef and pork in relation to meat geain and pig RN genotype. Food Chemistry. 2001, č. 73, s. 313-319. ISSN: 0308-8146 DESHMUKH, N. S.; BAGCHI, M.; LAU, F. C.; BAGCHI, G.: Safety of a novel oxygencoordinated niacin-bound chromiumnext term (III) complex (NBC): I. Two-generation previous termreproductionnext term toxicity study. Journal of Inorganic Biochemistry. 2009, 103: 1748–1754. ISSN: 0162-0134 EBEIT, T. A.: Organic selenium enhances the antioxidative status and quality of cockerel semen under high ambient temperature. British Poultry Science. 2009, 50, s. 641-647. ISSN 00071668. ECHEVERRÍA-ALONZO, A.; SANTOS-RICALDE, R.; CENTURIÓN-CASTRO, F.; AKELÓPEZ, R.; ALFARO-GEMBOA, M.; RODRIGUEZ-BUENFIL, J.: Effects of dietary selenium and vitamin e on semen quality and sperm morphology of young boars during warm and fresh season. Journal of Animal and Veterinary Advances. 2009, 8, s. 2311-2317. ISSN: 16805593 EVANS, G. W., BOWMAN, T. D.: Chromium Picolinate Increases Membrane Fluidity and Rate of Insulin Internalization. Journal of Inorganic Biochemistry. 1992, 46: 243–250. ISSN: 0162-0134 EVOC-CLOVERE, CH.; POLANSKY, M. M.; ANDERSON, R. A.; STEELE, N. C.: Dietary Chromium Supplementation with or without Somatotropin Treatment Alters Serum Hormones and Metabolites in Growing Pigs without Affecting Growth Performance. The Journal of Nutrition. 1993, 123: 1504–1512. ISSN: 0022-3166
66
FANG, Y; YANG, Z.; WU, G.: Free Radicals, Antioxidants, and Nutrition. Nutrition. 2002, 18, s. 872– 879. ISSN: 0899-9007 FERNANDEZ, L. D. a kol.: The effect of selenium suplement in diet of boars on semen quality, antioxidant enzymatic activity and lipid peroxidation. Theriogenology. 2008, 50, s. 1386. ISSN: 0093-691X FOOTE, R. H.: Factors Influencing the Quantity and Quality of Semen Harvested From Bulls, Rams, Boars and Stalions, Journal of Animal Science. 1978, 47: 1–11. ISSN: 0021-8812
FRYDRYCH, Z.: Organické zdroje mikroprvků a jejich vlastnosti (komplexy, cheláty). Krmivářství. 2007, 11, 5, s. 10-13. ISSN 1212-9992.
GALL, T. J.; ROSEBOOM, K. J.; MOSER, R. A.; ORR, D. E.; PURSER, P. R.: Effect of feeding chromium tripicolinate as a top dress to boars upon sperm production. Journal of Dairy Science. 2003, 85: 161–163. ISSN: 0022-0302
GROENEWEGEN, P. P.; HARRISON, G. A.; BEUSEKON, A.; ROSENDAL, B. A.: Impact of Bioplex® and Sel-Plex® supplementation on semen production in Canadian boars. In: Biotechnology in the Feed and Food Industry, Proceedings of Alltech’s 22nd Annual Symposium (Suppl. 1), Abstracts of posters presented. 2006, Lexington, KY, USA, Apríl, s. 23-26 GUERTIN, J.; JACOBS, J. A.; AVAKIAN, C. P.: Chromium (VI) Handbook. United States of America (New York) : CRS, 2005. 761 s. ISBN: 1-56670-608-4 HAWKES, W.C.; ALKAN, Z.; WONK, K.: Selenium supplementation does not affect testicular selenium status or semen quality in North American men. Journal of Andrology. 2009, 30, s. 525-533. ISSN: 01963635 HAWKES, W. CH.; TUREK, P. J.: Effects of dietary selenium on sperm motility in healthy men. Journal of Andrology. 2001(22), 764–772. ISSN: 0196-3635
67
HENDING, B.N.; KOLETTIS, P. N.; SHARMA, R. K.; THOMAS, J. A.; AGARWAL, A.: Varicocele is associated with elevated spermatozoal reactive oxygen species production and deminished seminal plazma antioxidant capacity. Journal of Urology. 1999, 161, s. 18311834. ISSN: 0022-5347 HORKÝ, P.; JANČÍKOVÁ, P. a ZEMAN, L.: The effect of a supplement of chromium (picolinate) on the level of blood glucose, insulin activity and changes in laboratory evaluation of the ejaculate of breeding boars. Acta Universitatis Agriculturae et Silviculturae Mendelianae Brunensis. 2012, č. 1, s. 49-56. ISSN 1211-8516. CHEN, T. L.; LaCARTE, C.; WISE, S.; HOLMES, A.; MARTINO, J.; WISE, J. P.; THOMPSON, W. D.; WISE, J. P.: Comparative cytotoxicity and genotoxicity of particulate and soluble hexavalent chromium in human and sperm whale (Physeter macrocephalus) skin cells. Comperative Biochemistry and Physiology C-toxicology. 2012, č. 1, s. 143-150. ISSN: 1532-0456 CHAIR, J. R.; HU, F. B.; CARE, D.; JOLLY, P. L.: The Role of Chroumium in Animal Nutrition. Washington, D.C. : National Academy of Sciences., 1997. 79 s. ISBN: 0-30906354-X JACYNO, E.; KAWECKA, M.; KOLODZIEJ, A.; KAWECKA, M.; KAMYCZEK, M.; PIETRUSZKA, A.; ELZANOVSKI, C.: Influence of inorganic selenium + vitamin E and organic Se on reproductive performance of young boars. Agricultural and Food Science in Finland. 2002(11), 175-184. ISSN: 1239-0992 JACYNO, E; KOLODZIEJ, A.; KAWECKA, M.; KAMYCZEK, M.; PIETRUSZKA, A.; ELZANOVSKI, C.: Reproductive performance of young boars receiving during their rearing inorganic or organic sellenium + vitamin E in diets. Journal of Polish Agricultural Universities. 2005 (8). ISSN: 1505-0297
JÁNSKÝ, L.; NOVOTNÝ, I.: Fyziologie živočichů a člověka. Praha : Avicentrum, 1981. 383 s. ISBN: 08-085-80
68
JEEJEEBHOY, K. N.; CHU, R. C.; MARLISS, E. B.; GREENBERG, G. R.; ROBERTSON, A. B.: Chromium deficiency, glucose intolerance, and neuropathy reversed by chromium supplementation, in a patient receiving long-term total parenteral nutrition14. The American Journal of Clinical Nutrition. 1977, 30: 531–538. ISSN: 0002-9165 JELEZARSKY , L.; VAISBERG, CH; CHAUSHEV, T.; SAPUNDJIEV, E.: Localization and characterization of glutathione peroxidase (GPx) in boar accessory sex glands, seminal plasma, and spermatozoa and activity of GPx in boar semen. Theriogenology. 2008, 69, s. 139-145. ISSN: 0093-691X JELÍNEK, P.; KOUDELA, K.: Fyziologie hospodářských zvířat. Vyd. 1. Brno: Mendelova lesnická a lesnická univerzita v Brně, 2003. 414 s. ISBN: 80-7157-644-1 KAMEN, B.: Chrom je pro vás důležitý. Praha: Pragma, 2000. 170 s. ISBN: 80-7205-697-2 KAUSHIK, R. D.; SINGH, R. P.; SHASHI L.: Kinetic-mechanistic stud of periodate oxidation of p-chloroaniline. Asian Journal of Chemistry, 2003. 15, s. 1485-1490. ISSN: 0970-7077
KIM, Y. Y.; MAHAN, D. C.: Biological aspects of selenium in farm animals. Asianaustralasian Journal of Animal Sciences. 2003, 16, s. 435-444. ISSN: 0021-8812
KIM, Y. Y.; MAHAN, D. C.: Prolonged feeding of high dietary levels of organic and inorganic selenium to gilts from 25 kg body weight through one parity. Journal of Animal Science. 2001, 79, s. 956-966. ISSN: 0021-8812 KIM, B. G.; LINDEMANN, M. D. a CROMWELL, G. L.: Effects of Dietary Chromium (III) Picolinate on Growth Performance, Respiratory Rate, Plasma Variables, and Carcass Traits of Pigs Fed High-Fat Diets. Biological Trace Element Research. 2010, č. 2, s. 181-196. ISSN: 0163-4984 KOLLER, L. D.; SOUTH, P. J; EXON, J. H.; WHITBECK, G. A.; MASS, J.: Comparison of Selenium Levels and Glutathione Peroxidase Activity in Bovine Whole Blood. Canadian Journal of Comparative Medicine. 1984, 48, s. 431-433. ISSN: 0008-4050
69
KOLODZIEJ, A.; JACYNO, E.: Effect of selenium and vitamin E supplementation on reproductive performance of young boars. Archiv Tierzucht. 2005, 48, s. 68-75. ISSN: 00039438 KOZUMPLÍK, J.; KUDLÁČ, E.: Reprodukce prasat ve velkochovech. Praha: Státní zemědělské nakladatelství, 1980. 296 s. ISBN: 07-103-80
KUDRNA, V.: Produkce krmiv a výživa skotu. Praha: Agrospoj Praha, 1998. 362 s. KUMAR, N.; VERNA, R. P.; SINGH, L. P.; VARSHNEY, V. P.; DASS, R. S.: Effect of different levels and sources of zinc supplementation on quantitative and qualitative semen attributes and serum testosterone level in crossbred cattle (Bos indicus × Bos taurus) bulls. Reproduction Nutrition Development. 2006, 46, s. 663-675. ISSN: 09265287
KUNAVONGRIT, A.; SURIYASOMBOON, A., LUNDEHEIM, N., HEARD, T. W.; EINARSSON, S.: Management and sperm production of boars under differing environmental conditions. Theriogenology. 2005, č. 2, s. 657-667. ISSN: 0093-691X
KURZA, J.; HERZIG, I.; TRÁVNÍČEK, J.; ILEK, J.; KROUPOVÁ, V.: Iodine and Selenium Contents in Skeletal Muscles of Red Deer (Cervus elaphus), Roe Deer (Capreolus capreolus) and Wild Boar (Sus scrofa) in the Czech Republic. Acta Veterinaria. 2010(79), 403-407. ISSN: 0001-7213
KVASNIČKOVÁ, A.: Minerální látky a stopové prvky : Esenciální minerální prvky ve výživě. Vyd 1. Praha : ÚZPI, 1998. 128 s. ISBN: 80-85120-94-1
LASOTA, B.; BLACZSZIK, B.; SEREMAK, B.: Selenium Status and GSH-Px Activity in Semen and Blood of Boars at Different Ages Used for Artificial Insemination. Reproduction Domestic Animals. 2004, 39, s. 309-314. ISSN: 0936-6768
LAWRENCE, R. A., PARKHILL, L. a BURK, F.: Hepatic Cytosolic Non SeleniumDependent Glutathione Peroxidase Activity: Its Nature and the Effect of Selenium Deficiency. The Journal of Nutrition. 1978, 108, s. 981-987. ISSN: 0022-3166
70
LEŠNÍK, F.: Volné radikály v etiopatogenéze chorob. Slovenský veterinársky časopis. 2003, roč. 28, č. 4, s. 39-40. ISSN: 1582-91745 LEWIS, A. J.; SOUTHERN, L. L.: Swine Nutrition. vyd. 2. USA, Florida: CRC Press LLC, 2001. 1009 s. ISBN: 0-8493-0696-5
LINDEMANN, M. D.; WOOD, C. M.; HARPER, A. F.; KORNEGAY, E. T.; ANDERSON, R. A.: Dietary chromium picolinate additions improve gain/feed and carcass characteristic in growing-finishing pigs and increase litter size in reproducing sows. Journal of Animal Science. 1995, 73: 457–465. ISSN: 0021-8812 LINDEMANN, M. D.; CROMWELL, G. L.; MONEGUE, H. J.; PURSER, K. W.: Effect of chromium source on tissue concentration of chromium in pigs. Journal of Animal Science. 2008, č. 3, s. 2971-2978. ISSN: 0021-8812 LINDEMANN, M. D.: Chromium and swine nutrition. The Journal of Trace Elements in Experimental Medicine. 1999, 12, s. 149-161. ISSN: 0896-548X LÓPEZ, A.; RIJSSELAERE, T.; VAN SOOM, A.; LEROY, J. L. M. R.; De CLERCQ, J. B. P.; BOLS, P. E. J.; MAES, D.: Effect of organic selenium in the diet on sperm quality of boars. Reproduction in Domestic Animals. 2010, 45, s. 297-305. ISSN: 09366768 LOUDA, F.: Reprodukce hospodářských zvířat. Praha: Státní pedagogické nakladatelství, 1980. 270 s. ISBN: 17-268-80
LUKASKI, H. C.: Chromium as a supplement. Annual Review of Nutrition. 1999, 19: 279– 302. ISSN: 0199-9885
McDOWELL, L. R.: Minerals in animal and human nutrition. vyd. 1. Amsterdam: Elseviere Science, 2003. 614 s. ISBN: 0444513671
MAHAN, D. C.; MOXON, A. L.; HUBBARD, M.: Efficaci of inorganic selenium supplementation to sow diets on resulting carry – over to thein progeny. Journal of Animal Science. 1977, č. 45, s. 738-746. ISSN: 0021-8812
71
MAHAN, D. C.; PARRETT, N. A.: Evaluating the efficacy of selenium-enriched yeast and sodium selenite on tissue swine selenium retention and serum glutathione peroxidase activity in grower and finisher. Journal of Animal Science. 1996, 74, s. 2967-2974. ISSN: 0021-8812
MAHAN, D. C.; CLINE, T. R.; RICHERD, B.: Effects of dietary levels of selenium-enriched yeast and sodium selenite as selenium sources fed to growing-finishing pigs on performance, tissue selenium, serum glutathione peroxidase activity, carcass characteristics, and loin quality. Journal of Animal Science. 1999, 77, s. 2172-2179. ISSN: 0021-8812
MAHAN, D. C.: Effect of organic and inorganic selenium sources and levels on sow colostrum and milk selenium content. Journal of Animal Science. 2000, č. 78, s. 100-105. ISSN: 0021-8812
MAHAN, D. C.; PETERS, J. C.: Long-term effects of dietary organic and inorganic selenium sources and levels on reproducing sows and their progeny. Journal of Animal Science. 2004, č. 82, s. 1343-1358. ISSN: 0021-8812 MÁCHAL, L.; HOŠEK, M.; RECKOVA, Z; KŘIVÁNEK, I.: Semen quality parameters and content of selected minerals in boar blood and seminal plasma. Polish Journal of Natural Science. 2007, 4, 608-619. ISSN: 1643-9953 MACHLIN, L. J., BENDICH, A.: Free radicals tissue damage: protective role or antioxidant nutrients. FASEB Journal, 1987, no. 1, s. 441–445. ISSN: 0892-6638 MARIN-GUZMAN, J.; MAHAN, D. C.; CHUNG, Y. K.; PATE, J. L.; POPE, W. F: Effects of Dietary Selenium and Vitamin E on Boar Performance and Tissue Responses, Semen Quality, and Subsequent Fertilization Rates in Mature Gilts. Journal of Animal Science. 1997, 75, s. 2994-3003. ISSN: 0021-8812 MERIN-GUZMAN, J.; MAHAN, D. C.; PATE, J. L: Effect of dietary selenium and vitamin E on spermatogenic development in boars. Journal of Animal Science. 2000, 78, s. 15371543. ISSN 00218812. ISSN: 0021-8812 MERTZ, W.: Chromium Research from a Distance: from 1959 to 1980. 1998: Journal of the American College of Nutrition, 17: 544–547. ISSN 0731-5724
72
MERTZ, W. Effects and metabolism of glucose tolerance factor. Nutrition Review, 1975, 33: 129–35. ISSN: 1550-2783
MILLER, G.; JARVIS, J.; MCBEAN, L. D.: Dairy foods and nutrition. New York : CRS Press, 2007. 407 s. ISBN: 978-0-8493-2828-2
MOORADIAN, A.D., MORLEY, J.E.: Micronutrient status in diabetes mellitus. The American Journal of Clinical Nutrition. 1987, 45: 877–895. ISSN: 0002-9165
MOUREK, J.; NEDBALOVÁ, M.; ŠMÍDOVÁ, L.; MYDLILOVÁ, A.: Mastné kyseliny omega-3: Zdraví a vývoj. 2. Praha: Triton, 2009. 185 s. ISBN: 978-80-7387-310-3 MULLAN, B.; JACQUES, K. A.; HOWER, J. M.: Defining organic mineral requirements. Nutritional Biotechnology in the Feed and Food Industries. Nottingham: Nottingham University Press, 2007. s. 81-86. ISBN: 978-1-904761-61-7 NAKAYAMA, H.; HIDAKA, R a ASHIZAWA, K.: Effect of testosterone injection on the semen quality in boars during high ambient-temperature. Animal Reproduction Science. 1991, č. 1, s. 73-82. ISSN: 0378-4320 NAVARO, F.; NAVAS, P.; BURGESS, J. R.; BELLO, R. I.; CABO, R. D.; ARROYO, A.; VILLALBA, J. M.: Vitamin E and selenium deficiency induces expression of the ubiquinonedependent antioxidant system at the plasma membrane. FASEB Journal. 1998, č. 12. ISSN: 0892-6638 NRC (National Research Council). Mineral tolerance of animals. Vyd. 1. Washington, D.C.: The Nactional academi press, 2005. 496 s. ISBN: 0-309-09654-5 NRC (National Research Council). Nutriend requirements of swine. United States of America, Washington, D.C.: The National academi press, 1998. 189 s. ISBN: 0-309-05993-3 OGNJANOVIČ, B. I.: Effect of Chronic Cadmium Exposure on Antioxidant Defense System in Some Tissues of Rats: Protective Effect of Selenium. Physiological Research. 2008, č. 57, s. 403-411. ISSN: 0862-8408
73
OLDEREID, N. B.; THOMASSEN, Y.; PURVIS, K.: Selenium in human male reproductive organs. Human Reproduction. 1998, 13, s. 2172–2176. ISSN: 0268-1161
OPLETAL, L.; SKŘIVANOVÁ, V.: Přírodní látky a jejich biologická aktivita: Využití látek pro ovlivnění fyziologických procesů hospodářských zvířat. Vyd. 1. Praha: Karolinum, 2010. 653 s. ISBN: 978-80-246-1801-2
PAGE, T. G.; SOUTHERN, L. L.; WARD, T. L.; THOMPSON, D. L.: Effect of chromium picolinate on growth and serum carcass traits of growing-finishing pigs. Journal of Animal Science. 1993, 71: 656–662. ISSN: 0021-8812
PAPAS, A.: Vitamin E. Praha: Pragma, 1999. 380 s. ISBN: 80-7205-773-1 PASSWATER, R. A.: Vše o selenu. Praha: Pragma, 1999. 97 s. ISBN: 80-7205-902-5 PECHOVA, A., PAVLATA, L.: Chromium as an essential nutrient: a review. Veterinarni Medicina. 2007, 52: 1–18. ISSN: 0375-8427 PETERS, J. C. a MAHAN, D. C.: Effects of dietary organic and inorganic trace mineral levels on sow reproductive performances and daily mineral intakes over six parities. Journal of Animal Science. 2008 (86), 2247-2260. ISSN: 0021-8812 POLÁKOVÁ, Š.: Obsah selenu (Se) v zemědělských půdách ČR. Ústřední a zkušební ústav zemědělský v Brně; Odbor bezpečnosti krmiv a půdy. Brno, 2010. POND, W. G.; MERSMANN, H. J.: Biology of the Domestic Pig. Vyd. 1. New York : Cornell University Press, 2001. 745 s. ISBN: 0-8014-3468-8
QUESNEL, H.; RENAUDIN, A.; FLOCH, N.; JONDREVILLE, N; PERE, M. C.; TAYLORPICKARD, J. A.; DIVIDLICH, J.: Effect of organic and inorganic selenium sources in sow diets on colostrum production and piglet response to a poor sanitary environment after weaning. Animal. 2008, č. 2, 859–866. ISSN: 1751-7311
RACEK, J.; HOLEČEK, V.: Enzymy a volné radikály. Chemické listy. 1999, 93, s. 774-780. ISSN 1213-7103
74
RADOMIL, L.; PETTITT, M. J.; MARKIES, K. M.; HICKEY, K. D.; BUHR, M. M.: Stress and Dietary Factors Modify Boar Sperm for Processing. Reproduction in Domestic Animals. 2011, roč. 46, č. 2, s. 39-44. ISSN: 0936-6768 REECE, W. O.: Fyziologie domácích zvířat. Vyd.1. Praha : Grada Publishing, 1998. 456 s. ISBN: 80-7169-547-5 REILLY, C.: Selenium in Food and Health. 2. vyd. United States of America: Springer Science, 2006. ISBN: 978-0387-33243-7 ROCA, J.; RODRIGUES, M. J.; GIL, M. A.; CARVAJAL, G.; GARCIA, E. M.; CUELLO, C.; VAZQUES, J. M.; MARTINEZ, A. M.: Survival and in vitro fertility of boar spermatozoa frozen in the presence of superoxide dismutase and/or catalase. Journal of Andrology. 2005, roč. 26, č. 1, s. 15-24. ISSN: 0196-3635 ROGINSKI, E. E., MERTZ, W.: Effects of Chromium (III) Supplementation on Glucose and Amino Acid Metabolism in Rats Fed a Low Protein Diet. The Journal of Nutrition. 1969, 97: 525–530. ISSN: 0022-3166 SAEZ, F.; MOTTA, C; BOUCHER, D; GRIZARD, G.: Antioxidant capacity of prostasomes in human semen. Molecular Human Reproduction. 1998, 4, s. 667–672. ISSN: 1360-9947 SANOCA, D. a KURPISZ, M.: Reactive oxygen species and sperm cells. Reproductive Biology and Endocrinology. 2004, roč. 12, č. 2. ISSN: 1477-7827 SEGERSON, E. C.; GETZ, W. R.; JOHNSON, B. H.: Selenium and reproductive function in boars fed a low selenium diet.. Journal of Animal Science. 1981, 53, s. 1360-1367. ISSN 00218812. ISSN: 0021-8812 SEGOVIA J.; ARZOLA, C.; RUIZ, O.; SALINAS-CHAVIRA, J.; RODRIGUES-MULEA, C.; JIMENEZ, J.; GONZALES-GARCIA, H.; CASTYLLO, Y.: Effect of Organic and Inorganic Selenium Supplementation on Weight Performance of Ewes and Lambs. Journal of Animal and Veterinary Advances. 2008, 7: 1555-1558. ISSN: 1680-5593 SHARMA, R. K.; PASQUALOTO, F. F.; NELSON, D, R; THOMAS, A. J.; AGARVAL, A.: The reactive oxygen species - total antooxidant capacity score is e new measure of oxidative
75
stress to predict male ifertility. Human Reproduction. 1999, 14, s. 2801-2807. ISSN: 02681161 SHI, L.: Short-term effect of dietary selenium next term-enriched yeast on semen parameters, antioxidant status and Se concentration in goat seminal plasma. Animal Feed Science and Technology. 2010, 157, s. 104-108. ISSN: 0377-8401 SHI, L.; YANG, R. J.; YUE, W. B.; XUN, W.J.; ZHANG, C. X.; REN, Y.S.; SHI, L.; LEI, F. L.: Effect of elemental nano-selenium on semen quality, glutathione peroxidase activity, and testis ultrastructure in male Boer goats. Animal Reproduction Science. 2009, 118, s. 248-254. ISSN: 0378-4320 SCHLEGEL, P.; JONDREVILLE, C.: Ways to Improve Zinc Bioavailability. In Europan poultry Conference- Mineral Nutrition. Nancy Universite, France: 2010. s. 8. ISBN: 978-807375-426-6 SIES, H.: Oxidative stress: Oxidants and antioxidants. Experimental Physiology, 1997. 82. s. 291295. ISSN: 0958-0670
SIVERTSEN, T.; VIE, E.; BERNHOFT, A.; BAUSTAD, B.: Vitamin E and selenium plasma concentrations in weanling pigs under field conditions in Norwegian pig herds. Acta Veterinaria Scandinavica. 2007, č. 1, s. 1-9. ISSN: 0044-605X SLAVÍK, P.; ILLEK, J.; RAJMON, R.; ZELENÝ, T.; JÍLEK, F.: Selenium Dynamics in the Blood of Beef Cows and Calves Fed Diets Supplemented with Organic and Inorganic Selenium Sources and the Effect on Reproduction. Acta Veterinaria. 2008, 77, s. 11-15. ISSN: 0001-7213 SMITAL, J.: Faktory působící na efektivitu a skladování kančího spermatu v kapalném stavu. Náš chov. 2001, 12, s. 34-37. ISSN: 0027-8068 SMITAL, J.: Effects influencing boar semen. Animal Reproduction Science. 2008, 110, s. 335-346 . ISSN 03784320. SMITH, D. G.; SENGER, P. L.; MECCUCHTAN, F. J.; LANDA, C. A.: Selenium and Glutathione Peroxidase Distribution in Bovine Semen and Selenium-75 Retention by the
76
Tissues of the Reproductive Tract in the Bull. Biology of Reproduction. 1979, 20, s. 377-383. ISSN: 0006-3363 SNEDECOR, G. W.; COCHRAN, W. G.: Statistical Methods. United States of America: Iowa Satates University Press, 1989, 505 s. ISBN 978-0813815619. SOCHOR, J.; RYVOLOVA, M.; KRYSTOFOVA, O.; SALAS, P.; HUBALEK, J.; ADAM, V.; TRNKOVA, L.; HAVEL, L.; BEKLOVA, M.; ZEHNALEK, J.; PROVAZNIK, I.; KIZEK, R.: Fully Automated Spectrometric Protocols for Determination of Antioxidant Activity: Advantages and Disadvantages. Molecules. 2010, 15: 8618-8640. ISSN: 1420-3049 SOMMERBURG, O.; GRUNE, T.; EHRICH, J. H.; SIEMS, W. G.: Adaptation of glutathionperoxidase activity to oxidative stress occurs in children but not in adult patients with endstage renal failure undergoing hemodialysis. Clinical Nephrology. 2002, 58, s. 31-36. ISSN: 0301-0430 SPEIGHT, S. M.; ESTIENE, M. J.; HARPER, A. F.; CRAWFORT, W. J.; KNIGHT, J. W.; WHITAKER, B. D.: Effects of dietary supplementation with an organic source of selenium on characteristics of semen quality and in vitro fertility in boars. Journal of Animal Science. 2012, č. 90, s. 761-770. ISSN: 0021-8812
STRAW, B. E.: Nemoci prasat. Bratislava: TYPOSET, 2003. 880 s. ISBN: 80-88700-58-2
SURAI, P. F. Selenium in Nutrition and Health. Vyd. 1. United Kingdom: Nottingham University Pres, 2006, 955 s. ISBN: 1-904761-16-X
SURAI, P. F.: Natural Antioxidant in Avian Nutrition and Reproduction.Vyd. 1. Nottingham: Nottingham University Press, 2002. 615 s. ISBN: 1-897676-95-6 SVOBODA, M.; FAJT, Z.; BAŇOCH, T.; DRÁBEK, J.; SALÁKOVÁ, A.: The Use of Selenium Enriched Enterococcus faecium as an Alternative Selenium Source for Growingfinishing Pigs. Acta Veterinaria. 2010, 79, s. 511-517. ISSN 0001-7213. ŠIMEČEK, K.; ZEMAN, L.; HEGER, J.: Potřeba živin a tabulky výživné hodnoty krmiv pro prasata. Vyd.1. Pohořelice: ČZS a VÚVZ Pohořelice, 1993. 78 s. ISBN: 80-901598-0-X
77
ŠIMEK, M.: Minerální látky a jejich zdroje u monogastrických zvířat. Krmivářství. 2007, 11, 5, s. 20-22. ISSN: 1212-9992
ŠIMEK, M.: Organické zdroje minerálních látek a zatížení životního porstředí. Vyd. 1. Praha: ústav zemědělských a potravinářských informací, 2001. 37 s. ISBN: 80-7271-092-3
ŠTÍPEK, S.: Antioxidanty a volné radikály ve zdraví a v nemoci. Vyd. 1. Havlíčkův Brod: Garda Publishiing, 2000. 320 s. ISBN: 80-7169-704-4 TAKADA, N.; OSHIDA, T.; DOHGASAKI, C.; SAKURAI, M.: Changes of the Selenium Content in Whole Blood and Milk Samples from Brood Sows and Piglets. Japanese Journal of Swine Science. 2005, roč. 42, č. 3, s. 121-129. ISSN: 0913-882X
THONGCHALAM, K.; RUKKWAMSUK, T a CHOMCHAI, S.: Blood and Semen Selenium Concentrations and Semen Quality in Boars Fed Diets Supplemented with Organic or Inorganic Selenium. Journal of Animal and Veterinary Advances. 2012, č. 5, s. 35-40. ISSN: 1680-5593
UNDERWOOD, E. J.; SUTTLE, N. F.: The Mineral Nutrition of Livestock. Vyd.3. London: CABI Publishing, 1999. 614 s. ISBN: 0851991289
UUSITUPA, B.; MYKKANEN, L.; SIITONEN, O.; LAKKSO, M.; SARLUND, H.; KOLEHMAINEN, O.; RASANEN, T.; KUMPULAINEN, J.; PIORALA, K.: Chromium supplementation in impaired glucose tolerance of elderly: effects on blood glucose, plasma insulin, C-peptide and lipid levels. British Journal of Nutrition. 1992, 68: 209–216. ISSN: 0007-1145 WAGNER, E. L., POTTER, G. D.; GIBBS, P. G.; ELLER, E. M.; SCOTT, B. D.; VOGELSANG, M. M.; WALZEM, R. L.: Copper and Zinc balance in exercising horses fed 2 forms of mineral supplements. Journal of Animal Science. 2011, 89, s. 722 - 728. ISSN: 0021-8812 WANG, Y. X.; ZHANG, X. A.; YUAN, D.; ZHANG, X. W.; WU, R. J.: Effects of selenomethionine and sodium selenite supplementation on quality, selenium distribution and
78
antioxidant status in broilers. Czech Journal of Animal Science. 2011, 56, s. 305-313. ISSN 1212-1819 WATTERMANN, R. T.; BAZER, F. W.: Influence of environmental temperature on prolificacy of pigs. Journal of Reproduction and Fertility. 1985, 33, 199-208. ISSN: 00224251
WETTERMANN, R. P.; DESJARDINS, C.: Testicular Function in Boars Exposed to Elevated Ambient Temperature. Biology of Reproduction. 1979, 20, 235-241. ISSN: 00063363 WATTERMANN, R. P.; WELLS, M. E; JOHNSON, R. K.: Reproductive Characteristics of Boars during and after Exposure to Increased Ambient Temperature. Journal of Animal Science. 1972, 49, 1501-1505. ISSN: 0021-8812 WATTERMANN, R. P.; WELLS, M. E.; OMTVEDT, I. T.; POPE, C. E.; TURMAN, E. J.: Influence of Elevated Ambient Temperature on Reproductive Performance of Boars. Journal of Animal Science. 1976, 42, 664-669. ISSN: 0021-8812 WILSON, M. E.; ROZEBOOM, K. J.; CRENSHAW, T. D.: Boar Nutrition for optimum Sperm Production. Advances in Pork Production. 2004, 15, s. 295-306. ISSN: 1489-1395
WRIGHT, A. J.; MOWAT, D. N.; MALLARD, B. A.: Supplemental chromium and bovine respiratory disease vaccines for stressed feeder calves. Canadian Journal of Animal Science. 1994, 74: 287–295. ISSN: 0008-3984 WU, A. S. H.; OLDFIELD, J. E.; SHULL, L. R.; CHEEKE, P. R. L: Specific Effect of Selenium Deficiency on Rat Sperm. Biology of Reproduction. 1979, 793-798. ISSN: 00063363 XIA, Y.; HILL, K. E.; BURK, R. F.: Effect of Selenium Deficiency on HydroperoxideInduced Glutathione Release from the Isolated Perfused Rat Heart. The Journal of Nutrition. 1985, 115, s. 733-742. ISSN: 0022-3166
ZEMAN, L. DOLEŽAL, P.; KOPŘIVA, A.; MRKVICOVÁ, E.; PROCHÁZKOVÁ, J.; RYANT, P.; SKLÁDANKA, J.; STRAKOVÁ, E.; SUCHÝ, P.; VESELÝ, P.; ZELENKA, J.: 79
Výživa a krmení hospodářských zvířat. 1. Praha: Profi Press, 2006. 360 s. ISBN: 80-8672617-7
ZEMAN, L.: Výživa a krmení prasat. Vyd. 1. Brno: Ediční středisko MZLU v Brně, 2004. 98 s. ISBN: 80-715-558-5 ZHANG, J.; GAO, X. Y.; ZHANG, L. D.; BAO, Y. P.: Biological effects of a nano red elemental selenium. BioFactors. 2001, 15, s. 27-38. ISSN: 09516433
80
9 PŘÍLOHY Tabulky Tabulka č. 1 :
Složení krmné směsi pro kance
Tabulka č. 2 :
Složení premixu pro kance (0,5%)
Tabulka č. 3 :
Změny laboratorních hodnot ejakulátu kanců kontrolní skupiny (přídavek 0 µg Cr/kg KS) a Cr1 (přídavek 60 µg Cr/kg KS)
Tabulka č. 4 :
Změny laboratorních hodnot ejakulátu kanců skupiny Cr2 (přídavek 121,2 µg Cr/kg KS) a Cr3 (181,8 µg Cr/kg KS)
Tabulka č. 5 :
Změny laboratorních hodnot ejakulátu kanců skupiny Se1 (0,3 mg Se/kg KS organická forma) a Se2 (0,3 mg Se/kg KS anorganická forma)
Tabulka č. 6 :
Změny laboratorních hodnot ejakulátu kanců skupiny Se3 (0,6 mg Se/kg KS organická forma) a Se4 (0,6 mg Se/kg KS anorganická forma)
Tabulka č. 7 :
Znázornění změn antioxidační kapacity ejakulátu kanců a celkový počet vyprodukovaných spermií - experiment č.2- selen
Grafy Graf č. 1 :
Koncentrace glukózy v krevní plazmě kanců (mmol/l) – experiment č. 1chróm
Graf č. 2 :
Aktivita inzulínu v krevní plazmě kanců (mU) – experiment č. 1- chróm
Graf č. 3 :
Vývoj celkového počtu vyprodukovaných spermií (mld.) v závislosti na teplotě prostředí (oC) u experimentálních skupin kanců – experiment č. 2 - selen
81
Graf č. 4
Znázornění závislosti mezi množstvím „ free radicals“ a celkovým množstvým vyprodukovsných spermií (ve čtvrtém odběru) – druhý experiment - selen
Obrázky Obrázek č. 1
Individuální ustájení kanců v pokusu na ISK
Obrázek č. 2
Odběr ejakulátu inseminačním technikem
Obrázek č. 3
Mikroskopické hodnocení motility spermií
Obrázek č.4
Odběr vzorku krve na analýzu glukózy a inzulínu u plemenných kanců
82
Tab. 1: Složení krmné směsi pro kance Komponenta
% zastoupení
Ječmen zrno Pšenice zrno Oves zrno Sojový extrahovaný šrot EKPO T Bergafat Uhličitan vápenatý Monodikalciumfosfát Minerálně vitaminózní premix (0,5 %) Chlorid sodný Oxid hořečnatý L-Lyzin HCl L - Threonin Methionin DL
36,00 20,36 20,00 14,50 3,00 2,10 1,50 1,20 0,50 0,40 0,15 0,14 0,09 0,06
Bergafat (Berg + Schmidt, Německo, www.berg-schmidt.de) – palmový olej; EKPO T (Delika – Pet, Česká Republika, www.delikapet.cz) – biskvitová moučka
Tab. 2: Složení premixu pro kance (0,5%) Parametr Vit.A Vit.D3 Alfatokoferol Vit.B1 Vit.B2 Vit.B6 Vit.B12 Vit.K3 Vit.C Biotin Kyselina listová Niacinamid Pentotenan vápenatý Cholin-chlorid Betain Butylhydroxy-toluen Ethoxyquin Cu - ve formě síranu měďnatého pentahydrátu Zn - ve formě oxidu zinečnatého Mn - ve formě oxidu manganatého Fe - ve formě uhličitanu-železnatého I - ve formě jodidu draselného Co - ve formě síranu-kobaltnatého heptahydrátu Se – ve formě selenomethioninu* Lyzin ve formě L-Lyzin monohydrochlorid nosič ad. - pšeničná krmná mouka, uhličitan vápenatý
Jednotka m.j. m.j. mg mg mg mg mg mg mg mg mg mg mg mg mg mg mg mg mg mg mg mg mg mg g kg
Množství 3 000 000 400 000 20 020 500 1 200 800 6 600 16 000 70 200 8 000 4 000 55 200 26 500 400 180 2 883 19 976 19 760 23 625 229 91 60 226 1
* v experimentu č. 2 byla tato složka premixu vyřazena
83
Tab. 3: Změny laboratorních hodnot ejakulátu kanců kontrolní skupiny (přídavek 0 µg Cr/kg KS) a Cr1 (přídavek 60,6 µg Cr/kg KS)
Skupina
Perioda
Průměrný počet odběrů na jednoho kance
Ukazatele ejakulátu Celkový počet spermií (mld.)
Motilita spermií (%)
Objem ejakulátu (ml)
Koncentrace spermií (tis/mm3)
Patologické spermie (%)
I.
2,8
106,0 ± 35,7
70,5 ± 2.7
284,9 ± 69,1
387,2 ± 142,0
8,3 ± 6.2
II.
3,4
111,1 ± 29,5
70,5 ± 1,5
264,8 ± 78,2
443,5 ± 125,6
8,5 ± 4,8
III.
3,2
105,4 ± 34,7
69,5 ± 8,1
265,0 ± 79,9
423,4 ± 150,6
11,7 ± 7,2
IV.
2,2
89,4 ± 26,0
71,4 ± 4,1
261,9 ± 88,2
368,2 ± 117,9
10,4 ± 7,7
I.
2,7
100,0 ± 28,5
70,2 ± 1,8
260,0 ± 79,3
412,8 ± 128,8
10,7 ± 5,5
II.
3,7
118,0 ± 31,5
70,0 ± 3,7
284, 3 ± 80,5
441,7 ± 136,2
9,7 ± 5,7
III.
3,1
107,4 ± 27,2
69,2 ± 3,4
250,1 ± 73,9
406,6 ± 123,7
11,2 ± 7,0
IV.
2,7
97,2 ± 28,1
68,5 ± 12,5
268,0 ± 79,11
384,7 ± 119,8
12,9 ± 7,4
Kontrolní
Cr1
* - symbol vyjadřující statisticky průkazné změny (ve srovnání s I obdobím tj. počátkem experimentu) P < 0,05 *; P < 0,01**
84
Tab. 4: Změny laboratorních hodnot ejakulátu kanců skupiny Cr2 (přídavek 121,2 µg Cr/kg KS) a Cr3 (181,8 µg Cr/kg KS)
Skupina
Průměrný počet odběrů na jednoho kance
Celkový počet spermií (mld.)
Motilita spermií (%)
Objem ejakulátu (ml)
Koncentrace spermií (tis/mm3)
Patologické spermie (%)
I.
2,7
102,5 ± 34,3
70,4 ± 1,1
265,5 ± 84,5
417,8 ± 170,6
6,3 ± 4,7
II.
3,5
110,6 ± 38,5
70,6 ± 2,6
265,2 ± 73,4
438,5 ± 147,1
7,8 ± 4,9
III.
3,5
106,7 ± 38,7
71,1 ± 2,8
249,3 ± 72,5
456,5 ± 185,6
9,1 ± 4,6
IV.
2,6
85,0 ± 21,5
71,7 ± 2,9
254,1 ± 86,0
385,9 ± 152,0
10,5 ± 5,3 *
I.
2,7
125,1 ± 38,8
68,5 ± 5,3
288,3 ± 129,1
462,2 ± 133,7
9,5 ± 4,6
II.
3,3
134,6 ± 41,1
68,7 ± 7,3
284,7 ± 119,8
523,7 ± 169,6
9,2 ± 4,9
III.
2,9
123,1 ± 41,8
67,2 ± 9,0
267,2 ± 112,7
502,2 ± 148,3
8,6 ± 4,7
IV.
2,4
68,9 ± 6,8
251,3 ± 101,8
427,4 ± 133,5
9,4 ± 6,1
Perioda
Ukazatele ejakulátu
Cr2
Cr3
97,8 ± 29,7 **
* - symbol vyjadřující statisticky průkazné změny (ve srovnání s I obdobím tj. počátkem experimentu) P < 0,05 *, P < 0,01 **
85
Tab. 5: Změny laboratorních hodnot ejakulátu kanců skupiny Se1 (0,3 mg Se/kg KS organická forma) a Se2 (0,3 mg Se/kg KS anorganická forma)
Skupina
Se1
Se2
Průměrný počet odběrů na jednoho kance
Celkový počet spermií (mld.)
Motilita spermií (%)
Objem ejakulátu (ml)
Koncentrace spermií (tis/mm3)
Patologické spermie (%)
I.
2,3
99,0 30,8
72,2 ± 3,3
255,7 ± 77,4
412,4 ± 145,9
8,8 ± 5,3
II.
3,2
102,4 28,1
73,1 ± 3,9
242,9 ± 73,8
450,8 ± 159,6 *
7,3 ± 5,6
III.
3,5
101,7 27,4
69,3 ± 7,4
262,7 ± 85,9
423,6 ± 161,6
9,0 ± 7,5
IV.
3,3
93,9 22,4
72,0 ± 6,5
270,3 ± 94,2
385,1 ± 145,1
10,6 ± 7,2
V.
3,4
93,5 30,7
73,7 ± 4,7
271,7 ± 103,8
380,7 ± 170,9
11,1 ± 7,6
I.
2,2
105,7 21,2
72,0 ± 3,5
269,2 ± 134,5
405,2 ± 135,4
9,3 ± 5,8
II.
3,2
100,1 24,8
71,5 ± 4,9
244,7 ± 63,2
431,8 ± 137,9
7,2 ± 4,4
III.
3,0
93,8 25,4
71,1 ± 9,6
260,2 ± 74,6
388,9 ± 153,5
8,4 ± 6,3
IV.
3,1
94,7 35,8
72,5 ± 3,4
267,2 ± 68,4
370,0 ± 149,3
8,2 ± 6,6
V.
3,7
86,2 21,5 **
70,7 ± 9,9
264,0 ± 67,3
343,6 ± 111,8 **
9,3 ± 7,9
Perioda
Ukazatele ejakulátu
* - symbol vyjadřující statisticky průkazné změny (ve srovnání s I obdobím tj. počátkem experimentu) P < 0,05 *; P < 0,01**
86
Tab. 6: Změny laboratorních hodnot ejakulátu kanců skupiny Se3 (0,6 mg Se/kg KS organická forma) a Se4 (0,6 mg Se/kg KS anorganická forma)
Skupina
Se3
Se4
Průměrný počet odběrů na jednoho kance
Celkový počet spermií (mld.)
Motilita spermií (%)
Objem ejakulátu (ml)
Koncentrace spermií (tis/mm3)
Patologické spermie (%)
I.
2,4
100,6 27,0
72,2 ± 2,8
234,3 ± 72,5
452,4 ± 138,0
7,9 ± 5,0
II.
3,1
100,5 26,3
72,9 ± 4,0
232,9 ± 70,0
453,3 ± 123,6
6,3 ± 3,6
III.
3,2
91,0 16,3
73,1 ± 4,0
226,0 ± 87,2
444,6 ± 145,3
9,5 ± 7,4
IV.
3,5
99,1 25,4
70,5 ± 13,0
241,5 ± 86,4
443,6 ± 137,0
10,7 ± 5,9 *
V.
3,6
100,8 32,0
68,6 ± 14,7
247,0 ± 84,5
437,6 ± 160,6
9,8 ± 6,8
I.
2,1
96,6 24,4
72,5 ± 3,2
255,2 ± 83,1
407,9 ± 133,4
7,0 ± 3,9
II.
3,3
98,7 28,1
73,5 ± 3,9
272,4 ± 75,6
386,9 ± 152,7
6,3 ± 4,8
III.
3,3
99,2 33,5
72,0 ± 4,2
263,9 ± 94,8
406,9 ± 163,8
7,2 ± 4,8
IV.
3,2
99,6 32,3
71,7 ± 7,8
290,4 ± 85,1 *
359,4 ± 125,0 *
9,3 ± 5,9
V.
3,4
101,2 34,0
70,3 ± 9,2
295,8 ± 95,0 **
363,9 ± 148,1
9,3 ± 4,9
Perioda
Ukazatele ejakulátu
* - symbol vyjadřující statisticky průkazné změny (ve srovnání s I obdobím tj. počátkem experimentu) P < 0,05 *; P < 0,01**
87
Tab. 7: Znázornění změn antioxidační kapacity ejakulátu kanců a celkový počet vyprodukovaných spermií - experiment č. 2 - selen Pokusná skupina
Celkový počet vyprodukovaných spermií (mld/odběr)
Free Radicals (mmol/l)
GSH-Px (mmol/l)
Obsah selenu (µg/l)
I.
108,3 ± 39,6
277,0 ± 144,0
9,6 ± 0,2
60,4 ± 38,5
II.
125,3 ± 28,7
203,1 ± 99,2
9,4 ± 0,1
64,3 ± 52,1
III.
91,1 ± 14,7
213,8 ± 147,2
9,6 ± 0,1
39,3 ± 21,6
IV.
91,3 ± 23,7
281,9 ± 195,2
9,8 ± 0,4
37,7 ± 26,9
I.
107,1 ± 25,9
9,5 ± 0,2
41,0 ± 31,9
II.
110,8 ± 12,1
257,0 ± 200,3
9,5 ± 0,2
50,7 ± 37,8
III.
92.9 ± 16,2
297,4 ± 224,0 *
9,7 ± 0,4
39,7 ± 41,8
IV.
88,9 ± 21,5 ***
312,5 ± 157,0 **
9,8 ± 0,6
41,9 ± 18,0
I
95,0 ± 18,7
187,9 ± 152,2
9,5 ± 0,2
66,1 ± 24,9
II.
101,6 ± 29,1
175,8 ± 138,9
9,4 ± 0,2
106,3 ± 55,3
III.
94,2 ± 28,5
178,4 ± 171,3
9,8 ± 0,3
112,0 ± 34,8 *
IV.
101,1 ± 31,2
157,5 ± 106,4
10,2 ± 0,2 ***
113,4 ± 40,0 *
I.
107,5 ± 30,3
277,9 ± 140,4
9,7 ± 0,3
52,9 ± 42,1
II.
103,7 ± 25,5
268,7 ± 165,0
9,7 ± 0,2
61,9 ± 39,3
III.
107,5 ± 31,2
353,6 ± 249,2
9,7 ± 0,4
47,1 ± 23,1
IV.
100,9 ± 33,7
309,8 ± 200,4
9,8 ± 0,6
66,3 ± 51,1
Odběr
Se1
163,2 ± 114,9
Se2
Se3
Se4
* - symbol vyjadřující statisticky průkazné změny (ve srovnání s I. obdobím tj. počátkem experimentu) P < 0,05 *; P < 0,01**; P < 0,001 ***
88
Graf č. 1: Koncentrace glukózy v krevní plazmě kanců (mmol/l) – experiment č. 1- chróm 5
4
3
2
3,5
3,7
3,4
2,7 **
kontrola
S1
S2
S3
1
**- symbol značící statistickou průkaznost na hladině P < 0,01
Graf č. 2: Aktivita inzulínu v krevní plazmě kanců (mU) – experiment č. 1 - chróm 40
30
20
10
22,2
21,4
14,5
23,2
kontrola
S1
S2
S3
0
89
Graf č. 3: Vývoj celkového počtu vyprodukovaných spermií (mld.) v závislosti na teplotě prostředí (oC) u experimentálních skupin kanců – experiment č. 2 - selen Teplota
S1
S2
S3
S4
110
22 20
100
18 16
90
14 12
80
10 1
2
3
4
5
Období
Graf č. 4: Znázornění závyslosti mezi množstvým free radicals a celkovým množstvým vyprodukovsaných spermií (ve čtvrtém odběru) – druhý experiment - selen
90
Obrázek č. 1: Individuální ustájení kanců na ISK
Obrázek č. 2:Odběr ejakulátu inseminačním technikem
91
Obrázek č. 3:Mikroskopické hodnocení motility spermií
Obrázek č. 4: Odběr vzorku krve na analýzu glukózy a inzulínu u plemenných kanců
92
Seznam zkratek AAS - atomová absorpční spektrometrie BU - Bílé ušlechtilé Cr - chróm Cr1 – první experimentální skupina kanců – chróm (60,6 µg/kg KS) Cr2 – druhá experimentální skupina kanců – chróm (121,2 µg/kg KS) Cr3 - třetí experimentální skupina kanců – chróm (181,8 µg/kg KS) Du - Duroc FR - free radicals; (volné radikály) GSH - redukovaný glutathion GSH-Px- glutathion peroxidáza GSSH - oxidovaný glutathion GTF - glukózo toleranční faktor ISK - inseminační stanice kanců KS - krmná směs LW - Large White MEp - metabolizovatelná energie pro prasata Pn - Pietren ROS - reactive oxygen species Se1- první experimentální skupina kanců - selen (0,3 mg Se/kg KD v organické formě) Se2 - druhá experimentální skupina kanců - selen (0,3 mg Se/kg KD v anorganické formě) Se3 - třetí experimentální skupina kanců - selen (0,6 mg Se/kg KD v organické formě) Se4 - první experimentální skupina kanců - selen (0,6 mg Se/kg KD v anorganické formě) Se - selen SOD - superoxid dismutáza
93
