Masarykova univerzita v Brně Přírodovědecká fakulta Ústav experimentální biologie Oddělení mikrobiologie
Aflatoxiny, jejich výskyt, význam a stanovení (Bakalářská práce studijního programu Biologie, oboru Obecná biologie – směr Mikrobiologie)
Jana Konečná Brno, 2008
Ráda bych poděkovala svému vedoucímu bakalářské práce Ing. Martinu Krskovi, CSc. především za trpělivost při výběru tématu a cenné rady při zpracovávání této práce.
2
Obsah
1. Cíl práce………………………………………………………………………..…………....5
2. Úvod o aflatoxinech……………………………………………………..…………………..6 2.1 Definice aflatoxinů……………………………………………..……………………6 2.2 Historie objevení aflatoxinů……..……………………………………..……………6 2.3 Druhy aflatoxinů, třídění a chemická charakteristika ……………………..……..….7 2.3.1 Aflatoxin B1………………………………………………………..…………...7 2.3.2 Aflatoxin B2……………………………………………………..…………...…8 2.3.3 Aflatoxin G1………………………………………………………..…………...8 2.3.4 Aflatoxin G2……………………………………………………..……………...9 2.3.5 Aflatoxin M1…………………………….……………………….…………....10 2.4 Druhy rodu Aspergillus produkující aflatoxiny……………………….……..…....10
3. Výskyt aflatoxinů……………………………………………….……………………….....13 3.1 Faktory ovlivňující produkci aflatoxinů………………………..…………………13 3.1.1 Biologické faktory……………………………………………...…..…………13 3.1.2 Chemické faktory………………………………………………...…...……….13 3.1.3 Fyzikální faktory………………………………...………………...…………..14 3.2 Druhy potravin a typy krmiv jež mohou aflatoxiny obsahovat………...……...….14 3.3 Prevence vzniku aflatoxinů v krmivech a potravinách……………...…..…….….17
4. Klinický význam……………………………………………………………...…………....18 4.1 Humánní klinický význam…………………….………….…………...………….19 4.2 Veterinární klinický význam…………….……………….……………...………..22
5. Metody stanovení a identifikace aflatoxinů…………………….……………....……….…25 5.1 Stanovení obsahu aflatoxinů v potravinách a krmivech………………………..…25 5.1.1 Fyzikálně – chemické metody……………………….……….………..……...26 5.1.2 Biologické metody……………….….………………………….………..…....27 5.2 Stanovení toxigenity……………………….……………….……….………..…...31 5.3 Povolené limity aflatoxinů v ČR…….……………….…………….…..………....31
3
6. Dekontaminace a detoxikace aflatoxinů…………………………………………..…….…35
7. Diskuze……………………………………………………………………………………..38
8. Závěr……………………………………………………………………………..………...39
9. Seznam použité literatury…………………………………………………..………………40
4
1. Cíl práce Problematice mykotoxinů se větší pozornost začala věnovat zejména v 60. letech 20. století. Poté proběhly studie různých druhů těchto toxinů. Jak jsem však zjistila, existuje v naší literatuře jen několik souhrnných prací, které by se zabývaly jak všeobecnou charakteristikou, tak i možným výskytem, klinickým významem a metodami stanovení těchto toxinů v různých druzích potravin a krmiv. Proto jsem si jako cíl své práce stanovila především podat formou literární rešerše s využitím dostupných zdrojů přehlednou charakterizaci jednoho z nejznámějších druhů mykotoxinů, aflatoxinů. V kapitolách významu zahrnu oblast humánní i veterinární, jelikož spolu velmi úzce souvisí. Ve své práci se budu snažit také uvést, pokud možno, nejnovější dostupná data týkající se množství aflatoxinů v potravinách a krmivech, jež jsou povolená legislativou České republiky. Jako jeden z posledních cílů bych také ráda nastínila určité možnosti předcházení vzniku těchto toxinů, případně způsoby, jak alespoň částečně řešit problém spojený s jejich dekontaminací.
5
2. Úvod o aflatoxinech 2.1 Definice aflatoxinů Aflatoxiny jsou nejčastější skupinou mykotoxinů, přírodních toxických látek produkovaných za určitých podmínek skupinou vláknitých hub neboli mikromycet. V současnosti známe více než 150 druhů těchto hub schopných produkovat 1 či více mykotoxinů, přičemž aflatoxiny produkuje několik významných druhů hub rodu Aspergillus (Šimůnek, 2004). Produkce aflatoxinů začíná po vytvoření konidií, maxima dosahuje v lag fázi a zhruba po 6 dnech se většinou snižuje (Malíř a kol., 2003). Aflatoxiny jsou přirozeně se vyskytující kontaminanty potravin. (Šimůnek, 2004) Jsou charakteristické svou termostabilitou, nerozloží je vaření či sterilizace (Malíř a Ostrý, 2004). Ani při skladování kontaminovaných potravin (konkrétně např. arašídů) při 23°C po dobu 2 let se obsah aflatoxinů v potravině nezměnil. Napadené potraviny je proto nutné zlikvidovat. 2.2 Historie objevení aflatoxinů Aflatoxiny patří mezi jedny z prvních objevených mykotoxinů, jejichž průkaz poukázal znovu na nebezpečí těchto látek pro člověka i pro hospodářská zvířata, a to zejména vzhledem k možné kontaminaci potravin a/nebo krmiv těmito látkami. Aflatoxiny byly objeveny poprvé v 60. letech 20. století, kdy v roce 1960 došlo na farmách v Anglii ke hromadnému úhynu více než 100 000 krůt a jejich mláďat, krmených mimo jiné i krmnou moučkou z podzemnice olejné dovážené z Brazílie (Šimůnek, 2004). Tato epidemie byla označena jako krůtí X onemocnění. Bylo pro ni charakteristické poškození jaterního parenchymu a proliferace epitelu žlučovodu (Malíř a kol., 2003). Nebylo možné identifikovat jako původce bakteriální ani virové agens, jednalo se tedy o intoxikaci. Později byl jako původce odhalen toxický metabolit, který dostal název aflatoxin dle svého hlavního producenta, vláknité houby druhu Aspergillus flavus („Aspergillus flavus toxins“). Několik let poté byla zaznamenána epidemie hepatomu pstruhů v USA související, jak bylo později prokázáno, také s kontaminací krmiva aflatoxiny. V roce 1974 byla zaznamenána první epidemie aflatoxikózy u lidí ve více než 150 vesnicích v severozápadní Indii (Bennett a Klich, 2003). Tento případ se týkal několika set lidí vykazujících příznaky otravy a poškození jater doprovázené žloutenkou, což jsou jedny z hlavních příznaků související s aflatoxiny. V tomto případě došlo k úmrtí více než 100 tamních obyvatel. Po provedení testů na přítomnost aflatoxinů byl potvrzen nález aflatoxinu B1 v kukuřici, kterou tito lidé zkonzumovali.
6
2.3 Druhy aflatoxinů, třídění a chemická charakterisitka Aflatoxiny jsou chemicky definovány jako komplexní organické látky (polycyklické, nesaturované, vysoce substituované kumariny) nebílkovinné povahy, vyznačující se nízkou molekulovou hmotností (do 700 g/mol) (Malíř a kol., 2003). Jsou produkovány jako sekundární metabolity některých druhů vláknitých hub rodu Aspergillus a vznikají biosyntézou, při níž jako primární konečné produkty vystupují mastné kyseliny a meziproduktem je malonyl-koenzym-A (Betina, 1994). Dělí se na základě jejich barvy pod krátkovlnným UV zářením (o vlnové délce 365 nm) a jsou označeny indexy dle pořadí, ve kterém vystupují na chromatografu při tenkovrstvé chromatografii (Sweeney a Dobson, 1998). Za základní tedy považujeme aflatoxiny B1, B2, které vykazují modré světélkování (označení z anglického blue = modrá) a G1, G2, které světélkují zeleně (označení z anglického green = zelená). Mezi aflatoxiny dalších řad můžeme uvést například toxiny řady M, jež byly nejprve zjištěny pouze jako metabolizovaná forma (po požití aflatoxinu B v potravě byly zjištěny v mléce hospodářských zvířat tomuto toxinu vystaveným), ale později byli nalezeni také přirození producenti těchto mykotoxinů (Malíř a kol., 2003). Dále zmiňme například aflatoxiny H (původně izolované z jater = hepar), P, Q atd. V dnešní době známe asi 20 druhů dosud identifikovaných aflatoxinů. Z hlediska třídění mykotoxinů podle různých charakteristik můžeme aflatoxiny zařadit do následujících skupin: a) dle chemické struktury: furanofurany b) dle biosyntézy: biosyntéza z polyketidů c) kvantitativně dle toxigenity: silně toxické d) kvalitativně dle toxigenity: hepatotoxiny, hematotoxiny, imunotoxiny, ... e) dle účinku na buňku: karcinogenní 2.3.1 Aflatoxin B1 (Ostrý a kol., 1997) •
Sumární vzorec: C17H12O6
•
Strukturní vzorec (převzato z www.fermentek.co.il/aflatoxin_B1.htm):
7
•
Název podle Chemical abstracts: Cyclopenta [c] furo [3‘2‘:4,5] furo [2,3-h] [1]benzopyran-1,1 1-dione, 2,3,6a, 9a-tetrahydro-4-methoxy-, (6aR-cis)-
•
Jiný název: 6-methoxydifurocoumarone
•
Molekulová hmotnost: 312
Fyzikální vlastnosti: •
Popis: světle žluté krystaly, emituje v UV světle modrou fluorescenci
•
Bod tání: 268 – 269°C
•
Rozpustnost: nerozpustný v nepolárních rozpouštědlech, málo rozpustný ve vodě (10 20 µg/ml), dobře rozpustný v polárních organických rozpouštědlech
Producenti: Aspergillus flavus, Aspergillus parasiticus, Aspergillus nominus 2.3.2 Aflatoxin B2 •
Sumární vzorec: C17H14O6
•
Strukturní vzorec (převzato z www.fermentek.co.il/aflatoxin_B2.htm):
•
Název podle Chemical abstracts: Cyclopenta[c] furo [3‘2‘:4,5] furo [2,3,-h] [1] benzopyran-1,1 1-dione, 2,3,6a,8,9,9a-hexahydro-4-,ethoxy-,(6aR-cis)-
•
Jiný název: Dihydro-aflatoxin B1
•
Molekulová hmotnost: 314
Fyzikální vlastnosti: •
Popis: světle žluté krystaly, emituje v UV světle modrou fluorescenci
•
Bod tání: 286 – 289°C
•
Rozpustnost: nerozpustný v nepolárních rozpouštědlech, málo rozpustný ve vodě (10 – 20 µg/ml), dobře rozpustný v polárních organických rozpouštědlech
Producenti: Aspergillus flavus, Aspergillus parasiticus, Aspergillus nominus 2.3.3 Aflatoxin G1 •
Sumární vzorec: C17H12O7
8
•
Strukturní vzorec (převzato z www.fermentek.co.il/aflatoxin_G1.htm):
•
Název podle Chemical abstracts: 1 H, 12H-furo [3‘2‘:4,5] furo [2,3-h] pyrano [3,4-c] [1] benzopyran-1,12-dione,3,4,7a,10a-tetrahydro-5-methoxy-,(7aR-cis)-
•
Jiný název: -
•
Molekulová hmotnost: 328
Fyzikální vlastnosti: •
Popis: bílý až světle žlutý prášek, emituje v UV světle modrozelenou fluorescenci
•
Bod tání: 244 – 246°C
•
Rozpustnost: nerozpustný v nepolárních rozpouštědlech, málo rozpustný ve vodě (10 – 20 µg/ml), velmi dobře rozpustný v polárních organických rozpouštědlech
Producenti: Aspergillus parasiticus, Aspergillus nominus 2.3.4 Aflatoxin G2 •
Sumární vzorec: C17H14O7
•
Strukturní vzorec (převzato z www.fermentek.co.il/aflatoxin_G2.htm):
•
Název podle Chemical abstracts: 1 H, 12H-furo [/3‘2‘:4,5] furo [2,3-h] pyrano [3,4-c] [1] benzopyran-1,12-dione,3,4,7a,9,10,10a-hexahydro-5-methoxy-,(7aR-cis)-
•
Jiný název: Dihydro-aflatoxin G1
•
Molekulová hmotnost: 330
Fyzikální vlastnosti: •
Popis: světle žluté krystaly, emituje v UV světle zelenou fluorescenci
•
Bod tání: 237 – 239°C
9
•
Rozpustnost: nerozpustný v nepolárních rozpouštědlech, málo rozpustný ve vodě (10 – 20 µg/ml), velmi dobře rozpustný v polárních organických rozpouštědlech
Producenti: Aspergillus parasiticus, Aspergillus nominus 2.3.5 Aflatoxin M1 •
Sumární vzorec: C17H12O7
•
Strukturní vzorec (převzato z www.fermentek.co.il/aflatoxin_M1.htm):
•
Název
podle
Chemical
abstracts:
Cyclopenta[c]furo[3‘2‘:4,5]furo[2,3-h]
[1]benzopyran-1,1 1-dione, 2,3,6a,9a-tetrahydro-9a-hydroxy-4-methoxy •
Jiný název: 4-hydroxyaflatoxin B1
•
Molekulová hmotnost: 328
Fyzikální vlastnosti: •
Popis: emituje v UV světle modro - fialovou fluorescenci
•
Bod tání: 299°C
•
Rozpustnost: nerozpustný v hexanu, málo rozpustný v benzenu, rozpustný v metanolu, ethanolu, acetonitrilu, chloroformu, směsi methanol:ether (1:1)
Producenti: Aspergillus parasiticus, Aspergillus nominus 2.4 Druhy rodu Aspergillus produkující aflatoxiny Taxonomické zařazení rodu Aspergillus je následující (Ostrý a Škarková, 2003):
říše: Fungi
oddělení:Ascomycota
řád: Eurotiales
čeleď: Trichocomaceae
rod: Aspergillus
Druhy produkující aflatoxiny patřící do podrodu Circumdati, sekce Flavi (Malíř a kol., 2003): akceptované druhy:
10
Aspergillus flavus – 2 morfotypy: tzv. L-kmen: sklerocium v průměru > 400 µm, nižší produkce aflatoxinů nebo atoxigenní a tzv. S-kmen: sklerocium < 400 µm, vyšší produkce aflatoxinů (Probst a kol., 2007 ). Pouze asi polovina kmenů tohoto druhu hub produkuje aflatoxiny, avšak pokud již k produkci dochází může dosahovat množství až 106 µg/kg (Bennett a Klich, 2003).
Obrázek č. 1: Aspergillus flavus, konidiofor s řetízky konidií, SEM (převzato z http://botany.natur.cuni.cz/pdf/kubatova/3.04%20Eurotiales-Asp%20sekce%20Flavi.pdf):
Obrázek
Aspergillus nominus (Malíř a kol., 2003) č.
2:
Aspergillus
nominus,
konidiofory
s konidiemi
(převzato
z
http://botany.natur.cuni.cz/pdf/kubatova/3.04%20Eurotiales-Asp%20sekce%20Flavi.pdf):
Aspergillus parasiticus
11
Obrázek č. 3: Aspergillus parasiticus, fialidy a řetízky konidií, skanovací elektronový mikroskop(SEM), (převzato z http://www.aflatoxin.info/aflatoxin.asp):
nově popsané druhy:
Aspergillus argentinicus
Aspergillus bombycis
Aspergillus pseudotamarii
Aspergillus zhaoqingensis
nutné potvrzení molekulárně biologickými metodami:
Aspergillus tamarii
Obrázek č.4: Aspergillus tamarii, konidiofor, konidie, skanovací elektronový mikroskop (SEM),
(převzato
z
http://botany.natur.cuni.cz/pdf/kubatova/3.04%20Eurotiales-
Asp%20sekce%20Flavi.pdf):
12
3. Výskyt aflatoxinů 3.1 Faktory ovlivňující produkci aflatoxinů Tvorba mykotoxinů je především závislá na druhu vláknité houby, ale ovlivňuje ji také řada dalších faktorů vedoucích k souhře enzymatických aktivit buňky a z toho vyplývající možnosti produkce toxinů. Mezi podmínky vedoucí k této souhře můžeme zařadit biologické, chemické a fyzikální faktory prostředí (Šimůnek, 2004; Suchý a Herzig, 2004). Tyto faktory mohou produkci mykotoxinů ovlivňovat už během pěstování (na poli), před i v průběhu sklizně úrody a také během její přepravy a uskladňování. 3.1.1 Biologické faktory a) Přítomnost více druhů toxigenních vláknitých hub v substrátu: antagonistické nebo synergické vztahy mezi nimi: synergismus mezi aflatoxinem B1 a diacetoxyscirpenolem, deoxynivalenolem, ochratoxinem A nebo T-2 toxinem b) Směsná kultura: obvykle vede k poklesu produkce mykotoxinů c) Přítomnost spor jiného kmene, případně druhu v médiu: pokles produkce aflatoxinů houbami druhu Aspergillus flavus při příměsi spor hub netoxigenního druhu Aspergillus niger; ochrana před kontaminací mikromycetami druhu Aspergillus flavus pokud je na kukuřici přítomná houba druhu Fusarium moniliforme (Malíř a kol., 2003) d) Hmyz narušující povrch rostlinných orgánů následně kontaminovaných sporami: narušení vnějšího povrchu zrn např. u kukuřice během vývojové fáze plodiny nejčastěji jedinci druhu Sitophilus zeamais, Ostrinia nubilalis, Spodoptera frugiperda, Helicoverpa zea se stává ideální vstupní branou infekce mikromycetami (Gorman a Kang, 1991). 3.1.2 Chemické faktory a) Přísun energie (Šimůnek, 2004; Suchý a Herzig, 2004) b) Přísun nezbytných chemických látek: jako vstupy do metabolismu c) Přísun kyslíku, tzn. aerobní podmínky: koncentrace O2 v prostředí pod 1% vede k útlumu produkce aflatoxinů d) Vliv cukrů: produkce aflatoxinů houbami druhu Aspergillus flavus probíhá do 50% sacharózy v prostředí (Ostrý, 1998) e) Vliv solí: produkce aflatoxinů na substrátu obsahujícím do 14% NaCl (Malíř a kol., 2003) f) Vliv dalších chemických látek aktivujících enzymatické systémy mikromycet: polychlorované bifenyly, rozpouštědla, některé mikroelementy – přídavek zinku, kadmia,
13
železa a molybdenu vedou ke zvýšené tvorbě aflatoxinů, naopak např. kofein může tvorbu částečně inhibovat (Šimůnek, 2004; Suchý a Herzig, 2004) g) pH: nejčastěji probíhá produkce aflatoxinů při pH mezi 3,5 a 8, s optimem okolo pH 6 (Sweeney a Dobson, 1998) 3.1.3 Fyzikální faktory (Šimůnek, 2004; Suchý a Herzig, 2004) a) Teplota substrátu a vnějšího prostředí: nejvhodnější je obvykle rozmezí 16 až 30°C s optimem okolo 25°C, u hub druhu Aspergillus flavus tvorba aflatoxinů při teplotě pod 16°C nebyla prokázána b) Vlhkost substrátu vhodná k produkci aflatoxinů: min. 16% c) Relativní vlhkost vzduchu: min.65% d) Osmotické vlastnosti substrátu, především vodní aktivita - aw (voda využitelná mikroorganismy): růst většinou ustává při aw pod 0,65, ale tento pokles pod optimální hodnotu neznamená usmrcení kultury, přežívají spory a při návratu k optimálním podmínkám, tj. hodnotě aw minimálně 0,75, mohou znovu vyklíčit a růst kultury pokračuje e) Struktura substrátu: ovlivňuje prorůstání do média a tím dostupnost chemických látek a kyslíku f) Čas: např. mikromycety druhu Aspergillus flavus produkují aflatoxiny obvykle až po vysporulování kultury g) Ionizující záření: 2,5 kGy padesátkrát zvýší syntézu aflatoxinů B1 a G1, dávka 1 kGy vyvolá tvorbu aflatoxinů také v konidiích kmenů hub druhu Aspergillus flavus, které nejsou přirozeně toxigenní (Malíř a kol., 2003) h) Stresové faktory působící na rostlinu během sklizně (Gorman a Kang, 1991) •
vodní stres: extrémní sucha roku 1977 v jihovýchodní USA měla za následek neobvykle vysoký výskyt aflatoxinů zejména u kukuřice
•
dusíkový stres: rostliny bez přísunu dusíku vykazovaly v průměru o 28% vyšší hodnoty výskytu aflatoxinů než rostliny s optimálním přísunem dusíku
3.2 Druhy potravin a typy krmiv jež mohou aflatoxiny obsahovat Vzhledem k přirozenému výskytu vláknitých hub v prostředí lze předpokládat také možnost kontaminace mnoha druhů potravin a krmiv. K takzvané primární kontaminaci může docházet již před sklizní a skladováním. Průnik mikromycet do pletiv jejich rostlinných hostitelů probíhá přes kořen, stonek a listy rostlin nebo mohou průniku napomáhat různé druhy vektorů, jako jsou například nematoda. Zejména při velkovýrobě potravin a krmiv
14
tvoříme vhodnou ekologickou niku pro dobré množení a adaptaci těchto hub. K další kontaminaci vláknitými houbami rodu Aspergillus dochází zejména u potravin rostlinného původu, v největší míře hlavně během skladování těchto potravin. V našich klimatických podmínkách jsou vláknité houby jako kontaminanty potravin a krmiv méně rozšířené, ale jsou k nám importovány především s obilninami a dalšími produkty ze zemí tropického a subtropického pásma, kde jsou podmínky pro jejich výskyt mnohem příznivější. Kvůli častému překračování povolených limitů obsahu aflatoxinů v potravinách dovážených z takzvaných třetích zemí byly Rozhodnutím Komise ze dne 12. července 2006, kterým se stanoví zvláštní podmínky pro dovoz některých potravin z vybraných třetích zemí vzhledem k riziku jejich kontaminace aflatoxiny, určeny zvláštní podmínky, týkající se především vyšší frekvence odběru vzorků z těchto potravin, častější a důkladnější kontroly obsahu aflatoxinů v návaznosti na časné odhalení a zadržení nevyhovujících zásilek u následujících produktů: podzemnice olejné a výrobků z ní z Číny; fíků, lískových ořechů, pistácií a výrobků z nich z Turecka; para ořechů z Brazílie; pistácií a výrobků z nich z Íránu; další řady podezřelých produktů a výrobků z těchto produktů z Brazílie, Číny, Egypta, Íránu, Turecka. V České republice byla kvůli opakovanému výskytu kontaminovaných potravin a většinou nekompletním datům, která se týkají stupně kontaminace potravin, počínaje rokem 1999 zahájena rozsáhlá studie MYKOMON, která v rámci projektu Monitoringu zdravotního stavu obyvatelstva ČR ve vztahu k životnímu prostředí měla chybějící informace doplnit (Ostrý a Škarková, 2003). Malíř a kol. (2003) uvádějí, že mikromycety druhu Aspergillus flavus se vyskytují v zahraničí především v těchto potravinách: kukuřice a produkty z kukuřice, čirok, rýže, oves, obiloviny a potraviny vyrobené z obilovin (pšenice, pšeničná zrna, mouka, chléb, těstoviny, otruby, ječmen, millet, ...), proso, sójové boby, sója mungo, hrách, čerstvé ovoce (citrusy, liči, granátová jablka, ananas), sušené ovoce, ořechy (arašídy, kemiri, kola, pekanové ořechy, pistácie, lískové ořechy, vlašské ořechy, betelové ořechy, kokosové ořechy atd.), koření (pepř, koriandr, paprika, muškátový oříšek, zázvor atd.), zpracovaná masa, slanina, šunky, šunky ze Španělska, africké rybí výrobky, sušené, solené, uzené ryby z jihovýchodní Asie, mléko, sušené mléko, sýr. U mikromycet druhu Aspergillus parasiticus je nejčastější výskyt v amarantu, prosu, milletu, sójových bobech, arašídech, lískových ořeších, vlašských ořeších, pekanových ořeších, pistáciích, zpracovaných masech. 15
Mikromycety druhu Aspergillus tamarii může obsahovat: pšenice, ječmen, kukuřice, čirok, rýže, sójové boby, zelené kávové boby, černé fazole, sója mungo, kopra, prách, arašídy, pistácie, pekanové ořechy, lískové ořechy, vlašské ořechy, ořechy kola, betelové ořechy, ořechy kemiri, kešu, kakao, palmové jádro, koření (pepř), masné výrobky, solené sušené ryby, uzené sušené ryby. Výskyt aflatoxinů byl zjištěn v následujících druzích potravin: •
aflatoxin B1: arašídová omáčka, pasta, směs; arašídy kandované; broskvová jádra; bataty; cereální snídaně; česnek nakládaný; česnekový prášek; čili koření, papričky; čirok; čokoláda; fíky; fíková pasta; hrášek; jádra melounu; kakaová drť, keksy; kari pasta, kari; kávová zrna; kokosová zmrzlina, ořechy, olej; kayenský pepř, pepř; kmín; kukuřice sušená, vařená, otruby, slupky, výrobky, slad, stonek, škrob; maniok (cassava); mandle; marcipán; maso; müsli; nudle; muškátový oříšek; olej; ořechy brazilské, pistáciové, pekanové, vlašské; paprika; pekařské výrobky; pistácie kandované; pivo; proso (millet); rozinky; ryby; sezamové semeno; sójová mouka; špagety; tykvová jádra; vaječné výrobky; víno; zázvor; zrno ječmene
•
aflatoxin G1: stejný jako u B1 + semena celeru
•
aflatoxin G2:stejný jako u B1 + citrony; indická kassia (skořice); mango; olivový olej; pomeranče; slunečnicová semínka; sezamová semínka; kurkuma; římský kmín
•
aflatoxin M1: jogurt; kukuřice bílá a žlutá; máslo; mléko pasterizované a sterilizované, sušené; mléko velbloudí; zaplísněné pistáciové ořechy; syrovátka sušená; sýry (blue, Blue Haverti, Brie, Camembert, Cheddar, Cheshire, Chester, Cottage, Compte, Cream, Double Gloucester, Eidam, Emmental, Fresh, Gouda, Grana Padano, Lancashire, Leicester, Maribo, Mozarella, Parmesan, Romadur, Samsoe, Stilton, Wensleydale)
Vzhledem ke svým významným toxickým účinkům nejen pro člověka, ale i hospodářská zvířata, je důležité sledovat též možnost výskytu v krmivech (Suchý a Herzig, 2004). U krmiv dochází v prvé řadě ke zhoršení nutriční hodnoty (pokles obsahu bílkovin, esenciálních aminokyselin atd.) Ztráty způsobené znehodnocením krmiv mykotoxiny v zemích Evropské unie jsou odhadovány až na 25% celkové produkce krmiv.
16
Dále mohou některé druhy aflatoxinů po metabolické přeměně přecházet do mléka zvířat a tím ohrozit opět i lidský organismus, a proto je sledování výskytu těchto toxinů v krmivech také významnou součástí mnoha studií. Jelikož nejcitlivější k aflatoxinům jsou především mláďata drůbeže, prasata a dobytek chovaný pro mléko, jsou také nejsledovanějšími komoditami právě krmiva pro tyto druhy zvířat. Za další riziková krmiva lze však pokládat veškeré obiloviny, luskoviny, olejniny a produkty z nich vyrobené (např. krmiva z kukuřice a podzemnice olejné, bavlníkový šrot, ...), které i u méně citlivých zvířat způsobují především snížení přírůstků, pokles mléčné a masné užitkovosti, snůšky atd. Z takzvaných konzervovaných krmiv mohou být kontaminovány především sušená nebo fermentovaná píce, což jsou zelené rostliny včetně klasů a semen, které mohou být zvířaty konzumovány v surovém stavu, jako pastva, ošetřené = seno, nebo fermentované = siláž. K nejčastěji zasaženým krmivům patří především kukuřičná píce. Výskyt toxigenních plísní může být zaznamenán také v mnoha dalších doplňkových krmivech, krmných moučkách a různých komponentech krmiv. 3.3 Prevence vzniku aflatoxinů v krmivech a potravinách Z řady různých jmenovaných faktorů ať již fyzikálních, chemických či biologických, působících při produkci aflatoxinů je zřejmé, že preventivní opatření prováděná v tomto směru jsou velmi obtížná. Odstranit vláknité houby, respektive především jejich spory z prostředí je prakticky nemožné. Podle Suchého a Herziga (2004) by u preventivních opatření kontaminace potravin a krmiv měla být dodržována zejména tato opatření: a) při pěstování a sklizni •
střídání plodin v osevních postupech
•
výběr vhodného hybridu, odrůdy
•
ošetření osiv vhodnými fungicidy
•
boj proti plevelům, škůdcům a chorobám (rezervoáry)
•
šlechtění geneticky upravených odrůd odolných vůči houbovým chorobám
•
zabránění mechanickému poškození zrna, udržování dobrého zdravotního stavu porostu
•
s využitím atoxigenních kmenů konkurenční vyloučení toxigenních kmenů z prostředí
•
kvalitní ošetření krmiva po sklizni
b) při skladování a konzervaci •
uskladnění v suchu (relativní vlhkost vzduchu do 65%)
17
•
u cereálií do 48 hodin po sklizni snížení vlhkosti pod 14%
•
odstranění zbytků starých krmiv, vyčištění zásobníků krmiv před plněním
•
zajištění minimálního přístupu kyslíku
•
případné ošetření vhodnými protiplísňovými přípravky, u siláží mohou být použita silážní prezervativa ke zlepšení fermentace
Ve studii Gormana a Kanga (1991) je také kladen důraz na: •
ošetření vhodnými insekticidy (pomáhají redukovat množství rostlin napadených mikromycetami)
•
vývin nových hybridů rezistentních k napadení určitými druhy hmyzu, které mohou na svém povrchu a/nebo ve svých útrobách přenášet též spory mikromycet
•
vývin hybridů odolnějších ke stresovým faktorům, případně rezistentních k infekci mikromycetami
V práci Malíře a Ostrého (2004) týkající se otázky skořápkových plodů je u této suroviny doporučeno k účinnému snížení aflatoxinů dodržovat zejména: •
minimalizace produkce aflatoxinů pomocí správné zemědělské praxe
•
správné skladování a manipulace s těmito plody
•
užití vhodných technologických postupů pro zpracování a dekontaminaci
•
dodržování hygienických limitů a monitoring
•
zavádění vzdělávacích programů pro zemědělce, výrobce potravin a krmiv, distributory, prodejce a spotřebitele
4. Klinický význam aflatoxinů Při stanovování klinického významu aflatoxinů vyjdeme z biochemických účinků těchto toxinů (Betina, 1990). Ty jsou určeny chemickou strukturou molekuly aflatoxinů. Všeobecně se mechanismy účinku mykotoxinů zkoumají na úrovni: 1) Interakce s biomolekulami na molekulární úrovni (vazby v DNA,…) 2) Interakce s purifikovanými enzymy v enzymových reakcích 3) Interakce s nebuněčnými systémy (účinky na syntézu RNA, proteosyntézu,…) 4) Interakce s buněčnými systémy (jádro, membrány, mitochondrie,…) 5) Interakce na úrovni buňky (účinky na metabolické procesy) 6) Interakce na úrovni tkání a orgánů po podání toxinů V případě aflatoxinů se projevují:
18
1) Interakce s molekulou DNA: aflatoxin B1 se váže kovalentní vazbou na atom N7 guanidinových zbytků, právě tato vazba způsobuje inhibici replikace a transkripce a také mutagenitu tohoto toxinu 2) Inhibice replikace, transkripce, translace: aflatoxin B1 inhibuje RNA, působí na templáty DNA, inhibuje iniciaci transkripce, biosyntézu DNA, proteinů 3) Účinky na buněčné membrány a energetický metabolismus buňky: aflatoxin B1 •
inhibuje
syntézu
glykogenu
snížením
aktivity
glykogensyntetázy
a
transglykosylázy (enzymy katalyzující elongaci a uspořádání molekul glykogenu) •
snižuje aktivitu fosfoglukomutázy (reverzibilně katalyzuje přeměnu glukóza-6fosfátu na glukóza-1-fosfát)
•
redukuje hladinu glykogenu v játrech urychlením oxidace glukóza-6-fosfátu
•
zasahují do metabolismu lipidů, v cytosolu se zvyšuje hladina NADPH na syntézu mastných kyselin v játrech
•
inhibuje transport triacylglycerolů
•
ovlivňuje transport fosfolipidů a cholesterolu
•
ovlivňuje některý z dějů mezi cytochromem b a c v mitochondriích (vliv na dýchací řetězec)
4.1 Humánní klinický význam Aflatoxiny patří mezi jedny z nejsilnějších přírodních toxinů, jimž může být člověk vystaven. Toxicita se projevuje zejména v závislosti na délce doby, po kterou jedinec přicházel do styku s aflatoxiny, a také na množství toxinu, které po tuto dobu přešlo do jeho organismu. Vstup aflatoxinů do organismu může probíhat intravenózně, intraperitoneálně, subkutánně, orálně či penetrací kůží. Podle množství přijatého aflatoxinu a doby jeho příjmu s potravou se intoxikace projevuje buď akutně (končí ve většině případů smrtí) nebo chronicky (vyvolává rakovinné bujení, oslabení imunity a další orgánová postižení) (Bennet a Klich, 2003). Toxikologická charakteristika je následující (Malíř a kol., 2003): •
aflatoxin
B1:
nejsilnější
známý
přírodní
karcinogen
a
nejúčinnější
hepatokarcinogen, primárně postihuje játra (jelikož játra jsou hlavním místem metabolismu aflatoxinů), způsobuje změny i na jiných orgánech •
aflatoxin B2: karcinogen (možný), genotoxický, nižší toxické účinky než B1
•
aflatoxin G1: jaterní a ledvinový karcinogen, genotoxický
•
aflatoxin G2: karcinogen (možný), genotoxický 19
•
aflatoxin M1: mutagenní, karcinogenní, genotoxický
•
ostatní aflatoxiny: v různé míře toxické
Aflatoxiny jsou považovány za možné agens několika závažných onemocnění. Absorpce aflatoxinu B1 se uskutečňuje především v duodenu. Do jater přechází portální vénou a přechod z plazmy do hepatocytů probíhá pasivní difuzí přes membrány. Po biotransformaci dochází k eliminaci žlučí, při níž je vyloučeno asi 50% z celkového množství aflatoxinů nahromaděných v organizmu. Dalších asi 15 - 25% je vyloučeno močí. Tento proces je však u různých biologických druhů zcela individuální. U mnoha chorob, spojovaných s těmito toxiny, jsou aflatoxiny považovány pouze za jeden z faktorů způsobujících onemocnění, přesto jsou jejich účinky velmi závažné. Za původce onemocnění nebo jeden z vyvolávajících faktorů jsou považovány v následujících případech: •
Akutní aflatoxikóza: Vyskytuje se poměrně zřídka. Nejčastěji postihuje játra, v nichž v důsledku postižení vznikají nekrózy. Dále způsobuje jaterní dystrofii. V játrech zemřelých je následně možno histopatologicky ověřit přítomnost toxinu (nejčastější jsou případy s nálezem aflatoxinu B1). Jedna z nejhorších akutních aflatoxikóz byla zaznamenána v roce 2004 v Keni. Při této epidemii zemřelo více než 125 lidí s příznaky odpovídajícími právě intoxikaci aflatoxiny (Probst a kol., 2007). Klinické příznaky tohoto onemocnění jsou podle Suchého a Herziga (2004) hlavně nažloutlé oční bělmo, zvracení, křeče v žaludku, vysílení, hubnutí a bezvědomí končící až smrtí postiženého.
•
Primární jaterní karcinom: Karcinogenita aflatoxinu B1 je zapříčiněna jeho metabolizovanou formou, která způsobuje bodovou mutaci na kodonu 249 (ser) – dochází ke změně pořadí bází z AGT na AGG u tumor supresorového genu p53 (Malíř a kol., 2004). Mutace vede ke vzniku primárního karcinomu. Nádory jater tvoří v ČR asi 3% případů pacientů se zhoubnými nádory (Šimůnek, 2004). Také byl studován vztah mezi virem hepatitidy typu B a zvýšením rizika jaterního karcinomu a bylo zjištěno, že prodělání hepatitidy B zvyšuje přibližně dvacetinásobně riziko vzniku tohoto typu nádoru. Virus hepatitidy B je řazen mezi lidské onkoviry. Potřebuje ovšem, aby působil některý z faktorů vyvolávající onkogenezi a právě v této funkci se často uplatňují aflatoxiny.
•
Kvašiorkor (kwashiorkor): Toto onemocnění, nejčastěji se vyskytující v zemích potýkajících se s hladomorem, je charakterizováno jako výživová dysbalance. Při
20
potenciálním energetickém dostatku se projevuje nedostatek kvalitních bílkovin v potravě. To způsobuje edémy vyvolané právě nedostatkem bílkovin v krvi. U nejtěžších případů tohoto onemocnění byly současně potvrzeny nálezy aflatoxinů jak v potravinách, tak v tělních tekutinách (krev, moč) postižených jedinců. Existuje tedy zřejmě úzký vztah mezi nemocí kvašiorkor a konzumací potravin kontaminovaných aflatoxiny, který byl zjištěn zejména při výzkumech v Etiopii a dalších afrických zemích. •
Reyův syndrom: Tato choroba postihuje celosvětově zejména děti (Malíř a kol., 2004). Je považována za polyetiologickou a jako jedno z hlavních agens jsou označovány aflatoxiny (Šimůnek, 2004). Především u kojenců do 1 roku (respektive do 6 měsíců) života krmených umělou výživou. Projevuje se horečnatým onemocněním, u něhož jsou příznaky nespecifické. Připomínají však virózu, která záhy přechází do těžkého bezvědomí. Dle Malíře a kol. (2003) má toto onemocnění 2 stádia, přičemž první se projevuje jako zcela běžné respirační onemocnění. Druhá fáze, která nastává většinou již během několika hodin, se vyznačuje zvracením, průjmy a progradující encefalopatií. V této fázi je možno prokázat též patologické laboratorní hodnoty a neurologické příznaky končící křečemi a smrtí postiženého. Morfologicky se prokazuje difúzní malokapénková steatóza jater, steatóza proximálních tubulů ledvin, myokardu a hrudkovitý rozpad kosterních vláken. V 60% dětí zemřelých v bývalém Československu právě na následky tohoto onemocnění byly prokázán aflatoxin B1 ve vzorcích z jater, žluči a krve.
•
Respirační nádorová onemocnění: U buněk respiračního traktu byla též prokázána schopnost metabolizovat aflatoxin B1. Zejména při profesním vystavení aflatoxinům se objevily pozitivní nálezy tohoto toxinu ve spojení s respiračními onemocněními a také bylo diagnostikováno několik případů plicního aspergilomu.
•
Encefalopatie Udorn: Výskyt byl pozorován u několika dětí v Thajsku v roce 1971. Příznaky se vyznačují encefalopatií, morfologickým průkazem je tuková degenerace orgánů a edém mozku. Následně byl diagnostikován aflatoxin B1 v orgánech zemřelých.
•
Cirhóza dětí v Indii: Projevy tohoto onemocnění jsou nejasné gastrointestinální postižení spolu s anorexií, následná hepatomegálie, která postupuje obvykle ke žloutence a jaternímu kómatu (Amla a kol., 1971). Asi v 7% vzorků moči dětí
21
postižených tímto onemocněním byly prokázány aflatoxiny. Z biopsie byly již v prvním až druhém měsíci po konzumaci kontaminovaných potravin odhaleny mírné až vážné tukové infiltrace, ascites (vodnatelnost), architektura jaterních laloků byla zatím nezměněna a dále zde byl nález zánětlivé tekutiny pronikající až do jaterního parenchymu. Další biopsie dětí ve stáří 10 měsíců až jednoho roku vykazovaly již kompletní destrukci architektury jaterních laloků s oddělováním do sept o různé tloušťce, přítomny byly nekrózy různého stupně a proliferace žlučovodů. •
Další onemocnění: chronická gastritida (Malíř a kol., 2003) mentální retardace dětí (USA)
•
Další
nežádoucí
účinky
aflatoxinů
se
projevují
například
ve
snížení
obranyschopnosti jedince. Zejména aflatoxin B1 způsobuje poškození chromozomů a inhibici proteosyntézy v lymfocytech (Wada a kol., 2008). Obrázek č. 5: Vážné tukové infiltrace jater po intoxikaci aflatoxiny, zv. 200x, Amla a kol., 1971
4.2 Veterinární klinický význam Aflatoxiny se běžně vyskytují v krmivech, ohrožují tedy nejen člověka, ale také mnoho druhů zvířat, a proto je třeba jim věnovat pozornost i ve veterinární sféře. Zejména kvůli ohrožení hospodářských zvířat, prostřednictvím nichž se aflatoxiny dostávají s jatečními produkty nebo ve své metabolizované podobě obsažené v mléce a mléčných výrobcích také do potravního řetězce lidí.
22
Ze studií propracovaných nejvíce především na zvířatech pochází mnoho výsledků, které byly později též aplikovány na člověka a byla takto potvrzena například i karcinogenita aflatoxinu B1, jenž byl Mezinárodní agenturou pro výzkum rakoviny při Světové zdravotní organizaci (IARC/WHO) zařazen do karcinogenů skupiny 1, takzvaných prokázaných karcinogenů pro člověka (Malíř a kol., 2003). Tento aflatoxin způsobuje zejména nádory jater a dalších orgánů (žaludek, tračník, příp. ledviny) u následujících zvířat: myši, potkani, pstruzi, lososi, rovníkové ryby, další exotické ryby, kachny, opice, dle Betiny (1994) zejména kosmani. Tvorbu tumorů vyvolává již dávka od 1ppm (=mg/kg) (Rada, 2004). Nejcitlivější k intoxikaci aflatoxiny bývají dle Suchého a Herziga (2004) především drůbeží mláďata (nejvíce kuřata a kachňata). Vnímavá jsou též prasata a koně. Skupinu tolerantní k aflatoxinům zastupují především přežvýkavci a relativně dosti odolné se jeví zejména ovce. Záleží ovšem též na pohlaví, stáří zvířete, jeho fyziologickém stavu a dalších faktorech. Následky intoxikace aflatoxiny jsou následující: •
akutní intoxikace (vyvolány jednorázovým příjmem vysokých dávek aflatoxinů): úhyn bez příznaků nebo s příznaky anorexie, deprese, dyspnoe, krvácení a anemie
•
subchronická a chronická intoxikace (vyvolaná dlouhodobým příjmem nižších dávek
aflatoxinů
v potravě):
ikterus,
hypoprotrombinémie,
hematomy,
gastroenteritida Jedním z cílových orgánů citlivým k působení aflatoxinů je rovněž thymus (Pier, 1992). Z toho vyplývá, že též u zvířat se objevují imunosupresivní účinky těchto toxinů. Aflatoxiny redukují množství imunoglobulinů G a A a snižují aktivitu komplementu C4 potřebného pro normální hemolytickou aktivitu v organismu. U mláďat může být již při narození patrné snížení obranyschopnosti způsobené přenosem toxinů přes placentu v děloze březí samice. Taková mláďata postrádají rezistenci k některým infekcím a též nevykazují adekvátní odpověď na očkování. Aflatoxiny mají rovněž prokázaný teratogenní účinek (Malíř a kol., 2003). V dávce 4 mg/kg aflatoxinu B1 podané intraperitoneálně samicím křečka 8.den březosti vyvolala tato aplikace rozsáhlé anomálie a malformace plodu. K hlavním příznakům intoxikace předcházejícím ve většině případů úhynu zvířete patří nevolnost, neklid, ztráta chuti k jídlu a hmotnostních přírůstků. U slepic snížení produkce vajec, jaterní nekróza, hemoragie. Dalšími příznaky jsou ikterus a vodnatelnost, překrvení
plic,
glomerulonefritida
ledvin,
poškození
imunitního
systému.
Nejcharakterističtější známky blížícího se úhynu jsou melancholie, vrávoravá chůze, nervozita a svalové spasmy. U samic také dochází k pozorovatelným změnám na vaječnících 23
a u samců můžeme sledovat menší objem ejakulátu a snížení hmotnosti gonád (Suchý a Herzig, 2004). Požití krmiva zasaženého aflatoxiny způsobuje: •
u skotu: omezený příjem krmiva, nízké přírůstky, vyšší procento potratů a embryové mortality, nepravidelný pohlavní cyklus, nižší procento zabřeznutí, tiché říje, záněty dělohy, nízké přírůstky, nižší produkce mléka, pokles obranyschopnosti, dysfunkce slezu, ketózy a ztučnění jater, rezidua v mléce
•
u drůbeže: zhoršený růst, snížený přísun krmiva a jeho špatná konverze v organismu, atrofie vaječníků, nižší líhnivost, deformovaná vejce, ztučnění jater, hemoragie, pokles hladiny protilátek v krvi, menší počet leukocytů a T-lymfocytů, pokles koncentrace fagocytů, orální léze
Obrázek č.6: Účinky aflatoxinu B1 na drůbež, vpravo kuře, vystavené aflatoxinu B1, vlevo zdravý jedinec (převzato z http://www.aflatoxin.info/mycotoxins.asp):
•
u prasat: nechutenství, poruchy reprodukce, průjmy a zvracení, extrémní rozklad zažitiny, změněné biochemické ukazatele v krvi
Tabulka č. 1: Letální dávka u aflatoxinů (po perorálním podání), Suchý a Herzig, 2004: Aflatoxin
Aflatoxiny (celkem)
AFB1
18,2 µg/ 50 g (1 denní káče)
AFG1
39,2 µg/ 50 g (1 denní káče)
AFB2
84,8 µg/ 50 g (1 denní káče)
AFG2
172,5µg/ 50 g (1 denní káče) 370,0 µg/kg (1denní kuře) 500,0 µg/kg (pstruh) 620,0 µg/kg (sele) 7400,0 µg/kg (potkan)
24
5. Metody stanovení a identifikace 5.1 Stanovení obsahu aflatoxinů v potravinách a krmivech V České republice ještě v současnosti neplatí ucelené evropské normy pro stanovování obsahu aflatoxinů v potravinách a krmivech, a proto je jednotlivými směrnicemi dovoleno použít jakoukoliv z metod (Mrkvicová, 2007). Musí pouze splňovat předpoklady týkající se její reprodukovatelnosti, opakovatelnosti a výtěžnosti (Nařízení ES č. 401/2006) . Při stanovování obsahu aflatoxinů v potravinách se využívá především jejich fyzikálních, chemických a také biologických charakteristik. Pro každou z analýz jsou velmi důležité, i když často podceňované, první kroky předcházející samotné detekci toxinu v potravinách, a to zejména (Šimůnek, 2004; Malíř a kol., 2003): •
Zisk vzorku a příprava ke stanovení: Pro některé potraviny je postup upraven speciální normou. Kvalitní odběr vzorku má vliv na přesnost stanovení a je také vhodné používat při kontrole vždy stejnou metodu odběru vzorků pro stejný výrobek. Množství odebraného vzorku se provádí s ohledem na množství produktu, z něhož odebíráme. Měl by být odebrán také takzvaný duplikátní vzorek za účelem potvrzení budoucího výsledku stanovení. Pro daný produkt je třeba vystavit protokol o odběru. Důraz bývá kladen i na transport vzorku, jenž by měl probíhat po uložení daného vzorku do čisté nádoby z inertního materiálu, která jej v případě potřeby ochrání před poškozením či případnou kontaminací při přepravě. Důležitým krokem je také homogenizace vzorku, jelikož aflatoxiny jsou v potravinách často nerovnoměrně rozloženy (zejména v případě sušených fíků nebo arašídů).
•
Extrakce: Cílem je především přenesení co největšího množství testované látky do co nejmenšího objemu vhodného rozpouštědla a zajištění co nenižšího podílu rušících látek. Používá se extrakce vhodným rozpouštědlem na laboratorní třepačce v Erlenmayerově baňce se zábrusem při neutrálním až kyselém pH (Mrkvicová, 2007). Jako jedna z metod se používá takzvaná superkritická fluidní extrakce, kdy dochází k převedení rozpouštědla do superkritického stavu (za teploty od 25°C do 200°C a tlaku 7-60 MPa) Výhodou jsou malé spotřeby rozpouštědla a vysoká účinnost, nevýhodou je zejména značná instrumentální náročnost metody.
•
Čištění: V tomto kroku se potřebujeme zbavit nežádoucích příměsí, které by mohly následně ovlivňovat výsledky detekce. Provádí se ve fázi kapalina-kapalina (dnes již málo používané), kapalina-pevná látka nebo imunoafinní. V současnosti se nejčastěji používají imunoafinní kolonky (prostupné gely, na které jsou specificky ukotveny
25
protilátky proti aflatoxinu). Principem je imunologická reakce antigen + protilátka (Mrkvicová, 2007). Extrakt proteče přes kolonku a nežádoucí látky jsou vymyty (Šimůnek, 2004). Následně je kolonka promyta rozpouštědlem, které zruší vazbu mykotoxin-protilátka. Nevýhodou této metody je poměrně vysoká cena kolonek, většinou pouze na jedno použití. Jako velká výhoda se jeví především rychlost reakce a malá spotřeba rozpouštědel. •
Detekce: Dělí se na kvalitativní, semikvantitativní a kvantitativní. Používané metody jsou fyzikálně-chemické a biologické.
5.1.1 Fyzikálně-chemické metody: chromatografie 1) Sloupcová chromatografie Látka, která zde působí jako sorbent, je obsažena ve sloupci obklopeném trubicí z vyhovujícího materiálu. Tato metoda je dnes již používaná spíše k přečišťování vzorků než k celkovému stanovení. 2) Tenkovrstvá chromatografie (TLC) Na povrchu odpovídajícího nosiče dochází ke vzlínání směsi rozpustidel v tenké vrstvě použitého sorbentu. Po nanesení vzorku postupně dochází k přechodu rozpouštědla přes vzorek a jednotlivé složky jsou takto unášeny po vrstvě sorbentu různou rychlostí. Další analýzu látek je možno provést buď přímo, pod UV nebo postřikem vhodného chemického činidla, jež vzorek vizualizuje. Výhodou TLC je její odolnost vůči balastním látkám, vzorek nemusí být tak důkladně přečištěn. Z toho vyplývají rovněž menší ztráty při čištění i možnost důkladnějšího studia vlastní látky. Nevýhodou se jeví především horší a méně přesná kvantifikace metody (chyba 5 – 10%). 3) Vysokoúčinná tenkovrstvá chromatografie (HPTLC) Používají se malé speciální desky s velmi jemným sorbentem. 4) Vysokoúčinná kapalinová chromatografie (HPLC) Při této metodě se využívají drobné kolonky ve spojení s pumpou, kterou přes ně dochází k protlačování unášecí soustavy. Po průchodu látky přes kolonku se její detekce provádí většinou na základě fyzikálních vlastností roztoku (absorpce viditelného, infračerveného nebo ultrafialového světla). Speciálně pro aflatoxiny se používá takzvaná packed flow cell, což je kyveta z křemenného skla naplněná silikagelem. Ten zesiluje fluorescenci a tím také vzrůstá citlivost dané metody detekce.
26
Nespornou výhodou metody je tedy zejména její kvantifikace s vysokou přesností. Nevýhodou je poměrná materiální náročnost, nákladnost a případné ztráty při čištění. V souvislosti se studií sledující obsah zearalenonu a aflatoxinů v pícninách (Ježková a kol., 2007) byla ke stanovení aflatoxinů metodou HPLC použita kolonka Hypersil ODS ve spojení s mobilní fází skládající se z vody:metanolu:acetonitrilu v poměru 63:26:11 s průtokem nastaveným na 0,3 ml/min. Experiment byl proveden při laboratorní teplotě a detekce byla dokončena pomocí hmotnostního detektoru (MS). 5.1.2 Biologické metody (Šimůnek, 2004) Z těchto metod jsou nejpoužívanější metody RIA a ELISA založené na principu imunitní reakce námi sledované látky s protilátkou. Mykotoxiny působí jako hapteny, to znamená, že vyvolají tvorbu protilátek po navázání na vhodný nosič, kterým může být například bílkovina. Protilátky vhodné pro tuto reakci získáváme buď přímo ze séra imunizovaného zvířete, nebo jako takzvané monoklonální protilátky (všechny jsou produkovány z jedné buňky a pro jejich výrobu se používá B lymfocytů z imunizovaného zvířete, které fúzují s vhodnou nádorovou nebo leukemickou buňkou, poté splynou a vzniká takzvaná „nesmrtelná“ buňka, jež se neomezeně dělí a produkuje protilátky). Výhodou použití metody ELISA je snadné odečítání vzorku (měření intenzity zbarvení fotometricky). Problémem zůstávají hlavně falešně pozitivní výsledky (u aflatoxinu B1 může dojít ke zkřížené reakci vanilinem nebo mezi aflatoxiny navzájem) •
Mikrobiologické metody (Ostrý a Škarková, 2003) Pro stanovení aflatoxigenních druhů mikromycet jsou uplatňovány především metody
založené na: 1) Rozpoznání morfologických znaků hub potenciálně toxigenních druhů (makrohabitus a mikrohabitus hub druhu Aspergillus flavus, Aspergillus parasiticus, případně dalších aflatoxigenních druhů) Aspergillus flavus tvoří rychle rostoucí, žlutozelené kolonie, často tvoří sklerocia zpočátku nahnědlá, později mohou být černá. Mikroskopicky lze rozpoznat jak biseriátní, tak i uniseriátní konidiofory s bradavčitou stopkou a kulovitým měchýřkem. Konidiální hlavice jsou typicky paprsčité, konidie kulovité, hrubě bradavčité, v průměru 3,6 µm. Jemu blízký Aspergillus parasiticus má výrazněji ostnité kolonie.
27
Obrázek
č.
7:
Aspergillus
flavus
kolonie
(převzato
z
http://botany.natur.cuni.cz/pdf/kubatova/3.04%20Eurotiales-Asp%20sekce%20Flavi.pdf):
Obrázek č. 8: Aspergillus flavus, konidiofor, skanovací elektronový mikroskop (SEM), (převzato z http://www.denniskunkel.com/product_info.php?products_id=1199):
Obrázek č. 9: Mikrohabitus rodu Aspergillus, Ostrý a Škarková, 2003:
28
2) Identifikaci pomocí fyziologických znaků (specifický růst na Czapkově agaru při 42°C dobrý především u hub druhů Aspergillus flavus a Aspergillus parasiticus, slabší u hub druhu Aspergillus nominus) 3) Využití biochemických znaků (pigmenty na diagnostických médiích pro aflatoxiny) Kultivační metoda průkazu mikromycet druhu Aspergillus flavus a Aspergillus parasiticus se provádí na médiu vyvinutém již roku 1974 Bothastem a Fennellem, jehož tehdejší složení bylo následující: 1% kvasničního extraktu, 1,5% tryptonu, 0,5% chloridu železitého. Doporučená inkubace 3 dny při 28°C. Dále do tohoto média přidali Hamsa a Ayes (1977) streptomycin a dichloran a doba inkubace se prodloužila na 5 dní při teplotě 28°C. Později bylo složení média upraveno Kingem a kol. a Pittem a kol. v letech 1979 a 1983, čímž se doba inkubace výrazně snížila na 42-48 hodin při 30°C. Dnešnímu složení odpovídají dvě obdobná média: Aspergillus Differentiation Medium Base (ADMB), jež se skládá z 20g kvasničného extraktu, 10g peptonu, 0,5g citranu železito-amonného, 0,002g dichloranu (2,6-dichloro-4nitroanilin), 0,1g chloramfenikolu, 15g agaru a 1000ml destilované vody. Barva média je jantarová až čirá, pH 6,3±0,2 (4,55% vodný roztok živné půdy), skladovatelnost se doporučuje po dobu 4 týdnů při 2-8°C a vzorek se na toto médium může aplikovat: •
na Petriho misce s živnou půdou roztěrem 0,1 ml naředěného vzorku
•
na Petriho misce s živnou půdou vzorek izolovaného kmene jehlou namočenou do suspenze z konidií izolátu a polotuhého agaru
•
přímo část testovaného vzorku na Petriho misku s živnou půdou
Inkubuje se po dobu 48-72 hodin při 30°C. Poté se provede odečtení výsledku, přičemž pozitivní reakce se projeví oranžovo-žlutým (chromově žlutým) pigmentem pozorovatelným na spodní straně kolonií (viz. Obrázek č. 10) (ten je způsoben reakcí kyseliny aspergilové produkované aflatoxigenními kmeny s železitými ionty, jenž jsou součástí daného média).
29
Obrázek č. 10: Specifický růst Aspergillus flavus na ADMB médiu (Ostrý a Škarková, 2003):
Aspergillus flavus a Aspergillus parasiticus agar (AFPA) je médium, které obsahuje 20g kvasničného extraktu, 10g peptonu, 0,5g citranu železito-amonného, 0,002g dichloranu (2,6-dichloro-4-nitroanilin), 0,1g chloramfenikolu, 15g agaru a 1000ml destilované vody. Platí téměř stejné podmínky pro skladovatelnost a inokulaci, pouze inkubace může být kratší, a to 42-48 hodin při 30°C. Přítomnost aflatoxigenních kmenů se projevuje stejně jako v předcházejícím případě (viz. obrázek č. 11) .
Obrázek č. 11: Specifický růst Aspergillus flavus na AFPA médiu (Ostrý a Škarková, 2004):
•
Molekulárně-biologické metody, např. polymerázová řetězová reakce (PCR) Při polymerázové řetězové reakci se využívá především detekce genů kódujících
enzymy podílející se na biosyntéze aflatoxinů (například specifického genu apa-2) (Malíř a kol., 2003).
30
5.2 Stanovení toxigenity Pro stanovování toxigenity (schopnosti produkovat aflatoxiny) daného druhu mikromycety se využívá vhodných substrátů, na kterých je tento druh houby schopen toxin produkovat. Nejznámějšími metodami jsou: a) testování izolovaného kmene vláknitých hub na karlovarských sucharech •
postup: 10g sterilních sucharů se rozdrtí a na Petriho misce se zalije 5ml suspenze testovaného kmene; kultivace 14 dní, 26°C; k vyhodnocení se využívají metody chromatografické (např. HPLC) nebo imunochemické (ELISA)
b) testování izolovaného kmene na syntetickém živném médiu (např. YES médium = Yeast Extract Agar, který je připraven smícháním 20g kvasničného extraktu, 150g sacharózy, 20g agaru, 1ml Cu-Zn koncentrátu a 1000ml destilované vody) •
postup: médium se očkuje suspenzí kmene určeného k testování; kultivace 14 dní, 30°C; zpracování a vyhodnocení pomocí chromatografických nebo imunochemických metod
c) přímé testování potraviny •
postup: vzorek potraviny, ze které byl izolován potenciálně toxigenní kmen, se umístí na Petriho misku, upraví se jeho vodní aktivita zvlhčením na hodnotu aw zhruba 0,85 (příznivá pro produkci aflatoxinů); kultivace 14 dní, 26°C; vyhodnocení za pomoci chromatografických či imunochemických metod
5.3 Povolené limity aflatoxinů v České republice Jelikož je Česká republika od 1. května 2004 členem Evropské unie, platí u nás následující směrnice týkající se obsahu aflatoxinů v potravinách. Za nejnovější nařízení týkající se tohoto tématu, které uvádí Úřední věstník Evropské unie, je považováno Nařízení Komise (ES) č. 1881/2006 ze dne 19. prosince 2006, kterým se stanoví maximální limity některých kontaminujících látek v potravinách a také Nařízení Komise (ES) č. 2174/2003 ze dne 12. prosince 2003, kterým se mění nařízení (ES) č. 466/2001, pokud jde o aflatoxiny. Použití těchto dvou směrnic shrnuje následující tabulka pro maximální povolené limity těchto toxinů v potravinách.
31
Tabulka č. 2: Maximální limity pro aflatoxiny v potravinách Produkt
Maximální limit pro aflatoxiny (μg/kg) B1
Suma B1, B2, G1
M1
a G2 Jádra podzemnice olejné,
2,0
4,0
-
8,0
15,0
-
5,0
10,0
-
2,0
4,0
-
2,0
4,0
-
skořápkové plody, sušené ovoce a z nich zpracované výrobky určené k přímé lidské spotřebě nebo pro použití jako potravinová složka Jádra podzemnice olejné, které mají být před použitím k lidské spotřebě nebo před použitím jako potravinová složka vytříděny nebo jinak fyzikálně ošetřeny Skořápkové plody a sušené ovoce, které mají být před použitím k lidské spotřebě nebo před použitím jako potravinová složka vytříděny nebo jinak fyzikálně ošetřeny Obiloviny (včetně pohanky, Fagopyrum sp.) a z nich zpracované výrobky určené k přímé lidské spotřebě nebo pro použití jako potravinová složka Obiloviny (včetně pohanky, Fagopyrum sp.), kromě kukuřice, které mají být před použitím k lidské spotřebě nebo před použitím jako potravinová složka vytříděny nebo jinak
32
fyzikálně ošetřeny Kukuřice, která má být před
5,0
10,0
-
5,0
10,0
-
2,0
4,0
-
-
-
0,050
5,0
10,0
-
0,10
-
-
-
-
0,025
použitím k lidské spotřebě nebo před použitím jako potravinová složka vytříděna nebo jinak fyzikálně ošetřena Sušené ovoce, jež má být před použitím k lidské spotřebě či jako potravinová složka tříděno nebo jinak fyzikálně ošetřeno Sušené ovoce a výrobky z něj zpracované určené k přímé lidské spotřebě nebo pro použití jako potravinová složka Syrové mléko, tepelně ošetřené mléko a mléko pro výrobu mléčných výrobků Následující druhy koření: Capsicum spp. (sušené plody, celé nebo mleté, včetně chilli, mletého chilli, kayenského pepře a papriky) Piper spp. (plody, včetně bílého a černého pepře) Myristica fragrans (muškátový oříšek) Zingiber officinale (zázvor) Curcuma longa (kurkuma) Obilné příkrmy a ostatní příkrmy určené pro kojence a malé děti (maximální limit se vztahuje na sušinu) Počáteční a pokračovací
33
kojenecká výživa, včetně počátečního a pokračovacího mléka pro kojence Dietní potraviny pro zvláštní
0,10
-
0,025
léčebné účely určené speciálně pro kojence (maximální limit se v případě mléka a mléčných výrobků vztahuje na výrobky připravené k použití, prodávané jako takové nebo rekonstituované podle pokynů výrobce a v případě jiných produktů než mléka a mléčných výrobků se vztahují na sušinu) Pozn. Maximální limity se použijí na tu část jader podzemnice olejné, skořápkových plodů a sušeného ovoce, která je určena ke spotřebě. Jestliže se analyzují skořápkové plody, při výpočtu obsahu aflatoxinů se předpokládá, že se všechny kontaminující látky nacházejí v té části, která je určena ke spotřebě. V České republice, členském státu Evropské unie platí též Směrnice č. 32/2002/ES, která stanovuje maximální povolené množství aflatoxinu B1 v krmivech (Mrkvicová, 2007). Směrnice pro další druhy toxinů bohužel nejsou zatím k dispozici. Tabulka č. 3: Směrnice Evropského parlamentu a Rady 2002/32/ES ze dne 7. května 2002 o nežádoucích látkách v krmivech: Nežádoucí látka
Produkty určené ke krmení Maximální obsah v mg/kg zvířat
(ppm) v krmivu s 12% obsahem vlhkosti
Aflatoxin B1
Všechny krmné suroviny
0,02
Kompletní krmiva pro skot,
0,02
ovce a kozy, s výjimkou: — kompletních krmiv pro
0,005
zvířata chovaná pro mléko
34
— kompletních krmiv pro
0,01
telata a jehňata Kompletní krmiva pro
0,02
prasata a drůbež (kromě mladých zvířat) Ostatní kompletní krmiva
0,01
Doplňková krmiva pro
0,02
skot, ovce a kozy (kromě doplňkových krmiv pro zvířata chovaná pro mléko, telata a jehňata) Doplňková krmiva pro
0,02
prasata a drůbež (kromě mladých zvířat) Ostatní doplňková krmiva
0,005
Tabulka č. 4: Doporučené limity aflatoxinů v krmivu (Suchý a Herzig; 2004): Pstruzi
0,1 µg/kg
Mladá drůbež a bažanti
2,0 µg/kg
Zvířata březí a v laktaci
10,0 µg/kg
Prasata ve výkrmu a drůbež
20,0 µg/kg
Ovce a skot ve výkrmu
50,0 µg/kg
6. Dekontaminace a detoxikace aflatoxinů Ve studii Malíře a Ostrého (2004) zabývající se zejména problematikou suchých skořápkových plodů jsou k dekontaminaci a detoxikaci těchto komodit doporučovány následující postupy: 1) Metody fyzikálně separační a) Mechanická separace - principem je jednoduše oddělení plesnivých či jinak poškozených plodů od nepoškozených. Separaci lze provést:
čištěním
tříděním
ručním vytřiďováním
35
elektronickým tříděním (v některých případech snížilo celkovou koncentraci aflatoxinů v potravině až o 80-90%)
tříděním podle velikosti jader (bylo zjištěno, že malé plody obsahují 20-40% celkového množství aflatoxinů)
odstraněním barevně změněných, seschlých či poškozených plodů
b) Třídění dle měrné hmotnosti
metoda floatace (čištění provzdušňováním, kdy vzduch je pouštěn přes kapalinu a usazuje se na částicích kapalinou nesmáčených, které pak vynáší na hladinu). Biologicky poškozené plody se tudíž vznáší ve vodě. U pistácií takto došlo k poklesu obsahu aflatoxinů až o 70%, nutné je však kvalitní opětovné vysušení.
c) Suché mletí
použito u kukuřice, rýže, pšenice (pokles obsahu aflatoxinů až o 47%)
d) Mokré mletí
zejména v případě dekontaminace obilí
2) Metody fyzikální dekontaminace Především díky své složité chemické struktuře je fyzikální dekontaminace aflatoxinů obtížná. Používají se především následující metody: a) Inaktivace teplem
vzhledem k termostabilitě aflatoxinů se využívá pražení s využitím mikrovlnného ohřevu, které koncentraci aflatoxinů snižuje (v některých případech pokles obsahu toxinů od 45 do 83%), je však poměrně nákladným způsobem
b) Využití záření
účinkovalo pouze v případě střídavé aplikace krátkovlnného a dlouhovlnného UV záření, bohužel však došlo ke zvýšení mutagenity aflatoxinů
dle Suchého a Herziga (2004) dochází po použití UV záření také k nežádoucí destrukci živin v krmivu
c) Adsorpce z roztoků a kovalentní/nekovalentní vazba (Malíř a Ostrý, 2004)
speciální materiály – aktivní uhlí, aluminosilikáty v kontaminované vodné suspenzi tvoří vazbu s aflatoxinem, a tak snížil jeho využitelnost. Došlo tedy až k odstranění akutní aflatoxikózy u dobytka a též
36
k poklesu reziduí (aflatoxinu M1) v mléce. Bohužel pro svůj protisrážlivý účinek byla metoda zakázána.
další syntetické zeolity, minerální jíly, krmná aditiva (např. hlinitokřemičitany), které toxiny z krmiva izolují, omezují absorpci a trávení zvířetem, bohužel často snižují biologickou hodnotu krmiva (Suchý a Herzig, 2004)
3) Biologická dekontaminace (Malíř a Ostrý, 2004) a) testuje se metoda využití netoxigenního kmene ke snížení produkce aflatoxinů kmeny toxigenních hub b) některé kvasinky a plísně mohou aflatoxiny modifikovat c) bakterie rodu Flavobacterium auranticum odstraňuje aflatoxiny z tekutého média, bylo prokázáno již i odstranění aflatoxinu B1 z kontaminovaného arašídového mléka d) některé bakteriální kultury (například Lactobacillus rhamnosus) částečně vážou aflatoxiny (Suchý a Herzig, 2004) 4) Chemická inaktivace (Malíř a Ostrý, 2004) a) Metoda čpavkování
čpavek má schopnost ovlivnit toxicitu aflatoxinů v potravinách
nejúčinnější při vysokém tlaku a teplotě: čpavek v koncentraci 0,5-2%, vlhkost 12-16%, tlak 44-55 psi (1 psi = 14,504⋅10-5 Pa), teplota 80-100°C, doba působení 20-60 minut
při využití plynného čpavku nebo hydroxidu amonného pokles obsahu aflatoxinů až o 99%
sloučeniny vzniklé po reakci mají minimální nebo žádný vliv na zdraví zvířat krmených krmivem ošetřeným čpavkem, i když ještě obsahuje zbytky aflatoxinů (více než 90% konvertovaných toxinů se v tomto případě vyloučilo močí, pouze 0,25 - 1,6% aflatoxinů bylo identifikováno v mléce)
b) Metoda inaktivace kyselým siřičitanem sodným
reaguje s aflatoxiny B1, G1, M1 za tvorby ve vodě rozpustných sloučenin
c) Ozonizace
ve vodném roztoku detoxikuje aflatoxiny B1, B2, G1, G2
rozkládá se na kyslík
5) Podpoření detoxikačních procesů (Suchý a Herzig, 2004) a) doporučuje se podávat o 30-40% vyšší přísun metioninu b) zajistit vyšší obsah antioxidantů v krmivu (vitamín A, E, kyselina askorbová) 37
7. Diskuze Domnívám se, že aflatoxinům a všeobecně také dalším novým druhům mykotoxinů bude třeba věnovat nadále minimálně stejnou míru pozornosti jako nyní. Zjistila jsem, že toto téma je stále aktuální (jen během psaní mé práce došlo k zadržení několika kontaminovaných zásilek potravin na hranicích České republiky). Také díky změnám klimatu se může i v naší republice stávat, že výskyt aflatoxinů bude častější (díky zvyšujícím se průměrným teplotám, které vytváří lepší prostředí pro rozvoj toxigenních vláknitých hub) a bude nutné vyvíjet nové metody jak předcházet napadení, zabránit množení vláknitých hub v potravinách a krmivech, případně jak odstranit toxiny z již napadených produktů. Budoucnost preventivních opatření se bude jistě ubírat metodami genetiky a molekulární biologie (například šlechtění geneticky upravených odrůd rostlin odolných vůči houbovým chorobám). Bude ovšem velmi důležité poskytnout informace týkající se této problematiky i širší veřejnosti, aby nezaujala k těmto metodám odmítavý postoj. Již ze studie Sweeneyho a Dobsona (1998) je zřejmé, že metodami molekulární biologie byla objasněna biosyntetická dráha aflatoxinů a geny, které se do ní zapojují. Proto je zřejmé, že také detekce aflatoxinů se v budoucnu bude pravděpodobně více rozvíjet i metodami molekulární biologie a ke klasickým mikrobiologickým metodám se připojí častěji například detekce genů, které nesou pouze aflatoxigenní druhy mikromycet. V neposlední řadě bude důležité věnovat pozornost metodám dekontaminace napadených
potravin,
která
je
zejména
kvůli
vysoké odolnosti
aflatoxinů
velmi
problematická. Také vzhledem k možnému znehodnocení potravin například chemickými metodami by bylo vhodnější využívat přirozených biologických či méně náročných fyzikálních metod dekontaminace.
38
8. Závěr Ve své práci, jak již název napovídá, jsem se zabývala jednou z nejvýznamnějších skupin mykotoxinů, aflatoxiny. V jednotlivých kapitolách jsem uvedla charakteristiku dosud známých druhů aflatoxinů a jejich výskyt v rozmanitých druzích potravin a krmiv. V kapitole zabývající se významností těchto toxinů jsem zahrnula jak oblast humánní, tak veterinární a uvedla jsem nejdůležitější onemocnění, která aflatoxiny způsobují nebo u kterých jsou jedním z možných agens. Dále jsem do této práce zařadila několik informací týkajících se stanovování obsahu aflatoxinů v potravinách a krmivech a také legislativu, která povoluje maximální limity těchto toxinů v potravinách a krmivech v České republice. Na závěr jsem se pokusila nastínit také metody, jimiž se provádí dekontaminace již napadených produktů, která je často velmi důležitá, ale také velmi obtížně proveditelná.
39
9. Seznam použité literatury:
Amla I., Kamala C. S., Gopalakrishna G. S., Jayaraj A. P., Screenivasamurthy V., Parpia H. A. B. (1971): Cirrhosis in children from peanut meal contaminated by aflatoxin, Am. J. Clin. Nutr., 24, str. 609 – 614
Bennett J. W., Klich M. (2003): Mycotoxins, Clin. Microbiol. Rev., 16, str. 499 – 500
Betina V. (1990): Mykotoxíny-chémia-biológia-ekológia, Vydavateľstvo ALFA Bratislava, str. 26 – 36, 39 – 51, 55 – 64, 66 – 70, 97 – 106
Betina V. (1994): Bioactive secondary metabolites of microorganisms, ELSEVIER, str. 23 – 27, 153 – 156
Gorman D. P., Kang M. S. (1991): Preharvest Aflatoxin Contamination in Maize: Resistance and Genetics, Plant Breeding, 107, str. 1 – 8
Ježková A., Dohnal V., Skládanka J. (2007): Sledování obsahu zearalenonu a aflatoxinů v pícninách, 8. vedecká konferencia doktorandov a mladých vedeckých pracovníkov, 6. 4. 2007, FVP UFK Nitra, str. 246 – 248
Malíř F., Ostrý V., Bárta I., Buchta V., Dvořáčková I., Paříková J., Severa J., Škarková J. (2003): Vláknité mikromycety (plísně), mykotoxiny a zdraví člověka, Národní centrum ošetřovatelských a nelékařských zdravotnických oborů v Brně, str. 28 – 58, 92, 105 – 112, 143, 148 – 156, 161 – 216, 259 – 330
Malíř F., Ostrý V. (2004): Stanovisko vědeckého výboru pro potraviny ve věci: Snížení obsahu aflatoxinů v suchých skořápkových plodech (zejména pistáciích a burských oříšcích), Vědecký výbor pro potraviny v Brně, str. 4 – 5, 7 – 11
Mrkvicová M. (2007): Stanovení ochratoxinu A, deoxynivalenolu, zearalenonu, aflatoxinů a fumonisinů metodou HPLC nebo LC/MS/MS v krmivech, Ústřední kontrolní a zkušební ústav zemědělský, Národní referenční laboratoř, Bulletin 2007, XI, str. 12 – 16
40
Nařízení Komise (ES) č. 401/2006 ze dne 23. února 2006, kterým se stanoví metody odběru vzorků a metody analýzy pro úřední kontrolu množství mykotoxinů v potravinách, Úřední věstník Evropské unie, L70, str. 12 – 15, 30
Nařízení Komise (ES) č.1881/2006 ze dne 19. prosince 2006, kterým se stanoví maximální limity některých kontaminujících látek v potravinách, Úřední věstník Evropské unie, L364, str. 5 – 16
Nařízení Komise (ES) č. 2174/2003 ze dne 12. prosince 2003, kterým se mění nařízení (ES) č. 466/2001, pokud jde o aflatoxiny, Úřední věstník Evropské unie 15/sv. 7, L326/12, str. 678 – 681
Ostrý V. (1998): Vláknité mikroskopické houby (plísně), mykotoxiny a zdraví člověka, Státní zdravotní ústav v Praze, str. 13
Ostrý V., Ruprich J., Überhuberová M. (1997): Metodický návod pro dekontaminaci a rozklad vybraných mykotoxinů v laboratořích, Příloha č. 5/1997 k Acta hygienica, epidemiologica et microbiologica, str. 65 - 76
Ostrý V., Škarková J. (2003): Metodické doporučení mikrobiologickému zkoušení potravin a pokrmů, Kultivační metoda průkazu aflatoxigenních mikromycetů (plísní) Aspergillus flavus a Aspergillus parasiticus v potravinách a pokrmech, Acta hygienica, epidemiologica et microbiologica, 1, str. 5 – 7, 10 - 18
Pier A. C. (1992): Major biological consequences of aflatoxicosis in animal production, J. Anim. Sci. , 70, str. 3965
Probst C., Njapau H., Cotty P. J. (2007): Outbreak of an Acute Aflatoxicosis in Kenya in 2004: Identification of the Casual Agent, Appl. Environ. Microbiol., 77, str. 2762
Směrnice Evropského parlamentu a rady 2002/32/ES ze dne 7. května 2002 o nežádoucích látkách a krmivech, Úřední věstník Evropské unie, L14, str. 11
41
Suchý P., Herzig I. (2004): Plísně a mykotoxiny, Prevence jejich vzniku a dekontaminace v krmivech, Vědecký výbor výživy zvířat, Brno, str. 3 – 8, 16 – 20, 23 – 24
Sweeney M. J., Dobson A. D. W. (1998): Rewiev, Mycotoxin production by Aspergillus, Fusarium and Penicillium species, Int. J. Food Microbiol., 43, str. 141 – 143
Šimůnek J. (2004): Plísně a mykotoxiny, str. 1 – 3, 15, 18 – 21, 24 – 31, 47 – 50, 59 – 65
Rada V. (2004): Mikrobiální rizika krmiv, Vědecký výbor výživy zvířat, Praha, str. 22 – 23
Rozhodnutí Komise ze dne 12. července 2006, kterým se stanoví zvláštní podmínky pro dovoz některých potravin z vybraných třetích zemí vzhledem k riziku jejich kontaminace aflatoxiny, Úřední věstník Evropské unie, L199, str. 21 - 22
Wada K., Hashiba Y., Ohtsuka H., Kohiruimaki M., Masui M., Kawamura S., Endo H., Ogata Y. (2008): Effects of Mycotoxins on Mitogen-Stimulated Proliferation of Bovine Peripheral Blood Mononuclear Cells, J. Vet. Med. Sci., 70/2, str. 194 - 195
42
