Masarykova univerzita v Brně Přírodovědecká fakulta Ústav experimentální biologie Oddělení mikrobiologie Houbové chitinázy v životním prostředí

Masarykova univerzita v Brně Přírodovědecká fakulta Ústav experimentální biologie Oddělení mikrobiologie

Houbové chitinázy v životním prostředí (Bakalářská práce studijního programu Biologie, oboru Obecná biologie – směr Mikrobiologie)

Pavla Lerchová Brno 2009

Děkuji Ing. Martinu Krskovi, CSc., za poskytnutí potřebných zdrojů a za cenné rady při zpracovávání práce. Prohlašuji, že jsem bakalářskou práci zpracovala sama s využitím uvedených zdrojů.

Obsah 1. Úvod...................................................................................................................................2 2. Cíl práce............................................................................................................................ 3 3. Chitin................................................................................................................................. 4 3.1 Vlastnosti chitinu....................................................................................................... 4 3.2 Výskyt chitinu............................................................................................................ 5 4. Chitinázy a jejich fyziologické funkce............................................................................6 4.1 Vlastnosti chitináz...................................................................................................... 6 4.2 Stanovení chitinolytické aktivity................................................................................7 4.3 Organismy produkující chitinázy............................................................................... 7 4.4 Význam chitináz v přírodě......................................................................................... 7 4.5 Houbové chitinázy..................................................................................................... 8 4.5.1 Vlastnosti houbových chitináz.......................................................................... 8 4.5.2 Funkce houbových chitináz.............................................................................. 9 4.5.3 Významní houboví producenti chitináz............................................................ 10 4.5.4 Regulace exprese houbových chitináz.............................................................. 15 4.6 Chitinázy kódované viry............................................................................................ 18 4.7 Bakteriální chitinázy.................................................................................................. 18 4.8 Rostlinné chitinázy.....................................................................................................18 4.9 Chitinázy dalších živočichů....................................................................................... 19 4.10 Chitinázy člověka.....................................................................................................19 5. Využití houbových chitináz............................................................................................. 21 5.1 Biologická kontrola.................................................................................................... 21 5.1.1 Mykoparazitické houby.....................................................................................22 5.1.2 Nematofágní houby........................................................................................... 24 5.1.3 Entomofágní houby........................................................................................... 26 5.2 Průmyslová produkce chitináz a transgenní organismy.............................................27 5.3 Zpracování chitinózního odpadu............................................................................... 29 5.3.1 Využití chitinu a jeho derivátů.......................................................................... 30 6. Diskuze.............................................................................................................................. 33 7. Závěr................................................................................................................................. 35 8. Seznam literatury............................................................................................................. 36

1

1. Úvod Chitinázy jsou enzymy, hydrolyticky rozkládající nejhojnější v přírodě se vyskytující aminopolysacharid, chitin. Ten je součástí hub, exoskeletu hmyzu i korýšů, je obsažen ve vajíčcích nematod a radule měkkýšů a v dalších strukturách různých organismů. Tyto organismy produkují také chitinolytické enzymy. Chitinázy jsou ale produkovány i řadou dalších organismů, jako jsou rostliny, bakterie, viry a také savci včetně člověka. Chitinázy mají morfogenetickou roli (v organismech obsahujících chitin), dále se účastní parazitismu, mají nutriční význam a plní také obranné funkce. Příkladem obranných funkcí jsou rostlinné i lidské chitinázy, které chrání svého producenta před napadením houbami či nematody. Parazitická funkce je typická pro mykoparazitické a nematocidní mikromycety. Významným zástupcem této skupiny je Trichoderma harzianum. Houbové chitinázy jsou využitelné v některých oblastech lidské činnosti: v biologické kontrole škůdců zemědělských plodin, v produkci krmných směsí z chitinózního odpadu korýšů i ve zpracování chitinu, jehož deriváty, nebo deriváty chitosanu, jsou využívány v lékařství ke krytí ran či hemostáze. Chitooligosaccharidy mají i významné imunomodulační schopnosti.

2

2. Cíl práce Cílem práce je shrnout dostupné poznatky o výskytu chitinolytických enzymů hub, jejich významu pro producenta a další organismy a také zhodnotit možné využití chitinolytických enzymů v různých oblastech lidské činnosti.

3

3. Chitin 3.1 Vlastnosti chitinu Chitin

je

nejrozšířenějším

aminopolysacharidem

a

po

celulóze

je

druhým

nejrozšířenějším polysacharidem na Zemi. Je tvořen jednotkami N-acetylglukosaminu spojenými vazbou β-1,4 (obr. 1) (Gortari a Hours 2008, Duo-Chuan 2006). Hmotnost polysacharidových molekul chitinu může být až 106 Da. Kromě molekulové hmotnosti je molekula chitinu charakterizována stupněm deacetylace. Tyto dva parametry významně ovlivňují rozpustnost ve vodném roztoku a biologické vlastnosti chitinu.

Obr. 1: Struktura molekuly chitinu (převzato z: http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Chitin.svg)

Jednotlivé řetězce chitinu jsou lineární (Tharanathan a Kittur 2003). Molekula chitinu se po syntéze spojuje s druhou pomocí vodíkových vazeb mezi -NH skupinami jedné a -C=O skupinami druhé molekuly. Tyto vazby přispívají k tvorbě mikrofibril. Fibrily jsou obvykle obklopeny proteinovou matricí a mají průměr mezi 2,5 do 2,8 nm. Krystalové modifikace chitinu se označují α-, β-, nebo γ-chitin. Liší se stupněm hydratace, velikostí elementárních buněk a počtem chitinových řetězců v elementární buňce. Nejčastěji se vyskytuje ve formě α, ve které jsou řetězce uspořádány antiparalelně. β-chitin je tvořen paralelními řetězci chitinu. γ-chitin je tvořen 3 řetězci, z nichž jeden je antiparalelní k druhým dvěma (Gortari a Hours 2008). Chitin je syntetizován z jednotek uridindifosfo-N-acetylglukosaminu za účasti enzymu chitin syntetázy. Chitin je u většiny organismů asociován s dalšími makromolekulami.

4

Reaguje například s aminokyselinami a peptidy a vytváří stabilní komplexy, odolnější zejména ke změnám pH (Tharanathan a Kittur 2003).

3.2 Výskyt chitinu Chitin byl objeven v roce 1811 ve stopkatých houbách. Je přítomen ve schránkách řady mnohobuněčných živočichů a také ve strukturách některých jednobuněčných organismů. Chitin přispívá k mechanické pevnosti struktur, které jej obsahují. S výjimkou nižších hub, v jejichž buněčné stěně převažuje glukan a celulóza, je chitin hlavní komponentou buněčné stěny hub (Tharanathan a Kittur 2003). V Saccharomyces cerevisiae jsou krátká chitinová vlákna přítomna v primárním septu, pravděpodobně jako jediná komponenta. Přítomnost chitinu a dalších polysacharidů může být jedním z kritérií taxonomie hub. Chitin je přítomný také v buněčné stěně řas (zlativky – Chrysophyceae, rozsivky – Bacillariophyceae) a améb (Gohel a kol. 2006, Gortari a Hours 2008, http://www.sci.muni.cz/botany/studium/nrrasy.htm). Je také součástí vnějších schránek a kutikuly korýšů a hmyzu, nematod a měkkýšů (Gortari a Hours 2008). Chitinózní struktury mnohobuněčných živočichů jsou většinou ektodermálního původu. Někdy je také chitin součástí výstelky vnitřních orgánů. V chitinózních strukturách chitin tvoří pouze výjimečně více než polovinu organické hmoty. Vysoké koncentrace chitinu, až 85 %, jsou přítomny v exoskeletu členovců. Schránky měkkýšů obvykle obsahují pouze malá množství chitinu (Gortari a Hours 2008, Tharanathan a Kittur 2003). Typické struktury organismů jsou většinou tvořeny určitou krystalovou strukturou chitinu. Nejčastější je α-chitin, který je typický pro buněčnou stěnu hub a exoskelet bezobratlých. β-chitin je přítomen ve výstelce trávicího ústrojí olihní (Loligo sp.), kokonech hmyzu (Cleopus sp., Cionus sp.) a rozsivkách. γ-chitin se vyskytuje v kokonech hmyzu i u Loligo sp., konkrétně v žaludeční sliznici (Gortari a Hours 2008).

5

4. Chitinázy a jejich fyziologické funkce 4.1 Vlastnosti chitináz Chitinázy jsou enzymy hydrolyticky rozkládající β-1,4-glykosidické vazby chitinu a chitooligosacharidů. Variabilita chitinových molekul (stupeň acetylace, uspořádání řetězce) vede k produkci rozdílných chitinolytických enzymů s rozdílnými substráty i produkty. Chitinázy patří mezi glykosylhydrolázy (Gooday 1999). Podle molekulární struktury se glykosylhydrolázy dělí do skupin 18, 19 a 20. Skupiny se od sebe odlišují aminokyselinovou sekvencí,

3D

strukturou

a

molekulárními

mechanismy

chitinolytické

reakce

(Duo-Chuan 2006). Chitinázy z 19. skupiny nejsou schopné hydrolyzovat některé modelové substráty, jako jsou 4-methylumbelliferyl glykosidy a jsou rezistentní k inhibici allosamidinem, inhibitorem chitináz ze skupiny 18 (Gooday 1999). Podle mechanismu působení se chitinázy dělí na endochitinázy a exochitinázy. Produktem působení endochitináz jsou rozpustné nízkomolekulární oligomery, jako je chitotetróza, chitotrióza a diacetylchitobióza. Exochitinázy je možné dále rozdělit do dvou kategorií:

chitobiosidázy

neredukujícího

konce

β-(1,4)-N-acetylglukosaminidázy.

a

oddělují

diacetylchitobiózu,

Chitobiosidázy

neuvolňují

jiné

od

sacharidy.

β-(1,4)-N-acetylglukosaminidázy neboli chitobiázy štěpí diacetylchitobiózu a vyšší polymery včetně chitotriózy a chitotetrózy na monomery N-acetylglukosaminu. Díky své široké substrátové specifitě je tento enzym nazýván také jako β-(1,4)-N-acetylhexosaminidáza (Duo-Chuan 2006). Podle enzymatické nomenklatury jsou chitinolytické enzymy zastoupeny zejména ve skupině EC 3.2.1.14 a ve skupině EC 3.2.1.52. Klasifikace enzymů se dynamicky vyvíjí, dříve byly některé chitinázy zařazeny do dalších skupin, např. EC 3.2.1.29, EC 3.2.1.30 (Duo-Chuan 2006, http://www.brenda-enzymes.org/). Chitinolytickou

aktivitu

má

i

lysozym

(EC

3.2.1.17)

a

další

enzymy

(http://www.brenda-enzymes.org/). Většina chitinolytických organismů má několik isoforem těchto enzymů, které mohou vznikat postranslačními změnami (glykosylace, proteolýza) nebo jako produkty různých genů. Deacetylace chitinu je katalyzována chitosanázou (Gortari a Hours 2008).

6

4.2 Stanovení chitinolytické aktivity Chitinolytická aktivita roztoku se měří chromogenně s využitím p-nitrofenolových derivátů, jako je p-nitrofenyl-N-acetylglukosamin a jeho oligomery. Tyto substráty jsou depolymerizovány chitinázami a uvolněný p-nitrofenol je spektrofotometricky kvantifikován (Duo-Chuan 2006, Krokeide a kol. 2007). Chitinolytická aktivita může být stanovena také ze snížení viskozity suspenze chitinu nebo měřena podle množství redukujících cukrů uvolněných z chitinu působením chitináz. Redukující cukry přemění ionty Cu2+ na Cu+, ty jsou vyvázány neocuproinem (derivát fenantrolinu) a vzniká oranžový komplex. Opět se tedy využívá spektrofotometrie (Vullo 2006). Chitinázy je možné detekovat elektroforeticky využitím SDS-PAGE, elektroforézy na polyakrylamidovém gelu za přítomnosti dodecylsulfátu sodného. Přítomnost chitináz na gelu je detekována fluorescenčně po enzymatické hydrolýze oligosacharidů N-acetylglukosaminu s navázaným 4-methylumbelliferonem, který po uvolnění v UV záření fluoreskuje. Purifikace chitináz je možná např. chromatografickými metodami. Chitinázy jsou charakterizovány molekulovou hmotností, izoelektrickým bodem, optimálním pH a teplotou, termostabilitou, inhibitory a antifungální aktivitou (Duo-Chuan 2006).

4.3 Organismy produkující chitinázy Chitinázy jsou produkovány jak organismy obsahujícími chitin, tak organismy bez obsahu chitinu. Produkují je bakterie, řasy, houby, rostliny, hmyz, nematoda, členovci, měkkýši, obratlovci včetně člověka a také některé viry (Gooday 1999). Chitinázy 18. skupiny se vyskytují v bakteriích, houbách, virech, rostlinách a zvířatech. Zástupci 19. skupiny se téměř výlučně vyskytují u rostlin, výjimkou je enzym přítomný u Streptomyces griseus. Do 20. skupiny patří β-N-acetylhexosaminidázy bakterií, hub a lidí. Na základě struktury a aminokyselinové sekvence se chitinázy dělí na další podskupiny. Bakteriální chitinázy se dělí na 3 hlavní podskupiny, A, B a C. Rostlinné chitinázy se dělí na 5 tříd (Duo-Chuan 2006).

4.4 Význam chitináz v přírodě Chitinázy jsou produkovány patogeny a predátory chitinózních organismů, ale produkují je také hostitelé chitinózních patogenů, mají tedy jak agresivní, tak obrannou funkci (Gooday 1999). V patogenezi chitinázy jednak umožňují penetraci do hostitelského organismu, jednak získávají potravu ve formě aminocukrů nebo umožňují získat jiný materiál 7

hostitele pro další enzymatické zpracování. U bakterií je nejvýznamnější výživa, parizitismus a recyklace chitinu v prostředí, zatímco u hub, protozoí a bezobratlých mají funkci i v morfogenezi. U vyšších organismů mají obrannou funkci (Gortari a Hours 2008). V půdě je chitin obsažen v koncentracích do několika desetin procent. Vysoká aktivita mikrobiálních chitináz umožňuje mobilizaci uhlíku a dusíku z chitinu (Manucharova a kol. 2005). Chitinázy se účastní i interakcí mezi symbionty u arbuskulární mykorrhizy (Gortari a Hours 2008).

4.5 Houbové chitinázy 4.5.1 Vlastnosti houbových chitináz Všechny houby obsahující chitin jako hlavní strukturní součást buněčné stěny produkují chitinázy (Gortari a Hours 2008). Chitinolytické houby produkují obvykle více než jeden typ chitinázy. Většina houbových endochitináz a chitobiosidáz jsou jednoduché polypeptidy, zatímco N-acetylglukosaminidázy bývají dimerní. Molekulová hmotnost houbových chitináz dosahuje od 27 do 190 kDa a pI 3-8. Optimální pH se nejčastěji pohybuje mezi 4-7 a teplota mezi 20-40 ºC. Chitinázy Thermomyces lanuginosus má optimální katalytickou aktivitu při 55 ºC a Talaromyces emersonii má nejvyšší aktivitu při 65 ºC. Inhibitorem houbových chitináz je allosamidin nebo demethylallosamidin, produkovaný zástupci rodu Streptomyces. Většina houbových chitináz je součástí 18. skupiny, pro kterou je typická multidoménová struktura (obr. 2). Houbové chitinázy 18. skupiny jsou tvořeny 5 doménami: N-terminální signální oblastí, katalytickou doménou, oblastí bohatou na serin/threonin, chitinbinding doménou a C-terminálním prodlouženým koncem. Katalytická doména, zodpovědná za hydrolýzu substrátu, zahrnuje N-terminální polovinu enzymu. Signální peptid ovlivňuje sekreci enzymu a při transportu membránou je odstřižen peptidázami. Chitinázy bez signálního peptidu jsou intracelulární enzymy a pravděpodobně se účastní morfogeneze. Oblast bohatá na serin/threonin je obvykle posttranslačně glykosylována. Glykosylace může být významná pro sekreci proteinu a zajištění stability. Chitin-binding doména ukotvuje enzym k buněčné stěně nebo substrátu. Funkce C-terminální oblasti není známá. U některých hub bylo zjištěno, že C-terminální oblast má funkci glykosyl-fosfosfatidylinositolové (GPI) kotvy, připevňující enzymy k buněčným strukturám. Většině houbových chitináz ale poslední 3 domény chybí.

8

a) b) c)

Obr. 2: Houbové chitinázy 18. skupiny: a) S. cerevisiae CTS1, b) Rhizopus oligosporus CHI1, c) T. harzianum CHIT33. 1: signální oblast, 2: katalytická doména, 3: oblast bohatá na serin/threonin, 4: chitin-binding doména, 5: C-terminální oblast (upraveno podle Duo-Chuan 2006).

β-N-acetylglukosaminidázy jsou tvořeny signálním peptidem, propeptidem, zincinu podobnou doménou, katalytickou doménou a C-terminální oblastí. Na základě podobnosti s rostlinnými nebo bakteriálními chitinázami můžeme houbové chitinázy 18. skupiny rozdělit na 2 skupiny: houbové/bakteriální chitinázy podobné třídě V a houbové/rostlinné chitinázy podobné III. třídě. Každá houbová/rostlinná chitináza obsahuje doménu bohatou na serin/threonin a pravděpodobný úsek GPI a úsek pro sestřih (Duo-Chuan 2006). Genomy vláknitých hub nejčastěji obsahují mezi 10 a 25 různými chitinázami. Tato skupina genů se tedy v průběhu evoluce vyvíjela velmi dynamicky. Vývoj tolika enzymů v rámci jedné genové skupiny nebo podskupiny můžeme považovat za výsledek toho, že přítomnost těchto genů byla pro druh výhodou v průběhu evoluce. Vznik rozdílných genů je pravděpodobně podmíněn rozdíly ve stavbě bunečné stěny a rozmnožování, růstovými modely, různým způsobem získávání potravy a antagonistickým působením mezi druhy. Počet genů pro chitinázy v rámci jednoho druhu může odrážet funkční rozdíly mezi příbuznými proteiny (Gortari a Hours 2008).

4.5.2 Funkce houbových chitináz Chitinázy se účastní růstu buněčné stěny u hub, u kterých je přítomen chitin. Buněčná stěna hub je zodpovědná za mechanickou pevnost buněk. Stěna hub je komplexní struktura tvořená chitinem, 1,3-β- a 1,6-β-glukany, mannanem a proteiny, které jsou vzájemně zesíťovány. Přesné složení stěny se mezi jednotlivými druhy hub značně liší (Sahai a Manocha 2003). U kvasinek tvoří chitin pouze 1 % sušiny buněčné stěny, jako odpověď na

9

stres může ale buněčná stěna obsahovat dočasně až 20 % chitinu (Šilhánková 2002, Smits a kol. 2001). Struktura buněk vláknitých hub je téměř totožná s kvasinkami, významně se ale liší buněčná stěna, ve které jsou chitin a chitosan hlavními polysacharidy a jsou doprovázené glukany, mannany, polysacharidy galaktosaminu, fukózy a rhamnózy (Šilhánková 2002). Buněčná stěna je dynamická struktura, zejména ve fázích buněčného dělení, růstu a morfogeneze. Konkrétními příklady jsou germinace spor, větvení hyf nebo tvorba septa u vláknitých hub, u kvasinek je to růst buňky a pučení. Této dynamičnosti je dosaženo díky souhře působení hydrolytických enzymů, zejména chitináz a glukanáz, a chitin syntetizujících enzymů. Řada chitináz a glukanáz má i transglykosylační aktivitu, mohou tedy přispívat k rozkladu i tvorbě vazeb mezi polymery buněčné stěny (Adams 2004). Růst je pak výsledkem rovnováhy mezi působením enzymů účastnících se syntézy (chitin syntetáza, EC 2.4.1.16) a lýzy chitinu (chitinázy). Lytické enzymy uvolňují v buněčné stěně místo pro inzerci nového materiálu nebo růst intususcepcí (Sahai a Manocha 2003). Při nedostatku potravy může houba degradovat část buněčné stěny, tedy i chitin (Gortari a Hours 2008). Chitinolytické houby se často společně s chitinolytickými bakteriemi vyskytují v půdě. Často se vyskytují zejména Mucorales (Mortierella), Deuteromycota a Ascomycota (Aspergillus, Trichoderma, Verticillium, Thielavia, Penicillium, Humicola) (Duo-Chuan 2006). Chitinázy se účastní kolonizace kořenů rostlin u arbuskulárních mykorrhizních hub. První kompletní seznam chitinolytických enzymů založený na sekvenování genomu byl znám u Trichoderma reesei. Bylo zjištěno nejméně 18 otevřených čtecích rámců kódujících pravděpodobné chitinázy (Gortari a Hours 2008). Označování konkrétních houbových chitináz se různí. Označení chitinázy může obsahovat informaci o molekulové hmotnosti enzymu, ale také může vyjadřovat pořadí objevené chitinázy nebo seřazení chitináz podle vlastností, např. pI. Příkladem je gen pro chitinázu identifikovaný z rodu Trichoderma, označovaný jako chi18-5 nebo ech42 (Seidl a kol. 2005).

4.5.3 Významní houboví producenti chitináz V následující kapitole je uveden souhrn několika houbových producentů chitináz a je popsán význam chitináz pro buňku mikromycet. Pro taxonomické zařazení do řádů a uvedení různých názvů teleomorfních a anamorfních forem byla využita databáze GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/). 10

Pro pochopení morfogenetického významu chitináz Saccharomyces cerevisiae (Saccharomycetales) uvádím stručný popis procesu pučení. Před vytvořením pupenu je na místě jeho vytvoření uložen prstenec chitinu, který zabraňuje rozšíření kanálku spojujícího mateřskou a dceřinou buňku v průběhu pučení. Po pučení jsou na povrchu stěny kvasinek přítomny jizvy tvaru prstenců (obr. 3). Jizva zrodu, neobsahující chitin, zůstala v místě dřívějšího spojení s mateřskou buňkou. Na mateřské buňce zůstává chitinový prstenec, který zpevňoval kanálek (Šilhánková 2002, Smits a kol. 2001). Ve fázi apikálního růstu pupenu jsou polysacharidy buněčné stěny ukládány zejména na vrcholu pupenu, když pupen doroste velikosti přibližně dvou třetin mateřské buňky, materiál buněčné stěny je rozmístěn po celém povrchu pupenu (Smits a kol. 2001). Kanálek se uzavře nejdříve invaginací cytoplazmatické membrány. Poté je centripetálně vytvořeno působením chitin syntetázy Chs2p chitinózní primární septum, na obou stranách tohoto septa je následně vytvořeno sekundární septum a primární septum je odbouráno chitinolytickým enzymem. U kvasinek je za tento krok zodpovědná pouze jedna endochitináza s molekulovou hmotností asi 130 kDa. Chitináza je nekovalentně vázaná v buněčné stěně, je vysoce glykosylovaná. Tato chitináza je kódována genem CTS1, který je transkribován v G1 fázi buněčného cyklu a je regulován transkripčním faktorem Ace2p. Mutace v genu CTS1 nebo působení inhibitoru chitináz vedou k defektům v dělení buňky, včetně pseudohyfálního růstu. U kmenů, které jsou schopné pseudohyfálního růstu, je chitinázová aktivita mnohem menší než u kmenů bez této schopnosti (Adams 2004, Smits a kol. 2001). Endochitináza S. cerevisiae CTS1 má 4 domény, postrádá C-terminální konec. Chitin-binding doména Cts1p může mít roli v lokalizaci enzymu v buněčné stěně. V chitinbinding doméně Cts1p je konzervativní motiv šesti cysteinů, zřejmě udávající terciární strukturu pomocí vytvoření disulfidových můstků. V S. cerevisiae byl identifikován gen CTS2. Narušení genu CTS2 vede k tvorbě abnormální buněčné stěny spor a neschopnosti vytvořit funkční vřecko, je tedy významný pro produkci spor (Duo-Chuan 2006). Pro vysoký obsah glukanů v buněčné stěně kvasinek mají významnou roli i glukanázy (Adams 2004).

11

Obr. 3: Pučící Saccharomyces cerevisiae (upraveno podle http://www.kaeberleinlab.org/projects.html) U druhu Candida albicans (Saccharomycetales) byly identifikovány geny CHT1, CHT2 a CHT3. CHT1 kóduje 42 kDa protein, který může odpovídat 45 kDa chitináze izolované z tohoto organismu. CHT2 a CHT3 kódují proteiny s molekulovou hmotností 61 kDa. Aminokyselinové sekvence Cht2p a Cht3p jsou shodné z 36 % a z 36-8 % shodné s Cts1p S. cerevisiae. Transkripce z CHT2 a CHT3 je u C. albicans větší v průběhu jednobuněčné fáze v porovnání s myceliální fází. CHT2 pravděpodobně kóduje protein významný v oddělení buněk, podobně jako Cts1p S. cerevisiae. U Cht2p a Cht3p nebyla zjištěna C-terminální chitin-binding doména. Chitináza Cht2p C. albicans může být s buněčnou membránou nebo stěnou spojena GPI (Adams 2004). Killer toxin Kluyveromyces lactis (Saccharomycetales) je trimerní glykoprotein kódovaný plazmidem k1. Je to trimerní protein složený z jednotek α, β a γ. Jeho toxicita proti jiným kvasinkám je zřejmě spjata s exochitinázovou aktivitou. Podjednotka γ je toxická pro S. cerevisiae. Podjednotka α má exochitinázovou aktivitu, ve dvou oblastech se sekvencemi podobá jiným chitinázám. Jedna oblast se podobá katalytické doméně chitináz ze skupiny 18, druhá vazebné doméně skupiny 19. Význam chitinázové aktivity tohoto toxinu může být v interakci s povrchem buňky vnímavých kvasinek. Kvasinkové buňky, které chitin neobsahují, nejsou k toxinu vnímavé (Gooday 1999). Další chitinázou K. lactis je KICts1p, endochitináza kódovaná jadernou DNA. Její součástí je i serin/threonin doména a chitin-binding doména s šesti cysteiny, stejně jako u Cts1p S. cerevisiae. Účastní se dělení buněk (Duo-Chuan 2006). Plazmidem je kódován i další killer toxin s chitinolytickou aktivitou, přítomný u druhu Pichia acaciae (Saccharomycetales) (Gooday 1999).

12

V genomu Schizosaccharomyces pombe (Schizosaccharomycetales) je přítomen pouze 1 gen pro chitinázu z 18. skupiny (Gortari a Hours 2008). Jednotlivé druhy Trichoderma sp. (Hypocreales), vláknité houby vyskytující se v půdě, produkují množství chitináz. Jedním z nejlépe prozkoumaných druhů je Trichoderma harzianum (obr. 4). Můžeme se také setkat s názvem Hypocrea lixii, což je teleomorfní stadium tohoto druhu. V textu budu používat označení anamorfy, se kterým se v literatuře setkáme častěji. T.

harzianum

může

produkovat

nejméně

7

různých

chitináz:

2

N-

acetylglukosaminidázy, 4 endochitinázy a 1 chitobiosidázu. 33 kDa endochitináze T. harzianum chybí serin/threoninová doména, chitin-binding doména a C-terminální oblast. Chitinázy CHIT33, CHIT37 a CHIT42 T. harzianum mají synergickou funkci při degradaci buněčné stěny (Duo-Chuan 2006, Hoella a kol. 2005). Chitin-binding doména chitináz Chi18-13 a Chi18-16 T. reesei má značnou podobnost s houbovou cellulose-binding doménou (Duo-Chuan 2006). Ech30, endochitináza T. artroviridis P1 je nejmenší chitinázou tohoto kmenu. Nebyla u něj zjištěna antifungální aktivita. Působí odlišně od jiné, aminokyselinovou sekvencí velmi podobné, endochitinázy hevaminu. Tyto dvě chitinázy se i přes vzájemnou podobnost váží na molekulu oligochitosacharidu v odlišném místě (Hoella a kol. 2005). Chitinázy rodu Trichoderma jsou příbuzné chitinázám Gibberella zeae (Hypocreales), předpokládá se tedy společný evoluční vývoj (Seidl a kol. 2005).

Obr. 4: Mycelium Trichoderma harzianum (upraveno podle http://www.mycolog.com/CHAP4a.htm)

13

T. harzianum se při kontaktu s hostitelem ovine okolo hostitelské hyfy a vytvoří struktury, které pomohou proniknout do buněčné stěny hostitele. V penetraci i trávení hostitelského materiálu hrají chitinázy významnou roli (Duo-Chuan 2006). Mykoparazitismu se pravděpodobně účastní geny chi18-13, chi18-14 a chi18-16. Některé chitinázy rodu Trichoderma se podobají killer-toxinům kvasinek, tato podoba může mít funkci v penetraci strukturami hostitele (Seidl a kol. 2005). Inhibiční aktivitu vůči dalším houbovým organismům vykazují i purifikované enzymy. Chitinázy T. harzianum jsou efektivnější proti jiným druhům hub v porovnání s chitinázami rostlin a jiných mikroorganismů (Duo-Chuan 2006). Rod Trichoderma kromě chitináz a dalších enzymů produkuje látky s antibiotickou aktivitou, tzv. peptaiboly, což jsou peptidy obsahující neobvyklé aminokyseliny. Peptaiboly narušují tvorbu buněčné stěny a pozměňují permeabilitu membrán tím, že vytvářejí iontové kanály (Omero a kol. 2004, Benedett a kol. 1982). Gen Coccidioides immitis (Onygenales, obr. 5) kódující chitinázu Cts1p se exprimuje zejména v průběhu tvorby endospor. In vitro je obsah proteinu Cts1p v této fázi 100násobně větší než v jiných vývojových fázích (Thomas a Cole 1999). Mutace v genu pro Cts1p chitinázu C. immitis nemá vliv na fenotyp. Je možné, že ztráta tohoto enzymu je nahrazena funkcí podobných proteinů, nebo tento enzym nemá funkci v morfogenezi, ale v utilizaci exogenního chitinu jako zdroje výživy (Duo-Chuan 2006).

Obr. 5: Arthrokonidie mikromycety Coccidioides immitis (upraveno podle http://commons.wikimedia. org/wiki/File:Arthroconidia_of_Coccidioides_immitis_39G0040_lores.jpg)

14

Houbové/bakteriální chitinázy Aspergillus sp. (Eurotiales) dosahují hmotnosti přibližně 46-48 kDa. Narušení genu kódujícího chitinázu ChiB1p (A. fumigatus) neovlivňuje fenotyp. Molekulová hmotnost houbových/rostlinných chitináz Aspergillus sp. je výrazně větší: 83-97 kDa. Tento typ chitináz může mít funkci v růstu a morfogenezi. A. fumigatus má nejméně 21 ORF kódujících chitinázy. Mutace v genu kódujícího chitinázu ChiA v A. nidulans (Emericella nidulans) vede k méně častému klíčení spor a nižšímu růstu hyf. Použití inhibitoru chitináz inhibuje fragmentaci hyf při tvorbě arthrokonidií. Narušení nagA genu Aspergillus nidulans vede k horšímu růstu na médiu obsahujícím chitobiózu, ale neovlivňuje fenotyp, tento gen je tedy významný zejména pro získání potravy v nutričně chudém prostředí (Duo-Chuan 2006, Adams 2004). Talaromyces flavus (Eurotiales) produkuje nejméně 2 chitinázy. Z Beauveria bassiana (Cordyceps bassiana, Hypocreales) a Metarhizium anisopliae (Hypocreales) byly purifikovány N-acetylglukosaminidáza, endochitináza a exochitináza. Metarhizium anisopliae produkuje nejméně 6 rozdílných chitináz. Tyto chitinázy se svým působením vzájemně doplňují. Chitinázy I a II druhu Rhizopus oligosporus (Mucorales) mají 5 domén. V katalytické doméně jsou 2 vysoce konzervované oblasti, označované jako SxGG a DxxDxDxE. Serin/threonin doména a chitin-binding doména jsou přítomny v chitináze I a II z Rhizopus oligosporus. U vláknité houby Rhizopus oligosporus se chi3 účastní prodlužování hyfy. N-acetyl-β-glukosaminidáza dimorfní houby Benjaminiella poitrasii (Mucorales) je významná pro přeměnu kvasinkové fáze na mycelium (Duo-Chuan 2006). Morfologická funkce chitináz byla zjištěna i u druhu Acremonium chrysogenum (Sordariomycetes), u kterého specifické inhibitory chitináz inhibují fragmentaci hyf v arthrokonidia. Není ale narušena produkce antimikrobiálních cefalosporinů (Sándor a kol. 2006). Chitinázy jsou produkovány i druhem Pythium oligandrum, houbám příbuznou oomycetou

(říše

Chromista)

(Madsen

a

de

Neergaard

1999,

http://www.sci.muni.cz/botany/studium/nr-rasy.htm).

4.5.4 Regulace exprese houbových chitináz Regulace genové exprese chitináz probíhá na základě kontaktu se substráty a produkty chitinolytické reakce. Dále jsou chitinázy regulovány stresem, vzájemným působením, u parazitů i kontaktem s hostitelem. Na regulaci houbových chitináz se podílí i posttranskripční regulace - sestřih mRNA a degradace exprimovaných enzymů. 15

Regulace substrátem V houbách pěstovaných na médiu obsahujícím chitin jsou indukovány chitinolytické enzymy. V represor-induktorovém regulačním systému houbových chitináz vystupuje chitin a produkty jeho degradace jako induktory, zatímco glukóza a snadno metabolizovatelné zdroje uhlíku jako represory. Geny chit36, chit33 a nag1, kódující chitinázy T. harzianum, jsou indukovány buněčnou stěnou hub nebo koloidním chitinem a nedostatkem zdrojů uhlíku. Gen ech42 není zřejmě indukován chitinem, ale pouze nedostatkem uhlíku. Vysoké koncentrace glukózy a glycerolu vedou k inhibici exprese. chit33 je indukován N-acetylglukosaminem. Exprese nag1 je narozdíl

od

ech42

indukována

nízkomolekulárními

chitooligosaccharidy

a

N-

acetylglukosaminem. N-acetylglukosaminidáza T. harzianum je produkována konstitutivně i při růstu v médiu bohatém na glukózu. Výsledkem působení N-acetylglukosaminidázy je uvolňování Nacetylglukosaminu, který indukuje expresi nag1. V promotoru nag1 jsou regulační elementy CCCCT a CCAGN13CTGG, ovlivňující inducibilitu pomocí N-acetylglukosaminu. Gen chit33 T. harzianum je silně reprimován glukózou. Při nedostatku potravy je gen chit33 silně přepisován do mRNA, ale chitinázová aktivita tomu neodpovídá, dochází tedy k posttranskripční regulaci nebo rozkladu CHIT33. Naopak u chit42 je množství mRNA a proteinu stejné. Proteinový produkt regulačního genu creA/cre1 je negativní transkripční faktor, reprimující v přítomnosti glukózy produkci chitináz.

Vzájemná regulace Chitinázy se regulují také navzájem. Aktivita chitináz může být regulována i sekrecí (Duo-Chuan 2006). Po pučení je na dceřiné buňce patrná kruhová jizva v místě, kde byl degradován chitin, zatímco na mateřské buňce zůstává prstenec chitinu. Základem této asymetrie je indukce genů v dceřiné buňce: genů kódujících Cts1p chitinázu, Eng1p glukanázu a 3 další glukanázy. Transkripční faktor Ace2p, přítomný v jádru dceřiné buňky, reguluje řadu genů včetně Cts1p. Přítomnost Ace2p je dána působením Cbk1p kinázy a proteinu Mob2 (Adams 2004). Exprese eng1 glukanázy Schizosaccharomyces pombe je regulována proteinem podobným Ace2p (Gortari a Hours 2008, Adams 2004). Na regulaci hydroláz buněčné stěny S. cerevisiae se kromě Cbk1b podílejí i další kinázy, např. proteinkináza C. Mutant v genu PKC pro proteinkinázu C má značně 16

redukované množství glukanu v buněčné stěně, zatímco množství glukanázy Bgl2p je trojnásobně větší oproti divokému typu. Narušením genu BGL2 v kvasinkách mutantních v genu PKC1 nedošlo ke zvýšení odolnosti kvasinek, proteinkináza C se tedy zřejmě podílí kromě BGL2 i na regulaci dalších mechanismů metabolismu buněčné stěny. Expresi Exg1p glukanázy regulují Pbs2p kináza, Ptc1p fosfatáza v signální dráze MAP kinázy. Gen ech42 T. harzianum je indukován v průběhu germinace spory. U vláknitých hub jsou významnými regulátory buněčné morfogeneze a proliferace Cbk1p a příbuzné serin/threonin proteinkinázy. COT1 gen Neurospora crassa kóduje regulační protein této skupiny, který je nezbytný pro růst. Organismy mutantní v COT1 jsou citlivé na teplotu a jejich růst je pomalejší. Přímá spojitost regulačních kináz a fosfatáz a exprese lytických enzymů důležitých v morfogenezi a růstu ale zatím nebyla u vláknitých hub prokázána (Adams 2004).

Stres Předpokládá se, že regulace stresem je nejvýznamnějším faktorem v regulaci genové exprese chitináz rodu Trichoderma. Transkripce ech42 T. harzianum je indukována nízkou teplotou a vysokým osmotickým tlakem a nutričním stresem. V promotoru ech42 jsou 4 pravděpodobné elementy odpovídající na stres (CCCCT). Podobné elementy jsou zaznamenány i u nag 1, chit33 a chitináz S. cerevisiae. V promotoru ech42 byl dále identifikován Br1A-like „cis-acting“ element, účastnící se regulace při nedostatku potravy. Chit33 je indukován vysokou teplotou (Gortari a Hours 2008, Duo-Chuan 2006).

Kontakt s hostitelem Chitinázy mykoparazitických hub jsou indukovány také interakcí s hostitelem, např. přímým kontaktem s lektiny na buněčném povrchu hostitele. Příkladem indukce kontaktem s hostitelem jsou ech42 i chit33 T. harzianum, indukované při kontaktu s Botrytis cinerea. Exprese ech42 je podporována degradačními produkty buněčné stěny fytopatogena, jejichž vznik není podmíněn interakcí hostitele a parazita. Indukce je podpořena rozpustnými chitooligosacharidy vytvořenými konstitutivní CHIT42 a dalšími chitinolytickými enzymy. Geny chit33 a nag1 jsou exprimovány až po přímém kontaktu parazita a hostitele (Gortari a Hours 2008, Duo-Chuan 2006).

17

4.6 Chitinázy kódované viry Chitinázy jsou také kódovány některými viry, například virem nukleární polyhedrózy napadajícím severoamerické ploštice Autographa californica, a také viry zelených řas, jako je PBCV-1, napadající rod Chlorella. Geny kódující chitinázy tohoto viru se vysoce podobají mikrobiálním chitinázám (Gooday 1999).

4.7 Bakteriální chitinázy Chitinolytické bakterie mohou být patogeny hub a dalších organismů obsahujících chitin. Příkladem je Ewingella americana, napadající komerčně pěstované žampióny Agaricus bisporus. Druh Enterobacter agglomerans je zkoumán jako potenciální antifungální agens. Další zkoumanou bakterií je Serratia marcescens. Významným producentem je také rod Streptomyces (Gooday 1999, Gortari a Hours 2008). Chitinázy jsou také součástí enzymové výbavy rodu Bacillus (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/).

4.8 Rostlinné chitinázy Všechny rostliny produkují řadu chitináz, které se řadí do nejméně 4 strukturních skupin: třídy I, II a IV 19. skupiny a třídy III z 18. skupiny. Chitinázy patří mezi rostlinné enzymy spojené s patogenezí (Gooday 1999). Rostlinné chitinázy jsou častěji endochitinázy, jejich molekulová hmotnost se pohybuje nejčastěji kolem 30kDa. Jejich hlavní funkcí je ochrana před invazí patogenních hub (Sahai a Manocha 2003). Antifungální aktivita chitináz je podpořena β-glukanázami, dalšími enzymy ze skupiny enzymů spojených s patogenezí, které rozkládají vazby glukanů s chitinem buněčné stěny. Kromě přímé antifungální aktivity mají rostlinné chitinázy také nepřímou obrannou funkci: z chitinu hub uvolňují oligosacharidy, které mají schopnosti vyvolávat v rostlinách další reakce, jako je syntéza antifungálních fytoalexinů, indukce chitináz a indukce uvolňování K+ a Cl-, extracelulární alkalizace a syntéza peroxidu vodíku. Byl charakterizován i pravděpodobný receptor oligosacharidů, velmi citlivý k N-acetylchitooktóze. Některé rostlinné chitinázy jsou bifunkční, například chitinázy třídy III produkované Trichosanthes kirilowii, které inaktivují ribozom. Mají 28S rRNA N-glykosidázovou aktivitu (Gooday 1999). I houby, které chitin neobsahují, jako je Peronospora tabacina napadající tabák, podněcují tvorbu chitinázy v rostlině. Produkce chitináz je ale také někdy nespecifickou odpovědí rostliny při napadení viry, bakteriemi a při poranění a vystavení osmotickému stresu či ethylenu a dalším látkám. Některé rostlinné lysozymy mají vysokou chitinázovou aktivitu. 18

Chitinázy byly zjištěny také u řady zdravých vyšších rostlin, mají zřejmě roli v morfogenezi rostliny (Sahai a Manocha 2003). Chitinázy jsou přítomny ve vakuolách, v případě napadení rostliny jsou vyloučeny do apoplastického prostoru, jak bylo zjištěno např. u mrkve a fazole. Naopak v kultivovaných buňkách dýně a ječmene se nacházela chitináza v extracelulárním prostoru. Chitináza indukovaná v listech okurky patogenními viry, bakteriemi či houbami byla detekována v mezibuněčných prostorech. Bylo zjištěno, že v intercelulárním prostoru infikovaných rostlin jsou přítomny kyselé chitinázy, zatímco zásadité chitinázy se vyskytují v centrální vakuole a jsou indukovány ethylenem, a to jak exogenně dodaným, tak endogenně produkovaným rostlinou v reakci na houbovou infekci nebo ošetření látkami podporujícími jeho produkci. Ethylen se uplatňuje v regulaci transkripce genů pro chitinázu, jak bylo zjištěno u fazole. Přesto byla produkce chitináz možná i u rostlin napadených houbami a ošetřených inhibitorem ethylenu. Na regulaci produkce chitináz se podílejí i cytokinin, auxin a salicylová kyselina (Sahai a Manocha 2003).

4.9 Chitinázy dalších živočichů Chitinázy se vyskytují v hepatopankreatu korýšů (Mukhin a Novikov 2002). Byly zjištěny i ve slinách některých chobotnic, těmito slinami natravují chobotnice chitinózní struktury své kořisti, korýšů (Gooday 1999). Chitinázovou aktivitu má krev řady obratlovců. Chitinázy mají u těchto organismů zřejmě obrannou funkci. Přímá obranná funkce byla potvrzena u morčat infikovaných houbou Aspergillus fumigatus (Gooday 1999).

4.10 Chitinázy člověka U lidí byly chitinázy detekovány v séru a v granulocytech. Nejčastější lidskou chitinázou je chitotriosidáza, která byla poprvé detekována v plazmě lidí s Gaucherovou nemocí, což je vrozený deficit glukocerebrosidázy. Chitotriosidáza existuje ve 2 formách: jako 50kDa protein a jako 39kDa enzym, který je výsledkem posttranslačních úprav proteinu. Protein o hmotnosti 50 kDa sestává z C-terminální chitin-binding domény, spojovací oblasti a 39kDa N-terminální domény s chitinázovou aktivitou. Zdrojem chitotriosidázy jsou polymorfonukleární neutrofily a makrofágy. Enzym je uložen ve speciálních granulách polymorfonukleárů. V lysozymech makrofágů je přítomen enzym jako 50 kDa i 39 kDa, v plazmě pouze 50 kDa protein. Chitotriosidáza je secernována exocytózou při stimulaci GMCSF. GM-CSF indukuje také expresi chitotriosidázy v makrofázích, které enzym secernují 19

konstitutivně a částečně ho ukládají ve svých lysozymech. Chitotriosidáza má antifungální aktivitu, je tedy součástí nespecifické imunitní odpovědi. V některých etnických skupinách se vyskytuje inzerce 24 bp v exonu 10 genu pro chitotriosidázu, výsledkem je u homozygotů absence aktivního enzymu. Absence homozygotů i nosičů v subsaharské populaci je zřejmě způsobena významem funkčního enzymu v oblasti s vysokým výskytem různých parazitických onemocnění. Infekce Wuchereria bancrofti, filarióza, bývá spojena s deficitem chitotriosidázy (Gooday 1999, van Eijk a kol. 2005). Byl

potvrzen

inhibiční

účinek

chitotriosidázy

na

řadu

patogenních

hub,

u imunosuprimovaných myší docházelo po podání chitotriosidázy ke zlepšení stavu u systémových mykóz. Rekombinantní chitotriosidáza by se mohla využít k léčbě život ohrožujících mykóz. Využití chitotriosidázy se zdá bezpečné, protože pacienti s Gaucherovou nemocí dobře tolerují i 1000násobné zvýšení koncentrace enzymu (van Eijk a kol. 2005). Aktivita chitotriosidázy je také závislá na genetických predispozicích a zvyšuje se u kuřáků, což je zřejmě odpovědí na aktivaci makrofágů kouřem a také na přítomnost mikromycet v cigaretách. U nemocných astmatem se celková aktivita chitinázy snižuje (Seibold a kol. 2008). Deficit chitotriosidázy by mohl být částečně kompenzován přítomností další lidské chitinázy, AMCase (acidic mammalian chitinase). AMCase je více exprimována u pacientů s astmatem (van Eijk a kol. 2005). AMCase je produkována epiteliálními buňkami plic, makrofágy a eosinofily (Lee a kol. 2008). Kromě AMCase a chitotriosidázy byl u savců identifikován YKL-40 (chitinase-like protein), který se na chitin váže, ale nemá chitinolytickou aktivitu. Zvýšené hodnoty tohoto proteinu se vyskytují u některých patologických stavů (Thomas a Cole 1999).

20

5. Využití houbových chitináz

5.1 Biologická kontrola Kromě důležitých fyziologických funkcí mají houbové chitinázy široké pole potenciálního využití. Výzkum se v současné době zaměřuje na nahrazení části chemických látek, používaných v zemědělství na ochranu před škůdci a onemocněním rostlin. Důvody jsou zřejmé: vznik rezistence k některým látkám, znečištění životního prostředí a také rezidua toxických látek v potravinách. V této souvislosti je zkoumáno využití biologické kontroly – tedy interakcí mezi organismy, kdy dochází k poškození rostlinného patogena jiným organismem. Chitinolytické organismy se nabízejí pro využití v biologické kontrole chitinózních organismů, které vystupují jako patogeny rostlin a obratlovců, tedy organismů, které chitin neobsahují. Těmito patogeny jsou houby, hmyz a nematoda. Chitinázy rozkládají jejich vitální struktury: kutikuly a membrány hmyzu, buněčné stěny hub, vaječné obaly nematod. Chitinolytickou aktivitu mají entomopatogenní, mykoparazitické a nematofágní houby. Zdrojem chitináz mohou být divoké kmeny mikroorganismů, ale výnosnějším zdrojem jsou geneticky modifikované organismy (Gortari a Hours 2008, Yan a kol. 2008). Biologická kontrola může probíhat přímo nebo nepřímo. Jako přímou označujeme kompetici kontrolujícího agens a patogena o potravu nebo prostor, produkci antibiotických a lytických látek, inaktivaci enzymů patogena a parazitismus. Mechanismus kompetice o substrát můžeme sledovat u hub, kde jsou antagonista a patogen blízce příbuzní. Příkladem je kontrola patogenního rodu Fusarium nepatogenním zástupcem stejného rodu. Nepatogenní Fusarium vyžaduje stejný zdroj uhlíku a také kolonizuje stejná místa jako patogen. Dalším mechanismem je antibióza. Pro své antibiotické vlastnosti proti patogenům byly zkoumány rody Pseudomonas a Bacillus, ale také zástupci houbových organismů, Trichoderma a Gliocladium (Gohel a kol. 2006). Nepřímá kontrola probíhá změnou morfologických nebo biochemických vlastností hostitele. Indukovaná systémová odpověď zahrnuje proces aktivní rezistence hostitelské rostliny, kdy jsou fyzikální a chemické bariéry chránící před patogeny aktivovány kontaktem s živými i neživými faktory. Tato obrana zahrnuje produkci fenoloxidáz, peroxidáz, polyfenoloxidáz, glukanáz a chitináz. Dochází také k zesilování buněčné stěny kořenových epidermálních a kortikálních buněk a k vytváření ligninových a dalších bariér. Zvyšuje se

21

produkce fytoalexinů a exprese genů spojených se stresem (Gortari a Hours 2008, Gohel a kol. 2006). Chitinázy je možné využít i na sklizeném ovoci a zelenině. Největší ztráty na sklizených plodech způsobují právě houbové patogeny. Mezi biologické strategie využitelné na sklizených plodech patří indukce rezistence, využití přírodních produktů s fungicidním působením a aplikace antagonistických mikroorganismů (Yan a kol. 2008). Kromě zemědělství jsou principy biologické kontroly využívané i v lékařské kosmetice a v ochraně zdiva před napadením plísněmi (http://biopreparaty.cz). Přídavky chitinu v půdě zvyšují populace chitinolytických organismů v půdě a společně s tímto růstem se snižuje množství patogenních hub, hmyzu a nematod. Úspěšná aplikace chitináz je závislá na velikosti nákladů na výrobu preparátů (Gortari a Hours 2008). Komerční produkce biopesticidů vyžaduje dlouhodobou životaschopnost, vysokou toleranci ke změnám počasí a fyziologickému stresu spojenému s transportem, uchováváním a aplikací. Aplikace musí být snadná a ekonomicky dostupná. Formulace prostředků s chitinolytickými organismy vyžaduje, aby v průběhu skladování byly organismy inaktivní a imobilní, ale po aplikaci na cílové místo se musí metabolické procesy rychle obnovit. Nejjednodušším řešením je využití spor u sporulujících organismů. Často je při výrobě biopesticidů používána lyofilizace. Organismy mohou být suspendovány v oleji, což zabraňuje přístupu kyslíku, a také enkapsulovány (Gohel a kol. 2006).

5.1.1 Mykoparazitické houby

Využití mykoparazitických hub v zemědělství Jako součást prostředků biologické kontroly jsou zkoumány následující rody mykoparazitů. Mykoparazit Trichoderma uvolňuje řadu enzymů, které poškozují patogenní houby. Na začátku infekce hostitelské houby produkuje Trichoderma zejména proteázy, které naruší první obrannou bariéru, proteinovou vrstvu, a tím usnadní přístup dalších enzymů, chitináz, k chitinu. Chitinázy lyzují chitin hyf, konidií, chlamydospor a sklerotií. Chitinázy rodu Trichoderma mají obecně silnější antifungální aktivitu než chitinázy rostlin i chitinázy z jiných zdrojů. Chitinázy rodu Trichoderma mohou dosahovat antifungální aktivity podobné některým chemickým fungicidům. Také spektrum rostlinných patogenů citlivých na chitinázy

22

je široké. T. harzianum napadá například buněčnou stěnu Crinipellis perniciosa, houby způsobující onemocnění kakaových bobů. Rod Paecilomyces kolonizuje sklerotia hub (Gortari a Hours 2008, Dahiya a Tewari 2005, Gohel a kol. 2006). Fusarium chlamydosporum, mykoparazit druhu Puccinia arachidis, který je původcem rzi u podzemnice olejné, inhibuje klíčení spor této houby. Tutéž houbu inhibují chitinázy Myrothecium verrucaria. Penicillium janthinellum napadá mycelia druhů Mucor plumbus a také Cladosporium cladosporoides, druh patogenní pro obiloviny a vyskytující se také na vlhkém zdivu (Dahiya a Tewari 2005). Chitinázy CHIT41 a CHIT 32 produkované Talaromyces flavus jsou schopné rozložit buněčnou stěnu Verticillium dahliae, Sclerotinia sclerotinium a Rhizoctonia solani. Inhibují také klíčení spor Alternaria alternata, Fusarium moniliforme a Magnaporthe grisea. Dalším mykoparazitickým rodem je Gliocladium (Duo-Chuan a kol. 2005). Škody na zemědělských plodinách ale nevznikají jen v průběhu růstu, ale také po sklizni. Řada patogenů infikuje plody přes poranění, která při sklizni vznikají. Při aplikaci chitináz na poranění na plodech mišpule umístěné v médiu s Botrytis cinerea byla houba inhibována po 3 dny, poté došlo k rychlému zvětšení lézí, pravděpodobně následkem deaktivace enzymů (Yan a kol. 2008). Plné nahrazení chemických fungicidů biologickými často není možné. Využívají se tedy kombinace biologických a chemických prostředků. Příkladem je využití T. harzianum v kombinaci s methylbromidem v kontrole Rhizoctonia solani a Fusarium solani na rostlinách tabáku, T. harzianum v kombinaci s fungicidem Captan v kontrole Verticillium dahliae na rostlinách lilku bramboru. T. virens v kombinaci s metalaxylem účinkuje proti infekci Pythium ultimum na bavlníku (Gohel a kol. 2006). Biokontrolní přípravky s obsahem mykoparazitických hub jsou registrované i v České republice, přehled přípravků využívaných v zemědělství uvádím v tabulce (Věstník státní rostlinolékařské správy 01/2009).

23

Tabulka č. 1: Přípravky obsahující mykoparazitické houby registrované v ČR (podle Věstníku státní rostlinolékařské správy 01/2009)

název přípravku

složení

kmen

koncentrace

Trichodex

Trichoderma harzianum

T-39

20 %

Supresivit Contans WG Polyversum

Trichoderma PV 5736-89 harzianum Coniothyrium minitans CON/M/91-08 Pythium oligandrum, oospory (říše Chromista)

spektrum Pythium, Phytophthora, Botryotinia, Rhizoctonia, Fusarium

14.109/g

Botrytis cinerea

100 g/kg

Sclerotinia sclerotium

106/g

Leptosphaeria maculans, Sclerotinia sclerotiorum

Působení mykoparazitických hub proti dermatofytům Principy biologické kontroly jsou využitelné i v léčbě infekčních onemocnění. Dermatofyty z rodů Trichophyton, Microsporum nebo Epidermophyton jsou častými původci onychomykózy u člověka. Nejčastějšími původci jsou T. rubrum, T. mentagrophytes a E. floccosum. S úspěchem bylo testováno mykoparazitické působení T. virens a T. harzianum na dermatofyty rodu Trichophyton. Na kulturách Trichophyton rubrum docházelo k částečné lýze hyf dermatofyta (Omero a kol. 2004). V České republice je rozšířené používání preparátů s obsahem tzv. chytré houby, oomycety Pythium oligandrum (http://biopreparaty.cz).

5.1.2 Nematofágní houby Parazitická nematoda napadají kořeny rostlin a ovlivňují jejich funkce ve prospěch svého vývoje a reprodukce. Například v Argentině způsobují ztráty od 30-100 % zemědělské produkce. Významní zástupci háďátek patří do rodů Meloidogyne a Nacobbus. Životní cyklus nematod obecně zahrnuje vajíčko, 4 juvenilní stadia a dospělce. Parazitická nematoda patří mezi geohelminty – část vývojových stádií žije v hostiteli, část volně v prostředí: vajíčka, larvy a cysty. V závislosti na taxonomickém zařazení se obal vajíčka skládá z jedné až pěti vrstev. Chitin-proteinový komplex ve středních vrstvách je zodpovědný za pevnost vajíčka. Nematofágní houby se dělí do 3 hlavních skupin: houby napadající dospělá stadia a houby napadající vajíčka nebo cysty. S nematody je spojeno asi 160 druhů a 70 rodů parazitických hub. Pouze několik z nich však bylo úspěšně použito v biologické kontrole. 24

První objevenou nematofágní houbou je Catenaria auxilliaris, parazitující na Heterodera schachtii. Často na třídě Nematoda parazitují rody Acremonium, Arthrobotrys, Aspergillus, Cylindrocarpon, Dactylella, Fusarium, Lecanicillium, Monacrosporium, Paecilomyces, Penicillium, Pochonia, Pyrenochaeta, Trichoderma a Verticillium. Pro své nematocidní účinky byly testovány zejména Pochonia chlamydosporia, Paecilomyces lilacinus a Verticillium chlamydosporium. Tyto houby žijí v půdě a mohou kolonizovat rhizosféru a kořeny. Byly využity v přípravě nematocidních preparátů. P. chlamydosporia je patogenní i pro houby a hmyz. U imunokomprimovaných pacientů byly zaznamenány oportunní infekce způsobené některými kmeny P. lilacinus. Nematoa entomofágní kmeny P. lilacinus jsou ale v zemědělství využitelné. Ve středu zájmu jsou kmeny parazitující na vajíčcích nematod, ale byly zaznamenány i kmeny parazitující na pohyblivých stadiích. Stavba vaječných obalů se mezi jednotlivými druhy nematod velmi liší. Nejčastěji má obal vajíčka 3 vrstvy. Vnitřní vrstva je tvořena lipidy, prostřední chitinem a vnější vrstvu tvoří žloutkový vak. Tyto vrstvy se začnou vytvářen ihned po oplození vajíčka. Lipidová vrstva, obsahující také proteiny, vytváří semipermeabilní membránu, umožňující přestup vody, hydrofobních látek malých iontů a plynů. Chitinová vrstva je obvykle nejsilnější, zajištuje pevnost. Chitin je zde tvořen mikrofibrilami o průměru 2,8 nm, uloženými v proteinové matrici. Obal vajíčka nematod je jediná struktura nematod, ve které byla dokázána přítomnost chitinu a patří mezi nejodolnější biologické struktury, což hraje důležitou roli v epidemiologii rostlinných, zvířecích i lidských onemocnění. Při napadení vajíčka nematofágní houbou dochází nejdříve k rozpoznání vajíčka a poté k adhezi a penetraci. Kolonizace vaječných obalů probíhá průnikem hyfy nebo vytvořením specializovaných orgánů, apresorií. Tyto struktury působí mechanicky i enzymaticky – uvolňováním proteáz, chitináz a lysozymu. V některých případech se mezi povrchem apresorií a vajíčkem vytvoří slizovitá vrstva, pravděpodobně usnadňující adhezi houby k vaječným obalům. Na poškození obalů se podílí mechanická síla, toxiny pozměňující fyziologické funkce a hydrolytické enzymy. Rozklad chitinu ve vaječném obalu může vyvolat předčasné vylíhnutí méně životaschopných jedinců. Charakterizovány byla chitináza CHI43 V. chlamydosporium (P. chlamydosporia) a V. suchlasporium (Pochonia rubescens). Tato chitináza je protein o hmotnosti 43 kDa. Efekt enzymů na vajíčko byl pomocí elektronové mikroskopie pozorován u druhu Globbodera pallida za působení purifikované CHI43 a proteázy P32. Působením chitinázy vznikaly na povrchu vajíčka jizvy, při použití proteázy došlo k mírnému 25

olupování povrchových vrstev vajíčka. Působením obou enzymů vznikaly jizvy a olupování bylo výraznější. Na druhu Meloidogyne javanica bylo testováno působení částečně purifikovaných proteáz a chitináz P. lilacinus. Při jednotlivé i kombinované aplikaci významně redukovaly embryogenezi a líhnutí. Při testování aktivity P. lilacinus z různých zdrojů proti Caenorhabditis elegans byly zaznamenány velké rozdíly ve virulenci. Dále byl zkoumán efekt purifikované chitinázy (LPCHI1) a proteázy (Ver112) na vývoj vajíček Meloidogyne incognita. Při použití obou enzymů se počet vylíhnutých jedinců snížil o 56,5 %. Opět došlo k nabobtnání struktur, vytvoření vakuol v chitinové vrstvě a částečné degradaci vaječných obalů. Nematocidní efektivita přirozeně se vyskytujících antagonistů je ovlivňována podmínkami prostředí (Gortari a Hours 2008).

5.1.3 Entomofágní houby Exoskeleton hmyzu je tvořen zejména chitinem a proteiny, dále také lipidy, katecholaminy a minerály. Entomopatogenním houbám, jako jsou Metarhizium anisopliae, Beauveria bassiana, Nomuraea riley a Aspergillus flavus, umožňují napadení hostitele právě chitinázy a proteázy (Kramer a Muthukrishnan 1997). Houby mohou také škodit na hmyzích vektorech lidských onemocnění. Např. hrubý lyzát Myrothecium verrucaria degraduje kutikulu prvního a čtvrtého instaru Aedes aegypti, který přenáší žlutou zimnici a horečku dengue. V případě, že purifikovaná chitináza M. verrucaria byla doplněna lipolytickými enzymy, se čas potřebný k zabití larválních stadií zkrátil až na polovinu, tedy na 24 hod oproti 48 při použití hrubého lyzátu. Naopak použití pouze purifikované chitinázy je neefektivní (Dahiya a Tewari 2005). V zemědělství je v EU povoleno používání přípravků s obsahem Paecilomyces lilacinus, P. fumosoroseus (obr. 6), Verticilium albo-atrum, Metarhizium anisopliae, Beauveria bassiana (obr. 7) a B. brongniartii (http://ec.europa.eu/sanco_pesticides/public/index.cfm).

26

2 1

Obr. 6: Myceliální síť entomofágní houby Paecilomyces na povrchu těla zavíječe voskového (Galleria mellonella: 1 – houbové mycelium, 2 – kutikula zavíječe ( upraveno podle http://home.zf.jcu.cz/public/departments/krv/rostlin/vyuka/clanky/agro.htm)

Obr. 7: Nosatec (parazit bavlníku) napadený Beauveria bassiana (upraveno podle http://www.inta.gov.ar/imyza/info/gal/picudo.htm)

5.2 Průmyslová produkce chitináz a transgenní organismy Biotechnologie umožňuje identifikaci a vývoj kmenů s vysokou produkcí požadovaných enzymů. V biotechnologii jsou vláknité houby často využívány. Jako producenti chitináz byly více zkoumány bakterie, ale i přes tuto skutečnost byla vybrána a je často využívána zejména Trichoderma harzianum, nejčastěji kmen 2413. Mikrobiální chitinázy jsou produkovány fermentačními procesy. Produkce chitináz je ovlivněna složením média, hlavně zdroji uhlíku a dusíku a fyzikálními faktory: aerací, pH a inkubační teplotou (Gortari a Hours 2008).

27

I když přirozeně se vyskytující organismy jsou bohatým zdrojem chitináz, genetická modifikace umožňuje efektivnější aplikaci v biotechnologiích. Obvykle je využívána mutageneze a selekce požadovaných kmenů. Mutageneze probíhá fyzikálními (UV a γ záření) nebo chemickými (EMS – ethylmetan sulfonát) faktory (Gohel a kol. 2006). Využití technologie rekombinantní DNA v průmyslu nabízí další možnosti. Molekulární biologie umožňuje zvýšení rezistence proti patogenům a také zvýšení antagonistické kapacity biokontrolních agens. U Trichoderma sp. je možné zvýšit aktivitu proti patogenním organismům pomocí genetické transformace (overexprese, konstitutivní exprese) nebo zvýšením lytické aktivity, což je možné zvýšením exprese genů kódujících hydrolytické enzymy, nebo konstrukcí hybridních enzymů s modifikovanou afinitou k substrátu (Gortari a Hours 2008). Transformací enzymů divokých kmenů vznikají chitinázy se silnějším biokontrolním působením. Chitinázy Chit42 a Chit33 T. harzianum CECT 2413 nemají substrát vázající doménu. Doplněním cellulose-binding domény z jiných enzymů (celobiohydrolázy II z T. reesei) byly vytvořeny transformované enzymy. Byly zaznamenány významné rozdíly v chitinolytické aktivitě enzymů bez a s touto doménou proti nerozpustné či krystalické formě chitinu, nejčastější formě chitinu v buněčné stěně hub. Přítomnost chitin-binding domény u S. cerevisiae nezvýšila hydrolýzu chitinu, ale obohacení chitinázy Chit42 T. harzianum o chitin-binding domény z chitinázy ChiA Nicotiana tabacum měla příznivý efekt (DuoChuan 2006, Limón a kol. 2004). Pomocí fermentačních procesů je možné při využití Pichia pastoris produkovat řadu proteinů. V této kvasince se při působení alkoholoxidázového 1 genového promotoru dají získat velká množství rekombinantních proteinů. Vysoké hladiny rýžové chitinázy byly získány při využití Pichia pastoris GS115, chitináza byla úspěšně využita v biologické kontrole Botrytis cinerea na plodech mišpule (Yan a kol. 2008). Overexprese Bbchit1 genu entomopatogenní houby Beauveria bassiana v transgenní B. bassiana snižuje letální koncentrace této houby pro mšice a zkracuje čas potřebný k usmrcení v porovnání s divokým kmenem (Duo-Chuan 2006). Příkladem zvýšení rezistence proti parazitickým houbám je využití transgenních rostlin s inkorporovanými houbovými chitinázami (Gortari a Hours 2008). Gen chit42 hub T. harzianum, který kóduje chitinázu se silnou angifungální aktivitou proti širokému spektru fytopatogenetických hub, zvyšuje rezistenci trangenních rostlin (tabák, lilek brambor, jabloň). Transgenní rostliny tabáku, exprimující Cts1p chitinázu z S. cerevisiae mohou inhibovat růst Botrytis cinerea (Duo-Chuan 2006). 28

Chitináza rýže může zvýšit rezistenci rostlin v mnoha rostlinách (jahodník, tabák). V posledních letech byla vyvinuta řada transgenních rostlin s antifungální aktivitou. Přesto některé rostliny se silnou chitinolytickou aktivitou nemají antifungální vlastnosti. Příkladem je tabák produkující zvýšení množství bazické chitinázy. Úspěšná je antifungální aktivita u produktu genu Chi3K Vitis vinifera, který in vitro inhiboval růst Botrytis cinerea, napadající hrozny (Yan a kol. 2008). Izolace protoplastů je dalším možným využitím chitinolytických enzymů: protoplasty hub se využívají pro výzkum syntézy buněčné stěny a enzymů a výzkum sekrece (Dahiya a Tewari 2005). Byla zkoumána také enzymatická přeměna chitinu na ethanol (Duo-Chuan 2006).

5.3 Zpracování chitinózního odpadu Chitinázy je možné využít ke zpracování chitinózního odpadu z korýšů. Např. v Mexiku mezi lety 1950-1998 chyceno 40000-80000 tun korýšů, třetina této biomasy tvořená převážně chitinem byla nevyužita a skončila jako odpad. Chitinózní odpad lze zpracovat spalováním, což ale škodí životnímu prostředí kvůli vzniku oxidů uhlíku a amoniaku. Chitinózní odpad se také zpracovává chemickými metodami pro zisk chitinu a chitosanu. Dále se odpad z korýšů zpracovává pro výrobu médií pro kultury, extrakci pigmentů a proteinů, zúrodňování půd a boj s parazitickými nematody a imobilizaci enzymů (Rojas-Avelizapa a kol. 2002, Gohel a kol. 2006). Pevný odpad z korýšů je tvořen zejména chitinem, CaCO3 a proteiny (Dahiya a Tewari 2005). Odpadní materiál bohatý na proteiny lze využít pro extrakci proteinů k přípravě singlecell proteinů jako krmných směsí. Je třeba oddělit proteiny od chitinu, což je možné chemickou cestou, tedy alkalizací. Toto zpracování ale snižuje nutriční hodnotu proteinů. Chemická deproteinace také může způsobit částečnou deacetylaci chitinu a hydrolýzu polymeru. Při chemickém zpracování vzniká nutnost neutralizace a detoxifikace odpadní vody. Alternativou chemického zpracování je enzymatická hydrolýza, využívající proteolytický komplex z krabího hepatopankreatu. Tato metoda umožňuje získat proteiny z nestravitelného odpadního materiálu, zbylý materiál je možné využít pro přípravu chitinu. Enzymatická degradace chitinózního materiálu ale zahrnuje i využití chitináz. Chitinolytické organismy mohou být kultivovány přímo na substrátu z odpadního materiálu (Mukhin a Novikov 2002, Gohel a kol. 2006).

29

Prostřednictvím chitináz Serratia marcescens a Pichia kudriavazevii je možné získat single-cell protein s asi 45% obsahem proteinů a 8-11% obsahem nukleových kyselin. K získání single-cell proteinu se obvykle používají houby Hansenula polymorpha, Candida tropicalis, S. cerevisiae a Myrothecium verrucaria. Využitím posledních dvou druhů je možné získat single-cell protein s velmi nízkým obsahem nukleových kyselin (3,1 %) a vysokým obsahem proteinů (61 %) (Dahiya a Tewari 2005). Odpad obsahující skořápky je z 15-40 % sušiny tvořen chitinem. Tento materiál je zajímavý z hlediska přípravy chitinu. Surovina je deproteinována a demineralizována a získaný chitin se nejčastěji využije pro výrobu chitosanu nebo D-glukosaminu (Mukhin a Novikov 2002). V roce 2000 bylo celosvětově získáno asi 80 000 tun chitinu získaného z mořských bezobratlých (Gohel a kol. 2006).

5.3.1 Využití chitinu a jeho derivátů Další zajímavou oblastí využití chitináz je produkce chitooligosacharidů, glukosaminu a N-acetylglukosaminu, které mají významný farmaceutický potenciál. Chitooligomery mají výraznou farmakologickou aktivitu. Pro získání chitooligosacharidů je nezbytné využít velké množství endochitináz a malé množství N-acetylglukosaminidáz a exochitináz, zatímco Nacetylglukosamin je možné získat při použití velkého mnoštví exochitináz a Nacetylglukosaminidáz. Také transglykosylační aktivita různých endochitináz a N-acetylglukosaminidáz je užitečná pro produkci požadovaných chitooligomerů a glykopeptidů. Například chitinázy T. reesei vytvářejí zejména hexamery a dimery přeměnou tetramerů. Upravením podmínek (katalýza lysozymem a přítomnost 30% síranu amonného v pufru) dochází také k prodloužení řetězce

a

vzniku

heptamerů.

Transglykosylace

katalyzovaná

endo-β-N-

acetylglukosaminidázou modifikuje cukerné deriváty na C1 a C2 a umožňuje tvorbu glykopeptidů (Dahiya a Tewari 2005). Při zpracování chitosanu je enzymatická depolymerizace snadno kontrolovatelná, riziko přílišné depolymerizace je menší než u dalších depolymerizačních metod. Výsledkem působení chitosanázy jsou preferenčně monomery a navíc je tento enzym drahý. Glykosidické vazby v molekule chitosanu je možné štěpit působením chitinázy, výsledkem působení tohoto enzymu jsou chitooligosacharidy požadovaného složení (Lin a kol. 2009).

30

Obvazový materiál s obsahem derivátů chitinu Využití chitinu a jeho derivátů v léčbě ran je zkoumáno od 70. let 20. století. Chitosan je využíván v hojení ran, je součástí obvazů a šití, protože vytváří pevný, hygroskopický film, propouštějící kyslík. Ve srovnání s jinými přirozenými vlákny mají houbové filamenty výhodu v tom, že jsou dostupné v různých modifikacích: jako nevětvená vlákna (sporangiofory) nebo jako mycelium. Sporangiofory je možné získat pouze při kultivaci na pevných substrátech, zatímco mycelium lze vypěstovat v tekutém médiu v bioreaktorech. Vypěstované mycelium se dále deproteinuje alkalizací a bělí. Filamenty se mohou kombinovat s dalšími materiály. Samotná vlákna jsou velmi křehká, ale mohou být změkčena glycerolem. Lyofilizací vláken je možno získat vysoce absorbční materiál (Hamlyn a Schmidt 1994). Pro použití v medicíně a farmacii jsou preferovány částečně hydrolyzované chitosany díky jejich vysoké rozpustnosti. Rozmanitost derivátů chitinu nabízí široké pole možných aplikací. Některé materiály na bázi chitinu jsou komerčně dostupné. Chitosan zvyšuje aktivitu polymorfonukleárních leukocytů makrofágů a fibroblastů. Tyto buňky se účastní granulace tkáně, má tedy příznivý účinek u hojení otevřených ran. Dále podporuje produkci cytokinů a stimuluje syntézu kolagenu IV, reepitelizaci a angiogenezi. Chitosan má schopnost podporovat správnou míru granulace tkání - přílišná granulace vede ke tvorbě jizvy. Podobné vlastnosti má i chitin. Chitin i chitosany mají inhibiční účinek na metaloproteinázy, což jsou transmembránové endopeptidázy degradující extracelulární matrix, která je vytvářena v průběhu hojení. Možným mechanismem působení chitosanu je chelatace zinkových iontů, působících jako kofaktory metaloproteináz. Deriváty chitinu jsou v těle degradovány na N-acetylglukosamin, běžný aminocukr lidského těla. Chitooligomery tedy slouží jako stavební součásti pro tvorbu hyaluronové kyseliny. Deriváty chitinu urychlují hemostázu. Hemostatická odpověď závisí na chemické povaze a terciární a kvarterní struktuře derivátů chitinu. Dochází k aktivaci destiček a tvorbě fibrinu, současně dochází k interakci s červenými krvinkami (Muzzarelli 2009).

Další využití derivátů chitinu Chitosanové nosiče jsou pro svou biodegradabilitu použitelné v technologii lékových forem (Muzzarelli 2009). Chitosan v kombinaci s dalšími materiály umožňuje bukální aplikaci peptidových léčiv včetně inzulinu. Chitosan-glutamát působí jako enhancer, 31

usnadňující průnik velkých hydrofilních molekul na tkáňovém modelu bukální sliznice (Portero a kol. 2002). Příznivý efekt degradačních produktů chitinu byl sledován i ve snížení invazivnosti buněk lidského melanomu cestou inhibice metaloproteináz a také u buněk lidského fibrosarkomu, protinádorovou aktivitu mají např. chitohexóza a chitoheptóza (Dahiya a Tewari 2005, Muzzarelli 2009). Chitosany aplikované intraartikulárně podporují tvorbu chrupavčité tkáně. Monomery odvozené od chitinu mají hojivý účinek na chrupavky i při perorálním podání. Častým využitím glukosamin-sulfátu je léčba artritidy. Má protizánětlivé působení a na jeho účinku se opět podílí mechanismus inhibice metaloproteináz. Z derivátů chitinu je možné vytvářet podpůrný skelet pro růst buněk pro potřeby tkáňového inženýrství (Muzzarelli 2009). Některé deriváty chitosanu mají baktericidní aktivitu. Nejvyšší baktericidní aktivitu má nízkomolekulární chitosan (5-10 kDa) (Lin a kol. 2009). Díky propustnosti pro kyslík je chitosan využíván jako materiál pro kontaktní a intraokulární čočky (Hamlyn a Schmidt 1994). Chitosan v potravě působí jako prebiotikum, ovlivňuje složení střevní mikroflóry. U kuřat, krmených potravou s přídavkem chitosanu, byl zaznamenán větší obsah rodu Bifidobacterium ve střevě (Tharanathan a Kittur 2003). Fotokompozitní materiály na bázi chitinu jsou využitelné zejména v urgentní medicíně, ale také k vrstvení anorganických povrchů, jako je sklo (Muzzarelli 2009). Díky schopnosti vázat těžké kovy je chitosan využitelný v čištění odpadní vody. Depolymerizované deriváty chitinu se využívají v kosmetice jako součást šamponů pro svou viskozitu a příznivý vliv na pokožku a vlasy. Další možností využití derivátů chitinu je výroba obalových materiálů (Tharanathan a Kittur 2003).

32

6. Diskuze Substrátem pro chitinolytické enzymy je chitin, druhý nejrozšířenější polysacharid na Zemi. Chitin je přítomen v exoskeletu členovců, ve schránkách měkkýšů, vajíčcích nematod a je součástí buněčné stěny hub a některých řas. Chitin také tvoří primární septum v průběhu pučení kvasinek. Chitin je složen z jednotek N-acetylglukosaminu, spojených glykosidickými vazbami. Právě tyto vazby jsou štěpeny chitinázami (Gortari a Hours 2008). Klasifikace chitinolytických enzymů a označení jednotlivých chitináz nejsou ustálené. Základní dělení chitináz na endo- a exochitinázy, případně ještě na N-acetylglukosaminidázy, je dostatečné pro pochopení průběhu hydrolýzy makromolekuly chitinu. Z molekulárního hlediska je významné rozdělení chitináz podle přítomnosti, resp. absence některých domén. Nejvíce je zkoumána chitin-binding doména a vliv její přítomnosti na chitinolytickou aktivitu. Jsou vytvářeny transgenní mikromycety, u kterých mají produkované chitinázy po přidání chitin-binding domény často významně vyšší aktivitu. Podobného zvýšení aktivity je dosaženo i po přidání jiné substrát vázající domény, cellulosebinding domény (Fan a kol. 2007, Limón a kol. 2004). Chitinázy jsou obsaženy v řadě organismů, jsou tvořeny zejména houbami, rostlinami a některými bakteriemi, ale i měkkýši, členovci, nematody, obratlovci včetně člověka a některými viry a řasami (Gooday 1999). Význam chitináz pro producenta spočívá v morfogenezi, to platí u organismů, které obsahují chitin jako strukturní komponentu. Příkladem je u mikromycet sporulace, růst buněčné stěny a nezbytné je působení chitináz při pučení u kvasinek. V řadě pokusů bylo zjištěno, že narušením genů pro chitinázy, případně působením specifických inhibitorů chitináz, dochází k poruchám dělení buněk a růstu buněčné stěny. Např. u S. cerevisiae byl sledován při nedostatečném působení chitináz pseudohyfální růst (Adams 2004). Chitinázy slouží producentovi také k získávání potravy rozkladem chitinu. Účastní se interakcí mezi hostitelem a patogenem, kdy patogenům umožňuje průnik chitinózními strukturami hostitele, ale také je součástí obranných reakcí v případě, kdy patogenem je organismus obsahující chitin (Gooday 2009). Chitinázy se rozkladem tak rozšířeného polymeru, jako je chitin, významně podílejí na koloběhu uhlíku a dusíku v přírodě. Nejdůležitější roli v rozkladu chitinu mají právě houbové a bakteriální chitinázy (Manucharova a kol. 2005).

33

Široké možnosti pro využití houbových chitináz nabízí zemědělství. Důvodem je mykoparazitismus a nematofágní či entomofágní působení některých mikromycet. Tyto mikromycety jsou využitelné jako prostředek biologické kontroly, umožňující nahrazení části používaných chemických prostředků (Gortari a Hours 2003). Snížení množství pesticidů je žádoucí zejména z důvodu snížení reziduí chemických látek v potravinách a nižší ekologické zátěže prostředí. V této souvislosti je nejvíce zkoumán rod Trichoderma, zejména pro svou vysokou antifungální aktivitu v porovnání s jinými mykoparazity (Duo-Chuan 2006). Mikromycety kromě vlastního antiparazitického působení aktivují obranný systém rostlin (Gortari a Hours 2003). Již dnes jsou dostupné prostředky biologické kontroly s obsahem houbových spor. Další výzkum využití houbových chitináz je žádoucí, může přinést zvýšení dostupnosti a rozšíření spektra biologických preparátů. Rovněž se domnívám, že další výzkum je potřebný kvůli potenciální hrozbě vzniku obranných mechanismů rostlinných patogenů proti současným prostředkům biologické kontroly. Chitinázy je možné využít k rozkladu chitinózního odpadu, vznikajícího zejména při zpracování korýšů. Chitin je v tomto odpadu asociován s dalšími látkami, zejména proteiny a minerály. Využití chitináz ve zpracování odpadu je ekologickou alternativou dalších postupů, jako je spalování nebo chemický rozklad. Další výhodou chitináz je, že na rozdíl od chemického zpracování nejsou proteiny při využití enzymů znehodnocovány a výsledný produkt má vysokou hodnotu jako single-cell protein (Gohel a kol. 2006). Chitin získaný z chitinózního odpadu je široce používán zejména v medicíně. Podle požadovaných vlastností výsledného materiálu je depolymerizován a často deacetylován. Deriváty chitinu a chitosanu se používají pro výrobu obvazových materiálů, intenzivně jsou zkoumány farmakologické vlastnosti chitooligomerů pro svou tumoricidní a imunostimulační aktivitu. Glukosamin je při perorálním podání široce využíván při léčbě artritidy. Výzkum se zabývá také využitím chitinu v technologii lékových forem (Muzzarelli 2009).

34

7. Závěr Chitinázy, enzymy rozkládající chitin, jsou přítomny v řadě organismů, jako jsou houby, bakterie, rostliny a obratlovci. V práci jsem shrnula vlastnosti chitinolytických enzymů a jejich význam pro buňky mikromycet i další organismy. Chitinázy se účastní morfogeneze, parazitismu, výživy a jsou také součástí obranných mechanismů rostlin a živočichů. Dále se významně podílejí na koloběhu uhlíku a dusíku. Zaměřila jsem se zejména na možnosti využití houbových chitináz v zemědělství pro jejich antifungální, entomofágní a nematofágní působení. Přínos širšího využívání prostředků biologické kontroly je nesporný. Věnovala jsem se také využití chitináz ve zpracování odpadu obsahujícího chitin.

35

8. Seznam literatury Adams D.J. (2004): Fungal cell wall chitinases and glucanases. Microbiology 150: 2029-2035. Benedett E., Bavoso A., Blasio B.D., Pavone V., Pedone C., Toniolo C., Bonora G.M. (1982): Peptaibol antibiotics: A study on the helical structure of the 2-9 sequence of emerimicins III and V. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 7951-7954. Dahiya N., Tewari R. (2005): Biotechnological aspects of chitinolytic enzymes: a review. Appl. Microbiol. Biotechnol. 71: 773-782. Duo-Chuan L. (2006): Review of fungal chitinases. Mycopathologia 161: 345-360. Duo-Chuan L., Chen S., Jing L.U. (2005): Purification and partial characterization of two chitinases from the mycoparasitic fungus Talaromyces flavus 159: 223–229. van Eijk M., van Roomen C.P.A.A., Renkema G.H., Bussink A.P., Andrews L., Blommaart E.F.C., Sugar A., Verhoeven A.J., Boot R.G., Aerts J.M.F.G. (2005): Characterization of human phagocytederived chitotriosidase, a component of innate immunity. International Immunology 17: 1505-1512. Fan Y., Fang W., Guo S., Pei X., Zhang Y., Xiao Y., Li D., Jin K., Bidochka M.J., Pei Y. (2007): Increased Insect Virulence in Beauveria bassiana Strains Overexpressing an Engineered Chitinase. Appl. Environ. Microbiol. 73: 295-302. Gohel V., Singh A., Vimal M., Ashwini P., Chhatpar H.S. (2006): Bioprospecting and antifungal potential of chitinolytic microorganisms. African Journal of Biotechnology 5: 54-72. Gooday G.W. (1999): Aggresive and defensive roles for chitinases. In: Jollès P., Muzzarelli R.A.A. (eds.), Chitin and Chitinases, Birkhäuser Verlag, Basel, 157-165. Gortari M., Hours R.A. (2008): Fungal chitinases and their biological role in the antagonism onto nematode eggs: A review. Mycol. Progress. 7: 221-238. Hamlyn P.F., Schmidt R.J. (1994): Potential Therapeutic Application of Fungal Filaments in Wound Management. Mycolologist 8: 147-152. Hoella I.A., Klemsdalb S.S., Vaaje-Kolstada G., Horna S.J., Eijsinka V.G.H (2005): Overexpression and characterization of a novel chitinase from Trichoderma atroviride strain P1. Biochimica et Biophysica Acta 1748: 180-190. Kramer J. K., Muthukrishnan S. (1997): Insect chitinases: Molecular biology and potential use as Biopesticides. Insect Biochem. Molec. Biol. 27: 887-900. Krokeide I-M., Synstad B., Gåseidnes S., Horn S.J., Eijsink V.G.H., Sørlie M. (2007): Natural substrate assay for chitinases using high-performance liquid chromatography: A comparison with existing assays. Analytical Biochemistry 363: 128-134. Lee C.G., Da Silva C.A., Lee J-Y., Hartl D., Elias A.J. (2008): Chitin regulation of immune responses: an old molecule with new roles. Current Opinion in Immunology 20: 684–689. Limón, M. C., Chacón, M. R., Mejías, R., Delgado-Jarana, J., Rincón, A. M., Codón, A. C., Benítez, T. (2004): Increased antifungal and chitinase specific activities of Trichoderma harzianum CECT 2413 by addition of a cellulose binding domain. Appl. Microbiol. Biotechnol. 64: 675-685.

36

Lin S-B. Yi-Chun Lin Y-C., Chen H-H. (2009): Low molecular weight chitosan prepared with the aid of cellulase, lysozyme and chitinase: Characterisation and antibacterial activity. Food Chemistry 116: 47-53. Madsen A.M., de Neergaard E. (1999): Interactions between the mycoparasite Pythium oligandrum and sclerotia of the plant pathogen Sclerotinia sclerotiorum. European Journal of Plant Pathology 105: 761–768. Manucharova N.A., Belova E.V., Vorob´ev A.V., Polyanskaya L.M., Stepanov A.L. (2005): Succession of Chitinolytic Microorganisms in Chernozem Soil. Microbiology (74): 602–607. Mukhin V.A., Novikov V.Y. (2002): The efficient utilisation of catching and processing waste of Barents Sea Crustacea. In: Muzzarelli R.A.A., Muzzarelli C. (eds.), Chitosan in Pharmacy and Chemistry, Italy 2002, 489-495. Muzzarelli R.A.A. (2009): Chitins and chitosans for the repair of wounded skin, nerve, cartilage and bone. Carbohydrate Polymers 76: 167–182. Omero C., Dror Y., Freeman A. (2004): Trichoderma spp. antagonism to the dermatophyte Trichophyton rubrum: implications in treatment of onychomycosis. Mycopathologia 158: 173–180. Portero A., Alonso M.J., Remunan-Lopez C. (2002): Chitosan bilayered devices for buccal administration of insulin. In: Muzzarelli R.A.A., Muzzarelli C. (eds.), Chitosan in Pharmacy and Chemistry, Atec, Italy 2002, 21-29. Rojas-Avelizapa L.I., Gómez-Ramírez M., Cruz-Camarillo R. (2002): Fermentation of shrimp waste with Bacillus thuringiensis, to produce proteo-chitinolytic enzymes and insecticidal crystals. In: Muzzarelli R.A.A., Muzzarelli C. (eds.), Chitosan in Pharmacy and Chemistry, Atec, Italy 2002, 479487. Sahai A.S., Manocha M.S. (1993): Chitinases of fungi and plants: their involvement in morphogenesis and host-parasite interaction. FEMS Microbiology Reviews 11: 317-338. Sándor E., Pusztahelyi T., Karaffa L., Karányi Z., Pócsi I., Biró S., Szentirmai A., Pócsi I. (2006): Allosamidin inhibits the fragmentation of Acremonium chrysogenum but does not influence the cephalosporin-C production of the fungus. FEMS Microbiology Letters 164: 231-236. Seibold M.A., Donnelly S., Solon M., Innes A., Woodruff P.G., Boot R.G., Burchard E.G., Fahy J.V. (2008): Chitotriosidase is the primary active chitinase in the human lung and is modulated by genotype and smoking habit. J. Allergy Clin. Immunol.122: 944-949. Seidl V. Huemer B., Seiboth B., Kubicek C.P. (2005): A complete survey of Trichoderma chitinases reveals three distinct subgroups of family 18 chitinases. FEBS Journal 272: 5923–5939. Smits G.J., van den Ende H., Klis F.M. (2001): Differential regulation of cell wall biogenesis during growth and development in yeast. Microbiology 147: 781-794. Šilhánková L. (2002): Mikrobiologie pro potravináře a biotechnology, Akademia, Praha, 363 s. Tharanathan R.N., Kittur F.S. (2003): Chitin - The Undisputed Biomolecule of Great Potential. Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 43: 61–87. Thomas P.W., Cole G.T. (1999): Chitinase: a potential target for an antifungal drug. Abstr. Gen. Meet. Am. Soc. Microbiol. 99: 306.

37

Vullo D.L. (2006): Biopolymers, enzyme activity, and biotechnology in an introductory laboratory class experience. Biochemistry and Molecular Biology Education 31: 42-45. Yan R., Ding D., Guan W., Hou J., Li M. (2008): Control of grey mould rot of loquat with chitinase expressed in Pichia pastoris: Crop Protection 27: 1312– 1317. Seznam registrovaných přípravků a dalších prostředků na ochranu rostlin 2009. Věstník státní rostlinolékařské správy 01/2009. 322 s. Internetové zdroje: http://biopreparaty.cz Biopreparáty s.r.o. [15.4.2009] www.brenda-enzymes.org/ The Comprehensive Enzyme Information System [10.4.2009] http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Arthroconidia_of_Coccidioides_immitis_39G0040_lores.jpg Wikipedia commons [6.5.2009] http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Chitin.svg Wikimedia commons [24.4.2009] http://ec.europa.eu/sanco_pesticides/public/index.cfm EU Pesticide Database [15.4.2009] http://home.zf.jcu.cz/public/departments/krv/rostlin/vyuka/clanky/agro.htm Biopreparáty na bázi entomopatogenních hub [15.4.2009] http://www.inta.gov.ar/imyza/info/gal/picudo.htm Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria [6.5.2009] http://www.kaeberleinlab.org/projects.html The Kaeberlein Lab [6.5.2009] http://www.mycolog.com/CHAP4a.htm [15.4.2009] http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/ GenBank [15.4.2009] http://www.sci.muni.cz/botany/studium/nr-houby.htm Systém a vývoj hlenek, hub a lišejníků [22.4.2009] http://www.sci.muni.cz/botany/studium/nr-rasy.htm Systém a vývoj sinic a řas [22.4.2009]

38