Univerzita Karlova v Praze Přírodovědecká fakulta Biologie

Univerzita Karlova v Praze Přírodovědecká fakulta Biologie

Zuzana Matějková Evoluce žihadla a jeho žláz u blanokřídlého hmyzu (Hymenoptera:Aculeata) Evolution of the sting and associated glands in Hymenoptera (Aculeata) Bakalářská práce Školitel: Mgr. Jakub Straka, Ph.D.

Praha, 2014

Prohlášení: Prohlašuji, že jsem závěrečnou práci zpracovala samostatně a že jsem uvedla všechny použité informační zdroje a literaturu. Tato práce ani její podstatná část nebyla předložena k získání jiného nebo stejného akademického titulu.

V Praze, 13. 5. 2014

Zuzana Matějková

Poděkování: Děkuji svému školiteli Jakubovi Strakovi za odbornou konzultaci a pečlivé a vstřícné vedení. Ráda bych poděkovala také Filipu Děchtěrenkovi za revizi a připomínky a rovněž své rodině a přátelům.

Praha 2014.

Obsah 1.Úvod..................................................................................................................................6 2.Evoluce anatomie a morfologie žihadla............................................................................7 2.1.Původ žihadla.............................................................................................................7 2.2.Sklerotizovaná a svalová část žihadla........................................................................7 2.3.Žlázy a měkké tkáně žihadlového aparátu.................................................................9 2.4.Jed..............................................................................................................................9 3.Funkce žihadla v evoluci blanokřídlých..........................................................................11 3.1.Fylogeneze skupiny Aculeata..................................................................................11 3.2.Funkce......................................................................................................................12 3.2.1.Žihadlo jako zbraň...........................................................................................12 3.2.2.Žihadlo k obraně..............................................................................................13 3.2.3.Autotomie.........................................................................................................15 3.2.4.Vznik eusociality..............................................................................................15 3.2.5.Úloha žihadla v kolektivní imunitě..................................................................17 3.2.6.Úloha žihadla v komunikaci............................................................................19 3.2.7.Polyesterové sekrety........................................................................................22 3.2.8.Další funkce žihadla.........................................................................................24 4.Antimikrobiální proteiny v žihadlové žláze....................................................................25 4.1.Jak vypadá AMP......................................................................................................25 4.2.Mechanismus účinku na bakterie.............................................................................27 4.3.Rezistence vůči antimikrobiálním peptidům...........................................................28 4.4.Funkce AMP u hmyzu.............................................................................................29 4.4.1.Imunita.............................................................................................................29 4.4.2.Toxiny..............................................................................................................29 4.4.3.Synergismus.....................................................................................................30 4.4.4.Konzervace.......................................................................................................30 4.4.5.Signalizace.......................................................................................................30 4.4.6.Další možné funkce..........................................................................................31 5.Diskuze a závěr................................................................................................................32 6.Použitá literatura..............................................................................................................34

Abstrakt Pro skupinu žahadlových (Hymenoptera:Aculeata) je žihadlo synapomorfním znakem. Linie žahadlových se oddělila od linie skupiny Parasitica v rámci řádu štíhlopasých. Žihadlo se vyvinulo z původního kladélka – žahadloví ztratili schopnost klást jím vajíčka. Žihadlem ústní na povrch těla kromě jedové žlázy také žláza Dufourova a některé další žlázy. Sekrety těchto žláz mají vícero různých funkcí. Původní funkcí, vázanou na predátorsko-parazitickou životní strategii, je funkce paralyzování oběti. U sociálních druhů získává naopak žihadlo spolu se žlázami funkci obrannou. Jde především o obranu společenství a jeho zdrojů před predátory z řad obratlovců. Tuto strategii podporuje i možná autotomie žihadla – jeho odtržení od zbytku těla. Žihadlo je také zdrojem feromonů a podílí se i na produkci dalších látek. Významnou složkou jedů žahadlových jsou malé peptidy s antimikrobiální funkcí. Ty původně sloužily patrně ke konzervaci kořisti, ale figurují také v imunitě hmyzu a feromonální signalizaci a přispívají k vyšší účinnosti jedu.

Abstract A stinger is a synapomorphy of Aculeata group. The branch of Aculeata has cleaved from the Parasitica group – they both belong to the order Apocrita. Stinger of Aculeata has evolved from a former ovipositor – though the function of laying eggs has been lost. Besides venom gland several other glands including Dufour's gland vent into stinger. The original (parasitic-predator strategy-binding) function of the gland secrets is a paralysis of the prey. In social Aculeata it gains a defensive function – associated with a possible act of autotomy of the stinger. The stinger and associated glands are also a source of pheromones and small peptides with an antimicrobial function. These peptides act together with other venom components and they help to improve its effectiveness.

Klíčová slova Žahadloví – žihadlo – jedová žláza – antimikrobiální peptidy Aculeata – sting/stinger – venom gland/poison gland – antimicrobial peptides

1. Úvod Žahadloví – tedy různé druhy včel, vos a mravenců, jsou monofyletickou skupinou blanokřídlého hmyzu (Hymenoptera: Aculeata), u které se vyvinul u hmyzu unikátní orgán – žihadlo se žlázami produkujícími látky různé chemické povahy a funkce. Z nich snad každý dobře zná bolestivé účinky včelího jedu. Mezi včelaři jsou po dlouhou dobu známy i jeho léčebné účinky. V poslední době vzrostla vlna vědeckého zájmu o jedy žahadlových – příčinu takové pozornosti zavdala potřeba nalezení alternativy k používaným antibiotikům. K těm, která jsou v současném lékařství používána, narůstá v důsledku nadužívání rezistence mnohých bakteriálních kmenů. Jed včely medonosné byl jedním z prvních zkoumaných a jedy dalších druhů včel a jiných blanokřídlých na sebe nenechaly dlouho čekat. Byly v nich nalezeny krátké peptidy, které mohou bakterie i jiné mikroorganismy ničit. Zatímco medicínské použití izolovaných, případně poupravených peptidů je vcelku zřejmé, jejich původ a skutečná funkce v těle živočichů, ze kterých pochází, zatím nebyla systematičtěji popsána. Nezodpovězené otázky ohledně přesné funkce peptidů spadají svým charakterem spíše do práce diplomové. Ačkoli i je v následující práci nastíním, hlavním záměrem práce je sumarizovat dostupné informace, které by sloužily jako podklad k podrobnějšímu studiu úlohy antimikrobiálních peptidů. Jedná se především o zmapování vývoje žihadla, jeho žláz a zejména funkce žihadla v průběhu evoluce blanokřídlých. Práce je členěna do tří částí. První z nich popisuje žihadlo a přilehlé struktury z anatomicko-morfologické stránky, druhá část je věnována vývoji funkce žihadla v souvislosti ze změnami životních strategií žahadlových. Třetí část shrnuje dostupné znalosti o antimikrobiálních peptidech z jedových žláz žahadlových a nastiňuje jejich možné uplatnění.

1

2. Evoluce anatomie a morfologie žihadla Byly publikovány několikeré studie morfologických rozdílů žihadla a souvisejících struktur žahadlových (Packer 2003; Surendra et al. 2013) komparativního charakteru, nesoucí význam pro taxonomii a fylogenezi především parazitických skupin blanokřídlých. Zde uvádím pouze základní morfologii a anatomii, která je v hlavních rysech společná všem žahadlovým. Užité termíny morfologie blanokřídlých se velmi různí, v této práci je používána převážně terminologie Packerova (2003).

2.1. Původ žihadla Žihadlo je charakteristickým znakem monofyletické skupiny Aculeata (žahadloví) (Macek et al. 2010). Slouží k ochromení, případně usmrcení kořisti nebo k vlastní obraně. Samotné žihadlo vzniklo přeměnou kladélka (ovipositoru). To je přeměněné prakticky u všech blanokřídlých. (Macek et al. 2010). Původní dutina kladélka se změnila na jedový kanálek. Vajíčka nyní místo toho, aby procházela dutinou kladélka, vychází z pohlavního otvoru na bázi žihadla (Chapman et al. 2013). Došlo i k přestavbě okolních struktur zadečkových článků – poslední tři články (8.-10.) jsou překryté zvětšeným sedmým zadečkovým článkem a vnořené do tzv. žahadlové komory. (Macek et al. 2010)

2.2. Sklerotizovaná a svalová část žihadla Samotný bodec žihadla je tvořen čtyřmi gonapofýzami – sklerotizovanými strukturami kladélka (Snodgrass 1933). Spodní část žihadla je tvořena gonapofýzami 8. zadečkového článku – prvními valvami. Svrchní, dorsální část je tvořena nepárovými druhými valvami – gonapofýzami 9. zadečkového článku. Na bázi druhých valv se upínají dva páry svalů. Jeden pár je ukotven ke 2. vaflviferům, jeden k proximálním částem rami. Tyto svaly jsou charakteristickou komponentou žihadla/ovipositoru u řádu Hymenoptera, nemají však u hmyzu žádnou homologii (Snodgrass 1933). 2

První valvy bývají také nazývány lancet, druhé valvy stylet. Jejich propojením vzniká s pomocí svalů funkční mechnanismus lišty a drážky (rhachis-aulax), což umožňuje pohyb v podélném směru (Macek et al. 2010). Tvoří pak tzv. olistheter – chitinizované zařízení, pevný bodec vpravující jed do těla oběti. Valvy vybíhají v tenké výběžky (rami), které je spojují s valvifery. První valvifer je na ramus napojen přímo, druhý ramus je laterárně spojen s přední částí druhého valviferu (Obrázek 1). Místo tohoto spoje je nazýváno rostrální výběžek. Od zbylé části zadečku ho odděluje elastická membrána – incisura postarticularis. Třetí valvy tvoří žihadlovou pochvu. Ta chrání žihadlo po dobu, kdy není používáno. Známy jsou nejrůznější morfologické variace – dobře viditelný je například rozdíl v míře zahnutí žihadla. Nejvíce zahnuté žihadlo mají kutilky čeledi Crabronidae, které loví rychle se pohybující druhy hmyzu – včely, vosy či mouchy. Naopak u druhů zaměřujících se spíše na pomalejší druhy kořisti – například některé pavouky či housenky – je žihadlo zahnuté méně (Radović 1985). Podle další studie je zahnutější žihadlo výhodné k tomu, že se pohodlněji zabodává do ventrální strany loveného živočicha (Hermann & Gonzalez 1986).

Obrázek 1: struktura žihadla (podle Packer 2003 a Matushkina 2011): 1- jedový váček, 2 Dufourova (alkalická) žláza, 3 - II. ramus, 4 - I. ramus, 5 - valvilli, 6 - ztluštěnina žihadla, 7 - I. valvy, 8 - II. valvy, 9 - II. valvifer, 10 - III. valvy (žih. pochva), 11 - IX. tergit (čtverc. destička), 12 - I. valvifer, 13 - jedový kanálek, 14 - furka

3

2.3. Žlázy a měkké tkáně žihadlového aparátu Na bázi žihadla ústí kromě jedové také žláza Dufourova. Bývají nazývány také žláza zásaditá, respektive kyselá. Dufourova žláza je trubice tvořená jednovrstevným glandulárním epitelem a řadí se mezi žlázy I. typu (Chapman et al. 2013; Noirot & Quennedey 1974). Tato žláza se pravděpodobně vyvinula ze žlázy samičí colleteriální (tj. přídatné žlázy reprodukčních orgánů). Jejími sekrety jsou chemikálie různých funkcí - specifických vždy pro určitý druh. Slouží například při stavbě hnízda, jako krmivo pro larvy, mohou mít komunikační funkci coby feromony. U většiny blanokřídlých mají sekrety Dufourovy žlázy lubrikační funkci – tj. promazávají vnitřní kanálek kladélka a tím usnadňují průchod vajíček (Macek et al. 2010). U mravenců ústí přímo do samotného žihadla, u včel a vos do dorsální vaginální stěny (Mitra 2013) Jedová žláza je rovněž epidermálního původu. Vyvinula se ze samičí přídatné pohlavní žlázy. Jedná se o epidermální žlázu III. typu (Chapman et al. 2013; Noirot & Quennedey 1974). Tuto žlázu tvoří sekreční buňky, které mají uvnitř dutinku s mikrovilli. Na ni navazuje struktura spojující sekreční buňku s buňkou kanálkovou (tzv. end apparatus). Žláza se skládá obecně z jednoho či více sekrečních kanálků, které ústí do jedového váčku – rezervoáru, ve kterém je jed skladován (Peiren & kol. 2008) . U některých podčeledí se kanálky spojují ještě před ústím do jedového váčku (Apinae, Andreninae), u jiných ústí každý samostatně (Vespinae, Polistinae, Eumeninae) či se rozvětvují (Sphecinae, Phylantinae, Cabroninae). Kanálky se skládají z válcovitých buněk a jejich epitel, zevnitř potažený kutikulou, vymezuje úzký lumen. Sekreční funkci má kromě sekrečních buněk také epitel nalezený uvnitř jedového váčku – nazývaný convoluted gland (stočená žláza). Vyskytuje se u vos a některých mravenců, naopak chybí u řady včel (Apini, Melliponini, Bombini) a Sphecidae, postrádají ji také řády Symphyta a Parasitica (Britto & Caetano 2005).

2.4. Jed Chemické složení samotného jedu se u jednotlivých druhů značně liší. Látky obsažené 4

v jedu blanokřídlých spadají do třech kategorií – malé molekuly ne-proteinové povahy s molekulovou hmotností < 300, peptidy o hmotnosti 1500 – 4000 a enzymy spolu s dalšími proteiny o molekulové hmotnosti > 10000 (Schmidt 1983). Celkově vzato obsahují jedy různé volné aminokyseliny, respektive jejich deriváty, často biogenní aminy, peptidy a enzymy. Nejvýnamnější složku včelího jedu (až 50% sušiny) tvoří polypeptid melittin, který se u ostatních čeledí žahadlových nevyskytuje. Na buňky má melittin hemolytický efekt, snižuje povrchové napětí, narušuje membrány a enzymatické systémy na ně napojené. Apamin je malý polypeptid. Podobně jako melittin je zásadité povahy, je ovšem daleko výrazněji neurotoxický. Podobné povahy jsou také MCD-peptid (Mast Cell Degranulating peptid), způsobující degranulaci žírných buněk a malý peptid minimin (Habermann 1972). V současnosti jsou známy desítky dalších peptidů. Mezi starší objevy patří zejména vosí a sršní kininy. Z biogenních aminů obsahuje včelí jed histamin, vosí navíc serotonin, sršní pak také acetylcholin. Mezi nejčastěji se vyskytující enzymy v jedech patří fosfolipázy A,, B a hyaluronidáza. Tyto enzymy hydrolyticky narušují membránové fosfolipidy a spolupůsobí s melittinem hemolyticky. Činí tak však jiným způsobem – a sice hydrolýzou. Významnou roli v narušování tkáňových struktur hrají také reakční produkty fosfolipázy – lysofosfolipidy. Předpokládá se, že značnou část efektu jedu na živé tkáně způsobují nejen vlastnosti jednotlivých látek, ale také jejich vzájemné interakce (Habermann 1972).

5

3. Funkce žihadla v evoluci blanokřídlých 3.1. Fylogeneze skupiny Aculeata Žahadloví (Aculeata) jsou prokazatelně monofyletickou skupinou hmyzu (Klopfstein et al. 2013), jejímž znakem je přeměněné kladélko. To už bylo přeměněno v orgán ke vpravování jedu do tkání jiných živočichů (Oeser 1961). Linie žahadlových se v rámci podřádu štíhlopasých (Apocrita) pravděpodobně oddělila od linie skupiny Parasitica; sesterskou skupinou jsou buď lumkovití (Ichneumonoidea (Sharkey 2007) nebo skupiny Trigonaloidea či Evanoidea (Klopfstein et al. 2013). Kladélko zástupců skupiny Parasitica je původní – ještě neseparované od bodacího aparátu – mnohým z nich slouží jak ke kladení vajíček, tak jako bodec, kterým jsou vajíčka vpravena do těla hostitele (Steiner & Piek 1986). Dá se tedy říci, že společným znakem žahadlových je spíše než žihadlo s bodací funkcí ztráta schopnosti klást vajíčka samotným kladélkem (Whitfield 2003). Vztahy v rámci nadčeledi žahadlových nejsou zatím nejsou zatím přesvědčivě objasněny. Co je pravděpodobné, je holofylie nadčeledí Chrysidoidea, Vespoidea a Apoidea. Jisté je, že včely (Anthophila) pochází z parafyletické skupiny predátorských vos Spheciformes (Debevec et al. 2012), do které patří bazální skupiny nadčeledi Apoidea. Zda jsou v rámci této skupiny Anthophila linií čeledi Crabronidae (Debevec et al. 2012), nebo její sesterskou skupinou (Brothers 1999) není příliš jasné. O čeledi Formicidae se doposavad předpokládalo, že je nejpříbuznější ektoparazitickým vosám (čeledi Scoliidae, Bradynobaenidae) (Debevec et al. 2012). Nyní se ukazuje, že je spíše sesterskou skupinou Apoidea (Johnson et al. 2013). Vosy čeledi Vespidae jsou sesterskou skupinou všech vos, včel a mravenců s výjimkou Chrysidoidea (Johnson et al. 2013). Fylogeneze žahadlových v kontextu funkce žihadla má význam hlavně pro souvislosti mezi vývojem potravních strategií a vznikem eusociality – ve čtyřech liniích žahadlových se vyvinuly potravní strategie alternativní k původnímu parazitismu. Jsou to čeledi Vespidae, Pompilidae, a linie (Formicidae+Apoidea). Ve stejných skupinách s výjimkou Pompilidae je známý také eusociální způsob života (Johnson et al. 2013).

6

3.2. Funkce 3.2.1.Žihadlo jako zbraň U žahadlových jsou známy různé potravní strategie. Včely jsou (až na výjimky) fytofágním hmyzem (Michener 2007). Naproti tomu zástupci nadčeledi Vespoidea (s výjimkou podčeledi Masarinae čeledi Vespidae) jsou většinou masožraví a své potomky krmí hmyzem a pavouky. Souhrn vosí potravy co se taxonomického zařazení týče poskytují například články od Boharta (1976), Iwaty (1976) a Krombeina a kol. (1979). Mravenci se pak řadí mezi predátory, mrchožrouty a nepřímé býložravce (Wilson & Hölldobler 2005). Pro predátorské vosy, které zásobují hnízdo živočišnou potravou, tedy funguje žihadlo jako zbraň k jejímu obstarávání. Vosa vpichuje žihadlo ve většině případů z ventrální strany do membránovité oblasti v sousedství ganglií na bázi nohou, hrudníku či krku kořisti, tak aby účinek jedu ochromil nervový systém a oběť nemohla utéct nebo se bránit (Andrietti 2011). Počet vpichů kolísá podle míry sjednocení ganglií u kořisti (O’Neill 2001; Steiner 1976). Vpich jedu kořist obvykle paralyzuje, ale neusmrtí. U různých druhů vos se znehybnění kořisti pohybuje od neúplného a dočasného až po úplné a přetrvávající (Piek et al. 1986). Neúplné znehybnění znamená, že kořist má znehybněné nohy, křídla a kusadla, zatímco srdce a někdy také trávicí trakt fungují. Kořist je pak schopna vyměšování a některé druhy se mohou paralyzované i zakuklit (Cooper 1957; Piek 1985; Rau & Rau 1918). Paralýza pomocí žihadla slouží v takovém případě zkrátka k tomu, aby mohla vosa kořist transportovat do hnízda, aniž by riskovala zranění. Mimo to pomáhá uchovat kořist coby potravu delší dobu čerstvější, než kdyby byla úplně usmrcena. Ke znehybnění hostitele a získání času používají někdy žihadlo také parazitodi z řad samotářských vos. Vosa Laelius pedatus z čeledi Bethylidae omráčí vpichem svého hostitele – brouka rodu Anthrenus. Dobu paralýzy využije k odstranění chloupků z jeho těla a na snesení vajíček na očištěná místa (O’Neill 2001). Jiná vosa Pseudomethoca frigida, jejímž hostitelem jsou sociální včely Lassioglossum zephyrum klade vajíčka do buněk s plodem. Žihadla užívá ke zbrzdění vývoje jedinců, kteří už dospěli do stadia kukly. Tím získá čas k vylíhnutí svých larev, které na nich 7

mohou parazitovat (O’Neill 2001). Příkladem parazitoida z čeledi Sphecidae je samička Ampulex bantuae, která loví šváby Bantua dispar. Její hostitel je o mnoho větší než ona sama – proto ho jedním až dvěma vpichy částečně paralyzuje. Šváb je omráčený, ale může se pohybovat – samička ho popadne za tykadla a odvleče do otvoru v kůře stromu, kde na něj naklade vajíčko a kde ho následně uvězní (O’Neill 2001).

3.2.2.Žihadlo k obraně Žahadloví mají řadu přirozených nepřátel (jak bezobratlých, tak obratlovců) a rovněž jsou si predátory sobě navzájem. Způsob obrany se liší podle situace – od napadení malými členovci uvnitř hnízda přes ohrožení hnízda jako celku člověkem, medvědem nebo jiným obratlovcem, po bránění teritoria – tedy zdroje květin proti cizím včelám (Breed et al. 2004). Kromě toho se žihadlo uplatní také ve vnitrodruhových potyčkách a proti případným kleptoparazitům či hnízdním parazitům, kteří se také obvykle přiživují na plodu – vajíčkách, larvách a kuklách. Podle O'Neilla (2001) se u 29 vybraných druhů vos celková úmrtnost plodu pohybuje od 12% do 77%, z čehož 0% až 42% je způsobeno přirozenými nepřáteli vos. Žahadlovým se tedy vyplatí investovat do obranných prostředků. Ty rozděluje Starr (1985b) na prostředky primární – pasivní obrany, jako je mimetické zbarvení, hnízdnění na nedostupných místech, pevný exoskeleton, přítomnost jedovatých látek a jiné známky „nejedlosti“ a aktivní – sekundární obranu, jakou je úprk, kousání či bodání. I když přítomnost žihadla hraje významnou roli pro druhy eusociální (viz kapitola Vznik eusociality), klíčovým krokem k jeho pozdější evoluci byla přítomnost u evolučně původnějších samotářských druhů, u nichž primárně pravděpodobně sloužilo k obstarávání potravy spíše než k obraně. Způsob použití žihadla se často liší – jak mezidruhově, tak v rámci jednoho druhu. Obvykle se však jedná až o poslední instanci obranného chování. Například Breed a kol. (2004) popisují systém obranných reakcí včely medonosné (pravděpodobně platný i pro ostatní druhy včel), kdy včela nejprve potenciálního útočníka ohmatá tykadly, upozorní ostatní či dá výstražné znamení. Pokud útočník odolává, přichází na řadu útok žihadlem. 8

To je obvykle vbodnutí žihadla do těla ohrožujícího živočicha. Záleží však na typu predátora – sociální vosy Parachartergus colobopterus se brání rozprašováním jedu z žihadla do vzduchu. Zamaskování (krypse) hnízda těchto vos pravděpodobně omezila jejich predátory pouze na malé hmyzožravé ptáky, proti kterým je rozstřikování jedu účinnější než bodání (Jeanne & Keeping 1995). Žahadloví jsou schopni odradit od útoku i mnohanásobně větší obratlovce, pro které několik málo žihadel nepředstavuje žádné výrazné nebezpečí. Podle Starra (1985b) obrana pomocí žihadla využívá v podstatě „primitivnějšího“, nespecifického poplašného signálu obratlovčího těla vyvolaného bolestí. Je to v podstatě takový klam. Žihadlo pro živočicha nepředstavuje reálné ohrožení života, ale bolest takovému stavu neodpovídá – je neúměrně větší. Jedná se o univerzální mechanismus, kterému mohou živočichové jen těžko odolávat. Pokud by se snad vyvinula odolnost, „lhostejnost“ vůči bolesti způsobené žihadlem, vyvinula by se ruku v ruce s lhostejností k bolesti jako takové, která už může ohrožení života představovat. Dalo by se pak předpokládat, že zatímco u solitérních žahadlových bude probíhat selekce na toxicitu jedu, u sociálních naopak na bolestivost. Starr (1985a) ve své práci uvádí, že korelace mezi tendencí k socialitě a bolestivostí žihadla se neukázala. Je pouze pravděpodobné, že určitá bolestivost je nutná k zahnání predátora, ale extrémnost v tomto nepřináší žádnou zvláštní výhodu.

Bylo by vhodné zjistit rozdíly v chemickém složení a působení jedu solitérních žahadlových (pro obranu spíše zřídka používaného) a sociálních druhů (naopak málokdy používaného k něčemu jinému než je obrana) (Starr 1985b). Možnosti vidím v návaznosti na článek Schmidta (1983) například v porovnání výskytu různých typů látek v jedech různých druhů (solitérních/sociálních) – některé látky jsou spíše toxické, jiné typy a velikosti molekul působí lokální bolest, jiné fungují jako pomocné látky pro šíření jedu.

9

3.2.3.Autotomie Některé druhy žahadlových mají rozšířenou možnost obrany proti predátorům o tzv. autotomii – odvržení části žihadlových struktur včetně žláz. Ta se vyskytuje u včel (Apis), vos (Epiponini, Polistini, Ropalidiini) i mravenců (Pogonomyrmex comanche a P. badius) (Hermann 1971), ovšem pouze u eusociálních druhů (Shorter & Rueppell 2012). Tyto skupiny mají dobře vyvinuté žihadlo se zpětnými háčky či štětinkami a zadečkové svaly, které se mohou jednoduše odtrhnout od zbytku těla. Při vbodnutí žihadla se háčky zaseknou ve tkáni oběti a kontrakcí zadečkových svalů je jed vpuštěn do rány (Shorter & Rueppell 2012). K odtržení žihadla obvykle nedochází při útoku na bezobratlé (Hermann 1971), odtržení je nejefektivnější při útoku na savce – z pružné savčí kůže jde žihadlo jen těžko vytáhnout. Efektivnost autotomie žihadla coby obrany vůči savčímu predátorovi spočívá v několika ohledech. Účinek jedu je úměrný jeho množství – pokud vydrží žihadlo v ráně déle, stihne se jedu vstřebat více. Proti malým živočichům (bezobratlým) je taková obrana zbytečná – zabije či paralyzuje je i malé množství jedu. Navíc jsou s obránci obvykle ve vyrovnaném počtu. Kromě toho je odtržení žihadla výzvou k hromadné obraně – vyloučením feromonu s poplašným signálem, který přivolá další jedince (Reed et al. 2000; Shorter & Rueppell 2012). Odtržení žihadla je tedy speciálním obranným mechanismem vůči obratlovcům. Není divu, že se vyvinul právě u sociálních druhů – jde o nedobrovolně altruistickou strategii. Útočící dělnice přijde o život ve prospěch své kolonie – respektive ve prospěch její reprodukční kasty (Shorter & Rueppell 2012).

3.2.4.Vznik eusociality Mluvíme-li o eusocialitě, máme na mysli životní strategii založenou na principu kolonií, kde se vícero jedinců podílí na péči o potomstvo. Aby dostála klasické definici, musí mít taková kolonie oddělenou reprodukční kastu (často jedinou královnu) a musí ji obývat jedinci z různých generací (Starr 1985b). Mezi žahadlovými panuje co do míry eusociality a typu hnízdění značná diverzita. Vedle sociálních druhů známe eusociálních druhy na úrovni sib-sociality (pouze s 10

alloparentální péčí) (Linksvayer & Wade 2005) či subsociality (rodiče pečují o plod a zásobují ho potravou) (Linksvayer 2010). Je to způsobeno tím, že eusocialita – jakožto úspěšná životní strategie – vznikla několikrát nezávisle? Podle Danfortha (2013) převládal do počátku 90. let minulého století názor, že eusocialita vznikala u žahadlových opakovaně – v řádu desítek až stovek opakování. Na základě výsledků současné molekulární fylogenetiky se však zdá, že vznik eusociality u včel a vos musel být spíše zřídkavým jevem. Naopak návrat z eusociálního způsobu života k jednodušším formám soužití je podle Danfortha častý. K takovýmto zvratům, které by tuto diverzitu ve způsobu hnízdění vysvětlovaly, došlo například u některých včel podčeledi Halictinae (Gibbs et al. 2012) a Xylocopinae (Rehan et al. 2012). V 80. letech se začali entomologové zajímat o mechanismus vzniku eusociálního chování u blanokřídlých v souvislosti s úlohou žihadla při vzniku eusociality. Vzhledem k tomu, že se eusocialita vyvinula u blanokřídlých více než desetkrát (Linksvayer & Wade 2005), je důvod hledat určitou společnou predispozici umožňující vznik eusociality u blanokřídlého hmyzu. Zatímco v pozdějších studiích jsou více zdůrazňovány jiné predispozice (hnízdění, péče o potomstvo) (Andersson 1984; Linksvayer & Wade 2005), Starr (1985b) a Kukuk a kol. (1989) diskutují přítomnost žihadla coby obranného mechanismu jako zásadní predispozici. Je zřejmé, že prostředí vznikající s rostoucí eusocialitou může přitahovat nové druhy predátorů či parazitů. Snadnou kořistí se mohou stát právě větší zásoby potravy na jednom místě či množství malých jedinců (kteří by jinak nestáli za pronásledování) koncentrovaných v hnízdě. Starr (1985b) zdůrazňuje použití žihadla proti predátorům z řad obratlovců. Ti jsou svou predací na hmyzu potenciální bariérou pro vznik sociality. Neloví samostatné jedince, za námahu jim stojí až jejich větší množství. V tom podle něj spočívá důležitost obrany z hlediska evoluce – pokud je kolonie zničena, zmizí i její genotyp. Starr tedy považuje přítomnost žihadla za klíčovou při vzniku eusociality, byť jen u malých kolonií nečítajících více než desítky jedinců. Kukuk a kol. (1989) naopak zdůrazňují úlohu žihadla v boji mezi potenciálními královnami a jako prostředek obrany proti bezobratlým parazitům a tzv. kukaččím včelám. Žihadlo podle nich nabývá na významu v obraně proti obratlovcům až se

11

zvětšujícími a po sociální stránce zdokonalujícími se koloniemi, kde jedinci dokáží efektivně komunikovat a mohou se tak obratlovcům lépe bránit. Zároveň teprve větší kolonie jsou pro obratlovce dostatečně významným lákadlem. Celkově lze za hlavní příčiny evoluce žahadlových směrem k socialitě považovat spíše sklony k péči o potomstvo a stavbě hnízda (Michener & Michener 1951), do určité míry pak také haplo-diploidní určení pohlaví (Hamilton 1964, 1972). Na základě předchozích výzkumů upřednostňuje jedna z posledních studií teorii, že haplodiploidie mohla ovlivnit spíše vznik alloparentální péče u některých druhů a tím umožnit subsociální formu hnízdění – tedy krok směrem k eusocialitě. (Linksvayer & Wade 2005). Svou roli patrně sehrála i řada dalších faktorů – např. mutualistické hnízdění, manipulace královnou či příbuzenský výběr (Andersson 1984).

3.2.5.Úloha žihadla v kolektivní imunitě Vývoj sociality v sobě nese jednak vyšší atraktivitu hnízda pro predátory, jednak také vyšší riziko nákazy společenství parazity a patogeny (Otvos 2000). Infekce se snadněji přenáší v populaci o větší relativní hustotě jedinců a mezi jedinci, kteří jsou mezi sebou více v kontaktu. Mimo to mohou populace sociálních blanokřídlých díky své podobné genetické výbavě snadněji podléhat parazitárním nákazám (Cremer et al. 2007). V hnízdech bývá vlhké a teplé prostředí, což umožňuje rychlejší vývoj mikroorganismů – bakterií, virů, hub a prvoků (Baracchi et al. 2011). Obrana proti patogenům funguje u žahadlových na několika úrovních. Z části je to individuální imunita každého jedince, z části obranné mechanismy aktivované v případě potřeby (např. kolektivní zvýšení teploty včelí kolonie (Starks et al. 2000)), z části profylaktická opatření – vnášení pryskyřice ze stromů do hnízda (Christe et al. 2003) nebo čištění. Kromě individuální imunity, ze které profituje vždy pouze jedinec, se jedná o mechanismy kolektivní imunity založené na altruistickém chování jednotlivých členů kolonie (Cremer et al. 2007) které zvyšují fitness jak jedince, tak celé kolonie (Cotter & Kilner 2010). Jako prostředek kolektivní imunity se u včel vyvinuly různé obranné strategie zahrnující shromažďování a používání přírodních antimikrobiálních látek, což jsou svým 12

charakterem většinou antimikrobiální peptidy (viz níže Antimikrobiální peptidy). Vedle produktů jiných žláz (Zasloff 2002) se ukázala být zdrojem takových látek i jedová žláza (Kuhn-Nentwig 2003). Jako první byla prokázána antimikrobiální účinnost mellitinu (Kuhn-Nentwig 2003). Později byly navrženy podobné vlastnosti apaminu a MCDpeptidu (Froy & Gurevitz 1998). Baracchi a kol (2011) prokázali výskyt antimikrobiálních peptidů na kutikule a plástvích několika druhů včelovitých. Na základě toho, že peptidy byly nalezeny u dělnic a zřídkakdy se vyskytovaly u trubců, usuzují, že zdrojem peptidů je žihadlo (které trubci postrádají). Na kutikule čerstvě vylíhlých jedinců tyto látky také nebyly nalezeny, což by mohlo být způsobeno tím, že si je na povrch těla nanesou včely stejným způsobem jako při upravování a čištění. Přítomnost antimikrobiálních látek v hnízdě je také závislá na druhu. Například u primitivně sociálních vos podčeledi Stenogastrinae porovnáváných se sociálními Polistes v hnízdě antimikrobiální látky nalezeny nebyly (Baracchi et al. 2012). Jako vysvětlení se nabízí, že buď používají nějaký jiný mechanismus účinný proti patogenům, nebo že se narozdíl od Polistes zbavují fekálií kuklících se larev (Baracchi et al. 2012) a tudíž nemají nějaké zvýšené obrany proti patogenům zapotřebí. Vosy rodu Polistes nechávají fekálie ležet na dně komůrek, ale také následně nehnízdí ve stejném hnízdě (Turillazzi a Pardi 1981). Složení jedu a množství antimikrobiálních látek je druhově značně odlišné – dá se předpokládat, že je adaptací vždy na určité mikroklima. Rozdíly mohou být způsobeny například typem hnízdění – druhy obývající otevřená hnízda mohou mít menší potřebu bránit se mikrobům než druhy žijící v dutinách, kde je přeci jen vlhčí a teplejší mikroklima, a kde jsou tedy pro růst patogenů vhodnější podmínky (Baracchi et al. 2011). U sociálních mravenců rodu Solenopsis invicta se vyvinul unikátní způsob nanášení malého množství jedu na plod v hnízdě. Třepáním zadečku (gaster flagging) rozpráší na povrch plodu přibližně 1 ng jedu. Ten obsahuje z 95% piperidinové alkaloidy, které vykazují insekticidní a antibiotické účinky (Obin & Vander Meer 1985). Ovšem stejně jako u ostatních sociálních žahadlových je hlavní funkce žihadla těchto mravenců obranná. Dělnice rozkmitáním zadečku rozstřikují až 500 ng jedu, objeví-li se v okolí cizí jedinec, kterého je třeba zahnat (Obin & Vander Meer 1985). Podobný způsob obrany má také druh mravence rodu Monomorium (Adams & Traniello 1981).

13

3.2.6.Úloha žihadla v komunikaci Jak bylo zmíněno, podle Kukuk a kol. (1989) nabývá role žihadla na významu v sociálně pokročilejších společenstvích. Důraz je kladen na fakt, že v takovém společenství spolu dokáží jedinci efektivněji komunikovat a mohou tak žihadla účinně využít k obraně. A právě žihadlo je jedním z prostředků, který komunikaci umožňuje. Nachází se na něm totiž několik žláz produkujících feromony – chemikálie, zprostředkující komunikaci mezi hmyzími jedinci (Seeley 2009). Jedná se o převážně těkavé sekrety různých žláz, které přijímající jedinec vnímá pomocí sensorických buněk na tykadlech, nohou a dalších částí těla (Chapman et al. 2013). Účinek feromonů může být buď behaviorální, ale krátkodobý (releaser feromon) – způsobující například poplašný signál, nebo fyziologický a dlouhodobý (primer feromon) – způsobující například signál, který brání dělnicím naklást vajíčka (Billen & Morgan 1998). Krátkodobě působící feromony jsou obvykle těkavé látky, ty dlouhodobě působící jsou spíše méně těkavé (Wyatt 2003). Podle účinku rozeznáváme několik kategorií feromonů. Ty se vyskytují napříč sociálními žahadlovými – u mravenců (Hölldobler & Engel 1978), vos (Reed et al. 2000), a samozřejmě u včel, u kterých jsou nejpodrobněji zkoumané. Alarm feromon vysílá informaci o hrozícím nebezpečí a vyvolává přípravu k útoku nebo útěku, trubčí feromon láká trubce k místu páření, stopovací feromon (trail feromon) upozorňuje na zdroje v okolí – zanechávají ho za sebou dělnice při hledání potravy, aggregation feromon láká jedince ke shromažďování na jednom místě, nestmate recognition feromon označuje jedince z jedné kolnie, sex feromon přitahuje jedince opačného pohlaví, feromon královny blokuje reprodukční chování dělnic a na jeho úkor stimuluje péči dělnic o plod královny (Billen & Morgan 1998; Chapman et al. 2013). Přítomnost jednotlivých druhů žláz vylučujících feromony je charakteristická pro určité taxonomické skupiny – od nadčeledí až po úroveň druhů. Voskové žlázy mají jen příslušníci čeledi Apidae, Van der Vechtovy a Richarsovy žlázy mají jen vosy, zatímco postfaryngeální, metapleurální a pygidiální žlázy jsou specifické pro mravence (Billen & Morgan 1998).(Obrázek 2).

14

Feromony jsou syntetizovány ve žláznatých buňkách de novo, nebo z prekurzorů přijatých v potravě (Chapman et al. 2013). Jsou to svým chemickým složením alkany, alkoholy, karboxylové kyseliny, estery alkoholu a karboxylové kyseliny, ketony či terpeny. Tvoří se v exokrinních žlázách ústících na povrch v různých částech těla. Některé žlázy jsou přímo napojené na žihadlo – u včel, vos i mravenců jsou to jedová a Dufourova žláza, u včely medonosné navíc také Koschevnikovova žláza. Některé ústí v jeho těsné blízkosti – jsou to Vander Vechtova a Richardsova žláza u vos, pygidiální žláza u mravenců a Nasanovova žláza spolu se žlázami voskovými a tergálními u včel. (Viz Obrázek 2.) (Vander Meer et al. 1998; Wilson 1965). Koschevnikovova žláza může být přítomna u včelích dělnic, vyskytuje se však hlavně u královny. Nalezena byla také u vos. Jedná se o párové shluky žláznatých buněk s kanálkem v intersegmentální membráně mezi čtvercovou a spirakulární destičkou (Hölldobler & Engel 1978). Obsahuje rychle vytěkávající látky – malé molekuly. Na dělnice působí atraktivně (Winston 1991). Jedová žláza je vedle žláz mandibulárních zdrojem takzvaného alarm feromonu u včel (Wilson 1965) a stejný feromon poplašné funkce produkuje také u vos (Reed et al. 2000). U mravenců může být zdrojem jak alarm feromonu, tak trail feromonu. Trail feromon umožňuje dělnicím zanechat za sebou stopu, kterou mohou ostatní následovat například ke zdroji potravy (Vander Meer et al. 1998). Podobným způsobem používá peptidy z jedové žlázy vosík Polistes dominulus – slouží mu k označování míst hibernace. U královen mravence rodu Solenopsis invicta byl v jedovém váčku identifikován takzvaný feromon královny – látka, která má atrahující účinky na dělnice a podněcuje k ukládání plodu (Vander Meer et al. 1980). Feromony jedové žlázy jsou povahou aldehydy a ketony – tedy malé molekuly, které jsou relativně těkavé. To je důležitá vlastnost těchto krátkodobě účinkujících feromonů – je třeba, aby rychle předaly svou informaci a dále nepřekážely a nevytvářely signál k akci v době, kdy není nezbytný. Alarm feromon, který se v jedové žláze nachází, může nést i dosti komplexní informace – nikoli jen binární povel útočit nebo neútočit. Hodně záleží na koncentraci feromonu a okolnostech jeho použití (Hunt 2007). Alarm feromon se skládá z většího množství různých látek. Ty mohou mít specifické funkce – benzyl acetát například vyvolává vylétávání včel z hnízda, jiné látky jejich 15

shromažďování k útoku či lokalizaci létajících objektů v okolí hnízda. Funkce vícero dalších látek se překrývají, celkový výsledek záleží na složení, koncentraci feromonu a na aktuální situaci (Wager & Breed 2000). Nejaktivnější složkou včelího alarm feromonu je ester isoamyl acetát s typickou banánovou vůní. V dělnicích vyvolává zvýšenou respiraci a obecně připravenost boji, k letu a agresivnímu chování. Informace se k dělnicím dostává pravděpodobně skrze aktivitu neuropeptidů, případně biogenních aminů (Hunt 2007). Významným zdrojem feromonů je také Dufourova žláza, která je přítomna napříč žahadlovými, a to jak u sociálních, tak u solitérních druhů. Je známo, že jejím produktem je alarm feromon (u mravenců a Vespidae), trail feromon (mravenci), queen feromon (včela medonosná) (Mitra 2013), nestmate recognition feromon (čmeláci) (Abdalla et al. 1999), a další rozpoznávací feromony (Halictidae) (Ayasse et al. 1993). Látky v ní produkované jsou vesměs těkavé či polotěkavé – uhlovodíky, terpenoidy, alkoholy, kyseliny, quinony a aromatické sloučeniny (Mitra 2013). V Ichneumonoidea u čeledi Braconidae je Dufourova žláza pravděpodobně kromě zdroje sex feromonu (Mitra 2013) také zdrojem feromonů, které specificky označují hostitele (Guillot et al. 1974). Samičky hledající hostitele pak mohou vybírat takového, ve kterém jejich potomkům nebudou konkurovat geneticky nepodobní jedinci (Chapman et al. 2013; Marris et al. 1996). U předků blanokřídlých fungovaly sekrety Dufourovy žlázy vypouštěné spolu s kladenými vajíčky jako jakési lepidlo – pomáhaly udržet vajíčka na substrátu. Tato funkce se ovšem zachovala (nebo znovu objevila) jen u Stenogastrinae, některých současných Ichneumonidae a Polistinae. U parazitických druhů pak byly látky používané k přichycení vajíček kooptovány k funkci semiochemikálií, které označují parazity již obsazeného hostitele (Mitra 2013). Jedová žláza žihadla hrála patrně roli už v raných fázích vývoje komunikace žahadlových pomocí feromonů. Určitý prekurzor feromonu připomínajícho trail feromon či sex feromon byl nalezen u mravenců podčeledi Myrmicinae (druhy Leptothorax acervorum, L. muscorum, a L. nylanderi). Objeví-li některý z těchto mravenců zdroj potravy, přivolá na pomoc další jedince způsobem zvaným „tandem-calling“ – tedy tandemové vyzvání. Informace je předávána vždy pouze mezi dvojicí mravenců dotykem – první z nich zvedne zadeček a vypustí z vytaženého žihadla kapku sekretu jedové žlázy, druhý z nich ji nahmatá tykadlem a

16

prvního následuje (Möglich et al. 1974). V zásadě stejný způsob předávání informace používají samičky jiného druhu Myrmicinae – Harpagoxenus subleavis. Používají ho ovšem k vysílání signál feromonu sexuální přitažlivosti. Dá se tedy předpokládat, že sex feromon a trail feromon mají společný původ, a to v jedové žláze žihadla (Möglich et al. 1974).

Obrázek 2 (podle Van Der Meer a kol. a E. O. Wilsona): Exokrinní abdominální žlázy žahadlových.

3.2.7.Polyesterové sekrety Samotářské včely čeledi Colletidae si budují svá hnízdí převážně v zemi. Jejich hnízda jsou tak trvale vystavena zvýšené vlhkosti a s ní souvisejícím infekcím, plísním a půdním parazitům. Aby ochránily své zásoby a zejména plod, vytváří tyto včely kolem 17

svým komůrek průhledné polyesterové membrány (Batra 1985). Ty jsou u čeledi Colletidae nepropustné pro vodu a rezistentí vůči parazitům a houbovým hyfám (Albans et al. 1980). Pravděpodobně se jedná o synapomorfní znak této čeledi (Almeida 2008). Polyesterové membrány jsou pravděpodobně tvořeny několika složkami. Primárně jde o sekret Dufourovy žlázy, který si včela olízne z vlastního žihadla. Co se s ním stane nadále, je otázkou. Je možné, že včela sekret pozře, smísí v žaludku s polymerizačními enzymy, následně směs vyvrhne a svým dvojlaločnatým jazykem rozprostře po povrchu komůrky (Batra 1985). Druhou možností je, že enzym(y) nepochází ze žaludku, ale z thorakálních slinných žláz a s produktem Dufourovy žlázy se mísí už v ústech (Albans et al. 1980). Způsob ochrany buněk pomocí polyesterových membrán je znám i u dalších čeledí – Andrenidae, Mellitidae, Halictidae. Jejich postup je vlastně obdobný, byť technicky méně dokonalý. Colletidae u každé komůrky vytvoří kus membrány o velikosti průměru komůrky navíc a nechají ho volně ležet, dokud není komůrka naplněna. Tu nakonec tímto kusem zavíčkují a utěsní sekretem Dufourovy žlázy. U ostatních druhů je vchod do komůrky utěsňován jen kusem hlíny. Narozdíl od Colletidae musí pak tyto druhy věnovat více času zabezpečování zásob a zamezení jejich kontaktu s povrchem komůrky, který představuje potenciální můstek pro infekci patogeny (Albans et al. 1980). Dominantní složkou Dufourovy žlázy u rodu Colletes a některých Halictinae jsou kyselina 20-hydroxyeikosanová a 18-hydroxyoctadekanová, respektive laktony těchto kyselin, další uhlovodíky a aldehydy. U rodu Andrena byly navíc nalezeny estery farnesolu a geraniolu (Hefetz et al. 1979). Sloučeniny tvořící membrány obsahují množství dvojných vazeb, jejichž kondezace a oxidace mohou vést k polymeračním reakcím či oxidačnímu zesíťování kyslíkem. Výsledné sloučeniny jsou nerozpustné ve vodních a organických rozpouštědlech a velmi silně hydrofobní – při kontaktu s vodou se na povrchu membrány vytvoří tenká vrstvička vzduchu (Hefetz et al. 1979). Existuje i řada dalších včel hnízdících v zemi, které sekrety Dufourovy žlázy na stavbu svých komůrek nepoužívají. Polyesterové membrány jsou nejspíš jenom jedním z mezistupňů vývoje těchto ochranných membrán. Primitivnějším předstupněm by mohly být hedvábí podobné sekrety ústních žláz u Colletidae, vývojově pokročilejším stupněm pak integumentální voskové žlázy, které k potahování komůrek využívají Anthophorinae

18

či Xylocopinae. Ze sekretů takových žláz pak vyšší Apidae budují celé soustavy komůrek (Batra 1972).

3.2.8.Další funkce žihadla Když už se jednou u žahadlových struktura jakou je žihadlo vyvinula, adoptovala patrně také různé další, sekundární funkce. Mutillidae jsou vosy, jež parazitují v hnízdech ostatních blanokřídlých. Jejich samičky kladou vajíčka do hnízdních komůrek s maturními larvami (Bogusch 2007). Jejich žihadlo slouží jako zbraň k případnému usmrcení hostitelské samice a k obraně vůči predátorům, a také k ohmatání larev hostitelského druhu. Žihadlo u těchto samiček funguje jako smyslový orgán – zjišťují tak, jestli jsou larvy dost staré, a tedy vhodné k nakladení vajíček (Macek et al. 2010). Vosa Oxybelus sericeus z čeledi Sphecidae používá žihadlo k manipulaci s kořistí. S kořistí obvykle při přenášení zachází nohama, za určitých okolností ji ale raději napíchne na žihadlo. Závisí to zřejmě na velikosti kořisti – malé druhy přenáší nohama, ty větší na žihadle. Takto může kořist lépe táhnout a navíc si uvolní končetiny pro další manipulaci (Hook & Matthews 1980). Zvláštností je, že po kopulaci samičky většinou upřednostňují napíchnutí kořisti na žihadlo – je možné, že jim to umožní rychleji přenést kořist do hnízda a vyhnout se pozornosti dalších samečků (Hook & Matthews 1980).

19

4. Antimikrobiální proteiny v žihadlové žláze S vývojem obranných mechanismů hmyzí imunity vznikla i komplexní imunitní odpověď v podobě antimikrobiálních peptidů, které dokáží rychle a účinně zničit nejrůznější patogeny. Zároveň se u jedovatých členovců vyvíjely i jedové žlázy, jejichž produkty jim pomáhaly v lovu potravy (Kuhn-Nentwig 2003). Jedová i Dufourova žláza obsahují množství biologicky aktivních látek, jejichž významnými zástupci jsou právě antimikrobiální peptidy. Jejich primární funkce vychází z těchto dvou potřeb – účinkují proti patogenům a pomáhají zvyšovat účinnost jedu při útoku na kořist (Kuhn-Nentwig 2003). Antimikrobiální peptidy vzbudily pozornost až relativně nedávno – a to zejména v oblasti farmakologie. Podíl má na tom zejména vzrůstající rezistence patogenů k používaným antibiotikům, související s jejich nadužíváním. Antimikrobiální peptidy v tomto ohledu nabízejí slibnou alternativu (viz níže). Pro potenciální využití v medicíně jsou peptidy často upravovány. Vlastnosti analogů – modifikovaných peptidů – jsou cíleny především na větší selektivitu bakteriálních a lidských buněk. Upravené peptidy se liší na jednom či více místech své sekvence, změna nejčastěji obnáší deleci, případně vytvoření hybridu dvou různých peptidů (Tossi et al. 1997). V současnosti je známo přes 2300 antimikrobiálních peptidů z různých organismů (více: http://aps.unmc.edu/AP/main.php) (Wang 2009), z toho přinejmenším 200 z hmyzu (Li et al. 2012). Mezi nimi je množství jak sociálních, tak solitérních druhů žahadlových (Turillazzi 2006). Je patrné, že antimikrobiální peptidy jsou druhově poměrně specifické látky (Baltzer & Brown 2011).

4.1. Jak vypadá AMP Antimikrobiální peptidy mají několik společných vlastností. Jsou to malé (30-60 aminokyselin (Li et al. 2012), respektive 5-100 aminokyselin (Bahar & Ren 2013)), termostabilní (100°C, 15 min), v genomu kódované polypeptidy (Li et al. 2012). Díky pří tomnosti kladně nabitých aminokyseliových zbytků (lysin, arginin) a dalším hydrofobním zbytkům kyselin nesou kl

20

adný náboj (Baltzer & Brown 2011; Brown & Hancock 2006). Pojmenování peptidu je většinou odvozené od názvu některého z taxonů, u kterého se vyskytují (lasioglossiny, eumenitin, bombolitiny), v některých případech je jméno modifikací označení specifické peptidové struktury (mastoparany, kininy, defensiny). Klasifikace peptidů se u různých autorů mírně odlišuje, v principu je ale na základě struktury a specifických antimikrobiálních vlastností můžeme dělit do pěti základních skupin: cecropiny, defensiny, glycin-bohaté peptidy, prolin-bohaté peptidy a lysozymy (Li et al. 2012). Dále mohou být děleny jako: lineární α-helikální cysteinu prosté peptidy, peptidy s velkým množstvím prolinu, případně glycinu a peptidy bohaté na cystein, který v nich stabilizuje α-β motivy (Hwang et al. 2009). Cecropiny patří ke skupině lineárních α-helikálních peptidů – obsahují dvě spojené šroubovice, které integrují do bakteriálních membrán, což vytváří v membránách trhliny. Působí obvykle na Gram-positivní i Gram-negativní bakterie (Otvos 2002). Postrádají cysteinové zbytky a skládají se z 35 – 39 aminokyselin. Jedná se o peptidy s velmi četným výskytem v živočišné říši, u hmyzu však byly dosud popsány jen u řádu Lepidoptera a Diptera (Li et al. 2012) – nacházejí se v jejich hemolymfě. Jsou to peptidy s velkou mírou vzájemné homologie (Hancock & Chapple 1999). Hmyzí defensiny jsou naopak na cystein bohaté peptidy se třemi až čtyřmi disulfidovými můstky. Jejich funkční specifita se odvíjí od charakteru postranních řetězců (Li et al. 2012). Obvykle nesou αββ nebo βαββ motivy (Bulet & Stocklin 2005). Působí proti Gram-negativním bakteriím, částečně i proti Gram-pozitivním bakteriím, houbám, kvasinkám a protozoím (Li et al. 2012). Peptidy, řadící se do kategorie glycin-bohatých antimikrobiálních peptidů, obvykle obsahují 22-40% glycinových zbytků. Tato primární struktura má značný vliv na strukturu sekundární a potažmo na způsob interakcí těchto peptidů s okolím. Účinkují proti Gramnegativním bakteriím a ničí membrány rakovinných buněk (Li et al. 2012). Na prolin bohaté peptidy obsahují kromě množství prolinových zbytků (25-50% ) často také vyšší množství na arginin bohatých motivů, odpovědných za kladný náboj peptidu. Působí proti Gram -negativním bakteriím – a to jiným způsobem než ostatní druhy peptidů. Nerozkládají membrány, ale penetrují do buněk a působí uvnitř (Casteels

21

& Tempst 1994). Nalezeny byly u savců, obojživelníků, korýšů a měkkýšů, avšak většina dosud známých na prolin bohatých peptidů byla izolována z hmyzu – abaeciny a apidaeciny ze hemolymfy žahadlových (Scocchi et al. 2011).

4.2. Mechanismus účinku na bakterie Názory na přesné působení antimikrobiálních peptidů se zatím poměrně výrazně různí (Alves et al. 2009). Ústřední roli v tomto mechanismu hraje interakce s membránou cílové buňky, obvykle způsobená zmiňovaným kladným nábojem peptidů. Membrána bakterií nese naopak náboj záporný. Přiblíží-li se k ní kladně nabité peptidy ve své stále ještě rozvolněné formě, začnou být k membráně přitahovány a získávají finální (αhelikální) konformaci (Kuhn-Nentwig 2003). V membránách eukaryotických buněk figurují na rozdíl od bakterií v první řadě neutrální fosfolipidy, díky čemuž nejsou eukaryotické buňky tolik vystaveny ohrožení ze strany peptidů (Gottler & Ramamoorthy 2009). Peptidy mají podobu amfifilických molekul a jejich kladně nabité části interagují se záporně nabitými hlavičkami lipidové dvojvrstvy plazmatické membrány. Jejich působením se vytvoří ztenčenina vnější části dvojvrstvy a peptidy zformují kanál, jenž jim umožňuje přístup do nitra cílové buňky (Straus & Hancock 2006). Proces formování pórů v membráně popisuje několik různých modelů, žádný z nich se však nezdá být univerzálním pro všechny peptidy (Gottler & Ramamoorthy 2009; Straus & Hancock 2006). V mechanismu ničení cílové buňky je zásadním okamžikem poškození membrány. To se může odehrávat různými způsoby – jak zmiňovaným vytvořením pórů, tak prostým porušením povrchu membrány. Tím je narušen membránový potenciál a pH gradient a znemožněna osmotická regulace a respirace, což ve svém důsledku vede k lyzi buňky (Li et al. 2012). Antimikrobiální peptidy interagují jak s membránami buněk, tak s jejich vnitrobuněčnými složkami – váží se na proteiny, DNA, RNA a mohou inhibovat jejich syntézu a syntézu buněčné stěny, ovlivňují proces cytokineze (Brown & Hancock 2006) a (Aggarwal & Silverman 2008). Celkově mohou v mezibuněčném prostoru aktivovat letální procesy vedoucí k hydrolýze a následnému zničení buňky (Zasloff 2002).

22

4.3. Rezistence vůči antimikrobiálním peptidům Působení specifických peptidů podléhají rozličné bakterie (ve větší míře Gramnegativní než Gram-pozitivní), zástupci fungi, protozoa i virů. Účinné mohou být tyto látky i vůči rakovinným buňkám (Li et al. 2012). Otázkou je, jak je to s vytvářením rezistence (obzvláště bakterií) vůči antimikrobiálním peptidům. Vyvinula se specificita těchto peptidů díky koevoluci s patogeny? Pak by jejich účinnost závisela na míře jejich vzájemného kontaktu. Pokud by ke kontaktu docházelo zřídka, byla by jejich efektivnost vysoká. Rezistence se však vytváří s rostoucí četností kontaktu peptidu s patogenem, a pokud by byl jejich společný výskyt častý, rezistence by rostla a účinnost se ztrácela (Baltzer & Brown 2011). Již pár desítek let je vědecké i laické veřejnosti známo, že dochází ke zvyšující se rezistenci patogenů vůči používaným antibiotikům. Za příčinu je mimo jiné považováno nadužívání antibiotik v léčbě (zbytečné předepisování těchto léků například na virová onemocnění) (Bulet & Stocklin 2005), jejich preventivní nadužívání ve velkochovech zvířat (Bulet & Stocklin 2005) a v čistících prostředcích (Aiello & Larson 2003). Navzdory optimistickému předpokladu, že vytváření rezistence vůči antimikrobiálním peptidům je naopak spíše nepravděpodobné (Zasloff 2002), skutečná situace je komplikovanější. Vznik rezistence patogenu by musel zahrnovat přeorganizování buněčné membrány patogenu (což je samo o sobě energeticky náročný úkon (Zasloff 2002)) nebo proměnu jiného cíle antimikrobiálního peptidu. Komplikací pro takovou akci je fakt, že peptid může cílit ne na jednu, ale na několik různých struktur (Marr et al. 2006). Přestavby membrány podobného charakteru přesto existují. Například obávaný nemocniční patogen Staphylococcus aureus, jehož buněčná stěna se skládá z peptidoglykanů a polymerů kyseliny teichoové, modifikuje části této kyseliny D-lysinem a dalšími aminokyselinami. Ty částečně zneutralizují původní záporný náboj tvořený kyselinou teichoovou. Zmírnění záporného náboje zabraňuje peptidům v nakumulování se na povrchu membrány (Peschel & Vincent Collins 2001). Obvyklé způsoby vzniku rezistence jsou snížení propustnosti membrány v důsledku inkorporace mastných kyselin do její struktury, podobné přestavby membrány pomocí fosfoethanolaminu a

23

aminoarabinosy, či změna hydrofobicity buněčné stěny a fluidnosti membrány u bakterií (Gunn 2001; Peschel 2002). Možný je také vznik rezistence vůči několika druhům peptidů najednou (Baltzer & Brown 2011).

4.4. Funkce AMP u hmyzu 4.4.1.Imunita Antimikrobiální peptidy jsou charakteristickým znakem imunitní odpovědi hmyzu. (Hoffmann et al. 1996). Hmyz postrádá adaptivní imunitu, vyvinula se u něj však důkladná imunita vrozená – jejíž složkou jsou mimo jiné právě antimikrobiální peptidy (Li et al. 2012). Vrozená imunita hmyzu je založena na třech složkách. Jde o o indukci proteolytických kaskád v důsledku zranění, buněčnou obranu – hlavně fagocytózu a enkapsulaci mikrobů a rychlou produkci antimikrobiálních peptidů, které jsou syntetizovány v tukovém tělísku – obdobě jater u hmyzu (Hoffmann et al. 1996). Hmyzí antimikrobiální peptidy figurují tedy jak v individuální imunitní odpovědi, tak jak je uvedeno výše, v imunitě kolektivní. Součástí kolektivní imunity jsou obzvláště peptidy v žihadlových žlázách. Ty jsou předurčené k vnější aplikaci a tedy i interakci s jinými jedinci a okolím. Právě antimikrobiální peptidy z jedových žláz žahadlových mají kromě funkce v imunitě několik dalších možných funkcí.

4.4.2.Toxiny Nejen v predátorsko-parazitické potravní strategii, ale i u sociálních žahadlových se zcela jistě peptidy s antimikrobiálními účinky uplatňují coby součást toxické směsi určené k paralýze oběti. Mastoparany, přítomné u solitérních i sociálních vos (Polistes, Eumeninae), mohou rozkládat červené krvinky a způsobovat degranulaci žírných buněk (Konno et al. 2000; Turillazzi 2006). Mellitin je hlavním toxinem v jedu sociální včely medonosné. Jeho hlavním účinkem je také hemolýza, dále pak snižování povrchového napětí buněk a vytváření micel (Habermann 1972). Dalším významným peptidem tohoto

24

druhu je apamin – tento neurotoxický peptid blokuje vápenato-draselné kanálky buněk (Hugues et al. 1982).

4.4.3.Synergismus Antimikrobiální peptidy působí synergicky s ostatními látkami v jedu a zajišťují tak jeho vyšší účinnost. Zmiňované mastoparany mohou aktivovat činnost enzymů či spouštět molekulární kaskády interakcemi s G-proteiny (Mendes et al. 2005). V jedu včely medonosné je například mellitin syntetizován spolu s enzymem fosfolipázou A2. Mellitin působí jako mediátor vesikulárních substrátových výměn s fosfolipidy, v důsledku čehož dokáže aktivovat činnost fosfolipázy (Cajal & Jain 1997).

4.4.4.Konzervace Od predátorsko-parazitických předků žahadlových pochází pravděpodobně funkce konzervace potravy. Tělo ulovené kořisti zůstane po vbodnutí jedu nejen omráčené, ale také déle čerstvé, v případě že jed obsahuje peptidy bránící množení mikroorganismů. U samotářských vos Anoplius samariensis a Eumenes rubronotatus byly objeveny antimikrobiální peptidy anoplin, respektive eumenitin, které pravděpodobně pomáhají uchovat kořist nezkaženou a chrání tak larvy před infekcí (Konno et al. 2001, 2006). Obdobně by ke konzervaci potravy – tedy pylu a nektaru – mohly antimikrobiální peptidy sloužit i u sociálních druhů. V hnízdě sice stopy jedu nalezeny byly (Baracchi et al. 2011), jeho přítomnost v zásobách však prokázána dosud není. Podobně navrhují Li a kol. (Li et al. 2012) použití antimikrobiálních peptidů z jedlých druhů hmyzu ke konzervaci potravin.

4.4.5.Signalizace Další funkcí antimikrobiálních peptidů je zcela jistě feromonální signalizace. Není dosud známo, o jak četnou záležitost se jedná, jisté však je, že minimálně vosíci rodu Polistes tyto peptidy v komunikaci využívají. Látky této molekulové hmotnosti ani

25

nemohou být nijak zvlášť těkavé, je tedy zřejmé, že budou sloužit nikoli k akutním signálům, ale jako značkovací látky. Spářené matky těchto vos vylétávají s koncem léta z hnízd a hledají chráněné místo k přezimování – takzvané hibernaculum. Zima je pro ně nejkritičnějším obdobím a schopnost najít dobré místo je tedy klíčová pro přežití i následné rozmnožení (Rau 1930). Královny preferují k přezimování stále stejná místa – ta je možné najít podle označení specifickými látkami. Ty byly nalezeny zároveň v hibernaculech, v jedu i na kutikule těchto vos – jednalo se o petidy dominuliny (Turillazzi et al. 2006). Jiným možným feromonem peptidové povahy by mohla být látka v jedu mravenčích královen druhu Solenopsis invicta. Dělnice těchto mravenců (podobně i u druhů Linepithema humile a Monomorium pharaonis) zabíjejí vyvíjející se sexualizované larvy, je-li v hnízdě přítomna královna. Tento mechanismus zbavování se přebytečných a pro kolonii příliš energeticky nákladných larev je řízen feromonem královny. Ten by také mohl být peptidické povahy (Klobuchar & Deslippe 2002).

4.4.6.Další možné funkce Častou životní strategií žahadlových je také hnízdní parazitismus. Samičky v nestřežený okamžik nakladou vajíčka do cizího hnízda a jejich potomci tak využívají péče a potravy od cizích dělnic (Begon et al. 2009). Nabízí se otázka, zda-li by vzhledem ke své druhové specificitě nemohly antimikrobiální peptidy hostitelských druhů hrát roli v obraně proti takovým kukaččím druhům. Jednou možností je, že by peptidy hostitelského druhu byly pro parazitující druh toxické. Kromě toho by peptidy larev parazitujícího druhu mohly fungovat jako marker upozorňující hostitelský druh na vetřelce mezi vlastními larvami. Oba druhy ale mohou být blízce příbuzné, navíc jejich imunitní systémy podléhají selekčním tlakům ze strany stejných patogenů a pravděpodobně se u nich konvergentně vyvíjí podobné prostředky k obraně. Ty pak pro vlastní druh toxické být nemohou a ani neumožňují vzájemné odlišení larev různých druhů.

26

5. Diskuze a závěr Antimikrobiální peptidy jsou sice nenápadnou, ale podstatnou součástí jedů žahadlových. Na jejich aktivitě závisí většina významných chemických funkcí žihadla. Peptidy se podílí na funkci imunitní, signalizační i na paralýze oběti či útočníka. Je ale otázkou, jak velkou měrou, a jestli vůbec přínos peptidů či žihadla jako takového přispěl ke vzniku eusociality. S určitostí můžeme říci, že se přítomnost této evoluční novinky žahadlových projevila minimálně na jejich evoluční úspěšnosti. Ač jsou jejich vlastnosti i mechanismy působení v novější literatuře celkem podrobně popsané, stále zůstává množství neznámých souvislostí.

Liší se nějak peptidy solitérních a sociálních druhů? Rozumíme-li peptidy jako klíčovou složku kolektivní imunity, musely být sociální druhy v průběhu evoluce pod mnohem větším selekčním tlakem než druhy solitérní. U sociálních a solitérních má bodání značně odlišnou funkci. Je rozdíl v celkovém složení jedu solitérního hmyzu selektovaným na toxicitu a jedu sociálního hmyzu selektovaným na bolestivost? Je rozdíl mezi složením jedu predátorsko-parazitických vos a býložravých včel? A proč se vůbec zachovalo žihadlo s jedovou žlázou u včel, když muselo ztratit svou původní paralytickou funkci? V čem je výhoda tak obrovské mezidruhové diverzity peptidů? Mají druhy natolik specifické peptidy kvůli tomu, že jejich geny snadno podléhají mutacím a umožňují tak rychlejší přizpůsobení se agresivnějším patogenům během koevoluce hostitele a parazita? Nebo je pro druh nějakým způsobem výhodné být označen specifickým peptidem? Jak souvisí změna syntézy různých peptidů (mellitin, apamin) v závislosti na věku dělnice? Nejvyšší míra syntézy mellitinu je okolo věku dvou týdnů, u starších dělnic zase klesá (Owen & Pfaff 1995). Je nějaká souvislost mezi mírou jeho syntézy a mírou pobytu včely uvnitř hnízda spojeného s vyšší hygienickou zátěží pro společenství? Mohly by peptidy sloužit ke konzervaci potravy u sociálních včel živících se rostlinou 27

potravou? U mnohých peptidů dnes známe jejich přesné sekvence – ty by mohly sloužit jak ke sledování jejich evoluce, tak k podrobnějšímu poznání vzájemných vztahů v rámci žahadlových. Zajímavé by také bylo porovnat, v jakém množství se peptidy vyskytují u různých čeledí. Některé z těchto otázek bych se ráda věnovala ve své budoucí diplomové práci.

28

6. Použitá literatura Abdalla, F.C., Velthuis, H., Da Cruz Landim, C. & Duchateau, M.J. (1999) Changes in the morphology and ultrastructure of the Dufour’s Gland during the life cycle of the bumble bee queen, Bombus Terrestris L. (Hymenoptera: Bombini). Netherlands Journal of Zoology 49, 251–261. Adams, E.S. & Traniello, J.F.A. (1981) Chemical interference competition by Monomorium minimum (Hymenoptera: Formicidae). Oecologia 51, 265–270. Aggarwal, K. & Silverman, N.S. (2008) Positive and negative regulation of the Drosophila immune response. BMB Reports 41, 267–277. Aiello, A.E. & Larson, E. (2003) Antibacterial cleaning and hygiene products as an emerging risk factor for antibiotic resistance in the community. Lancet Infectious Diseases 3, 501–506. Albans, K.R., Aplin, R.T., Brehcist, J., Moore, J.F. & O’Toole, C. (1980) Dufour’s gland and its role in secretion of nest cell lining in bees of the genus Colletes (Hymenoptera: Colletidae). Journal of Chemical Ecology 6, 549–564. Almeida, E.A.B. (2008) Colletidae nesting biology (Hymenoptera: Apoidea). Apidologie 39, 16–29. Alves, I.D., Correia, I., Jiao, C.Y., Sachon, E., Sagan, S., Lavielle, S., Tollin, G. & Chassaing, G. (2009) The interaction of cell-penetrating peptides with lipid model systems and subsequent lipid reorganization: thermodynamic and structural characterization. Journal of Peptide Science 15, 200–209. Andersson, M. (1984) The evolution of eusociality. Annual Review of Ecology and Systematics 15, 165–189. Andrietti, F. (2011) The art of managing weapons: The stinging behaviour of solitary wasps in the eyes of past, present and future research. In: C. Polidori (Ed), Predation in the Hymenoptera: An Evolutionary Perspective. Transworld research network, Kerala, pp. 123–198. Ayasse, M., Engels, W., Hefetz, A., Tengö, J., Lübke, G. & Francke, W. (1993) Ontogenetic patterns of volatiles identified in Dufour’s gland extracts from queens and workers of the primitively eusocial halictine bee, Lasioglossum malachmum (Hymenoptera: Halictidae). Insectes Sociaux 40, 41–58. Bahar, A.A. & Ren, D. (2013) Antimicrobial peptides. Pharmaceuticals 6, 1543–1575. Baltzer, S.A. & Brown, M.H. (2011) Antimicrobial peptides – promising alternatives to conventional antibiotics. Journal of Molecular Microbiology and Biotechnology 20, 228– 235. 29

Baracchi, D., Francese, S. & Turillazzi, S. (2011) Beyond the antipredatory defence: honey bee venom function as a component of social immunity. Toxicon 58, 550–557. Baracchi, D., Mazza, G. & Turillazzi, S. (2012) From individual to collective immunity: the role of the venom as antimicrobial agent in the Stenogastrinae wasp societies. Journal of Insect Physiology 58, 188–193. Batra, S.W.T. (1972) Some properties of the nest-building secretions of Nomia, Anthophora, Hylaeus and other bees. Journal of the Kansas Entomological Society 45, 208–218. Batra, S.W.T. (1985) Polyester-making bees and other innovative insect chemists. Journal of Chemical Education 62, 121. Begon, M., Townsend, C.R. & Harper, J.L. (2009) Ecology: from Individuals to Ecosystems. 4th ed. John Wiley & Sons, Malden, Oxford, Carlton, 752 pp. Billen, J. & Morgan, E.D. (1998) Pheromone communication in social insects: sources and secretions. In: Pheromone Communication in Social Insects. Westview Press, Boulder, Colorado, USA, pp. 3–33. Bogusch, P. (2007) Annotated checklist of the Aculeata (Hymenoptera) of the Czech Republic and Slovakia. – Acta Entomologica Musei Nationalis Pragae. : Vespoidea: Mutillidae (kodulkovití). Acta Entomologica Musei Nationalis Pragae Supplementum 11, 93–104. Bohart, R.M. (1976) Sphecid Wasps of the World: A Generic Revision. University of California Press, Berkeley, 695 pp. Breed, M.D., Guzmán-Novoa, E. & Hunt, G.J. (2004) Defensive behavior of honey bees: organization, genetics, and comparisons with other bees. Annual Reviews in Entomology 49, 271–298. Britto, F.B. & Caetano, F.H. (2005) Ultramorphological analysis of the venom glands and their histochemical relationship with the convoluted glands in the primitive social paper wasp Polistes versicolor (Hymenoptera: Vespidae). Journal of Venomous Animals and Toxins including Tropical Diseases 11, 160 – 174. Brothers, D.J. (1999) Phylogeny and evolution of wasps, ants and bees (Hymenoptera, Chrysidoidea, Vespoidea and Apoidea). Zoologica Scripta 28, 233–250. Brown, K.L. & Hancock, R.E.W. (2006) Cationic host defense (antimicrobial) peptides. Current Opinion in Immunology 18, 24 – 30. Bulet, P. & Stocklin, R. (2005) Insect antimicrobial peptides: structures, properties and gene regulation. Protein and Peptide Letters 12, 3–11. Cajal, Y. & Jain, M.K. (1997) Synergism between mellitin and phospholipase A2 from bee venom: apparent activation by intervesicle exchange of phospholipids. Biochemistry 36, 3882–3893.

30

Casteels, P. & Tempst, P. (1994) Apidaecin-type peptide antibiotics function through a nonporeforming mechanism involving stereospecificity. Biochemical and Biophysical Research Communications 199, 339 – 345. Cooper, K.W. (1957) Biology of eumenine wasps. V. Digital communication in wasps. Journal of Experimental Zoology 134, 469–513. Cotter, S.C. & Kilner, R.M. (2010) Personal immunity versus social immunity. Behavioral Ecology 21, 663–668. Cremer, S., Armitage, S.A.O. & Schmid-Hempel, P. (2007) Social immunity. Current Biology 17, R693–R702. Danforth, B.N. (2013) Social insects: are ants just wingless bees? Current Biology 23, R1011–R1012. Debevec, A.H., Cardinal, S. & Danforth, B.N. (2012) Identifying the sister group to the bees: a molecular phylogeny of Aculeata with an emphasis on the superfamily Apoidea. Zoologica Scripta 41, 527–535. Froy, O. & Gurevitz, M. (1998) Membrane potential modulators: a thread of scarlet from plants to humans. The FASEB Journal 12, 1793–1796. Gibbs, J., Brady, S.G., Kanda, K. & Danforth, B.N. (2012) Phylogeny of halictine bees supports a shared origin of eusociality for Halictus and Lasioglossum (Apoidea: Anthophila: Halictidae). Molecular Phylogenetics and Evolution 65, 926–939. Gottler, L.M. & Ramamoorthy, A. (2009) Structure, membrane orientation, mechanism, and function of pexiganan—a highly potent antimicrobial peptide designed from magainin. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes 1788, 1680–1686. Guillot, F.S., Joiner, R.L. & Vinson, S.B. (1974) Host discrimination: isolation of hydrocarbons from Dufour’s gland of a braconid parasitoid. Annals of the Entomological Society of America 67, 720–721. Gunn, J.S. (2001) Bacterial modification of LPS and resistance to antimicrobial peptides. Journal of Endotoxin Research 7, 57–62. Habermann, E. (1972) Bee and Wasp Venoms. Science 177, 314–322. Hamilton, W.D. (1964) The genetical evolution of social behaviour. I. Journal of theoretical biology 7, 1–16. Hamilton, W.D. (1972) Altruism and related phenomena, mainly in social insects. Annual Review of Ecology and Systematics 3, 193–232. Hancock, R.E.W. & Chapple, D.S. (1999) Peptide antibiotics. Antimicrobial Agents and Chemotherapy 43, 1317–1323.

31

Hefetz, A., Fales, H.M. & Batra, S.W.T. (1979) Natural polyesters: Dufour’s gland macrocyclic lactones form brood cell laminesters in Colletes bees. Science 204, 415–417. Hermann, H.R. (1971) Sting autotomy, a defensive mechanism in certain social Hymenoptera. Insectes Sociaux 18, 111–120. Hermann, H.R. & Gonzalez, J.M. (1986) Venom apparatus of Trypoxylon clavatum clavatum (Hymenoptera: Sphecidae). Journal of the Kansas Entomological Society, 213– 218. Hoffmann, J.A., Reichhart, J. & Hetru, C. (1996) Innate immunity in higher insects. Current Opinion in Immunology 8, 8 – 13. Hölldobler, B. & Engel, H. (1978) Tergal and sternal glands in ants. Psyche 85, 285–330. Hook, A.W. & Matthews, R.W. (1980) Nesting biology of Oxybelus sericeus with a discussion of nest guarding by male sphecid wasps (Hymenoptera). Psyche: A Journal of Entomology 87, 21–37. Hugues, M., Romey, G., Duval, D., Vincent, J.P. & Lazdunski, M. (1982) Apamin as a selective blocker of the calcium-dependent potassium channel in neuroblastoma cells: voltage-clamp and biochemical characterization of the toxin receptor. Proceedings of the National Academy of Sciences 79, 1308–1312. Hunt, G.J. (2007) Flight and fight: a comparative view of the neurophysiology and genetics of honey bee defensive behavior. Journal of Insect Physiology 53, 399–410. Hwang, J., Lee, J., Kim, Y., Bang, H., Yun, E., Kim, S., Suh, H., Kang, B., Nam, S. & Jeon, J. (2009) Isolation and characterization of a defensin-like peptide (coprisin) from the dung beetle, Copris tripartitus. International Journal of Peptides 2009, 1–5. Chapman, R.F., Simpson, S.J. & Douglas, A.E. (2013) The Insects: Structure and Function. Cambridge University Press 1998, New York, 929 pp. Christe, P., Oppliger, A., Bancalà, F., Castella, G. & Chapuisat, M. (2003) Evidence for collective medication in ants. Ecology Letters 6, 19–22. Iwata, K. (1976) Evolution of instinct: comparative ethology of Hymenoptera. PB-US National Technical Information Service. Jeanne, R.J. & Keeping, M.G. (1995) Venom spraying in Parachartergus colobopterus: A novel defensive behavior in a social wasp (Hymenoptera: Vespidae). Journal of Insect Behavior 8, 433–442. Johnson, B.R., Borowiec, M.L., Chiu, J.C., Lee, E.K., Atallah, J. & Ward, P.S. (2013) Phylogenomics resolves evolutionary relationships among ants, bees, and wasps. Current Biology 23, 2058–2062. Klobuchar, E.A. & Deslippe, R.J. (2002) A queen pheromone induces workers to kill sexual larvae in colonies of the red imported fire ant (Solenopsis invicta). Naturwissenschaften 89, 302–304.

32

Klopfstein, S., Vilhelmsen, L., Heraty, J.M., Sharkey, M. & Ronquist, F. (2013) The Hymenopteran tree of life: evidence from protein-coding genes and objectively aligned ribosomal data A. Janke (Ed). PLOS One 8. Konno, K., Hisada, M., Fontana, R., Lorenzi, C.C.B., Naoki, H., Itagaki, Y., Miwa, A., Kawai, N., Nakata, Y., Yasuhara, T., Neto, J.R., de Azevedo, W.F., Palma, M.S. & Nakajima, T. (2001) Anoplin, a novel antimicrobial peptide from the venom of the solitary wasp Anoplius samariensis. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Protein Structure and Molecular Enzymology 1550, 70 – 80. Konno, K., Hisada, M., Naoki, H., Itagaki, Y., Fontana, R., Rangel, M., Oliveira, J.S., Cabrera, M.P., Neto, J.R., Hide, I., Nakata, Y., Yasuhara, T. & Nakajima, T. (2006) Eumenitin, a novel antimicrobial peptide from the venom of the solitary eumenine wasp Eumenes rubronotatus. Peptides 27, 2624 – 2631. Konno, K., Hisada, M., Naoki, H., Itagaki, Y., Kawai, N., Miwa, A., Yasuhara, T., Morimoto, Y. & Nakata, Y. (2000) Structure and biological activities of eumenine mastoparan-AF (EMP-AF), a new mast cell degranulating peptide in the venom of the solitary wasp (Anterhynchium flavomarginatum micado). Toxicon 38, 1505 – 1515. Krombein, K.V., Hurd, P.D., Smith, D.R., Burks, B.D. (1979) Catalog of Hymenoptera in America north of Mexico. Volume 1. Symphyta and Apocrita (Parasitica). The Government Printing Office, Washington, 1198 pp. Kuhn-Nentwig, L. (2003) Antimicrobial and cytolytic peptides of venomous arthropods. Cellular and Molecular Life Sciences CMLS 60, 2651–2668. Kukuk, P.F., Eickworth, G.C., Raveretrichter, M., Alexander, B., Gibson, R., Morse, R.A. & Ratnieks, F. (1989) Importance of the sting in the evolution of sociality in the Hymenoptera. Annals of the Entomological Society of America 82, 1–5. Li, Y., Xiang, Q., Zhang, Q., Huang, Y. & Su, Z. (2012) Overview on the recent study of antimicrobial peptides: origins, functions, relative mechanisms and application. Peptides 37, 207–215. Linksvayer, T.A. (2010) Subsociality and the Evolution of Eusociality. In: Encyclopedia of Animal Behaviour. 3. Oxford, pp. 358–362. Linksvayer, T.A. & Wade, M.J. (2005) The evolutionary origin and elaboration of sociality in the aculeate Hymenoptera: maternal effects, sib-social effects, and heterochrony. The Quarterly Review of Biology 80, 317–336. Macek J., Straka J., Bogusch P., Dvořák L., Bezděčka P., Tyrner P. (2010) Blanokřídlí České republiky: Žahadloví I. Academia, Praha, 520 pp. Marr, A.K., Gooderham, W.J. & Hancock, R.E.W. (2006) Antibacterial peptides for therapeutic use: obstacles and realistic outlook. Current Opinion in Pharmacology 6, 468–472. Marris, G.C., Hubbard, S.F. & Scrimgeour, C. (1996) The perception of genetic similarity by the solitary parthenogenetic parasitoid Venturia canescens, and its effects on the occurrence of superparasitism. Entomologia Experimentalis et Applicata 78, 167–174. 33

Mendes, M.A., Souza, B.M. & Palma, M.S. (2005) Structural and biological characterization of three novel mastoparan peptides from the venom of the neotropical social wasp Protopolybia exigua (Saussure). Toxicon 45, 101 – 106. Michener, C.D. (2007) 1 The Bees of the World. Johns Hopkins University Press, Baltimore, 992 pp. Michener, C.D. & Michener, M.H. (1951) American Social Insects: A Book about Bees, Ants, Wasps, and Termites. Literary Licensing, LLC, 364 pp. Mitra, A. (2013) Function of the Dufour’s gland in solitary and social Hymenoptera. Journal of Hymenoptera Research 35, 33–58. Möglich, M., Maschwitz, U. & Hölldobler, B. (1974) Tandem calling: A new kind of signal in ant communication. Science 186, pp. 1046–1047. Noirot, C. & Quennedey, A. (1974) Fine structure of insect epidermal glands. Annual Review of Entomology 19, 61–80. O’Neill, K.M. (2001) Solitary Wasps: Behavior and Natural History. Cornell University Press, New York, 406 pp. Obin, M.S. & Vander Meer, R.K. (1985) Gaster flagging by fire ants (Solenopsis spp.): functional significance of venom dispersal behavior. Journal of Chemical Ecology 11, 1757–1768. Oeser, R. (1961) Vergleichend-morphologische Untersuchungen über den Ovipositor der Hymenopteren. Mitteilungen aus dem Museum für Naturkunde in Berlin. Zoologisches Museum und Institut für spezielle Zoologie (Berlin) 37, 3–119. Otvos, L., Jr (2002) The short proline-rich antibacterial peptide family. Cellular and Molecular Life Sciences CMLS 59, 1138–1150. Otvos, L.J. (2000) Antibacterial peptides isolated from insects. Journal of Peptide Science 6, 497–511. Owen, M.D. & Pfaff, L.A. (1995) Melittin synthesis in the venom system of the honey bee (Apis mellifera L.). Toxicon 33, 1181 – 1188. Packer, L. (2003) Comparative morphology of the skeletal parts of the sting apparatus of bees (Hymenoptera: Apoidea). Zoological Journal of the Linnean Society 138, 1–38. Peiren, N., de Graaf, D.C., Vanrobaeys, F., Danneels, E.L., Devreese, B., Van Beeumen, J. & Jacobs, F.J. (2008) Proteomic analysis of the honey bee worker venom gland focusing on the mechanisms of protection against tissue damage. Toxicon 52, 72–83. Peschel, A. (2002) How do bacteria resist human antimicrobial peptides? Trends in Microbiology 10, 179–186. Peschel, A. & Vincent Collins, L. (2001) Staphylococcal resistance to antimicrobial peptides of mammalian and bacterial origin. Peptides 22, 1651–1659.

34

Piek, T. (1985) Insect venoms and toxins. Comprehensive Insect Physiology Biochemistry and Pharmacology 10, 595–634. Piek, T., Spanjer, W. & others (1986) Chemistry and pharmacology of solitary wasp venoms. In: Venoms of the Hymenoptera. Biochemical, Pharmacological and Behavioural Aspects, pp. 161–307. Radović, I.T. (1985) Morphology and adaptive value of the sting apparatus of digger wasps (Hymenoptera: Sphecidae). Acta Entomologica Jugoslavica 21, 61–73. Rau, P. (1930) Mortality of Polistes annularis wasps during hibernation. The Canadian Entomologist 62, 81–83. Rau, P. & Rau, N.L.H. (1918) Wasp Studies Afield. Dover Publications, New York, 398 pp. Reed, H.C., Landolt, P.J. & others (2000) Application of alarm pheromone to targets by southern yellowjackets (Hymenoptera: Vespidae). Florida Entomologist 83, 193–196. Rehan, S.M., Leys, R. & Schwarz, M.P. (2012) A mid-cretaceous origin of sociality in Xylocopine bees with only two origins of true worker castes indicates severe barriers to eusociality. PLOS One 7, e34690. Scocchi, M., Tossi, A. & Gennaro, R. (2011) Proline-rich antimicrobial peptides: converging to a non-lytic mechanism of action. Cellular and Molecular Life Sciences 68, 2317–2330. Seeley, T.D. (2009) The Wisdom of the Hive: The Social Physiology of Honey Bee Colonies. Harvard University Press, Cambridge, Mass, 295 pp. Sharkey, M.J. (2007) Phylogeny and classification of Hymenoptera. Zootaxa 1668, 521– 548. Shorter, J.R. & Rueppell, O. (2012) A review on self-destructive defense behaviors in social insects. Insectes Sociaux 59, 1–10. Schmidt, J.O. (1983) Hymenopteran envenomation. In: Urban Entomology, Interdisciplinary Perspectives., pp. 187–216. Snodgrass, R.E. (1933) Morpholgy of the Insect Abdomen Part II. The Genital Ducts and the Ovipositor. Smithsonian Institution, City of Washington, 148 pp. Starks, P.T., Blackie, C.A. & Seeley, T.D. (2000) Fever in honeybee colonies. Naturwissenschaften 87, 229–231. Starr, C.K. (1985)a) A simple pain scale for field comparison of hymenopteran stings. Journal of Entomological Science 20, 225–231. Starr, C.K. (1985)b) Enabling mechanisms in the origin of sociality in the Hymenoptera the stings the thing. Annals of the Entomological Society of America 78, 836–840.

35

Steiner, A.L. (1976) Digger wasp predatory behavior (Hymenoptera, Sphecidae). Zeitschrift für Tierpsychologie 42, 343–380. Steiner, A.L. & Piek, T. (1986) Stinging behaviour of solitary wasps. In: Venoms of the Hymenoptera: Biochemical, Pharmacological, and Behavioural Aspects. Academic Press, London ; Orlando, pp. 63–160. Straus, S.K. & Hancock, R.E.W. (2006) Mode of action of the new antibiotic for Grampositive pathogens daptomycin: comparison with cationic antimicrobial peptides and lipopeptides. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes 1758, 1215–1223. Surendra, N.S., Jayaram, G.N., Reddy, M.R.S. & Ravikumar, H. (2013) Comparative morphometric studies of the sting apparatus of the worker bees of four different Apis species (Apis dorsata, Apis mellifera, Apis cerana and Apis florea). Journal of Apicultural Research 52, 74–80. Tossi, A., Tarantino, C. & Romeo, D. (1997) Design of synthetic antimicrobial peptides based on sequence analogy and amphipathicity. European Journal of Biochemistry 250, 549–558. Turillazzi, S. (2006) Polistes venom: a multifunctional secretion. Annales Zoologici Fennici 43, 488–499. Turillazzi, S., Dapporto, L., Pansolli, C., Boulay, R., Dani, F.R., Moneti, G. & Pieraccini, G. (2006) Habitually used hibernation sites of paper wasps are marked with venom and cuticular peptides. Current Biology 16, R530–R531. Vander Meer, R.K., Breed, M.D., Espelie, K.E. & Winston, M.L. (1998) Pheromone Communication in Social Insects. Westview Press Colorado, 368 pp. Vander Meer, R.K., Glancey, B.M., Lofgren, C.S., Glover, A., Tumlinson, J.H. & Rocca, J. (1980) The poison sac of red imported fire ant queens: source of a pheromone attractant. Annals of the Entomological Society of America 73, 609–612. Wager, B.R. & Breed, M.D. (2000) Does honey bee sting alarm pheromone give orientation information to defensive bees? Annals of the Entomological Society of America 93, 1329–1332. Wang, G. (2009) The Antimicrobial Peptide Database. APD2: the updated antimicrobial peptide database and its application in peptide design. Available from:http://aps.unmc.edu/AP/main.php. Whitfield, J.B. (2003) Phylogenetic insights into the evolution of parasitism in Hymenoptera. Advances in Parasitology 54, 69–100. Wilson, E.O. (1965) Chemical communication in the social insects. Science 149, 1064– 1071. Wilson, E.O. & Hölldobler, B. (2005) The rise of the ants: A phylogenetic and ecological explanation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 102, 7411–7414.

36

Winston, M.L. (1991) The Biology of the Honey Bee. Harvard University Press, 281 pp. Wyatt, T.D. (2003) Pheromones and Animal Behaviour: Communication by Smell and Taste. Cambridge University Press, Cambridge, 391 pp. Zasloff, M. (2002) Antimicrobial peptides of multicellular organisms. Nature 415, 389– 395.

37