Univerzita Karlova v Praze Přírodovědecká fakulta Studijní program: Biologie Studijní obor: Biologie
Kristýna Haltufová
Paenibacillus larvae jako patogen ničící populace včely medonosné (Apis mellifera) Paenibacillus larvae destroying the honeybees (Apis mellifera) population
Bakalářská práce
Vedoucí závěrečné práce: Mgr. Jan Hubert Ph.D.
Praha, 2015
Prohlášení: Prohlašuji, že jsem závěrečnou práci zpracovala samostatně a že jsem uvedla všechny použité informační zdroje a literaturu. Tato práce ani její podstatná část nebyla předložena k získání jiného nebo stejného akademického titulu.
V Praze, 11. 8. 2015
Podpis
Poděkování Chtěla bych zde poděkovat svému školiteli Mgr. Janu Hubertovi Ph.D. za možnost pracovat pod jeho vedením na této bakalářské práci, za trpělivost a hlavně za poskytnuté rady. Zároveň patří mé díky Ing. Janu Tylovi a MVDr. Martinu Kamlerovi z Výzkumného ústavu včelařského v Dole za odborné rady v řešené problematice. Také chci poděkovat své rodině, přátelům a všem, kteří mě podporovali.
Abstrakt Paenibacillus larvae je Gram-pozitivní, sporulující bakterie tyčinkovitého tvaru. Tento nebezpečný patogen ohrožuje jednoho z nejvýznamnějších světových opylovačů – včelu medonosnou (Apis mellifera). Způsobuje chorobu včel zvanou mor včelího plodu. Přestože dokáže napadnout pouze včelí larvy, nejlépe první den jejich života, je schopný velice oslabit až vyhubit celou včelí kolonii. Dospělé včely nejsou náchylné vůči nákaze, avšak kvůli obrovské odolnosti spor P. larvae, zprostředkovávají roli hlavního přenašeče a šiřitele choroby. K většímu rozšíření napomáhají mnohdy i nedbalí a nezkušení včelaři. Choroby včel jsou vyšetřovány státní veterinární správou, jelikož je včela zařazována mezi hospodářská zvířata. Pokud se nemoc rozvine až do klinické fáze, nakažené včely a úl se všemi pomůckami je nařízeno spálit. Mor včelího plodu je jedna z nejvážnějších včelích chorob. Tato bakalářská práce pojednává o problematice celé choroby a zaměřuje se na interakce mezi bakterií Paenibacillus larvae, blanokřídlým hmyzem včelou medonosnou a lidským faktorem v podobě včelařů, státní veterinární správy i konkrétních zákonů.
Klíčová slova: Paenibacillus larvae, mor včelího plodu, entomopatogenní bakterie, Apis mellifera, včela medonosná
Abstract Paenibacillus larvae is Gram-positive, spore-forming, rod-shaped bacteria. This pathogen threatens one of the most considerable worldwide pollinators – the honeybee (Apis mellifera). It is causative agent of bee disease called American foulbrood. Although it affects only bee larvae, preferably on the first day of its live, it is highly contagious and could quickly destroy whole bee colony. Adult bees are not susceptible to infection, however due to huge spores resilient of P. larvae, they perform the role of main disease vector. Also the careless beekeepers make it easier to spread. Bee diseases are enquired by state veterinary administration, because honeybee is classified as a livestock. If disease evolves to clinic phase, infected bees and hive with all tools must be burned. American foulbrood is one of the most deleterious bee diseases. This bachelor thesis discuss about problems of whole disease and it is focused on the interactions between bacteria Paenibacillus larvae, hymenoptera insect honeybee and human factor presented by beekeepers, state veterinary administration and corresponding laws.
Key words: Paenibacillus larvae, American Foulbrood, entomopathogenic bacteria, Apis mellifera, honeybee
Obsah Úvod ........................................................................................................................................... 1 1.
Včela medonosná (Apis mellifera) ...................................................................................... 2 1.1.
Taxonomie ................................................................................................................... 2
1.2.
Historie ........................................................................................................................ 2
1.3.
Význam včel ................................................................................................................ 2
1.4.
Patologie včel .............................................................................................................. 3
1.4.1. 2.
3.
4.
Choroby včel ........................................................................................................ 3
Paenibacillus larvae ........................................................................................................... 4 2.1.
Taxonomie ................................................................................................................... 4
2.2.
Historie ........................................................................................................................ 4
2.3.
Genotypy ..................................................................................................................... 4
2.4.
Stádia životního cyklu ................................................................................................. 5
Interakce larvy včely medonosné a bakterie Paenibacillus larvae ..................................... 8 3.1.
Způsob napadení .......................................................................................................... 8
3.2.
Průběh nákazy.............................................................................................................. 8
Mor včelího plodu ............................................................................................................. 13 4.1.
Historie ...................................................................................................................... 13
4.2.
Příznaky nemoci ........................................................................................................ 13
4.3.
Přenos a šíření ............................................................................................................ 14
4.4.
Vyšetřování a řešení nemoci...................................................................................... 16
4.5.
Detekce ...................................................................................................................... 17
4.6.
Výskyt ........................................................................................................................ 18
4.7.
Prevence a léčba ........................................................................................................ 19
Závěr......................................................................................................................................... 20 Seznam zkratek ........................................................................................................................ 21 Definice použitých výrazů ....................................................................................................... 21 Seznam použité literatury ......................................................................................................... 22
Úvod Včely jsou zástupci blanokřídlého hmyzu reprezentované známým modelem sociálně společenských včel, ale také mnoha samotářských druhů (Roulston and Goodell 2011, Encyclopedia of Life [online]). Nejdůležitější činností včel je přirozené opylování rostlin v okolí jejich úlu či hnízda za účelem získání pylu a nektaru (Morse & Calderone, 2000). Této skutečnosti člověk využil a začal cíleně chovat včely (Ransome, 2012). Zřejmě nejznámějším a nejrozšířenějším druhem včely se stala včela medonosná (Apis mellifera Linnaeus, 1758). Jelikož jsou včely pro člověka významné nejen jako opylovači, ale zároveň kvůli obchodu se včelami a jejich produkty, jsou zařazeny mezi hospodářská zvířata a řešení jejich problémů spadá pod Státní veterinární správu (Zákon č. 166/1999 Sb., § 3). Jednou z oblastí řešených SVS jsou choroby včel. Včely mají poměrně velké množství přirozených parazitů a nemocí (Evans & Schwarz, 2011). Tyto nemoci mohou významně ovlivňovat mizení včel v posledních zhruba deseti letech zvané Syndrom zhroucení včelstev (vanEngelsdorp et al., 2009). Jednou z velice závažných včelích chorob je mor včelího plodu, jehož původcem je bakterie Paenibacillus larvae (White, 1906) (Genersch, 2008, 2010a). Tato bakterie napadá pouze larvy včely medonosné, nikoli dospělce, ti nevědomky přenáší spory P. larvae a nemoc tím šíří (Fries & Camazine, 2001; Lindström, Korpela, & Fries, 2008b). Pokud se mor v úlu rozvine do nejhoršího stádia, nakažené úly se musí spálit (Vyhláška č. 299/2003 Sb., § 140). Kvůli odolnosti spor zatím není znám a používán žádný lepší účinný způsob likvidace nákazy. MVP ohrožuje včelstva po celém světě a je považován za jednu z nejnebezpečnějších včelích chorob (Morrissey et al., 2015). Cílem této bakalářské práce je vytvořit literární rešerši týkající se vzájemných vztahů mezi bakterií Paenibacillus larvae, blanokřídlým hmyzem včelou medonosnou a včelaři. Popíši způsob, kterým bakterie napadá a usmrcuje včelí larvu a zároveň zdůrazním velký vliv dospělých včel na šíření patogenu včetně vypsání konkrétních způsobů přenosu. Pozornost je věnována také významu včely medonosné jako světového opylovače a biologii bakteriálního původce choroby. Práce sleduje i vliv člověka na šíření, rozpoznání a řešení moru včelího plodu jakožto závažné choroby v aktuálním světovém dění.
1
1. Včela medonosná (Apis mellifera) 1.1.
Taxonomie
Včela medonosná náleží do čeledi Apidae, řádu Hymenoptera neboli blanokřídlí, třídy Insecta, kmene Arthropoda a do říše Ophistokonta domény Eukaryota. Mezi blanokřídlý hmyz patří kromě včel například také další sociální hmyz jako vosy či mravenci (Encyclopedia of Life [online]). Přestože je včela medonosná pravděpodobně nejčastěji vídaným zástupcem včel v naší přírodě, čeleď Apidae zahrnuje více než 25 000 druhů včel, nejen další sociálních skupin a zástupců rodu Apis, ale i mnoho rodů samotářských včel (Roulston and Goodell 2011, Encyclopedia of Life [online]).
1.2.
Historie
Včely obývaly svět mnohem dříve než člověk. Vyvinuly se pravděpodobně v oblasti současné střední Evropy, jelikož se zde našly jejich nejstarší fosilie, které se výrazně nelišily od současných včel. Odkdy se člověk začal zajímat o včely a využívat je ke svému prospěchu, se asi přesně nedozvíme. Existují však důkazy o sbírání medu z hnízd v pozdním paleolitu, což je okolo 10 000 let před naším letopočtem. Záznamy o počátcích včelaření jsou známé i ze starověkého Egypta, Řecka, Říma či Indie a Číny (Ransome, 2012). Je tedy očividné, že včely byly od dávných časů důležité jak pro přírodu, tak i pro člověka.
1.3.
Význam včel
Zřejmě nejmarkantnější činností včel je přirozené opylování rostlin za účelem získání pylu a nektaru, který poté uskladňují ve svých hnízdech či úlech a slouží jim jako potrava. Se stále rostoucím počtem obyvatel planety se navyšuje i spotřeba hospodářských plodin, a s tím spojená také nutnost většího množství opylovačů. Nejpočetnější skupinou živočichů zprostředkující opylení je hmyz, jemuž kraluje včela medonosná (Morse & Calderone, 2000). Dalším důvodem, proč lidé chovají včely, je velké množství produktů, které včely přirozeně vyrábí. Člověk se naučil tyto produkty využívat v mnoha různých oblastech. Nejznámějším produktem je bezpochyby med, který používáme nejvíce jako sladidlo do různých pokrmů či nápojů a také třeba při výrobě alkoholického nápoje Medoviny. Při vaření můžeme použít i včelí vosk, nicméně jeho větší uplatnění se nachází spíše ve farmacii, kosmetice a proslulé jsou i voskové svíčky. Včelí produkty se však ve zdravotnictví používají poměrně často. Kromě již zmíněného vosku jsou to také v přírodě sesbíraný pyl a propolis, mateří kašička a také včelí jed (Spürgin, 2013). 2
Díky výše zmíněnému nenahraditelnému přínosu pro člověka patří včela medonosná mezi hospodářská zvířata (Zákon č. 166/1999 Sb; § 3). Kvůli obchodu se včelami a jejich produkty jsou i nemoci včel řešeny na stejné úrovni jako nemoci dobytka, koní, prasat a dalších hospodářských zvířat (OIE, 2014, 2015).
1.4.
Patologie včel
V posledních již zhruba deseti letech začal postupně po celém světě klesat počet včel a včelích kolonií v nepřehlédnutelném množství. Tento jev byl pojmenován Colony collaps disorder (CCD) neboli Syndrom zhroucení včelstev (Rada, Havlík, & Flesar, 2009; vanEngelsdorp et al., 2009). Syndrom se projevuje poklesem včelích dělnic v kolonii, vyšším počtem plodu a zásob než dělnic, ale malým množstvím mrtvých dospělých včel (Cox-Foster et al., 2007). Přesná příčina zůstává zatím stále neobjasněna, avšak nejpravděpodobnějším vysvětlením by mohlo být dlouhodobé společné působení negativních stresových vlivů na včelí kolonie – množství patogenů, parazitů a chorob, pesticidy, nedostatečná variabilita rostlinných druhů v okolí, nedostatek potravy (odebrání velkého množství medu a doplnění malým množstvím cukerné náhrady), kočování či celková špatná péče včelaře (Sharpe & Heyden, 2009; vanEngelsdorp & Meixner, 2010). Z včelích chorob mohou mít pozitivní vliv na rozvoj CCD například varroáza, nosematóza nebo virové nemoci jako Izraelský akutní paralyzující virus (Cox-Foster et al., 2007; vanEngelsdorp et al., 2009). 1.4.1. Choroby včel Včely mají poměrně velké množství přirozených nemocí a parazitů. Pro příklad uvádím výčet významnějších zástupců. Nemalé problémy působí včelám viry. Zdraví ohrožující jsou například virus deformovaných křídel, viry akutní a chronické paralýzy včel nebo již zmiňovaný Izraelský virus akutní paralýzy. Dále mají důležité bakteriální patogeny. Prvním je Melissococcus plutonius (White, 1912), který je hlavním původcem hniloby včelího plodu a druhým je Paenibacillus larvae, jež způsobuje mor včelího plodu. Ohrožením je pro včely také nosematóza způsobená mikrosporidiemi neboli hmyzomorkami Nosema apis (Zonder, 1909) a N. ceranae (Fries et al., 1996), které napadají převážně trávicí trakt. Zástupem hub je také Ascosphaera apis (L. S. Olive & Spiltoir, 1955), která je původcem nemoci zvané zvápenatění včelího plodu. Mezi včelí ektoparazity patří roztoč Varroa destructor Anderson & Trueman, 2000 způsobující varroázu a sající hemolymfu dospělců i larev (Genersch, 2010b, Choroby včel [online]). Tato práce je zaměřena na problematiku bakteriálního patogenu Paenibacillus larvae a jeho vlivu na kolonie včely medonosné.
3
2. Paenibacillus larvae 2.1.
Taxonomie
Paenibacillus larvae je obligatorní patogenní bakterie, patřící do kmene Firmicutes. Tato Gram-pozitivní, fakultně anaerobní baterie má dvě životní stádia – tyčinkovité vegetativní a elipsovité sporulující. Napadá včelí larvy a vyvolává u nich chorobu zvanou mor včelího plodu. U této bakterie je v současné době popsán genom (Djukic et al., 2014). Paenibacillus larvae v současnosti náleží do čeledi Paenibacillaceae, řádu Bacillales, třídy Bacilli a do kmenu Firmicutes, který spadá přímo pod doménu Bacteria. Dalšími bakteriálními rody patřícími do tohoto kmenu jsou například Staphylococcus, Streptococcus, Lactobacillus či Clostridium. Čeleď Paenibacillaceae čítá okolo 160 patogenních i nepatogenních zástupců rodu Paenibacillus a zhruba 3100 dalších zástupců Paenibacillus sp. (Encyclopedia of Live [online]; List of prokaryotic names with standing in nomenclature [online]; Mohapatra & La Duc, 2013).
2.2.
Historie
Od začátku dvacátého století až do současnosti prošlo pojmenování samotného patogenu mnoha změnami. V roce 1906 byl nazván Bacillus larvae (White, 1906), poté byla izolována další bakterie, určená jako Bacillus pulvifaciens (Katznelson, 1950). Obě tyto bakterie byly považovány za původce moru včelího plodu. Na základě sekvenční analýzy malé podjednotky rRNA – 16S rRNA a následně zjištěné výrazné odlišnosti bakterií B. larvae, B. pulvifaciens a mnohých dalších od rodu Bacillus, vzniká nový rod Paenibacillus. Pojmenování patogenů se mění na Paenibacillus larvae a Paenibacillus pulvifaciens (Ash, Priest, & Collins, 1993). Po dalších molekulárních analýzách došlo k přeřazení P. larvae a P. pulvifaciens do jednoho druhu Paenibacillus, avšak do dvou poddruhů – P. larvae larvae a P. larvae pulvifaciens (Heyndrickx et al., 1996). Konečnou změnou v klasifikaci bylo přeřazení P. l. larvae a P. l. pulvifaciens do jednoho společného druhu Paenibacillus larvae (Genersch et al., 2006).
2.3.
Genotypy
V roce 2006 se vědecky potvrdilo, že Paenibacillus larvae nemá dva speciální poddruhy P. l. larvae a P. l. pulvifaciens, nýbrž že existuje pouze druh P. larvae, který je reprezentován čtyřmi různými genotypy. Tyto genotypy byly zjišťovány molekulární metodou rep-PCR za použití ERIC primerů a podle nich získaly genotypy své označení – ERIC I, II, III a IV (Genersch et al., 2006). Většina výzkumů se zaměřuje převážně na genotypy ERIC I a II, jelikož jsou nejvíce rozšířené. Jednotlivé genotypy se od sebe různě liší. Virulence u ERIC I 4
je spíše pomalá, včelí larvu usmrtí až po zhruba dvanácti dnech jejího života (viz 3.2. Průběh nákazy). Genotypy ERIC II, III a IV mají rychlejší průběh infekce a larvu usmrtí okolo sedmého dne života (Rauch, Ashiralieva, et al., 2009). Rozeznáme je také v elektronovém mikroskopu podle různého povrchu spor. Zatímco ERIC I má hladký povrch, ERIC II vypadá hrbolatě a připomíná strukturu mozku a ERIC III a IV mají různě velké odlišitelné vyvýšeniny. Další můžeme pozorovat při kultivačních pokusech na Petriho miskách. Vyrostlé kolonie mají výrazně odlišitelné barvy, ERIC I a IV bílou až šedou a ERIC II a III oranžovou až červenou. Odlišných fenotypových i genotypových vlastností mají tyto čtyři genotypy mnohem více (Genersch et al., 2006).
2.4.
Stádia životního cyklu
Paenibacillus larvae má dvě životní stádia. Vegetativní stádium je tyčinkovitého tvaru cca 1,6 - 4,5 µm dlouhé a 0,4 - 0,6 µm široké (Ludvik, Benada, & Drobnikova, 1993). Nachází se pouze ve střevě uvnitř larvy, jelikož není dostatečně odolné. Nepřežije v dospělcích a například ani v potravě larev, v mateří kašičce (Hornitzky, 1998; Wilson, 1971). Sporulující stádium je charakteristické tvorbou spor elipsovitého tvaru o velikosti cca 0,6 x 1,2 µm (Ludvik et al., 1993). Spory jsou velmi odolné a bakterie díky tomu dokáží přežít v nejrůznějších nepříznivých podmínkách (Nicholson, Munakata, et al., 2000). Vysoká odolnost spor P. larvae, ale i dalších sporulujících bakterií z kmene Firmicutes, je dána jejich stavbou. Mají šest obalů, pod nimiž se nachází dobře chráněné jádro obsahující genetickou informaci (Setlow, 2007). Podle vnějšího povrchu spor můžeme určit příslušný genotyp P. larvae (viz 2.3. Genotypy) (Genersch et al., 2006). Spory jsou přenášeny dospělými včelami, které tím zprostředkují rozšíření bakterie (Fries, Lindström, & Korpela, 2006; Lindström, Korpela, & Fries, 2008a; Wilson, 1971). Paenibacillus larvae může ve vzácných případech způsobit i bakteriózu, respektive může se dostat do lidského těla, kde se poté nachází v krvi. Jedním prokázaným příkladem je nákaza z kontaminovaného medu, který byl použit k ředění látek, které si injikovali drogově závislí lidé. Nakažení trpěli horečkami, slabostí, nevolností, ospalostí, slizničním krvácením, chudokrevností či měli problémy s dýcháním i s játry (Rieg et al., 2010).
5
Obr. 1: Vegetativní buňka Paenibacillus larvae subsp. larvae, rok 2002; Zdroj: ASM MicrobeLibrary.org, autor Donald Stahly.
Obr. 2: Spora Bacillus larvae. Upraveno dle (Bakhiet & Stahly, 1985). Šipky ukazují na jednotlivé obaly spory, avšak jsou pojmenovány jinak, než je standardem v současnosti. Proto nepřidávám popis.
6
Obr. 3: Obecná struktura bakteriální spory, zástupců kmene Firmicutes. Upraveno podle (Setlow, 2007).
7
3. Interakce larvy včely medonosné a bakterie Paenibacillus larvae 3.1.
Způsob napadení
Paenibacillus larvae dokáže napadnout pouze larvy včely medonosné (Wilson, 1971; Yue, Nordhoff, et al., 2008). Čím dříve larva pozře infekční spory, například při přijímání potravy od dospělé včely, tím dříve v ní mohou vyklíčit, a postupně larvu napadnout. Se zvyšujícím se stářím larvy se snižuje šance na její úspěšné nakažení. Nejefektnější průběh nastane v prvním dnu života a již okolo 48 hodin života začíná být larva rezistentní (Bamrick, 1967; Brødsgaard, Ritter, & Hansen, 1998). V těchto prvních dnech se larva ještě celkově vyvíjí a jednou z jejich důležitých vnitřních struktur je peritrofická matrix, která onu rezistenci zvyšuje (Garcia-Gonzalez & Genersch, 2013). Peritrofická matrix (PM, někdy zvaná též peritrofická membrána) se vytváří nejen u většiny hmyzu, ale i u dalších skupin živočichů, a odděluje buňky střevního epitelu od pozřené potravy. Slouží tedy k ochraně střevního epitelu před mechanickým poškozením a toxickými látkami, přispívá k lepšímu trávení a její pravděpodobně hlavní funkcí je ochrana před patogeny. Primární a většinou nejvíce zastoupenou složkou PM je chitin, respektive chitinová vlákna, a dále různé proteiny (Hegedus, Erlandson, et al., 2009; Lehane, 1997). Je dokázáno, že peritrofická matrix je pro život larvy nepostradatelná. Při pokusech s proděravěním či zničením PM podáním Calcofluor White, což je chitin vázající barvivo používané při biologických pokusech, a endochitinázy bakterie Streptomyces griseus (Krainsky, 1914), byla u testovaných larev významně zvýšena jejich úmrtnost. Po patnácti dnech byla úmrtnost kontrolních larev zhruba 13 %, zatímco u larev krmených potravou s přídavkem látky Calcofluor White, dosahovala úmrtnost 39 % až 57 %, v závislosti na koncentraci. U larev krmených potravou s obsahem endochitinázy z bakterie Streptomyces griseus byla úmrtnost stoprocentní (Garcia-Gonzalez & Genersch, 2013).
3.2.
Průběh nákazy
Z dospělých včel, které pečují o právě vylíhlé larvy, se při krmení přenesou spory P. larvae – infekční stádia, které se nacházejí nejen v prostorách úlu, ale hlavně přímo ve vyživovacích neboli hltanových žlázách včel (Fries & Camazine, 2001; Lindström et al., 2008b; Wilson, 1971). Larva pozře spory a uvnitř trávicího traktu, v mezodeu, začnou spory nepravidelně a nestejnoměrně klíčit. Následuje proces obrovského množení vegetativních stádií bakterie ve střevě. Při této fázi nejsou na larvě pozorovatelné žádné změny v porovnání s nenakaženou larvou. Bakterie se zatím živí jako komenzál cukrem z potravy, kterou přijímá larva (Djukic et al., 2014; Yue et al., 2008). Uvnitř střeva vylučuje sekundární metabolity, které pomáhají 8
potlačit přirozenou mikroflóru larvy a také vykazují cytotoxickou aktivitu (Garcia-Gonzalez, Müller, et al., 2014; Müller et al., 2015). Zároveň začíná bakterie pomocí speciálních proteáz, které vážou chitin, ničit vyvíjející se peritrofickou matrix (viz výše) (Djukic et al., 2014). Jedním z klíčových proteinů vázajících chitin je PlCBP49. Pokud tento protein nefunguje správně, degradace PM se značně snižuje, což vytváří horší podmínky pro úspěšný rozvoj infekce (Garcia-Gonzalez, Poppinga, et al., 2014). Po přibližně šesti dnech života, dosáhne larva dostatečné velikosti k zahájení metamorfózy a včelí dělnice ji uvnitř buňky zavíčkují stavebním voskem (Spürgin, 2013). Paenibacillus larvae tuto změnu v životě larvy pozná a zhruba ve stejnou dobu, nejlépe již po zavíčkování, přestává ve střevech žít jako komenzál a zahájí invazi skrze střevní epitel (Yue et al., 2008). V této chvíli už se na larvě začínají projevovat změny. Po zničení peritrofické matrix získá patogen přímý přístup k epiteliální vrstvě střev. Princip invaze spočívá ve využití mezibuněčných spojů střevního epitelu a proniknutí skrze ně do vnějšího prostoru střeva a do hemocoelu (Yue et al., 2008). Mechanizmy průniku však nejsou u všech genotypů stejné (Poppinga & Genersch, 2015). Genotyp ERIC I využívá k proniknutí skrze mezibuněčné spoje mnoha toxinů, například z rodiny Plx (Djukic et al., 2014). Genotyp ERIC II využívá protein SplA, který se nachází v S-vrstvě okolo bakterie, a pomocí něho se přichytí na střevní buňky (Poppinga et al., 2012). Přesný způsob průniku mezibuněčnými spoji zůstává však nejasný (Müller et al., 2015; Poppinga et al., 2012). Příčinou rozdílných strategií je pravděpodobně různorodost genotypů – ERIC I postrádá protein SplA, zatímco u ERIC II chybí potřebné toxiny (Djukic et al., 2014). Po proniknutí skrze střevní epitel následuje postupná degradace veškeré tkáně, která larvu brzy usmrtí (Djukic et al., 2014; Genersch et al., 2006; Gregorc & Bowen, 1998; Poppinga & Genersch, 2015; Yue et al., 2008). P. larvae využívá během celé invaze mnoha proteáz, například pro utlumení imunitní odpovědi larvy, pro narušení mezibuněčných spojů a lepší průnik epitelem nebo k budoucímu rozkladnému procesu mrtvé larvy (Djukic et al., 2014). Poté, co larva zemře, probíhá stále její degradace a tělo larvy postupně mění svůj vzhled. Nejprve se vyvine v gelovitou či tekutý karamel připomínající zapáchající hmotu nahnědlé barvy. Ta následně vysychá, mění barvu do tmavší hnědé, zůstává pevně přichycena na stěně uvnitř buňky a obsahuje velké množství spor. Nazýváme ji příškvar a při jeho čištění na sebe dospělé včely přenesou spory, které následně šíří (viz 4.3.) (Ashiralieva & Genersch, 2006; Poppinga & Genersch, 2015; Titěra, 2009). Sporulace uvnitř larvy neprobíhá pouze v mrtvém, rozkládajícím se těle larvy, ale probíhá různě po celou dobu infekce (Yue et al., 2008). 9
Obr. 4: Průnik P. larvae střevním epitelem pomocí mezibuněčných spojů. Zdroj: Upraveno od (Poppinga & Genersch, 2015). 1. Sekundární metabolity působící uvnitř střeva (šestihrany). 2. Chitin degradující protein PlCBP49 (červené hvězdy). 3.1 Genotyp ERIC I vylučuje toxiny pro průnik střevním epitelem (fialové ovály). 3.2 Genotyp ERIC II se váže na střevní epitel pomocí proteinu SplA v S-vrstvě (žlutý okraj).
Obr. 5: Nakažené včelstvo, larva v konečném rozkladném stádiu gelovité či karamel připomínající hmoty. Zdroj: Wikimedia Commons; autor Tenarus
10
Obr. 6: Účinek působení P. larvae na peritrofickou matrix včelí larvy a průběh infekce. Upraveno dle (Garcia-Gonzalez & Genersch, 2013). PM – peritrofická matrix; Ep – epitel střeva; St – vnitřní prostor střeva (mezodeum); Mv – mikroklky (mikrovilli). Černé šipky označují místa průniku P. larvae. A – zdravá larva, kontrola, stáří 4 dny; peritrofická matrix je jasně viditelná a silná struktura oddělující potravu ve střevě od střevního epitelu B – larva nakažená P. larvae, stáří 4 dny; PM zde není vůbec vyvinuta a obsah střeva i s možnými patogeny je v přímém kontaktu se střevním epitelem C – živá larva; vegetativní stádia P. larvae začínají prostupovat skrze mezibuněčné spoje D – mrtvá larva; zde už P. larvae výrazně porušuje střevní epitel včelí larvy
Pokud je vývoj bakterie rychlý, nastane smrt larvy ještě před zavíčkováním. Rychlý postup infekce mají genotypy ERIC II, III a IV (viz kap. 2.3. Genotypy), které larvu zabijí okolo sedmého dne (Rauch et al., 2009). Mrtvé larvy nebo neobvyklých změn si všimnou dělnice a vynesou larvu pryč z úlu, což napomáhá zamezení šíření nákazy (Spivak & Reuter, 2001). Pokud je postup infekce pomalejší jako u genotypu ERIC I (viz kap. 2.3. Genotypy), který usmrtí larvu až okolo dvanáctého dne života, existuje velká pravděpodobnost, že larva bude zavíčkovaná a dospělé včely si tedy nemohou všimnout změn probíhajících uvnitř buňky (Rauch et al., 2009). 11
Obr. 7: Průběh nákazy včelí larvy bakterií Paenibacillus larvae. Červené tečky reprezentují bakteriální spory a zeleně jsou vegetativní stádia. Černé písmo odděluje neinvazivní fázi nákazy od invazivní fáze, ta je červeným písmem. Upraveno dle (Poppinga & Genersch, 2015).
Pokud pozřou spory dospělé včely, na jejich zdravotním stavu se neprojeví žádné pozorovatelné změny. Když včely podrobíme pitvě, najdeme uvnitř těla mnoho spor, které za normálních okolností projdou trávicím traktem za zhruba tři dny, avšak velké množství spor se nashromáždí v již zmiňovaných vyživovacích žlázách, kde dokáží přežít minimálně 28 dní. Těmito žlázami vytváří mateří kašičku, kterou krmí nejmladší larvy, a tímto způsobem je nemoc přenesena na další generace. Vegetativní stádia v dospělých včelách nalézána nejsou (Lindström, 2008; Wilson, 1971).
12
4. Mor včelího plodu Mor včelího plodu je bakteriální onemocnění mladých včelích larev, jehož původcem je Paenibacillus larvae.
4.1.
Historie
Nemoc včel s podobnými příznaky, kterými se dnes popisuje mor včelího plodu, byla popsána v 18. století a nazvána „Foulbrood“. ‚Foul‘, mající v angličtině význam hnilobný, odporný, zkažený a ‚brood‘ znamenající plod, potomstvo (Schirach, 1769, podle Genersch, 2010). V roce 1906 byl zaveden pro chorobu včelího plodu konkrétnější název, jak ho známe i ze současné anglicky psané literatury, „American foulbrood“ (White, 1906).
4.2.
Příznaky nemoci
Pokud je úl nakažen, můžeme to většinou poznat již při jeho prohlédnutí. Plodové plástve vykazují výrazné změny oproti zdravým plástvím, takzvané klinické příznaky. Nápadnou změnou je mezerovitost plodu, jelikož u zdravých včelstev je plod celistvý a jen zřídka se objevují prázdné nezakladené buňky (viz obr. 8). Mezerovitost se však objevuje i u jiných včelích nemocí či u špatně kladoucí matky. Některé buňky mají ve víčku malý otvor, který udělají dospělé včely, když kontrolují, zda je larva uvnitř nakažená (viz obr. 5). Nejzřetelnějším klinickým příznakem silného propuknutí MVP jsou rozkládající se larvy gelovitého či karamelovitého vzhledu s typickým nepříjemným zápachem. Dají se většinou odhalit zápalkovým testem, který spočívá ve vložení sirky do buňky plástve a při vytahování z buňky by se za sirkou mělo táhnout vlákno z rozkládající se larvy (viz obr. 5). Larvy po rozložení vyschnou na příškvar pevně přichycený ke stěně buňky, který obsahuje spory P. larvae (Titěra, 2009).
Obr. 8a: Srovnání velice nakaženého plodu se zdravým plodem. Zdroje: The Bee Informed Partnership, American foulbrood; autor: Rob Snyder; beeinformed.org (vlevo) a University of Georgie, Non-infectious diseases and pests, Spotty brood; ent.uga.edu (vpravo). 13
Obr. 8b: Výřez nakažené plodové plástve. Můžeme vidět otvory ve víčkách, mezerovitost, propadlá víčka, nakažené larvy. Zdroj: The Bee Informed Partnership, American foulbrood; autor: Rob Snyder; beeinformed.org
4.3.
Přenos a šíření
Mor včelího plodu se šíří nejvíce skrze dospělé včely medonosné. Jelikož jsou vůči nákaze již odolné, slouží nevědomky jako přenašeči a rezervoár bakterie. (Lindström et al., 2008b; Lindström, 2008; Wilson, 1971). U včel nalezneme oba hlavní způsoby přenosu chorob a jejich původců – vertikální (z královny na potomstvo, rojení) a horizontální (mezi včelími dospělci navzájem a mezi dělnicemi a plodem, krádeže) (Fries & Camazine, 2001). Obě varianty se odlišně uplatňují uvnitř i vně úlu. Vertikální přenos není příliš účinným typem přenosu MVP. Uvnitř úlu je možný pouze prostřednictvím královny, která přenese spory na své potomky – dělnice, trubce či jinou královnu. Přenos choroby z královny přímo na plod zatím není známý (Fries & Camazine, 2001). Šíření mimo úl představuje rojení, tedy rozmnožování včel na úrovni kolonií. Pokud je ve včelstvu například nadpočet jedinců v porovnání s velikostí úlu, odpojí se od něho roj včel, někdy i více rojů, které začínají fungovat samostatně. Tyto roje poté hledají nové místo k uhnízdění, a pokud bylo původní včelstvo nakaženo, může se nemoc tímto způsobem rozšířit do jiných oblastí. Ve volné přírodě však množství spor, které si roje nesou s sebou, prokazatelně velmi klesá (Fries et al., 2006). I přesto je preventivním opatřením proti nákaze MVP vyhledávat a utrácet včelí roje neznámého původu (Vyhláška č. 299/2003 Sb.; § 138). Horizontální přenos u této choroby převažuje, což není u ostatních včelích parazitů obvyklé. Pokud se bakterie už nachází v úlu, roznese se postupně do všech jeho částí. Dospělé včely ji na sebe přenesou při čištění nakažených larev nebo při stravování, a pak si ji při jakémkoli kontaktu mohou předat (Fries & Camazine, 2001). Po pozření spor zprostředkovávají mladší včelí dělnice přenos v rámci úlu, jelikož se uvnitř jejich těla spory nashromáždí i ve vyživovacích žlázách, které vytváří mateří kašičku, jíž jsou krmeny larvy v prvních třech dnech života. Tímto způsobem jsou spory přeneseny na právě narozené larvy, které jsou nejvíce náchylné k nákaze (Spürgin, 2013; Wilson, 1971). 14
Starší včely, které již létají ven z úlu a sbírají v přírodě potravu, přenáší spory mimo úl. Pozřené spory prochází jejich zažívacím traktem a jsou postupně vylučovány spolu s výkaly do okolí. Největší množství spor se v nich nachází mezi druhým a šestým dnem, ale v postupně se snižujícím množství se objevují po dobu dvou měsíců a více. Pokud by se nějaká nakažená včela dostala do cizího včelstva, mohla by tímto způsobem nemoc za určitých okolností přenést (Wilson, 1972). Pokud nakažená včelí kolonie velmi zeslábne nebo nákaze podlehne, v jejím úlu zbydou velké zásoby potravy. Včely z okolí si všimnou, že úl nikdo nestráží, a tak jim nic nebrání si připravené zásoby přenést do svého úlu. Nemoc se tímto způsobem může v plné síle rozšířit nejméně do vzdálenosti jednoho kilometru (Lindström et al., 2008a). Roznášet bakterii mohou i ostatní parazité včel jako například roztoč Varroa destructor nebo brouk Aethina tumida Murray, 1867 (Rycke, Joubert, et al., 2002; Schäfer, et al., 2009). V současné době napomáhají horizontálnímu přenosu mezi koloniemi i včelaři. Pokud krmí včely neznámými zásobami či zásobami včelstev, jejichž současný zdravotní stav neznají, přemísťují plástve mezi různými úly, používají pro více včelstev totéž vybavení, slabší včelstva spojují se silnějšími nebo mají mnoho včelstev na jednom místě, což může vést k nedostatku potravy a k vykrádání úlů, může se nemoc s velkou pravděpodobností úspěšně přenášet (Fries & Camazine, 2001; Lindström et al., 2008b).
Obr. 9: Schéma přenosu a šíření moru včelího plodu uvnitř úlu a v přírodě. Autor: Kristýna Haltufová
15
4.4.
Vyšetřování a řešení nemoci
Včely a včelstva se podle veterinárního zákona řadí mezi hospodářská zvířata (Zákon č. 166/1999 Sb., § 3). Problémy ohledně chorob včel, včetně moru včelího plodu, řeší Státní veterinární správa ČR příslušného kraje (Vyhláška č. 299/2003 Sb.; Nákazy včel). Pokud vznikne podezření, že by se na určitém včelím stanovišti mohla nacházet včelstva nakažená morem včelího plodu, nařídí a provede krajská veterinární správa klinické vyšetření všech včelstev daného stanoviště a odebere vzorky plodových pláství a měli. Včelaři je zároveň doporučeno, jak v aktuální situaci pečovat o včely, aby se nemoc dále nešířila, a jak jim při zdolávání nemoci připravit vhodné podmínky. Odebrané vzorky budou následně laboratorně vyšetřeny v akreditovaných a specializovaných institucích (viz 4.5. Detekce). Pokud jsou výsledky z odebraných vzorků pláství pozitivní a zároveň se v úlu nalézají klinické příznaky nákazy, je mor ve včelstvu potvrzen (Vyhláška č. 299/2003 Sb.; § 139). V tomto okamžiku vymezí krajská veterinární správa okolo ohniska nákazy ochranné pásmo v okruhu pěti kilometrů s přesahy dle uspořádání krajiny. U včelstev nacházejících se v tomto pásmu se musí provést také vyšetření měli a prohlídka a je též zakázáno přemísťování včelstev mimo ochranné pásmo. Pokud je na stanovišti nakaženo více jak 15 % včelstev, musí se zlikvidovat celé stanoviště, včetně nástrojů používaných ke včelaření, které nejdou jiným způsobem dostatečně vydezinfikovat. Pokud je nakaženo méně než 15 % včelstev, likvidují se pouze konkrétní nakažená včelstva. Likvidace včelstev začíná nejprve utracením včel za použití benzínu a následně pokračuje spálením včelstev, včelích produktů a hořlavých předmětů používaných u těchto včelstev, nehořlavé předměty se řádně vydezinfikují. Včelař má nárok na náhradu v podobě uhrazení nákladů za likvidaci a ztrátu včelstev i včelařských pomůcek. Likvidaci dokumentuje přítomná likvidační komise, určená krajskou veterinární správou. Po provedení závěrečné dezinfekce odvolá KVS vyhlášení ohniska, a pokud zde v průběhu následujícího roku mor nepropukne znovu, odvolá také ochranné pásmo (Vyhláška č. 299/2003 Sb., § 140, § 141, § 142; Zákon č. 166/1999 Sb., § 67; Nařízení č. 1069/2009, článek 19).
16
Obr. 10: Pálení včelstev. Zdroj: ČSV o. s. základní organizace Konice, Prevence moru včelího plodu; vcelarikonicko.webnode.cz
4.5.
Detekce
Pokud je zapotřebí zjistit zdravotní stav včel, například kvůli nařízenému vyšetření v ohniskové oblasti, pravidelné kontrole, vědeckému výzkumu či jen ze zvědavosti včelaře, musí se odebrat vhodné vzorky pro laboratorní vyšetření. Takovými vzorky mohou být kusy pláství obsahující plod s larvami, dospělé včely, potrava včel jako je med, pyl nebo mateří kašička, ale nejčastěji se využívá vosková měl, kterou představují zbytky stavebního vosku a ostatní materiál, který spadá na dno úlu. Vzorky jsou poslány či předány do akreditované laboratoře a zde se provede jejich vyšetření (de Graaf et al., 2013). V České Republice mají v současné době akreditaci na výzkum moru včelího plodu Státní veterinární ústav Praha (a jejich pracoviště v Hradci Králové), SVÚ Olomouc, SVÚ Jihlava, SVÚ Jihlava – České Budějovice, Vojenský veterinární ústav v Hlučíně, MVDr. Marta Burdychová v Náchodě a Výzkumný ústav včelařský v Dole (Český institut pro akreditaci [online]). Základní postup pro potvrzení nebo vyvrácení přítomnosti P. larvae v odebraných vzorcích je kultivace na živném médiu, jako je například běžně používaný MYPGP agar. Rychlejší, avšak dražší metodou je PCR, při které se odebraný vzorek DNA mnohonásobně namnoží a následně se porovnává s matricí DNA P. larvae (de Graaf et al., 2013)
17
Konkrétní doporučené postupy jednotlivých metod jsou dostupné v Manuálu diagnostických testů a vakcín pro suchozemská zvířata (OIE, 2014), který spravuje Světová organizace pro zdraví zvířat a také ve Standardních metodách pro výzkum moru včelího plodu od Mezinárodní společnosti pro výzkum včel (de Graaf et al., 2013).
4.6.
Výskyt
Mor včelího plodu ohrožuje v současné době včelstva po celém světě. Výzkumy jsou prováděny v Evropě, Americe, Asii, Africe i Austrálii (Morrissey et al., 2015). Podle četnosti publikované literatury se v Evropě výzkumem MVP významně zabývají například vědci v Německu, Švédsku, Belgii, ale i v České Republice. Konkrétní výskyt moru v ČR nejlépe zobrazuje mapa vytvořená a provozovaná Státní veterinární správou. Ukazuje ke zvolenému dni stav nahlášených morových ohnisek a výstražných vyznačených pásem okolo bývalých a současných ohnisek. V roce 2015 je nejhorší situace řešena na Moravě, což stále přetrvává z minulých let. Stav se naopak oproti předchozím rokům pravděpodobně zlepšil v jižních Čechách.
Obr. 11: Mapové výstupy ohnisek moru včelího plodu (červené špendlíky) a ochranných pásem (žluté oblasti); porovnání let 2012 – 2015 v odhadovaném nejhorším období výskytu nákazy; spravuje Státní veterinární správa. Zdroj: Státní veterinární správa, Mapy vyhlášených ohnisek a pásem [online]
18
4.7.
Prevence a léčba
Předcházet nakažení včelstva morem včelího plodu se dá mnoha způsoby. Záleží na včelaři, jemuž včelstva patří a který se o ně stará, jak velkou péči včelám věnuje a pokud něco zanedbá, následkem může být propuknutí nějaké choroby. Mezi preventivní opatření proti nákaze patří například průběžné dezinfikování úlů, souší, včelařských potřeb a pomůcek; pravidelné vyšetřování vzorků zimní měli; chov včel s dobrým čistícím instinktem; včasné léčení varroázy; ke krmení včel nepoužívat plásty, vosky, med a pyl z oblastí s neznámou nákazovou situací nebo vzaté od včelstev, které uhynuly z nejasného důvodu; s tím souvisí i nutnost zjišťování příčin zimních úhynů a slábnutí včelstev (Vyhláška č. 299/2003 Sb.; § 138). Podchytit problematická včelstva mohou i státní orgány, a to například prováděním pravidelných plošných preventivních prohlídek; namátkovým bakteriologickým vyšetřováním tuzemského i dováženého medu; věnováním zvýšené pozornosti místům, kde již zaniklo ohnisko nákazy a zrušilo se ochranné pásmo, alespoň po dobu pěti let; zákazem léčení moru včelího plodu antibiotiky; likvidací nepoužívaných prázdných úlů nebo bohužel i vyhledáváním a utrácením rojů neznámého původu a divoce žijících včelstev (Vyhláška č. 299/2003 Sb.; § 138). Mor včelího plodu se dá tlumit také antibiotiky. Jejich používání je na území Evropské unie zakázáno. V Americe, Kanadě i dalších zemích světa se však antibiotika používají. Jejich užívání se ale bohužel projevuje spíše negativně, jelikož Paenibacillus larvae si proti nim vytvořil rezistenci (Evans, 2003; Kochansky, Knox, et al., 2001; Nařízení č. 37/2010; Pernal & Melathopoulos, 2006). Jakmile se přestanou antibiotika používat, je možné, že se nákaza opět objeví, jelikož antibiotika zabíjí pouze vegetativní stádia, nikoli spory (Pernal & Melathopoulos, 2006). Do medu odebraného od těchto včel se antibiotika dostanou také a tímto způsobem i do našeho těla (Bogdanov, 2005).
19
Závěr Paenibacillus larvae je Gram-pozitivní, patogenní bakterie, která má tyčinkovité vegetativní životní stádium, které žije pouze ve střevech larvy a sporulující stádium, při kterém vznikají velice odolné, infekční, elipsovité spory. Reprezentují ho čtyři různé genotypy ERIC I, II, III a IV, které se liší virulencí, povrchem spor a mnoha dalšími vlastnostmi. Napadá a usmrcuje larvy včely medonosné, významného světového opylovače. Spory se do larvy dostanou s potravou od dospělých včel, začnou klíčit ve střevě a poté se vegetativní stádia ohromně množí. Začínají postupně ničit vyvíjející se peritrofickou matrix, která v budoucnu vytváří bariéru mezi trávenou potravou a střevním epitelem. PM obsahuje velké množství chitinu, takže bakterie používá proteázy a proteiny, které vážou chitin, například protein PlCBP49. Po odstranění PM vyčkává P. larvae, než bude včela připravená zahájit metamorfózu a včelí dělnice ji zavíčkují uvnitř buňky. Poté začínají provádět invazi skrze střevní epitel pomocí mezibuněčných spojů. Genotyp ERIC I využívá toxiny, například Plx. Genotyp ERIC II se proteinem SplA přichytí na střevní epitel, ale přesný způsob průniku skrze mezibuněčné spoje zůstává nejasný. Po proniknutí skrze střevní epitel následuje postupná degradace veškeré tkáně, která larvu brzy usmrtí. Ostatky larvy poté mění svou konzistenci – z bělavé larvy postupně na gelovitou, zapáchající, hnědavou hmotu až na vysušený tmavě hnědý příškvar. Sporulace uvnitř larvy probíhá po celou dobu infekce. Při čištění mrtvých včel a příškvarů na sebe dospělé včely přenesou spory, které pak roznášejí po celém úlu a nákaza se šíří. Dále se nemoc přenáší v případě, že včely zaletí do cizího úlu, také když se od nemocné kolonie oddělí roj nebo pokud je včelí kolonie oslabená či uhyne, tak hrozí nebezpečí vykrádání zásob a velký vliv má také jednání včelaře. Pokud krmí včely zásobami neznámého původu, nevšímá si podezřelého chování včel, neprovádí pravidelné zdravotní kontroly a všeobecně se jednotlivě nestarají o svá včelstva, nemoc se s větší pravděpodobností objeví. V případě nálezu MVP a jeho potvrzení státní veterinární správou je pro zamezení dalšího šíření nutné včelstva spálit spolu s většinou včelařských pomůcek. Mor včelího plodu trápí včelaře po celém světě. Včely stále ubývají, a pokud by se podařilo vynalézt šetrnější způsob odstranění nákazy nebo omezit množství nakažených včelích kolonií, jistě by to byl vítaný objev. Pokud bychom více porozuměli funkci dospělých včel, jakožto přenašečů a rezervoáru bakteriálních spor, mohli bychom se pokusit tomuto přenosu do jisté míry zamezit. Z tohoto důvodu bych se v budoucím studiu chtěla více zaměřit na dospělé včely a pokusit se zjistit, zda by bylo možné včelám pomoci v boji proti bakterii Paenibacillus larvae a snížit tím procenta přenesené nákazy skrze dospělce. 20
Seznam zkratek CCD = z anglického „Colony collaps disorder“ ERIC = z anglického „enterobacterial repetitive intergenic consensus“ KVS = krajská veterinární správa MVP = mor včelího plodu PM = peritrofická matrix (membrána) rep-PCR = z anglického „repetitive element polymerase chain reaction“ S-vrstva = z anglického „surface layer“ (– povrchová vrstva či vrstva na povrchu) SVS = státní veterinární správa
Definice použitých výrazů -
hemocoel = tělní dutina členovců někdy dalších skupin bezobratlých vyplněná hemolymfou (Volf & Horák, 2007)
-
hospodářská zvířata = zvířata využívaná převážně k chovu, výkrmu, práci a jiným hospodářským účelům, zejména skot, prasata, ovce, kozy, koně, osli a jejich kříženci, drůbež, běžci, králíci, kožešinová zvířata, zvěř ve farmovém chovu, ryby a jiní vodní živočichové, včely a včelstva (Vyhláška č. 166/1999 Sb., § 3)
-
mateří kašička = potrava larev, kterou vyrábí včely pomocí žláz (Spürgin, 2013)
-
obligatorní (patogen) = patogen zcela odkázaný na patogenní způsob života (Volf & Horák, 2007)
-
ochranné pásmo moru včelího plodu = ochranné pásmo v okruhu nejméně 5 km kolem ohniska nákazy s přihlédnutím k epizootologickým, zeměpisným, biologickým a ekologickým podmínkám (Předpis č. 299/2003 Sb., § 140)
-
ohnisko moru včelího plodu = stanoviště včelstev, na němž byl potvrzen krajskou veterinární správou mor nebo hniloba včelího plodu (předpis č. 299/2003 Sb., § 138)
-
patogen = (micro)organismus, který je schopen vyvolat u příslušného hostitele onemocnění (Volf & Horák, 2007)
-
propolis = včelí produkt, sbíraný a používaný na tmelení skulin (Spürgin, 2013)
-
přenos horizontální = mezi jedinci v rámci jedné generace (Fries & Camazine, 2001)
-
přenos vertikální = mezi jedinci mezi jednou generací a další nadcházející (Fries & Camazine, 2001), přenos onemocnění z rodičů na potomky (Velký lékařský slovník [online])
-
souš = vystavěné včelí dílo bez plodu a bez medu (Spürgin, 2013)
-
(zimní) měl = materiál spadaný na dno úlu, nejvíce stavební vosk (Titěra, 2009) 21
Seznam použité literatury Ash, C., Priest, F. G., & Collins, M. D. (1993). Molecular identification of rRNA group 3 bacilli (Ash, Farrow, Wallbanks and Collins) using a PCR probe test. Antonie van Leeuwenhoek, 64(3-4), 253–260. Ashiralieva, A., & Genersch, E. (2006). Reclassification, genotypes and virulence of Paenibacillus larvae, the etiological agent of American foulbrood in honeybees – a review. Apidologie, 37(4), 411–420. Bakhiet, N., & Stahly, D. P. (1985). Ultrastructure of sporulating Bacillus larvae in a broth medium. Applied and Environmental Microbiology, 50(3), 690–692. Bamrick, J. F. (1967). Resistance to American foulbrood in honey bees VI. Spore germination in larvae of different ages. Journal of Invertebrate Pathology, 9(1), 30–34. Bogdanov, S. (2005). Contaminants of bee products. Apidologie, 37(1), 1–18. Brødsgaard, C. J., Ritter, W., & Hansen, H. (1998). Response of in vitro reared honey bee larvae to various doses of Paenibacillus larvae larvae spores. Apidologie, 29(6), 569–578. Cox-Foster, D. L., Conlan, S., Holmes, E. C., Palacios, G., Evans, J. D., Moran, N. A., … Lipkin, W. I. (2007). A metagenomic survey of microbes in honey bee colony collapse disorder. Science, 318(5848), 283–287. de Graaf, D. C., Alippi, A. M., Antúnez, K., Aronstein, K. A., Budge, G., De Koker, D., … Elke, E. (2013). Standard methods for American foulbrood research. Journal of Apicultural Research, 52(1), 1–28. Djukic, M., Brzuszkiewicz, E., Fünfhaus, A., Voss, J., Gollnow, K., Poppinga, L., … Daniel, R. (2014). How to kill the honey bee larva: genomic potential and virulence mechanisms of Paenibacillus larvae. PloS ONE, 9(3), 1–14. Evans, J. D. (2003). Diverse origins of tetracycline resistance in the honey bee bacterial pathogen Paenibacillus larvae. Journal of Invertebrate Pathology, 83(1), 46–50. Evans, J. D., & Schwarz, R. S. (2011). Bees brought to their knees: microbes affecting honey bee health. Trends in Microbiology, 19(12), 614–620. Fries, I., & Camazine, S. (2001). Implications of horizontal and vertical pathogen transmission for honey bee epidemiology. Apidologie, 32(3), 199–214. Fries, I., Lindström, A., & Korpela, S. (2006). Vertical transmission of American foulbrood (Paenibacillus larvae) in honey bees (Apis mellifera). Veterinary Microbiology, 114(34), 269–274. Garcia-Gonzalez, E., & Genersch, E. (2013). Honey bee larval peritrophic matrix degradation during infection with Paenibacillus larvae, the aetiological agent of American foulbrood of honey bees, is a key step in pathogenesis. Environmental Microbiology, 15(11), 2894– 2901. 22
Garcia-Gonzalez, E., Müller, S., Hertlein, G., Heid, N., Süssmuth, R. D., & Genersch, E. (2014). Biological effects of paenilamicin, a secondary metabolite antibiotic produced by the honey bee pathogenic bacterium Paenibacillus larvae. MicrobiologyOpen, 3(5), 642– 656. Garcia-Gonzalez, E., Poppinga, L., Fünfhaus, A., Hertlein, G., Hedtke, K., Jakubowska, A., & Genersch, E. (2014). Paenibacillus larvae chitin-degrading protein PlCBP49 is a key virulence factor in American foulbrood of honey bees. PLoS Pathogens, 10(7), 1–12. Genersch, E. (2008). Paenibacillus larvae and American Foulbrood – long since known and still surprising. Journal Für Verbraucherschutz Und Lebensmittelsicherheit, 3(4), 429– 434. Genersch, E. (2010a). American Foulbrood in honeybees and its causative agent , Paenibacillus larvae. Journal of Invertebrate Pathology, 103(supplement), S10–S19. Genersch, E. (2010b). Honey bee pathology: Current threats to honey bees and beekeeping. Applied Microbiology and Biotechnology, 87(1), 87–97. Genersch, E., Forsgren, E., Pentikäinen, J., Ashiralieva, A., Rauch, S., Kilwinski, J., & Fries, I. (2006). Reclassification of Paenibacillus larvae subsp. pulvifaciens and Paenibacillus larvae subsp. larvae as Paenibacillus larvae without subspecies differentiation. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 56(3), 501–511. Gregorc, A., & Bowen, I. D. (1998). Histopathological and histochemical changes in honeybee larvae (Apis mellifera L.) after infection with Bacillus larvae, the causative agent of American foulbrood disease. Cell Biology International, 22(2), 137–144. Hegedus, D., Erlandson, M., Gillott, C., & Toprak, U. (2009). New insights into peritrophic matrix synthesis, architecture, and function. Annual Review of Entomology, 54(1), 285– 302. Heyndrickx, M., Vandemeulebroecke, K., Hoste, B., Janssen, P., Kersters, K., de Vos, P., … Berkeley, R. C. W. (1996). Reclassification of Paenibacillus (formerly Bacillus) pulvifaciens (Nakamura 1984) Ash et al. 1994, a later subjective synonym of Paenibacillus (formerly Bacillus) larvae (White 1906) Ash et al. 1994, as a subspecies of P. larvae, with emended description of P. larvae as P. larvae subsp. larvae and P. larvae subsp. pulvifaciens. International Journal of Systematic Bacteriology, 46(1), 270–279. Hornitzky, M. A. Z. (1998). The pathogenicity of Paenibacillus larvae subsp. larvae spores and vegetative cells to honey bee (Apis mellifera) colonies and their susceptibility to royal jelly. Journal of Apicultural Research, 37(4), 267–271. Katznelson, H. (1950). Bacillus pulvifaciens (n. sp.), an organism associated with powdery scale of honeybee larvae. Journal of Bacteriology, 59(2), 153–155. Kochansky, J., Knox, D. A., Feldlaufer, M. F., & Pettis, J. S. (2001). Screening alternative antibiotics against oxytetracycline-susceptible and -resistant Paenibacillus larvae. Apidologie, 32(3), 215–222.
23
Lehane, M. . J. (1997). Peritrophic matrix structure and function. Annual Review of Entomology, 42(1), 525–550. Lindström, A. (2008). Distribution of Paenibacillus larvae spores among adult honey bees (Apis mellifera) and the relationship with clinical symptoms of American foulbrood. Microbial Ecology, 56(2), 253–259. Lindström, A., Korpela, S., & Fries, I. (2008a). Horizontal transmission of Paenibacillus larvae spores between honey bee (Apis mellifera) colonies through robbing. Apidologie, 39(5), 515–522. Lindström, A., Korpela, S., & Fries, I. (2008b). The distribution of Paenibacillus larvae spores in adult bees and honey and larval mortality , following the addition of American foulbrood diseased brood or spore-contaminated honey in honey bee ( Apis mellifera ) colonies. Journal of Invertebrate Pathology, 99(1), 82–86. Ludvik, J., Benada, O., & Drobnikova, V. (1993). Ultrastructure of Bacillus pulvifaciens. Archives of Microbiology, 159(2), 114–118. Mohapatra, B. R., & La Duc, M. T. (2013). Detecting the dormant: a review of recent advances in molecular techniques for assessing the viability of bacterial endospores. Applied Microbiology and Biotechnology, 97(18), 7963–7975. Morrissey, B. J., Helgason, T., Poppinga, L., Fünfhaus, A., Genersch, E., & Budge, G. E. (2015). Biogeography of P aenibacillus larvae , the causative agent of American foulbrood, using a new multilocus sequence typing scheme. Environmental Microbiology, 17(4), 1414–1424. Morse, R. A., & Calderone, N. W. (2000). The value of honey bees as pollinators of U.S. crops in 2000. Bee Culture, 128(3), 1–15. Müller, S., Garcia-Gonzalez, E., Genersch, E., & Süssmuth, R. D. (2015). Involvement of secondary metabolites in the pathogenesis of the American foulbrood of honey bees caused by Paenibacillus larvae. Natural Product Reports, 32(6), 765–778. Nicholson, W. L., Munakata, N., Horneck, G., Melosh, H. J., & Setlow, P. (2000). Resistance of Bacillus endospores to extreme terrestrial and extraterrestrial environments. Microbiology and Molecular Biology Reviews, 64(3), 548–572. OIE. (2014). Chapter 2.2.2. American foulbrood of honey bees. Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals, 1, 1–15. OIE. (2015). Chapter 9.2. Infection of honey bees with Paenibacillus larvae (American foulbrood). Terrestrial Animal Health Code, 2, 1–4. Pernal, S. F., & Melathopoulos, A. P. (2006). Monitoring for American foulbrood spores from honey and bee samples in Canada. Apiacta, 41(1), 99–109.
24
Poppinga, L., & Genersch, E. (2015). Molecular pathogenesis of American Foulbrood: how Paenibacillus larvae kills honey bee larvae. Current Opinion in Insect Science, 10(1), 29–36. Poppinga, L., Janesch, B., Fünfhaus, A., Sekot, G., Garcia-Gonzalez, E., Hertlein, G., … Genersch, E. (2012). Identification and functional analysis of the S-layer protein SplA of Paenibacillus larvae, the causative agent of American foulbrood of honey bees. PLoS Pathogens, 8(5), 1–13. Rada, V., Havlík, J., & Flesar, J. (2009). Biologicky aktivní látky ve výživě včel. Vědecký výbor výživy zvířat. Praha, 1–52. Ransome, H. M. (2012). The Sacred Bee in Ancient Times and Folklore. United States of America, Mineola: Courier Corporation, 1–336. Rauch, S., Ashiralieva, A., Hedtke, K., & Genersch, E. (2009). Negative correlation between individual-insect-level virulence and colony-level virulence of Paenibacillus larvae, the etiological agent of American foulbrood of honeybees. Applied and Environmental Microbiology, 75(10), 3344–3347. Rieg, S., Bauer, T. M., Peyerl-Hoffmann, G., Held, J., Ritter, W., Wagner, D., … Serr, A. (2010). Paenibacillus larvae bacteremia in injection drug users. Emerging Infectious Diseases, 16(3), 487–489. Roulston, T. H., & Goodell, K. (2011). The role of resources and risks in regulating wild bee populations. Annual Review of Entomology, 56(1), 293–312. Rycke, P. H. de, Joubert, J. J., Hosseinian, S. H., & Jacobs, F. J. (2002). The possible role of Varroa destructor in the spreading of American foulbrood among apiaries. Experimental & Applied Acarology, 27(4), 313–318. Setlow, P. (2007). I will survive: DNA protection in bacterial spores. Trends in Microbiology, 15(4), 172–180. Sharpe, R. J., & Heyden, L. C. (2009). Honey bee colony collapse disorder is possibly caused by a dietary pyrethrum deficiency. Bioscience Hypotheses, 2(6), 439–440. Schäfer, M. O., Ritter, W., Pettis, J., & Neumann, P. (2009). Small hive beetles, Aethina tumida, are vectors of Paenibacillus larvae. Apidologie, 41(1), 14–20. Schirach, G. A. (1769). Histoire des Abeilles. Chapter, 3, 1–56. Spivak, M., & Reuter, G. S. (2001). Resistance to American foulbrood disease by honey bee colonies Apis mellifera bred for hygienic behavior. Apidologie, 32(6), 555–565. Spürgin, A. (2013). Zázračné včely. Praha: Vydavatelství VÍKEND, 1–120. Titěra, D. (2009). Mor včelího plodu. Dol: Výzkumný ústav včelařský, 1–47.
25
vanEngelsdorp, D., Evans, J. D., Saegerman, C., Mullin, C., Haubruge, E., Nguyen, B. K., … Pettis, J. S. (2009). Colony collapse disorder: a descriptive study. PLoS ONE, 4(8), 17. vanEngelsdorp, D., & Meixner, M. D. (2010). A historical review of managed honey bee populations in Europe and the United States and the factors that may affect them. Journal of Invertebrate Pathology, 103(Supplement), S80–S95. Volf, P., & Horák, P. (2007). Paraziti a jejich biologie. Praha: Triton, 1–306. White, G. F. (1906). Bacteria of the apiary, with special reference to bee diseases. U. S. Department of Agriculture, Bureau of Entomology, Technical Series, 14, 1–50. Wilson, W. T. (1971). Resistance to American foulbrood in honey bees. XI. Fate of Bacillus larvae spores ingested by adults. Journal of Invertebrate Pathology, 17(2), 247–255. Wilson, W. T. (1972). Resistance to American foulbrood in honey bees XII. Persistence of viable Bacillus larvae spores in the feces of adults permitted flight. Journal of Invertebrate Pathology, 20(2), 165–169. Yue, D., Nordhoff, M., Wieler, L. H., & Genersch, E. (2008). Fluorescence in situ hybridization (FISH) analysis of the interactions between honeybee larvae and Paenibacillus larvae, the causative agent of American foulbrood of honeybees (Apis mellifera). Environmental Microbiology, 10(6), 1612–1620.
Zákony Česká Republika. Vyhláška č. 299/2003 Sb. ze dne 1. září 2003, o opatřeních pro předcházení a zdolávání nákaz a nemocí přenosných ze zvířat na člověka. In Sbírka zákonů ČR, ročník 2003. Dostupné z: http://www.zakonyprolidi.cz/cs/2003-299 [cit. 2015-08-11]. Česká Republika. Zákon č. 166/1999 Sb. ze dne 13. července 1999, o veterinární péči a o změně některých souvisejících zákonů (veterinární zákon). In Sbírka zákonů ČR, ročník 1999. Dostupné z: http://www.zakonyprolidi.cz/cs/1999-166 [cit. 2015-08-11]. Evropská Unie. Nařízení č. 1069/2009 ze dne 21. října 2009, o hygienických pravidlech pro vedlejší produkty živočišného původu a získané produkty, které nejsou určeny k lidské spotřebě, a o zrušení nařízení (ES) č. 1774/2002 (nařízení o vedlejších produktech živočišného původu). In Úřední věštník Evropské Unie, ročník 2009. Dostupné z: http://eur-lex.europa.eu/legalcontent/CS/TXT/?qid=1439418853630&uri=CELEX:32009R1069 [cit. 2015-08-11]. Evropská Unie. Nařízení č. 37/2010 ze dne 22. prosince 2009, o farmakologicky účinných látkách a jejich klasifikaci podle maximálních limitů reziduí v potravinách živočišného původu. In Úřední věštník Evropské Unie, ročník 2010. Dostupné z: http://ec.europa.eu/health/documents/eudralex/vol-5/index_en.htm#reg [cit. 2015-08-11]. 26
Webové stránky Český institut pro akreditaci: Seznam akreditovaných laboratoří pro výzkum Paenibacillus larvae [online]; Dostupné z: http://www.cia.cz/subjekty.aspx?ScopeID=L&Search=paenibacillus%20larvae&Disable Filter=true; [cit. 2015-08-11] Encyclopedia of Life [online]; Dostupné z: http://www.eol.org/; [cit. 2015-08-11] Choroby včel - multimediální pomůcka [online]; Dostupné z: http://soubory.vfu.cz/fvhe/choroby-vcel/; [cit. 2015-08-11] List of prokaryotic names with standing in nomenclature [online]; Dostupné z: http://www.bacterio.net/-classifphyla.html#Firmicutes; [cit. 2015-08-11] Státní veterinární správa: Mapy vyhlášených ohnisek a pásem [online]; Dostupné z: http://eagri.cz/public/web/svs/portal/zdravi-zvirat/vcely/mor-vceliho-plodu/mapyvyhlasenych-ohnisek-pasem.html; [cit. 2015-08-11]. Velký lékařský slovník [online]; Dostupné z: http://lekarske.slovniky.cz/pojem/vertikalniprenos; [cit. 2015-08-11]
27
