Univerzita Karlova v Praze Přírodovědecká fakulta. Studijní program: Biologie Studijní obor: Biologie. Julie Vacková

Univerzita Karlova v Praze Přírodovědecká fakulta Studijní program: Biologie Studijní obor: Biologie

Julie Vacková

Vliv parazitů na hematologické parametry u obratlovců Bakalářská práce

Školitel: RNDr. Michal Vinkler, PhD.

Praha, 2014

1

Prohlášení Prohlašuji, že jsem závěrečnou práci zpracoval/a samostatně a že jsem uvedl/a všechny použité informační zdroje a literaturu. Tato práce ani její podstatná část nebyla předložena k získání jiného nebo stejného akademického titulu.

V Praze Julie Vacková

2

Abstrakt Vychýlení organismu z homeostázy se projevuje fyziologickým stresem a změnami imunologické aktivity, které vedou ke změnám ve složení krve. Vyšetřením krevního obrazu lze zjistit odchýlení od dlouhodobého optima - zdravotní stav. Hematologické změny spojené s parazitismem jsou u některých skupin parazitů tak charakteristické, že lze odhadnout, čím je daný jedinec infikován. Cílem práce je shrnout základní metody používané ve veterinární hematologii k popisu krevního obrazu a zhodnotit vliv jednotlivých skupin parazitů na hematologické parametry týkající se červených a bílých krvinek. Změny hematologických parametrů obratlovců jsou nejvýraznější u mnohobuněčných endoparazitů, pro které je většinou typická eozinofilie a zvýšení celkového počtu leukocytů v krvi. Mnohobuněční ektoparazité obvykle snižují počet erytrocytů a zvyšují počet leukocytů. Extracelulární bakterie zvyšují absolutní počet neutrofilů a lymfocytů, zatímco intracelulární bakterie způsobují pokles všech typů krevních buněk. Viry často snižují absolutní počet leukocytů a způsobují změny relativního počtu lymfocytů neutrofilů. Typická je anemie. Změny v hematologických parametrech způsobené prvoky je obtížné zobecnit a o vlivu hub na krevní obraz obratlovců se toho mnoho neví. Variabilita v efektu různých parazitů na konkrétní hostitele je ale velká a hematologické vyšetření nám může pouze neznačit, jakým směrem by se měl ubírat další výzkum.

Klíčová slova erytrocyt, hematologie, krev, leukocyt, metody, parazit, patogen, zdravotní stav

Abstract Deviation out of homeostasis is reflected by physiological stress and altered immunological activity leading to changes in blood composition. Haematological examination may reveal deflection from the long-term optimum-the state of health. Haematological changes associated with parasitism are in some cases so distinctive that they allow the estimation of the parasite type affecting the host health. I aim to summarise basic methods utilised in veterinary haematology and evaluate the influence of individual groups of parasites on haematological parameters related to red and white blood cells. In vertebrates the most significant haematological changes are caused by multicellular endoparasites. Typical is eosinophilia and increased total leucocyte count. Ectoparasites are usually responsible for decrease in erythrocytes and increase in leucocytes. Extracellular bacteria increase total neutrophil and lymphocyte counts while intracellular bacteria cause decrease in all blood cell types. Viruses 3

often decrease number of erythrocytes and leucocytes and change neutrophil/lymphocyte ratio. Changes in the haematological parameters caused by protists are difficult to generalize and not much is presently known about the influence of fungi on the blood composition in vertebrates. Variation in the effect of various parasites on specific hosts is huge and haematological examination can only indicate us the direction for further research.

Key words erythrocytes, haematology, blood, leukocyte, methods, parasite, pathogen, health

Obsah 1Úvod...........................................................................................................................................5 2Krevní buňky..............................................................................................................................7 2.IErytrocyty............................................................................................................................9 2.IILeukocyty........................................................................................................................10 Lymfocyty.........................................................................................................................11 Monocyty.....................................................................................................................11 Granulocyty.......................................................................................................................12 Neutrofily a heterofily..................................................................................................12 Eozinofily.....................................................................................................................13 Bazofily........................................................................................................................14 3Vztahy mezi parazity a hostiteli...............................................................................................14 4Vyšetřování zdravotního stavu pomocí hematologických metod.............................................15 5Skupiny parazitů a jejich vliv na hematologii..........................................................................18 5.IBakterie extracelulární......................................................................................................18 5.IIBakterie intracelulární......................................................................................................19 5.IIIViry.................................................................................................................................20 5.IVProtozoa intracelulární...................................................................................................21 5.VProtozoa extracelulární....................................................................................................23 5.VIMnohobuněční endoparaziti...........................................................................................24 5.VIIHouby............................................................................................................................26 5.VIIIEktoparaziti..................................................................................................................27 6Závěr.........................................................................................................................................28 7Poděkování...............................................................................................................................30 8Seznam zkratek.........................................................................................................................31 9Literatura

4

1 Úvod V zoologickém výzkumu je často užitečné zhodnotit zdravotní stav studovaného jedince. Vlivem parazitismu totiž dochází k fyziologickému stresu a tudíž imunitní odpovědi na daný patogen. Stres a imunologická aktivita se pak odráží v zastoupení krevních buněk. Protože vliv různých parazitů na imunitní systém je různý, dochází v konkrétních interakcích hostitelů s parazity k různým změnám jednotlivých hematologických parametrů. Intenzita těchto změn pak do určité míry souvisí s intenzitou infekce. Imunologické metody můžeme rozdělit na „single time point“ metody (pozorování) a „multiple time point“ metody (experiment). Při využití „single time point“ metod je vyšetření jedince provedeno pouze jednou a následně jsou data porovnávána s referenčními hodnotami anebo s ostatními jedinci. Naopak při zvolení „multiple time point“ metod jsou data o konkrétním jedinci zaznamenávána opakovaně a studovány jsou změny (Norris & Evans 2000). Ačkoliv na rozřešení kauzality je potřeba provést experiment, výsledky pozorování mohou být také důležitým vodítkem při porovnávání různých jedinců, populací a druhů. Hematologická data jsou v zoologii obvykle sbírána jako „single time point“. Ačkoliv tedy samy nemohou ukázat směr pozorovaných změn, mohou sloužit jako nedoceněný údaj o zdravotním stavu zvířat při interpretaci výsledků experimentů (kombinace observačních dat s experimentálními). Nedostatek absence opakování v čase lze do určité míry eliminovat porovnáním hodnot zjištěného krevního obrazu s kvalitními referenčními daty, případně vzájemným porovnáním skupin jedinců ve velkém populačním vzorku. Pak lze snadno odhadnout rozdíly mezi jedinci v jejich zdravotním stavu. Dílčí mechanismy antiinfekční imunity obratlovců jsou charakteristické pro jednotlivé skupiny parazitů (tj. např. viry, bakterie, prvoky, mnohobuněčné živočichy, atp.) (Grayfer et al 2014, Harris & Gause 2011, Van Muiswinkel & Nakao 2014). Aktivace jednotlivých typů imunologických mechanismů je obvykle spojena se změnami aktivity jednotlivých typů buněk imunitního systému, zejména leukocytů (Belkaid 2007, Fischer et al 2013). Krom vlastní aktivace se také mění rychlost tvorby jednotlivých typů leukocytů a jejich lokalizace. Leukocyty migrují z kostní dřeně do primárních a sekundárních lymfatických tkání i do periferních oblastí těla (Ley et al 2007). Proto také změny aktivity imunitního systému můžeme u obratlovců pozorovat jako specifické změny hematologických parametrů (krevního obrazu) (Da Silva et al 2011, Hoglund et al 1992, Chamond et al 2010). Ačkoliv mají parazitace a aktivita imunitního systému velký vliv na krevní obraz, zastoupení krevních buněk se průběžně mění také v důsledku působení vlivů okolního prostředí a momentálního stavu jedince (Benavides et al 2013, Kaminski et al 2014, Shutler & 5

Marcogliese 2011, Zhelev et al 2013). Některé změny krevního obrazu od referenčních hodnot u obratlovců způsobené určitými skupinami parazitů jsou však natolik výrazné, že je lze využít k odhadnutí příčin ve změnách zdravotního stavu jedince (Averbeck 1992). Zdravotní stav lze navíc chápat jako homeostázu organismu, přičemž odchylky z homeostázy indikované například změnami v krevním obrazu (ať už v důsledku stresu nebo infekčních chorob) můžeme považovat za odchylky z dlouhodobého optima, které mohou mít zásadní vliv na fitness jedince. Zoologický výzkum se provádí především na nemodelových organismech a moderní metody jako například průtoková cytometrie bývá z důvodu absence specifických molekulárních nástrojů velice náročné optimalizovat. Ačkoliv jsou klasické hematologické metody mnohem méně přesné, manuální vyšetření hematologických parametrů pod světelným mikroskopem může mít svůj význam i v dnešní době. Jedná se totiž o technicky nenáročné a finančně přijatelné vyšetření, které lze aplikovat na různé, fylogeneticky i velice vzdálené, druhy. Velice důležitá je ale zkušenost a zručnost hodnotitele, od níž se odvíjí i přesnost měření. Cílem mé bakalářské práce je s ohledem na využití v zoologickém výzkumu shrnout základní klasické metody používané ve veterinární hematologii k popisu krevního obrazu u živočichů a popsat vliv jednotlivých skupin parazitů (viry, bakterie, prvoci, houby, živočichové - tam, kde je to účelné děleno na další kategorie, např. vnitrobuněční a mimobuněční) na vyšetřované hematologické parametry. Tato práce nemá v žádném případě utřídit veškerou známou literaturu k tomuto tématu. To by bylo vzhledem k omezenému rozsahu nemožné. Spíše má snahu shrnout obecný charakter vlivu různých skupin parazitů na krevní obraz a na základě toho naznačit interpretační hodnotu různých krevních parametrů při použití v zoologickém výzkumu. Tato bakalářská práce svým způsobem navazuje na bakalářskou práci Jitky Poplové "Hematologické metody v zoologii" (Application of Haematological Methods in Zoological Studies). Tato práce popisovala základní hematologické metody použitelné v zoologické praxi, jejich postupy, výhody i možná úskalí. Na rozdíl od ní, já ve své práci pojednávám o vlivu jednotlivých skupin parazitů na hematologické parametry (krevní obraz) obratlovců, což je otázka dosud v rámci bakalářských prací obhajovaných na PřF UK neřešená a ve světové literatuře nedostatečně analyzovaná.

6

2 Krevní buňky V krvi obratlovců se vyskytují buňky pocházející z pluripotentních hematopoetických kmenových buněk, které jsou přítomny v kostní dřeni. Z myeloidního prekurzoru vznikají erytrocyty a megakaryocyty (z megakaryocytů vznikají trombocyty) a leukocyty – granulocyty (bazofily, eozinofily, neutrofily/heterofily), monocyty. Lymfoidní progenitor dává vzniknout NK buňkám, T lymfocytům a B lymfocytům. Jak vypadají krevní buňky na typickém krevním nátěru je vidět na obr 1. Krevní buňky ryb, obojživelníků, plazů, ptáků a savců viz obr 2-6.

Obr 1: Vzhled typického nátěru krve odebrané z vena basilica Leghornské slepice staré 2,095 dnů. 1 – heterofil, 2,3 – lymfocyt, 4,5 – trombocyt, 6 – jádro lyzovaného erytrocytu, 7 – typický erytrocyt, 8 – erytrocyt menší než průměrný, 9 – erytrocyt s excentrickým jádrem, 10 – kulaté malé jádro, 11 – jádro erytrocytu členité na konci, 12 – jádro erytrocytu členité na boku, 13 – erytrocyt se zúženým jádrem, 14 – jádro erytrocytu s výčnělky (Lucas & Jamroz 1961).

7

Obr 2: Krevní buňky ryb; a, b erytrocyt, c - trombocyt, d - neutrofil (pstruh), e - heterofil, f - eosinofil, g monocyt, h - bazofil, i - lymfocyt (Claver & Quaglia 2009).

Obr 3: Krevní buňky obojživelníků; a, b - erytrocyt, c trombocyt, d - neutrofil, e heterofil, f - eosinofil, g - bazofil, h - lymfocyt, h,j - monocyt (Claver & Quaglia 2009).

Obr 4: Krevní buňky plazů; a erytrocyt (krokodýl), b - erytrocyt (leguán), c - erytrocyt (želva), d, e trombocyt, f - heterofil (krokodýl), g heterofil (želva), i,j - monocyt, k lymfocyt, l - bazofil (Claver & Quaglia 2009).

Obr 5: Krevní buňky ptáků; a, b erytrocyt, c - trombocyt, d heterofil, e - eosinofil, f - bazofil, g, h - lymfocyt, i - monocyt (Claver & Quaglia 2009).

Obr 6: Krevní buňky savců; neutrofil, eozinofil, bazofil, monocyt, lymfocyt(http://medicaldictionary.thefreedictionary.com/leukocyte) 8

2.I Erytrocyty Erytrocyt je nejpočetnější buňka v krevní cirkulaci obratlovců vznikající z myeloidního progenitoru v kostní dřeni (Polo et al 1992). Během vývoje se v kostní dřeni mění erytroblast na retikulocyt, který putuje do cévního řečiště a posléze maturuje na erytrocyt (Koury et al 2005). Plní funkci hlavního přenašeče kyslíku při respiraci a to díky hemoglobinu v cytoplasmě. Hemoglobin je esenciální univerzální kyslík vážící pigment obratlovců. Erytrocyty (obr 1(6-14), 2ab, 3ab, 4ab, 5ab, 6) většiny obratlovců jsou oválné buňky s oválným jádrem (Lucas & Jamroz 1961, Correa et al 2013). Erytrocyty rybovitých obratlovců jsou považovány za prototyp cirkulujících nukleovaných a hemoglobin nesoucích buněk, které jsou fylogeneticky zachovány u všech ostatních obratlovců, vyjma savců. U některých ryb je krev hlavním místem maturace erytrocytů, proto je v krvi značný počet nezralých erytrocytů (erytroblastů) (Glomski et al 1992). Porovnáme – li velikost erytrocytů u různých skupin rybovitých obratlovců, potom erytrocyty skupiny příčnoústí (Elasmobranchii) nabývají téměř dvojnásobné velikosti erythrocytů kostnatých (Teleostei) a šířka erythrocytů příčnoústých je pouze nepatrně větší než jejich délka (Hartman & Lessler 1964). Největší erytrocyty však mají v rámci všech recentních fylogenetických větví obratlovců obojživelníci (Amphibia) (obr 3) (Glomski et al 1997). Ocasatí obojživelníci (Caudata) mají největší erytrocyty mezi obojživelníky a erytrocyty skupiny žab nabývají pouze poloviční velikosti erytrocytů ocasatých obojživelníků (Hartman & Lessler 1964). Velké rozměry poukazují na evoluční procesy související se změnami velikosti genomu, ploiditou, rychlostí metabolismu a relativní velikostí ostatních somatických buněk. Naopak počet erytrocytů a koncentrace hemoglobinu těchto obratlovců jsou nízké (Glomski et al 1997). Největší erytrocyty mezi plazy pak mají zástupci rodu Bothrops patřící do skupiny zmijovití (Viperidae). Krokodýli mají větší erytrocyty než ještěrky a želvy (obr 4). Ptačí erytrocyty jsou méně snadno deformovatelné a mají vyšší koncentrace volného hemoglobinu v cytoplasmě než erytrocyty savců. Hemoglobin ptáků je podobný hemoglobinu savců, ale fosfátové skupiny zodpovědné za afinitu ke kyslíku jsou odlišné (ptačí – IP5, savčí – DPG) (Campbell & Ellis 2013). V savčí krvi se za normálních okolností nevyskytují imaturní erytrocyty, pokud ano, je to považováno za patologický jev. Na rozdíl od savců se u ptáků imaturní erytrocyty vyskytují běžně (Lucas & Jamroz 1961). Je známo, že téměř u všech ryb, obojživelníků, plazů a ptáků zůstává v erytrocytech jádro (obr 1 - 5), ale o mitochondriích se toho příliš mnoho neví (Stier et al 2013). U ryb byly v 9

erytrocytech prokázány mitochondrie i funkční ribozomy (Moyes et al 2002). Obojživelníci mají v erytrocytech o něco méně mitochondrií (Bratosin et al 2004). Přítomnost mitochondrií v erytrocytech plazů je dosud diskutabilní (Olsson et al 2008). Dle recentních studií jsou v erytrocytech ptáků mitochondrie přítomny (Stier et al 2013). Hlavní funkcí erytrocytů je přenos kyslíku, ale mitochondrie kyslík spotřebovávají na metabolické procesy jako je např. oxidativní fosforylace. Navíc pak dochází k produkci radikálů ROS, které jsou jedním z důvodů buněčného stárnutí. Zřejmě z těchto důvodů evolučně nejpokročilejší erytrocyty savců mitochondrie ztrácí během vývoje (Stier et al 2013).

2.II Leukocyty Imunitní odpověď na patogena sestává z nespecifických a neadaptivních mechanizmů – vrozené imunity (Medzhitov & Janeway 1997) a specifických adaptivních mechanizmů získané imunity. Také kůže, slizniční povrchy a ostatní fyziologické bariéry mohou být zahrnovány do vrozených mechanizmů (Srikumaran et al 2007). Na rozdíl od vrozené imunity je adaptivní imunita antigenně specifická, somaticky rozmanitá a má imunologickou paměť (Preston et al 1999). Vlastní buňky imunitního systému vznikají ze společné primordiální buňky v kostní dřeni (Calvi & Link 2014) a jsou označovány jako leukocyty, bílé krvinky. Leukocyty cirkulující v krevním oběhu jsou děleny na lymfocyty, monocyty, granulocyty (heterofily/neutrofily, eosinopfily, basofily) (Campbell & Ellis 2013). Z pohledu efektorové funkce jsou klíčovými buňkami vrozené imunity buňky myeloidní linie granulocyty, z monocytů odvozené makrofágy a dendritické buňky a buňky lymfoidní linie NK (natural killer) buňky (Mathy et al 2002). Makrofágy (Murray & Wynn 2011) a neutrofilní granulocyty (Kolaczkowska & Kubes 2013) fungují jako fagocyty, tj. fagocytují extracelulární patogeny a zbytky jejich degradace, které tak pomáhají eliminovat. NK buňky pak pomáhají eliminovat intracelulární patogeny, jako např. viry (Huntington et al 2007). Adaptivní imunita je zprostředkována B a T lymfocyty. Jak B buňky, tak T buňky lze dále dělit do funkčních kategorií. Imaturní B buňky vzniklé v kostní dřeni migrují na periferie a dávají vzniknout heterogenním populacím periferních B buněk, paměťovým buňkám a plazmatickým buňkám (Rajewsky 1996). Zatímco B lymfocyty produkují solubilní protilátky, některé T lymfocyty mají funkci cytotoxických efektorových buněk. Zvláště v případě T lymfocytů mají jednotlivé subtypy velice rozdílné funkce. T pomocné (Th) buňky jsou regulační, zatímco T cytotoxické (Tc) buňky se účastní přímé likvidace infikovaných buněk. Ačkoliv mají různé populace lymfocytů různou receptorovou výbavu, klasickými hematologickými metodami je 10

není možné rozlišit (Srikumaran et al 2007). Mezi vrozenou a získanou složkou imunity existuje intenzivní spolupráce. Získaná imunita nemůže fungovat bez předchozí aktivace složkami vrozené imunity (He et al 2011). Cytokiny jako jsou například interferon γ (INF- γ), interleukin 10 (IL-10) (Mosser & Edwards 2008), interleukin 4 (IL-4) (Gallo et al 2010) a mnohé další produkované během adaptivní imunitní odpovědi ovlivňují aktivitu efektorových buněk (Gallo et al 2010). Cytokiny se tedy výrazně podílí na homeostáze a kontrole přiměřené imunitní odpovědi (He et al 2011).

Lymfocyty Lymfocyty bývají morfologicky variabilní (obr 1 - 6). Měkteré jsou oválné, jiné nepravidelné, malé i velké. Jádro je většinou oválné (Claver & Quaglia 2009). U některých druhů ptáků jsou lymfocyty hlavními cirkulujícími leukocyty v krvi. Ptáci byli prvními imunologickými modely, na kterých byly identifikovány B a T lymfocyty. Zdá se, že ptačí lymfocyty fungují stejným způsobem jako savčí (Claver & Quaglia 2009, Campbell & Ellis 2007). Lymfocyty jsou převládající cirkulující buňkou také v krvi plazů a vykazují sezónní variabilitu (Duguy 1970). V případě obojživelníků jsou lymfocyty nejmenšími leukocyty, v porovnání s velikostí granulcytů jsou poloviční (Claver & Quaglia 2009). Pravděpodobně hrají roli ve specifické imunitě, avšak někteří obojživelníci, a to zejména ocasatí, zřejmě nemá lymfocyty zprostředkovanou specifickou imunitu, na rozdíl od skupin žáby, ptáci a savci (Terio 2004). Lymfocyty jsou nejčastějšími cirkulujícími buňkami ryb (Claver & Quaglia 2009). T, B a NK lymfocyty se vyskytují u kostnatých a chrupavčitých ryb, ale ne u kruhoústých a bezobratlých (Anderson et al 2001). Dříve převládal názor, že kruhoústí mají pouze vrozenou imunitu (Shintani et al 2000). Ale bylo zjištěno, že lymfocyty mihulí (Lampetra) exprimují nové receptory (Variable lymphocyte receptor, VLR) sestávající z repetic bohatých na leucin (Leucin rich repeats), které dokážou generovat diverzitu pomocí procesů somatických přeskupení (Pancer et al 2004). Na rozdíl od vyšších obratlovců se mnohé ryby líhnou v embryonální fázi ontogeneze s vrozeným imunitním systémem, který je jejich primárním obranným mechanismem. Získaný imunitní systém, reprezentovaný B a T buňkami, vznikne až později během života, nejčastěji po konzumaci potravy (Rombout et al 2005). Monocyty Typické monocyty jsou oválné buňky s ledvinitým jádrem (Claver & Quaglia 2009). Jejich velikost často bývá větší než velikost lymfocytů, ale běžně se v krvi vyskytují monocyty stejné 11

velikosti jako lymfocyty (Lucas & Jamroz 1961). Buňky patřící k linii monocytů jsou důležitými elementy imunitního obranného systému, protože tyto buňky mají schopnost fagocytózy cizích materiálů, umí prezentovat antigeny imunokompetentním buňkám a produkovat cytokiny (Lee et al 2008, He et al 2011, Yim et al 2013). Z monocytů mohou vznikat makrofágy a některé typy dendritických buněk (Cheong et al 2010). Monocyty bývají největšími leukocyty v krvi ptáků. Jedná se o buňky se schopností fagocytózy. Mohou migrovat do tkání, kde z nich vznikají makrofágy (Harmon 1998, Shi & Pamer 2011). Monocyty a makrofágy uvolňují biologicky aktivní látky, jako jsou například produkty metabolismu kyseliny arachidonové (prostaglandiny, prostacykliny, leukotrieny, tromboxany) které se podílí na zánětu a destrukci cizích organismů a hrají důležitou roli ve zpracování antigenů (Shi & Pamer 2011). Po vystavení různým cytokinům hrají makrofágy důležitou roli v nádorové imunitě, což je regulováno komplexními molekulárními mechanizmy (Ruffell et al 2012).

Granulocyty Granulocyty jsou leukocyty vznikající z myeloidního prekurzoru. Jsou charakteristické laločnatým jádrem a navíc obsahují sekretorní granula v cytoplazmě. Díky chemickému barvení byly v devatenáctém století popsány eozinofily (obr 8), neutrofily (obr 10) (místo nich heterofily (obr 7) u ptáků) a bazofily (obr 9) (Makepeace et al 2012).

Obr 10: Neutrofil Obr 9: Bazofil Obr 8: Eosinofil (Lucas & Jamroz 1961) (http://serpihanilmuku.blogspot.cz/2011/11/neutrofil.html) Obr 7: Heterofil

Neutrofily a heterofily Jedná se o buňky patřící do skupiny polymorfonukleárních granulocytů, v periferní krvi bývají nejhojnější (Claver & Quaglia 2009). Neutrofily jsou buňky ekvivalentní k heterofilům, ale mají jinak barvitelná granula (obr 7, 10) (Campbell & Ellis 2007). V krvi ptáků a plazů se totiž místo neutrofilů vyskytují heterofily (Kaiser 2007). Cytoplasmatická granula obsahují

lyzozomální a nelyzozomální enzymy, které slouží k 12

zabíjení bakterií (Brune & Spitznag.Jk 1973). Na rozdíl od savčích neutrofilů neobsahují heterofily myeloperoxidázu a jsou závislé primárně na neoxidativních mechanizmech, lyzozymech a acid fosfatázách (Claver & Quaglia 2009). Neutrofily jsou centrální efektorové buňky vrozeného imunitního systému. Mají schopnost rychle rozpoznat, přijmout a eliminovat patogeny. Podílejí se na přežívání hostitele před nástupem adaptivní imunity (Galioto et al 2006). V některých případech jsou nezbytné pro to, aby došlo k adaptivní imunitní odpovědi (Al-Qaoud et al 2000, Galioto et al 2006). Neutrofily, jako primární efektorové buňky zánětu (Irazuzta et al 2000), se uplatňují také v nádorové imunitě. Dokáží uvolnit tumor-cytotoxické substance nebo aktivovat další anti-nádorové imunitní efektorové buňky (Brandau 2013). Specifické typy T lymfocytů - T H17 (Dong 2008) mohou ovlivňovat aktivitu neutrofilů, které se pak díky této aktivaci mohou podílet při nádorové imunitní odpovědi iniciací různých mediátorů (Wei et al 2012). Odpověď heterofilů na infekci je podobná imunitní odpovědi u savčích neutrofilů. Migrují do míst zánětu a zabíjejí patogeny (Jain et al 1995), umí fagocytovat široké spektrum bakterií (Claver & Quaglia 2009) a také se angažují v zánětlivých lézích (Topp & Carlson 1972). U ptáků hrají heterofily nezastupitelnou roli v obraně organismu proti virům a bakteriím (Wells et al 1998). V časné fázi bacteriální infekce dojde k mobilizaci během několika hodin, pokles heterofilů v periferní krvi se projeví brzy po propuknutí infekce (Tellez et al 1993). Eozinofily Eozinofily se vyskytují u většiny obratlovců, jen u ptáků a některých plazů možná sekundárně nejsou. Eozinofily jsou morfologicky podobné jejich heterofilům (obr 7,8). O jejich funkci je jen málo známo. O eozinofilech ryb se toho také mnoho neví, ale zřejmě mají podobnou funkci jako savčí žírné buňky sliznic. Vyskytují se v trávicím traktu a žábrách a jsou spojeny s antigenní stimulací a parazitárním onemocněním (Claver & Quaglia 2009). Funkce ptačích eozinfilů je zatím jen málo prozkoumaná. Specifická granula eozinofilů u ptáků jsou podobná savčím a obsahují vysoké koncentrace argininu, peroxidázy, acid fosfatázy a arylsulfatázy (Campbell & Ellis 2007), což podporuje teorii, že jsou lyzozomální povahy (Claver & Quaglia 2009). U savců hrají eozinofily důležitou roli v regulaci buněčných odpovědí na stavy mimo homeostázi organismu nebo v případě infekce (Gebreselassie et al 2012). Například pro nematoda je charakteristická eozinofilie (Swartz et al 2006). Eozinofilie je typická rovněž při alergických reakcích a pravděpodobně je spojena s parazitizmem trávicího ústrojí. 13

Eozinofily jsou buňky vrozené imunity asociované s T pomocnými buňkami 2 (Th2) (Carlens et al 2009, Mishra et al 1999, Petit et al 1990)). Jedná se o efektorové buňky posledního stádia, kdy jsou uvolněna jejich cytotoxická granula (Rothenberg & Hogan 2006). Tkáňové eozinofily dokáží exprimovat molekuly podílející se na aktivaci lymfocytů, např MHCIIgp a CD 80, což naznačuje, že mohou být přímo nebo nepřímo zapojeny do adaptivních imunitních odpovědí (Yang et al 2008, Svensson et al 2011). Bazofily Bazofily jsou buňky obsahující cytoplasmatická granula s histaminem a vyskytující se v krvi obratlovců obvykle v nižších počtech. Například stres a parazitární infekce mohou být základní příčinou zvýšené odpovědi bazofilů (Falcone 2004). Na rozdíl od savčích bazofilů jsou ptačí bazofily relativně časté na periferii. Jejich funkce je zatím neznámá, ale zřejmě bude podobná jako u savců (Claver & Quaglia 2009). Ptačí bazofily zřejmě hrají důležitou roli v časných stadiích zánětu a akutních hypersenzitivních reakcích. Ptačí bazofily se ale liší se od savčích tím, že nepřispívají k opožděné hypersenzitivitě (Delayed type hypersensitivity - DTH) (Claver & Quaglia 2009). U savců (studie byly provedeny například na morčatech) se vyskytují specifické typy opožděné hypersenzitivní reakce, které se účastní bazofily (Greenberg & Kerbs 1980, Richerson et al 1970). U některých obojživelníků jsou v bazofilech heparin-like substances. Bazofily ryb u některých druhů jako jsou např. dánio pruhované (Danio rerio) a mořčák chutný (Dicentrarchus labrax) chybí, ale jsou u mořana zlatého (Sparus aurata), kapra obecného (Cyprinus caprio) a to v nízkých počtech. Rybám, které nemají bazofily, rovněž chybí žírné buňky, immunoglobulin E a serotonin (Claver & Quaglia 2009).

3 Vztahy mezi parazity a hostiteli Parazité často znamenají značnou zátěž pro infikované jedince, což může vést až ke smrti hostitele (Krams et al 2012). Parazité snižují reprodukční fitness hostitele a zvyšují tak riziko jeho predace (Marzal et al 2005), navíc jsou příčinou fyziologického stresu u hostitelů, což se může projevovat například zvýšenou hodnotou stresových hormonů (Fleming 1997). Stres lze mimo jiné detekovat na molekulární úrovni pomocí stresových proteinů, jako jsou např. Proteiny teplotního šoku HSP60 (Tomas et al 2005). Byla prokázána negativní korelace mezi kondicí jedinců a počtem parazitů (Scheelings & Jessop 2011). Míra parazitovanosti jedinců se může v průběhu roku lišit, protože sezónní změny prevalence parazitů souvisí s reprodukčním cyklem. Dokladem toho jsou například studie provedené na sojce chocholaté (Cyanocitta cristata) (Garvin & Greiner 2003) a strnadci zimním (Junco hyemalis) (Deviche et al 2001), u 14

nichž je během reprodukční sezony prevalence parazitů vyšší než v době pelichání. Infekce způsobuje zhoršení zdravotního stavu, a proto lze změny hematologických parametrů očekávat právě během hnízdní sezony (Deviche et al 2001, Garvin & Greiner 2003). Parazitismus silně ovlivňuje evoluční vývoj hostitele (Clayton & Moore 1997) a je to nekončící závod ve zbrojení parazit vs hostitel (Dawkins & Krebs 1979), protože hostitel musí mít pod kontrolou populaci parazita a parazit se naopak snaží vyhnout imunitní obraně hostitele (Grayfer et al 2014). Selekční tlak na hostitele generovat variabilitu v odpovědi na parazita je proto velmi silný (Sorci 1995). Se všudypřítomností a diverzitou parazitů je spojena diverzita možností obrany proti parazitismu, kterou vyvíjejí hostitelé (Danilova 2006, Ots & Horak 1998). Obrana hostitele zahrnuje behaviorální, fyziologické a imunologické mechanismy. Selekční tlak parazitismu a environmentální podmínky utvářejí životní strategie (life history) hostitelů (Soler et al 2013). Parazit se musí adaptovat, aby nebyl rozpoznán imunitním systémem hostitele. Hostitel ale může zaujmout strategii, kdy se snaží parazita tolerovat (Raberg et al 2007). Změny imunitní odpovědi jsou používány v ekologických studiích zabývajících se vztahy mezi parazitem a hostitelem (Norris & Evans 2000). Imunologická obrana proti parazitizmu se projevuje změnou poměru zastoupení bílých krvinek (Ots & Horak 1998). Srovnáním s hematologickými referencemi (Averbeck 1992, Bourges-Abella et al 2014) lze zjistit v případě subletálních podmínek zdraví organismů (Averbeck 1992, Newman et al 1997, Work 1996). Invaze parazitů u různých skupin obratlovců jsou spojeny s nárůstem nebo naopak poklesem konkrétních typů krevních buněk a lze je díky tomu detekovat (Lofts 1976, Dawson & Bortolotti 1997).

4 Vyšetřování zdravotního stavu pomocí hematologických metod Hematologické parametry se mění s aktuální kondicí jedince a jsou rovněž ovlivňovány vnějšími vlivy (Benavides et al 2013, Kaminski et al 2014), jako jsou například environmentální faktory - chemické znečištění biotopu (Zhelev et al 2013). Rozdíly v hematologických parametrech jsou i mezi pohlavími (Morton 1994, Motsch et al 2012) a mohou být ovlivněny také věkem, hormony a hypoxií (Kopp et al 2014, Munoz et al 2012). Hematologické parametry lze použít také k diagnóze parazitovanosti obratlovců, protože změny způsobené konkrétními skupinami parazitů bývají charakteristické (Bearhop et al 1999). Může docházet například ke zvýšení počtu leukocytů (leukocytóza) nebo ke snížení počtu 15

leukocytů (leukopenie). Obdobně bývá pozorována lymfocytóza, lymfopenie, zvýšení počtu eozinofilů (eozinofilie), eozinopenie atd. V některých případech dochází k poklesu všech krevních buněk – pancytopenii (Waner et al 1997). Hematologické metody, ač technicky nenáročné, jsou hojně používány pro zhodnocení zdravotního stavu jedince (Vinkler et al 2010, Whitworth & Bennett 1992). Pro porovnání hematologických parametrů vyšetřovaného živočicha mohou sloužit již dříve stanovené referenční intervaly (Sheerer et al 2013). Pomocí hematologických parametrů lze dokonce v některých případech odhalit těžko detekovatelnou subklinickou fázi infekcí (Waner et al 1997). Hematologické parametry jsou často používány jako indikátory zdraví a kondice při studiích divoce žijících ptáků (Bearhop et al 1999, Dawson & Bortolotti 1997). Tyto údaje mohou být užitečné pro klinické hodnocení zdraví a zvolení vhodného managementu v hospodářství a péči o obratlovce (Roletto 1993). Hlavním postupem základního hematologického měření je stanovení buněčného složení krve (Campbell & Ellis 2013, Vinkler et al 2010). Mezi vyšetřované hematologické parametry patří absolutní počet červených krvinek (red blood cells, RBC), absolutní počet trombocytů (total platelets, PLT) (Acker et al 2012), dále hematokrit (packed cell volume, PCV), což je podíl krve který zaujímají erytrocyty a lze jej zjistit například centrifugací krve nebo pomocí automatického analyzéru, který vypočítá hodnotu hematokritu nepřímo z hodnot MCV (mean cell volume, střední objem erytrocytu - stanovuje anemii). Dále je měřen MEV (mean erythrocyte volume - střední objem erytrocytu), MCH (mean corpuscular hemoglobin průměrné množství Hb v buňce) a MCHC (mean corpuscular hemoglobin concentration – střední koncentrace hemoglobinu v erytrocytech) (Roletto 1993). Hodnoty PCV, MCV, MCH a MCHC jsou indikátorem anemie, kterou lze rozdělit do následujících typů: regenerativní anemie (vzniká důsledkem hemolýzy nebo akutní ztrátou krve), normocytická anemie (MCV v rozmezí standatrních hodnot, ale hematokrit a hemoglobin snížený) a normochromická anemie (koncentrace hemoglobinu v rozmezí standartních hodnot, ale snížený počet erytrocytů) (Chamond et al 2010). Makrocytická hypochromická anemie je charakteristická zvýšením MCV a nižším MCH (Omer et al 2002), zatím co při normochromické normocytické anemii je MCV i MCH v rozmezí normálních hodnot (Asberg et al 2014). Zjišťováno je také zastoupení barviv a proteinů krevní plazmy. Koncentrace hemoglobinu (Hb) bývá detekována standartní cyanmethemoglobinovou metodou tzv Drabkinsova metoda – hemoglobin uvolněný z lyzovaných erytrocytů irreverzibilně reaguje s kyanidem draselným a je

tak

oxidován

na

stabilní

pigment

cyanmethemoglobin,

který

je

detekován

spektrofotometricky a na základě těchto hodnot je posléze určena koncentrace hemoglobinu 16

(Acker et al 2012). Mezi parametry týkající se leukocytů patří absolutní počet leukocytů (tj. počet leukocytů na objemovou jednotku krve, total white blood cell – TWBC) a diferenciální počet leukocytů (tj. frekvence jednotlivých typů leukocytů, differential white blood cell – DWBC) (Bearhop et al 1999, Averbeck 1992). V některých případech se DWBC neliší u parazitovaných a neparazitovaných obratlovců, pokud jsou sníženy nebo zvýšeny všechny hematologické parametry. Dojde-li ke zvýšení určitých parametrů DWBC, nelze bez stanovení TWBC zjistit, zda to bylo způsobeno nárůstem počtu daných typů leukocytů, nebo naopak snížením počtu ostatních typů leukocytů (Qamar & Maqbool 2012). Existují různé manuální i automatické metody pro vyšetřování absolutního a relativního počtu erytrocytů a leukocytů (Post et al 2003). Absolutní koncentrace buněk bývá počítána manuálně Unopettovou metodou nebo NattHerrickovou

metodou

v

hemacytometru

(počítací komůrce – obr 11) (Campbell & Ellis 2013, Schinnerl et al 2011). Jedná se o komerčně dostupné systémy, součástí jsou speciální

pipety

a

ředící

roztoky

což

eliminuje chyby pipetování a manuální metoda je pak přesnější. Tyto systémy lze Obr 11: Neubauerův hemocytometr s devíti velkými čtverci: 1,3,7 a 9 jsou rohové; 2,4,6 a 8 použít ke zjištění WBC, RBC, Hb, počet jsou boční a 5 je ve středu (Dein et al 1994). krevních destiček a eosinofilů (Rodak et al 2007). Pro Unopettovu a Natt-Herrickovu metodu se používá odlišné ředění vzorku krve a Natt-Herrickův roztok obsahuje navíc methyl violeť (Jacobson 2010). Natt-Herrickova metoda je přímá zatímco Unopettova metoda je nepřímá (Dein et al 1994). Přímou metodou se rozumí spočítání všech buněk daného typu v konkrétním počtu čtverců hemacytometru (Campbell et al 2010). Určování DWBC se provádí pomocí světelné mikroskopie spočítáním 100 (případně 400) leukocytů. Zaznamenávány jsou jednotlivé typy leukocytů, z čehož je zjištěno jejich zastoupení v procentech (Lucas & Jamroz 1961). Z DWBC je pak možné spočítat H/L poměr, který slouží jako indikace stresu (El-Lethey et al 2003). V některých studiích bývá také měřeno procentuální zastoupení retikulocytů. Pro barvení krevního nátěru bývá použita methylénová modř. Pod světelným mikroskopem je zjištěn počet retikulocytů na 1000 erytrocytů (Fujino et al 2013). 17

Pro hematologické studie je doporučena krev odebraná z žíly, ne z kapilár. Typ žíly pro odběr závisí na druhu obratlovce, odběr lze provést například z hrdelní žíly (vena jugularis), popřípadě z žil nártu (vena metatarsalis), z povrchové podkožní žíly dolní končetiny (vena saphena), cefalické žíly (vena cephalica). Objem odebrané krve je specifický pro konkrétní druhy obratlovců a závisí na celkovém objemu krve jedince, který se odhaduje podle tělesné hmotnosti a kondice jedince (Campbell 1988, Campbell 1990). Krevní vzorky jsou obvykle odebírány pomocí jehly do stříkačky, která může, ale nemusí, obsahovat antikoagulanty (Campbell 1988, Campbell 1990, Ortiz-Catedral et al 2011). Krev bez antikoagulantů musí ale být neprodleně použita pro analýzy. Pro některá vyšetření krve je nutné použít antikoagulanty např. EDTA nebo heparin (Campbell et al 2010). Máme k dispozici mnoho moderních metod pro zjišťování hematologických parametrů a pro detekci parazitů na molekulární úrovni, jako je např. FACS (Seliger et al 2012) (Becker et al 2008) (Petit et al 1990). Existují různé automatické hematologické analyzéry založené na fluorescenční laserové průtokové cytometrii pro rutinní měření hematologických parametrů týkajících se červených a bílých krvinek především ve veterinární medicíně (Fujino et al 2013). Dále je používána metoda enzyme-linked immunosorbent assay ELISA (Santana et al 2013), interferon-gamma release assay (IGRA) (Chambers 2013), indirect fluorescent antibody (IFA) (Waner et al 1997), polymerase chain reaction (PCR) (Ottiger 2010).

5 Skupiny parazitů a jejich vliv na hematologii 5.I Bakterie extracelulární Extracelulární bakterie obvykle spíše zvyšují TWBC (Lauritzen et al 2005, Talpur & Ikhwanuddin 2013). To je potenciálně důležitý marker zdravotního stavu například v potravinářském průmyslu. Například robalo stříbřitý je velice ceněnou rybou v Austrálii a jihovýchodní Asii a halofilní gramnegativní bakterie Vibrio harveyi způsobuje u těchto ryb vážné onemocnění spojené se zvýšenou mortalitou (Talpur & Ikhwanuddin 2013, Tendencia 2002). Podobně infekce bakterií Actinobacillus pleuropneumoniae se u prasat projevuje leukocytozou (Lauritzen et al 2005) a totéž bylo pozorováno u Mycobacterium bovis, což je původce tuberkulózy dobytka (Quevillon et al 2013). Zde bylo zjištěno, že zvýšení TWBC souvisí se zvýšením absolutního počtu lymfocytů, neutrofilů a monocytů v důsledku parasitismu. Nebyla však pozorována žádná změna počtu eozinofilů a bazofilů (Quevillon et al 2013). Absolutní počet eozinofilů a bazofilů poklesl i u robala stříbřitého při infekci V. harveyi (Talpur & Ikhwanuddin 2013). Lymfocyty, monocyty a neutrofily mohou mít zásadní funkční význam pro obranu hostitele proti bakteriálním infekcím, zatímco význam eozinofilů a 18

basofilů při boji s tímto typem patogenů je zanedbatelný (Chen et al 2001, Quevillon et al 2013). Tuto skutečnost dokládá i příklad u morčat, která byla experimentálně infikována bakterií Salmonella dublin, kde došlo ke značnému nárůstu TWBC, a to především kvůli lymfocytoze a neutrofilii (Gupta et al 1999). Odpovídající, ne však identické, změny v krevním obrazu lze pozorovat i na úrovni relativních počtů jednotlivých typů leukocytů. Relativní počet neutrofilů u robala stříbřitého, který byl parazitován bakterií Vibrio harveyi vzrostl, avšak relativní počet lymfocytů a monocytů se snížil (Talpur & Ikhwanuddin 2013). Zvýšení TWBC a relativního počtu neutrofilů je u tohoto druhu považováno za indikátor boje organismu s patogenem. Patogenní bakterie ovlivňují i hematologické znaky spojené s erytrocyty. Například v důsledku infekce robala stříbřitého bakterií Vibrio harveyi byly napadené žábry, popřípadě zničené další tkáně, proto je typický pokles RBC, MCV, MCH a MCHC. Hematokrit byl nízký, ryby trpěly anemií (Talpur & Ikhwanuddin 2013). Podobně i infekce Salmonella dublin snížila u morčat RBC, koncentraci hemoglobinu a MCHC, což poukazuje na anemii (Gupta et al 1999). MCV bylo ale u infikovaných jedinců signifikantně vyšší než u zdravých jedinců. Dalším příkladem poklesu RBC je onemocnění purpura haemorrhagica, které se u koní projevuje zánětem cév (vaskulitidou), které vede k rozsáhlému otoku a krvácení sliznic a podkožních tkání (Pusterla et al 2003). Toto onemocnění bývá způsobeno infekcí Streptococcus equi (Whelchel & Chaffin 2009), zřídka také Streptococcus zooepidemicus, Rhodococcus equi, Corynebacterium pseudotuberculosis. Mezi typické hematologické projevy patří anemie a neutrofilie (Pusterla et al 2003).

5.II Bakterie intracelulární Intracelulární bakterie ovlivňují hematologické parametry různě, navíc je o jejich vlivu na hematologické parametry obratlovců známo ne příliš mnoho a není zde patrný jednoznačný trend. Navíc intracelulární bakterie vyvíjí rozličné strategie, aby se vyhnuly imunitní odpovědi infikovaného jedince (Grayfer et al 2014). Ehrlichia která je parazitem leukocytů různých skupin obratlovců, způsobuje změny krevního obrazu. Cílovými buňkami bývají nejčastěji monocyty, makrofágy a granulocyty. U savců se projevuje pancytopenií, dochází tedy k leukopenii, anemii a trombocypenii. Velikost krevních destiček může být větší, než odpovídá normálním hodnotám (Waner et al 1997). Tradičně dochází k poklesu monocytů a lymfocytů (Souza et al 2013). Dle některých studií je snížen absolutní počet neutrofilů (Waner et al 1997). Bakterie Edwardsiella tarda která infikuje buňky gastrointestinálního traktu obratlovců se 19

například u korejské ryby Silurus asotus naopak projevuje zvýšením WBC. Relativní počet lymfocytů bývá po uplynutí 48 hodin zvýšený a relativní počet neutrofilů a monocytů snížený v porovnání k neinfikovaným jedincům (Yu et al 2010). Pro bakterii (Anaplasma marginale) obligátně se vyskytující uvnitř erytrocytů různých druhů savců, jejímž nejčastějším vektorem bývá klíště, je původcem anaplasmosy (Zivkovic et al 2007). U telat jsou typické snížené hematologické parametry Hb, PCV a RBC (De et al 2012). Totéž dokládá studie provedená na rybě Silurus asotus infikované bakterií Edwardsiella tarda (Yu et al 2010). Extravaskulární hemolytická anemie je typická pro anaplasmosu (De et al 2012). Jiný autor (Bell-Sakyi 2004) studoval vliv anaplasmosy na dobytek, ovce a kozy. Dobytek nakažený anaplasmosou měl PCV nejnižší z celého vzorku studovaných jedinců. Další druh A. platys obligátně intracelulární bakterie infikující krevní destičky parazituje na psech a způsobuje především pokles počtu trombocytů (Gaunt et al 2010). Bakterie rodu Yersinia jsou fakultativními intracelulárními patogeny savců (Platt-Samoraj et al 2009) a ptáků (Cork et al 1999), dokážou se množit v makrofágách (Pujol & Bliska 2003) a infikují lymfatickou tkáň (Balada-Llasat & Mecsas 2006). Například orální infekce vepřů bakterií Yersinia enterocolitica se projevuje mírnou leukocytozou 2 týdny po infikaci (Platt-Samoraj et al 2009).

5.III Viry Viry většinou u obratlovců způsobují snížení TWBC a charakteristické jsou změny relativního počtu lymfocytů a neutrofilů (Zhu et al 2013). Viry mívají vliv i na hematologické parametry týkající se erytrocytů, častá bývá anemie. Například Virus CIAV (chicken infectious anaemia virus - virus způsobující slepičí anemii) rodu Gyrovirus patřící do skupiny Ciroviridae je patogenem drůbeže, který bývá příčinou významných ekonomických ztrát (Bhatt et al 2011) způsobuje především anemii a to v důsledku poklesu RBC, PCV a koncentrace hemoglobinu. Také snižuje TWBC kdy relativní počet lymfocytů klesá a relativní počet heterofilů vzrůstá (Bhatt et al 2013). Pokles TWBC je charakteristický také pro onemocnění dýchacího traktu dobytka, která bývají způsobena komplexem patogenů, kde hrají dominantní roli viry (bovine viral diarrhea virus BVDV, bovine herpesvirus-1 - BHV-1, bovine respiratory syncytial virus, parinfluenza-3 virus), přítomny bývají ale také bakterie (Srikumaran et al 2007). BVDV je ssRNA virus patřící mezi pestiviry skupiny Flaviviridae. Celosvětově způsobuje onemocnění dobytka, která často bývají fatální. BVDV jsou různůch biotypů – cytopatické (cp) které u dobytka způsobují slizniční onemocnění a necytopatické (ncp) (Lee et al 2008). Změny hematologických 20

parametrů související s imunosupresivní aktivitou BVDV (Brownlie et al 1987) a BHV-1 u telat se projevují poklesem TWBC, zahrnují přechodnou leukopenii (lymfopenie) (Molina et al 2012), dále dochází k monocytopenii (Littel-van den Hurk 2007, Pedrera et al 2009) a neutropenii (Pedrera et al 2009) s funkčním poškozením monocytů, neutrofilů a lymfocytů (Glew et al 2003, Molina et al 2013). Vliv virů na hematologické parametry obratlovců není příliš známý zřejmě z toho důvodu, že jsou viry většinou studovány především na molekulární úrovni a takové charakteristiky z krevního obrazu bohužel zjistin nelze. Například pro BVDV a BHV-1 je charakteristický pokles absolutního počtu B lymfocytů (Brewoo et al 2007) a T lymfocytů, především CD4+ a CD8+ gama – delta. T lymfocyty jsou ovlivněny v menším rozsahu než B lymfocyty (Winkler et al 1999). Buněčná imunitní odpověď hraje klíčovou roli v boji proti BVDV a BHV-1, protože humorální odpověď není dostatečná pro eliminaci infikovaných buněk (Molina et al 2013).

5.IV Protozoa intracelulární Pro infekci obratlovců intracelulárními prvoky jsou typické změny hematologických parametrů, které se týkají červených krvinek, jako je například aemie (snížené PCV) (BellSakyi 2004, Da Silva et al 2011, Sandhu et al 1998, Singh et al 2001). Dále bývá patrný pokles absolutního počtu erytrocytů, trombocytů, hemoglobinu (Omer et al 2002, Osman & AlGaabary 2007, Sandhu et al 1998) a častá je splenomegalie (zvětšení sleziny) (Da Silva et al 2011). Změny hematologických parametrů byly studovány u výtrusovců (Apikomplexa) Theileria mutans, T. Velifera a Babesia bigemina infikujících dobytek a ovce. Nejnižší PCV bylo zaznamenáno u dobytka infikovaného prvoky rodu Babesia. U dobytka a ovcí bez detekované hemoparasitické infekce bylo PCV znatelně vyšší na rozdíl od infikovaných jedinců. Hodnoty PCV nevykazovaly žádné sezónní trendy u dobytka ani u ovcí, kterým byl vzorek odebírán 1x měsíčně (Bell-Sakyi et al 2004). Tropická theileriosa (Theileria annulata) buvolů (Bubalus bubalis) v Egyptě u infikovaného dobytku také typicky snižuje hematologické parametry RBC, Hb, PCV, MCHC, PLT. Signifikantní však byl nárůst MCV. Tyto změny indikují makrocytickou hypochromickou anemii (Omer et al 2002). U křížených telat holštýnského a sahiwalského skotu experimentalně infikovaných Theileria annulata byla zaznamenána normocytická normochromická anemie (Sandhu et al 1998). Také zástupce výtrusovců Rangelia vitalii infikující psy způsobuje mírnou anemii, navíc pokles hematokritu, splenomegalii (zvětšení sleziny), hepatomegalii (zvětšení jater) a lymfadenopathii (zvětšení 21

mízních uzlin) (Da Silva et al 2011). Další zástupce výtrusovců Hepatozoon canis se u psů projevuje hypochromickou macrocytickou anemií a thrombocytopenií (snížené množství krevních destiček) (Da Silva et al 2011). Naopak v případě jestřába Coopferova nebylo prokázáno, že by krvinkovky (Hematozoa) Haemoproteus, Leucocytozoon toddi a Plasmodium ovlivňovaly PCV (Boal et al 1998). Intracelulární prvoci způsobují změny hematologické parametry týkající se leukocytů různými způsoby. Například výtrusovec Hepatozoon canis bývá příčinou zmnožení leukocytů (zvýšení TWBC) u psů, což je považováno za znak aktivace imunitního systému. Narůstá počet segmentovaných neutrofilů, lymfocytů, eozinophilů, monocytů. Leukocytosa ale nejvíce souvisí s neutrofilií a lymfocytosou. Na úrovni celého organismu dochází stejně jako v případě infekce výtrusovcem Theileria annulata ke zvětšení sleziny, navíc ke snížení koncentrace Fe, Zn a zvýšení koncentrace Cu. Onemocnění bývá často spojeno s dalšími parazity, jako jsou Babesia a Ehrlichia canis (Da Silva et al 2011). Na rozdíl od infekce psů Hepatozoon canis (Da Silva et al 2011) je dle dalších studií theilerioza buvolů (Bubalus bubalis) doprovázena signifikantním poklesem počtu leukocytů eosinopenií, neutropenií, lymfocytopenií a monocytopenií (Osman & Al-Gaabary 2007). Stejné změny u dobytku popsal (Omer et al 2002), kdy byl zjištěn pokles absolutního počtu lymfocytů, eozinofilů, neutrofilů, ale nebyl zaznamenán rozdíl v absolutním počtu bazofilů a monocytů v porovnání s nenakaženými jedinci. Procentuální zastoupení monocytů bylo ale podstatně vyšší oproti neinfikovaným jedincům, zatímco procentuální zastoupení lymfocytů, eozinofilů, neutrofilů, bazofilů nebylo signifikantně odlišné u infikovaných a neinfikovaných jedinců. Relativní nárůst monocytů v infikovaném dobytku nebyl překvapující (Forsyth et al 1999, Preston et al 1999), protože absolutní počet monocytů zůstal stejný a relativní zvýšení počtu monocytů je tedy dáno snížením absolutního počtu ostatních leukocytů (Omer et al 2002). Ve studii, kdy byla křížená telata experimentálně infikovanána Theileria annulata, se v čase měnila mírná leukocytoza na mírnou leukopenii (Singh et al 2001) Patogenicita krevních parazitů u volně žijících ptáků je těžko zjistitelná, protože hostitel je schopen udržovat infekci pod prahem detekovatelnosti (Merino et al 2000). Nejčastější výskyt ptačí malárie, které způsobuje Plasmodium infikující erytrocyty u drozda bledoprstého Turdus leucomelas je během období rozmnožování a hematologické parametry bývají ovlivňovány, mnohdy je ale problematické příslušné změny detekovat (Lobato et al 2011). Jiné studie provedené na drozdu stěhovavém (Turdus migratorius) a drozdu hnědém (T. Grayi) zaznamenaly zvýšení TWBC, diferenciálního počtu lymfocytů a eozinofilů (Ricklefs & Sheldon 2007). Naopak studie provedená na kakariki rudočelém (Cyanoramphus 22

novozelandiae) vliv Plasmodia na hematologické parametry nepotvrzuje (Ortiz-Catedral et al 2011). Obdobně ptačí malárie způsobená výtrusovcem Haemoproteus, který infikuje erytrocyty a v dalších stádiích svalovou tkáň, slezinu, plíce a játra, se u sýkory koňadry (Parus major) projevuje zvýšením počtu lymfocytů v periferní krvi, ale pouze u samců. Zejména u starších jedinců bývá změna výrazná (Ots & Horak 1998).

5.V Protozoa extracelulární O vlivu extracelulárních prvoků na hematologické parametry u obratlovců vyjma člověka existuje nejvíce poznatků o rodu Trypanosoma, o vlivu jiných skupin se toho bohužel příliš mnoho neví. U myši domácí (Mus musculus) je považována trombocypenie za univerzální indikátor infekce prvokem Trypanosoma vivax (Davis 1982). Byl pozorován dramatický pokles množství krevních destiček sedm dnů po infikaci (Chamond et al 2010). Vyšetřením krve infikovaných myší byla indikována ztráta červených krvinek souběžně s vysokou úrovní parasitemie. S tím souvisí také značný pokles koncentrace hemoglobinu a hodnoty hematokritu (Chamond et al 2010). To samé bylo zaznamenáno u přežvýkavců (Ohaeri & Eluwa 2011). Dle dalších studií se Trypanosoma sp. u přežvýkavců projevuje znatelným poklesem MCHC, anemií způsobenou intra/extravaskulární destrukcí erythrocytů. Anemie je také přímým důsledkem deficitu erythropoetinu (EPO), což je hormon podporující tvorbu červených krvinek (Ohaeri & Eluwa 2011). U myší bylo zaznamenáno zmnožení retikulocytů 14 dní po infikaci. Také u přežvýkavců absolutní počet retikulocytů narůstá (Ohaeri & Eluwa 2011). Myši těsně před úhynem trpěly regenerativní, normocytickou a normochromickou anemií (Chamond et al 2010). Pro nákazu způsobenou Trypanosomou sp. je typická anemie také u dobytka (Silva et al 1999). Další hematologické parametry jako je MCV, MCH a absolutní počet retikulocytů naopak obvykle narůstají (Ohaeri & Eluwa 2011). V počáteční fázi infekce dochází u myší ke zmnožení bílých krvinek, později byla zaznamenána leukopenie, a to od druhého týdne infekce. Leukopenie byla však doprovázena nárůstem počtu neutrofilů a monocytů (Chamond et al 2010). Dle jiné studie monocyty a granulocyty zůstávají bez signifikantního ovlivnění (Blom-Potar et al 2010). T. vivax spouští blastogenezi lymfocytů, tedy zvýšení jejich počtu v sekundárních lymfoidních orgánech, což indikuje, že došlo ke stimulaci imunity (Blom-Potar et al 2010). Pro infekci prvokem Trypanosoma u přežvýkavců je naopak typická leukocytosa, lymfocytosa a neutropenie. Neurtofily jsou využívány při zánětu. Nebyl pozorován velký rozdíl v počtu eozinofilů, bazofilů a monocytů u infikovaných a neinfikovaných jedinců (Ohaeri & Eluwa 23

2011), stejně jako dle některých studií na myších (Blom-Potar et al 2010). Rovněž v případě parasitismu prvoky rodu Trypanosoma na úhoři říčním (Anguilla anguilla) nebyl zaznamenán vliv na zastoupení granulocytů v krvi (Haenen et al 2010).

5.VI Mnohobuněční endoparaziti Mnohobuněční endoparaziti často zvyšují WBC (Haenen et al 2010), což je zapříčiněno především nárůstem množství granulocytů bazofilů, eozinofilů (Louvandini et al 2006, Rotman et al 1996) a neutrofilů v periferní krvi (Louvandini et al 2006, Makepeace et al 2012). Neutrofily jsou zřejmě velice důležité pro zahájení adaptivní imunitní odpovědi proti mnohobuněčným endoparazitům (Galioto et al 2006). Molekulární mechanismy však dosud nejsou zcela zřejmé, je však známo že význačnou roli hrají IL-5 který ovlivňuje neutrofily nepřímo (Al-Qaoud et al 2000) a chemokinový receptor neutrofilů CXCR2 (Galioto et al 2006). Nejtypičtější změnou hematologických parametrů je eozinofilie, která se projevuje téměř ve všech případech (Louvandini et al 2006, Parvathi & Karemungikar 2011, Rotman et al 1996), existují však i výjimky (EL-Malky et al 2013). Diferenciální počet lymfocytů a neutrofilů se může i snižovat (Hoglund et al 1992). Zvýšení WBC v souvislosti s endoparazitismem bylo popsáno u ryb (Haenen et al 2010) a savců (Roletto 1993). U ptáků byl rovněž zjištěn tento trend, avšak jedinci dlaska tlustozobého (Coccothraustes

coccothraustes),

kteří

byli

studováni,

trpěli

parazitismem

nejen

mnohobuněčných endoparazitů, ale současně byli zaznamenáni také prvoci (Protozoa) (Hauptmanova et al 2004). U úhoře říčního (Anguilla anguilla) bylo zjištěno, že sanguivorní (krví se živící) hlístice krevnatka úhoří (Anguillicola crassus) způsobující mechanická poškození plynového měchýře (Palstra et al 2007) a je zodpovědná za chronické stadium relativní lymfocytosa (Haenen et al 2010). Toto se projevilo i u lachtana kalifornského (Zalophus californianus) na němž parazitovaly hlístice Contracaecum a Anisakis a motolice Zalophotrema hepaticum (Roletto 1993). V porovnání se zdravými lachtany měli infkovaní jedinci zvýšený TWBC. Také rypouš severní (Mirounga angustirostris) trpící stejným parasitismem měl vyšší TWBC (Roletto 1993). Na rozdíl od parazitů zmíněných výše v důsledku parazitismu tasemnice dětské (Hymenolepsis nana) na myši domácí (Mus musculus) klesá TWBC. Ztráta krevních buněk je způsobena hemofagií (Parvathi & Karemungikar 2011). TWBC klesá také v důsledku parasitismu hlístem plicnivkou (Metastrongylus sp.) na evropském divočáku (Sus scrofaa) (Lopez-Olvera et al 2006). Dle některých studií dochází u obratlovců parazitovaných hlísticemi (Nematoda) k polesu relativního počtu lymfocytů a vzrůstu relativního počtu granulocytů (Hoglund et al 1992). 24

Studie zabývající se střevními hlísticemi zaznamenávají, že imunitní odpověď na druhy Heligmosomoides polygyrus, Nippostrongylus brasiliensis, Trichuris muris a Trichinella spiralis je řízena lymfocyty Th2. Patrná je bazofilie, eozinofilie a alternativní je aktivace makrofágů (Herbert et al 2002, Maizels et al 2009b). U myší infikovaných T. muris, S. mansoni a T. spiralis hrály eosinofily klíčovou roli (Swartz et al 2006). Lachtan kalifornský (Zalophus californianus) na němž parazitovali Contracaecum, Anisakis a Zalophotrema hepaticum měl značně zvýšený diferenciální počet neutrofilů, to samé se projevilo u rypouše severního (Roletto 1993). Larvy vlasovky slezové (Haemonchus contortus) parazitující na mláďatech ovcí a koz indukují zvýšení počtu eosinofilů a neutrofilů (Rowe et al 2008). Dle jiných studií bylo relativní zastoupení neutrofilů nižší, ale relativní zastoupení lymfocytů, basofilů a monocytů vyšší (Qamar & Maqbool 2012). Také byla nalezena inverzní korelace mezi počtem lymfocytů a fekunditou červů a korelace mezi velikostí červů a fekunditou (Rowe et al 2008). Mnohobuněční endoparazité mohou ale počet granulocytů i snižovat. Například tasemnice dětská (Hymenolepsis nana) parazitující u myši domácí (Mus musculus) snižuje relativní počet neutrofilů (neutropenie). Je zde prokazatelná tendence ztráty obranných mechanizmů vůči patogenu, protože enzymy parazita způsobují lýzi neutrofilů. Naopak množství lymfocytů vzrůstá (lymfocytóza). Lymfocyty jsou zodpovědné za imunitní odpověď hostitele na parazita poté, co fagocytující neutrofily selžou. Zmnožení monocytů (monocytosa) je také imunologickou odpovědí infikovaného hostitele bojujícího s hymenolepsií. Leukopenie, neutropenie, lymfocytosa, eosinophilie a monocytosa indikují rozličné obranné mechanismy hostitele vůči infekci tasemnicí dětskou (Parvathi & Karemungikar 2011). Hádě Strongyloides venezuelensis v myších způsobuje snížení výskytu mastocytů a eosinofilů v krvi (EL-Malky et al 2013). Eliminace háděte Strongyloides venezuelensis z myší je spojeno s proliferací a aktivací střevních žírných buněk a eozinofilů a s protilátkami, které reagují s tímto parazitem (El-Malky et al 2003, Lantz et al 1998, Maruyama et al 2000). Dle některých autorů (Herbert et al 2002) nejsou B lymfocyty potřebné v primární imunitní odpovědi na hádě Strongyloides, ale až v sekundární imunitní odpovědi. B lymfocyty ale hrají kritickou roli v eliminaci dospělců Strongyloides venezuelensis prostřednictvím protilátek a možná také prostřednictvím dosud neznámých mechanismů, které budou zkoumány (EL-Malky et al 2013). Hematologické parametry jako je RBC, Hb, PCV, MCV, MCH, MCHC a počet krevních destiček, bývají u savců, kteří jsou hostitelé mnohobuněčných parazitů, sníženy (Mir et al 2007). Dokládá to například studie zabývající se parazitismem Contracaecum, Anasakis a 25

Zalophotrema hepaticum na lachtanu kalifornském (Zalophus californianus) (Roletto 1993). Lachtan parazitovaný hlísticí Parafilaroides decorus měl také sníženou koncentraci hemoglobinu a snížené PCV, MCH, MCHC. Larvy Haemonchus contortus parazitující na mláďatech ovcí a koz také způsobují snížení RBC (Mir et al 2007). Ovce i kozy měly vyšší PCV a více hemoglobinu se snižujícím se stupněm infekce. Dále dochází k poklesu PCV a poklesu koncentrace hemoglobinu (Qamar & Maqbool 2012). U potkana (Rattus norvegicus) zůstávají hematologické parametry MCV, MCH, MCHC a krevní destičky v důsledku infekce Enchiostoma paraensei bez velkých změn (Garcia et al 2012) narozdíl od Contracaecum, Anisakis a Zalophotrema hepaticum infikující ploutvonožce (Roletto 1993). Také gastrointestinalní hlístice Trichostrongylus colubriformis, Haemonchus Contortus, Trichuris globulosa a Moniezia expansa u ovcí způsobují anemii a ovlivňují tak hematologický parametr MCV (Louvandini et al 2006). Naopak rypouši severní (Mirounga angustirostris) trpící parasitismem výše zmíněnými hlísticemi měli vyšší RBC a vyšší koncentraci hemoglobinu, navíc i vyšší hematokrit (Roletto 1993). Podobně hlístice Aspicularis tetraptera vyskytující se v myších (Mus musculus) zodpovídá za zvýšené hodnoty hemoglobinu a RBC (Gaherwal et al 2012). Stejně tak tuleni (Phoca vitulina richardsi) parazitovaní hlísticemi měli vyšší RBC a vyšší koncentraci hemoglobinu, ale nižší MCH, MCHC (Roletto 1993). O něco málo nižší hodnoty v porovnání s běžnými hodnotami hematologických parametrů u rypouše severního byly zaznamenány v případě MCHC, avšak MCH bylo sníženo téměř o polovinu původních hodnot (Roletto 1993).

5.VII Houby Imunologická odpověď na infekci houbami bývá založena na makrofázích, neutrofilech a posléze dendritických buňkách a T buněčné regulaci imunitní odpovědi (Romani 2004). Kvasinka Candida tropicalis byla detekována současně s bakteriemi skupiny Staphylococcus sp. a Streptococcus sp. u slona cejlonského Elephas maximus maximus, který měl zvýšený WBC a to především kvůli zmnožení lymfocytů a neutrofilů, přítomné byly navíc segmentované neutrofily které jsou výrazným hematologickým indikátorem této infekce. Patrný byl však pokles monocytů a eosinofilů. Rovněž došlo ke snížení RBC (Ka 2008). Naopak

dle

studie

zabývající

se

chytridiomykozou

způsobenou

Batrachochitrium

dendrobatidis nebyl prokázán vliv na hematologické parametry RBC, Hb a hematokrit u žáby Litoria

caerulea.

Úhyny

těchto

obojživelníků

jsou

zřejmě

v

důsledku

nákazy

chytridiomykozou způsobeny narušením funkce pokožky v regulaci osmotických hodnot organismu a nemají vliv na hematologické parametry (Voyles et al 2007). 26

5.VIII Ektoparaziti Ektoparaziti jsou typičtí tím, že snižují hematologické parametry obratlovců, které se týkají červených krvinek a naopak obvykle zvyšují hematologické parametry týkající se bílých krvinek (Ipek et al 2012, Simon et al 2005). Ektoparazité mohou způsobovat rozsáhlá poškození tkání (Ipek et al 2012). Parazitovaní jedinci musí věnovat mnoho času a energie ke zbavování se ektoparazitů místo shánění potravy a odpočinku (Simon et al 2005), což vede ke stresu a tedy ke zvýšení poměru N/L (Harrington et al 2012, Johnstone et al 2012). Například moucha Wohlfahrtia magnifica parazituje na ovcích a její přítomnost je detekovatelná sníženým RBC a snížným PCV (Ipek et al 2012). Byla nalezena negativní korelace mezi počtem larev a RBC (Ipek et al 2012). Stejně tak larvy mouchy Protocalliphora parazitující na ptácích snižují PVC a koncentraci hemoglobinu (Simon et al 2005, Whitworth & Bennett 1992). Roztoč Rhipicephalus sanguineus patřící do skupiny klíšťatovití (Ixodidae) se vyskytuje u psů. Je to vektor přenášející bakterii Ehrlichia canis a také výtrusovce Babesia vogeli a Hepatozoon canis. Způsobuje neregenerativní anemii (Otranto et al 2012). Pstruh duhový (Oncorhynchus mykiss), losos obecný (Salmo salar) a losos (Oncorhynchus kisutch) byli experimentálně nakaženi klanonožcem "mořská veš" (sea lice) (Lepeophtheirus salmonis). Koncentrace hematokritu byla ve standartním fyziologickém rozmezí bez rozdílu mezi infikovanými a neinfikovanými jedinci (Fast et al 2002). Někteří ektoparaziti ale způsobují změny hematokritu. Toto se týká jednorodých (Monogenea) Urocleidoides eremitus a Anacanthorus sp., což jsou ektoparazité ryb. U trahiry malé (Hoplias malabaricus) došlo ke zvýšení RBC a zvýšení hodnot hematokritu (Correa et al 2013). Naopak u jedinců kranase Dumerilova (Seriola dumerili) kteří byli parazitováni zástupci jednorodých Zeuxapta seriolae byly hodnoty hematokritu signifikantně snížené (Montero et al 2004). Ve většině případů dochází k nárůstu leukocytů. Moucha Wohlfahrtia magnifica u ovcí zvyšuje absolutní počet leukocytů, neutrofilů, lymfocytů a bazofilů. Také byla zjištěna pozitivní korelace mezi počtem larev, TWBC a relativním počtem neutrofilů (Ipek et al 2012). Jeseter ostrorypý

(Acipenser

oxyrinchus

oxyrinchus)

infikovaný

parazitickým

kopepodem

Dichelesthium oblongum vykazuje nárůst eosinofilů a neutrofilů, ale pokles lymfocytů (Sokolowski et al 2012). Roztoč Rhipicephalus sanguineus u psů způsobuje neutrofilii, trombocypenii a pancytopenii (Otranto et al 2012).

27

6 Závěr Klasická hematologická vyšetření kondice studovaného jedince jsou především v zoologickém výzkumu velice výhodná a to zejména pro svou nízkou cenu a technickou nenáročnost (na rozdíl od moderních automatických metod, kdy bývá při práci s nemodelovými organismy obtížná optimalizace). Porovnáním s referenčními hodnotami lze snadno zjistit, zda se jedinec nachází v homeostáze nebo naopak trpí fyziologickým stresem, jehož příčinou může být, mj. infekce parazity. Některé skupiny parazitů způsobují natolik charakteristické změny hematologických parametrů, že je možné odhadnout, jakým typem parazitů je daný jedinec majoritně infikován. Není tomu tak vždy, občas je problematické identifikovat, kteří paraziti mohli způsobit ty změny krevního obrazu, které v krvi pozorujeme. Přesto jsou často patrné zřetelné rysy infekce, které nám mohou dát první vodítko při diagnostice nebo interpretaci výsledků. Pro studie citované v této bakalářské práci lze vliv daných skupin parazitů na obratlovce shrnout následujícím způsobem: •

Obrana proti extracelulárním bakteriím je zprostředkována především neutrofily a lymfocyty, což se v krevním obrazu projevuje zvýšením absolutního počtu těchto typů leukocytů. V některých případech může vzrůstat i absolutní počet monocytů.

•

Pro intracelulární bakterie je typické snížení všech typů krevních buněk a to především z důvodu přímého napadání těchto buněk daným patogenem.

•

Při infekci viry často dochází ke snížení TWBC, což doprovází změny relativního počtu lymfocytů a neutrofilů. Viry mohou způsobovat také anemii. Viry ale nebývají často studovány z hlediska hematologických změn.

•

O vlivu extracelulárních prvoků na hematologické parametry obratlovců se toho bohužel příliš mnoho neví. Nejvíce studií se zabývá prvoky rodu Trypanosoma. Markerem této infekce je především trombocypenie a pokles hematologických parametrů, které se týkají červených krvinek.

•

Změny v hematologických parametrech v důsledku parazitismu intracelulárními prvoky je obtížné zobecnit, obvyklá je anemie. Dále může v průbehu nákazy docházet ke změnám lymfocytozy na lymfopenii a opačně.

•

O vlivu hub na krevní obraz obratlovců se toho mnoho neví. Navíc něktré studie vliv hub na hematologické parametry obratlovců vyvrací. Imunologickou obranu proti infekcí houbami zajišťují především makrofágy, neutrofily, dendritické buňky a 28

lymfocyty. •

Mnohobuněční endoparazité obvykle zvyšují absolutní počet leukocytů, velice výrazná je eosinofilie, dochází však i ke zvyšování počtu bazofilů. Tato skutečnost se může projevit také jako snížení relativního počtu lymfocytů a neutrofilů.

•

Ektoparazité mohou způsobovat rozsáhlá poškození tkání. Často jsou hemofágové a obvykle snižují hematologické parametry týkající se červených krvinek a zvyšují počty leukocytů. Nakažení jedinci musí věnovat mnoho času a energie ke zbavování se ektoparazitů místo shánění potravy a odpočinku, což zvyšuje stres a tím zvyšuje poměr N/L.

Pro zlepšení interpretačního rámce hematologických dat v zoologických studiích je nezbytné udržovat a rozšířit databázi s referenčními hodnotami hematologických parametrů u konkrétních druhů obratlovců. Taková databáze byla pro znaky spojené s leukocyty obojživelníků, ptáků a plazů vytvořena Dr. Davisem (http://wildlifehematology.uga.edu/). Užitečná bude rovněž optimalizace moderních automatických metod (průtoková cytometrie) pro různé nemodelové organismy. Hlavní přínos vidím ve využití ve veterinární praxi, zohlednění zdravotního stavu jedince v ekologických studiích a zařazení hematologického vyšetření do pro pilotních terénních studií antiinfekční imunity, tedy předběžné testování, zda je daný jedinec parazitován a pokud ano, čím, což následně může být zkoumáno na molekulární úrovni.

29

7 Poděkování Ráda bych poděkovala svému školiteli Michalu Vinklerovi za to, že mě vedl při psaní této bakalářské práce a za konzultace které mi poskytnul. Dále bych chtěla poděkovat celé naší skupině pro výzkum evoluční ekologie ptáků za velice příjemné a přátelské prostředí a své rodině za podporu a péči.

30

8 Seznam zkratek RBC absolutní počet červených krvinek PLT (total platelets) absolutní počet trombocytů PCV hematokrit (podíl krve který zaujímají erytrocyty a lze jej zjistit například centrifugací krve, indikátor anemie) Hb koncentrace hemoglobinu RBC absolutní koncentrace erytrocytů MCV střední objem buňky MEV střední objem erytrocytu MVH střední hodnota buněčného hemoglobinu MCHC střední koncentrace hemoglobinu na buňku TWBC absolutní počet leukocytů DWBC diferenciální počet leukocytů DTH delayed type hypersensitivity TH1 pomocné TH1 lymfocyty TREG regulační T lymfocyty EPO erythropoetin

31

9 Literatura Acker JP, Croteau IM, Yi QL. 2012. An analysis of the bias in red blood cell hemolysis measurement using several analytical approaches. Clinica Chimica Acta 413: 1746-52 Al-Qaoud KM, Pearlman E, Hartung T, Klukowski J, Fleischer B, Hoerauf A. 2000. A new mechanism for IL-5-dependent helminth control: neutrophil accumulation and neutrophilmediated worm encapsulation in murine filariasis are abolished in the absence of IL-5. International immunology 12: 899-908 Asberg AE, Mikkelsen G, Aune MW, Asberg A. 2014. Empty iron stores in children and young adults-the diagnostic accuracy of MCV, MCH, and MCHC. International Journal of Laboratory Hematology 36: 98-104 Averbeck C. 1992. HEMATOLOGY AND BLOOD-CHEMISTRY OF HEALTHY AND CLINICALLY ABNORMAL GREAT BLACK-BACKED GULLS (LARUS-MARINUS) AND HERRING-GULLS (LARUS-ARGENTATUS). Avian Pathology 21: 215-23 Balada-Llasat J-M, Mecsas J. 2006. Yersinia has a tropism for B and T cell zones of lymph nodes that is independent of the type III secretion system. Plos Pathogens 2: 816-28 Bearhop S, Griffiths R, Orr K, Furness RW. 1999. Mean corpuscular volume (MCV) as a measure of condition in birds. Ecology Letters 2: 352-56 Becker M, Moritz A, Giger U. 2008. Comparative clinical study of canine and feline total blood cell count results with seven in-clinic and two commercial laboratory hematology analyzers. Veterinary Clinical Pathology 37: 373-84 Bell-Sakyi L. 2004. Ehrlichia ruminantium grows in cell lines from four ixodid tick genera. Journal of Comparative Pathology 130: 285-93 Benavides J, Martinez-Valladares M, Tejido ML, Giraldez FJ, Bodas R, et al. 2013. Quercetin and flaxseed included in the diet of fattening lambs: Effects on immune response, stress during road transport and ruminal acidosis. Livestock Science 158: 84-90 Bhatt P, Shukla SK, Mahendran M, Dhama K, Chawak MM, Kataria JM. 2011. Prevalence of chicken infectious anaemia virus (CIAV) in commercial poultry flocks of northern India: a serological survey. Transbound Emerg Dis 58: 458-60 Bhatt P, Shukla SK, Wani MY, Tiwari R, Dhama K. 2013. Amelioration of chicken infectious

anaemia virus induced immunosuppression by immunomodulator and haematinic supplementation in chicks. Vet Arhiv 83: 639-52 Blom-Potar MC, Chamond N, Cosson A, Jouvion G, Droin-Bergere S, et al. 2010. Trypanosoma vivax Infections: Pushing Ahead with Mouse Models for the Study of Nagana. II. Immunobiological Dysfunctions. Plos Neglect Trop D 4 Bourges-Abella N, Geffre A, Moureaux E, Vincenti M, Braun JP, Trumel C. 2014. Hematologic reference intervals in Cynomolgus (Macaca fascicularis) monkeys. J Med Primatol 43: 1-10 Bratosin D, Estaquier J, Slomianny C, Tissier JP, Quatannens B, et al. 2004. On the evolution of erythrocyte programmed cell death: apoptosis of Rana esculenta nucleated red blood cells involves cysteine proteinase activation and mitochondrion permeabilization. Biochimie 86: 183-92 Brownlie J, Clarke MC, Howard CJ, Pocock DH. 1987. Pathogenesis and epidemiology of bovine virus diarrhoea virus infection of cattle. Ann Rech Vet 18: 157-66 Calvi LM, Link DC. 2014. Cellular Complexity of the Bone Marrow Hematopoietic Stem Cell Niche. Calcified Tissue International 94: 112-24 Campbell DE, Lai JP, Tustin NB, Riedel E, Tustin R, et al. 2010. Analytical and Biological Considerations in the Measurement of Cell-Associated CCR5 and CXCR4 mRNA and Protein. Clinical and Vaccine Immunology 17: 1148-54 Campbell TW. 1988. FISH CYTOLOGY AND HEMATOLOGY. Veterinary Clinics of North America-Small Animal Practice 18: 349-64 Campbell TW. 1990. AVIAN HEMATOLOGY. American Association of Zoo Veterinarians, Annual Meeting, October 21-26, 1990: Proceedings: 236-37 Campbell TW, Ellis CK. 2013. Avian and exotic animal hematology and cytology. John Wiley & Sons. Claver JA, Quaglia AIE. 2009. Comparative Morphology, Development, and Function of Blood Cells in Nonmammalian Vertebrates. Journal of Exotic Pet Medicine 18: 87-97 Clayton DH, Moore J. 1997. Host-parasite evolution: General principles and avian models. xiii+473p pp. Cork SC, Collins-Emerson J, Alley M, Fenwick S. 1999. Visceral lesions caused by Yersinia pseudotuberculosis, serotype II, in different species of bird. Avian pathology 28: 393-99 Correa LL, Karling LC, Takemoto RM, Ceccarelli PS, Ueta MT. 2013. Hematological parameters of

Hoplias malabaricus (Characiformes: Erythrinidae) parasitized by Monogenea in lagoons in Pirassununga, Brazil. Rev Bras Parasitol Vet 22: 457-62 Da Silva AS, Franca RT, Costa MM, Paim CB, Paim FC, et al. 2011. Experimental infection with Rangelia vitalii in dogs: Acute phase, parasitemia, biological cycle, clinical-pathological aspects and treatment. Exp Parasitol 128: 347-52 Danilova N. 2006. The evolution of immune mechanisms. Journal of Experimental Zoology Part BMolecular and Developmental Evolution 306B: 496-520 Dawkins R, Krebs JR. 1979. ARMS RACES BETWEEN AND WITHIN SPECIES. Proceedings of the Royal Society Series B-Biological Sciences 205: 489-511 Dawson RD, Bortolotti GR. 1997. Are avian hematocrits indicative of condition? American kestrels as a model. Journal of Wildlife Management 61: 1297-306 De UK, Dey S, Banerjee PS, Sahoo M. 2012. Correlations among Anaplasma marginale parasitemia and markers of oxidative stress in crossbred calves. Trop Anim Health Pro 44: 385-88 Dein FJ, Wilson A, Fischer D, Langenberg P. 1994. Avian leucocyte counting using the hemocytometer. J Zoo Wildlife Med: 432-37 Deviche P, Greiner EC, Manteca X. 2001. Seasonal and age-related changes in blood parasite prevalence in Dark-eyed Juncos (Junco hyemalis, Aves, Passeriformes). Journal of Experimental Zoology 289: 456-66 El-Lethey H, Huber-Eicher B, Jungi TW. 2003. Exploration of stress-induced immunosuppression in chickens reveals both stress-resistant and stress-susceptible antigen responses. Vet Immunol Immunop 95: 91-101 El-Malky M, Maruyama H, Hirabayashi Y, Shimada S, Yoshida A, et al. 2003. Intraepithelial infiltration of eosinophils and their contribution to the elimination of adult intestinal nematode, Strongyloides venezuelensis in mice. Parasitology International 52: 71-79 EL-Malky MA, Maruyama H, Al-Harthi SA, El-Beshbishi SN, Ohta N. 2013. The role of B-cells in immunity against adult Strongyloides venezuelensis. Parasites & Vectors 6 Falcone FH. 2004. Basophils and immunity to parasites: an update. Revue Francaise D Allergologie Et D Immunologie Clinique 44: 14-22 Fast MD, Ross NW, Mustafa A, Sims DE, Johnson SC, et al. 2002. Susceptibility of rainbow trout Oncorhynchus mykiss, Atlantic salmon Salmo salar and coho salmon Oncorhynchus kisutch to experimental infection with sea lice Lepeophtheirus salmonis. Dis Aquat Organ 52: 57-68

Fleming MW. 1997. Cortisol as an indicator of severity of parasitic infections of Haemonchus contortus in lambs (Ovis aries). Comparative Biochemistry and Physiology B-Biochemistry & Molecular Biology 116: 41-44 Fujino Y, Nakamura Y, Matsumoto H, Fukushima K, Takahashi M, et al. 2013. Development and Evaluation of a Novel In-Clinic Automated Hematology Analyzer, ProCyte Dx, for Canine Erythrocyte Indices, Leukogram, Platelet Counts and Reticulocyte Counts. Journal of Veterinary Medical Science 75: 1519-24 Gaherwal S, Solanki S, Prakash MM, Wast N. 2012. Aspicularis tetraptera Induced Hematological Parameters in Infected and Vaccinated Mice. Iran J Parasitol 7: 61-66 Galioto AM, Hess JA, Nolan TJ, Schad GA, Lee JJ, Abraham D. 2006. Role of eosinophils and neutrophils in innate and adaptive protective immunity to larval Strongyloides stercoralis in mice. Infection and Immunity 74: 5730-38 Gallo P, Goncalves R, Mosser DM. 2010. The influence of IgG density and macrophage Fc (gamma) receptor cross-linking on phagocytosis and IL-10 production. Immunology Letters 133: 70-77 Garcia JS, Pinheiro J, Hooper CS, Simoes RO, Ferraz JS, Maldonado A. 2012. Haematological alterations in Rattus norvegicus (Wistar) experimentally infected with Echinostoma paraensei (Trematoda: Echinostomatidae). Exp Parasitol 131: 300-03 Garvin MC, Greiner EC. 2003. Epizootiology of Haemoproteus danilewskyi (Haemosporina : Haemoproteidae) in blue jays (Cyanocitta cristata) in Southcentral Florida. Journal of Wildlife Diseases 39: 1-9 Gaunt SD, Beall MJ, Stillman BA, Lorentzen L, Diniz PPVP, et al. 2010. Experimental infection and co-infection of dogs with Anaplasma platys and Ehrlichia canis: hematologic, serologic and molecular findings. Parasites & Vectors 3 Gebreselassie NG, Moorhead AR, Fabre V, Gagliardo LF, Lee NA, et al. 2012. Eosinophils Preserve Parasitic Nematode Larvae by Regulating Local Immunity. Journal of Immunology 188: 417-25 Glew EJ, Carr BV, Brackenbury LS, Hope JC, Charleston B, Howard CJ. 2003. Differential effects of bovine viral diarrhoea virus on monocytes and dendritic cells. Journal of General Virology 84: 1771-80 Glomski CA, Tamburlin J, Hard R, Chainani M. 1997. The phylogenetic odyssey of the erythrocyte .4. The amphibians. Histology and Histopathology 12: 147-70

Glomski CA, Tamburlin J, Chainani M. 1992. THE PHYLOGENETIC ODYSSEY OF THE ERYTHROCYTE .3. FISH, THE LOWER VERTEBRATE EXPERIENCE. Histology and Histopathology 7: 501-28 Grayfer L, Hodgkinson JW, Belosevic M. 2014. Antimicrobial responses of teleost phagocytes and innate immune evasion strategies of intracellular bacteria. Developmental and Comparative Immunology 43: 223-42 Greenberg JH, Kerbs S. 1980. Cutaneous Basophilic Hypersensitivity Response to Fungal Antigens in Guinea-Pigs. J Invest Dermatol 74: 26-28 Gupta RP, Verma PC, Chaturvedi GC. 1999. Experimental salmonellosis in guinea-pigs: Haematological and biochemical studies. Veterinary Research Communications 23: 415-24 Haenen OLM, Lehmann J, Engelsma MY, Sturenberg FJ, Roozenburg I, et al. 2010. The health status of European silver eels, Anguilla anguilla, in the Dutch River Rhine Watershed and Lake IJsselmeer. Aquaculture 309: 15-24 Harmon BG. 1998. Avian heterophils in inflammation and disease resistance. Poultry Science 77: 972-77 Harrington LA, Gelling M, Simpson V, Harrington A, Macdonald DW. 2012. Notes on the health status of free-living, non-native American mink, Neovison vison, in southern England. European Journal of Wildlife Research 58: 875-80 Hartman FA, Lessler MA. 1964. ERYTHROCYTE MEASUREMENTS IN FISHES, AMPHIBIA, AND REPTILES. Biological Bulletin 126: 83-88 Hauptmanova K, Barus V, Literak I, Benedikt V. 2004. Haemoproteids and microfilariae in hawfinches in the Czech Republic. Helminthologia 41: 125-33 He HQ, Genovese KJ, Kogut MH. 2011. Modulation of chicken macrophage effector function by T(H)1/T(H)2 cytokines. Cytokine 53: 363-69 Hoglund J, Andersson J, Hardig J. 1992. HEMATOLOGICAL RESPONSES IN THE EUROPEAN EEL,

ANGUILLA-ANGUILLA

L,

TO

SUBLETHAL

INFESTATION

BY

ANGUILLICOLA-CRASSUS IN A THERMAL EFFLUENT OF THE SWEDISH BALTIC. J Fish Dis 15: 507-14 Huntington ND, Vosshenrich CAJ, Di Santo JP. 2007. Developmental pathways that generate natural-killer-cell diversity in mice and humans. Nature Reviews Immunology 7: 703-14 Chambers MA. 2013. Review of the Diagnosis of Tuberculosis in Non-Bovid Wildlife Species Using Immunological Methods - An Update of Published Work Since 2009. Transboundary

and Emerging Diseases 60: 14-27 Chamond N, Cosson A, Blom-Potar MC, Jouvion G, D'Archivio S, et al. 2010. Trypanosoma vivax Infections: Pushing Ahead with Mouse Models for the Study of Nagana. I. Parasitological, Hematological and Pathological Parameters. Plos Neglect Trop D 4 Chen SC, Thompson KD, Adams A, Richards RH. 2001. The production of a lymphokine (macrophage activating factor) by rainbow trout, Oncorhynchus mykiss (Walbaum), leucocytes stimulated with the extracellular products of Mycobacterium sp. J Fish Dis 24: 217-23 Cheong C, Matos I, Choi J-H, Dandamudi DB, Shrestha E, et al. 2010. Microbial Stimulation Fully Differentiates Monocytes to DC-SIGN/CD209(+) Dendritic Cells for Immune T Cell Areas. Cell 143: 416-29 Ipek DNS, Saki CE, Cay M. 2012. The investigation of lipid peroxidation, anti-oxidant levels and some hematological parameters in sheep naturally infested with Wohlfahrtia magnifica larvae. Vet Parasitol 187: 112-18 Johnstone CP, Lill A, Reina RD. 2012. Does habitat fragmentation cause stress in the agile antechinus? A haematological approach. Journal of Comparative Physiology B-Biochemical Systemic and Environmental Physiology 182: 139-55 Ka RV. 2008. Trunk pyoderma in a male Ceylon elephant (Elephas maximus maximus). Acta Veterinaria Brno 77: 127-31 Kaminski P, Jerzak L, Sparks TH, Johnston A, Bochenski M, et al. 2014. Sex and other sources of variation in the haematological parameters of White Stork Ciconia ciconia chicks. J Ornithol 155: 307-14 Kolaczkowska E, Kubes P. 2013. Neutrophil recruitment and function in health and inflammation. Nature Reviews Immunology 13: 159-75 Kopp R, Bauer I, Ramalingam A, Egg M, Schwerte T. 2014. Prolonged Hypoxia Increases Survival Even in Zebrafish (Danio rerio) Showing Cardiac Arrhythmia. Plos One 9 Koury MJ, Koury ST, Kopsombut P, Bondurant MC. 2005. In vitro maturation of nascent reticulocytes to erythrocytes. Blood 105: 2168-74 Krams I, Suraka V, Rattiste K, Abolins-Abols M, Krama T, et al. 2012. Comparative analysis reveals a possible immunity-related absence of blood parasites in Common Gulls (Larus canus) and Black-headed Gulls (Chroicocephalus ridibundus). J Ornithol 153: 1245-52 Lantz CS, Boesiger J, Song CH, Mach N, Kobayashi T, et al. 1998. Role for interleukin-3 in mast-

cell and basophil development and in immunity to parasites. Nature 392: 90-93 Lauritzen B, Lykkesfeldt J, Friis C. 2005. Evaluation of a single dose versus a divided dose regimen of amoxycillin in treatment of Actinobacillus pleuropneumoniae infection in pigs. Research in Veterinary Science 79: 61-67 Lee SR, Pharr GT, Boyd BL, Pinchuk LM. 2008. Bovine viral diarrhea viruses modulate toll-like receptors, cytokines and co-stimulatory molecules genes expression in bovine peripheral blood monocytes. Comparative Immunology Microbiology and Infectious Diseases 31: 40318 Littel-van den Hurk SV. 2007. Cell-mediated immune responses induced by BHV-1: rational vaccine design. Expert Review of Vaccines 6: 369-80 Lobato DNC, Braga EM, Belo ND, Antonini Y. 2011. Hematological and parasitological health conditions of the Pale-breasted Thrush (Turdus leucomelas) (Passeriformes: Turdidae) in southeastern Brazil. Zoologia 28: 771-76 Lopez-Olvera JR, Hofle U, Vicente J, Fernandez-de-Mera I, Gortazar C. 2006. Effects of parasitic helminths and ivermectin treatment on clinical parameters in the European wild boar (Sus scrofa). Parasitology Research 98: 582-87 Louvandini H, Veloso CFM, Paludo GR, Dell'Porto A, Gennari SM, McManus CM. 2006. Influence of protein supplementation on the resistance and resilience on young hair sheep naturally infected with gastrointestinal nematodes during rainy and dry seasons. Vet Parasitol 137: 103-11 Lucas A, Jamroz C. 1961. Atlas of avian hematology. United States Department of Agriculture. Agriculture Monograph 25 Makepeace BL, Martin C, Turner JD, Specht S. 2012. Granulocytes in Helminth Infection - Who is Calling the Shots? Current Medicinal Chemistry 19: 1567-86 Maruyama H, Yabu Y, Yoshida A, Nawa Y, Ohta N. 2000. A role of mast cell glycosaminoglycans for the immunological expulsion of intestinal nematode, Strongyloides venezuelensis. Journal of Immunology 164: 3749-54 Marzal A, de Lope F, Navarro C, Moller AP. 2005. Malarial parasites decrease reproductive success: an experimental study in a passerine bird. Oecologia 142: 541-45 Mathy NL, Mathy JPD, Lee RP, Walker J, Lofthouse S, Meeusen ENT. 2002. Pathological and immunological changes after challenge infection with Pasteurella multocida in naive and immunized calves. Vet Immunol Immunop 85: 179-88

Medzhitov R, Janeway CA. 1997. Innate immunity: The virtues of a nonclonal system of recognition. Cell 91: 295-98 Merino S, Moreno J, Sanz JJ, Arriero E. 2000. Are avian blood parasites pathogenic in the wild? A medication experiment in blue tits (Parus caeruleus). Proceedings of the Royal Society BBiological Sciences 267: 2507-10 Mir RA, Chishti MZ, Zarger MA, Tak H, Ganie SA. 2007. Clinicopathological Changes in Sheep Experimentally Infected with Haemonchus contortus. World Journal of Agricultural Sciences 3: 562-66 Molina V, Risalde MA, Sanchez-Cordon PJ, Pedrera M, Romero-Palomo F, et al. 2013. Effect of infection with BHV-1 on peripheral blood leukocytes and lymphocyte subpopulations in calves with subclinical BVD. Research in Veterinary Science 95: 115-22 Montero FE, Crespo S, Padros F, De la Gandara F, Garcia A, Raga JA. 2004. Effects of the gill parasite Zeuxapta seriolae (Monogenea : Heteraxinidae) on the amberjack Seriola dumerili Risso (Teleostei : Carangidae). Aquaculture 232: 153-63 Morton ML. 1994. Hematocrits in Montane Sparrows in Relation to Reproductive Schedule. Condor 96: 119-26 Mosser DM, Edwards JP. 2008. Exploring the full spectrum of macrophage activation. Nature Reviews Immunology 8: 958-69 Motsch P, Gonzalez JP, Verrier D. 2012. Clinical Biochemistry and Hematology of the Elusive SunTailed Monkey (Cercopithecus solatus) in Gabon: Inaugural Data From the Only Semifree Ranging Colony in the World. American Journal of Primatology 74: 236-46 Moyes CD, Sharma ML, Lyons C, Leary SC, Leon M, et al. 2002. Origins and consequences of mitochondrial decline in nucleated erythrocytes. Biochimica Et Biophysica Acta-Molecular Cell Research 1591: 11-20 Munoz A, Riber C, Trigo P, Castejon F. 2012. Age- and gender-related variations in hematology, clinical biochemistry, and hormones in Spanish fillies and colts. Research in Veterinary Science 93: 943-49 Murray PJ, Wynn TA. 2011. Protective and pathogenic functions of macrophage subsets. Nature Reviews Immunology 11: 723-37 Newman SH, Piatt JF, White J. 1997. Hematological and plasma biochemical reference ranges of Alaskan seabirds: Their ecological significance and clinical importance. Colonial Waterbirds 20: 492-504

Ohaeri CC, Eluwa MC. 2011. Abnormal biochemical and haematological indices in trypanosomiasis as a threat to herd production. Vet Parasitol 177: 199-202 Olsson M, Wilson M, Uller T, Mott B, Isaksson C, et al. 2008. Free radicals run in lizard families. Biology Letters 4: 186-88 Omer OH, El-Malik KH, Mahmoud OM, Haroun EM, Hawas A, et al. 2002. Haematological profiles in pure bred cattle naturally infected with Theileria annulata in Saudi Arabia. Vet Parasitol 107: 161-68 Ortiz-Catedral L, Prada D, Gleeson D, Brunton DH. 2011. Avian malaria in a remnant population of red-fronted parakeets on Little Barrier Island, New Zealand. New Zealand Journal of Zoology 38: 261-68 Osman SA, Al-Gaabary MH. 2007. Clinical, haematological and therapeutic studies on tropical theileriosis in water buffaloes (Bubalus bubalis) in Egypt. Vet Parasitol 146: 337-40 Otranto D, Dantas-Torres F, Tarallo VD, Ramos RAD, Stanneck D, et al. 2012. Apparent tick paralysis by Rhipicephalus sanguineus (Acari: Ixodidae) in dogs. Vet Parasitol 188: 325-29 Ots I, Horak P. 1998. Health impact of blood parasites in breeding great tits. Oecologia 116: 441-48 Ottiger HP. 2010. Development, standardization and assessment of PCR systems for purity testing of avian viral vaccines. Biologicals 38: 381-88 Palstra AP, Heppener DFM, van Ginneken VJT, Szekely C, van den Thillart GEEJM. 2007. Swimming performance of silver eels is severely impaired by the swim-bladder parasite Anguillicola crassus. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology 352: 244-56 Parvathi J, Karemungikar A. 2011. Leucocyte Variation, an Insight of Host Defenses During Hymenolepiasis and Restoration with Praziquantel. Indian J Pharm Sci 73: 76-U151 Pedrera M, Sanchez-Cordon PJ, Romero-Trevejo JL, Risalde MA, Greiser-Wilke I, et al. 2009. Morphological changes and virus distribution in the ileum of colostrum-deprived calves inoculated with non-cytopathic bovine viral diarrhoea virus genotype-1. J Comp Pathol 141: 52-62 Petit PX, Oconnor JE, Grunwald D, Brown SC. 1990. ANALYSIS OF THE MEMBRANEPOTENTIAL OF RAT-LIVER AND MOUSE-LIVER MITOCHONDRIA BY FLOWCYTOMETRY AND POSSIBLE APPLICATIONS. European Journal of Biochemistry 194: 389-97 Platt-Samoraj A, Szweda W, Janowski T, Skipor J, Procajlo Z. 2009. INFLUENCE OF EXPERIMENTAL YERSINIA ENTEROCOLITICA INFECTION ON THE COURSE OF

PREGNANCY IN SOWS - PRELIMINARY STUDIES. CLINICAL AND LABORATORY EXAMINATIONS. B Vet I Pulawy 53: 337-44 Polo F, Celdran J, Peinado V, Viscor G, Palomeque J. 1992. Hematological values for four species of birds of prey. Condor: 1007-13 Preston PM, Hall FR, Glass EJ, Campbell JDM, Darghouth MA, et al. 1999. Innate and adaptive immune responses co-operate to protect cattle against Theileria annulata. Parasitology Today 15: 268-74 Pujol C, Bliska JB. 2003. The ability to replicate in macrophages is conserved between Yersinia pestis and Yersinia pseudotuberculosis. Infection and Immunity 71: 5892-99 Pusterla N, Watson JL, Affolter VK, Magdesian KG, Wilson WD, Carlson GP. 2003. Purpura haemorrhagica in 53 horses. Veterinary Record 153: 118-21 Qamar MF, Maqbool A. 2012. Biochemical Studies and Serodiagnosis of Haemonchosis in Sheep and Goats. J Anim Plant Sci 22: 32-38 Quevillon EL, Diaz F, Jaramillo L, Lascurain R, Gutierrez-Pabello JA, et al. 2013. Comparison of immune peripheral blood cells in tuberculin reactor cattle that are seropositive or seronegative for Mycobacterium bovis antigens. Vet Immunol Immunop 154: 194-201 Raberg L, Sim D, Read AF. 2007. Disentangling genetic variation for resistance and tolerance to infectious diseases in animals. Science 318: 812-14 Rajewsky K. 1996. Clonal selection and learning in the antibody system. Nature 381: 751-58 Ricklefs RE, Sheldon KS. 2007. MALARIA PREVALENCE AND WHITE-BLOOD-CELL RESPONSE TO INFECTION IN A TROPICAL AND IN A TEMPERATE THRUSH. Prevalencia de Malaria y Respuesta de Glóbulos Blancos a la Infección en un Zorzal de la Zona Tropical y Uno de la Zona Templada. 124: 1254-66 Richerson HB, Dvorak HF, Leskowitz S. 1970. Cutaneous basophil hypersensitivity I. A new look at the Jones-Mote reaction, general characteristics. The Journal of experimental medicine 132: 546-57 Roletto J. 1993. Hematology and Serum Chemistry Values for Clinically Healthy and Sick Pinnipeds. J Zoo Wildlife Med 24: 145-57 Romani L. 2004. Immunity to fungal infections. Nature Reviews Immunology 4: 11-24 Rothenberg ME, Hogan SP. 2006. The eosinophil In Annual Review of Immunology, pp. 147-74 Rotman HL, Yutanawiboonchai W, Brigandi RA, Leon O, Gleich GJ, et al. 1996. Strongyloides

stercoralis: Eosinophil-dependent immune-mediated killing of third stage larvae in BALB/cByJ mice. Exp Parasitol 82: 267-78 Rowe A, McMaster K, Emery D, Sangster N. 2008. Haemonchus contortus infection in sheep: Parasite fecundity correlates with worm size and host lymphocyte counts. Vet Parasitol 153: 285-93 Ruffell B, Affara NI, Coussens LM. 2012. Differential macrophage programming in the tumor microenvironment. Trends in Immunology 33: 119-26 Sandhu GS, Grewal AS, Singh A, Kondal JK, Singh J, Brar RS. 1998. Haematological and biochemical studies on experimental Theileria annulata infection in crossbred calves. Veterinary Research Communications 22: 347-54 Santana PA, Alvarez CA, Guzman F, Mercado L. 2013. Development of a sandwich ELISA for quantifying hepcidin in Rainbow trout. Fish Shellfish Immun 35: 748-55 Seliger C, Schaerer B, Kohn M, Pendl H, Weigend S, et al. 2012. A rapid high-precision flow cytometry based technique for total white blood cell counting in chickens. Vet Immunol Immunop 145: 86-99 Sheerer KN, Couto CG, Marin LM, Zaldivar-Lopez S, Iazbik MC, et al. 2013. Haematological and biochemical values in North American Scottish deerhounds. J Small Anim Pract 54: 354-60 Shi C, Pamer EG. 2011. Monocyte recruitment during infection and inflammation. Nature Reviews Immunology 11: 762-74 Scheelings TF, Jessop TS. 2011. Influence of capture method, habitat quality and individual traits on blood parameters of free-ranging lace monitors (Varanus varius). Aust Vet J 89: 360-65 Schinnerl M, Aydinonat D, Schwarzenberger F, Voigt CC. 2011. HEMATOLOGICAL SURVEY OF COMMON NEOTROPICAL BAT SPECIES FROM COSTA RICA. J Zoo Wildlife Med 42: 382-91 Silva RAMS, Ramirez L, Souza SS, Ortiz AG, Pereira SR, Davila AMR. 1999. Hematology of natural bovine trypanosomosis in the Brazilian Pantanal and Bolivian wetlands. Vet Parasitol 85: 87-93 Simon A, Thomas DW, Speakman JR, Blondel J, Perrer P, Lambrechts MM. 2005. Impact of ectoparasitic blowfly larvae (Protocalliphora spp.) on the behavior and energetics of nestling Blue Tits. Journal of Field Ornithology 76: 402-10 Singh A, Singh J, Grewal AS, Brar RS. 2001. Studies on some blood parameters of crossbred calves with experimental Theileria annulata infections. Veterinary Research Communications 25:

289-300 Sokolowski MS, Allam BA, Dunton KJ, Clark MA, Kurtz EB, Fast MD. 2012. Immunophysiology of Atlantic sturgeon, Acipenser oxyrinchus oxyrinchus (Mitchill), and the relationship to parasitic copepod, Dichelesthium oblongum (Abilgaard) infection. J Fish Dis 35: 649-60 Sorci G. 1995. REPEATED MEASUREMENTS OF BLOOD PARASITE LEVELS REVEAL LIMITED ABILITY FOR HOST RECOVERY IN THE COMMON LIZARD (LACERTAVIVIPARA). Journal of Parasitology 81: 825-27 Souza DRD, Melo ALT, Muraro LS, Aguiar DM, Albuquerque D. 2013. Levamisole enhances global and differential leukocyte numbers in peripheral blood of dogs with ehrlichiosis. Turkish Journal of Veterinary & Animal Sciences 37: 647-52 Srikumaran S, Kelling CL, Ambagala A. 2007. Immune evasion by pathogens of bovine respiratory disease complex. Anim Health Res Rev 8: 215-29 Stier A, Bize P, Schull Q, Zoll J, Singh F, et al. 2013. Avian erythrocytes have functional mitochondria, opening novel perspectives for birds as animal models in the study of ageing. Frontiers in Zoology 10 STUDIES PIS-P. 2009. INFLUENCE OF EXPERIMENTAL YERSINIA ENTEROCOLITICA INFECTION ON THE COURSE OF PREGNANCY IN SOWS-PRELIMINARY STUDIES. CLINICAL AND LABORATORY EXAMINATIONS. Bull Vet Inst Pulawy 53: 337-44 Svensson M, Bell L, Little MC, DeSchoolmeester M, Locksley RM, Else KJ. 2011. Accumulation of eosinophils in intestine-draining mesenteric lymph nodes occurs after Trichuris muris infection. Parasite Immunol 33: 1-11 Swartz JM, Dyer KD, Cheever AW, Ramalingam T, Pesnicak L, et al. 2006. Schistosoma mansoni infection in eosinophil lineage-ablated mice. Blood 108: 2420-7 Talpur AD, Ikhwanuddin M. 2013. Azadirachta indica (neem) leaf dietary effects on the immunity response and disease resistance of Asian seabass, Lates calcarifer challenged with Vibrio harveyi. Fish Shellfish Immun 34: 254-64 Tendencia EA. 2002. Vibrio harveyi isolated from cage-cultured seabass Lates calcarifer Bloch in the Philippines. Aquac Res 33: 455-58 Tomas G, Merino S, Martinez J, Moreno J, Sanz JJ. 2005. Stress protein levels and blood parasite infection in blue tits (Parus caeruleus): a medication field experiment. Annales Zoologici Fennici 42: 45-56

Vinkler M, Schnitzer J, Munclinger P, Votypka J, Albrecht T. 2010. Haematological health assessment in a passerine with extremely high proportion of basophils in peripheral blood. J Ornithol 151: 841-49 Voyles J, Berger L, Young S, Speare R, Webb R, et al. 2007. Electrolyte depletion and osmotic imbalance in amphibians with chytridiomycosis. Dis Aquat Organ 77: 113-18 Waner T, Harrus S, Bark H, Bogin E, Avidar Y, Keysary A. 1997. Characterization of the subclinical phase of canine ehrlichiosis in experimentally infected beagle dogs. Vet Parasitol 69: 307-17 Wells LL, Lowry VK, DeLoach JR, Kogut MH. 1998. Age-dependent phagocytosis and bactericidal activities of the chicken heterophil. Developmental and Comparative Immunology 22: 10309 Whelchel DD, Chaffin MK. 2009. Sequelae and complications of Streptococcus equi subspecies equi infections in the horse. Equine Veterinary Education 21: 135-41 Whitworth TL, Bennett GF. 1992. Pathogenicity of Larval Protocalliphora (Diptera, Calliphoridae) Parasitizing Nestling Birds. Canadian Journal of Zoology-Revue Canadienne De Zoologie 70: 2184-91 Work TM. 1996. Weights, hematology, and serum chemistry of seven species of free-ranging tropical pelagic seabirds. Journal of Wildlife Diseases 32: 643-57 Yang D, Chen Q, Su SB, Zhang P, Kurosaka K, et al. 2008. Eosinophil-derived neurotoxin acts as an alarmin to activate the TLR2-MyD88 signal pathway in dendritic cells and enhances Th2 immune responses. Journal of Experimental Medicine 205: 79-90 Yim JY, Yang SJ, Yim JM, Song MY, Rho HW, et al. 2013. Lymphocyte-mediated macrophage apoptosis during IL-12 stimulation. Cytokine 64: 62-70 Yu JH, Han JJ, Park SW. 2010. Haematological and biochemical alterations in Korean catfish, Silurus asotus, experimentally infected with Edwardsiella tarda. Aquac Res 41: 295-302 Zhelev ZM, Popgeorgiev GS, Angelov MV. 2013. Investigating the Changes in the Morphological Content of the Blood of Pelophylax ridibundus (Amphibia: Ranidae) as a Result of Anthropogenic Pollution and Its Use as an Environmental Bioindicator. Acta Zoologica Bulgarica 65: 187-96 Zhu Y, Cao X, Tao G, Xie W, Hu Z, Xu D. 2013. The lymph index: a potential hematological parameter for viral infection. Int J Infect Dis 17: e490-3 Zivkovic Z, Nijhof AM, De la Fuente J, Kocan KM, Jongejan F. 2007. Experimental transmission of Anaplasma marginale by male Dermacentor reticulatus. BMC veterinary research 3: 32