UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA
Studijní program: Biologie Studijní obor: Biologie
Markéta Petrů
MANIPULACE INTRACELULÁRNÍCH PATOGENŮ S BUNĚČNÝM TRANSPORTEM HOSTITELSKÉ BUŇKY HOW INTRACELLULAR PATHOGENS MANIPULATE CELLULAR TRAFFICKING
BAKALÁŘSKÁ PRÁCE
Školitel: Mgr. Pavel Doležal, Ph.D. PRAHA 2011
Děkuji svému školiteli Mgr. Pavlu Doležalovi, Ph.D. za pomoc a rady při psaní této bakalářské práce.
Prohlašuji, že jsem závěrečnou práci zpracovala samostatně a že jsem uvedla všechny použité informační zdroje a literaturu. Tato práce ani její podstatná část nebyla předložena k získání jiného nebo stejného akademického titulu.
V Praze 5. 5. 2011, Markéta Petrů
2
Abstrakt
Mnoho intracelulárních jednobuněčných organismů patří mezi medicínsky významné patogeny člověka. Předmětem této práce budou vybraní parazité - Chlamydia spp., Legionella pneumophila, Trypanosoma cruzi a Toxoplasma gondii - a jejich interakce s vezikulárním transportem hostitelské buňky. Jsou zde popsány základní dráhy vezikulárního transportu a jeho důležité molekuly. Dále pak efektorové proteiny patogenů, které s popsanými molekulami interagují. Zvláštní kapitola je věnována fenoménu mimetování SNARE proteinů bakteriemi. Závěrem je uvedena kapitola o SNARE homologu L. pneumophila, který byl nalezen v naší laboratoři a který je předmětem mojí výzkumné práce.
Klíčová slova
vezikulární transport, intracelulární parazitismus, Chlamydia spp., Legionella pneumophila, Trypanosoma cruzi, Toxoplasma gondii, SNARE, LpSNARE
3
Abstract
Many intracellular single-celled organisms belong to medically important human pathogens. The selected parasites are subject of this thesis – Chlamydia spp., Legionella pneumophila, Trypanosoma cruzi and Toxoplasma gondii – as well as their interactions with the vesicular transport of the host cell. Basic pathways of vesicular transport are delineated and important participating molecules described. Furthermore, the effector proteins of pathogens that interact with these molecules are included. The special chapter is devoted to phenomenon of mimetics of SNARE proteins by bacteria. The manuscript concludes with a chapter on LpSNARE of Legionella pneumophila, which was found in our laboratory and which is a topic of my experimental work herein.
Key words
vesicular trafficking, intracellular parazitism, Chlamydia spp., Legionella pneumophila, Trypanosoma cruzi, Toxoplasma gondii, SNARE, LpSNARE
4
Obsah 1. Úvod .................................................................................................................................................... 6 2. Způsoby přežívání patogenů uvnitř hostitelské buňky........................................................................ 7 2.1. Přehled vybraných intracelulárních patogenů ............................................................................. 7 2.1.1. Bacteria.................................................................................................................................. 7 2.1.2. Eukaryota............................................................................................................................... 8 3. Vezikulární transport ......................................................................................................................... 11 3.1. Rab GTPázy ................................................................................................................................. 12 3.2. SNARE proteiny .......................................................................................................................... 14 4. Interakce vybraných intracelulárních patogenů s buněčným transportem ...................................... 17 4.1. Bacteria....................................................................................................................................... 17 4.1.1. Chlamydiae .......................................................................................................................... 17 4.1.2. Legionella pneumophila ...................................................................................................... 18 4.2.Eukaryota..................................................................................................................................... 22 4.2.1. Trypanosoma cruzi .............................................................................................................. 22 4.2.2. Toxoplasma gondii .............................................................................................................. 23 5. Miméze SNARE proteinů ................................................................................................................... 26 6. Legionella pneumophila SNARE ......................................................................................................... 28 7. Závěr .................................................................................................................................................. 30 8. Seznam často používaných zkratek ................................................................................................... 31 9. Seznam použité literatury ................................................................................................................. 32
5
1. Úvod
Mezi důležité děje, které v intracelulárních prostředích organismů probíhají, se bezpochyby řadí buněčný vezikulární transport. Jedná se o neustálou výměnu látek mezi vnitřním a vnějším prostředím organismu pomocí membránových váčků. Velmi zjednodušeně můžeme na jedné straně vidět sekretorickou dráhu, kde se látky vyrábí, upravují a doručují se do různých kompartmentů buňky včetně cytoplazmatické membrány a extracelulárního prostoru. Na druhé straně vidíme přijímání látek endocytickou dráhou z okolí a jejich postupnou degradaci a rozklad na prvočinitele. Mnoho jednobuněčných organismů, bakterií i eukaryot, řadících se mezi lékařsky i veterinárně významné parazity člověka a zvířat, umí tyto dráhy modifikovat v jejich prospěch. Po vstupu do buňky dovedou upravit endocytickou dráhu tak, že nejsou jako běžné látky či neškodné mikroorganismy přijímané z okolí, ničeni v kyselém prostředí lysozomu. Díky modifikacím sekretorické dráhy získávají látky vyrobené buňkou. Tyto schopnosti patogeni využívají k vlastnímu růstu a množení. Tato
bakalářská
práce
představí
vybrané
jednobuněčné
intracelulární
parazity a ukáže, jak tyto organismy mohou v buňce přežívat a jak kooperují s buněčným transportem, převážně s endocytickou a sekretorickou dráhou. Nastíní funkci efektorových molekul, které jsou patogeny produkovány a které mají podíl na vzniku snesitelného prostředí pro rozmnožování.
6
2. Způsoby přežívání patogenů uvnitř hostitelské buňky Intracelulární parazité mají řadu strategií, které jim umožňují přežití v hostitelské buňce. Mezi ty nejdůležitější patří volná lokalizace patogena v cytoplasmě buňky (např. Rickettsia prowazekii, Trachipleistophora hominis), indukce nového membránového kompartmentu (např. Plasmodium falciparum) a přestavba existujícího kompartmentu např. fagozomu, na organelu slučitelnou se životem patogena (např. Mycobacterium tuberculosis, Leishmania donovani).
2.1. Přehled vybraných intracelulárních patogenů 2.1.1. Bacteria 2.1.1.1. Chlamydiaceae (Planctobacteria)1
Chlamydie jsou gram-negativní bakterie s řadou unikátních vlastností. Buněčná stěna postrádá peptidoglykan, resistence k okolnímu prostředí vyplývá ze značného disulfidického zesíťování proteinů vnější membrány. Specifickou vlastností je i střídání dvou buněčných forem: extracelulární formy zvané elementární tělísko (elementary body; EB) a intracelulární formy zvané retikulární tělísko (reticulate body; RB). EB jsou malé (v průměru 0,3 µm), nejsou metabolicky aktivní a mají kondenzovaný chromozom. RB jsou větší (v průměru 1 µm) a reprezentují metabolicky aktivní stadium životního cyklu. Když se EB diferencuje na RB, disulfidické vazby mezi proteiny vnější membrány jsou štěpeny (Fields and Hackstadt, 2002). Chlamydie jsou intracelulární obligátní parazité eukaryotických buněk, zodpovědné za mnoho významných chorob zvířat i člověka. Druh Chlamydia trachomatis je složen alespoň z patnácti sérotypů, které jsou spojeny s lidskými nemocemi. Sérotypy A, B, Ba, C způsobují trachom, což je nejčastější příčina infekční slepoty. Sérotypy D - K jsou nejčastěji asociovány se sexuálně přenosnými chorobami a občas vyvolávají záněty spojivek. Závažnější, než slepota a pánevní zánětlivá onemocnění je imunopatologická odpověď. Sérotypy L1, L2, L3 jsou také sexuálně přenosné, ale na rozdíl od předchozích sérotypů, které jsou lokalizovány ve slizničním epitelu, tyto způsobují systematické infekce. Chlamydia pneumoniae způsobuje
1
Nový taxon ustanovený T. Cavalier-Smith v roce 2006.
7
pneumonii a možná je zodpovědná za aterosklerózu nebo jiné chronické nemoci. Chlamydia psittaci infikuje drůbež a hospodářská zvířata (Fields and Hackstadt, 2002). 2.1.1.2. Legionellaceae (Proteobacteria: Gammaproteobacteria)
Během 58. shromáždění amerických legionářů ve Filadelfii, v červenci roku 1976, 182 ze 4000 delegátů onemocnělo těžkým zápalem plic a 29 z nich zemřelo. Z plicní tkáně pacienta, který pneumonii podlehl, byl izolován původce nemoci a „na počest“ legionářů byl pojmenován Legionella pneumophila. Dnes se rodina Legionellaceae sestává z jediného rodu Legionella, který obsahuje 56 druhů náležících do 70 sérotypů. 19 druhů je spojeno s onemocněním člověka. Nejběžnější druh způsobující chorobu je ale Legionella pneumophila séroskupiny 1 (90% případů) (Gomez-Valero et al., 2009; Hubber and Roy, 2010). Legionela je fakultativní intracelulární parazit. Ve vodním prostředí aerobní gramnegativní bakterie infikují jednobuněčné hostitele jako např. améby a naeglerie (Horwitz and Silverstein, 1980; Newsome et al., 1985). Při nákaze hostitele alternuje legionela mezi dvěma stadii: nepohyblivou formou s tenkou buněčnou stěnou, která se replikuje, a pohyblivou infekční formou s tlustou buněčnou stěnou. Kromě Legionářské nemoci způsobuje legionela také tzv. horečku Pontiac (GomezValero et al., 2009). Obě onemocnění vznikají tím, že člověk vdechne hostitele nakaženého L. pneumophila – bakterie se v plicích uvolňuje a je endocytována monocyty (Horwitz and Silverstein, 1980) a alveolárními makrofágy. Uvnitř hostitelských buněk (včetně jednobuněčných hostitelů) se patogen úspěšně replikuje a při dokončení cyklu hostitelskou buňku lyzuje, což má za následek akutní poškození plic a pneumonii. Přenos z člověka na člověka nebyl pozorován (Hubber and Roy, 2010). Příznaky horečky Pontiac jsou teplota, bolesti hlavy, nevolnost a svalové křeče. Příznaky Legionářské nemoci jsou různé a pohybují se od nevolnosti, kašle, dušnosti, bolesti na hrudi, zimnice a bolestí hlavy až k průjmu. Nápadným rysem je i různá manifestace v centrálním nervovém systému: letargie, halucinace, hyperaktivní reflexy či neschopnost močit (Gomez-Valero et al., 2009). 2.1.2. Eukaryota 2.1.2.1. Trypanosoma cruzi (Excavata: Euglenozoa: Kinetoplastea)
Trypanosoma cruzi je původcem Chagasovy choroby, zoonózy hyperendemitní v oblasti Latinské Ameriky, kde lidé žijí v těsné blízkosti přenašeče, ploštic z čeledi Reduviidae 8
(Triatominae). Je to prvok s velmi komplikovaným životním cyklem. Ploštice nasaje krev obratlovce s krevní formou trypanosom tzv. trypomastigotů. Mnoho trypomastigotů je lyzováno v hmyzím trávicím ústrojí, přeživší se ale transformují do sferomastigotů nebo do epimastigotů. Epimastigoti migrují střevem, kde se intenzivně dělí a připojují se k perimikrovilární membráně, která je produkovaná buňkami zadní části středního střeva. Tato adheze je pravděpodobně důležitá pro transformaci neinfekčních epimastigotů na vysoce infekční metacyklické trypomastigoty, kteří jsou vylučováni společně s výkaly a dostávají se do těla obratlovce ránou po hmyzím sání. Uvnitř hostitelské buňky se dlouhý a štíhlý trypomastigot diferencuje na kulového amastigota s krátkým bičíkem (intracelulární sferomastigot) a ničí membránu parazitoformní vakuoly. Amastigoti se množí a před únikem z hostitelské buňky se opět diferencují v trypomastigoty (de Souza W. et al., 2010). Intracelulární amastigoti mohou v dormantním stádiu existovat v těle desítky let, schovaní ve svalech, bez výrazného ničení tkání. V lidském těle může napadnout tkáň vzniklou z embryonálního mesodermu, endodermu a neuroektodermu (Teixeira et al., 2006). Chagasova choroba se u 30% nakažených vyvíjí v klinicky zjevné onemocnění a 0, 56% z celkového počtu nakažených zemře. Klinické projevy se dají rozdělit do dvou fází, které rozděluje bezpříznaková fáze, jejíž kritéria jsou pozitivní specifický IgG protilátkový test nebo demonstrace parazita, absence symptomů a normální velikost srdce, jícnu, střeva. Akutní fáze se u imunokompetentních jedinců projevuje zatvrdlými kožními lézemi v místě vstupu parazita (u imunosuprimovaných osob postrádajících buněčně zprostředkovanou imunitní odpověď se takto neprojevuje) a v následném období však příznaky chybí a nemoc není pacientem vnímána. Smrt v akutní fázi se vztahuje k selhání srdce, meningitidě a encefalitidě. Srdeční chronická fáze napadá srdce, u nějž je nejvíce život ohrožující jeho selhání, arytmie a tromboembolismus. Pro chronickou fázi Chagasovy choroby je také typický mesoesophagus a megacolon projevující se obtížemi v polykání a zažívání. (Teixeira et al., 2006). 2.1.2.2. Toxoplasma gondii (Chromalveolata: Apicomplexa: Coccidia)
Toxoplasma gondii je všudypřítomný obligátní intracelulární patogen, který jako definitivní hostitel pro sexuální rozmnožování využívá kočkovité šelmy. Jeho mezihostitelem však může být jakýkoli teplokrevný živočich včetně člověka, přesněji jakákoli jeho jaderná buňka. 9
Během životního cyklu Toxoplasma prochází několika stadii. Oocysty se sporozoity uvnitř jsou odolná stadia obsažená ve fekáliích kočkovitých šelem. Intracelulární tachyzoiti představují akutní fázi infekce. Po čtvrtém až pátém cyklu dělení protrhnou hostitelskou buňku makrofága a lymfatickým a krevním řečištěm jsou roznášeny k dalším buňkám (Sonar S.S and Brahmbhatt M.N., 2010; Jones et al., 1972). Bradyzoiti jsou pomalu se množící stadia, která se diferencují z tachyzoitů v reakci na imunitní systém hostitele. Tkáňové cysty jsou opouzdření dormantní bradyzoiti. Nacházejí se v dlouho žijících buňkách, tedy často ve svalech a centrální nervové soustavě (Sonar S.S and Brahmbhatt M.N., 2010). Toxoplasma pro vytvoření replikačně kompetentní parazitoformní vakuoly sekretuje proteiny z rhoptrií a denzních granulí (Sinai and Joiner, 1997). Povrch parazitoformní vakuoly neobsahuje proteiny odvozené od hostitelské buňky, naopak je modifikován produkty sekrece parazita (Beckers et al., 1994). Toxoplasmóza je nejrozšířenější zoonóza, kterou je postižena až 1/3 populace. U imunokompetentních osob se choroba nijak nemanifestuje. Patologicky se projevuje u imunosuprimovaných osob (AIDS, lidé užívající imunosupresiva po orgánových transplantacích) a u žen, které se nakazí v době těhotenství a nákaza projde přes placentu (aborty či zraková a neurologická postižení plodů) (Sonar S.S and Brahmbhatt M.N., 2010).
10
3. Vezikulární transport Transport v buňce můžeme pro naši potřebu zjednodušeně rozdělit na exocytickou (sekretorickou) a endocytickou dráhu. Sekretorický membránový systém
dovoluje buňce regulovat
export nově
nasyntetizovaných proteinů, uhlovodíků a lipidů na buněčný povrch. Na počátku stojí endoplazmatické retikulum (ER), kde je náklad syntetizován a shromážděn. Bývá to největší buněčná organela a skládá se z rozsáhlé sítě membránových tubulů a cisteren. ER se diferencuje do dvou částí – na hrubé ER s přisedlými ribozomy a na hladké ER, kde preferenčně probíhá syntéza lipidů, detoxikace a regulace vápníkem. Sekretovaný náklad je pečlivě tříděn do váčků, které pučí z vysoce organizovaných domén, tzv. exit sites. Tato místa přiléhají k přechodnému kompartmentu mezi ER a Golgiho aparátem (ERGIC). Uvolněné váčky jsou směrovány k tzv. stabilnímu pre-Golgi kompartmentu a následně k vlastnímu Golgiho aparátu (GA). Proteiny rezidentní v ER, které se dostanou do GA, jsou směřovány zpět retrográdním transportem na základě KDEL signálu. GA zaujímá v sekretorické dráze centrální pozici. Je to místo, kde je materiál modifikován a tříděn. Intermediáty jsou přijímány cis-stranou GA a postupují ke straně trans, kde jsou připraveny pro transport na cytoplazmatickou membránu (Lippincott-Schwartz et al., 2000). Pro posun materiálu v rámci GA existují dvě hypotézy. (i) GA je velmi dynamický a trans-cisterny jsou pouze zestárlé cis-cisterny. Retrográdní vezikulární transport pak vrací proteiny do mladších částí organely. (ii) GA je relativně stabilní a materiál se mezi jednotlivými cisternami pohybuje za pomoci váčků. Na pučení váčků se ve většině případů podílejí proteiny rodiny ARF. Jsou to malé GTPázy, které se stávají aktivní po navázání GTP specifickým GEF (guanin nucleotide exchange factor). Rozpustné ARF proteiny po aktivaci asociují s membránou, kde váží další proteiny, a indukují tak vytvoření vlastního váčku. Po hydrolýze GTP na GDP specifickým GAP (GTPase activating protein) se stávají inaktivní. GEF obsahují konzervovanou doménu, tzv. Sec7 doménu (viz níže) (Spang, 2008). Buňky přijímají extracelulární materiál procesem, který je obecně nazýván endocytóza. Získaný materiál pak obvykle končí v lysozomu, jehož kyselé prostředí je podmínkou pro správnou funkci mnoha hydrolytických enzymů (nukleázy, fosfatázy, lipázy, 11
proteázy). Nízkomolekulární produkty hydroláz jsou uvolněny do cytoplazmy a jsou dále využívány (Ostrowicz et al., 2008). Dalšími typickými lysozomálními proteiny jsou transmembránové, do lumen obrácené LAMP-1 a LAMP-2. Jsou to hlavní sialoglykoproteiny obsahující polylactosialoglykany v buňce (Carlsson et al., 1988) a jsou používány jako markery lysozomů. Do pěti minut po endocytóze je substrát lokalizován v časných endozomech, tubulárních cisternách. Dále pokračuje do pozdních endozomů, sférických váčků, které již vykazují přítomnost malého množství LAMP-1 a LAMP-2. Cesta je zakončena sférickou denzní strukturou – lysozomem (Rabinowitz et al., 1992). Lysozomy ovšem nejsou pouze konečná stanice pro makromolekuly, jak se myslelo dříve. Buňky také využívají lysozomy pro opravu poškozené cytoplazmatické membrány pomocí Ca2+-regulované exocytózy. Lysozomy fúzují s membránou v místě poškození a tak ji zacelují (Reddy et al., 2001). Po elektroporaci membrány se na cytoplazmatické membráně objevují epitopy LAMP-1 exponované do exterioru. Pro fúzi s cytoplazmatickou membránou jsou nezbytné SNARE proteiny lysozomu – TI-VAMP/VAMP7 a cytoplazmatické membrány – SNAP 23 a syntaxin 4. Funkční SNARE komlex se tvoří na základě signálu synaptotagminu VII, Ca2+ senzoru pro exocytózu (Rao et al., 2004). Na vezikulární transport může být nahlíženo jako na proces o čtyřech krocích: (i) formace váčku, (ii) pohyb váčku k cílovému kompartmentu, (iii) přisednutí váčku na akceptorovou membránu a (iv) fúze lipidových dvojvrstev. První specifická událost je zprostředkovaná monomerními malými GTPázami z rodiny Rab. Rab proteiny a jejich efektory koordinují průběh transportu – vznik váčků, pohyb váčků a organel, uvazování váčků k cílovým membránám. Další specifický krok je zprostředkováván tzv. SNARE [soluble NSF (N-ethylmaleimidesensitive fusion protein) attachment protein receptor] proteiny, které se kromě vlastní fúze podílejí na určení specificity zúčastěných membrán. Nezbytná je i vzájemná koordinace SNARE proteinů s Rab GTPázami (Zerial and McBride, 2001). 3.1. Rab GTPázy Počet Rab GTPáz se výrazně liší u jednotlivých eukaryot (11 proteinů v kvasince, 63 u člověka). Tato v evoluci vzrůstající komplexita poukazuje na jejich důležitou roli v buněčné organizaci a intracelulárním transportu v různých buněčných typech mnohobuněčného organismu. Rab GTPázy fungují jako molekulární spínače, které oscilují mezi vazbou GTP 12
a jeho hydrolýzou na GDP (tedy mezi aktivní a neaktivní formou). Každý transportní krok vyžaduje, aby aktivovaný Rab vázal solubilní faktor fungující jako přenašeč signálu. Jejich on/off regulační funkce je omezena membránovým kompartmentem, kde jsou lokalizovány (Zerial and McBride, 2001). Obr. 1: Mapa intracelulárního výskytu Rab proteinů v savčí buňce. Některé jsou buněčně (Rab3a
v neuronech)
tkáňově
(Rab17
nebo
v epitelech)
specifické
nebo
vykazují
specifickou
lokalizaci
podle
buněčného typu (Rab13 v těsných spojích). CCP – clathrinový váček, CCV – clathrinová jáma, EC – epiteliální buňky, IC – ER-Golgi intermediální kompartment, M – melanosomy,
MTOC
mikrotubulární centrum,
SG
–
organizační –
sekretorická
granula, SV – synaptické váčky, T – T-buněčná granula, TGN – trans-Golgi
síť
(Zerial
and
McBride, 2001).
Přemístění Rab-GDP mezi membránami je zprostředkováno solubilním komplexem GDI (GDP dissociation inhibitor) a poté usnadněno GDF (GDI displacement factor). Záměna GDP za GTP je katalyzována GEF (guanin nucleotide exchange factor). Deaktivace Rab-GTP na Rab-GDP je urychlena GAP (GTPase activating protein) (Lee et al., 2009). Příkladem uvedu Rab1 a Rab7 GTPázu, kterých se bude týkat i následující text. Jak je vidět na obr. 1, Rab1 je protein regulující vezikulární transport z endoplazmatického retikula do Golgiho aparátu (Plutner et al., 1991). Rab7 je lokalizován na membráně pozdního endozomu (Chavrier et al., 1990) a bylo ustanoveno, že je to důležitý regulátor transportu vedoucího od raného do pozdního endozomu (Feng et al., 1995). 13
3.2. SNARE proteiny
Obr. 2: Sekvenční alignment oblasti uzlu čtyř alfa-helixů v synaptickém fúzním komplexu SNARE z různých organismů. Sekvenční analýza je omezena na 16 vrstev (modře) a zahrnuje 7 vrstev “downstream“ a 8 vrstev “upstream“ od tzv. zero layer. Konzervované zbytky jsou označeny šedě. Konzervované glutaminové a argininové zbytky v 0 layer jsou červeně, resp. zeleně (Fasshauer et al., 1998).
Za určitých in vitro podmínek probíhá membránová fúze bez přispění proteinů. Za účasti proteinů však fúze probíhá rychleji a hlavně specificky (Chernomordik and Kozlov, 2008). Pro fúzi v eukaryotech jsou nezbytné SNARE proteiny, které jsou sekvenčně konzervované od jednobuněčných eukaryot až po člověka. Jedná se o proteiny obsahující zpravidla dvě domény. (i) Hydrofobní C-terminální doména kotví protein v membráně 14
zatímco (ii) N-terminální solubilní doména obsahuje tzv. SNARE motiv a je zodpovědná za interakci s dalšími SNARE proteiny. Existují ale i výjimky, např. SNAP-25 je k membráně připojen pomocí palmitoylace (Chen and Scheller, 2001; Paumet et al., 2004). SNARE motiv se sestává z alfa-helikálního segmentu tvořeného 60-70 aminokyselinami. Je schopný vytvořit s dalšími SNARE motivy komplex čtyř propletených alfa-helixů, které jako molekulární zip přitáhnou k sobě dvě zúčastněné membrány, a indukují tak vlastní fúzi (Chen and Scheller, 2001; Wesolowski and Paumet, 2010). V rámci čtyř interagujících alfa-helixů jsou vysoce konzervované aminokyseliny. Podle přítomnosti argininu (R) nebo glutaminu (Q) v tzv. zero layer rozlišujeme R- nebo Q-SNARE (viz obr. 2). Vždy spolu interagují tři Q- a jeden R-SNARE. Mutace v těchto konzervovaných aminokyselinách redukuje stabilitu komplexu a způsobuje defekty v membránové fúzi (Fasshauer et al., 1998).
Obr. 3: Model SNARE zprostředkované fúze: a, membrány jsou v blízkosti, ale SNARE ještě nejsou v kontaktu; b, SNARE komplexy se začínají „zipovat“ z N-konce, což přibližuje membrány; c, „zipování“ pokračuje a způsobuje nárůst zakřivení a bočního napětí membrán, vnitřní prostor dvojvrstvy se exponuje; d, vysoce nevýhodný volný prostor, který vznikl (c) způsobuje ustanovení kontaktu mezi vnějšími listy membrány; e, boční tlak indukuje zhroucení membrán do fúzního póru; f, fúzní pór se zvětšuje (Chen and Scheller, 2001).
15
Hlavní role těchto proteinů je generování a kontrola membránového elastického napětí. Místní ohyb vede k úzkému kontaktu obou membrán a ke snížení energetické bariéry, což směřuje k hemifúzi a otevření póru, viz obr. 3 (Chernomordik and Kozlov, 2008). Pro fúzi jsou dostatečné tři SNARE komplexy (Hua and Scheller, 2001).
16
4. Interakce vybraných intracelulárních patogenů s buněčným transportem 4.1. Bacteria 4.1.1. Chlamydiae
Chlamydie se mohou rozmnožovat jak ve fagocytujících, tak nefagocytujících buňkách. Pokusná infekce Chlamydie psittaci v myších makrofázích ukázala, že zatímco mrtvé chlamydie byly po internalizaci makrofágy rychle degradovány, tj. došlo k fúzi fagozomu s lysozomem, živé chlamydie se diferencovaly z EB na RB stádium a úspěšně se množily (Wyrick and Brownridge, 1978). V dalších studiích se ukázalo, že chlamydiemi vybudovaný membránový kompartment (dále jako inkluze) se neokyseluje a také, že neobsahuje pozdní endozomální a lysozomální markery (Al-Younes et al., 1999). Chlamydie mimo jiné také narušují exocytickou dráhu, normální anterográdní transport od GA k cytoplazmatické membráně. Ukázkový pokus byl následující: Chlamydia trachomatis byla inkubována s fluorescenčně značným ceramidem (sondou) specifickým pro GA. Buňky, které byly inkubovány se sondou ve 4 oC, vykazovaly difuzní fluorescenční barvení prakticky všech membrán. Po zvýšení teploty na 37 oC se fluorescence rychle přesunula do GA a dále do chlamydie uvnitř inkluze. Po delší době inkubace se sonda postupně z GA ztratila a akumulovala se do inkluze, kde zůstala asociována s chlamydií po zbytek životního cyklu. Sondu si bakterie zabudovává do buněčné stěny (Hackstadt et al., 1995). Analýzou složení buněčné stěny chlamydií byla zjištěna přítomnost sfingomyelinu. Chlamydie tedy využívají hostitelových produktů metabolismu ceramidu (Hackstadt et al., 1995). Na myším modelu bylo zjištěno, že syntéza sfingomyelinu se odehrává v GA, a to převážně v jeho cis a mediálních cisternách (Futerman et al., 1990). Stejnou cestou – tedy přes GA - se dostává k inkluzi i cholesterol. Pomocí radioaktivně značených lipidových prekurzorů bylo zjištěno, že 6% buněčného cholesterolu a 12% buněčného sfingomyelinu je obsaženo v inkluzi (Carabeo et al., 2003). Aby mohl váček obsahující sfingomyelin a cholesterol splývat s inkluzí, je třeba aktivní syntézy proteinů chlamydie v rané fázi infekce (Scidmore et al., 1996; Carabeo et al., 2003). Využívání sfingomyelinu a cholesterolu je navíc další unikátní vlastností chlamydií, neboť tyto lipidy jsou jinak výhradně využívány pouze eukaryotickými organismy. Dále Chlamydie od hostitelské buňky získávají fosfolipidy (Wylie et al., 1997). 17
Vývoj inkluze je kontrolován činností bakterie. V inkluzi dosud nebyly objeveny žádné hostitelské proteiny (Heinzen et al., 1996), zato jsou zde přítomny proteiny z rodiny Inc původem z patogena. Inc nejsou sekvenčně podobné žádnému dosud popsanému proteinu. Obsahují 40 – 70 AK dlouhou hydrofobní oblast a jsou sekretovány přes sekreční systém typu III (Subtil et al., 2001). Jako první protein asociovaný s inkluzí byl identifikován IncA Chlamydia psittaci, který je posttranslačně fosforylován hostitelskou buňkou (Rockey et al., 1995; Rockey et al., 1997). IncA byl identifikován i u dalších chlamydií. Jak ukazuje obrázek 4, míra podobnosti mezi jednotlivými IncA proteiny je velmi nízká (kolem 20% stejných AK). Obecně mají ale stejnou organizaci: krátká N-terminální doména, rozsáhlá hydrofobní doména a C-terminální cytoplazmatická doména (kde je u všech IncA s velkou pravděpodobností predikovaná coiled-coil struktura); funkcí CtrIncA – IncA Chlamydia trachomatis (Bannantine et al., 1998; Delevoye et al., 2004) se budu dále zabývat v 5. kapitole. Genomy chlamydií kódují víc jak 40 domnělých Inc proteinů, jejich funkce je však neznámá (Bannantine et al., 1998).
Obr. 4.: Schema IncA proteinů z různých druhů Chlamidiae. Stupnice ukazuje délku v aminokyselinách (Delevoye et al., 2004). 4.1.2. Legionella pneumophila
Uvnitř hostitelské buňky je L. pneumophila lokalizována v neporušených vakuolách, tzv. LCV (legionella cointainig vacuole). Tyto vakuoly se zvětšují natolik, že v některých případech mohou vyplňovat většinu z cytoplazmatického prostoru buňky a zatlačovat organely hostitele na okraj buňky. Některé vakuoly dokonce fúzují do větších celků (Newsome et al., 1985). Nezbytné pro přežití legionely v LCV a ustanovení replikačně 18
kompetentní niky, je zabránění normálního vstupu do endocytické dráhy. LCV obsahující živé legionely nefúzují s lysozomy. Pro porovnání formalínem zabité legionely jsou rychle degradovány (Horwitz, 1983). Toto morfologické pozorování se potvrdilo i experimentálním zjištěním, že pH vakuol nesoucích živé legionely je vyšší než pH vakuol s usmrcenými buňkami – tedy legionely brání acidifikaci LCV (Horwitz and Maxfield, 1984). Jednu hodinu po vstupu legionely je LCV obklopena hostitelskými organelami – hladkými váčky, které s ní fúzují, a mitochondriemi. Čtyři hodiny po infekci obklopení LCV organelami hostitele ubývá, ale začínají se objevovat ribosomy a hrubé váčky. Osm hodin po nákaze jsou již ribozomy přímo asociované s LCV (Horwitz, 1983). Následná pozorování infekcí myších i lidských makrofágů ukázala, že vakuola asociuje s endoplazmatickým retikulem. Váčky obklopující LCV jsou ranými sekretorickými vezikuly, které jsou legionelou rekrutovány před doputováním k ERGIC (Kagan and Roy, 2002). Důkazem pro toto pozorování je i obsah luminálního ER proteinu Hsp70 (Swanson and Isberg, 1995). Dot/Icm je multiproteinový transmembránový systém, esenciální virulentní faktor, který umožňuje transport efektorových proteinů do hostitelské buňky. Jedná se o sekreční systém typu IV, jehož původní funkcí (kterou si udržel) je bakteriální konjugace zodpovědná za předávání plasmidů. V případě mutací této mašinerie nebo v ní sekretovaných poteinech není bakterie schopná množení a LCV postupně spěje k fúzi s lysozomem. Bylo identifikováno na 300 transportovaných proteinů, z nichž jistě velké množství mění dynamiku membránového transportu v hostitelské buňce a jejich množství pravděpodobně reflektuje koevoluci s velkým spektrem eukaryotických hostitelů. Pouze některé z nich jsou naprosto nezbytné pro vytvoření LCV nebo intracelulární růst (Hubber and Roy, 2010). Nyní uvedu příklady proteinů, které jsou zajímavé z hlediska biogeneze parazitofomní vakuoly a její interakce s vezikulárním transportem. Produkt dotA genu, DotA je transmembránový protein vnitřní bakteriální membrány a klíčový faktor zodpovědný za regulaci biogeneze LCV. Má osm do membrány zanořených domén, mezi třetí a čtvrtou je velká periplasmatická doména. C – terminus je otočen do intracelulárního prostoru bakterie. Nese architekturu podobnou ABC transportérům. Toto uspořádání, ale i umístění na vnitřní membráně vedlo autory studie k úvaze, že protein je součástí většího komplexu, v rámci kterého by mohl přenášet signály dovnitř bakteriální buňky (Roy and Isberg, 1997). Mutanti v dotA spějí k degradaci v lysozomu (Swanson and 19
Isberg, 1996). Při normálním zrání fagozomů se v jejich membránách začne objevovat LAMP1, marker pro pozdní endozom (Rabinowitz et al., 1992) a Rab7, protein vážící GTP, regulátor zodpovědný za fúzi časných endozomů s pozdními endozomy (Feng et al., 1995). Při pokusech v myších makrofázích bylo zjištěno, že vakuoly mutantů v dotA genu už byly do pěti minut po vstupu pozitivní na LAMP-1 a Rab7. Následoval úbytek Rab1, což je dobrý důkaz toho, že pět minut je dostatečná doba pro dozrání váčku do stadia pozdního endozomu. To znamená, že DotA je důležitý pro ranou fázi infekce, kdy je třeba přerušit normální endocytickou dráhu. Buňky nemutované v dotA genu byly buď po pěti minutách infekce Rab7 i LAMP-1 negativní nebo Rab7 pozitivní a LAMP-1 negativní. To znamená, že DotA zasahuje ve fázi mezi raným a pozdním endozomem. Dále bylo zjištěno, že pro úspěšnou infekci je třeba, aby byl DotA syntetizován ještě před vstupem do buňky a během počáteční fáze infekce. Po vytvoření stabilní LCV je DotA produkován v nedetekovatelném množství. Před vstupem do nové buňky se produkce opět zvyšuje. Uměle navozená masivní kontinuální syntéza proteinu způsobuje poškození hostitelových membrán (Roy et al., 1998). Dalším proteinem, který však nemá pro biogenezi vakuoly takové fatální následky jako mutace v případě DotA, je LidA. Funkce LidA tedy musí být částečně redundantní. Bakterie s mutantním LidA sice nespějí k fúzi s lysozomem, vykazují však nižší schopnost dělení. Bohužel analýza sekvence LidA neodhalila žádné vodítko pro určení jeho funkce. LidA je sekretován pomocí Dot/Icm již od počátku bakteriální infekce. Před vstupem do makrofágu je LidA detekován na povrchu pouze malé frakce bakterií. Po pěti minutách kontaktu legionel s makrofágy má LidA na svém povrchu 30% bakterií a během dalších dvaceti minut vzroste počet buněk na 80% (Conover et al., 2003). Uvnitř makrofágu je LidA pevně asociován s parazitoformní vakuolou a během replikačního cyklu jeho množství stoupá. Další výzkum ukázal, že LidA je směřován i do membrán časné sekretorické dráhy (ERGIC nebo GA). Uměle navozená vysoká exprese LidA způsobuje redistribuci ERGIC a GA a přerušení transportu z ER do GA. Exprese malého množství LidA vede k akumulaci váčků, ale nechává dopravu z ER do GA funkční. Zdá se tedy, že funkcí LidA je získávání hostitelských váčků (Derre and Isberg, 2005). LegC2, LegC3 a LegC7 jsou transmembránové proteiny, jež integrací do hostitelových membrán ovlivňují organizaci a funkci endomembránového systému.
20
Pokud jsou exprimovány v kvasinkách, způsobují defekty v mechanismu třídění proteinů do vakuoly. Zdá se, že díky těmto proteinům se předchází zrání endozomů do stadia vakuoly. Produkce LegC2 v savčích buňkách vyústila ve vytvoření obrovského kompartmentu podobného vakuole, kde LegC2 kolokalizoval s protilátkou proti KDEL sekvenci, která je přítomna na rezidentních proteinech ER. Tato vakuola byla podobná LCV. Podobná byla i lokalizace LegC7. Na rozdíl od LegC2 a LegC7, LegC3 nekolokalizoval s markerem KDEL, ale s LAMP-1 asociovaným s lysozomy mimo ER. Tyto proteiny interferují s transportem váčků i uvnitř améby Dictyostelium discoideum. LegC3 zde indukuje velké množství váčků s nestráveným materiálem (de Felipe et al., 2008). Do třiceti minut po infekci hostitelské buňky je většina LCV pozitivních na Rab1. Legionely využívají Rab1 pro zjednodušení transportu váčků odvozených od ER směrem k LCV. Přítomnost Rab1 je nezbytná pro ustanovení replikačně kompetentní vakuoly a jeho získávaní je Dot/Icm závislý proces (Kagan et al., 2004). Jedním z více faktorů, které přímo interagují s Rab1 je bakteriální efektor DrrA, vysoce specifický Rab1 GEF, který stimuluje výměnu GDP za GTP. GEF katalytická doména je umístěna na C-konci proteinu. Cytotoxický efekt je uložen ale i v 60 aminokyselinách N-terminální oblasti. Pokud je produkován protein, který obsahuje pouze GEF doménu, Rab1 není rekrutován na membránu. Za získávání Rab1 jsou tedy zodpovědné obě dvě domény. DrrA je translokován Dot/Icm systémem a zůstává asociován s membránou parazitoformní vakuoly. Zajímavé je, že DrrA nemá žádný zjevný homolog mezi savčími proteiny a nenese ani podobnost k ostatním GEF (Murata et al., 2006). Další výzkum ukázal, že DrrA je multifunkční enzym nesoucí nejenom aktivitu GEF ale zároveň i GDF (Ingmundson et al., 2007). Legionela také sekretuje LepB protein, který funguje jako specifický GAP pro Rab1. Mechanismus hydrolýzy GTP LepB bude však odlišný od eukaryotických GAP, protože LepB neobsahuje typickou katalytickou GAP doménu (Ingmundson et al., 2007). Proteinem, který se také podílí na získávání váčků od ER, je RalF. Jeho cílem je ARF1 (Nagai et al., 2002). Bylo zjištěno, že po třiceti minutách infekce jsou na LCV přítomné ARF1 proteiny, po 10 hodinách po nákaze však mizí. Inhibice ARF1 nezpůsobí definitivní inhibici biogeneze vakuol, způsobí však snížení množství ustanovených LCV (Kagan and Roy, 2002). RalF byl nalezen na základě hledání homologie s eukaryotickými GEF v genomu L. pneumophila. Obsahuje doménu homologní se Sec7. RalF má 47% podobnost k proteinu 21
Rickettsie prowazekii. Jsou to jediná dvě prokaryota obsahující Sec7 homologní doménu. RalF je lokalizovaný na fagozomu, nemá však zjevnou doménu, která by ho k němu vázala. Možná interaguje s jiným proteinem, lipidem, nebo je v cytoplasmě hostitele rychle degradován (Nagai et al., 2002).
4.2.Eukaryota 4.2.1. Trypanosoma cruzi Na počátku infekce buňky jsou paraziti lokalizováni ve vakuolách, ze kterých posléze unikají a vyskytují se volně mezi záhyby drsného endoplazmatického retikula (Nogueira and Cohn, 1976). Trypanosoma cruzi využívá dvou mechanismů, jak se dostat do buňky: 1.
Pozorování,
že
nově
internalizovaní
parazité
se
nacházejí
v kyselých
intracelulárních vakuolách obsahujících lysozomální markery ukázalo, že T. cruzi schopnosti lysozomů dosáhnout cytoplazmatické membrány a opravovat ji. Trypanosoma vyžaduje ke svému vstupu do buňky lysozomální fúzi s cytoplazmatickou membránou (Reddy et al., 2001; Tardieux et al., 1992). Inhibice synaptotagminu VII proto vede k částečnému znemožnění vstupu parazita (Caler et al., 2001). 2. Parazit penetruje buňku tak, že indukuje invaginaci plasmatické membrány za současného narušení aktinových mikrofilament. Nově utvořená vakuola je bohatá na PI3 kinázy třídy I a chybí v ní lysozomální markery. Lysozomální markery se ale později začínají objevovat. Předpokládá se, že tato cesta je častější (Woolsey et al., 2003). Společným rysem obou mechanismů je časná fúze váčku nesoucí trypanosomu s lysozomy. Kyselé prostředí je nezbytné pro únik patogena z vakuoly, jeho diferenciaci v amastigota a pomnožení v cytoplasmě. T. cruzi totiž sekretuje hemolysin (TcTOX), který je optimálně funkční při nízkém pH. Při zvýšení pH fagolysozomu např. účinkem chlorochinu nebo chloridu amonného parazit nemůže z vakuoly uniknout (Ley et al., 1990). TcTOX je velmi
podobný
komponentě
C9
komplementu.
Parazit
nejdřív
trans-
sialidázou/neuraminidázou odstraní zbytky kyseliny sialové z vniřního povrchu vakuoly a učiní ji tak senzitivní k účinkům TcTOX, který pravděpodobně vytváří póry v membráně. To vede k desintegraci a fragmentaci membrány (de Souza W. et al., 2010). Velmi podobným proteinem je LYT1. Mutanti v LYT1 genu vykazují zpomalený vývoj, nižší infekčnost 22
a sníženou hemolytickou aktivitu. Předpokládá se tedy, že jedna z jeho funkcí se překrývá s funkcí TcTOX (Manning-Cela et al., 2001). Vstup parazita do buňky je reverzibilní. Pokud nedojde ke splynutí vakuoly s lysozomy, může se parazit dostat opět z buňky ven. Má na sobě ale dvě membrány – endocytickou a exocytickou (Andrade and Andrews, 2004). 4.2.2. Toxoplasma gondii Toxoplasma se dostává do buňky aktivně invaginací cytoplazmatické membrány za pomoci sekrece produktů z rhoptrií. Do prostoru cytoplazmy hostitele jsou produkovány malé váčky, tzv. evakuoly, které se v hojném množství vyskytují v těsné blízkosti apikálního konce parazita. Jejich postupné mizení po celou dobu nákazy naznačuje, že by se mohly podílet na biogenezi parazitoformní vakuoly (PV). Tyto satelitní vezikuly nejsou odvozeny od hostitele. Během experimentu byla hostitelská buňka před nakažením Toxoplasmou obarvena membránovou lipidickou barvou DiIC16. Po nakažení byla tímto markerem označena PV odvozená od cytoplazmatické membrány, nikoliv však evakuoly (Hakansson et al., 2001). Jak PV, tak evakuoly se vyhýbají fúzy s endozomem/lysozomem. Naopak oba kompartmenty mají tendenci fúzovat s mitochondriemi a endoplazmatickým retikulem. Evakuoly mohou fúzovat i s PV a pravděpodobně v počátečních fázích infekce způsobují rychlé zvětšení PV. Vkládáním lipidů by si také mohl patogen pravděpodobně zajistit selektivní fúzogenní povahu svého kompartmentu (Jones and Hirsch, 1972; Hakansson et al., 2001). Mrtvé toxoplasmy jsou fagocytovány a normální endocytickou drahou směrovány k degradaci v lysozomech (Jones et al., 1972). Pozorování asociace s mitochondriemi a endoplazmatickým retikulem bylo potvrzeno klasickými morfometrickými metodami. Už čtyři hodiny po infekci je téměř 75% povrchu PV asociováno s organelami (mitochondrie – 18% povrchu a endoplazmatické retikulum 56% povrchu) a LV obsahují jednoho parazita. Dvacet hodin po infekci velká většina LV obsahuje čtyři parazity; rozsah mitochondriální asociace zůstává stejný, zatímco asociace s endoplazmatickým retikulem ubývá. V důsledku toho je dohromady méně než polovina povrchu LV asociována s organelami. Smrt parazita tuto asociaci nezruší (Sinai et al., 1997). Asociace s organelami vyžaduje aktivní vstup do hostitelské buňky a ustanovení PV, která není kompetentní k fúzi s endozomálním systémem. Hypotéza autorů této studie zní 23
tak, že primární role asociace je získávání živin z endoplasmatického retikula a lipidů a metabolických meziproduktů z mitochondrií (Sinai et al., 1997). Členové ROP2 rodiny (ROP2, ROP4, ROP7,...) byli charakterizováni na základě sekvenční
analýzy
a
jejich
stabilní
asociace
s membránou
–
mají
C-koncový
transmembránový helix (Beckers et al., 1994). Ve své studii Joiner a Sinai predikovali na Nkonci proteinu ROP2 mitochondriální importní signál a zjistili, že cytosolická doména proteinu
ROP2
zprostředkovává
stabilní
asociaci
LV
jak
s mitochondriemi,
tak
i endoplazmatickým retikulem (Sinai and Joiner, 2001). Pozdější studie tuto práci ale vyvrátily. Podrobná proteomická analýza rodiny ROP2 ukázala, že C-konec proteinu obsahuje doménu s homologií k proteinkinázám a domnělý transmembránový helix tvoří hydrofobní jádro domény. N-koncová doména neukázala žádnou výraznou sekvenční podobnost k jiným proteinům v dostupných databázích (El Hajj H. et al., 2006). Protože teorie N-koncového intermembránového helixu kotvícího ROP2 v membráně byla vyvrácena, pozornost se upřela na C-konec. Zde byla identifikována oblast formující 3 amfipatické helixy bohaté na arginin, což je zároveň oblast s největší podobností mezi členy rodiny (RAH). Na základě testování bylo potvrzeno, že RAH je dostatečná a nutná komponenta ke kotvení proteinu k membráně (nutný je druhý helix, první a třetí vykazují pouze nízkou afinitu) – proteiny nejsou intermembránové a asociaci zajišťuje pouze silný pozitivní náboj RAH. V nenakažené buňce má RAH tendenci asociovat s membránou buněčných organel, což pravděpodobně vedlo k mylnému přesvědčení, že ROP2 zprostředkovávají asociaci mezi LV a organelami. V nakažené buňce byl ale zjištěn minimální překryv ROP2 s membránami organel. Důvodem je pravděpodobně to, že PV se od membrán hostitele liší svým extrémním negativním zakřivením udržovaným hustou sítí úzkých membránových tubulů vystupujících do lumen vakuoly. Experimenty s mutanty redukovanými v tubulární síti ukázaly, že asociace RAH k membráně vakuoly je na nich závislá (Reese and Boothroyd, 2009). Funkce ROP2 proteinů tedy zůstává neznámá stejně tak jako podstata fúze LV s buněčnými membránami. Kromě rhoptrií má Toxoplasma ještě dvě další sekreční organely. Mikronemy a denzní granula. Dezní granula se morfologicky velmi podobají sekretorickým granulím např. endokrinních buněk. Sekrece z jednotlivých organel probíhá postupně – zatímco mikronemy se hlavně podílejí na adhezi parazita, rhoptrie se vyprazdňují při vstupu do hostitelské buňky a denzní granula převážně až uvnitř hostitele (Joiner and Roos, 2002). 24
Příkladem proteinu, který je sekretován z denzních granulí, je GRA7. Je to integrální membránový protein, který byl pozorován nejenom na PV, ale také na cytoplazmatické membráně nakažených buněk (Neudeck et al., 2002). Mutanty s absencí GRA7 vykazují zhoršenou schopnost růstu. Ačkoli Toxoplasma zabraňuje fúzi s lysozomy, zdá se, že s endozomálním systémem hostitele interaguje. Jako intracelulární patogen vyžaduje příjem živin od hostitele a vypadá to, že materiál přijímá od endocytických kompartmentů. Dvě hodiny po infekci bylo 19% buněčných
struktur
značených
LysoTrackerem
(sonda
specificky
se
hromadící
v kompartmentech o nízkém pH) seskupených okolo PV. Když se použilo LDL adsorbované na koloidní zlato (používá se pro obarvení organel podél endocytické dráhy), mnoho struktur obsahujících zlato bylo distribuováno kolem PV, často v těsném kontaktu s PV. Kupodivu, několik takových struktur bylo po třiceti minutách nalezeno uvnitř PV. Tyto struktury byly však vždy obklopeny kontinuální membránou odvozenou od PV. Nebyly pozorovány žádné volné částice zlata, což potvrzuje to, že fúze s váčky nenastává. Dokonce byla uvnitř PV potvrzena přítomnost struktur obsahujících LAMP-1. Kolem PV se vyskytovalo významné množství struktur obsahujících LDL. Za doručení váčků k PV jsou zodpovědné mikrotubuly. Zjistilo se, že GRA7 může přímo interagovat s lipidovou dvojvrstvou a dokonce ji remodelovat ve vysoce zakřivenou membránu (pokusné sférické liposomy deformuje do trubkovitého tvaru). Je hojně přítomen na povrchu PV a vytváří homooligomery (trimery), čímž tvoří obalující protein generující mechanické zúžení membrán a tak napomáhá k příjmu živin. Model je následující. Mechanickou silou polymerizujiících mikrotubulů je vytvořena hluboká prohlubeň v membráně PV, která je stabilizovaná GRA7 (GRA7 je také schopen interakce s fosfatidylinositolem, který je mimo jiné zodpovědný za remodelaci cytoskeletu). Touto prohlubní se za pomoci mikrotubulů dostane váček, který je zúžen pravidelně rozmístěným elektrondenzním obalem, až k buňce parazita. Je pak odloučen do PV, a proto je obalen membránou odvozenou od PV (Coppens et al., 2006). Pochopení detailů této interakce je ale otázkou dalšího výzkumu.
25
5. Miméze SNARE proteinů Pro membránovou fúzi jsou nezbytné SNARE proteiny. Přestože jsou SNARE proteiny přítomny pouze u eukaryot, některé patogenní bakterie obsahují proteiny, které jsou schopné s nimi specificky interagovat. Jedná se o proteiny podobné struktury, ale odlišného evolučního původu označované jako SNARE-like proteiny. SNARE-like proteiny jsou mikroorganismy používány pro podporu nebo blokaci membránové fúze. Časté nálezy SNARE-like proteinů u patogenních organismů naznačují, že tento motiv byl evolucí vybrán, protože svou funkcí může zajistit přežití mikroorganismu v prostředí eukaryotické buňky (Paumet et al., 2009). Dobrým
příkladem
využití
SNARE-like
motivu
jsou
chlamydie.
Jedním
z nejdůležitějších momentů ve vývoji chlamydií je zabránění fúze inkluze s lysozomem (viz kap. 4). Chlamydia trachomatis exprimuje na povrch inkluze CtrIncA (Rockey et al., 1995), u něhož byla jako první funkce objevena zodpovědnost za homotypickou fúzi (Hackstadt et al., 1999). V sekvenci CtrIncA byl následně identifikován SNARE-like motiv, jehož vlastnosti jsou patrné na modelu struktury tetrametru CtrIncA, která velmi připomíná strukturu SNARE komplexu (Delevoye et al., 2004). CtrIncA obsahuje dva SNARE motivy, z nichž C-terminální motiv s glutaminem v „zero layer“ vykazuje vyšší skóre alignmentu k eukaryotickému SNARE než druhý N-koncový motiv (Delevoye et al., 2008). Experimentálně bylo zjištěno, že SNARElike motiv N-koncové domény reaguje s hostitelskými SNARE a tím inhibuje membránovou fúzi. Funkce SNARE-like motivu C-koncové domény zatím není známa, nevylučuje se ale jeho přispění k zesílení inhibice. Během infekčního cyklu C. trachomatis nejprve každý nově nasyntetizovaný CtrIncA váže na membráně přítomný SNARE, dokud nejsou všechny SNARE blokovány. Jak pokračuje syntéza, je přebytek proteinu pravděpodobně použit pro další modifikace hostitelské buňky a/nebo k vazbě dalších proteinů (může indukovat homotypickou fúzi inkluze). Mutanti CtrIncA jsou málo infekční, nikoli neinfekční. Zdá se tedy, že bakterie má další systémy, které se s funkcí CtrIncA překrývají (Paumet et al., 2009). L. pneumophila žije v membránovém kompartmentu (původně endozomu) eukaryotické buňky a vlivem svých proteinů si ho upravuje na tzv. LCV, která úspěšně uniká fúzi s lysozomem. Jedním z mechanismů je pravděpodobně komplex IcmG/DotF, který 26
vykazuje přítomnost jednoho SNARE-like motivu. Přesná funkce tohoto proteinu je nejasná. Mutanti jsou ale rychle degradovány v lysozomu (Paumet et al., 2009). Zajímavé je, že inhibiční mechanismus bakteriálních SNARE je velmi podobný mechanismu eukaryotického inhibičního SNARE (iSNARE) (Paumet et al., 2009). Jedná se o SNARE, který se váže na velmi specifickou strukturu čtyři alfa-helikální struktury ze SNARE motivů – je to tedy pátý SNARE, který inhibuje fúzi (Varlamov et al., 2004).
27
6. Legionella pneumophila SNARE Řada bakteriálních patogenů obsahuje velké množství původně eukaryotických proteinů nebo proteinů obsahujících eukaryotické domény (na leucin bohaté repetice, ankyrinové repetice, coiled-coils). Právě tyto proteiny jsou často substráty pro sekreční systém typu IV a pravděpodobně tedy zvyšují virulenci patogena (de Felipe et al., 2005). Tzv. eukaryotic-like proteiny zabírají asi 3% z genomu L. pneumophila a jejich přítomnost u 72 prozkoumaných kmenů ukazuje na dlouhou koevoluci s mnoha různými eukaryotickými hostiteli. Některé proteiny jsou dokonce virového původu a legionela je pravděpodobně získala během života uvnitř eukaryotického hostitele (Lurie-Weinberger et al., 2010). Dvě teorie popisují, jak se geny pro tyto proteiny objevily v bakteriálním genomu: konvergentní evoluce a horizontální genový transfer. Není jasné, který mechanismus u daného patogena převládá (Stebbins and Galan, 2001), ale v případě legionely většina důkazů svědčí pro horizontální genový transfer (např. jiný obsah G+C párů oproti bakteriálním genům) (de Felipe et al., 2005).
Obr. 5: Heterologní exprese LpSNARE v buňkách
Escherichia
coli.
Gen
LpSNARE byl zaklonován do vektoru pET42b.
Tvorba
proteinu
byla
indukovaná přidáním 1mM IPTG. 1 - neindukované bakterie, 2, 3, 4 – různé
klony
indukované
IPTG.
A - předpokládaná velikost LpSNARE, B - procesovaný produkt LpSNARE
Na základě bioinformatického výzkumu byl naší laboratoří v genomu L. pneumophila identifikován eukaryotický SNARE homolog, pojmenovaný LpSNARE. Sekvenční analýza v SNARE databázi určila tento protein jako Q-SNARE, jehož možnou rolí je účast na endozomálním transportu hostitelské buňky. Na rozdíl od běžných eukaryotických SNARE, 28
LpSNARE obsahuje pouze solubilní N-terminální doménu se SNARE motivem. Hydrofobní doména chybí. Na základě této znalosti bylo předpovězeno, že se jedná o volně rozpustný cytosolický protein. Podle naší hypotézy by LpSNARE (i) mohl fungovat jako iSNARE a inhibovat zrání parazitoformní vakuoly do fáze splynutí s lysozomem. Nebo (ii) by se mohl jako Q-SNARE kombinovat s hostitelskými Q- a R-SNARE a způsobovat neznámé fúzní události. Poslední možná aktivita LpSNARE vyplývá ze schopnosti legionel indukovat v hostitelské buňce na Dot/Icm (Zink et al., 2002) závislou apoptózu (Muller et al., 1996; Hagele et al., 1998). Ta je také potřebná pro úspěšnou biogenezi parazitoformní vakuoly (Molmeret et al., 2004). Naše předběžné pokusy ukazují, že exprese LpSNARE v HeLa buňkách vyvolává z 80% dramatický „membrane blebbing“, což by mohlo naznačovat indukci apoptózy (Monack et al., 1997), viz obr. 6. Tedy (iii) LpSNARE se podílí na indukci apoptózy hostitelské buňky.
Obr. 6: “Membrane blebbing“ HeLa buněk indukovaný expresí GFP-tagovaného LpSNARE.
Naše další plány s LpSNARE jsou následující: pomocí exprese chimérických proteinů a pomocí protilátek, které vytvoříme proti rekombinantnímu LpSNARE, budeme v HeLa buňkách sledovat A) přesnou lokalizaci proteinu a B) jeho účinek na membránovou fúzi a C) charakterizovat jeho interagující partnery. D) Budeme sledovat sekreci LpSNARE během infekce a E) pomocí sledování exprese apoptotických markerů zjišťovat účinek LpSNARE při indukci apoptózy.
29
7. Závěr
Tato bakalářská práce je přehledem dosavadních poznatků o ovlivňování buněčného transportu vybranými intracelulárními jednobuněčnými patogeny – bakteriemi Chlamydia spp., Legionella pneumophila a eukaryotickými organismy Toxoplasma gondii a Trypanosoma cruzi. Bylo ukázáno, že kritickým momentem přežití parazita uvnitř buňky je únik z normální endocytické dráhy a ustanovení podmínek vhodných pro replikaci. Ačkoli jsou některé efektorové molekuly známé, často bývá mechanismus jejich funkce utajený. Pro řadu efektorů je navíc často pozorován funkční překryv, a proto případná mutace či delece jednoho genu nevyvolá kýžený fenotyp. Tato redundance je zvlášť dobře viditelná právě u patogenů, kteří mají širokou škálu hostitelů a ve své evoluci se museli přizpůsobovat různorodým podmínkám. Oblasti výzkumu přežívání patogenů uvnitř hostitele je třeba nadále věnovat pozornost, protože pochopení těchto mechanismů by mohlo vést k vytvoření nových účinných léčiv a následně tak k eliminaci chorob způsobených těmito patogeny.
30
8. Seznam často používaných zkratek
EB
„Elementary body“
ER
Endoplazmatické retikulum
ERGIC
Přechodný kompartment mezi endoplazmatickým retikulem a Golgiho aparátem
GA
Golgiho aparát
GAP
„GTPase activating protein“
GDF
„GDI displacement factor“
GDI
„GDP dissociation inhibitor“
GEF
„Guanin nucleotide exchange factor“
iSNARE
„Inhibitory“ SNARE
LCV
„Legionella cointaining vacuole“
LDL
„Low - density lipoprotein“
LpSNARE
Legionella pneumophila SNARE
PV
Parazitoformní vakuola
RB
„Reticulate body“
31
9. Seznam použité literatury
Al-Younes,H.M., Rudel,T., and Meyer,T.F. (1999). Characterization and intracellular trafficking pattern of vacuoles containing Chlamydia pneumoniae in human epithelial cells. Cell Microbiol. 1, 237-247. Andrade,L.O. and Andrews,N.W. (2004). Lysosomal fusion is essential for the retention of Trypanosoma cruzi inside host cells. J. Exp. Med. 200, 1135-1143. Bannantine,J.P., Stamm,W.E., Suchland,R.J., and Rockey,D.D. (1998). Chlamydia trachomatis IncA is localized to the inclusion membrane and is recognized by antisera from infected humans and primates. Infect. Immun. 66, 6017-6021. Beckers,C.J., Dubremetz,J.F., Mercereau-Puijalon,O., and Joiner,K.A. (1994). The Toxoplasma gondii rhoptry protein ROP 2 is inserted into the parasitophorous vacuole membrane, surrounding the intracellular parasite, and is exposed to the host cell cytoplasm. J. Cell Biol. 127, 947-961. Caler,E.V., Chakrabarti,S., Fowler,K.T., Rao,S., and Andrews,N.W. (2001). The Exocytosisregulatory protein synaptotagmin VII mediates cell invasion by Trypanosoma cruzi. J. Exp. Med. 193, 1097-1104. Carabeo,R.A., Mead,D.J., and Hackstadt,T. (2003). Golgi-dependent transport of cholesterol to the Chlamydia trachomatis inclusion. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 100, 6771-6776. Carlsson,S.R., Roth,J., Piller,F., and Fukuda,M. (1988). Isolation and characterization of human lysosomal membrane glycoproteins, h-lamp-1 and h-lamp-2. Major sialoglycoproteins carrying polylactosaminoglycan. J. Biol. Chem. 263, 18911-18919. Chavrier,P., Parton,R.G., Hauri,H.P., Simons,K., and Zerial,M. (1990). Localization of low molecular weight GTP binding proteins to exocytic and endocytic compartments. Cell 62, 317-329. Chen,Y.A. and Scheller,R.H. (2001). SNARE-mediated membrane fusion. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2, 98-106. Chernomordik,L.V. and Kozlov,M.M. (2008). Mechanics of membrane fusion. Nat. Struct. Mol. Biol. 15, 675-683. Conover,G.M., Derre,I., Vogel,J.P., and Isberg,R.R. (2003). The Legionella pneumophila LidA protein: a translocated substrate of the Dot/Icm system associated with maintenance of bacterial integrity. Mol. Microbiol. 48, 305-321. Coppens,I., Dunn,J.D., Romano,J.D., Pypaert,M., Zhang,H., Boothroyd,J.C., and Joiner,K.A. (2006). Toxoplasma gondii sequesters lysosomes from mammalian hosts in the vacuolar space. Cell 125, 261-274. 32
de Felipe,K.S., Glover,R.T., Charpentier,X., Anderson,O.R., Reyes,M., Pericone,C.D., and Shuman,H.A. (2008). Legionella eukaryotic-like type IV substrates interfere with organelle trafficking. PLoS. Pathog. 4, e1000117. de Felipe,K.S., Pampou,S., Jovanovic,O.S., Pericone,C.D., Ye,S.F., Kalachikov,S., and Shuman,H.A. (2005). Evidence for acquisition of Legionella type IV secretion substrates via interdomain horizontal gene transfer. J. Bacteriol. 187, 7716-7726. de Souza W., de Carvalho,T.M., and Barrias,E.S. (2010). Review on Trypanosoma cruzi: Host Cell Interaction. Int. J. Cell Biol. 2010. Delevoye,C., Nilges,M., Dautry-Varsat,A., and Subtil,A. (2004). Conservation of the biochemical properties of IncA from Chlamydia trachomatis and Chlamydia caviae: oligomerization of IncA mediates interaction between facing membranes. J. Biol. Chem. 279, 46896-46906. Delevoye,C., Nilges,M., Dehoux,P., Paumet,F., Perrinet,S., Dautry-Varsat,A., and Subtil,A. (2008). SNARE protein mimicry by an intracellular bacterium. PLoS. Pathog. 4, e1000022. Derre,I. and Isberg,R.R. (2005). LidA, a translocated substrate of the Legionella pneumophila type IV secretion system, interferes with the early secretory pathway. Infect. Immun. 73, 4370-4380. El Hajj H., Demey,E., Poncet,J., Lebrun,M., Wu,B., Galeotti,N., Fourmaux,M.N., MercereauPuijalon,O., Vial,H., Labesse,G., and Dubremetz,J.F. (2006). The ROP2 family of Toxoplasma gondii rhoptry proteins: proteomic and genomic characterization and molecular modeling. Proteomics. 6, 5773-5784. Fasshauer,D., Sutton,R.B., Brunger,A.T., and Jahn,R. (1998). Conserved structural features of the synaptic fusion complex: SNARE proteins reclassified as Q- and R-SNAREs. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 95, 15781-15786. Feng,Y., Press,B., and Wandinger-Ness,A. (1995). Rab 7: an important regulator of late endocytic membrane traffic. J. Cell Biol. 131, 1435-1452. Fields,K.A. and Hackstadt,T. (2002). The chlamydial inclusion: escape from the endocytic pathway. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 18, 221-245. Futerman,A.H., Stieger,B., Hubbard,A.L., and Pagano,R.E. (1990). Sphingomyelin synthesis in rat liver occurs predominantly at the cis and medial cisternae of the Golgi apparatus. J. Biol. Chem. 265, 8650-8657. Gomez-Valero,L., Rusniok,C., and Buchrieser,C. (2009). Legionella pneumophila: population genetics, phylogeny and genomics. Infect. Genet. Evol. 9, 727-739. Hackstadt,T., Scidmore,M.A., and Rockey,D.D. (1995). Lipid metabolism in Chlamydia trachomatis-infected cells: directed trafficking of Golgi-derived sphingolipids to the chlamydial inclusion. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 92, 4877-4881. 33
Hackstadt,T., Scidmore-Carlson,M.A., Shaw,E.I., and Fischer,E.R. (1999). The Chlamydia trachomatis IncA protein is required for homotypic vesicle fusion. Cell Microbiol. 1, 119-130. Hagele,S., Hacker,J., and Brand,B.C. (1998). Legionella pneumophila kills human phagocytes but not protozoan host cells by inducing apoptotic cell death. FEMS Microbiol. Lett. 169, 5158. Hakansson,S., Charron,A.J., and Sibley,L.D. (2001). Toxoplasma evacuoles: a two-step process of secretion and fusion forms the parasitophorous vacuole. EMBO J. 20, 3132-3144. Heinzen,R.A., Scidmore,M.A., Rockey,D.D., and Hackstadt,T. (1996). Differential interaction with endocytic and exocytic pathways distinguish parasitophorous vacuoles of Coxiella burnetii and Chlamydia trachomatis. Infect. Immun. 64, 796-809. Horwitz,M.A. (1983). Formation of a novel phagosome by the Legionnaires' disease bacterium (Legionella pneumophila) in human monocytes. J. Exp. Med. 158, 1319-1331. Horwitz,M.A. and Maxfield,F.R. (1984). Legionella pneumophila inhibits acidification of its phagosome in human monocytes. J. Cell Biol. 99, 1936-1943. Horwitz,M.A. and Silverstein,S.C. (1980). Legionnaires' disease bacterium (Legionella pneumophila) multiples intracellularly in human monocytes. J. Clin. Invest 66, 441-450. Hua,Y. and Scheller,R.H. (2001). Three SNARE complexes cooperate to mediate membrane fusion. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 98, 8065-8070. Hubber,A. and Roy,C.R. (2010). Modulation of host cell function by Legionella pneumophila type IV effectors. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 26, 261-283. Ingmundson,A., Delprato,A., Lambright,D.G., and Roy,C.R. (2007). Legionella pneumophila proteins that regulate Rab1 membrane cycling. Nature 450, 365-369. Joiner,K.A. and Roos,D.S. (2002). Secretory traffic in the eukaryotic parasite Toxoplasma gondii: less is more. J. Cell Biol. 157, 557-563. Jones,T.C. and Hirsch,J.G. (1972). The interaction between Toxoplasma gondii and mammalian cells. II. The absence of lysosomal fusion with phagocytic vacuoles containing living parasites. J. Exp. Med. 136, 1173-1194. Jones,T.C., Yeh,S., and Hirsch,J.G. (1972). The interaction between Toxoplasma gondii and mammalian cells. I. Mechanism of entry and intracellular fate of the parasite. J. Exp. Med. 136, 1157-1172. Kagan,J.C. and Roy,C.R. (2002). Legionella phagosomes intercept vesicular traffic from endoplasmic reticulum exit sites. Nat. Cell Biol. 4, 945-954. Kagan,J.C., Stein,M.P., Pypaert,M., and Roy,C.R. (2004). Legionella subvert the functions of Rab1 and Sec22b to create a replicative organelle. J. Exp. Med. 199, 1201-1211. 34
Lee,M.T., Mishra,A., and Lambright,D.G. (2009). Structural mechanisms for regulation of membrane traffic by rab GTPases. Traffic. 10, 1377-1389. Ley,V., Robbins,E.S., Nussenzweig,V., and Andrews,N.W. (1990). The exit of Trypanosoma cruzi from the phagosome is inhibited by raising the pH of acidic compartments. J. Exp. Med. 171, 401-413. Lippincott-Schwartz,J., Roberts,T.H., and Hirschberg,K. (2000). Secretory protein trafficking and organelle dynamics in living cells. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 16, 557-589. Lurie-Weinberger,M.N., Gomez-Valero,L., Merault,N., Glockner,G., Buchrieser,C., and Gophna,U. (2010). The origins of eukaryotic-like proteins in Legionella pneumophila. Int. J. Med. Microbiol. 300, 470-481. Manning-Cela,R., Cortes,A., Gonzalez-Rey,E., Van Voorhis,W.C., Swindle,J., and Gonzalez,A. (2001). LYT1 protein is required for efficient in vitro infection by Trypanosoma cruzi. Infect. Immun. 69, 3916-3923. Molmeret,M., Zink,S.D., Han,L., Abu-Zant,A., Asari,R., Bitar,D.M., and Abu,K.Y. (2004). Activation of caspase-3 by the Dot/Icm virulence system is essential for arrested biogenesis of the Legionella-containing phagosome. Cell Microbiol. 6, 33-48. Monack,D.M., Mecsas,J., Ghori,N., and Falkow,S. (1997). Yersinia signals macrophages to undergo apoptosis and YopJ is necessary for this cell death. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 94, 10385-10390. Muller,A., Hacker,J., and Brand,B.C. (1996). Evidence for apoptosis of human macrophagelike HL-60 cells by Legionella pneumophila infection. Infect. Immun. 64, 4900-4906. Murata,T., Delprato,A., Ingmundson,A., Toomre,D.K., Lambright,D.G., and Roy,C.R. (2006). The Legionella pneumophila effector protein DrrA is a Rab1 guanine nucleotide-exchange factor. Nat. Cell Biol. 8, 971-977. Nagai,H., Kagan,J.C., Zhu,X., Kahn,R.A., and Roy,C.R. (2002). A bacterial guanine nucleotide exchange factor activates ARF on Legionella phagosomes. Science 295, 679-682. Neudeck,A., Stachelhaus,S., Nischik,N., Striepen,B., Reichmann,G., and Fischer,H.G. (2002). Expression variance, biochemical and immunological properties of Toxoplasma gondii dense granule protein GRA7. Microbes. Infect. 4, 581-590. Newsome,A.L., Baker,R.L., Miller,R.D., and Arnold,R.R. (1985). Interactions between Naegleria fowleri and Legionella pneumophila. Infect. Immun. 50, 449-452. Nogueira,N. and Cohn,Z. (1976). Trypanosoma cruzi: mechanism of entry and intracellular fate in mammalian cells. J. Exp. Med. 143, 1402-1420. Ostrowicz,C.W., Meiringer,C.T., and Ungermann,C. (2008). Yeast vacuole fusion: a model system for eukaryotic endomembrane dynamics. Autophagy. 4, 5-19. 35
Paumet,F., Rahimian,V., and Rothman,J.E. (2004). The specificity of SNARE-dependent fusion is encoded in the SNARE motif. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 101, 3376-3380. Paumet,F., Wesolowski,J., Garcia-Diaz,A., Delevoye,C., Aulner,N., Shuman,H.A., Subtil,A., and Rothman,J.E. (2009). Intracellular bacteria encode inhibitory SNARE-like proteins. PLoS. One. 4, e7375. Plutner,H., Cox,A.D., Pind,S., Khosravi-Far,R., Bourne,J.R., Schwaninger,R., Der,C.J., and Balch,W.E. (1991). Rab1b regulates vesicular transport between the endoplasmic reticulum and successive Golgi compartments. J. Cell Biol. 115, 31-43. Rabinowitz,S., Horstmann,H., Gordon,S., and Griffiths,G. (1992). Immunocytochemical characterization of the endocytic and phagolysosomal compartments in peritoneal macrophages. J. Cell Biol. 116, 95-112. Rao,S.K., Huynh,C., Proux-Gillardeaux,V., Galli,T., and Andrews,N.W. (2004). Identification of SNAREs involved in synaptotagmin VII-regulated lysosomal exocytosis. J. Biol. Chem. 279, 20471-20479. Reddy,A., Caler,E.V., and Andrews,N.W. (2001). Plasma membrane repair is mediated by Ca(2+)-regulated exocytosis of lysosomes. Cell 106, 157-169. Reese,M.L. and Boothroyd,J.C. (2009). A helical membrane-binding domain targets the Toxoplasma ROP2 family to the parasitophorous vacuole. Traffic. 10, 1458-1470. Rockey,D.D., Grosenbach,D., Hruby,D.E., Peacock,M.G., Heinzen,R.A., and Hackstadt,T. (1997). Chlamydia psittaci IncA is phosphorylated by the host cell and is exposed on the cytoplasmic face of the developing inclusion. Mol. Microbiol. 24, 217-228. Rockey,D.D., Heinzen,R.A., and Hackstadt,T. (1995). Cloning and characterization of a Chlamydia psittaci gene coding for a protein localized in the inclusion membrane of infected cells. Mol. Microbiol. 15, 617-626. Roy,C.R., Berger,K.H., and Isberg,R.R. (1998). Legionella pneumophila DotA protein is required for early phagosome trafficking decisions that occur within minutes of bacterial uptake. Mol. Microbiol. 28, 663-674. Roy,C.R. and Isberg,R.R. (1997). Topology of Legionella pneumophila DotA: an inner membrane protein required for replication in macrophages. Infect. Immun. 65, 571-578. Scidmore,M.A., Rockey,D.D., Fischer,E.R., Heinzen,R.A., and Hackstadt,T. (1996). Vesicular interactions of the Chlamydia trachomatis inclusion are determined by chlamydial early protein synthesis rather than route of entry. Infect. Immun. 64, 5366-5372. Sinai,A.P. and Joiner,K.A. (1997). Safe haven: the cell biology of nonfusogenic pathogen vacuoles. Annu. Rev. Microbiol. 51, 415-462. Sinai,A.P. and Joiner,K.A. (2001). The Toxoplasma gondii protein ROP2 mediates host organelle association with the parasitophorous vacuole membrane. J. Cell Biol. 154, 95-108. 36
Sinai,A.P., Webster,P., and Joiner,K.A. (1997). Association of host cell endoplasmic reticulum and mitochondria with the Toxoplasma gondii parasitophorous vacuole membrane: a high affinity interaction. J. Cell Sci. 110 ( Pt 17), 2117-2128. Sonar S.S and Brahmbhatt M.N. Toxoplasmosis: An Important Protozoan Zoonosis. Veterinary world 3 (9), 436-439. 2010. Spang,A. (2008). The life cycle of a transport vesicle. Cell Mol. Life Sci. 65, 2781-2789. Stebbins,C.E. and Galan,J.E. (2001). Structural mimicry in bacterial virulence. Nature 412, 701-705. Subtil,A., Parsot,C., and Dautry-Varsat,A. (2001). Secretion of predicted Inc proteins of Chlamydia pneumoniae by a heterologous type III machinery. Mol. Microbiol. 39, 792-800. Swanson,M.S. and Isberg,R.R. (1995). Association of Legionella pneumophila with the macrophage endoplasmic reticulum. Infect. Immun. 63, 3609-3620. Swanson,M.S. and Isberg,R.R. (1996). Identification of Legionella pneumophila mutants that have aberrant intracellular fates. Infect. Immun. 64, 2585-2594. Tardieux,I., Webster,P., Ravesloot,J., Boron,W., Lunn,J.A., Heuser,J.E., and Andrews,N.W. (1992). Lysosome recruitment and fusion are early events required for trypanosome invasion of mammalian cells. Cell 71, 1117-1130. Teixeira,A.R., Nascimento,R.J., and Sturm,N.R. (2006). Evolution and pathology in chagas disease--a review. Mem. Inst. Oswaldo Cruz 101, 463-491. Varlamov,O., Volchuk,A., Rahimian,V., Doege,C.A., Paumet,F., Eng,W.S., Arango,N., Parlati,F., Ravazzola,M., Orci,L., Sollner,T.H., and Rothman,J.E. (2004). i-SNAREs: inhibitory SNAREs that fine-tune the specificity of membrane fusion. J. Cell Biol. 164, 79-88. Wesolowski,J. and Paumet,F. (2010). SNARE motif: a common motif used by pathogens to manipulate membrane fusion. Virulence. 1, 319-324. Woolsey,A.M., Sunwoo,L., Petersen,C.A., Brachmann,S.M., Cantley,L.C., and Burleigh,B.A. (2003). Novel PI 3-kinase-dependent mechanisms of trypanosome invasion and vacuole maturation. J. Cell Sci. 116, 3611-3622. Wylie,J.L., Hatch,G.M., and McClarty,G. (1997). Host cell phospholipids are trafficked to and then modified by Chlamydia trachomatis. J. Bacteriol. 179, 7233-7242. Wyrick,P.B. and Brownridge,E.A. (1978). Growth of Chlamydia psittaci in macrophages. Infect. Immun. 19, 1054-1060. Zerial,M. and McBride,H. (2001). Rab proteins as membrane organizers. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2, 107-117.
37
Zink,S.D., Pedersen,L., Cianciotto,N.P., and Abu-Kwaik,Y. (2002). The Dot/Icm type IV secretion system of Legionella pneumophila is essential for the induction of apoptosis in human macrophages. Infect. Immun. 70, 1657-1663.
38
