LAMPIRAN 1 : Universitas Sumatera Utara

209

LAMPIRAN 1 :

Universitas Sumatera Utara

210

LAMPIRAN 2


211

LAMPIRAN 3A.


212

LAMPIRAN 3B.


213

LAMPIRAN 4 :


214

LAMPIRAN 5 :


215

LAMPIRAN 6 :


216


217


218


219


220


221


222


223


224

LAMPIRAN 7 : Prosedur pemeriksaan kadar TNF-α serum. Prinsip Pengujian Uji ini bekerja dengan teknik penyisipan enzim immunoassay secara kuantitatif. Antibodi monoklonal yang spesifik untuk TNF-α telah dilapisi atas microplate. Standar dan sampel dimasukkan kedalam dan TNF-α yang muncul terikat dengan antibodi yang immobile. Setelah membuang substansi yang tidak terikat, enzymelinked polyclonal antibody yang spesifik untuk TNF α ditambahkan. Kemudian, ditambahkan larutan substrat dan dilakukan pewarnaan. Pewarnaan dihentikan dengan mempertimbangkan intensitasnya.

Batasan pemeriksaan : Hanya untuk penelitian, tidak digunakan untuk prosedur diagnostik. Kit tidak boleh digunakan bila telah melewati tanggal kadaluarsa yang tertera pada label. Jangan mencampur reagen dengan bahan dari sumber yang lain. Penting untuk menggunakan alat kalibrasi pengencer sebagai kurva standar, agar konsisten terhadap sampel yang akan diuji. Jika nilai sampel secara umum lebih tinggi dari standar, lakukan pengenceran dengan alat kalibrasi yang sesuai dan ulangi pengujian. Standar pengencer, operator, pipetting technique, teknik pencucian, masa inkubasi/temperatur dan umur kit dapat mempengaruhi variasi pengikatan. Pemeriksaan ini diciptakan untuk mengeliminir percampuran dengan reseptor yang larut, ikatan protein dan faktor lain yang terdapat pada sampel biologis. Sebelum semua faktor diatas


225

diuji dengan Quantikine Immunoassay, kemungkinan dari percampuran belum bisa dieksklusikan. Reagen : TNF α microplate TNF α Conjugate TNF α Standard Assay diluent RD1F Calibrator Diluent RD6-35 Wash Buffer Concentrate Color Reagent A Color Reagent B Stop Solution Plate Covers Penyimpanan KIT

yang Simpan dalam suhu

2-8

ͦC, jangan gunakan

belum terbuka melebihi tanggal kadaluarsa KIT

yang Diluted wash buffer

sudah terbuka Stop solution

Bisa disimpan sampai 1 bulan

Calbrator diluent RD6-35

dalam suhu 2- 8C

Assay diluent RD 1F

ͦ

Conjugate Unmixed Color reagent A Unmixed Color reagent B Standard Microplate wells

Kembalikan tabung yang tidak terpakai kedalam kantung foil. Bisa

disimpan

sampai 1 bulan dalam suhu 2- 8C


226

Perlengkapan Lain Yang Dibutuhkan Microplate reader Pipet Air suling Squirt bottle, manifold dispenser atau automated microplate washer 100 ml dan 500 ml graduated cylinders Human TNF α controls Tindakan Pencegahan Calibrator diluent RD 6-35 terdiri atas sodium azide yang akan bereaksi dengan timah dan tembaga, dapat membentuk azides metalik yang bersifat eksplosif. Siram dengan air bervolume banyak selama pembuangan. Stop solution pada Kit ini berasal dari cairan asam. Gunakan pelindung mata, tangan wajah & baju pelindung saat menggunakan material tersebut.

Pengumpulan Dan Penyimpanan Sampel Cell Culture Supernates : hilangkan partikulat dengan sentrifugasi dan uji secepatnya dan simpan sampel pada suhu≤ - 20 C. Hindari pengulangan freeze-thaw cycles. Serum : gunakan serum separator tube (SST) dan biarkan sampel membeku selama 30 menit sebelum sentrifugasi selama 10 menit sekitar 10000 x g. Angkat serum dan uji secepatnya dan simpan sampel pada suhu≤

- 20 C. Hindari pengulangan freeze-thaw

cycles. Plasma : kumpulkan plasma menggunakan EDTA, Heparin atau citrate sebagai antikoagulan. Sentrifugasi pada 1000 x g selama 30 menit pengumpulan. Uji secepatnya dan simpan sampel pada suhu ≤ - 20 C. Hindari pengulangan freeze-thaw cycles.


227

Peringatan : jika menggunakan citrate atau tabung heparin, pastikan bebas pyrogen untuk menghindari produksi TNF α yang endogenus. Persiapan Reagen Simpan semua reagen dalam suhu kamar sebelum digunakan. Wash-buffer : Jika terjadi pembentukan kristal, hangatkan pada suhu kamar dan aduk perlahan hingga kristal larut. Diluted Calibrator Diluent RD6-35 : tambahkan 20 ml Calibrator Diluted RD6-35 dengan 80 ml air suling hingga menghasilkan 100 ml Diluted Calibrator Diluent RD6-35. Substrate Solution : Color reagent A & B harus dicampur dengan volume yang berimbang selama 15 menit. Hindari dari cahaya, 200 uL campuran hasil reaksi wajib per tabung. TNF α Standard : Susun kembali TNF α Standard dengan 1.0 ml air suling. Prosedur penyusunan kembali ini menghasilkan 10.000 pg/ml persediaan solution. Biarkan standard tersebut selama 15 menit agar membentuk pengenceran. Ambil 900 uL calibrator Diluent RD6-35 atau encerkan calibrator Diluent RD6-35 menjadi 1000 pg/ml. Ambil 500 ml dari Calibrator diluent yang sesuai ke tabung yang tersisa. Gunakan larutan persediaan untuk menghasilkan serial pengencer. Aduk setiap tabung sebelum dipindahkan ketabung berikutnya. 1000 pg/ml standard merupakan standard tertinggi. Calibrator diluent yang sesuai merupakan standard nol (0 pg/ml).

Prosedur Pengujian Simpan semua reagen dan sampel dalam suhu kamar sebelum digunakan. Direkomendasikan untuk membuat duplikat pada semua sampel, standar dan kontrol yang akan diuji. Persiapkan semua reagen dan standar seperti yang diarahkan pada sesi sebelumnya.


228

Buka microplate strips dari plate frame, masukkan kedalam foil yang berisi paket pengering. Tambahkan 50 ml Assay Diluent RD1F pada setiap tabung. Assay diluent RD1F dapat menyebabkan pengendapan. Aduk tabung sebelum dan selama penggunaan. Tambahkan 200 uL Standard, sampel atau control pada setiap tabung. Bungkus dengan adhesive strips yang tersedia. Lakukan inkubasi selama 2 jam pada suhu kamar. Plate layout disediakan untuk merekam standard dan sampel yang sudah diuji. Aspirasi setiap tabung dan cuci, ulangi proses sebanyak tiga kali dengan total empat kali pencucian. Cuci dengan menambahkan Wash Buffer (400 uL) pada setiap tabung dengan menggunakan squirt bottle, manifold dispenser atau autowasher.

Setelah

pencucian yang terakhir, bersihkan semua sisa wash buffer dengan aspirasi atau decanting ?. Balikkan plate dan keringkan dengan kertas handuk yang bersih. Tambahkan 200 uL TNF α Conjugate pada setiap tabung. Bungkus dengan adhesive strip yang baru. Untuk serum plasma sampel : inkubasi selama 2 jam pada suhu kamar dan untuk cell culture supernate sampel : inkubasi selama 1 jam pada suhu kamar. Ulangi aspirasi/pencucian seperti pada langkah di atas. Tambahkan 200 uL substrate solution pada setiap tabung. Inkubasi selama 20 menit pada suhu kamar. Hindari dari cahaya. Tambahkan 50 uL stop solution pada setiap tabung. Warna harus berubah dari biru menjadi kuning. Jika warnanya hijau atau tidak terjadi

perubahan

warna,

ketuk

perlahan

plate

nya

untuk

memastikan percampuran sepenuhnya. Pastikan densitas optikal pada setiap tabung dengan menggunakan microplate reader yang diatur pada 45 nm. Jika koreksi panjang gelombang tersedia, ubah menjadi 540 nm atau 570 nm. Jika koreksi panjang gelombang tidak tersedia, kurangi pembacaan pada 540 nm atau 570 nm pada 450 nm. Pengurangan ini akan


229

dikoreksi dengan optical imperfection pada plate. Pembacaan secara langsung pada 450 nm tanpa melakukan koreksi, akan menghasilkan akurasi yang lebih tinggi atau lebih rendah. Kesimpulan Prosedur Pengujian Persiapkan semua reagen dan sampel seperti yang sudah dijelaskan Tambahkan 50 uL assay diluent RD 1F pada setiap tabung Tambahkan 200uL standar, kontrol atau sampel pada setiap tabung, inkubasi selama 2 jam Aspirasi dan bilas sebanyak 4 kali Tambahkan 200 uL conjugate pada setiap tabung Aspirasi dan bilas sebanyak 4 kali Tambahkan 200 uL substrate solution pada setiap tabung. Hindari dari cahaya Tambahkan 50 uL stop solution pada setiap tabung. Baca pada 450 nm selama 30 menit. Λ correction pada 540 atau 570 nm Kalkulasi Hasil Rata-ratakan pembacaan hasil duplikasi pada setiap standar, kontrol dan sampel dan kurangi dengan rata-rata standar nol dari optical density. Buat kurva standar dengan mengurangi data menggunakan software komputer yang mampu menghasilkan four parameter logistic (4-PL) curve fit. Sebagai alternatif, buat kurva standar dengan membuat plot pada rata-rata absorbansi pada setiap standar di aksis y dengan konsentrasi pada aksis x dan buat garis antar titik pada grafik tersebut. Data mungkin akan membentuk garis dengan plotting log konsentrasi TNF α

vs log OD dan garis

yang sesuai dapat ditentukan dengan analisis regresi. Prosedur ini akan menghasilkan hasil yang adekuat tetapi ketepatan yang kurang cocok dengan data.


230

Jika

sampel

sudah

dilakukan

pengenceran,

konsentrasinya

pembacaan dari kurva standar harus dikalikan dengan faktor pengencer.

Petunjuk Teknik Saat mencampur protein solution, hindari pembentukan busa Substrate solution harus tetap tanpa warna sebelum dimasukkan kedalam plate. Jauhkan substrate solution dari cahaya. Substrate solution harus berubah warna menjadi biru. Stop solution harus dimasukkan kedalam plate berurutan dengan substrate solution. Warna akan berubah dari biru menjadi kuning saat dicampur dengan stop solution. Warna hijau merupakan indikasi jika stop solution tidak tercampur sepenuhnya dengan substrate solution. Untuk menghindari

kontaminasi, ganti pipet saat menambahkan

setiap level standard, penambahan sampel dan saat memasukkan reagen. Gunakan reservoir yang berbeda setiap reagen. Untuk memastikan hasil yang akurat, kelayakan adhesion plate selama tahap inkubasi adalah penting.

Ketelitian Intra-assay Precision Tiga sampel yang konsentrasinya sudah diketahui diuji sebanyak 20 kali pada satu plate untuk menilai ketelitian intra-assay. Inter-assay Precision Tiga sampel yang konsentrasinya sudah diketahui diuji sebanyak 20 kali secara terpisah untuk menilai ketelitian inter-assay. Linearitas Untuk menilai linearitas dari uji ini, lima sampel dibubuhi dengan TNF-α konsentrasi tinggi, dengan berbagai matriks dan diencerkan dengan calibrator diluent yang sesuai untuk menghasilkan sampel dengan nilai dalam range yang dinamis.


231

Kalibrasi Immunoasaay ini dikalibrasi terhadap highly purifired E coliexpressed recombinant human TNF α yang dihasilkan pada sistem R&D. Standar internasional pertama NIBSC/WHO 87/650 dievaluasi pada kit ini. Kurva respon dosis dari standar internasional pertama ini sejajar dengan kurva standard dari Quantikine. Untuk merubah nilai sampel diperoleh dari Quantikine TNFα yang setara dengan NIBSC 87/650 internasional unit. Nilai equivalent NIBSC (IU/mL) = 0.026 X nilai Quantikine TNFα (pg/mL)

Nilai Sampel Serum/Plasma : empatpuluh serum dan plasma sampel telah dievaluasi dalam uji ini. Semua sampel terukur dengan hasil dibawah nilai standard 15.6 pg/mL Cell Cultured Supernates : mononuklear sel dikultur di RPMI, ditambahkan

dengan

10%

fetal

calf

serum,

50uL

β-

mercaptoethanol, 2mM L-glutamine, 100 U/mL penicillin dan 100 ug/mL streptomycin sulfate. Sel tersebut distimulasi pada hari ke 1, 3 dan 5. Alikuot dari culture supernate dipisahkan pada hari ke 1, 3 dan 5dan diuji untuk natural TNF-α.

Sensitifitas Duapuluh lima uji yang telah dievaluasi dan range minimum detectable dose (MDD) dari TNF-α dari 0,5-5,5 pg/mL. Rata-rata MDDnya adalah 1,6 pg/mL. MDD ditentukan dengan menambahkan dua standar deviasi ke rata-rata

20 standar nol dari optikal densitas dan menghitung

semua konsentrasi yang sesuai.


232

Spesifisitas Uji ini mengenal kedua natural dan rekombinan TNF α. Faktor-faktor yang terdapat dibawah disiapkan sebanyak 50uL/ml di Calibrator Diluent RD6-35 dan diuji reaktifitasnya. Tidak ada reaktifitas yang signifikan maupun ditemukannya gangguan.


233

LAMPIRAN 8 : Prosedur pemeriksaan kadar IL-1 serum. Pengumpulan Sampel Dan Penyimpanan Sel Kultur Supernates : Buang partikulat melalui sentrifugasi dan periksa segera dan simpan pada suhu -200C. Hindari pembekuan ulang. Serum : Menggunakan serum separator tube (SST) dan biarkan sampel menggumpal selama 30 menit sebelum disentrifugasi selama 10 menit. Buang serum dan periksa segera dan simpan pada suhu -200C. Hindari pembekuan ulang. Plasma : Plasma dikumpul menggunakan antikoagulan EDTA atau sitrat. Disentrifuge selama 30 menit. Pengukuran dilakukan segera dan disimpan

pada suhu -200C. Hindari pembekuan yang

berulang.

Prosedur Pemeriksaan : 1. Persiapkan semua reagen dan standar 2. Untuk serum dan plasma : tambahkan 50 µL diluen RD1C Untuk sel kultur supernate : dimulai pada langkah no.3 3. Tambahkan 200 µL standar atau sampel. Inkubasi selama 2 jam. 4. Aspirasi dan cuci 3 kali 5. Tambahkan 200 µL konjugasi pada masing-masing tabung. Serum/plasma : inkubasi 2 jam Sel kultur supernate : inkubasi 1 jam 6.. Aspirasi dan cuci 3 kali 7.. Tambahkan 200 µL cairan substrat. Inkubasi 20 menit. Lindungi dari cahaya. 8.. Tambahkan 50 µL cairan Stop. Baca pada 490 nm dalam 30 menit. Koreksi λ 540 atau 570 nm.


234

Sensitifitas Kadar minimum

IL-1α yang terdeteksi adalah kurang dari 1,0

pg/mL.

Spesifisitas Alat ini mengenali IL-1α baik yang alami (dari manusia) maupun rekombinan. IL-1 beta Interleukin 1 (IL-1) terbagi atas dua protein, yaitu IL-1α dan IL-1β, yang berperan penting dalam inflamasi akut dan kronik, baik secara lokal maupun sistemik. IL-1β manusia disintesa sebagai 269 asam amino dan 31 kDa protein prekursor. IL-1β diproduksi terutama oleh monosit dan makrofag, selain itu juga astrosit, oligodendroglia, sel korteks adrenal, sel NK, sel endotel, keratinosit, megakariosit, trombosit, neutrofil, osteoblas, sel schwann, trofoblas, sel T, dan fibroblas. Fungsi utama dari IL-1β adalah

inisiasi

inflamasi.

Endotoksin

bakteri

atau

berbagai

substansi inflamasi non bakterial akan meningkatkan produksi IL-1, yang mana akan dilepaskan pada daerah lokal. IL-1 menginduksi sel endotel kapiler untuk mensekresikan kemokin (misalnya MCP-1) dan meningkatkan ekspresi dari molekul sel adhesi (misalnya Eselektin, ICAM-1 dan VCAM-1). MCP-1 mengaktivasi mononuklear sel integrin, memfasilitasi infiltrasi mononuklear. Dengan adanya IL12, IL-1 akan menginduksi sekresi IFN-γ oleh sel NK, sehingga akan mengaktifasi makrofag. Pada akhirnya, IL-1 menginduksi ekspresi

matriks

metaloproteinase

(MMPs),

sehingga

menyebabkan degradasi matriks ekstraseluler dan migrasi monosit. Efek IL-1 tidak hanya terbatas pada inflamasi, melainkan juga pada pembentukan dan remodeling tulang, sekresi insulin, mengatur selera makan, mencetuskan demam, dan lainnya. Pengumpulan Sampel Dan Penyimpanan


235

Sel Kultur Supernates : Buang partikulat melalui sentrifugasi dan periksa segera dan simpan pada suhu -200C. Hindari pembekuan ulang. Serum : Menggunakan serum separator tube (SST) dan biarkan sampel menggumpal selama 30 menit sebelum disentrifugasi selama 15 menit. Buang serum dan periksa segera dan simpan pada suhu -200C. Hindari pembekuan ulang. Plasma : Plasma dikumpul menggunakan antikoagulan sitrat, EDTA atau heparin. Disentrifuge selama 15 menit dalam 30 menit pengumpulan. Pengukuran dilakukan segera dan disimpan pada suhu -200C. Hindari pembekuan yang berulang.

Sensitifitas Kadar minimum

IL-1β yang terdeteksi adalah kurang dari 1,0

pg/mL.

Spesifisitas Alat ini mengenali IL-1β baik yang alami (dari manusia) maupun rekombinan.


236

LAMPIRAN 9 : Prosedur pemeriksaan kadar IL-6 serum. Sistem Amplifikasi Rangkaian alat Quantikine HS Immunoassay menggunakan sistem amplifikasi dimana adanya reaksi alkalin fosfat akan menghasilkan kofaktor yang mengaktifkan siklus redoks yang pada akhirnya menghasilkan bahan yang berwarna. Pada sistem ini, alkalin fosfat akan mendefosfolarisasi NADPH (nicotinamide adenine dinucleotide phosphate) menjadi NADH (nicotinamide adenine

dinucleotide).

Komponen

NADH

selanjutnya

akan

berperan sebagai kofaktor khusus yang mengaktivasi siklus redoks melalui

sistem

enzim

sekunder

yang

terdiri

dari

alkohol

dehidrogenase dan diaforase (amplifier). Reaksi yang dikatalisasi oleh diaforase, NADH akan memecah garam tetrazolium (INT-violet atau iodonitrotetrazolium violet) untuk menghasilkan colored formazan dye dan NAD+. Komponen NAD+ selanjutkan akan dipecah oleh etanol, dalam suatu reaksi katalisasi alkohol dehidrogenase, yang menghasilkan NADH yang kemudian akan kembali masuk dalam siklus redoks. Kecepatan pemecahan garam tetrazolium dan selanjutnya bahan yang berwarna yang terbentuk secara langsung menunjukkan jumlah IL-6. Pengumpulan Dan Penyimpanan Sampel Serum : Menggunakan serum separator tube (SST) dan membiarkan sampel menggumpal selama 30 menit sebelum disentrifugasi selama 15 menit. Serum dibuang dan diukur segera atau disimpan dahulu pada suhu -200C. Hindari pembekuan yang berulang. Plasma : Plasma dikumpul menggunakan antikoagulan EDTA atau sitrat. Disentrifuge selama 15 menit. Pengukuran dilakukan segera atau disimpan dahulu pada suhu -200C. Hindari pembekuan yang


237

berulang. Heparin tidak direkomendasikan digunakan sebagai antikoagulan.

Prosedur pemeriksaan : 1. Persiapkan semua reagen dan standar 2. Tambahkan 100 µL diluen RD1-75 3. Tambahkan 100 µL standar, sampel, atau kontrol. Inkubasi selama 2 jam. 4. Cuci 6 kali 5. Tambahkan 200 µL konjugasi. Inkubasi 2 jam. 6. Cuci 6 kali 7. Tambahkan 50 µL cairan substrat. Inkubasi 60 menit 8. Tambahkan 50 µL cairan Amplifier. Inkubasi 30 menit 9. Tambahkan 50 µL cairan Stop. Baca pada 490 nm dalam 30 menit. Koreksi λ 650 atau 690 nm. Sensitifitas Kadar minimum

IL-6 yang terdeteksi (minimum detectable

dose/MDD) adalah berkisar antara 0,016-0,110 pg/mL. Rata-rata MDD adalah 0,039 pg/mL

Spesifisitas Alat ini mengenali IL-6 baik yang alami (dari manusia) maupun rekombinan.


LAMPIRAN 1 : Universitas Sumatera Utara

Recommend Documents