86
Lampiran 1 Prosedur penentuan lipid serum
1) Prosedur analisis kolesterol total Kolesterol total ditentukan dengan metode enzim cholesterol oxidase-paminophenozone (CHOD-PAP). Prinsip uji Kolesterol dan kolesterol ester dilepaskan dari lipoprotein dengan enzim, selanjutnya dioksidasi secara enzimatik, reaksinadalah: Kolesterol esterase Kolesterol ester +H2O kolesterol + asam lemak Kolesterol oksidase Kolesterol + O2 kolesterol 3-on + H2O2 2H2O2 + phenol + 4-aminoantipyrine
peroksidase
Quinoneimine dye + 4 H2O
Reagen: Reagen enzim (R1) mengandung phenol, kolesterol oksidase, kolesterol esterase, peroksidase dan 4-aminoantipyrine. Reagen standar (R4) mengandung kolesterol, stabil disimpan pada suhu 2-8 oC. Prosedur: Panjang gelombang Suhu Kuvet kaca
: 500 nm, Hg 546 nm : 37 oC : 1 cm
Dipipet ke dalam kuvet
Reagen blanko
Standar
Contoh
Standar 10 µl Standar 10 µl Standar 1000 µl 1000 µl 1000 µl o Dicampur dengan baik, diukur sesudah diinkubasi pada suhu 37 C selama 5 menit. Absorbansi contoh dan standar dibaca terhadap RB dalam waktu 60 menit Pengukuran reagen blanko (RB) dilakukan satu kali untuk satu seri pemeriksaan. Perhitungan 1. Dengan standar Kolesterol = δA contoh/ δA standar x 200 mg/dl atau Kolesterol = δA contoh/ δA standar x 5,16 mmol 2. Dengan faktor Panjang gelombang
C (mg/dl)
C (mmol)
Hg 546
860 x δA
22,2 x δA
87
2) Prosedur analisis HDL Prinsip uji Contoh ditambahkan asam fosfotungsat dan magnesium klorida untuk mengendapkan kilomikron, VLDL, dan LDL dengan cara disentrifus, supernatan mengandung fraksi HDL, kadarnya ditentukan dengan metode enzimatik. Reagen: Reagen mengandung asam fosfotungsta 0,55 mmol/l dan magnesium klorida 25 mmol. Reagen stabil pada suhu 15-25 oC Prosedur: a. Presipitasi (Pengendapan) Dipipet ke dalam kuvet
Makro
Semi Mikro
Contoh Reagen presipitasi (tanpa pengenceran) Reagen presipitasi (diencerkan)
500 µl 1000 µl -
200 µl 500 µl
Dicampur dengan baik, diinkubasi selama 10 menit pada suhu ruang. Sentrifus selama 2 menit pada 10000 g atau 10 menit pada 4000 g/ Setelah disentrifugasi supernatan yang jernih dipisahkan dari endapan dalam waktu satu jam dan tentukan konsentrasi kolestrol dengan metode CHOD-PAP. b. Penentuan Kolestrol Dippet ke dalam kuvet
Reagen Blanko
Contoh
Akuabidestilata Supernatan HDL Reagen CHOD-PAP Kolestrol
100 µl 1000 µl
100 µl 1000 µl
Dicampur dengan baik, diinkubasi selama 10 menit pada suhu ruang. Sentrifus selama 2 menit pada 10000 g atau 10 menit pada 4000 g/ Setelah disentrifugasi supernatan yang jernih dipisahkan dari endapan dalam waktu satu jam dan tentukan konsentrasi kolestrol dengan metode CHOD-PAP. Perhitungan Panjang gelombang
Makro (mg/dl)
Semi Mikro (mg/dl)
Hg 546 nm
C = 280 x A contoh
C = 327 x A contoh
500 nm
C = 188 x A contoh
C = 220 x A contoh
88
Dengan perhitungan dapat ditentukan: LDL-kolesterol (mg/dl) = kolesterol total – trigliserida – HDL-kolestrol atau 5 LDL-kolesterol (mmol/l) = kolesterol total – trigliserida – HDL-kolestrol 2,2 3) Prosedur Analisis LDL Analisis LDL kolesterol serum ditentukan dengan kit Fluidtest LDLCHOL REF 413 LOT D283 dari Biocon Jerman menggunakan metode presipitasi (pengndapan). Prinsip Uji LDL diendapkan dengan heparin pada titik isoelektrik (pH5,12). Setelah disentrifugasi sisda LDL dan VLDL di dalam supernatan dan dapat ditentukan dengan metode enzimatik. Reagen: Reagen mengandung heparin 0,68 g/l, sodium sitrat 0,064 mol/l dan stabilizer 2 %. Reagen ini stabil apabila disimpan pada suhu (2-8) °C. Posedur: a. Presipitasi (Pengendapan) Dippet ke dalam tabung sentrifus Contoh 100 µl Reagen LDL 1000 µl Dicampur dengan baik, didiamkan selama sepuluh menit pada suhu +15 sampai +25 °C dan disentrifus selama 15 menit pada 4000 rpm. Setelah disentrifugasi supernatan yang jernih dipisahkan dari endapan dalam waktu satu jam ditentukan konsentrasi kolesterol dengan metode CHOD-PAP. b. Penentuan Kolesterol Dipipet ke dalam kuvet Reagen Blanko Contoh Akuabidestilata 100 µl Supernatan HDL 100 µl Reagen CHOD-PAP Kolestrol 1000 µl 1000 µl Dicampur dengan baik, diukur sesudah diinkubasi pada 37 °C selama 5 menit atau 10 menit pada suhu 20-25 °C. Dibaca absorbansi contoh terhadap terhadap reagen blanko dalam waktu 60 menit.
89
Perhitungan: Panjang gelombang Makro (mg/dl) Hg 546 nm C = 1028 x A contoh 500 nm C = 950 x A contoh LDL kolesterol = Total kolesterol – LDL koleserol supernatan
4) Prosedur Analisis Trigiliserida Serum Analisis trigiliserida serum ditentukan dengan kit Fluidtest TG REF 5748 LOT D716 dari Biocon Jerman menggunakan metode GPO-PAP merupakan uji kolorimetrik enzimatik. Prinsip uji Trigliserida dihidrolisis secara enzimatis menjadi gliserol menurut reaksi berikut. Trigeliserida Gliserol + ATP G-3-P + O2
LPL
Gliserol + asam lemak bebas GK
GPO
G-3-P + ADP DAP + H2O2
H2O2 + 4-aminoantipyrin + p-khlorofenol
POD
4H2O2 + Quinonimine
Reagen: Reagen R1 (reagen enzim) dan reagen R4 (standar) stabil bila disimpan pada suhu +2 sampai +8 °C dan terlindung dari cahaya. Prosedur: Panjang gelombang : 500-550 nm, Hg 546 nm Suhu : +37 °C Kuvet Kaca : 1 cm Pengukuran terhadap reagen blanko (RB) dilakukan satu kali untuk satu seri pemeriksaan. Dipipet ke dalam Reagen Blanko Standar Contoh kuvet Standar/R4 10 µl Sampel 10 µl Reagen kerja 1000 µl 1000 µl 1000 µl Campur dengan baik, diukur sesudah diinkubasi pada 37 °C selama 5 menit. Dibaca absorbansi contoh dan standar terhadap RB dalam waktu 60 menit. Perhitungan Konsentrasi trigliserida dapat dihitung dengan rumus:
90
Trigliserida (mg/dl)= 200xδA contoh/δA standar atau Trigliserida (mmol/l)= 2,28 x δA contoh/δA standar
91
Lampiran 2 Rata-rata berat badan kelinci (gram) selama periode penelitian Perlakuan Kontrol positif Simvastatin
Minggu
Kontrol
Discodoris sp
ke--
negative
0
1873± 156
1935± 310
1890 ± 309
1892 ± 118
1
1971± 135
2133± 279
2024 ± 315
2008 ± 141
2
2041± 109
2183± 250
2070 ± 284
2058 ± 150
3
2040± 135
2186± 253
2069 ± 236
2067 ± 162
4
2143± 67
2332± 190
2134 ± 261
2067 ± 117
5
2167± 51
2381± 182
2144 ± 240
2163 ± 201
6
2121± 95
2329± 229
2146 ± 264
2180 ± 221
7
2187± 57
2445± 212
2196 ± 256
2231 ± 255
8
2268± 44
2470± 219
2275 ± 305
2329 ± 258
9
2255± 33
2463± 231
2261 ± 270
2299 ± 287
10
2273± 49
2463± 231
2277 ± 255
2297 ± 317
11
2305± 19
2536± 248
2349 ± 327
2307 ± 428
12
2280± 34
2507± 249
2392 ± 374
2297 ± 401
92
Lampiran 3 SGOT dan SGPT darah kelinci setelah 12 minggu perlakuan Perlakuan Ulangan SGOT SGPT 46 60* 1 Kontrol negatif 2 41 34 3 28* 32 77* 93 1 Kontrol positif 2 51 48* 3 62 78 95 87 1 Simvastatin 2 87 94 3 96 99 42 46 1 Discodoris sp 2 75* 63* 3 46 44 * Data outlier yang menyebabkan ukuran keragaman >20%
93
Lampiran 4 Kandungan plasma darah kelinci selama pengamatan Kandungan plasma darah kelinci Perlakuan
Ulangan M0
M4
M8
M4
M8
M12
M0
M4
M8
M12
M0
M4
M8
M12
Kontrol negatif
1 2 3 1
79.8* 41.3 38.4 65.3
41.5 41.5 24.9* 268.3
56.1* 31.7 29.3 324.4
51.6* 31.6 31.6 573.7
74.0* 33.9 49.8 74.7*
42.3 28.1* 46.2 100.5
34.6 50.0* 34.6 156.5
35.5 32.3 51.6* 200.2
30.7 26.5 15.0* 28.5
41.4 47.6 59.3 44.6
59.8 38.2* 68.2 56.9
76.3 64.4 52.2 11.0
34.3* 48.0 41.4 21.9*
20.4 10.2 15.2 159.7
19.3 20.2 12.5* 208.7
50.3 30.4* 40.4 365.2
2 3 1 2 3
54.8 28.8* 50.9* 85.5 96.1
143.9* 268.3 51.2 46.3 97.6*
324.4 656.1* 63.4 78.1 129.3*
571.1 757.9* 128.9* 31.6 44.7
42.8 52.5 53.9 23.4* 51.8
105.5 102.6 42.3* 17.5 19.2
160.7 170.4* 34.6 19.2* 30.8
250.2* 220.5 46.1* 96.8 103.2
13.8* 23.8 27.6 63.3* 28.0
40.6 71.5* 99.3* 63.2 56.5
60.9 40.1* 146.2* 73.9 33.9
46.4* 26.9 52.2* 62.5 62.2
82.4 54.5 82.5 72.3 57.2
91.6* 191.9 66.8 87.5 37.3*
264.5 407.9* 40.4 64.1* 33.8
158.4* 505.2 91.4 74.7 81.1
1
28.8*
112.2
26.8*
68.4
38.0
35.1*
34.6
48.4
15.0
80.9*
106.0
96.2
76.2
38.0
20.3
15.0
2
49.0
119.5
75.6
52.6*
38.7
46.2
30.8
38.7
23.4
58.1
106.1
92.8
87.9
24.3
50.5*
20.0
3
44.2
75.6*
63.4
71.1
36.6
46.2
46.2*
35.5
21.9
60.8
93.5
120.7
75.0
52.2*
20.7
43.3*
Kontrol positif
Simvastatin
Discodoris sp
Kolesterol
Trigliserida M12
M0
* Data outlier yang menyebabkan ukuran keragaman > 20%
HDL
LDL
94
Lampiran 5 Persentasi kondisi sel hati yang mengalami kerusakan Degenerasi Degenerasi Nekrosa Perlakuan Ulangan Normal Hidropis lemak 1 90.92 5.01 0.10 3.97 Kontrol 2 92.77 0.00 0.00* 7.23 negatif 3 27.17* 66.41* 0.09 6.33 4 92.18 3.42 0.00* 4.40 1 43.88 53.02 0.00* 3.10 Kontrol 2 41.91 51.17 3.15 3.76 positif 3 17.77* 77.20 0.36 4.67 4 37.76 19.63* 37.09* 5.51* 1 87.26 2.60* 2.46 7.67 2 65.93* 21.26 3.59 9.22 Simvastatin 3 92.68 29.89 5.04 12.97* 4 87.76 1.50* 0.68* 10.07 1 86.16 0.98* 0.00 6.60 2 62.67* 32.10* 0.00 5.24 Discodoris sp 3 91.36 1.57 0.00 7.07 4 83.29 9.69 0.29* 6.74 * Data outlier yang menyebabkan ukuran keragaman > 20% Lampiran 6 Persentase endapan protein pada glomerulus ginjal kelinci percobaan Perlakuan Ulangan Endapan protein 3* 1 2 0* Kontrol negatif 3 1.1 4 1.66 2.58 1 2 0.9* Kontrol positif 3 3.56 4 1.96 7.8 1 2 4.94 Simvastatin 3 0* 4 0* 6.1* 1 2 9.02 Discodoris sp 3 10.76 4 11.08 * Data outlier yang menyebabkan ukuran keragaman >20%
95
