Lampiran 1. Pembuatan Media Natrium Agar

59

Lampiran 1. Pembuatan Media Natrium Agar Pembuatan Media Agar Natrium Agar (150 mL) 1. Siapkan gelas Erlenmeyer volume 250 ml dan air laut steril 150 mL. 2. Timbang natrium agar sebanyak 4,2 gram 3. Masukkan natrium agar ke dalam erlenmeyer lalu tuang air laut steril. 4. Panaskan media di atas hot plate hingga mendidih dan homogen. 5. Tutup erlenmeyer dengan kapas yang telah dibungkus dengan kassa. 6. Sterilisasi media menggunakan autoclave selama 15 menit pada suhu 121 oC 7. Setelah di autoclave, media didinginkan hingga suhu 45 – 50oC 8. Tuangkan media tersebut ke dalam cawan petri yang sudah steril sebanyak 8 – 10 ml dan biarkan membeku dalam keadaan tertutup.

Pemanasan Nutrient Agar

Nutrient Agar

60

Lampiran 2. Pembuatan Kultur Bakteri Vibrio harveyi dengan Kepadatan Sel 107 CFU/ml 1.

Larutan McFarland skala 0,5 dibuat dengan 0,05 mL BaCl2 1% dan 9,95 mL H2SO4 1% ke dalam tabung reaksi kemudian diukur absorbansinya dengan menggunkan spektrofotometer pada panjang gelombang 600 nm.

2.

Isolat bakteri uji yang berada dalam cawan petri diambil dengan menggunakan kawat ose sebanyak 2-3 ose kemudian dilarutkan ke dalam 10 mL air laut steril.

3.

Bandingkan larutan bakteri yang telah dilakukan dengan larutan McFarland.

4.

Sebanyak 0,01 mL larutan bakteri dituang ke dalam media agar.

Larutan Vibrio harveyi dan Standar McFarland

Penuangan Larutan Bakteri dalam Media Agar

61

Lampiran 3. Koordinat dan Data Parameter Fisik dan Kimia Perairan Lokasi Pengambilan Sampel Koordinat Lokasi Pengambilan Sampel: Area Perlindungan Laut (APL) : S 544’ 0,48” E 106 36’ 39,8” Perairan Semak Daun (PSD) : S 544’ 04,9” E 106 36’ 39,6” Perairan Panggang (PP) : S 544’ 00,5” E 106 34’ 05,7”

1. Suhu (°C) Koordinat APL PSD PP

I 29 28 30

Ulangan II 29 29 29

III 29 29 29

Rata-rata (°C) 29 28 29

I 28 28 26

Ulangan II 29 30 27

III 29 30 27

Rata-rata (‰) 28,6 29,3 26,6

I 100 100 100

Ulangan II 100 100 100

III 100 100 100

2. Salinitas (‰) Habitat APL PSD PP 3. Kecerahan (%) Habitat APL PSD PP

Rata-rata (%) 100 100 100

4. Kecepatan arus (m/s) Habitat APL PSD PP

I 0,14 0,13 0,10

Ulangan II 0,17 0,06 0,10

III 0,17 0,07 0,09

Rata-rata (m/s) 0,16 0,08 0,09

62

Lampiran 4. Ekstraksi Ascidian Didemnum molle

Sampel Ascidian Didemnum molle Dikeringkan Ascidian Didemnum molle kering Dihaluskan menggunakan blender Serbuk Ascidian Didemnum molle Dimaserasi 1x24 jam dengan pelarut Metanol Disaring

Ampas

Filtrat Diuapkan dengan Rotary Evaporator Ekstrak Pasta

Diagram Alir Ekstraksi Ascidian Didemnum molle

63

Lanjutan Lampiran 4

64

Lampiran 5. Pembuatan Konsentrasi Ekstrak pada Saat In Vitro

Ascidian Didemnum molle

1 ppm = 1 mg/L = 0,001 g/L Larutan Stok 100.000 ppm dalam 10 mL 100.000 ppm = 0,001 g/L =

0,001 g x 100.000 1000 mL

= 1 g/10 mL

Pengenceran dilakukan dengan menggunakan Jembatan Stok V1 = Volum larutan stok yang dibutuhkan V2 = Volum pengenceran yang akan dibuat M1 = Konsentrasi larutan stok M2 = Konsentrasi pengenceran yang akan dibuat

Konsentrasi 10.000 ppm V1 x M1

= V2 x M2

V1 x 100.000 ppm = 5 mL x 10.000 ppm V1

= 50000/100000 = 0,5 mL

0,5 mL dari larutan stok ditambah dengan 4,5 mL akuades

Konsentrasi 1.000 ppm V1 x M1

= V2 x M2

V1 x 100.000 ppm = 5 mL x 1.000 ppm V1

= 5000/100000 = 0,05 mL

0,05 mL dari larutan stok ditambah dengan 4,95 mL akuades

65

Lanjutan Lampiran 5.

Konsentrasi 100 ppm V1 x M1

=V2 x M2

V1 x 100.000 ppm = 5 mL x 100 ppm V1

= 500/100000

V1

= 0,005 mL

0,005 mL dari larutan stok ditambah dengan 4,995 mL akuades

Konsentrasi 10 ppm V1 x M1

= V2 x M2

V1 x 100.000 ppm = 5 mL x 10 ppm V1

= 500/100000 = 0,0005 mL

0,0005 mL dari larutan stok ditambah dengan 4,9995 mL akuades

Larutan Ekstrak Ascidian Didemnum molle Berdasarkan Perlakuan yang digunakan pada Uji Aktivitas Antibakteri

66

Lampiran 6. Diameter Zona Hambat Ekstrak Didemnum molle Terhadap Bakteri Vibrio harveyi

67

Lampiran 7. Pembuatan Konsentrasi Ekstrak Ascidian Didemnum molle pada Uji LC50 Konsentrasi larutan stok yang digunakan adalah 10.000 ppm dalam volum 500 mL 10.000 ppm = 10 g/L =

10 g 1L

×

1L 1000

×500 mL

=5 Untuk mendapatkan konsentrasi 10.000 ppm dilarutkan 5 gram ekstrak dalam 500 mL akuades.

Pengenceran dilakukan dengan menggunakan Jembatan Stok V1 = Volum larutan stok yang dibutuhkan V2 = Volum pengenceran yang akan dibuat M1 = Konsentrasi larutan stok M2 = Konsentrasi pengenceran yang akan dibuat Konsentrasi 1000 ppm V1 x M1

= V2 x M2

V1 x 10.000 ppm = 500 mL x 1.000 ppm V1

= 500.000/10.000 = 50 mL

50 mL dari larutan stok ditambah dengan 450 mL akuades

Konsentrasi 100 ppm V1 x M1

= V2 x M2

V1 x 10.000 ppm = 500 mL x 100 ppm V1

= 50.000/10.000 = 5 mL

5 mL dari larutan stok ditambah dengan 495 mL akuades

68

Lanjutan Lampiran 7

Konsentrasi 10 ppm V1 x M1

= V2 x M2

V1 x 10.000 ppm = 500 mL x 10 ppm V1

= 5.000/10.000 = 0,5 mL

0,5 mL dari larutan stok ditambah dengan 499,5 mL akuades

Larutan Ekstrak Ascidian Didemnum molle Berdasarkan Perlakuan yang Digunakan pada Uji LC50

69

Lampiran 8. Data Pengamatan Mortalitas Udang Windu pada Uji LC 50 Selama 48 jam

Lama Perendaman 15 menit 30 menit 1 jam 2 jam 4 jam 6 jam 8 jam 16 jam 24 jam 48 jam Total

I 0

Jumlah Udang yang Mati pada Konsentrasi (ppm) 0 10 100 1000 10000 II I II I II I II I II 2 2 1 1 1 1 1 1 1 1 3 1 2 2 2 1 0 0 0 0 1 4 6 6 6

70

Lampiran 9. Hasil Perhitungan LC50 dengan Menggunakan EPA Probit EPA PROBIT ANALYSIS PROGRAM USED FOR CALCULATING LC/EC VALUES Version 1.5 LC50 Didemnum molle Conc.

Number Exposed

10 100 1000 10000

12 12 12 12

Number Responding

Observation Proportion Responding

0 1 10 12

Chi - Square for Heterogeneity (calculated)

0,0000 0,0833 0,8333 1,0000

Proportion Predicted Responding Proportion Adjused for Responding Controls 0,0000 0,0001 0,0833 0,0822 0,8333 0,8352 1,0000 0,9996

= 0.007

Chi - Square for Heterogeneity (tabular value at 0.05 level) Mu Sigma

= =

= 5.991

2.587787 0.422818

Parameter Estimate Std. Err. 95% Confidence Limits --------------------------------------------------------------------Intercept -1.120327 1.729846 ( -4.510825, 2.270170) Slope 2.365082 0.652672 ( 1.085844, 3.644320) Theoretical Spontaneous Response Rate = 0.0000 Estimated LC/EC Values and Confidence Limits Point Exposure 95% Confidence Limits Conc. Lower Uper LC/EC 1.00 40.196 2.304 104.992 LC/EC 5.00 78.036 9.253 170.563 LC/EC 10.00 111.148 19.080 224.825 LC/EC 15.00 141.116 30.726 274.165 LC/EC 50.00 387.067 180.124 810.578 LC/EC 85.00 1061.685 551.051 4592.272 LC/EC 90.00 1347.940 674.208 7370.954 LC/EC 95.00 1919.908 891.534 15151.202 LC/EC 99.00 3727.254 1452.826 60656.582

71

Lampiran 10. Pembuatan Konsentrasi Ekstrak Ascidian Didemnum molle pada Uji Tantang

1 ppm = 0,001 g/L Ekstrak dibuat dalam 1 liter air laut. Perlakuan B (96,75 ppm) 96,75 ppm = 0,001 g/L = 0,001 x 96,75 = 0,09675 g/L Perlakuan C (193,5 ppm) 193,5 ppm = 0,001 g/L = 0,001 x 193,5 = 0,1935 g/L Perlakuan D (96,75 ppm) 290,25 ppm = 0,001 g/L = 0,001 x 290,25 = 0,29025 g/L Perlakuan E (387 ppm) 387 ppm = 0,001 g/L = 0,001 x 387 = 0,387 g/L

Larutan Ekstrak Ascidian Didemnum molle Berdasarkan Perlakuan yang Digunakan pada Uji Tantang

72

Lampiran 11. Dokumentasi Penelitian

Salah Satu Lokasi Pengambilan Sampel

Pengukuran Diameter Zona Hambat Menggunakan Jangka Sorong

Bakteri Vibrio harveyi yang Digunakan dalam Penelitian

73

Lanjutan Lampiran 11

Media Pemeliharaan Selama Penelitian

Benih Udang Windu yang Mati