85
Lampiran 1: Skema Pembuatan Stok Kultur Agar Miring Lactobacillus plantarum pada MRS agar miring
Di ambil satu ose lalu dicelupkan ke dalam MRS broth 10 ml
Dihomogenisasi dengan vortex Di inkubasi pada suhu 300C selama 48 jam
Isolat Lactobacillus plantarum dalam MRS broth
Dihomogenisasi dengan vortex
Di celupkan ujung oose steril pada larutan kultur cair
Digoreskan pada MRS agar miring
Stok kultur agar miring Lactobacillus plantarum
86
Lampiran 2: Skema Uji Ketahanan Lactobacillus plantarum Terhadap pH Asam Dilakukan kurva pertumbuhan bakteri Lactobacillus plantarum sebelum perlakuan terhadap uji probiotik Hasil Kultur stok cair Lactobacillus plantarum yang tumbuh pada MRS broth (300C, 24 jam)
Dihomogenisasi dengan vortex
Diinokulasikan sebanyak 1 ml ke dalam 10 ml MRS broth baru Diinkubasi pada 300C selama 18 jam
Diinokulasikan sebanyak 1 ml ke dalam 9 ml MRS broth baru (pH diatur menjadi 2, 3, dan 4 dengan menambahkan HCl 1 N Ditumbuhkan dalam MRS agar Diinkubasi pada suhu 300C selama 24 jam
Dihitung jumlah koloni yang tumbuh
87
Lampiran 3: Skema Uji Ketahanan Lactobacillus plantarum Terhadap Garam Empedu 0,3 % (b/v) Kultur stok cair bakteri asam laktatyang tumbuh pada MRS broth (300 C, 24 jam)
Dihomogenisasi dengan vortex
Diinokulasikan sebanyak 1 ml ke dalam 10 ml MRSB baru Diinkubasi pada suhu 300C selama 18 jam
Diinokulasikan sebanyak 1 ml ke dalam 9 ml MRSB baru yang mengandung Oxgall 0,3% (b/v) garam empedu
Ditumbuhkan dalam MRSA Diinkubasi pada suhu 300C selama 24 jam
Dihitung jumlah koloni yang tumbuh
88
Lampiran 4: Skema Uji Ketahanan Lactobacillus plantarum Terhadap Bakteri Patogen a) Langkah ke-1 Masing-masing kultur bakteri patogen (Escherichia coli, Staphylococcus aureus dan Salmonella typhi)
Dinokulasikan sebanyak 1 oose ke dalam 10 ml NB Diinkubasi pada suhu 300C selama 24 jam b) Langkah ke-2 Kultur stok cair Lactobacillus plantarum hasil isolasi dari usus itik Mojosari yang tumbuh pada MRS broth (300C, 24 jam)
Diinokulasikan sebanyak 1 ml ke dalam 10 ml MRS broth baru Diinkubasi pada suhu 300C selama 18 jam c) Langkah ke-3 Bakteri patogen (Escherichia coli, Staphylococcus aureus dan Salmonella typhi) yang tumbuh dalam NB (300C, 24 jam) Diinokulasikan ke dalam NA sebanyak 25 µl secara pour plate
Dituang media NA dan dibiarkan sampai padat d) Langkah ke-4 Dibuat sumuran (diameter 6 mm) dalam media NA
Dinokulasikan sebanyak 50 µl di dalam lubang sumuran tersebut Diinkubasi pada suhu 300C selama 24 jam Diukur zona hambat yang terbentuk
89
Lampiran 5: Skema Uji Interaksi Lactobacillus plantarum Terhadap Bakteri Non-Patogen a) Langkah ke-1 Kultur bakteri non-patogen (Lactobacillus paracasei)
Dinokulasikan sebanyak 1 oose ke dalam 10 ml MRS broth
Diinkubasi pada suhu 300C selama 24 jam
b) Langkah ke-2 Kultur stok cair Lactobacillus plantarum hasil isolasi dari usus itik Mojosari yang tumbuh pada MRS broth (300C, 24 jam)
Diinokulasikan sebanyak 1 ml ke dalam 10 ml MRS broth baru
Diinkubasi pada suhu 300C selama 18 jam
c) Langkah ke-3 Bakteri non-patogen (Lactobacillus paracasei) yang tumbuh dalam MRS broth (300C, 24 jam)
Lactobacillus paracasei diinokulasikan ke dalam cawan petri sebanyak 50µl secara pour plate
Dituang MRS agar dan dibiarkan sampai padat
90
d) Langkah ke-4 Dibuat sumuran (diameter 6 mm) dalam media MRSA
Diinokulasikan sebanyak 50 µl kultur Lactobacillus plantarum didalam lubang sumuran tersebut Diinkubasi pada suhu 300C selama 24 jam
Diamati dengan hasil kedua koloni bakteri menyatu
91
Lampiran 6: Data Hasil Uji Probiotik 6.1 Data awal jumlah sel bakteri Lactobacillus plantarum sebelum perlakuan Jam ke0 1 3 4 6 8 13 16 18 24
OD (optical density) 0,14 0,642 1,432 2,049 3,169 3,604 4 11,14 11,75 14,6
∑ sel bakteri (sel/ml) 1,7. 109 7,8. 108 4,7. 109 7,8. 109 1,3. 1010 1,6. 1010 1,8. 1010 5,3. 1010 5,6. 1010 7,1. 1010
fp 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
6.2 Data Uji Ketahanan Terhadap pH asam pH 2 3 4
Jumlah awal sel bakteri (CFU/ml) 1. 109 1. 109 1. 109
Jumlah sel bakteri (CFU/ml) 4,3. 107 3,8. 109 2,7. 1010
6.3 Data Uji Ketahanan Terhadap Garam Empedu 0,3 % (b/v) Perlakuan 0,3 %
Jumlah awal sel bakteri (CFU/ml) 1. 108
Jumlah sel bakteri (CFU/ml) 1,2. 109
Kontrol 1,4. 109 CFU/ml
2.3 Data Uji Ketahanan Terhadap Bakteri Patogen Perlakuan Bakteri patogen Escherichia coli Staphylococcus aureus Salmonella typhi
Diameter zona hambat (mm) Ulangan 1 Ulangan 2 Ulangan 3 10 13 15 17 14 9 9 9 10
Rata-rata 12,7 13,3 9,3
92
Lampiran 7: Gambar Hasil Pengamatan 7.1 Gambar uji interaksi Lactobacillus plantarum dengan Lactobacillus paracasei
a a
b a
Koloni antara L. plantarum (a) dengan L. paracasei (b) menyatu 7.2 Gambar sel bakteri Lactobacillus plantarum (anak panah) yang diisolasi dari usus halus itik Mojosari (Anas plathyrinchos) berbentuk batang
7.3 Gambar uji ketahanan Lactobacillus plantarum terhadap pH 2, 3 dan 4
Uji ketahanan L. plantarum terhadap pH 2 sebelum inkubasi
Uji ketahanan L. plantarum terhadap pH 2 setelah inkubasi
93
Uji ketahanan L. plantarum terhadap pH 3 sebelum inkubasi
Uji ketahanan L. plantarum terhadap pH 4 sebelum inkubasi
Uji ketahanan L. plantarum terhadap pH 3 setelah inkubasi
Uji ketahanan L. plantarum terhadap pH 4 setelah inkubasi
7.4 Gambar uji ketahanan Lactobacillus plantarum terhadap garam empedu 0,3% (b/v)
Uji ketahanan L. plantarum terhadap garam empedu sebelum inkubasi
Uji ketahanan L. plantarum terhadap garam empedu setelah inkubasi
94
7.5 Gambar uji ketahanan Lactobacillus plantarum terhadap bakteri patogen 7.5.1 Uji Ketahanan Terhadap Escherichia coli (tanda anak panah menunjukkan zona hambat Lactobacillus plantarum terhadap bakteri uji)
Ulangan 1
Ulangan 2
Ulangan 3
7.5.2 Uji Ketahanan Terhadap Staphylococcus aureus (tanda anak panah menunjukkan zona hambat Lactobacillus plantarum terhadap bakteri uji)
Ulangan 1
Ulangan 2
Ulangan 3
7.5.3 Uji Ketahanan Terhadap Salmonella typhi (tanda anak panah menunjukkan zona hambat Lactobacillus plantarum terhadap bakteri uji)
Ulangan 1
Ulangan 2
Ulangan 3
95
Lampiran 8: Komposisi Media No 1
Media MRSB (deMan Rogosa Sharpe Broth) Merck GaA, Germany 100 ml
2
MRSA (deMan Rogosa Sharpe Agar) Merck GaA, Germany 100 ml
3
NB (Nutrient Broth)
4
NA (Nutrient Agar)
Komposisi gr/l 20 g/l dektrosa 10 g/l pepton 8 g/l beef extract 5 g/l Na-asetat 4 g/l yeast extract 2 g/l dipotasium fosfat 1 g/l tween 80 2 g/l diamonium sitrat 0,2 g/l magnesium sulfat dan 0,05 g/l mangan sulfat 20 g/l dektrosa 10 g/l pepton 8 g/l beef extract 5 g/l Na-asetat 4 g/l yeast extract 2 g/l dipotasium fosfat 1 g/l tween 80 2 g/l diamonium sitrat 0,2 g/l magnesium sulfat dan 0,05 g/l mangan sulfat 14 g/lAgar 1 g/l beef extract 2 g/l yeast extract 5 g/l pepton 5 g/l NaCl pH 7,4±0,2 1 g/l beef extract 2 g/l yeast extract 5 g/l pepton 5 g/l NaCl pH 7,4±0,2 serta 0,85% agar
96
Lampiran 9: Alat dan Bahan Penelitian
Autoclave
Hot plate
Shaker incubator
b
a
Laminar Air Flow
Timbangan analitik
Vortex mixer
c e
f
a
a
b
c a
a
d
a
a
a
d
f
g a
h i e
5) Peralatan gelas (a. Gelas ukur, b. Erlenmeyer, c. Beaker glass, d. Corong, e. Tabung reaksi, f. Cawan petri)
a
a
6) a). Rak tabung reaksi, b. Blue tip, c. Sendok, d. Gunting, e. Spatula, f. Penggaris, g. Stirer, h. Jarum oose, i. Pipet tetes
Mikropipet 1000 µL dan 200µL
97
Colony counter
Kulkas penyimpan bahan
Bor (sumuran)
Spektrofotometer
Isolat Bakteri asam laktat
Media MRSA dan MRSB
