LAMPIRAN Lampiran 1. Pembuatan Larutan Stok dan Buffer A. LARUTAN STOK CTAB 5 % (100 ml) -
Ditimbang NaCl sebanyak 2.0 gram
-
Ditimbang CTAB sebanyak 5.0 gram.
-
Dimasukkan bahan kimia ke dalam erlenmeyer dan ditambahkan 100 ml aquades.
Tris HCl 1 M pH 8.0 (100 ml) -
Ditimbang Tris sebanyak 12.114 gram.
-
Dimasukkan Tris ke dalam erlenmeyer dan ditambahkan 80 ml aquades, diaduk di atas hot plate menggunakan stirrer.
-
Diatur pH mencapai 8 dengan HCl (4.2 ml)
-
Dimasukkan ke dalam gelas ukur, lalu ditambahkan aquades hingga volume larutan mencapai 100 ml.
-
Disterilisasi dengan autoklaf.
Tris HCl 1 M pH 7.4 (50 m) -
Ditimbang Tris sebanyak 6.057 gram.
-
Dimasukkan Tris ke dalam erlenmeyer dan ditambahkan 30 ml aquades, diaduk di atas hot plate menggunakan stirrer.
-
Diatur pH mencapai 7.4 dengan NaOH 2.5 M.
-
Dimasukkan ke dalam gelas ukur lalu ditambahkan aquades hingga volume larutan mencapai 50 ml.
-
Disterilisasi dengan autoklaf.
EDTA O.5 M pH 8.0 (100 ml) -
Ditimbang EDTA (ethylenediamine tetraacetic) sebanyak 18.612 gram
Universitas Sumatera Utara
29
-
Ditimbang NaOH sebanyak 2.0 gram.
-
Dimasukkan ke dalam erlenmeyer dan ditambahkan 80 ml aquades, diaduk di atas hot plate menggunakan stirrer.
-
Diatur pH mencapai 8 dengan HCl.
-
Dimasukkan ke dalam gelas ukur, lalu ditambahkan aquades hingga volume larutan mencapai 100 ml.
-
Disterilisasi dengan autoklaf.
NaCl 5 M pH 7.7 (l00 ml) -
Ditimbang NaCl sebanyak 29.22 gram.
-
Masukkan ke dalam erlenmeyer dan ditambahkan 80 ml aquades, diaduk di atas hot plate menggunakan stirrer.
-
Dimasukkan ke dalam gelas ukur, , lalu ditambahkan aquades hingga volume larutan mencapai 100 ml.
-
Disterilisasi dengan autoklaf.
B. LARUTAN BUFFER Buffer Ekstraksi/CTAB (100 ml) -
Dicampurkan 40 ml CTAB 5%, 25.1 ml NaCl 5 M, 4 ml EDTA 0.5 M pH 8.0, 10 ml Tris HCl 1 M pH 8.0 dan 20.8 ml aquades.
Buffer TAE 50 X (100 ml) -
Dicampurkan 24.2 ml Tris HCl 1 M pH 7.4, 5.7 ml Asam Asetat Glasial, 10 ml EDTA 0.5 M PH 8.0, dan aquades hingga volume larutan menjadi 100 ml.
Buffer TAE 1X (700 ml) -
Dilarutkankan 70 ml Buffer TAE 10 X dengan dan 630 ml aquades.
Buffer TE (50 ml) -
Dicampurkan 0.5 ml Tris HCl 1 M pH 8.0, 0.1 ml EDTA 0.5 M pH 8.0 dan 49.4 ml aquades.
Universitas Sumatera Utara
30
KIAA (Kloroform : Isoamilalkohol = 24 : 1 (50 ml) -
Dicampurkan 48 ml Kloroform dan 2 ml Isoamilalkohol.
Etanol 70 % (100 ml) -
Dicampurkan 70 ml Etanol dengan 30 ml aquades.
Universitas Sumatera Utara
31
Lampiran 2. Alur Penelitian Sampel Daun Bawang Merah
Isolasi DNA
Uji Kuantitas
PCR-RAPD
Elektroforesis
Analisis Hasil mplifikasi PCR
Universitas Sumatera Utara
32
Lampiran 3. Proses Isolasi dan Purifikasi
Sterilisasi alat dan bahan dengan autoklaf (121 oC 1 atm) Daun dibersihkan dan ditimbang sampel 3 gr
Daun digerus ditambahkan 0.1 g PVPP dan 0.5 ml b.e CTAB
Dimasukkan ke tabung mikro 2 ml yang diisi 1 ml b.e CTAB Ditambahkan 10 µl β-mercaptoetanol, lalu divortex hingga rata.
Tabung diinkubasi dalam waterbath selama 30 menit pada suhu 650C, setiap 10 menit sekali tabung dibolak balik dengan perlahan
Ditambahkan 1 ml larutan KIAA ke dalam tabung dan dikocok hingga homogen.
Tabung disentrifugasi selama 10 menit kecepatan 13.000 rpm
Fase atas dipindahkan ke tabung lain, ditambahkan 1 ml larutan KIAA. Tabung disentrifugasi selama 10 menit kecepatan 13.000 rpm
Fase atas dipindahkan ke tabung lain, ditambahkan 1 ml isopropanol dingin
Tabung dikocok perlahan dan diperhatikan adanya benang-benang halus putih yang muncul. Inkubasi suhu 4oC selama 30 menit.
Tabung disentrifugasi selama 10 menit kecepatan 13.000 rpm, lalu cairan isopropanol dibuang
Setelah cairan dibuang, kemudian pellet dicuci dengan etanol absolut lalu dikeringanginkan
Universitas Sumatera Utara
33
Ditambahkan 30 µl buffer TE dan pellet DNA disuspensikan ke dalam buffer. Stok DNA yang diperoleh disimpan salam freezer pada suhu ± 20 oC bila tidak digunakan.
Universitas Sumatera Utara
34
Lampiran 4. Proses PCR-RAPD Komposisi Master Mix volume 25 µl
Go Taq PCR
12.5 µl
Nuclease free wter
8.0 µl
Primer c.p
2.5 µl
DNA templak
2.0 µl
Tabel 1. Proses Amplifikasi PCR No. 1 2 3 4 5 6
Tahapan Denaturasi awal Denaturasi Annealing Ekstension Ekstension akhir Kondisi akhir PCR
Suhu 94 oC 94 oC 36 oC 72 oC 72 oC 4 oC Total waktu
Jumlah Siklus 1 45 45 45 1 1
Waktu 2 menit 1 menit 1 menit 2 menit 10 menit Tak terbatas ± 3 jam 51 menit
Universitas Sumatera Utara
