39
Lampiran 1. Pembuatan Larutan Buffer untuk Dialisa Larutan buffer yang digunakan pada proses dialisa adalah larutan buffer Asetat 10 mM pH 5,4 dan buffer Asetat 20 mM pH 5,4. Larutan buffer asetat 10 mM pH 5,4 sebanyak 200 mL dibuat dengan mencampur 171 mL larutan natrium asetat (CH3COONa) 10 mM dengan 29 mL larutan asam asetat (CH3COOH) 10 mM. Setelah homogen, pH nya diukur dengan pH meter. Larutan natrium asetat 10 mM dibuat dengan melarutkan 1,361 g CH3COONa.3H2O dalam 1000 mL aquades. Sementara larutan asam asetat 10 mM dibuat dengan mencampur 0,057 mL larutan asam asetat glacial dalam 800 mL aquades, dihomogenkan dan ditambah aquades hingga volumenya 1000 mL. Larutan buffer asetat 20 mM pH 5,4 sebanyak 200 mL dibuat dengan mencampur 171 mL larutan natrium asetat (CH3COONa) 20 mM dengan 29 mL larutan asam asetat (CH3COOH) 20 mM. Setelah homogen, pH nya diukur dengan pH meter. Larutan natrium asetat 10 mM dibuat dengan melarutkan 2,722 g CH3COONa.3H2O dalam 1000 mL aquades. Sementara larutan asam asetat 10 mM dibuat dengan mencampur 0,114 mL larutan asam asetat glacial dalam 800 mL aquades, dihomogenkan dan ditambah aquades hingga volumenya 1000 mL.
40
Lampira 2. Pemekatan yang Terjadi selama Presipitasi Garam dan Dialisa
Rennet ekstrak kasar
45 mL
Konsentrasi mukosa abomasum 50% b/v
Presipitasi garam Penambahan buffer Hasil dialisa
Endapan 4 mL 7 mL
321,43% b/v
Tahapan Pemurnian
Volume
Konsentrasi untuk uji koagulasi 4% v/v (0,4 mL dalam 9,6 mL susu) 1% v/v (0,01 mL dalam 9,99 mL susu)
Peningkatan konsentrasi Penurunan volume rennet dari 45 mL ekstrak kasar hingga menjadi 7 mL hasil dialisa mengindikasikan adanya pemekatan dari konsentrasi 50% b/v hingga menjadi 321,43% b/v. Konsentrasi untuk uji koagulasi
Ekstrak kasar
=
4% (v/v)
=
0,4 mL dalam 9,6 mL susu
Mukosa Abomasum dalam 0,4 mL ekstrak kasar =
50 100
× 0,4 mL = 0,2 g
Volume hasil dialisa yang seharusnya digunakan dalam uji dialisa untuk mendapatkan konsentrasi mukosa abomasum yang sama (y) : Mukosa abomasum y
= =
321,43 100
× y = 0,2 g
0,06 mL (dalam 9,94 mL susu)
Konsentrasi hasil dialisa yang seharusnya digunakan dalam uji koagulasi =
0,6% (v/v) (namun pada metode penelitian digunakan 1% (v/v))
41
Lampiran 3. Persiapan Running SDS-PAGE Pembuatan larutan buffer Larutan buffer yang digunakan dalam proses elektroforesis adalah tris HCl 1,5 M pH 8,8, tris HCl 0,5 M pH 6,8, dan running buffer. Tris HCl 1,5 M pH 8,8 dibuat dengan mencampur tris base 54,45 gr dan aquades 150 ml. Setelah homogen, pH-nya diatur hingga mencapai 8,8 dengan penambahan NaOH atau HCl dan selanjutnya ditambah aquades sampai volumenya 300 ml. Tris HCl 0,5 M pH 6,8 dibuat dengan campuran tris base sebanyak 6 gr, dan aquades 60 ml yang jika telah homogen, maka pH-nya diatur hingga mencapai 6,8 dengan penambahan NaOH atau HCl. Kemudian aquades ditambahkan sampai volumenya 100 ml. Langkah pertama yang dilakukan untuk pembuatan running buffer adalah pembuatan stock buffer. Stock buffer dibuat dengan campuran tris base 1,5 gr; glycine 7,2 gr; dan SDS 0,5 gr. Setelah itu, campuran dihomogenkan dan untuk membuat running buffer 1x yang siap dipakai, maka 100 ml stock buffer ditambah dengan 400 ml aquades. Larutan tersebut kemudian diatur pH-nya dengan menambah NaOH atau HCl sampai pH mencapai 8,3.
Pembuatan Gel Elektroforesis Gel untuk elektroforesis terdiri dari dua yaitu separating gel dan stacking gel. Separating gel dibuat dengan mencampurkan 4 ml bisakrilamid, 3,35 ml aquades, 2,5 ml tris HCl pH 8,6, 0,1 ml SDS 10%, 5 µl TEMED, dan 50 µl ammonium persulfat 10%. Semua bahan tersebut dihomogenkan dalam gelas ukur, kemudian dimasukkan sedikit demi sedikit ke dalam lempeng kaca pembentuk gel sampai memenuhi tiga perempat lempeng kaca tersebut. Separating gel dibuat terlebih dahulu, kemudian stacking gel. Setelah separating gel mulai memadat, stacking gel dimasukkan dan sisir tempat memasukkan sampel dipasang kemudian biarkan beberapa lama hingga gel memadat. Stacking gel dibuat dengan campuran 0,65 ml bisacrilamide, 3,05 ml aquades, 1,25 ml tris HCl pH 6,8, 50 µl SDS 10%, 5 µl TEMED, dan 25 µl ammonium persulphate 10%. Apabila gel telah memadat, maka sisir dilepas dan lempeng kaca dimasukkan ke dalam chamber alat elektroforesis
42
Proses Running SDS-PAGE Chamber yang telah dipasang lempeng kaca diisi dengan running buffer 1X sampai kira-kira bagian bawah gel terendam minimal setinggi 1 cm. Bagian atas chamber juga diisi dengan running buffer 1X. Setelah itu, sampel dimasukkan dalam masing-masing sumur gel. Sumur pertama gel diisi dengan marka protein yang memiliki berat molekul (BM) standar. Sampel tersebut terdiri dari 6 µl Laemmli sample dan 12 µl supernatan. Chamber ditutup dan kabel dipasang. Kemudian alat diatur dengan kuat arus listrik 25 mA dan tegangan sebesar 135 V, serta waktu 300 menit. Setelah selesai, gel dilepas dari lempeng kaca secara perlahan agar tidak rusak dan gel diwarnai dengan pewarnaan silver.
Pewarnaan silver untuk SDS-PAGE Larutan pewarna harus dibuat segar tidak lebih dari 24 jam agar memberikan hasil terbaik. Proses pewarnaan meliputi tahapan sebagai berikut: a. Proses fiksasi dilakukan selama 30 menit. Larutan fiksasi dibuat dengan mencampurkan 100 ml etanol absolute dengan 25 ml asam asetat glasial, lalu ditambah aquades hingga volume mencapai 250 ml. b. Proses sensitisasi dilakukan selama 30 menit sambil digoyangkan secara perlahan-lahan. Cara membuat larutan ini adalah mencampur 75 ml etanol absolute dengan 1,25 ml glutardialdehid, 10 ml sodium tiosulfat, dan 10 ml sodium asetat, lalu ditambah aquades hingga volume mencapai 250 ml. c. Gel dicuci dengan aquades selama 5 menit dengan 3 kali pengulangan. d. Proses pewarnaan dilakukan selama 20 menit sambil menggoyangkan wadahnya secara perlahan-lahan. Pembuatannya adalah mencampur 25 ml larutan silver nitrat dengan 0,1 ml formaldehid, lalu aquades ditambahkan hingga volume mencapai 250 ml. e. Gel dicuci kembali dengan aquades selama 1 menit sebanyak 2 kali pengulangan. f. Proses developing dilakukan selama 2 menit, hingga larutan developing tampak berwarna coklat. Proses ini menggunakan campuran sodium karbonat dengan 0,05 ml formaldehid, lalu ditambah dengan aquades
43
hingga volume mencapai 250 ml. Campuran dikocok secara perlahan hingga bening. g. Proses stopping selama 10 menit menggunakan EDTA-Na2.2H2O (3.65 g) ditambah dengan aquades hingga volume mencapai 250 ml. h. Proses terakhir gel dicuci dengan aquades selama 5 menit dengan 3 kali pengulangan.
